WO2022013477A1 - Nanopartículas para tratamiento, prevención y/o diagnóstico de tumores - Google Patents

Nanopartículas para tratamiento, prevención y/o diagnóstico de tumores Download PDF

Info

Publication number
WO2022013477A1
WO2022013477A1 PCT/ES2021/070526 ES2021070526W WO2022013477A1 WO 2022013477 A1 WO2022013477 A1 WO 2022013477A1 ES 2021070526 W ES2021070526 W ES 2021070526W WO 2022013477 A1 WO2022013477 A1 WO 2022013477A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanoparticle
cancer
micelles
monomer
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2021/070526
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Noureddine Khiar El Wahabi
Cristian ROSALES BARRIOS
Elena ROMERO BEN
David POZO PÉREZ
Jaime MUÑOZ FRANCO
Zaira I. GONZÁLEZ-SÁNCHEZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pontificia Universidad Catolica Madre Y Maestra Pucmm
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Sevilla
Original Assignee
Pontificia Universidad Catolica Madre Y Maestra Pucmm
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Sevilla
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pontificia Universidad Catolica Madre Y Maestra Pucmm, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC, Universidad de Sevilla filed Critical Pontificia Universidad Catolica Madre Y Maestra Pucmm
Publication of WO2022013477A1 publication Critical patent/WO2022013477A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles for the active targeting of antitumor compounds and/or diagnostic agents to tumor tissues. Therefore, the present invention falls within the field of organic nanoparticles and their application in the field of Therapy and Diagnosis (Theranostia) of diseases.
  • Prostate cancer is one of the most diagnosed cancers globally and is the second leading cause of cancer-related death in men. Although the number of deaths has been gradually declining, thanks, above all, to early detection and improved treatment, it continues to be one of the diseases that causes the most deaths each year in Western countries. The two main causes that contribute to this high mortality are: 1) the inability to discern the degree of aggressiveness of the patient's disease, complicating the choice of appropriate therapy; and, 2) the difficulty in ensuring a clear surgical margin for the prostatectomy, which could lead to possible relapses due to not having removed the tumor in its entirety.
  • prostate cancer This implies quite high annual costs. If the cancer has spread, hormone therapy is often used. This type of treatment cannot be used in the earliest stage of prostate cancer.
  • the evolution of prostate cancer is associated with the action of testosterone, so it is necessary to reduce the levels of this hormone or block its action in order to prevent tumor growth. It can be combined with other treatments.
  • Prostate cancers in advanced and metastatic stages have a worse treatment prognosis, making it necessary to develop new techniques to improve patient outcomes.
  • the treatment of these more aggressive cancers is based on non-specific therapies such as chemotherapy. Accumulating clinical data has shown that chemotherapy can extend the life of patients with advanced-stage prostate cancer by no more than 12-15 months.
  • Most conventional chemotherapeutic agents exhibit toxicity not only towards cancer cells, but also towards a wide variety of healthy tissues. This is due to the low Therapeutic Index (TI) of the drugs used in cancer therapy, unable to reach therapeutic concentrations in the target tissue, which means that the dose required to produce an antitumor effect is toxic to normal tissues.
  • TI Therapeutic Index
  • Gliomas are brain tumors originating in the glial cells of the nervous system.
  • Glial cells commonly called neuroglia or simply glia, are nonneuronal cells that provide support and nutrition, maintain homeostasis, form myelin, and are involved in signal transmission in the nervous system.
  • glial cells There are three different types of glial cells in the CNS: microglia, oligodendrocytes, and astrocytes. The two most important types of glioma are those that affect the last two types of cells mentioned (oligodendroglioma and astrocytoma).
  • Glioblastoma multiforme (hereinafter called glioblastoma) is found in the group of astrocytomas, which is the most common malignant brain tumor in adults, accounting for around 40% of malignant brain tumors and around 50% of gliomas. Glioblastoma is classified as primary (de novo) and secondary depending on differences in the genetic mechanism of malignant transformation in undifferentiated astrocytes or glial precursor cells. Secondary glioblastoma affects young people under 45 years of age. Over an average of 4 to 5 years, secondary glioblastoma evolves from a low-grade astrocytoma to an undifferentiated astrocytoma.
  • primary glioblastoma mainly affects older people, with an average of age of 55 years.
  • primary glioblastoma appears as a fulminant glioblastoma characterized by tumor progression within 3 months from the state without clinical or pathological abnormalities.
  • This type of tumor is relatively resistant to radiotherapy and chemotherapy, so post-treatment recurrence is high.
  • glioblastoma remains incurable.
  • the mortality caused by this brain tumor is very high: the average life expectancy is between 9 and 12 months from diagnosis.
  • glioblastoma tumor cells The degree of undifferentiation of glioblastoma tumor cells is the highest of all brain tumors, which explains its high potential for migration and proliferation and its high invasiveness and, therefore, its dire prognosis. Glioblastomas cause death due to the rapid, aggressive and infiltrative growth they show in the brain. Infiltrative growth is responsible for the inoperable nature of these tumors. Microglia have recently been found to be involved in this invasiveness of glioblastomas.
  • glioblastomas part of the tumor that comes into contact with healthy tissue
  • the invasive niche of glioblastomas is not well irrigated by the vasculature, leading to a situation of hypoxia that causes, on the one hand, the escape and invasion of tumor cells towards healthy areas and on the other hand the appearance of necrotic areas in the tumor.
  • Microglia are involved in the exclusive removal of dead tumor cells and the promotion of angiogenesis, thus facilitating tumor growth and expansion. That is why microglia have emerged as a new potential target to prevent the rapid development of glioblastomas (Saavedra-López E, Roig-Mart ⁇ nez M, Cribaro GP, Casanova PV, Gallego JM, Pérez-Vallés A, Barcia C.
  • NPs nanoparticles
  • nanoparticles as vehicles in medicine include: (1) the ability to improve the pharmaceutical and pharmacological properties of drugs, without the need to alter the active ingredient, (2) increase therapeutic efficacy through the selective delivery of drugs to specific tissues or cells, (3) the delivery of drugs across a series of biological and endothelial barriers, (4) the protection of a drug against premature degradation, (5) the ability to enhance intracellular penetration, and ( 6) the ability to deliver a combination of therapeutic and contrast agents for real-time monitoring of therapeutic efficacy.
  • nanoparticles for clinical use is below 100 nanometers. This type of nanoparticles would tend to accumulate in tumors due to their poor extravasation from the vasculature of normal tissues and their escape from surveillance by the immune system. On the other hand, these must be biocompatible and biodegradable, so that the nanovector (nanometric-sized drug transport systems), once it releases its load, degrades or metabolizes into non-toxic components that are cleared through circulation). Given the appropriate size, nanovectors can be concentrated passively (passive targeting), preferentially in tumors due to the increased Permeability and Retention Effect (EPR) of the vasculature of these tissues.
  • EPR Permeability and Retention Effect
  • nanovectors would be preferentially incorporated into tumors due to their aberrant tumor vasculature and would be maintained therein due to lack of a properly functioning lymphatic system).
  • the nanoparticles For the passive accumulation of NPs in the tumor to be effective due to the EPR effect, the nanoparticles must have an adequate surface chemistry that allows them to have sufficient circulation time. This is achieved by coating the nanoparticles with a polymer with a flexible chain, soluble in water and, above all, biocompatible.
  • Polyethylene glycol (PEG) polymers have come to the fore as one of the major families used as masking agents.
  • the "PEGylated” NPs exhibit, for example, a half-life 50 times higher than that of other polymers, greater stability and solubility in water and low immunogenicity and antigenicity, behaving as if they were "invisible” or "stealth” in the organism.
  • top-down approaches from the largest to the smallest
  • bottom-up approaches from the smallest to the largest
  • the latter would be the most adequate to modulate both the size and the function of the NPs.
  • bottom-up approaches is their ability to generate complex nanometric systems from simpler molecules or architectures.
  • Supramolecular chemistry is based precisely on this principle for the construction of a set of stabilized systems, not by covalent bonds, but by associations or weak forces.
  • EPR Enhanced Permeation Retention
  • nanopharmaceuticals had been approved by the FDA (Food and Drug Administration), and 77 were in some stage of clinical trials.
  • FDA Food and Drug Administration
  • nanomaterials consist of formulations polymeric, liposomal and nanocrystals there is currently a trend towards the development of more complex materials such as micelles, protein-based nanoparticles, and metallic particles.
  • the nanopharmaceuticals approved to date by the FDA and the EMA (European Medicine Agency) are good examples of recent developments in drug delivery, but there is still much room for improvement.
  • nanovectors In addition to the ability to deliver the active compound to the site of action, nanovectors must possess other characteristics such as active targeting, biocompatibility, low toxicity, water solubility, and high loading capacity.
  • Ease of internalization and/or release of the active compound into target cells and their site of action is also an important requirement. Furthermore, it can often be of interest to provide some means of visualizing the nanovectors by non-invasive imaging techniques. This is useful for tracking the targeting and delivery of the active compound for research purposes as well as for diagnosis.
  • PSMA Prostate Specific Membrane Antigen
  • PSMA is 100- to 1000-fold more overexpressed in prostate cancer than in normal tissues where it is moderately expressed, such as in the small intestine, kidney, and glial nervous system.
  • PSMA is also expressed in the endothelium of the vast majority of solid tumors (apart from prostate), which makes it an even more interesting target since it could be the target of specific anti-angiogenic drugs (Kroon, J. Metselaar JM, Storm G, van der Pluijm G. Cancer Treat Rev. 2014, 40, 578-
  • PSMA has two enzymatic activities, a peptidase activity responsible for the degradation in the brain of the neurotransmitter peptide N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate, and a folate hydrolase activity that hydrolyzes folate polyglutamate.
  • N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate dipeptide analogs have shown excellent PSMA inhibitory activity and are excellent ligands for active and targeted transport to prostate cancer.
  • the urea dipeptide Asp-CO-Glu is an excellent inhibitor of PSMA with an IC of 5 or 45nM, and has been chosen as the ligand for this study (Thangavel, C.; Perepelyuk, M.; Boopathi, E. ; Liu, Y.; Polischak, S.; Deshpande, DA; Rafiq, K.; Dicker, AP; Knudsen, KE; Shoyele, SA; Den, RB Mol. Pharmaceutics. 2018, 15, 1778-1790).
  • PSMA is currently a clinically validated target as a prostate cancer biomarker and as a receptor for active targeting of nanopharmaceuticals and diagnostics.
  • the present invention relates to a nanoparticle comprising the polymer of formula (I): where n is an integer between 1 and 10, m is an integer between 4 and 20, p is an integer between 2 and 40, q is an integer between 2 and 40, z is the aggregation number, i.e. , the number of monomers in the nanoparticle, and is between 50 and 200,
  • R is a targeting agent, the nanoparticle having a spherical shape.
  • the targeting agent is covalently linked to the rest of the polymer in the manner indicated in formula (I), through a functional group present therein.
  • nanoparticle refers to a spherical particle with a diameter between 10nm and 100nm, preferably between 15nm and 50nm.
  • the nanoparticles of the present invention preferably have a micellar structure, since they form micelles in aqueous solution, presenting the hydrophobic groups towards the inside of the sphere and the hydrophilic groups towards the outside (towards the water phase).
  • the term “nanomicelle” or “micelle” is used as a synonym for nanoparticle.
  • the determination of their size is carried out through Dynamic Light Scattering (DLS), where the average size of the micellar solution is obtained, or Transmission Electron Microscopy (TEM), where their morphology is observed. in addition to allowing the measurement of individual structures.
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • a “targeting agent” (also called a “targeting ligand”), according to the present invention, is a ligand specific to biological receptors that are overexpressed in cells/tissues or organs in which a tumor exists.
  • the targeting agents can be antibodies, RNA, DNA and/or aptamers, it can also be a small compound such as folic acid, whose receptor is overexpressed in cancer cells, or sugars such as lactose, galactose or galactosamine , specifically recognized by the asialoglycoprotein that is overexpressed in liver tumor tissues, etc.
  • the targeting agents in the nanoparticles of the present invention help direct the active agent to the desired site.
  • R is a targeting agent selected from the list consisting of: PMPA (2-phosphonomethyl pentanedioic acid), analogs of NAAG peptidase inhibitors such as N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate, and ((S)-2-(3-((S)-5-amino-1-carboxypentyl)ureido)pentanedioic acid (hereinafter ACUPA, from English ((S)-2-(3-((S)- 5-Amino-1 -Carboxypentyl)Ureido)Pentanedioic Acid).
  • R is the ACUPA targeting agent.
  • This agent is specific for Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), which is the prevalent biomarker of prostate cancer. This agent binds to the rest of the molecule through its amino group.
  • PSMA Prostate Specific Membrane Antigen
  • the nanoparticle will comprise the polymer of formula (G):
  • the nanoparticle may comprise, in addition to the polymer of formula (I), a drug and/or a diagnostic agent inside the sphere that forms said nanoparticle.
  • a drug and/or a diagnostic agent inside the nanoparticle, but do not form covalent bonds with the polymer of formula (I). I know kept inside the sphere by non-covalent interactions.
  • drug also referred to as “active agent” refers to a compound that provides some localized or systemic effect in a subject, often beneficial.
  • Reference to a specific active agent will include, where appropriate, the active agent and its pharmaceutically acceptable salts.
  • active agents are anticancer compounds such as camptothecin, topotecan, paclitaxel, docetaxel, sorafenib, aprepitant, doxorubicin; also antisense oligonucleotides, mRNAi, siRNA and the like, as well as the antivirals remdisivir, hydroxychloroquine, ritonavir, lopinavir, ribavirin, arbidol, among others.
  • the active agents are insoluble in water, limiting the optimal load for their supply.
  • paclitaxel is a highly hydrophobic molecule and practically insoluble in water (less than 0.1 microg/mL).
  • the use of paclitaxel with the present nanoparticle allows its solubility to be increased more than 100,000 times.
  • the active agent may be inactive in the physiological environment.
  • the active agent becomes water soluble and chemically stable when it is part of the nanoparticle.
  • camptothecin is insoluble in water and is chemically unstable in physiological environment.
  • camptothecin which is vital for its biological activity, opens in physiological media giving rise to the less active and more toxic carboxylate form of the drug.
  • camptothecin in the nanoparticle stabilizes the lactone form and improves its solubility in water by a factor of 137 times. It is contemplated that stabilization of the lactone form of the drug may improve the pharmacological profile of camptothecin and help prevent any specific effects of the carboxylic form against various cells or tissues.
  • the improvement in solubility by including it in the nanoparticle is of the order of 10,000 times and in the case of docetaxel, 88,000 times.
  • a “diagnostic agent” refers in the present invention to a pharmaceutical used for the in vivo determination of a disease or abnormal physical condition.
  • the diagnostic agent may be a fluorescent agent, an NMR imaging agent, or an ultrasound imaging agent.
  • imaging agents are hydrophobic compounds that are highly insoluble in water, and can be solubilized with the help of nanomicelles.
  • the diagnostic agents in the therapeutic compositions of the present disclosure can help to selectively identify a tumor without its concentration in the nanoparticle being relevant, although always below the toxicity level of each specific compound.
  • the nanoparticle comprises an active agent or drug inside the sphere that forms said nanoparticle.
  • the particle comprises an active agent and a diagnostic agent, such that the nanoparticle can diagnose and treat tumors.
  • the drug is preferably selected from the list comprising camptothecin, topotecan, paclitaxel, docetaxel, sorafenib, aprepitant and doxorubicin. More preferably, the drug is docetaxel (DTX).
  • the diagnostic agent is preferably selected from the list comprising: 3-DTTCI (3,3'-diethyltiatricarbocyanine iodide), Nile Red (Nile Red), fluorescein and rhodamine.
  • a second aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles as defined in the first aspect of the invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the "carrier” is preferably an inert substance.
  • the function of the vehicle is facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and shape to the pharmaceutical composition. Therefore, the vehicle is a substance that is used in the pharmaceutical composition to dilute any of its components to a certain volume or weight; or that, even without diluting said components, it is capable of allowing a better dosage and administration or giving consistency and shape to the medication.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of any of the components of the composition of the present invention, stabilizes said components or helps to prepare the pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more enjoyable. Therefore, the term “excipient” is defined as that material which, included in galenic forms, is added to the active ingredients or their associations to enable their preparation and stability, modify their organoleptic properties or determine the physical-chemical properties of the substance. Pharmaceutical composition and its bioavailability. The "pharmaceutically acceptable" excipient must allow the activity of the compounds of the pharmaceutical composition, that is, it must be compatible with said components.
  • the excipient and the vehicle must be pharmacologically acceptable, that is, the excipient and the vehicle are permitted and evaluated in such a way that they do not cause harm to the organisms to which they are administered.
  • the pharmaceutical composition can be presented in any clinically permitted form of administration and in a therapeutically effective amount.
  • it may be in a form adapted for oral, sublingual, nasal, intrathecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal, subcutaneous, intramuscular, inhaled, topical, or parenteral administration.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as tablet, capsule, powder, granule, ointment, solution, suppository, injection, inhalant, gel, microsphere or aerosol.
  • the form adapted to oral administration is selected from the list that includes, but is not limited to, drops, syrup, tisane, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granules, stamp, pill, tablet, pill, troche or lyophilisate.
  • the composition of the invention is presented in a form adapted to oral, sublingual, nasal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal, inhaled or parenteral administration.
  • the "galenic form” or “pharmaceutical form” is the disposition to which the active principles and excipients are adapted to constitute a medicine.
  • Another aspect of the present invention refers to the nanoparticle defined in the first aspect of the invention, or to the pharmaceutical composition that comprises it, for its use as a medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the nanoparticle defined in the first aspect of the invention, or to the pharmaceutical composition comprising it, for use in the treatment, prevention and/or diagnosis of cancer (tumors), for example, breast cancer. prostate, breast cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphatic cancer, liver cancer, glial cancer, etc. More preferably, the nanoparticle, or the pharmaceutical composition comprising it, is used in the treatment, prevention and/or diagnosis of prostate, liver or glial cancer.
  • cancer cancer
  • the nanoparticle, or the pharmaceutical composition comprising it is used in the treatment, prevention and/or diagnosis of prostate, liver or glial cancer.
  • Another aspect of the invention refers to the nanoparticle defined in the first aspect of the invention, or to the pharmaceutical composition that comprises it, for its use as a controlled drug release system.
  • Prolonged release refers to a period of release lasting from several hours to about 24 hours, usually up to about 12 hours, and often between about 4 and 14 hours.
  • the compound defined in the first aspect of the invention, or the pharmaceutical composition comprising it, for its uses as previously defined can be administered in different ways, for example, oral, sublingual, nasal, intrathecal, bronchial, lymphatic, rectal , transdermal, subcutaneous, intramuscular, inhaled, topical or parenteral.
  • treatment refers to combating the effects caused as a consequence of a disease or pathological condition of interest in a subject (preferably a mammal, and more preferably a human) including:
  • prevention refers to preventing the occurrence of the disease, that is, preventing the disease or pathological condition from occurring in a subject (preferably a mammal, and more preferably a human), in particular, when said subject has a predisposition for the pathological condition
  • the advantages of the nanoparticles of the present invention are the following: i) they are organic nanoparticles formed by self-association of a monomer with a well-defined structure, ii) the simplicity of their synthesis and reproducibility iii) adequate size, iv ) allows its large-scale synthesis, v) allows the controlled release of drugs, vi) presents biocompatibility, etc.
  • a final aspect of the present invention refers to the process for preparing the nanoparticle defined in the first aspect of the invention.
  • Nanoparticles can be obtained by supramolecular self-association of an amphiphilic monomer, followed by a photopolymerization reaction by simple irradiation with UV light.
  • the method comprises: i) ultrasonication in water, in total absence of light and temperature between 20 and 25 and C, of a monomer of formula (II), said monomer being at a concentration higher than its micelle concentration critical (CMC), concentration from which the monomers form micelles in contact with water, ii) photopolymerization of the micelles in water formed in the previous stage by irradiation with UV light; such that the monomers join together forming stable micelles that are the nanoparticles (photopolymerized micelles) of the present invention as defined in the first aspect of the invention.
  • CMC micelle concentration critical
  • the micelles formed in i) can be isolated by dialysis for 48 hours at 250rpm to remove free monomers.
  • the CMC of the micelle is previously calculated using, for example, a Varian Cary Eclipse spectrofluorometer at room temperature, using pyrene as a fluorescent probe, as is known in the state of the art (see for example for the calculation of CMC: G. Basu Ray, I. Chkraborty, SP Moulik, J. Coll. Int. Sci. 2006, 294, 248-254).
  • the already known procedure for calculating the CMC comprises the performance of the following steps:
  • the different samples are excited at 338nm.
  • the relationship between the fluorescence intensities at 375 nm and 395 nm depends on the monomer concentration and is shown, around the CMC, as a typical sigmoidal curve.
  • the plot of monomer concentration vs. to the relationship between the fluorescence intensities at 375 nm and 395 nm will allow to obtain the CMC of the monomer (the CMC will be the concentration from which the relationship of the intensities begins to vary drastically and ceases to be constant).
  • the ultrasonication is preferably carried out for a time between 30 min and 60 min, more preferably for 40 min.
  • ultrasonication is carried out with an ultrasonication probe (power output 125 W) for 40 min with 5 s on/off intervals.
  • Photopolymerization is preferably carried out by exciting the monomer in water with UV light at 254 nm.
  • the method may also comprise an additional step iii) of incorporating an active agent and/or a diagnostic agent into the nanoparticle once it has been formed.
  • This stage is carried out by adding the active agent and/or a diagnostic agent to a solution of photopolymerized nanoparticles obtained in ii) in water and stirring, preferably for a time between 20 and 24h at a temperature between 50 and 54 and C.
  • the weight ratio of active agent or a diagnostic agent with respect to the amount of nanoparticles can preferably vary between 1:1 to 2:1.
  • nanoparticles photopolymerized nanonomyceles without including active agent
  • they can be isolated by filtration and dialysis. If the nanoparticles (photopolymerized nanomycelles) include an active agent, they are preferably isolated by centrifugation.
  • it also comprises the lyophilization of the photopolymerized nanomicelles obtained.
  • the monomer of formula (II) is obtained by carrying out the following reaction steps: a) Reaction of compound R (addressing agent), with the following bifunctional spacer: having the compound R protected its functional groups except the one that is going to react with the bifunctional spacer, b) Reduction of the compound obtained in step a), which comprises an azide, to give an amine, followed by an amidation reaction of the same with the bifunctional spacer: c) Reaction of the compound obtained in step b) with the alkyne of formula by a 1,3-dipolar cycloaddition of azide and alkyne catalyzed by copper (I); d) Deprotection of protective groups of R, giving rise to the monomer of formula (II):
  • a "functional group” is a group that can be used, under normal conditions of organic synthesis, to form a covalent bond between the structure to which it is attached and another structure, typically containing another functional group.
  • the functional group generally includes a carboxylic group, heteroatoms, al
  • a "protecting group" for a functional group is a moiety that prevents or blocks a particular reaction of that protecting group in a particular process. The protecting group will therefore be involved in the protection of a functional group and prevents the reaction of said functional group in certain processes.
  • Functional groups that can be protected include, by way of example, hydroxyl groups, thiol groups, carboxylic acids, amino groups, and the like.
  • Representative protecting groups for carboxylic acids include esters, amides, and hydrazides; for carbamate and amide amino groups; for hydroxyl groups, ethers and esters; for thiol groups, thioethers and thioesters and such protecting groups are well known in the art.
  • the starting point will be the compound R that has these last protected groups, while the amino will be free to react with the carboxylic acid group of the bifunctional spacer, forming an amide.
  • the starting point will be the compound R that has these last protected groups, while the alcohol will be free to react with the carboxylic acid group of the bifunctional spacer, forming an ester.
  • the starting point will be the compound R that has its acid groups protected, while the amino will be free to react with the bifunctional spacer.
  • the carboxylic acid group is protected with a tert-butyl group.
  • step a) an amidation reaction is carried out between the adequately protected compound R and the bifunctional spacer using TBTU (2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3 tetrafluorophosphate, 3-tetramethyluronium) as dehydration agent, DIPEA (N,N-diisopropylethylamine) as base, DMF (N,N-dimethylformamide) as solvent at room temperature for 24 hours, after which the desired product is purified by column chromatography.
  • TBTU 2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3 tetrafluorophosphate, 3-tetramethyluronium
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • stage b) the product obtained in stage a) is hydrogenated between 1 and 4 bar for a period of time between 12 and 24 hours, using palladium on carbon as reaction catalyst.
  • an amidation reaction is carried out again under the same conditions as those described in step a).
  • step c) a solution of the product obtained in the preceding step b) and the PCDA derivative in dichloromethane is added to a solution of copper sulfate (I) and sodium ascorbate in distilled water.
  • the reaction is carried out in a microwave (Biotage) for 20-60 minutes at 110 ° C. After that, the compound is purified by column chromatography to remove copper.
  • n, m, p and q in relation to the procedure are the same as previously indicated in the first aspect of the invention.
  • R has the same meaning indicated in the first aspect.
  • Another aspect of the invention refers to the nanoparticle obtained by the procedure described in the previous aspect of the invention.
  • Fig. 1 General structure of the nanoparticle of the present invention.
  • Fig. 2. Synthetic scheme of the compound of formula 11 (self-organizing monomer).
  • Fig. 3. General scheme of the generation of photopolymerized micelles by supramolecular self-organization and photopolymerization of monomer 11.
  • Fig. 4 Study of the incorporation of docetaxel by proton NMR.
  • the spectrum of the charged micelles dissolved in D 2 0 is observed, where no appreciate the characteristic signals of the drug.
  • the spectrum of the charged micelles dissolved in DMSO-d6 (which disintegrates the micelles) is observed, where these signals can be seen in the box above 7-8 ppm.
  • Fig. 5 Cell viability of LnCAP (prostate cancer cell line) after treatment with polymerized micelles obtained from monomer 11 with ligand (M11) or polymerized micelles obtained from monomer 12 without ligand (M12) for 24 and 48h by an MTT assay.
  • Fig. 6 Cell viability of PC3 (prostate cancer cell line) after treatment with micelles of monomer 11 with ligand or monomer 12 without ligand for 24 and 48h by MTT assay.
  • Fig. 7 Images of LnCAP and PC3 cells by confocal microscopy after 3h of treatment with micelles of monomer 11 with ligand or monomer 12 without ligand, loaded with Nile Red (Nile Red) and co-treated with free pseudodipeptide.
  • Fig. 8 Cell viability of BV-2 (microglial cell lines) after treatment with empty 11 micelles loaded with docetaxel for 24h by MTT assay. PBS and free docetaxel were used as negative and positive control, respectively.
  • Fig. 9 Images of BV-2 cells and primary microglia by confocal microscopy after 3h treatment with micelles of monomer 11 with ligand or monomer 12 without ligand loaded with Nile Red and co-treated with dipeptide.
  • the chemicals used herein were purchased from Aldrich Chemical Co. and Carbosynth Co. and used as received without further purification. Dry solvents were purchased from SDS in anhydrous grade and further dried in a solvent purification system (Pange Solv MD5, innovative technology). The monitoring of the reactions was carried out by analytical thin layer chromatography (TLC), using aluminum sheets coated with silica gel 60 F254 (normal phase) purchased from Merck. Activations by sonication were achieved using a sonication tip (Qsonica Ultrasonic Liquid Processor, model Q500) or in a water bath (Ultrasonik®).
  • NMR spectra were recorded with DRX-300 (300 MHz), DPX-400 (400 MHz), and DRX-500 (500 MHz) devices.
  • Deuterated solvents are indicated in parentheses. Spectra have been recorded from samples in solution in the deuterated solvent indicated in parentheses. Chemical shifts are expressed in ppm(d), using the residual signal of the non-deuterated solvent as reference.
  • Two-dimensional proton-proton (COSY) and proton-carbon (HETCOR) correlation experiments using standard pulse sequences have been used to assign the most complex structures. Rotational powers [a] 20 D have been determined at room temperature, using a 10 cm long cell.
  • UV-Vis spectra were recorded on a Perkin Elmer Lambda 12 UV/Vis spectrometer, using milli-Q water (18 mW) or DMF purchased from Fluka Chemie in suitable spectroscopic quality as solvent.
  • Mass spectra (MS) were obtained using the electrospray ionization (ESI) technique on a Bruker Esquire6000 spectrometer. For this, solutions of the samples in CH2CI2, MeOH, or their mixtures, at a concentration in the mM range, were used.
  • spacer 5 (45.5 mg, 0.21 mmol), 0-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (hereinafter referred to as TBTU; 44, 5 mg, 0.19 mmol) and DIPEA (0.03 mL) in dry dimethylformamide (hereinafter referred to as DMF; 0.5 mL) was allowed to stir at room temperature for 5 minutes. After this time, a solution of 2 (97 mg, 0.19 mmol) and DIPEA (0.03 ml) in DMF (0.5 ml) was added. The mixture was allowed to stir for 24 hours.
  • TBTU 0-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • DMF dry dimethylformamide
  • Trifluoroacetic acid (1 mL) was added to a solution of 10 (134.3 mg, 0.064 mmol) in CH 2 CI 2 (2.06 mL) in a microwave tube. It was kept under agitation in a Biotage microwave and 70 C for 25 minutes. 11 was obtained in quantitative yield (141.3 mg).
  • CMC Critical Micellar Concentration
  • CMC Critical Micellar Concentration
  • the different samples were excited at 338nm.
  • the relationship between the fluorescence intensities at 375 nm and 395 nm depends on the total micellar concentration and is shown, around the CMC, as a typical sigmoidal curve. This curve was later processed to obtain the CMC.
  • the formation of the nanomicelles was carried out (figure 3). To do this, a certain amount of monomers 11 and 12, greater than the CMC, was dissolved in milliQ water. This solution was subjected to ultrasonication for 30 minutes at 20% amplitude under total darkness. After that, the micellar solution was dialyzed for 48 hours at 250 rpm to remove free monomers, and the unpolymerized micelles were analyzed by DLS and TEM. After DLS and TEM analysis of the non-polymerized micelles, they were kept for 3 hours under ultraviolet light for their polymerization (254nm).
  • the polymerized micelles are obtained pure and do not require any additional purification stage.
  • the polymerized micelles were re-analyzed by DLS and TEM. 5.3. Micellar stabilization tests.
  • nanomicelles The main problem presented by non-polymerized nanomicelles is their high tendency to dilution. This has been solved with the polymerization of the dialquine function of 10,12-pentacosadiinoic acid. To check if this strategy is effective, micelles were formed in PBS pH7.4 buffer (0.1 M) and analyzed by DLS and TEM every week until the month of study). After that, they were re-analyzed at 3 and 6 months. In turn, micelles were formed above the CMC and diluted well below it to see if the micelles were stable in the medium regardless of their concentration.
  • the desired compound (sorafenib: 1.54 mg/ml; docetaxel: 1.29 mg/ml; camptothecin: 0.72 mg/ml or aprepitant: 1.43 mg/ml) was added to a solution of nanomicelles (polymerized) 1.25mM in milliQ water and kept stirring for 24h at 54°C.
  • the solution obtained was centrifuged at 1500 rpm for 45 minutes, the supernatant (polymerized nanomycells with the drug or diagnostic agent incorporated) was separated from the precipitate (diagnostic agent or drug not incorporated) and the samples were lyophilized in a lyophilizer (llshin BioBase, Freeze Dryer) at -70°C.
  • the main problem with the administration of these drugs is their low solubility in water, since they are hydrophobic compounds, and therefore high doses of drug are needed to obtain adequate bioavailability.
  • the design of the nanoparticles of the present invention allows the incorporation of hydrophobic drugs inside, isolating them from the hydrophilic environment of the medium, improving their solubility. In this way, the administered dose of drug could be reduced and their side effects would be minimised.
  • the drug content of the loaded nanomicelles (drug-loading content,-DL) and the encapsulation efficiency (EE) were determined by HPLC following the following equations:
  • E E (%) Theoretical drug load* 100
  • the nanomicelles can be saturated with the drug, which causes the immediate release of most of its content due to the so-called 'Burst effect', whereby the drug that is interacting weakly with the hydrophobic core of the nanoparticle will be released in a pulsatile manner, or they can be loaded with a small amount of drug, with which controlled and sustained release profiles are obtained over time.
  • the encapsulation efficiency of docetaxel is 22%, of sorafenib 25%, of aprepitant 20.5% and of camptothecin 9.4% while the drug content depends on the concentrations of nanomicelles and drug used.
  • a C ⁇ e column (5pm, 4.6 x 150mm) was used and a mixture of 50% acetonitrile-0.1%TFA and 30% H 2 0-0.05%TFA as mobile phase with a flow rate of 1ml/min for the case of docetaxel, sorafenib and aprepitant and 30% acetonitrile-0.1%TFA and 70% H20-0.05%TFA for camptothecin.
  • the column temperature was 30°C. 10mI, 30mI or 50mI of the sample was injected onto the column.
  • Example 7 Cell Growth Assays 7.1. Cell lines and culture.
  • LnCAP and PC3 were cultured in RPMI1640 medium containing 10% inactivated fetal bovine serum, 1% penicillin, 1% streptomycin, and non-essential amino acids.
  • SIM-A9 cells in DMEM F12 medium with 10% fetal bovine serum and 5% horse serum both inactivated, 1% penicillin, 1% streptomycin, glutamine and non-essential amino acids.
  • BV-2 cells in "DMEM high glucose" medium with 10% inactivated fetal bovine serum, 1% penicillin, 1% streptomycin and glutamine (Leal-Lasarte, FASEB J.
  • coverslips were rinsed three times with PBS and fixed with PFA samples (paraformaldehyde) to 4% for 15 minutes at 4 e C and washed three times with PBS. Samples were then blocked with 3% BSA (bovine serum albumin) and 0.5% Triton in PBS for 1 hour at room temperature. Samples were then incubated with phalloidin for 20 min at room temperature and washed three times with PBS. Finally, DAPI was added and incubated for 5 min at room temperature and samples were washed three times with PBS and mounted on microscope slides using Vectashield mounting medium for fluorescence.
  • BSA bovine serum albumin
  • LnCAP and PC3 cells were treated for 3 h with Nile red (NR)-loaded nanomicelles, with or without the ligand, or NR-loaded micelles with ligand plus the free non-cleavable dipeptide ( glutamate-lysine) that specifically binds to the PSMA receptor. Fluorescence images were then acquired on a confocal microscope. The specificity of the interaction between micelles with ligand and PSMA is shown in Figure 7a and b.
  • Ligand specificity was also demonstrated by confocal microscopy in SIM-A9 as in primary microglia taken from neonatal mice.
  • the cells were treated for 3 h with micelles loaded with Nile red, with or without the ligand, or NR-loaded micelles with ligand plus free non-cleavable dipeptide (glutamate-lysine).
  • the specificity of the interaction between micelles with ligand and PSMA is demonstrated (FIG. 9).
  • When cells were treated with micelles without ligand small amounts of Nile red were observed in the cells, whereas when cells were treated with micelles with ligand, a significant amount of NR entered the cell, especially in LnCAP cells overexpressing PSMA.
  • the cells were co-treated with micelles containing ligand and the non-cleavable dipeptide, the amount of Nile red inside the cells was remarkably decreased.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a nanopartículas de fórmula (I) para el direccionamiento activo de compuestos antitumorales y/o agente de diagnóstico a tejidos tumorales. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dichas nanopartículas como medicamento y, en particular, para su uso en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas para tratamiento, prevención v/o diagnóstico de tumores
La presente invención se refiere a nanopartículas para el direccionamiento activo de compuestos antitumorales y/o agente de diagnóstico a tejidos tumorales. Por tanto, la presente invención se encuadra dentro del campo de las nanopartículas orgánicas y su aplicación en el campo de la Terapia y Diagnóstico (Teranóstia) de enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de próstata es uno de los cánceres más diagnosticados a nivel global y supone la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en hombres. Aunque el número de muertes ha ido descendiendo paulatinamente, gracias, sobre todo, a la detección temprana y la mejora en su tratamiento, sigue siendo una de las enfermedades que más muertes causa cada año en los países occidentales. Las dos causas principales que contribuyen a esta elevada mortalidad son: 1) la incapacidad para discernir el grado de agresividad de la enfermedad del paciente, complicando la elección de la terapia apropiada; y, 2) la dificultad para asegurar un margen quirúrgico claro para la prostatectomía, lo que podría acarrear posibles recaídas al no haber retirado el tumor en su totalidad.
Los cánceres de próstata en etapas tempranas son tratados de manera exitosa, normalmente, a través de terapias convencionales (cirugía y radioterapia). Actualmente, la cirugía (prostatectomía radical) es el tratamiento más usado para cánceres de próstata clínicamente localizados y proporciona una ventaja de supervivencia en comparación con la espera vigilante. Mediante este tipo de tratamiento se extrae por completo la próstata y los tejidos más adyacentes. Un problema acuciante de este tipo de tratamiento es la garantía de una resección completa del tumor, o sea, un margen quirúrgico negativo. Un margen quirúrgico positivo requiere radioterapia adyuvante (se da en más del 25% de los pacientes). La radioterapia, además de emplearse para intentar limpiar la zona por completo tras la extracción, también puede ser utilizada para preparar la zona antes de la intervención. Es muy habitual el uso de la radioterapia aun sin ser necesitada, ya que, como hemos comentado, se carece de métodos para la visualización precisa de la masa tumoral al completo. Esto supone unos costes anuales bastante elevados. Si el cáncer se ha diseminado, se emplea con asiduidad la terapia hormonal. Este tipo de tratamiento no se puede emplear en la fase más temprana del cáncer de próstata. La evolución del cáncer de próstata está asociada a la acción de la testosterona, por lo que se trata de reducir los niveles de esta hormona o bloquear su acción con el fin de evitar el crecimiento del tumor. Se puede combinar con otros tratamientos.
Los cánceres de próstata en etapas avanzadas y metastásicos tienen peor pronóstico de tratamiento, haciendo necesario el desarrollo de nuevas técnicas para la mejora de los resultados de los pacientes. El tratamiento de estos cánceres más agresivos se basa en terapias no específicas como la quimioterapia. Los datos clínicos acumulados han mostrado que la quimioterapia puede alargar la vida de los pacientes con cáncer de próstata en estadios avanzados durante no más de 12-15 meses. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos convencionales exhiben toxicidad no sólo hacia las células cancerosas, sino también hacia una gran variedad de tejidos sanos. Esto se debe al bajo índice Terapéutico (IT) que presentan los fármacos utilizados en la terapia contra el cáncer, incapaces de alcanzar concentraciones terapéuticas en el tejido diana, lo que conlleva que la dosis requerida para producir un efecto antitumoral sea tóxica para los tejidos normales. Los gliomas, por su parte, son tumores cerebrales originados en las células gliales del sistema nervioso. Las células gliales, llamadas por lo común neuroglía o simplemente glía, son células no neuronales que proporcionan soporte y nutrición, mantienen la homeostasia, forman la mielina e intervienen en la transmisión de señales en el sistema nervioso. Existen tres tipos diferentes de células gliales en el SNC: microglía, oligodendrocitos y astrocitos. Los dos tipos de glioma más importantes son los que afectan a los dos últimos tipos de células mencionadas (oligodendroglioma y astrocitoma). En el grupo de los astrocitomas se encuentra el glioblastoma multiforme (denominado en lo sucesivo glioblastoma) que es el tumor cerebral maligno más frecuente en adultos pues supone alrededor del 40% de los tumores cerebrales malignos y alrededor del 50% de los gliomas. El glioblastoma se clasifica en primario (de novo) y secundario dependiendo de las diferencias en el mecanismo génico de la transformación maligna que experimentan los astrocitos indiferenciados o las células precursoras gliales. El glioblastoma secundario afecta a personas jóvenes menores de 45 años. A lo largo de 4 o 5 años, en promedio, el glioblastoma secundario evoluciona de un astrocitoma de bajo grado a un astrocitoma indiferenciado. Por el contrario, el glioblastoma primario afecta sobre todo a personas más mayores, con una media de edad de 55 años. Por norma general, el glioblastoma primario aparece como un glioblastoma fulminante caracterizado por la progresión del tumor en 3 meses desde el estado sin anomalías clínicas ni patológicas. Este tipo de tumores son relativamente resistentes a la radioterapia y la quimioterapia, por lo que la recurrencia postratamiento es elevada. Pese a los avances en el tratamiento logrados merced a mejoras en las técnicas de neuroimagen, la microcirugía y las opciones terapéuticas como la temozolomida o la radiación, el glioblastoma sigue siendo incurable. La mortalidad causada por este tumor cerebral es muy alta: la esperanza de vida media se sitúa entre 9 y 12 meses desde el diagnóstico.
El grado de indiferenciación de las células tumorales del glioblastoma es el más elevado de todos los tumores cerebrales, lo que explica su alto potencial de migración y proliferación y su elevada invasividad y, por ende, su pronóstico funesto. Los glioblastomas provocan la muerte por el crecimiento rápido, agresivo e infiltrante que demuestran en el cerebro. El crecimiento infiltrante es el responsable del carácter inoperable de estos tumores. Se ha descubierto recientemente que la microglía está implicada en esta capacidad invasiva de los glioblastomas. El nicho invasivo de los glioblastomas (parte del tumor que va entrando en contacto con el tejido sano) no está bien irrigado por la vasculatura, llevando a una situación de hipoxia que provoca por una parte el escape e invasión de las células tumorales hacia zonas sanas y por otra parte la aparición de zonas necróticas en el tumor. La microglía está implicada en la retirada exclusiva de las células tumorales muertas y la promoción de angiogénesis, facilitando así el crecimiento y expansión del tumor. Es por ello que la microglía ha surgido como una nueva diana potencial para evitar el rápido desarrollo de los glioblastomas (Saavedra-López E, Roig-Martínez M, Cribaro GP, Casanova PV, Gallego JM, Pérez-Vallés A, Barcia C. Brain Communications, 2020, 2, fcz043). La búsqueda de enfoques no invasivos que permitan tratar de manera eficiente estos y otros cánceres, con un mínimo o sin efectos tóxicos, ha sido una prioridad en la oncología moderna. El advenimiento de la nanomedicina ha tenido un impacto significativo en este campo. El objetivo final de la nanomedicina es transportar una cantidad suficiente de sustancias activas a través de barreras fisiológicas y alcanzar, selectivamente, los tejidos enfermos. Para lograr este objetivo, las nanopartículas terapéuticas (NP) se están utilizando como vehículos para la liberación selectiva y / o controlada de fármacos citotóxicos.
Las principales ventajas de usar nanopartículas como vehículos en la medicina incluyen: (1) la capacidad de mejorar las propiedades farmacéuticas y farmacológicas de los medicamentos, sin la necesidad de alterar el ingrediente activo, (2) aumentar la eficacia terapéutica mediante el suministro selectivo de medicamentos a tejidos específicos o células, (3) la administración de medicamentos a través de una serie de barreras biológicas y endoteliales, (4) la protección de un medicamento contra la degradación prematura, (5) la capacidad de mejorar la penetración intracelular y (6) la capacidad de administración de una combinación de agentes terapéuticos y de contraste para el monitoreo en tiempo real de la eficacia terapéutica.
Aunque no existe un consenso general, el tamaño ideal de las nanopartículas para uso clínico se encuentra por debajo de los 100 nanómetros. Este tipo de nanopartículas tenderían a acumularse en los tumores debido a su pobre extravasación de la vasculatura de los tejidos normales y su escape a la vigilancia del sistema inmune. Por otra parte, estas deben ser biocompatibles y biodegradables, para que el nanovector (sistemas de transporte de fármacos de tamaño nanométrico), una vez libere su carga, se degrade o metabolice en componentes no tóxicos que sean aclarados a través de la circulación). Teniendo el tamaño adecuado, los nanovectores pueden concentrarse de forma pasiva (direccionamiento pasivo), preferentemente en los tumores debido al Efecto de Permeabilidad y Retención aumentada (EPR) de la vasculatura de estos tejidos. Debido a este efecto, los nanovectores se incorporarían de manera preferente a los tumores debido a su vasculatura tumoral aberrante y se mantendrían en él por falta de un sistema linfático con un correcto funcionamiento). Para que la acumulación pasiva de las NPs en el tumor sea efectiva por efecto EPR, las nanopartículas deben tener una química de superficie adecuada que les permite tener un tiempo suficiente de circulación. Esto se consigue mediante el recubrimiento de las nanopartículas con un polímero de cadena flexible, soluble en agua y, sobre todo, biocompatible. Los polímeros de polietilenglicol (PEG) han destacado enormemente como una de las familias principales utilizadas como agentes de enmascaramiento. Las NPs “PEGiladas” exhiben, por ejemplo, una vida media 50 veces superior a la de otros polímeros, mayor estabilidad y solubilidad en agua y baja inmunogenicidad y antigenicidad, comportándose como si fueran “invisibles” ó “furtivos” en el organismo. Sin embargo, se ha demostrado que el direccionamiento pasivo no es adecuado para reducir los efectos secundarios de los compuestos antitumorales comparado con el direccionamiento activo, que se basa en la programación de los nanovectores mediante la unión de un ligando, que interacciona de forma selectiva con los receptores de la superficie de la célula (Chen, Z.; Penet, M.F.; Nimmagadda, S.; Li, C.; Banerjee, S.R.; Winnard Jr, P.T.; Artemov, D.; Glunde, K.; Pomper, M.G.; Bhujwalla, Z.M. ACS Nano. 2012, 6, 7752-7762). Es por ello que, encontrar nuevas dianas biológicas, específicas, sobreexpresadas respecto a las células normales, con alta eficiencia endocítica y poca tendencia a sufrir mutaciones es de suma importancia en nanomedicina. Se ha observado que el uso de moléculas de bajo peso molecular como ligandos de direccionamiento, en lugar de anticuerpos, supondría una mejora significativa debido a sus grandes ventajas respecto a estos. Los ligandos pequeños son fáciles de preparar a gran escala, presentan propiedades farmacocinéticas favorables (mayor biodisponibilidad, vida media, penetración tumoral, etc.) y podrían penetrar la barrera hematoencefálica. Además, se pueden sintetizar numerosos análogos modificados de manera sencilla, de modo que se podría llegar a conseguir una especificidad y afinidad potenciadas (Lim, E. Transí. Cáncer Rev. 2018, 7, S676-S689).
En cuanto a la síntesis de nanopartículas, existen actualmente dos métodos diferentes, comúnmente denominadas aproximaciones “top-down” (“de lo más grande a lo más pequeño”), que consiste en una miniaturización de estructuras con métodos convencionales de foto-litografía mediante un haz de electrones, y “bottom-up” (“de lo más pequeño a lo más grande”), que contempla el uso de átomos y moléculas como unidades de fabricación para la construcción de arquitecturas nanométricas. Ésta última sería la más adecuada para modular tanto el tamaño como la función de las NPs. La gran ventaja de las aproximaciones del tipo “bottom-up” es su capacidad para generar sistemas nanométricos complejos a partir de moléculas o arquitecturas más sencillas. La química supramolecular se basa justamente en este principio para la construcción de un conjunto de sistemas estabilizados, no por enlaces covalentes, sino mediante asociaciones o fuerzas débiles. Concretamente, la autoasociación u autoorganización de monómeros mediante enlaces de tipo electrostático, Van der Waals o enlaces de hidrógeno, es hoy en día una de las aproximaciones más potentes y prometedoras para la construcción de nanomateriales funcionales complejos. En este sentido la búsqueda y el diseño de moléculas o bloques químicos sencillos capaces de realizar una autoorganización compleja y, en el mejor de los casos, modelable es de sumo interés. Un ejemplo ilustrativo de este tipo de moléculas lo constituyen los lípidos en particular, o las moléculas anfifílicas en general, capaces de generar un gran número de estructuras autoorganizadas de diferentes tamaños y topologías (Palermo, V.; Samori, P. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4428-4432). Esta aproximación bottom-up permite la escalabilidad de la síntesis, llegándose a poder sintetizar grandes cantidades del monómero que da lugar a los nanovectores, manteniendo sus propiedades. En otros casos, como el de las nanopartículas magnéticas, se llega a un límite de escalabilidad que, normalmente, es bastante bajo.
Es de destacar que tras más de dos décadas utilizando nanomateriales en medicina, el análisis del gran número de publicaciones en este campo revela que a pesar del éxito cosechado a nivel académico, su traslación a aplicaciones clínicas ha sido hasta la fecha muy limitada (Min,Y.; Caster, J.M.; Eblan, M.J.; Wang, A.Z. Chem. Rev. 2015, 115, 11147) debido a la alta complejidad del tema. En este sentido, los nanomateriales tienen que atravesar varias barreras biológicas, haciendo necesario un mayor entendimiento a nivel molecular de la interface bio-nano (McNeil, S. E. Nat. Rev. Mater. 2016, 1 , 16073), la formación de la corona proteica así como su importancia sobre la estabilidad y la actividad biológica de los nanovectores (Rócker, C.; Pótzl, M.; Zhang, F.; Parak, W.J.; Nienhaus, G.U. Nat. Nanotechnol. 2009, 4, 577). Por otra parte, datos recientes indican que el efecto Enhanced Permeation Retention (EPR) de los tumores es muy heterogéneo y depende de una serie de factores como, por ejemplo, la dinámica vascular, la presión arterial sistólica, el tamaño y tipo del tumor (lesión primaria vs. cáncer metastásico) (Tanaka, N. et al.; Nat. Biomed. Eng. 2017, 7796). Consecuentemente, una aproximación única tipo “one size fits all”, en el diseño de tratamientos basados en nanovectores, es poco probable que se traduzca en resultados clínicamente beneficiosos. Sin lugar a duda, uno de los problemas más acuciantes en la traslación al mercado de los nanomateriales terapéuticos, deriva de la dificultad en la producción a gran escala, de manera reproducible de la mayoría de los nanomateriales utilizados actualmente en los laboratorios de investigación básica. Es por ello, que desde el punto de vista sintético, para que las nanopartículas tengan un potencial de translación clínica, la complejidad en su diseño y desarrollo debe minimizarse tanto como sea posible para crear sistemas que puedan prepararse y caracterizarse de manera reproducible.
En el 2016, 51 nanofármacos han sido aprobados por la FDA (Food and Drug Administration), y 77 estaban en algún estadio de ensayos clínicos. Aunque la mayoría de los nanomateriales aprobados por la FDA consiste en formulaciones poliméricas, liposomales y de nanocristales existe actualmente una tendencia hacia el desarrollo de materiales más complejos tales como las micelas, nanoparticulas basadas en proteínas, y partículas metálicas. Los nanofármacos aprobados hasta la fecha por la FDA y de la EMA (European Medicine Agency), son buenos ejemplos de desarrollos recientes en la administración de fármacos, pero todavía hay mucho espacio para mejorar. Además de la capacidad de administrar el compuesto activo al sitio de acción, los nanovectores deben poseer otras características como el direccionamiento activo, biocompatibilidad, poca toxicidad, solubilidad en agua y alta capacidad de carga. La facilidad de internalización y/o liberación del compuesto activo en las células objetivo y en su sitio de acción también es un requisito importante. Además, a menudo puede ser interesante proporcionar algunos medios para visualizar los nanovectores mediante técnicas de imágenes no invasivas. Esto es útil para seguir la orientación y el suministro del compuesto activo con fines de investigación, así como para el diagnóstico.
En conjunto, a pesar de los avances recientes, todavía se necesitan estrategias para mejorar la eficacia terapéutica contra el cáncer al mejorar la administración y liberación de fármacos dirigidos a un sitio dado.
En esta solicitud de patente, se ha escogido como principal diana el Antígeno Prostático Específico de Membrana (PSMA), que es el biomarcador prevalente del cáncer de próstata y en menor medida de las células gliales. El PSMA, es una proteína integral de membrana de tipo II que presenta una expresión abundante en las células prostáticas cancerosas, sobre todo en estadios más avanzados y metastásicos (Banerjee, S.R.; Foss, C.A.; Castañares, M.; Mease, R.C.; Byun, Y.; Fox, J.J.; Hilton, J.; Lupold, S.E.; Kozikowski, A.P.; Pomper, M.G. J. Med. Chem., 2008, 51 , 4504-4517). El PSMA se sobreexpresa entre 100 y 1000 veces más en el cáncer de próstata que en los tejidos normales donde se expresa moderadamente, como en el intestino delgado, los riñones y el sistema nervioso de la glía. Además, el PSMA también se expresa en el endotelio de la gran mayoría de tumores sólidos (aparte del de próstata), lo que lo convierte en una diana aún más interesante ya que podría ser diana de fármacos específicos anti-angiogénicos (Kroon, J.; Metselaar, J.M.; Storm, G.; van der Pluijm, G. Cáncer Treat. Rev. 2014, 40, 578-
584). El PSMA posee dos actividades enzimáticas, una actividad peptidasa responsable de la degradación en el cerebro del péptido neurotransmisor N-acetil-L- aspartil-L-glutamato, y una actividad folato hidrolasa que hidroliza el f olato poliglutamato. Los análogos del dipéptido N-acetil-L-aspartil-L-glutamato han mostrado una excelente actividad inhibidora del PSMA y constituyen excelentes ligandos para el transporte activo y dirigido hacia el cáncer de próstata. En este sentido el dipéptido urea Asp-CO-Glu, es un excelente inhibidor del PSMA con un IC5o de 45nM, y ha sido escogido como ligando para este estudio (Thangavel, C.; Perepelyuk, M.; Boopathi, E.; Liu, Y.; Polischak, S.; Deshpande, D.A.; Rafiq, K.; Dicker, A.P.; Knudsen, K.E.; Shoyele, S.A.; Den, R.B. Mol. Pharmaceutics. 2018, 15, 1778-1790). El PSMA es actualmente una diana clínicamente validada como biomarcador del cáncer de próstata y como receptor para el direccionamiento activo de nanofármacos y elemento de diagnóstico. En los últimos años varios nanomateriales de diferentes estructuras han sido desarrollados utilizando el PSMA como diana para el tratamiento activo del cáncer de próstata, incluyendo nanoplexos, liposomas, nanoparticulas de oro, y polímeros, estos últimos probados clínicamente (Matsuoka, D.; Watanabe, H.; Shimizu, Y.; Kimura, H.; Yagi, Y.; Kawai, R.; Ono, M.; Saji, H. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 2291-2301).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una nanopartícula que comprende el polímero de fórmula (I):
Figure imgf000010_0001
donde n es un número entero entre 1 y 10, m es un número entero entre 4 y 20, p es un número entero entre 2 y 40, q es un número entero entre 2 y 40, z es el número de agregación, es decir, el número de monómeros en la nanopartícula, y está comprendido entre 50 y 200,
R es un agente de direccionamiento, teniendo la nanopartícula forma esférica.
El agente de direccionamiento está unido covalentemente al resto del polímero de la manera indicada en la fórmula (I), a través de un grupo funcional presente en el mismo.
El término “nanopartícula” de la presente invención se refiere a una partícula esférica con un diámetro entre 10nm y 100nm, preferiblemente entre 15 nm y 50 nm. Las nanopartículas de la presente invención tienen preferiblemente una estructura micelar, ya que forman micelas en solución acuosa, presentando los grupos hidrófobos hacia adentro de la esfera y los grupos hidrófilos hacia afuera (hacia la fase de agua). En la presente invención el término “nanomicela” o “micela” se utiliza como sinónimo de nanopartícula. La determinación del tamaño de las mismas se lleva a cabo a través de Dispersión de Luz Dinámica (DLS), donde se obtiene el tamaño medio de la disolución micelar, o Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), donde se observa la morfología de las mismas además de permitir la medición de estructuras individuales.
Un “agente de direccionamiento” (también denominado “ligando de direccionamiento”), de acuerdo a la presente invención, es un ligando específico a receptores biológicos que se sobreexpresan en las células/tejidos u órganos en los que existe un tumor. A modo de ejemplo, los agentes de direccionamiento pueden ser anticuerpos, ARN, ADN y/o aptámeros, también puede ser un pequeño compuesto como el ácido fólico, cuyo receptor se sobreexpresa en las células cancerosas, o azúcares como la lactosa, galactosa o galactosamina, reconocidos específicamente por la asialoglicoproteina que se sobreexpresa en los tejidos hepáticos tumorales, etc. Los agentes de direccionamiento en las nanopartículas de la presente invención ayudan a dirigir el agente activo al sitio deseado. En una realización preferida, R es un agente de direccionamiento seleccionado de la lista que consiste en: PMPA (ácido 2-fosfonometil pentanedioico), análogos de los inhibidores de peptidasas NAAG como es el N-acetil-L-aspartil-L-glutamato, y ácido ((S)-2-(3-((S)-5-amino-1-carboxipentil)ureido)pentanodioico (en adelante ACUPA, del inglés ((S)-2-(3-((S)-5-Amino-1 -Carboxypentyl)Ureido)Pentanedioic Acid).
Aún más preferiblemente, R es el agente de direccionamiento ACUPA. Este agente es específico al Antígeno Prostático Específico de Membrana (PSMA), que es el biomarcador prevalente del cáncer de próstata. Este agente se une al resto de la molécula a través de su grupo amino.
En el caso de que R sea ACUPA, la nanopartícula comprenderá el polímero de fórmula (G):
Figure imgf000012_0001
(P donde z, m, n, p y q tienen el mismo significado indicado anteriormente. En una realización preferida de la nanopartícula de la invención m = 10, n = 7, p = 19 y q = 3.
La nanopartícula puede comprender, además del polímero de fórmula (I), un fármaco y/o un agente de diagnóstico en el interior de la esfera que forma dicha nanopartícula. En este caso, tanto el fármaco como el agente de diagnóstico se encuentran dentro de la nanopartícula, pero no forman enlaces covalentes con el polímero de fórmula (I). Se mantienen en el interior de la esfera por interacciones de tipo no covalente.
El término “fármaco”, también denominado “agente activo”, se refiere a un compuesto que proporciona algún efecto localizado o sistémico en un sujeto, con frecuencia beneficioso. La referencia a un agente activo específico incluirá, en su caso, el agente activo y sus sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de agentes activos son compuestos anticancerígenos como camptotecina, topotecán, paclitaxel, docetaxel, sorafenib, aprepitant, doxorrubicina; también oligonucleótidos antisentido, mARNi, pARNi y similares, así como los antivirales remdisivir, hidroxicloroquina, ritonavir, lopinavir, ribavirina, arbidol, ente otros.
En general los agentes activos son insolubles en agua, limitando la carga óptima para su suministro. A modo de ejemplo, el paclitaxel es una molécula altamente hidrófoba y prácticamente insoluble en agua (menos de 0,1 microg/mL). El uso del paclitaxel con la presente nanopartícula permite aumentar su solubilidad más de 100.000 veces. Además de insoluble en agua, el agente activo puede ser inactivo en medio fisiológico. Sin embargo, el agente activo se vuelve soluble en agua y químicamente estable cuando forma parte de la nanopartícula. Por ejemplo, la camptotecina es insoluble en agua y es químicamente inestable en medio fisiológico. De hecho, el resto de lactona de camptotecina, que es vital para su actividad biológica, se abre en medios fisiológicos dando lugar a la forma carboxilato del fármaco que es menos activa y más tóxica. La inclusión de la camptotecina en la nanopartícula estabiliza la forma lactónica y mejora su solubilidad en agua en un factor de 137 veces. Se contempla que la estabilización de la forma lactónica del fármaco puede mejorar el perfil farmacológico de la camptotecina y ayudar a prevenir cualquier efecto específico de la forma carboxílica contra diversas células o tejidos.
En el caso del sorafenib, la mejora de la solubilidad al incluirlo en la nanopartícula es del orden de 10.000 veces y en el caso del docetaxel de 88.000 veces.
Un “agente de diagnóstico” se refiere en la presente invención a un producto farmacéutico empleado para la determinación in vivo de una enfermedad o estado físico anormal. El agente de diagnóstico puede ser un agente fluorescente, un agente pasible de utilización en RMN de imagen o un agente para la imagen por ultrasonido. Como en el caso de los agentes activos, los agentes de imagen son compuestos hidrófobos altamente insolubles en agua, y pueden solubilizarse con la ayuda de las nanomicelas. Los agentes de diagnóstico en las composiciones terapéuticas de la presente divulgación pueden ayudar a identificar selectivamente un tumor sin ser relevante la concentración del mismo en la nanopartícula, aunque siempre por debajo del nivel de toxicidad de cada compuesto concreto.
En otra realización preferida, la nanopartícula comprende un agente activo o fármaco en el interior de la esfera que forma dicha nanopartícula.
En otra realización más preferida, la partícula comprende un agente activo y un agente de diagnóstico, de manera que la nanopartícula puede diagnosticar y tratar tumores.
El fármaco está preferiblemente seleccionado de la lista que comprende camptotecina, topotecán, paclitaxel, docetaxel, sorafenib, aprepitant y doxorrubicina Mas preferiblemente, el fármaco es docetaxel (DTX).
El agente de diagnóstico está preferiblemente seleccionado de la lista que comprende: 3-DTTCI (3,3'-dietiltiatricarbocianine yoduro), Rojo Nilo (Nile Red), fluoresceína y rodamina. En otra realización preferida, R es el agente de direccionamiento ACUPA y el fármaco contenido en la nanopartícula es DTX. Aún más preferiblemente, R es el agente de direccionamiento ACUPA, el fármaco es DTX, m = 10, n = 7, p = 19 y q = 3.
Figure imgf000014_0001
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas como se ha definido en el primer aspecto de la invención y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El “vehículo” es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica para diluir cualquiera de los componentes de la misma hasta un volumen o peso determinado; o bien que, aún sin diluir dichos componentes, es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente. El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Por tanto, el término “excipiente” se define como aquella materia que, incluida en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente “farmacéuticamente aceptable” debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes.
Además, como entiende el experto en la materia, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo estén permitidos y evaluados de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
La composición farmacéutica se puede presentar bajo cualquier forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, puede estar en una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, subcutánea, intramuscular, inhalada, tópica o parenteral. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, píldora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. En una realización particular, la composición de la invención se presenta en una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, inhalada o parenteral. La “forma galénica” o “forma farmacéutica” es la disposición a que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combinación de la forma en la que la composición farmacéutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada. Otro aspecto de la presente invención se refiere a la nanopartícula definida en el primer aspecto de la invención, o a la composición farmacéutica que lo comprende, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a la nanopartícula definida en el primer aspecto de la invención, o a la composición farmacéutica que la comprende, para su uso en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cáncer (tumores), por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer linfático, cáncer de hígado, cáncer glial, etc. Más preferiblemente, la nanopartícula, o la composición farmacéutica que la comprende, se usa en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cáncer prostético, hepático o glial.
Otro aspecto de la invención se refiere a la nanopartícula definida en el primer aspecto de la invención, o a la composición farmacéutica que lo comprende, para su uso como sistema de liberación controlada de fármacos.
La expresión "liberación prolongada" se refiere a un periodo de liberación que dura desde varias horas hasta aproximadamente 24 horas, habitualmente hasta aproximadamente 12 horas y con frecuencia entre aproximadamente 4 y 14 horas. El compuesto definido en el primer aspecto de la invención, o la composición farmacéutica que lo comprende, para sus usos como se ha definido previamente, puede administrarse de diferentes formas, por ejemplo, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, subcutánea, intramuscular, inhalada, tópica o parenteral.
En la presente invención, el término “tratamiento” se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
En la presente invención, el término “prevención” se refiere a evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica
Entre las ventajas de las nanopartículas de la presente invención se encuentran las siguientes: i) se trata de nanopartículas orgánicas formadas por auto-asociación de un monómero con estructura bien definida, ii) la sencillez de su síntesis y reproducibilidad iii) tamaño adecuado, iv) permite su síntesis en gran escala, v) permite la liberación controlada de fármacos, vi) presenta biocompatibilidad, etc.
Un último aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de preparación de la nanopartícula definida en el primer aspecto de la invención. Las nanopartículas se pueden obtener mediante la auto-asociación supramolecular de un monómero anfifílico, seguida por una reacción de fotopolimerización mediante una simple irradiación con luz UV. De manera más particular, el procedimiento comprende: i) ultrasonicación en agua, en ausencia total de luz y a temperatura comprendida entre 20 y 25eC, de un monómero de fórmula (II), estando dicho monómero a una concentración superior a su concentración micelar crítica (CMC), concentración a partir de la cual los monómeros forman micelas en contacto con agua,
Figure imgf000018_0001
ii) fotopolimerización de las micelas en agua formadas en la etapa anterior mediante irradiación con luz UV; de manera que los monómeros se unen entre sí formando micelas estables que son las nanopartículas (micelas fotopolimerizadas) de la presente invención como se han definido en el primer aspecto de la invención.
Las micelas formadas en i) se pueden aislar por diálisis durante 48 horas a 250rpm para eliminar los monómeros libres.
La CMC de la micela se calcula previamente utilizando, por ejemplo, un espectrofluorímetro Varían Cary Eclipse a temperatura ambiente, empleando el pireno como sonda fluorescente, tal y como es conocido en el estado de la técnica (véase por ejemplo para el cálculo de CMC: G. Basu Ray, I. Chkraborty, S.P. Moulik, J. Coll. Int. Sci. 2006, 294, 248-254). El procedimiento ya conocido para el cálculo de la CMC comprende la realización de las siguientes etapas:
- preparación de varias disoluciones acuosas del monómero correspondiente a distintas concentraciones, generalmente de entre 0,01 mM y 1mM, manteniendo contante en todas ellas la concentración de pireno (en todas las disoluciones debe haber la misma concentración de pireno), que preferiblemente está entre 0,02mM y 1mM,
- las distintas muestras se excitan a 338nm. La relación entre las intensidades de fluorescencia a 375 nm y 395 nm (picos 1 y 3 del espectro de emisión del pireno) depende de la concentración del monómero y se muestra, alrededor de la CMC, como una curva sigmoidal típica. La representación de la concentración de monómero frente a la relación entre las intensidades de fluorescencia a 375 nm y 395 nm permitirá obtener la CMC del monómero (la CMC será la concentración a partir de la cual la relación de las intensidades comience a variar drásticamente y deje de ser constante). En una realización preferida, la ultrasonicación se lleva a cabo preferiblemente durante un tiempo entre 30 min y 60 min, más preferiblemente durante 40 min.
Preferiblemente, la ultrasonicación se lleva a cabo con una sonda de ultrasonicación (potencia de salida de 125 W) durante 40 min con intervalos de encendido / apagado (on/off) de 5 s.
La fotopolimerización se lleva a cabo preferiblemente mediante excitación del monómero en agua con luz UV a 254 nm.
El procedimiento puede comprender además una etapa adicional iii) de incorporación de un agente activo y/o un agente de diagnóstico en la nanopartícula una vez formada la misma. Esta etapa se lleva a cabo mediante la adición del agente activo y/o un agente de diagnóstico a una solución de nanopartículas fotopolimerizadas obtenidas en ii) en agua y agitación, preferiblemente durante un tiempo comprendido entre 20 y 24h a una temperatura entre 50 y 54eC. La proporción en peso de agente activo o un agente de diagnóstico con respecto a la cantidad de nanopartículas puede variar preferiblemente entre 1 :1 a 2:1 .
Una vez preparadas las nanopartículas (nanomicelas fotopolimerizadas sin incluir agente activo), éstas pueden ser aisladas por filtración y diálisis. Si las nanopartículas (nanomicelas fotopolimerizadas) incluyen un agente activo, éstas se aíslan preferiblemente mediante centrifugación.
En una realización preferida del procedimiento, éste comprende además la liofilización de las nanomicelas fotopolimerizadas obtenidas.
El monómero de fórmula (II) se obtiene llevando a cabo las siguientes etapas de reacción: a) Reacción del compuesto R (agente de direccionamiento), con el siguiente espaciador bifuncional: teniendo el compuesto R protegidos los sus grupos funcionales excepto aquél que va a reaccionar con el espaciador bifuncional, b) Reducción del compuesto obtenido en la etapa a), que comprende una azida, para dar una amina, seguido de una reacción de amidación de la misma con el espaciador bifuncional:
Figure imgf000020_0001
c) Reacción del compuesto obtenido en la etapa b) con el alquino de fórmula
Figure imgf000020_0002
mediante una cicloadición 1 ,3-dipolar de azida y alquino catalizada por cobre (I); d) Desprotección de grupos protectores de R, dando lugar al monómero de fórmula (II):
Figure imgf000020_0003
Un "grupo funcional" es un grupo que se puede usar, en condiciones normales de síntesis orgánica, para formar un enlace covalente entre la estructura a la que está unido y otra estructura, que típicamente contiene otro grupo funcional. El grupo funcional incluye generalmente un grupo carboxílico, heteroátomos, alcano- ó areno- sulfonatos.
Un "grupo protector" de un grupo funcional es un resto que evita o bloquea una reacción particular de ese grupo protector en un proceso particular. El grupo protector estará, por tanto, involucrado en la protección de un grupo funcional y evita la reacción de dicho grupo funcional en ciertos procesos. Los grupos funcionales que pueden protegerse incluyen, a modo de ejemplo, grupos hidroxilo, grupos tiol, ácidos carboxílicos, grupos amino y similares. Los grupos protectores representativos para ácidos carboxílicos incluyen ásteres, amidas e hidrazidas; para grupos amino carbamatos y amidas; para grupos hidroxilo, éteres y ásteres; para grupos tiol, tioéteres y tioésteres y tales grupos protectores son bien conocidos en el estado de la técnica.
En una realización particular en la que R presenta un grupo amino y otros grupos funcionales distintos de amino, se partirá del compuesto R que tenga estos últimos grupos protegidos, mientras que el amino estará libre para reaccionar con el grupo ácido carboxílico del espaciador bifuncional, formando una amida.
En una realización particular en la que R presenta un grupo alcohol (-OH) y otros grupos funcionales distintos de alcohol, se partirá del compuesto R que tenga estos últimos grupos protegidos, mientras que el alcohol estará libre para reaccionar con el grupo ácido carboxílico del espaciador bifuncional, formando un éster.
En una realización particular en la que R presenta grupos funcionales ácido carboxílico y un grupo amino, se partirá del compuesto R que tenga sus grupos ácido protegidos, mientras que el amino estará libre para reaccionar con el espaciador bifuncional. Preferentemente, el grupo ácido carboxílico se protege con un grupo tere-butilo.
En una realización preferida, en la etapa a) se realiza una reacción de amidación entre el compuesto R adecuadamente protegido y el espaciador bifuncional utilizando TBTU (tetrafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) como agente de deshidratación, DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) como base, DMF (N,N- dimetilformamida) como disolvente a temperatura ambiente durante 24 horas, tras las cuales se purifica el producto deseado mediante columna cromatográfica.
En una realización preferida de la etapa b), el producto obtenido en la etapa a) se hidrogena entre 1 y 4 bares durante un periodo de tiempo entre 12 y 24 horas, utilizando paladio sobre carbono como catalizador de la reacción. Seguidamente se vuelve a realizar una reacción de amidación en las mismas condiciones que las descritas en la etapa a).
En una realización preferida de la etapa c), a una disolución de sulfato de cobre (I) y ascorbato sódico en agua destilada se le añade una disolución del producto obtenido en la precedente etapa b) y el derivado del PCDA en diclorometano. La reacción se lleva a cabo en un microondas (Biotage) durante 20-60 minutos a 110eC. Tras ello, se purifica el compuesto mediante columna cromatográfica para la retirada del cobre.
Los valores de n, m, p y q en relación al procedimiento son los mismos que se han indicado previamente en el primer aspecto de la invención. De la misma manera, R tiene la misma significación indicada en el primer aspecto.
Otro aspecto de la invención se refiere a la nanopartícula obtenida por el procedimiento descrito en el anterior aspecto de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Estructura general de la nanopartícula de la presente invención.
Fig. 2. Esquema sintético del compuesto de fórmula 11 (monómero autoorganizable). Fig. 3. Esquema general de la generación de micelas fotopolimerizadas por autoorganización supramolecular y fotopolimerización del monómero 11.
Fig. 4. Estudio de la incorporación de docetaxel por RMN de protón. En el espectro inferior se observa el espectro de las micelas cargadas disueltas en D20, donde no se aprecian las señales características del fármaco. En el espectro central se observa el espectro de las micelas cargadas disueltas en DMSO-d6 (lo cual disgrega las micelas), donde recuadrado se pueden apreciar dichas señales sobre 7-8 ppm.
Fig. 5. Viabilidad celular de LnCAP (línea celular de cáncer de próstata) después del tratamiento con las micelas polimerizadas obtenidas a partir del monómero 11 con ligando (M11) o micelas polimerizadas obtenidas a partir del monómero 12 sin ligando (M12) durante 24 y 48h mediante un ensayo MTT. (a) Micelas vacías; (b) micelas cargadas con docetaxel. Se utilizó docetaxel libre como control positivo (nota: del término “ligando” en los ejemplos y figuras se está refiriendo al agente de direccionamiento R).
Fig. 6. Viabilidad celular de PC3 (línea celular de cáncer de próstata) después del tratamiento con micelas de monómero 11 con ligando o monómero 12 sin ligando durante 24 y 48h mediante un ensayo MTT. (a) micelas vacías; (b) micelas cargadas con docetaxel. Se utilizó PBS y docetaxel libre como control negativo y positivo, respectivamente.
Fig. 7. Imágenes de células LnCAP y PC3 mediante microscopía confocal después de 3h de tratamiento con micelas de monómero 11 con ligando o monómero 12 sin ligando, cargadas con Rojo Nilo (Nile Red) y co-tratado con pseudodipéptido libre.
Fig. 8. Viabilidad celular de BV-2 (líneas celulares de microglía) después del tratamiento con micelas de 11 vacías y cargadas con docetaxel durante 24h mediante un ensayo MTT. Se utilizó PBS y docetaxel libre como control negativo y positivo, respectivamente.
Fig. 9. Imágenes de células BV-2 y microglía primaria mediante microscopía confocal después de 3h de tratamiento con micelas de monómero 11 con ligando o monómero 12 sin ligando cargadas con Nile Red y co-tratado con dipéptido.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.
Materiales y Métodos,
Los productos químicos empleados en esta memoria se compraron de Aldrich Chemical Co. y Carbosynth Co., y se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional. Los disolventes secos se compraron a SDS en grado anhidro y además se secaron en un sistema de purificación de solventes (Puré Solv MD5, Innovative technology). El seguimiento de las reacciones se llevó a cabo mediante cromatografía analítica en capa fina (TLC), empleando láminas de aluminio recubiertas con gel de sílice 60 F254 (fase normal) adquirido de la casa Merck. Las activaciones mediante sonicación se lograron mediante el uso de una punta de sonicación (Qsonica Ultrasonic Liquid Processor, modelo Q500) ó en un baño de agua (Ultrasonik®). Los espectros de RMN se registraron con aparatos DRX-300 (300 MHz), DPX-400 (400 MHz) y DRX-500 (500 MHz). Los disolventes deuterados se indican entre paréntesis. Los espectros se han registrado a partir de muestras en disolución en el disolvente deuterado que se indica entre paréntesis. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm (d), usando como referencia la señal residual del disolvente no deuterado. Para la asignación de las estructuras más complejas se han utilizado experimentos bidimensionales de correlación protón-protón (COSY) y protón-carbono (HETCOR) usando secuencias de pulsos estándar. Los poderes rotatorios [a]20 D se han determinado a temperatura ambiente, utilizando una celda de 10 cm de longitud. El polarímetro utilizado fue de la marca Perkin Elmer 341 MC empleando la línea de emisión de sodio (l= 589 nm) como fuente de luz. Los espectros de UV-Vis se registraron en un espectrómetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda 12, utilizando como disolvente agua milli-Q (18 mW) o DMF comprados a Fluka Chemie en calidad espectroscópica adecuada. Los espectros de masas (EM) se obtuvieron empleando la técnica de ionización por electrospray (ESI) en un espectrómetro Bruker Esquire6000. Para ello se emplearon disoluciones de las muestras en CH2CI2, MeOH, o sus mezclas, a concentración en el rango mM. Las muestras se introdujeron mediante inyección directa usando una jeringa Cole-Palmer a un flujo de 120 pL/h. Los espectros de masas de alta resolución (EMAR) fueron realizados en un espectrómetro Kratos MS-80-RFA y en un espectrómetro de masas Micromass modelo AutoSpec. Los espectros de fluorescencia fueron realizados en un Jobin Yvon FLUOROLOG FL3- 11 fluorimeter equipado con dos monocromadores, a una longitud de onda de excitación 345 nm. Las micrografías obtenidas del microscopio electrónico de transmisión (TEM) se obtuvieron en un microscopio Philips CM10 trabajando a 80 kV,) El tamaño de partícula y la distribución de las micelas se midieron usando un aparato Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Se usó un rayo láser a una longitud de onda de 632,8 nm. El ángulo de dispersión se ajustó a 90e cuando se realizaron las mediciones. Ejemplo 1 : Síntesis del agente de direccionamieto ACUPA adecuadamente funcionalizado. Síntesis del compuesto 1.
Figure imgf000025_0001
A una disolución de trifosgeno (77 mg, 0,27 mmol) en CH2CI2 anhidro (1 ,38 mi), en agitación y a 0°C, se añadió una mezcla de un derivado del aminoácido lisina (250 mg, 0,67 mmol) en CH2CI2 (1 ,38 mi) y diisopropil etil amina (a partir de ahora referido como DIPEA; 0,3 mi) gota a gota.
Transcurrida 1 hora y 45 minutos, se preparó en otro matraz una mezcla de un derivado del aminoácido glutamato (198 mg, 0,67 mmol) en CH2CI2 (1 ,38 mi) y DIPEA (0,3 mi). Se dejó en agitación durante 45 minutos, tras los cuales se añadió al matraz de la reacción mediante una cánula. Tras la adición se retiró el baño de hielo y la reacción tuvo lugar a temperatura ambiente durante 2 horas y media.
Tras ello se evaporó el disolvente a vacío. La mezcla se lavó con CH2CI2 (30 mi) y se separaron las fases utilizando KHS0 2M (2 x 15 mi) y una disolución saturada de NaCI (15 mi). Tras secado de la fase orgánica sobre Na S0 anhidro, se filtró y evaporó el disolvente a presión reducida en un rotavapor, obteniéndose un crudo del cual se aisló el producto deseado mediante columna cromatográfica usando como mezcla de eluyentes AcOEt:Hex (1 :2). Se obtuvo 1 con un rendimiento del 72% (300mg).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7,38 (d, J = 4,4 Hz, 2H, C6H5), 7,36-7,30 (m, 3H, C6H5), 5,32 (s, 2H, CH2C6H5), 5,23-5,17 (d, J = 8,08Hz, 1 H, NHCONH), 5,14-5,10 (d, J = 5,17Hz, 1 H, NHCONH), 5,17-5,07 (m, 1 H, CH2NHCbz), 4,39-4,31 (m, 2H, NHCHCO), 3,25-3,15 (m, 2H, CH2NHCBz), 2,41 -2,23 (m, 4H, CHsCHsCOstBu), 1 ,93-1 ,75 (m, 2H, CH2(CH2)3NHCbz), 1 ,58-1 ,33 (m, CH2CH2NHCBZ), 1 ,48 (s, 9H, t-Bu), 1 ,474 (s, 9H, tBu), 1 ,458 (s, 9H, tBu), 1 ,31 -1 ,26 (m, 2H, OH2(OH2)2NHOBz).
13C RMN (100 MHz, CDCI3): d 172,5, 172,4, 172,2 (C02tBu), 156,8 (NHCONH), 156,6 (NHCO), 136,7, 128,5, 128,1 , 128,0 (C6H5), 82,1 , 81 ,8, 80,6 (C(CH3)3), 66,6 (NHC02CH2C6H5), 53,3, 53,1 (NHCHC02tBu), 40,6 (CH2NHCbz), 32,7 28,36
Figure imgf000026_0001
A una disolución de 1 (322 mg, 0,52 mmol) en EtOH (8,62 mi) se añadieron formiato de amonio (328 mg, 5,2 mmol) y Pd (C) (55,3 mg, 0,052 mmol). La reacción se agitó ocasionalmente durante 2 horas.
Una vez comprobamos que la reacción había terminado, pasamos la mezcla por una placa filtrante con Celita®545, añadiendo una gran cantidad de CH2CI2 repetidamente para que se filtrase el compuesto en su totalidad. Al no quedar rastros de producto de partida ni productos secundarios, no hubo necesidad de purificar en columna cromatográfica. Se obtuvo 2 con un rendimiento cuantitativo (310mg).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 6 6,05-5,98 (d, J=7,61 Hz, NHCONH), 5,97-5,91 (d, J=8,23Hz, NHCONH), 4,39-4,26 (m, 2H, NHCHC02tBu), 3,02-2,90 (m, 2H, CH2NH2), 2,42-2,26 (m, 4H, CH2CH2C02tBu), 2,14-2,01 (m, 2H, CH2(CH2)3NH2), 1 ,92-1 ,80 (m, 2H, CH2CH2NH2), 1 ,77-1 ,61 (m, 2H, NH2), 1 ,45 (s, 18H, tBu), 1 ,43 (s, 9H, tBu), 1 ,39- 1 ,22 (m, 2H, CH2(CH2)2NH2).
13C RMN (100 MHz, CDCI3): 6173,19, 172,74, 172,44 (C02tBu), 157,48 (NHCONH), 82,07, 81 ,58, 80,54 (C(CH3)3), 53,31 , 52,90 (NHCHC02tBu), 39,90 (CH2NH2), 31 ,74 (CH2CH2C02tBu), 31 ,68 (CH2(CH2)3NH2; CH2C02tBu), 29,70 (CH2CH2NH2), 28,09, 28,04 (C(CH3)3), 22,69 (CH2CH2C02tBu), 21 ,97 (CH2(CH2)2NH2).
EMAR (El): calculado para C2 H4607N3 m/z 488,3330; encontrado 488,3323. Ejemplo 2: Síntesis de los espaciadores bifuncionales
Ejemplo representativo: Síntesis de COOH-PEG4-N3 Síntesis del compuesto 3.
Figure imgf000027_0001
Sobre una solución de tetraetilenglicol (n = 3) (22,7 mi, 140 mmol) en tetrahidrofurano (a partir de ahora referido como THF; 100 mi) y E N anhidro (15 mi), se adicionó gota a gota y a 0°C MsCI (10,8 mi, 140 mmol). Seguidamente, se dejó que la reacción alcanzara la temperatura ambiente, continuándose la agitación durante toda la noche. Tras ello se evaporó el THF a presión reducida. Se añadió CH2CI2 hasta disolver bien el compuesto y se separaron las fases orgánica y acuosa con NH4CI (30ml) y NaCI (30ml). La fase orgánica se secó sobre Na S0 anhidro, se filtró y evaporó, purificándose el derivado deseado por columna cromatográfica con OH2OI :MbOH (40:1) como eluyentes. Así, se obtuvo 3 como un sirupo amarillo y con un rendimiento del 33% (12,45 g).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 4,41-4,35 (m, 2H, CH2OMs), 3,81-3,60 (m, 14H), 3,09 (s, 3H, CH2OSO2CH3), 2,97 (sa, 1 H, OH).
13C RMN (100,6 MHz, CDCI3): d 72,5 (H0CH2CH20), 70,4, 70,3, 70,1 , 69,4, 69,3, 69,0 (CH2CH2OMS), 61 ,6 (COH), 37,6 (OSO2CH3).
EMAR (El): Calculado para Cg^oO SNa 273,1008 [M+Na]+, encontrado 273,0997.
Síntesis del compuesto 4.
Figure imgf000027_0002
A una disolución de 3 (n = 3) (12,45 g, 45,7 mmol) en EtOH 95% (76,35 mi) se le añadió NaN3 (3,56 g, 54,84 mmol), y se mantuvo en agitación a reflujo (80°C) durante toda la noche. Posteriormente, se neutralizó la mezcla con una disolución saturada de NaCI (50 mi), extrayéndose la fase acuosa con éter etílico (100 mi). Los extractos orgánicos se reunieron y secaron sobre Na S04 anhidro. Tras la filtración del mismo y evaporación del disolvente a vacío, se purificó el compuesto mediante columna cromatográfica, usando como eluyentes Hex:AcOEt (1 :1), en primer lugar, y AcOEt (1) con posterioridad. Siguiendo este procedimiento se aisló 4 como un sirope con rendimiento del 86% (8,57g).
La síntesis del compuesto 4a (n = 19), se ha llevado a cabo siguiendo la misma ruta sintética partiendo del correspondiente mesilato 3a (n = 19)
1H RMN (500 MHz, CDCI3): d 3,58 (t, 2H, J = 4,8 Hz, HOCH2CH2), 3,55-3,51 (m, 10H, 5 CH20), 3,46 (t, 2H, J = 4,8 Hz, OCH2CH2N3), 3,26 (t, 2H, J = 4,8 Hz, CH2CH2N3), 3,10 (sa, 1 H, OH).
13C RMN (125,7 MHz, CDCI3): d 72,5 (H0CH2CH20), 70,6, 70,5, 70,4, 70,2, 69,9 (CH20), 61 ,5 (COH), 50,5 (CN3).
EMAR (El): Calculado para C8Hi7N30 Na 220,1297 [M+Na]+, encontrado 220,1288.
Síntesis del compuesto 5.
Figure imgf000028_0001
Se agitó una disolución de NaH (9,5 g, 395 mmol) en 20 mi de hexano durante 5 minutos, pasados los cuales se dejó que se asentase durante un tiempo el NaH. El hexano se recogió cuidadosamente con una jeringuilla y lo que no se pudo retirar mediante este método se eliminó mediante vacío y decapador por aire caliente a potencia media. Una vez retirado el hexano, se añadió THF seco (197,5 mi) por goteo mediante un embudo de adición. A esta disolución se le añadió por goteo, con la ayuda de un embudo de adición, una disolución del alcohol azida 4 (n = 2) (8,57 g,
39,09 mmol) en THF seco (197,5 mi). Tras agitar la disolución a temperatura ambiente durante una hora, se añadió por goteo, con la ayuda de un embudo de adición, una disolución de ácido bromoacético (11 ,1 g, 79 mmol) en THF seco (197,5 mi). La reacción se dejó en agitación durante 24 horas, pasadas las cuales se añadió agua destilada (50 mi) para destruir el exceso de NaH, seguida de evaporación del THF. Se acidificó la fase acuosa obtenida con una disolución de HCI 1M (25 mi), y se extrajo con CH2CI2. Tras secar los extractos orgánicos sobre Na2S04 anhidro, filtrar y evaporar el disolvente, el crudo obtenido fue purificado mediante columna cromatográfica, usando como mezcla de eluyentes CH2CI2:MeOH (40:1), obteniéndose el compuesto 5 (n = 3) como un sirope claro con rendimiento del 57% (6,26 g). 1H RMN (500 MHz, CDCI3): d 9,30 (sa, 1 H, COOH), 4,15 (s, 2H, CH2COOH), 3,80-3,60 (m, 10H, OCH2), 3,29 (t, 2H, J = 4,5 Hz, CH2N3).
13C RMN (125,7 MHz, CDCI3): d 173,5 (CO), 70,9 (CH2COOH), 70,4, 70,3, 70,2, 69,9, 68,3 (OCH2CH2N3), 50,5 (CN3).
EMAR (El): Calculado para C8H16N3O5 234,1089 [M+H]+, encontrado 234,1085.
Ejemplo 3: Síntesis del monómero auto-orqanizable 11.
Síntesis del compuesto 6.
Figure imgf000029_0001
Una disolución del espaciador 5 (45,5 mg, 0,21 mmol), 0-(Benzotriazol-1 -il)-N,N,N’,N’- tetrametiluronio tetrafluoroborato (a partir de ahora referido como TBTU; 44,5 mg, 0,19 mmol) y DIPEA (0,03 mi) en dimetilformamida seca (a partir de ahora referida como DMF; 0,5 mi) se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, se adicionó una disolución de 2 (97 mg, 0,19 mmol) y DIPEA (0,03 mi) en DMF (0,5 mi). La mezcla se dejó en agitación durante 24 horas.
Se evaporó la DMF empleando una bomba de vacío. Una vez evaporada la DMF se añadió CH2CI2 (10 mi) y se lavó, en este orden, con una disolución de HCI 1 M (15 mi), una disolución acuosa saturada de NaHC0 (15 mi) y una disolución saturada de NaCI (15 mi). Los extractos orgánicos reunidos se secaron con Na S0 anhidro. Una vez filtrado y evaporado el disolvente, se purificó el producto deseado por cromatografía en columna, usando como mezcla de eluyentes CFkC^MeOH (20:1), obteniéndose 6 con un rendimiento del 76% (111 ,2mg).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7,15-7,08 (t, J=5,50Hz, 1 H, NHCOCH2O), 5,379-5,34 (d, J=7,57Hz, NHCONH), 5,30-5,24 (d, J=7,89Hz, NHCONH), 4,40-4,25 (m, 2H, NHCHC02tBu), 4,07 (s, 2H, NHCOCJHsO), 3,74-3,66 (m, 12H, 0(CH2)20), 3,44-3,38 (t, A una disolución de 6 (111 ,2 mg, 0,144 mmol) en CH2CI2 (7,7 mi), contenida en un Fisher-Porter, se le añadió Pd (C) (15,3 mg, 0,0144 mmol) y se dejó en agitación durante 24 horas bajo presión de H2 (4 bar).
La mezcla se filtró mediante una placa filtrante con Celita®545, añadiendo una cantidad abundante de CH2CI2 repetidamente para que se filtrase en su totalidad. Tras la filtración, se obtuvo 7 con un rendimiento cuantitativo (126mg).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 7,63-7,55 (t, J=5,60Hz, ,1 H, NHCO), 6,49-6,45 (d, J=7,67Hz, NHCONH), 6,38-6,34 (d, J=8,12Hz, NHCONH), 4,36-4,22 (m, 2H, NHCHC02tBu), 4,08 (s, 2H, NHCOCJHsO), 3, 9-3, 8 (t, J=4,72Hz, 2H, OCH2CH2NH2), 3,75-3,6 (m, 12H, 0(CH2)20), 3,43-3,33 (m, 2H, OCH2CJH2NH2), 3,30-3,18 (m, 2H, CH2NHC0CH20), 2,15-2,04 (m, 4H, CH2CH2C02tBu), 1 ,93-1 ,78 (m, 2H,
CH2(CH2)3NHCO), 1 ,77-1 ,61 (m, 2H, NH2), 1 ,61-1 ,5 (m, 2H, CJiCH2NHCO), 1 ,44 (s, 9H, tBu), 1 ,43 (s, 9H, tBu), 1 . 42 (s, 9H, tBu), 1 ,29-1 ,19 (m, 2H, CH^CH^NHCO).
13C RMN (100 MHz, CDCI3): d 173,0, 172,4 (C02tBu), 170,7 (NHCO), 157,8
Figure imgf000031_0001
Se agitó durante 5 minutos una disolución del espaciador bifuncional 5a (n = 19) (270 mg, 0,275 mmol), TBTU (58,5mg, 0,25 mmol) y DIPEA (0,06 mi) en DMF seca (0,6 mi). Tras ello, se le adicionó una disolución de 7 (180 mg, 0,25 mmol) y DIPEA (0,06 mi) en DMF (0,6 mi). Se dejó en agitación durante toda la noche.
Transcurrido ese tiempo, se evaporó la DMF empleando una bomba de vacío y se purificó el producto mediante una columna cromatográfica (mezcla de eluyentes CH2CI2:MeOH 40:1 , aumentando paulatinamente la proporción de metanol). Se obtuvo 8 con un rendimiento del 42,78% (198 mg).
1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8,05-7,98 (m, 2H, NHCO), 7,90-7,85 (d, 1 H, J=7,97Hz, NHCONH), 7,79-7,73 (d, 1 H, J=7,97Hz, NHCONH), 4,25-4,12 (m, 2H, NHCHC02tBu), 4,04 (s, 2H, NHCOCH20), 4,01 (s, 2H, NHCOCH20), 3,87-3,82 (OCH2CH2NHCO), 3,71 (s, 12H, 0(CH2)20), 3,67 (s, 76H, 0(CH2)20), 3,52-3,45 (m, 2H, OCH2CH2N3), 3,43-3,38 (m, 2H, OCH2CH2NHCO), 3,31-3,22 (m, 2H, CJi>NHCOCH20), 2,43-2,25 (m,
Figure imgf000031_0002
13C RMN (100 MHz, CDCI3): d 172,5, 172,3, 172,0 (C02tBu), 171 ,5, 171 ,3 (NHCO), 158,5 (NHCONH), 81 ,4, 81 ,1 , 80,3 (C(CH3)3), 70,55, 70,52 (NHCOCH2O), 70,2 (0(CH2)20), 70,0 (OCH2CH2N3), 69,8 (NHC0CH20CH2CH20), 69,7
(NHC0CH20CH2CH20), 69,4 (NHC0CH20CH2CH20), 53,5, 52,7 (NHCHC02tBu), 50,4 (OCH2CH2N3), 38,4 (OCH2NHCO), 38,2 (CH2NHCO), 31 ,8 (CH2CH2C02tBu), 31 ,1 (CH2(CH2)3NHCO), 28,8 (CH2CH2NHCO), 27,0 (C(CH3)3), 22,5 (CH2CH2C02tBu), 17,3 (CH2(CH2)2NHCO).
EMAR (El): calculado para C76Hi45033N7Na m/z 1706,9776; encontrado 1706,9770.
Figure imgf000032_0001
Se agitó una disolución de ácido 10,12-pentacosadiinoico (1000 mg, 2,6 mmol) y 4- dimetilaminopiridina (DMAP; 32 mg, 0,26 mmol) en CH2CI2 anhidro (16 mi) y N,N’- diisopropilcarbodiimida (DIPC; 462 pl) durante 5 minutos, pasados los cuales se añadió la propargilamina (166 pl). La reacción se dejó en agitación durante 24 horas.
El producto se purificó por columna cromatográfica con una mezcla de eluyentes Hexano:AcOEt 5:1 . Se obtuvo 9 con un rendimiento del 94% (939,6 mg).
1H RMN (500 MHz, CDCI3): d 5,50 (sa, 1 H, NHCO), 4,06-4,04 (m, 2H, CH2NHCO), 2,23 (t, 4H, J = 6,9 Hz, 2 CH2CºC), 2,18 (t, 2H, J = 7,6 Hz, COCH2CH2), 1 ,64-1 ,60 (m, 2H, COCH2CH2), 1 ,52-1 ,47 (m, 4H, 2 CH2CH2CºC), 1,40-1 ,25 (m, 26H, 13 CH2), 0,88 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH3CH2).
13C RMN (125,7 MHz, CDCI3): d 172,6 (CO), 79,7 (HCºC), 77,6 (CH^CEC), 77,4 (CH2CºC), 71,6 (HCºC), 65,3 (CH2CºC), 65,2 (CH2CºC), 36,5 (NHCOCH2), 31 ,9 (CH2CH2CH3), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2, 29,1 , 28,9, 28,7, 28,4, 28,3, 25,5 (COCHsCHs), 22,6 (CH2CH3), 19,2 (CH2CºC), 19,1 (CH2CºC), 14,1 (CH3CH2).
EMAR (El): Calculado para C28H45NONa 434,3398 [M+Na]+, encontrado 434,3394. Síntesis del compuesto 10.
Figure imgf000033_0001
Se añadió una disolución de CuS0 (1 ,45 mg, 0,009 mmol) y ascorbato sódico (5,35 mg, 0,027 mmol) en H20 destilada (0,6 mi) a un tubo de microondas. A esta disolución se le añadió otra disolución de 8 (110 mg, 0,06 mmol) y 9 (24 mg, 0,072 mmol) en CH2CI2 (0,06 mi). La reacción “click” se dejó en agitación durante una hora (periodos de 15min hasta no ver producto de partida) a 110eC en el microondas. Se purificó el producto deseado por cromatografía en columna, usando como mezcla de eluyentes CH2Cl2:MeOH en gradiente (20:1 > 15:1 > 9:1), obteniéndose 10 con un rendimiento cuantitativo (140mg).
1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8,28-8,22 (m, 1 H, NHCO), 7,86 (s, 1 H, NCHC), 7,72- 7,60 (m, 2H, NHCO), 6,33-6,24 (t, 1 H, J=10,25Hz, NHCONH), 5,76 (s, 1 H, NHCONH),
4,53-4,46 (m, 2H, NHCHC02tBu), 4,30-4,26 (m, 2H, CCH2NHCO), 4,09-4,00 (m, 2H, OCH2CH2N), 4,00-3,92 (OCH2CH2N), 3,88 (s, 1 H, NHCOCH2O), 3,86 (s, 1 H, NHCOCH2O), 3,83-3,77 (m, 2H, OCH2CH2NHCO), 3,59-3,47 (m, 88H, 0(CH2)20), 3,20-3,16 (m, 2H, OCH2CH2NHCO), 3,13-3,05 (m, CH2NHC0CH20), 2,69 (s, 2H, CH2CºC), 2,34 (s, 2H, CºCCH2), 2,31-2,18 (m, 4H, CH2CH2C02tBu), 2,13-2,03 (t, J=6,61 Hz, 2H, NHCOCH2CH2), 1 ,94-1 ,82 (m, 2H, CH^CH^NHCO), 1 ,74-1 ,56 (m, 4H, CH2CH2NHCO), 1 ,56-1 ,37 (m, 4H, CH2CH2ºCCºCH2CH2), 1 ,40 (s, 27H, tBu), 1 ,36- 1 ,19 (m, 2H, CH2(CH2)2NHCO), 1 ,25 (s, 26H, CH2), 0,9-0,84 (t, J=7,08Hz, 3H, CH3).
13C RMN (100 MHz, CDCI3): d 172,5, 172,3 (C02tBu), 172,0, 171 ,5, 171 ,3 (NHCO),
158.5 (NHCONH), 131 ,0 (N3CHC), 128,5 (N3CHC), 81 ,4, 81 ,1 , 80,3 (C(CH3)3), 76,6,
76.5 (CH2CºCCºCCH2), 70,5, 70,4 (NHCOCH2O), 70,0, 69,9 (0(CH2)20), 69,8 (NHC0CH20(CH2)20), 69,4 (OCH2CH2N), 65,1 (CH2CºCCºCCH2), 54,5 (OCH2CH2N), 53,5, 52,7 (NHCHC02tBu), 42,5, 38,5, 38,3 (CH2NHCO), 35,1 (CCH2NHCOCH2), 31 ,8 (CH2CH2CH3), 31 ,7 (CH2CH2C02tBu), 31 ,1 (CH2(CH2)3NHCO), 29,4 (CH2CH2NHCO),
29,3, 29,2, 29,1 , 28,9, 28,79, 28,76, 28,68, 28,5, 28,48, 28,2, 27,7 (CH2), 27,02, 27,00,
26,98 (C(CH3)3), 25,5 (CH2CH2C02tBu), 22,5 (CH2CH3), 22,4 (CH2(CH2)2NHCO), 18,4
(CH2CºCCºCCH2), 13,1 (CH3). EMAR (El): calculated for Cio4Hi9o034N8Na m/z 2118,3277; found 2118,3241.
Síntesis del compuesto 11.
Figure imgf000034_0001
Se añadió ácido trifluoroacético (1 mi) a una disolución de 10 (134,3 mg, 0,064 mmol) en CH2CI2 (2,06 mi) en un tubo de microondas. Se mantuvo en agitación en un microondas Biotage a 70eC durante 25 minutos. Se obtuvo 11 con un rendimiento cuantitativo (141 ,3 mg).
1H RMN (400 MHz, CD3OD): d 8,27-8,21 (m, 1 H, NHCO), 7,87 (s, 1 H, NCHC), 7,75- 7,60 (m, 2H, NHCO), 6,36-6,26 (m, 1 H, NHCONH), 5,76 (s, 1 H, NHCONH), 4,53-4,43 (m, 2H, NHCHCO2H), 4,31 -4,23 (m, 2H, CCH2NHCO), 4,15-4,07 (m, 2H, OCH2CH2N), 4,07-4,00 (m, 2H, OCH2CH2N), 3,88 (s, 1 H, NHCOCH2O), 3,86 (s, 1 H, NHCOCH2O), 3,83-3,77 (t, J=4,98Hz, 2H, OCH2CH2NHCO), 3,59-3,48 (m, 88H, 0(CH2)20), 3,30-3,24 (m, 2H, OCH2CH2NHCO), 3,13-3,05 (m, CH2NHC0CH20), 2,69 (s, 2H, CH2CºC), 2,34 (s, 2H, CºCCH2), 2,31-2,18 (m, 4H, CH2CH2C02H), 2,13-2,03 (t, J=7,48Hz, 2H, NHCOCH2CH2), 2,03-1 ,85 (m, 2H, CH2(CH2)3NHCO), 1 ,84-1 ,59 (m, 4H,
CH2CH2NHCO), 1 ,58-1 ,37 (m, 4H, CH2CH2CºCCºCCH2CH2), 1 ,36-1 ,22 (m, 2H, CH2(CH2)2NHCO), 1 ,25 (s, 26H, CH2), 0,9-0,84 (t, J=6,56Hz, 3H, CH3).
13C RMN (100 MHz, CDCI3): d 175,0, 174,6, 174,2 (C02H), 172,5, 169,7, 169,5 (NHCO), 157,7 (NHCONH), 132,2 (N3CHC), 123,9 (N3CHC), 78,4 (CH2CºCCºCCH2), 70,7 (NHCOCH2O), 70,4, 70,2 (0(CH2)20), 70,1 (NHC0CH20(CH2)20), 70,0
(OCH2CH2N), 65,8 (CH2CºCCºCCH2), 55,4 (OCH2CH2N), 52,8, 52,1 (NHCHCO2H), 38,4, 38,3, 35,7 (CH2NHCO), 34,6 (CCH2NHCOCH2), 32,3 (CH2CH2CH3), 32,0 (CH2(CH2)3NHCO), 31 ,8 (CH2CH2CO2H), 30,4 (CH2CH2NHCO), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1 , 28,8, 28,7, 28,6, 28,2, 28,1 , 28,0 (CH2), 25,6 (CH2CH2C02H), 23,0 (CH2CH3), 22,5 (CH2(CH2)2NHCO), 18,7 (CH2CºCCºCCH2), 14,4 (CH3).
EMAR (El): calculado para C92Hi66034N8Na m/z 1950,1399; encontrado 1950,1369 En la figura 2 se muestra el esquema de la síntesis del monómero 11 .
Ejemplo 4: Síntesis del monómero auto-orqanizable 12.
Síntesis del compuesto 12 A una disolución de sulfato de cobre (2,5mg, 0,02mmol) y ascorbato sódico (9mg, 0,05mmol) en agua destilada (1 ,1 ml_) se añadió una disolución 4a (n = 19) (100mg, O.U mmol) y el derivado de PCDA 9 (43mg, 0.13mmol) en diclorometano (1.1 ml_). Se mantuvo en agitación a 110°C en un microondas Biotage durante 30 minutos, tras los cuales se pasó a la purificación mediante columna cromatográfica con una mezcla de eluyentes CH2CI2:MeOH (20:1), obteniéndose 12 con una rendimiento del 94,04% (138mg).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d 8.26 (t, 1 H, J = 5.2Hz, NHCO), 7.86 (s, 1 H, H Triazol), 4.60 (t, 1 H, J = 5.0Hz, OH), 4.49 (t, 2H, J = 5.1 Hz, CH2N-Triazol), 4.28 (d, 2H, J = 5.1 Hz, Triazol-CH2NHCO), 3.80 (t, 2H, J = 5.2Hz, ChbCHsN-Tñazol), 3.71 -3.67 (m, HOCH2), 358-352 (m, 74H, 37 CH20), 2.27 EC), 2.08 (t, 2H, J = 7.3Hz, CH2NHCO), 1.49-1.43 (m, 6H, CO
Figure imgf000036_0001
1.25 (m, 26H, 13
CH2), 0.86 (t, 3H, J = 6.8Hz, CH3).
13C RMN (100 MHz, DMSO-d6): d 172,5 (CO), 145,4 (C Triazol), 123,6 (CH Triazol), 78,5 (CH2CºC), 72,8, 70,2, 69,2 (CH20), 65,8 (CH2CºC), 60,7 (CH2OH), 49,7 (CH2N- Triazol), 35,7, 34,5 (CH2NHCO), 31 ,8 (CH2CH2CH3), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1 , 28,8, 28,7, 28,6, 28,2, 28,1 (CH2), 25,7 (CH2CH2CO), 22,6 (CH2CH3), 18,7 (CH2CºC), 14,4 (CH3).
EMAR (El): calculado para C68Hi2602iN4Na 1357,8807 [M+Na]+; encontrado 1357,8802.
Ejemplo 5: Síntesis v Caracterización de las micelas fotopolimerizadas a partir de los monómeros 11 y 12
5.1. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC). La CMC es la concentración a partir de la cual los monómeros tipo 11 y 12 forman micelas de manera espontánea al contacto con el agua.
Las medidas para estimar la Concentración Micelar Crítica (CMC) se realizaron en un espectrofluorímetro Varían Cary Eclipse a temperatura ambiente. Se utilizó el pireno como agente de fluorescencia hidrofóbico, que sería englobado por las micelas. Se prepararon muestras con diferentes concentraciones micelares (la concentración de pireno se mantiene constante: 0,2 mM).
Las distintas muestras fueron excitadas a 338nm. La relación entre las intensidades de fluorescencia a 375 nm y 395 nm (picos 1 y 3 del espectro de excitación del pireno) depende de la concentración total micelar y se muestra, alrededor de la CMC, como una curva sigmoidal típica. Esta curva fue posteriormente procesada para obtener la CMC.
5.2. Formación de las nanomicelas polimerizadas.
Una vez conocida las CMC de los monómeros 11 (363 mM) y 12 (233 mM) se llevó a cabo la formación de las nanomicelas (figura 3). Para ello, se disolvió una cantidad determinada de los monómeros 11 y 12, superior a la CMC, en agua milliQ. Esta disolución se sometió a ultrasonicación durante 30 minutos a un 20% de amplitud bajo oscuridad total. Tras ello, la disolución micelar se dializó durante 48 horas a 250rpm para eliminar los monómeros libres, y se analizaron las micelas sin polimerizar por DLS y TEM. Tras el análisis por DLS y TEM de las micelas no polimerizadas, se mantuvieron durante 3 horas bajo luz ultravioleta para su polimerización (254nm). Teniendo en cuenta que la polimerización no necesita ningún catalizador ni iniciador, las micelas polimerizadas se obtienen puras y no necesitan de ninguna etapa adicional de purificación. Las micelas polimerizadas se volvieron a analizar DLS y TEM. 5.3. Ensayos de estabilización micelar.
El principal problema que presentan las nanomicelas no polimerizadas es su alta tendencia a la dilución. Esto se ha solventado con la polimerización de la función dialquino del ácido 10,12-pentacosadiinoico. Para comprobar si esta estrategia es efectiva, se han formado micelas en tampón PBS pH7,4 (0,1 M) y se analizaron por DLS y TEM cada semana hasta el mes de estudio). Tras ello, se volvieron a analizar a los 3 y 6 meses. A su vez, se formaron micelas por encima de la CMC y se diluyeron muy por debajo de ésta para ver si las micelas eran estables en el medio independientemente de su concentración.
Por último, las micelas ya polimerizadas fueron sometidas a altas temperaturas (80eC y 100eC) para ver si la estructura sufría alguna alteración debido a este cambio de temperatura).
Como conclusión de este estudio es la alta estabilidad de las micelas polimerizadas frente a dilución y su idoneidad como agente de transporte de fármacos, en comparación con las micelas no polimerizadas.
Ejemplo 6: Estudios de Incorporación v liberación de Fármacos v Agentes de
Imagen.
Se estudió la incorporación y liberación de distintos fármacos (Docetaxel, Sorafenib, Aprepitant, Camptotecina) y agentes de diagnóstico ((3,3'-Dietilltiatricarbocianine ioduro), abreviado como DTTCI, y Rojo Nilo).
Para ello, se añadió el compuesto deseado (sorafenib: 1 ,54 mg/ml; docetaxel: 1 ,29 mg/m;l camptotecina: 0,72 mg/ml ó aprepitant: 1 ,43 mg/ml) a una disolución de nanomicelas (polimerizadas) 1 ,25mM en agua miliQ y se mantuvo en agitación durante 24h a 54°C. La disolución obtenida se centrifugó a 1500rpm durante 45 minutos, se separó el sobrenadante (nanomicelas polimerizadas con el fármaco o agente de diagnóstico incorporado) del precipitado (agente de diagnóstico o fármaco no incorporado) y se liofilizaron las muestras en un liofilizador (llshin BioBase, Freeze Dryer) a -70°C. La incorporación del fármaco se verificó por 1H RMN, utilizando como disolventes D20 y DMSO. La cantidad de fármaco incorporado se determinó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). En la figura 4 podemos apreciar la comprobación de la incorporación de docetaxel por RMN de protón. En primer lugar, se analizan las nanomicelas cargadas en agua deuterada, donde el fármaco debe estar dentro del núcleo hidrofóbico de la micela y no deberían verse las señales de protón del fármaco. Posteriormente se hace en dimetilsulfóxico deuterado, que desintegra las micelas y sale el fármaco de su interior, por lo que deberían verse las señales de protón de éste.
El principal problema que presenta la administración de estos fármacos es su baja solubilidad en agua, ya que son compuestos hidrófobos, y por tanto, se necesitan dosis altas de fármaco para obtener una biodisponibilidad adecuada. El diseño de las nanopartículas de la presente invención permite la incorporación de fármacos hidrófobos en su interior, aislándolos del entorno hidrófilo del medio, mejorando su solubilidad. De este modo, se podría reducir la dosis administrada de fármaco y se conseguiría minimizar los efectos secundarios de estos.
El contenido de fármaco de las nanomicelas cargadas (drug-loading content ,-DL) y la eficiencia de encapsulación (EE) fue determinada por HPLC siguiendo las siguientes ecuaciones:
Cantidad de fármaco añadido
DL (%) = - - - xlOO
Cantidad del monómero + Cantidad de fármaco en la NP
Carqa real de fármaco EE (%) = Carga teórica de fármaco*100 Las nanomicelas pueden ser saturadas de fármaco, lo cual provoca la liberación inmediata de la mayoría de su contenido por el denominado ‘efecto Burst’, por el cual el fármaco que esté interaccionando de manera más débil con el núcleo hidrofóbico de la nanopartícula se liberará de forma pulsátil, o pueden ser cargadas con una pequeña cantidad de fármaco, con el cual se obtienen unos perfiles de liberación controlada y sostenida en el tiempo. Para ambos tipos de carga, la eficiencia de encapsulación de docetaxel es del 22%, de sorafenib el 25%, de aprepitant el 20,5% y de camptotecina el 9,4% mientras que el contenido de fármaco depende de las concentraciones de nanomicelas y fármaco que se utilice. Una vez obtenidas las nanomicelas cargadas se estudió el perfil de liberación de estos fármacos a dos pHs distintos (tampón PBS pH7,4; 0,1 M y tampón acetato pH5,0 0,1 M) utilizando el método de diálisis. Sería interesante que el perfil de liberación fuese más acentuado a pH ácido, al ser el pH al que se encuentra el ambiente tumoral. La cuantificación se llevó a cabo por HPLC. La disolución de nanomicelas con el agente incorporado se transfirió a 8 tubos de diálisis (3500Da), los cuales se pusieron a dializar en tampón PBS (pH7,4; 0,1 M, t.a.) o tampón acetato (pH5,0: 0,1 M, t.a.) durante una semana con agitación continua (100rpm). A determinados tiempos (t0, 0,25; 0,5; 1 ; 5; 10; 24; 72; 168h) se retiró la totalidad de la muestra del tubo de diálisis seleccionado, se añadieron 200mI DMSO para romper las nanomicelas y se cuantificó la cantidad de fármaco restante en el interior de éstas por HPLC. Se usó un detector UV/Vis (Waters 996 Photodiode Array Detector) ajustado a una longitud de onda de 254nm. Se utilizó una columna Cíe (5pm, 4,6 x 150mm) y como fase móvil una mezcla 50% acetonitrilo-0,1%TFA y 30% H20-0,05%TFA con un caudal de 1ml/min para el caso del docetaxel, sorafenib y aprepitant y 30% acetonitrilo-0,1%TFA y 70% H20- 0,05%TFA para la camptotecina. La temperatura de la columna fue de 30°C. Se inyectaron 10mI, 30mI o 50mI de la muestra en la columna.
Se muestra el perfil de liberación de docetaxel desde el interior de una nanomicela a pH neutro (figura 9) y la liberación de sorafenib en función del pH (figura 10).
Ejemplo 7: Ensayos de Crecimiento Celular 7.1. Líneas celulares y cultivo.
En este trabajo se utilizaron las líneas celulares de cáncer de próstata LnCAP y PC3 y las líneas celulares de microglía SIM-A9 y BV-2. Las células LnCAP y PC3 se cultivaron en medio RPMI1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina y aminoácidos no esenciales. Las células SIM-A9 en medio DMEM F12 con 10% de suero fetal bovino y 5% de suero de caballo ambos inactivados, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina, glutamina y aminoácidos no esenciales. Las células BV-2 en medio “DMEM high glucose" con 10% de suero fetal bovino inactivado, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina y glutamina (Leal-Lasarte, FASEB J. 2017 Jul;31 (7):2797-2816). Antes de cada experimento, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en nuevos medios de cultivos completos. La extracción de microglía primaria se llevó a cabo como está descrito en la literatura (Leal-Lasarte, FASEB J. 2017 Jul;31(7):2797-2816) y se cultivaron en medio DMEM F12 con 10% de suero fetal bovino inactivado, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina, glutamina y aminoácidos no esenciales. 7.2. Ensayo de viabilidad celular por MTT
Se sembraron 180 mI de células LnCAP, PC3 o BV-2 a 2,5 x 104 células/ml en placas de 96 pocilios y se incubaron durante la noche en una atmósfera humidificada (37 ° C, 5% de C0 ) para permitir la adhesión celular. Las células se trataron posteriormente con nanomicelas de 11 vacías o cargadas con docetaxel, así como con docetaxel libre en concentraciones finales de 1 , 10 o 100 nM durante 24 y 48 h. Después de eso, se agregaron 20 pL de 3- bromuro de (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (5 mg / mi; MTT) a cada pocilio y se incubaron en oscuridad (37 °C, 5% de C0 ) durante 4 h. Los cristales de formazán producidos por las células viables se solubilizaron con 100 mI de dimetilsulfóxido y se incubaron durante la noche en las mismas condiciones. Finalmente, la absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas (ELISA) a 595 nm. Se usó PBS para el control negativo. 7.3. Internalización de M11
Se sembró 1 mi de células LnCAP, PC3 o SIM-A9 a 7,5 x 104 células / mi en cubreobjetos de 19 mm tratados previamente con poli-D-lisina y se incubaron durante la noche en una atmósfera humidificada (37 °C, 5% de C02) para permitir la adhesión celular. Luego, se agregaron a las muestras las nanomicelas, cargadas con rojo Nilo, 11 (con ligando ACUPA), 12 (sin ligando) o 11 (con ligando) más una concentración de ligando libre 100 veces superior a la encontrada en la nanomicela, y se incubó durante 3 horas. Después de eso, los cubreobjetos se enjuagaron tres veces con PBS y las muestras se fijaron con PFA (paraformaldehído) al 4% durante 15 minutos a 4eC y se lavaron tres veces con PBS. Luego, las muestras se bloquearon con BSA (albúmina de suero bovino) al 3% y Tritón al 0,5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se incubaron con faloidina durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Finalmente, se agregó DAPI y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y las muestras se lavaron tres veces con PBS y se montaron en portaobjetos de microscopio utilizando medio de montaje Vectashield para fluorescencia.
7.4. Resultados en cáncer de próstata:
Para evaluar la citotoxicidad de las nanomicelas vacías (sin docetaxel) con o sin el ligando ACUPA, se trataron LnCAP y PC3 durante 24 y 48 h con diferentes concentraciones de ambas nanomicelas y se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT. Como se ve en las figuras 5a y 6a, las nanomicelas vacías ni con ligando ni sin él, producen ningún efecto significativo en la viabilidad celular de LnCAP y PC3, respectivamente. Una vez demostrado que las nanomicelas vacías no afectan a las células, las células LnCAP y PC3 se trataron con diferentes concentraciones de micelas cargadas con docetaxel durante 24 y 48 h. Como indica la Figura 5b, la LnCAP no muestra una muerte significativa a las 24 h, pero se puede observar un 40% de las muertes a las 48 h con todas las concentraciones analizadas. Por otro lado, como se muestra en la Figura 6b, la viabilidad de las células PC3 se vio afectada a las 24 y 48 h, alcanzando un 50% de muerte aproximadamente con la mayor concentración de docetaxel (libre y cargada en nanomicelas).
Para evaluar la especificidad del ligando al receptor PSMA, las células LnCAP y PC3 se trataron durante 3 h con nanomicelas cargadas de rojo Nilo (NR), con o sin el ligando, o micelas cargadas con NR con ligando más el dipéptido no escindible libre (glutamato-lisina) que se une específicamente al receptor de PSMA. Luego se adquirieron imágenes de fluorescencia en un microscopio confocal. La especificidad de la interacción entre las micelas con ligando y PSMA se muestra en la Figura 7a y b. Cuando las células se trataron con micelas sin ligando, se observaron pequeñas cantidades de rojo Nilo en las células, mientras que cuando las células se trataron con micelas con ligando, una cantidad significativa de NR entró en la célula, especialmente en las células LnCAP que sobreexpresan PSMA. Además, cuando las células se trataron conjuntamente con micelas con ligando y el dipéptido no escindible, la cantidad de rojo Nilo en el interior de las células disminuyó notablemente.
7.5. Resultados en microglía: Del mismo modo, para evaluar la citotoxicidad de las micelas vacías con ligando en BV-2, se trataron las células durante 24 h con diferentes concentraciones de las micelas vacías y cargadas con docetaxel, así como docetaxel libre, empleando PBS como control negativo. A continuación, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT. Como se ve en la figura 8, las micelas vacías con ligando no producen ningún efecto significativo en la viabilidad celular de BV-2, mientras que las micelas cargadas con docetaxel muestran un efecto dependiente de la concentración superior al del docetaxel libre.
La especifidad del ligando se demostró también mediante microscopio confocal en SIM-A9 como en microglía primaria extraída de ratones neonatos. Para ello, las células se trataron durante 3 h con micelas cargadas de rojo Nilo, con o sin el ligando, o micelas cargadas con NR con ligando más el dipéptido no escindible libre (glutamato-lisina). De nuevo, se demuestra la especificidad de la interacción entre las micelas con ligando y PSMA (figura 9). Cuando las células se trataron con micelas sin ligando, se observaron pequeñas cantidades de rojo Nilo en las células, mientras que cuando las células se trataron con micelas con ligando, una cantidad significativa de NR entró en la célula, especialmente en las células LnCAP que sobreexpresan PSMA. Además, cuando las células se trataron conjuntamente con micelas con ligando y el dipéptido no escindible, la cantidad de rojo Nilo en el interior de las células disminuyó notablemente.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Nanopartícula que comprende el compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000044_0001
donde n es un número entero entre 1 y 10, m es un número entero entre 4 y 20, p es un número entero entre 2 y 40, q es un número entero entre 2 y 40, z es el número de agregación, o sea el número de monómeros en la nanopartícula y está comprendido entre 50 y 200,
R es un agente de direccionamiento, teniendo la nanopartícula forma esférica.
2. Nanopartícula, según reivindicación 1 , donde R es un agente de direccionamiento seleccionado de la lista que consiste en: PMPA (ácido 2-fosfonometil pentanedioico), N-acetil-L-aspartil-L-glutamato, y ácido ((S)-2-(3-((S)-5-amino-1- carboxipentil)ureido)pentanedioico.
3. Nanopartícula, según reivindicación 2, donde R es el ácido ((S)-2-(3-((S)-5- amino-1-carboxipentil)ureido)pentanedioico. 4. Nanopartícula, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde m =
10. n = 7, p = 19 y q = 3. 5. Nanopartícula, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además del compuesto de fórmula (I), un fármaco y/o un agente de diagnóstico en el interior de la esfera que forma dicha nanopartícula.
6. Nanopartícula, según reivindicación 5, donde el fármaco está seleccionado de la lista que comprende camptotecina, topotecán, paclitaxel, docetaxel, sorafenib, aprepitant, doxorrubicina. remdisivir, hidroxicloroquina, ritonavir, lopinavir, ribavirina yarbidol,
7. Nanopartícula, según reivindicación 5, donde el agente de diagnóstico está preferiblemente seleccionado de la lista que consiste en: 3-DTTCI (3,3- dietiltiatricarbocianine yoduro), Rojo Nilo, fluoresceína y rodamina.
8. Composición farmacéutica que comprende nanopartículas según se han descrito en las reivindicaciones 1 a 7 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Nanopartícula, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7 o composición farmacéutica, según reivindicación 8, para su uso como medicamento. 10. Nanopartícula, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7 o composición farmacéutica, según reivindicación 8 para su uso en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cáncer.
11 . Nanopartícula, o composición farmacéutica, para su uso según reivindicación 10, donde el cáncer es seleccionado de la lista que comprende: cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer linfático, cáncer de hígado o cáncer glial.
12. Nanopartícula, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7 o composición farmacéutica, según reivindicación 8, para su uso como sistema de liberación controlada de fármacos.
13. Procedimiento de preparación de la nanopartícula definida en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, que comprende: i) ultrasonicación en agua, en ausencia total de luz y a temperatura comprendida entre 20 y 25eC, de un monómero de fórmula (II), estando dicho monómero a una concentración superior a su concentración micelar crítica (CMC),
Figure imgf000046_0001
ii) fotopolimerización de las micelas en agua formadas en la etapa anterior mediante irradiación con luz UV.
14. Procedimiento, según reivindicación 13, caracterizado porque comprende una etapa adicional iii) de incorporación de un agente activo y/o un agente de diagnóstico en la nanopartícula fotopolimerizada obtenida en la etapa ii).
15. Procedimiento, según reivindicación 13 o 14, caracterizado porque comprende la preparación del monómero de fórmula (II) mediante las siguientes etapas de reacción: a) reacción del agente de direccionamiento “R” con el siguiente espaciador bifuncional:
Figure imgf000046_0002
teniendo el agente de direccionamiento teniendo protegidos los sus grupos funcionales excepto aquél que va a reaccionar con el espaciador bifuncional, b) reducción del compuesto obtenido en la etapa a), que comprende una azida, para dar una amina, seguido de una reacción de amidación de la misma con el espaciador bifuncional:
Figure imgf000047_0001
c) reacción del compuesto obtenido en la etapa b) con el alquino de fórmula
Figure imgf000047_0002
mediante una cicloadición 1 ,3-dipolar de azida y alquino catalizada por cobre (I); d) desprotección de grupos protectores de R, dando lugar al monómero de fórmula (II):
Figure imgf000047_0003
PCT/ES2021/070526 2020-07-16 2021-07-16 Nanopartículas para tratamiento, prevención y/o diagnóstico de tumores Ceased WO2022013477A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP202030733 2020-07-16
ES202030733A ES2891362B2 (es) 2020-07-16 2020-07-16 Nanoparticulas para tratamiento, prevencion y/o diagnostico de tumores

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022013477A1 true WO2022013477A1 (es) 2022-01-20

Family

ID=79555099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2021/070526 Ceased WO2022013477A1 (es) 2020-07-16 2021-07-16 Nanopartículas para tratamiento, prevención y/o diagnóstico de tumores

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2891362B2 (es)
WO (1) WO2022013477A1 (es)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEONARDO MANZONI, LAURA BELVISI, DANIELA AROSIO, MARIA PAOLA BARTOLOMEO, ALDO BIANCHI, CHIARA BRIOSCHI, FEDERICA BUONSANTI, CLAUDI: "Synthesis of Gd and 68 Ga Complexes in Conjugation with a Conformationally Optimized RGD Sequence as Potential MRI and PET Tumor-Imaging Probes", CHEMMEDCHEM, WILEY-VCH, vol. 7, no. 6, 5 June 2012 (2012-06-05), pages 1084 - 1093, XP055099156, ISSN: 18607179, DOI: 10.1002/cmdc.201200043 *
MATSUOKA DAIKO, HIROYUKI WATANABE, YOICHI SHIMIZU, HIROYUKI KIMURA, YUSUKE YAGI, RYOKO KAWAI, MASAHIRO ONO, HIDEO SAJI : "Structure-activity relationships of succinimidyl-Cys-C(O)-Glu derivatives with different near-infrared fluorophores as optical imaging probes for prostate-specific membrane antigen", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 26, 10 March 2018 (2018-03-10), pages 2291 - 2301, XP055898512, DOI: 10.1016/j.bmc.2018.03.015 *
YANG YANG, HUA CHONG, DONG CHANG-MING: "Synthesis, Self-Assembly, and In Vitro Doxorubicin Release Behavior of Dendron-like/Linear/Dendron-like Poly(ε-caprolactone)- b -Poly(ethylene glycol)- b -Poly(ε-caprolactone) Triblock Copolymers", BIOMACROMOLECULES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 10, no. 8, 10 August 2009 (2009-08-10), US , pages 2310 - 2318, XP055898510, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/bm900497z *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2891362A1 (es) 2022-01-27
ES2891362B2 (es) 2022-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Dendrimer–doxorubicin conjugate as enzyme-sensitive and polymeric nanoscale drug delivery vehicle for ovarian cancer therapy
Ding et al. A review of drug release mechanisms from nanocarrier systems
Zhou et al. Linear-dendritic drug conjugates forming long-circulating nanorods for cancer-drug delivery
ES2364987T3 (es) Copolímero de bloques para conjugados de fármaco y sus composiciones farmacéuticas.
CN102060991B (zh) 7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性药物前体及其制备方法
Lang et al. Tumor microenvironment-responsive docetaxel-loaded micelle combats metastatic breast cancer
CN1390143A (zh) 两亲型前药
Meng et al. Self-immolative micellar drug delivery: The linker matters
CN107335060A (zh) 一类基于rgd多肽-化疗药物的小分子偶联物及其纳米前药系统
US10376591B2 (en) Formulations and carrier systems including farnesylthiosalicylic moieties
KR101743399B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜과 트리페닐포스포늄이 컨쥬게이트된 물질 및 이를 적용한 미토콘드리아 표적 자기조립형 나노약물 전달체
CN103705943A (zh) 一种还原响应型聚乙二醇化药物纳米组合物的制备及其应用
Dhull et al. PSMA-targeted dendrimer as an efficient anticancer drug delivery vehicle for prostate cancer
Zheng et al. Hydrophobized SN38 to redox-hypersensitive nanorods for cancer therapy
Markowicz-Piasecka et al. Dendrimers in drug delivery
US20230277677A1 (en) Polymeric conjugates and uses thereof
CN105693807A (zh) 新型脑靶向脂质材料及其在药物传递系统中的应用
CN101935336A (zh) 一类水溶性紫杉烷类药物的制备方法和应用
Xu et al. Selective self-induced stimulus amplification prodrug platform for inhibiting multidrug resistance and lung metastasis
Pooja et al. Dendrimer-drug conjugates: Synthesis strategies, stability and application in anticancer drug delivery
CN118027128B (zh) 一种用于炎症协同治疗的地塞米松-亚麻酸前药自组装纳米粒及其应用
Kong et al. Targeted codelivery of doxorubicin and oleanolic acid by reduction responsive hyaluronic acid-based prodrug nano-micelles for enhanced antitumor activity and reduced toxicity
CN112089845A (zh) 紫杉烷类药物-阿霉素前药自组装纳米粒及其应用
Xu et al. The design and synthesis of redox-responsive oridonin polymeric prodrug micelle formulation for effective gastric cancer therapy
CN108752507A (zh) 一种酶敏感和氧化还原敏感双重响应型共聚物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21841547

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21841547

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1