WO2021206164A1 - 発達障害、依存症、及び精神疾患を検査する方法 - Google Patents

発達障害、依存症、及び精神疾患を検査する方法 Download PDF

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WO2021206164A1
WO2021206164A1 PCT/JP2021/015020 JP2021015020W WO2021206164A1 WO 2021206164 A1 WO2021206164 A1 WO 2021206164A1 JP 2021015020 W JP2021015020 W JP 2021015020W WO 2021206164 A1 WO2021206164 A1 WO 2021206164A1
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disease
group
subject
mineral
body fluid
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PCT/JP2021/015020
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English (en)
French (fr)
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昌一 島田
紀好 臼井
雪子 山本
近藤　誠
佳久 小山
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining developmental disorders, addictions, and mental illnesses.
  • MIA Maternal ImmunoActivation
  • ASD autism spectrum disease
  • ASD is an example of a brain disease caused by MIA.
  • ASD is a developmental disorder showing impaired social communication, limited / repeated behavior / interest, hyperesthesia and hypoesthesia, and the prevalence in Japan is estimated to be about 1 to 3%.
  • Early intervention has been reported to improve the symptoms of ASD, but there are no biomarkers available in the clinical setting.
  • DSM Guide to Classification and Diagnosis of Mental Illness
  • Patent Document 1 the event-related potential of a subject engaged in a priming task for determining whether or not a visual object presented as a visual stimulus and a sound source of an environmental sound presented as an auditory stimulus match is used as an index.
  • this method requires each inspection target to be engaged in a priming task, which poses a problem in terms of efficiency.
  • An object of the present invention is to provide a technique for more efficiently testing autism spectrum disorder. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a technique for more efficiently examining not only autism spectrum disorders but also developmental disorders including autism spectrum disorders, addictions, and psychiatric disorders.
  • the present inventor is selected from the group consisting of developmental disorders, addictions, and mental illnesses by detecting mineral elements in body fluid samples collected from subjects as a result of enthusiastic prefectural ownership in view of the above problems. We have found that at least one disease can be tested. The present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A method for testing at least one disease selected from the group consisting of developmental disorders, addictions, and psychiatric disorders, which includes a step of detecting mineral elements in a body fluid sample collected from a subject.
  • Item 2. Based on the amount or concentration of the mineral element detected in the step (1), whether or not the subject has the disease and / or the subject may be affected by the disease in the future.
  • the process of determining sex, Item 1. The method according to Item 1.
  • Item 3 The method according to Item 2, wherein in the step (2), the determination is performed using a discriminant created based on the amount or concentration of mineral elements.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the disease is a developmental disorder.
  • Item 5 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the disease is autism spectrum disorder.
  • Item 6. The method according to Item 2 or 3, wherein in the step (2), the possibility that the subject will be affected by at least one selected from the group consisting of addiction and mental illness in the future is determined.
  • Item 7 The mineral elements consist of Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, and Ti.
  • Item 6. The method according to any one of Items 1 to 6, which comprises at least one selected from the group.
  • Item 8 The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the mineral element contains an alkali metal element, an alkaline earth metal element, a transition metal element, a semi-metal element, and a non-metal element.
  • Item 9. The method according to any one of Items 1 to 8, wherein the body fluid sample is at least one selected from the group consisting of whole blood, serum, and plasma.
  • Item 10 The method according to any one of Items 1 to 9, wherein the subject is a human.
  • Item 11 Prevention of at least one disease selected from the group consisting of developmental disorders, addictions, and psychiatric disorders, indexed by the amount or concentration of mineral elements in body fluid samples collected from animals treated with the test substance. Alternatively, a method for screening the active ingredient of a therapeutic agent.
  • Item 12 Induction of at least one disease selected from the group consisting of developmental disorders, addictions, and psychiatric disorders, using the amount or concentration of mineral elements as an index in body fluid samples collected from animals treated with the test substance. Evaluation method for sex or exacerbation.
  • Test Example 2 The results of Test Example 2 are shown.
  • the vertical axis shows the index value indicating the degree of social communication disorder, and the horizontal axis shows the element amount. Each plot shows the value of each sample.
  • the results of Test Example 3 are shown.
  • the horizontal axis shows a scatter plot by group showing the scores obtained by analyzing the mineral elements in the body fluid sample and statistically processing them. Each plot shows the value of each sample.
  • the results of Test Example 4 are shown.
  • the horizontal axis shows a scatter plot by group showing the scores obtained by analyzing the mineral elements in the body fluid sample and statistically processing them. Each plot shows the value of each sample.
  • the present invention is selected from the group consisting of developmental disorders, addictions, and psychiatric disorders, which comprises (1) detecting mineral elements in body fluid samples collected from a subject.
  • the present invention relates to a method for testing at least one type of disease (in the present specification, it may be referred to as "the test method of the present invention”). This will be described below.
  • the type of disease to be tested (developmental disorder, addiction, and psychiatric disorder; hereinafter, these may be collectively referred to as “target disease”) is not particularly limited.
  • Developmental disorders include, for example, autism spectrum disorder, attention deficit hyperactivity disorder, learning disorder, etc.
  • addiction includes, for example, drug addiction, alcohol addiction, sugar addiction, gambling addiction, game addiction, etc. , Internet addiction, shopping addiction, sexual addiction, etc.
  • Examples of psychiatric disorders include schizophrenia, depression, bipolar disorder, anxiety disorder, panic disorder, post-traumatic stress disorder (PTSD), Examples include sleep disorders and eating disorders.
  • developmental disorders are preferably mentioned, and autism spectrum disorders are more preferable, as targets of the test method of the present invention. All classes, grades, stages, etc. in the various classification criteria of the target disease are not particularly limited.
  • the subject is the target organism of the test method of the present invention, and the species thereof is not particularly limited.
  • Examples of the organism species of the subject include various mammals such as humans, chimpanzees, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, and humans are preferable.
  • the condition of the subject is not particularly limited.
  • the subjects include, for example, a sample whose presence or absence is unknown whether or not they have the target disease, a sample which has already been determined to have the target disease by another method, and a sample which has not already suffered from the target disease by another method. Examples thereof include a sample that has been determined, a sample that is being treated for the target disease, and a sample that is suspected of being affected by the target disease in the future.
  • the body fluid sample is not particularly limited as long as it can contain mineral elements.
  • body fluid samples include body fluids such as whole blood, serum, plasma, follicle fluid, menstrual blood, saliva, bone marrow fluid, joint fluid, urine, tissue fluid, sweat, tears, saliva, umbilical cord blood, and cerebrospinal fluid.
  • samples derived from body fluids include samples derived from body fluids.
  • the sample derived from the body fluid is not particularly limited as long as it is a sample prepared from the body fluid, and examples thereof include a sample obtained by concentrating and purifying the mineral element contained in the body fluid from the body fluid.
  • the body fluid include whole blood, serum, plasma and the like, and more preferably serum, plasma and the like. As the body fluid sample, one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the body fluid sample can be collected from the subject by a method known to those skilled in the art.
  • whole blood can be collected by collecting blood using a syringe or the like. It is desirable that blood is collected by medical staff such as doctors and nurses.
  • Serum is a portion of blood from which blood cells and specific blood coagulation factors have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant after coagulation of blood.
  • Plasma is a portion of blood from which blood cells have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant when subjected to centrifugation under conditions that do not coagulate blood.
  • the detection target of process (1) is a mineral element.
  • Mineral elements are elements other than the four main elements of O (oxygen), C (carbon), H (hydrogen), and N (nitrogen) among the elements in the living body, and are not particularly limited as long as they are.
  • the mineral elements are preferably Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, Ti. And so on.
  • step (1) only one type of mineral element may be used, but two or more types, three or more types, four or more types, five or more types, six or more types, seven or more types, eight or more types, nine or more types, and ten types.
  • 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, or 21 or more can.
  • the mineral elements to be detected are Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr. , Mo, Ag, Cs, Ba, and Ti, at least one selected from 22 element groups (more preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 Species or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more , 20 or more, or 21 or more).
  • 22 element groups more preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 Species or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more , 20 or more, or 21 or more.
  • the mineral elements are Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs. At least one selected from 21 elemental groups consisting of, Ba, and Ti (more preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more. , 9 types or more, 10 types or more, 11 types or more, 12 types or more, 13 types or more, 14 types or more, 15 types or more, 16 types or more, 17 types or more, 18 types or more, 19 types or more, 20 types or more, or 21 species) are included.
  • the mineral elements are Na, Mg, P, S, K, Ca, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, and At least one selected from 19 element groups consisting of Ti (more preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more , 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, or 19 types).
  • the mineral elements are Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, and At least one selected from 19 element groups consisting of Cs (more preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more , 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, or 19 types).
  • the mineral element is at least one selected from a group of 10 elements consisting of Li, Na, P, Mn, Fe, Co, As, Se, Rb, and Ba (more preferably). Includes 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10).
  • the mineral element is at least one (more preferably 2) selected from a group of nine elements consisting of Li, Na, P, Mn, Fe, Co, Se, Rb, and Ba. Includes species or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, or 9).
  • the mineral element is at least one selected from eight element groups consisting of Na, P, Fe, Co, As, Se, Rb, and Ba (more preferably two or more). , 3 types or more, 4 types or more, 5 types or more, 6 types or more, 7 types or more, or 8 types).
  • the mineral element is an alkali metal element (eg, Li, Na, K, Rb, Cs, etc.), an alkaline earth metal element (eg, Mg, Ca, Sr, Ba, etc.), transition.
  • Metallic elements eg, Ti, V, Mn, Fe, Co, Cu, Mo, Ag, etc.
  • metalloid elements eg, As, Se, etc.
  • non-metal elements eg, P, S, etc.
  • Detection is performed by measuring the amount or concentration of mineral elements.
  • concentration is not limited to the absolute concentration, but may be a relative concentration, a weight per unit volume, or raw data measured to know the absolute concentration.
  • the method for detecting mineral elements is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring trace elements in a body fluid sample.
  • Specific examples of the detection method include inductively coupled plasma mass spectrometry, inductively coupled plasma emission spectrometry, atomic absorption spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, energy dispersive X-ray analysis, spark discharge OES method, and secondary.
  • Various elemental analysis methods such as ion mass spectrometry can be mentioned.
  • the inductively coupled plasma mass spectrometry method is particularly preferable from the viewpoint of sensitivity and the ability to analyze body fluids that can be easily collected.
  • the inspection method of the present invention including the step (1), it is possible to provide the amount and / or concentration of the mineral element (biomarker) which is a detection index of the target disease, thereby assisting the detection of the target disease and the like. can do.
  • the mineral element biomarker
  • test results by the test method of the present invention including step (1) include treatment effect determination, elucidation of the pathophysiology of the target disease, prognosis prediction of the target disease, patient stratification, selection of treatment method (individualized medical treatment, treatment responsiveness). It can be used for such purposes.
  • the test method of the present invention further comprises (2) whether or not the subject suffers from the disease based on the amount or concentration of the mineral element detected in the step (1). / Or includes a step of determining the susceptibility to the disease in the subject. According to the inspection method of the present invention including the step 2, it is possible to determine the target disease.
  • Examples of the determination method include a method using a discriminant created based on the amount or concentration of mineral elements, a method using a cutoff value of the amount or concentration of BM1B and / or BM2B, and the like.
  • a method using a discriminant is particularly preferable.
  • the discriminant formula is any discriminant analysis method that can create a discriminant formula that distinguishes between the target disease and healthy, such as Fisher's linear discriminant analysis, Mahalanobis distance non-linear discriminant analysis, deep learning, neural network, and Support. It can be created using machine learning such as Vector Machine (SVM), artificial intelligence (AI), etc., but it is not limited to these specific examples.
  • SVM Vector Machine
  • AI artificial intelligence
  • step (2) it is also possible to make a judgment using a method such as a neural network, k-nearest neighbor method, decision tree, or logistic regression analysis.
  • the discrimination formula one prepared in advance based on the amount or concentration of the mineral element measured from another subject can be used, or the amount or concentration of the mineral element measured from the subject in step (1) can be used. You can also use the one created based on.
  • the cutoff value can be appropriately set by those skilled in the art from the viewpoints of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc.
  • a body fluid sample collected from a subject not suffering from the target disease Based on the amount and / or concentration of the mineral element in, the value can be set to a predetermined value or a predetermined value each time.
  • the cutoff value is, for example, the amount and / or concentration of mineral elements in a body fluid sample collected from a subject who does not have the target disease (mean value, median value, etc. when there are multiple subjects), for example.
  • the value can be 0.5 to 2 times.
  • step (2) it is preferably possible to determine whether or not the subject suffers from a developmental disorder (particularly, autism spectrum disorder). In another preferred embodiment, whether the subject is likely (or likely (or high or low) to be affected in the future to at least one selected from the group consisting of addiction and psychiatric disorders). ) Can be determined.
  • test method of the present invention including the more accurate diagnosis step (2) of the disease determines that the subject is suffering from the target disease
  • the test method of the present invention is further performed by the doctor of the target disease.
  • the target disease can be diagnosed with higher accuracy.
  • the test method of the present invention can detect the target disease more accurately, by combining the above steps with the test method of the present invention, it is possible to more efficiently and more accurately diagnose "affected by the target disease". ..
  • test method of the present invention that includes the prevention, countermeasures, and treatment steps (2) of the disease that the subject has the target disease and / or may have the target disease in the future, the present invention Further to the test method of the present invention, or when it is diagnosed that the patient is suffering from the target disease as described in "2. Diagnosis of the disease with higher accuracy", the test method of the present invention and diagnosis by a doctor In addition to the combination with the step of applying the above, (3) prevention of the disease and / / Alternatively, by performing the step of performing the treatment, it becomes possible to prevent and / or treat the disease of the subject.
  • test method of the present invention can detect a target disease more accurately, a step (3) for the test method of the present invention or for a combination of the test method of the present invention and a step of applying a diagnosis by a doctor. ), It is possible to treat the subject suffering from the target disease more efficiently and more reliably, and more efficiently and more efficiently for the subject who may develop the target disease in the future. Certainly preventive measures or measures can be taken.
  • the prevention / treatment method of the target disease is not particularly limited, and examples thereof include behavior therapy and medication treatment.
  • the treatment method can be used alone or in combination of two or more.
  • the drug used for medication is not particularly limited, but for example, psychostimulants (Novartis Pharma Ritalin, Janssen Pharma Concerta, Japan Eli Lily Strattera, etc.), antipsychotic drugs (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Serenese, Tsuruhara Pharmaceutical, etc.) Chlorpromazine, Astellas Pharmaceuticals / Aulap, etc.), Atypical antipsychotics (Jansen Pharma Rispadar, Japan Eli Lily Zyprexa, Otsuka Pharmaceuticals / Abilify, etc.), Antidepressants (Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (Avi Lubox, Glaxo, etc.) Smith Klein paroxetin), serotonin noradrenaline reuptake inhibitor (Asahi Kasei Pharma Toledomin), tricyclic antidepress
  • a developmental disorder using the amount or concentration of a mineral element as an index in a body fluid sample collected from an animal treated with a test substance A method for screening an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for at least one disease selected from the group consisting of, addiction, and psychiatric disorder (in the present specification, it may be referred to as "the active ingredient screening method of the present invention”. .). This will be described below.
  • the measurement of body fluid sample, mineral element, disease, amount or concentration of mineral element, etc. is the same as the definition in "1. Disease inspection method" above.
  • Animal species are not particularly limited. Species of animals include various mammals such as humans, chimpanzees, monkeys, mice, rats, dogs, cats and rabbits. Preferably, a target disease model animal (for example, a pup animal born from a maternal immune-activated maternal animal during pregnancy) can be used.
  • a target disease model animal for example, a pup animal born from a maternal immune-activated maternal animal during pregnancy
  • test substance it can be widely used regardless of whether it is a naturally occurring compound or an artificially produced compound. Further, not only the purified compound but also a composition in which various compounds are mixed and an extract of animals and plants can be used.
  • Compounds include not only low molecular weight compounds but also high molecular weight compounds such as proteins, nucleic acids and polysaccharides.
  • the active ingredient screening method of the present invention can use the discriminant or the cutoff value obtained in the step (2) of the inspection method of the present invention.
  • the step of selecting the test substance as the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for the target disease is performed. include.
  • a developmental disorder, dependence using the amount or concentration of a mineral element as an index in a body fluid sample collected from an animal treated with a test substance. It relates to a method for evaluating the induction or exacerbation of at least one disease selected from the group consisting of illness and psychiatric disease (in the present specification, it may be referred to as "the toxicity evaluation method of the present invention"). This will be described below.
  • the toxicity evaluation method of the present invention can use the discriminant or the cutoff value obtained in the step (2) of the inspection method of the present invention.
  • the step of selecting the test substance as the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for the target disease is performed. include.
  • Test example 1 Judgment of pups affected by maternal immune activation
  • Maternal immune activation during pregnancy causes developmental disorders (autism spectrum disorders, attention deficit hyperactivity disorder, etc.) in the offspring and is dependent after growth. It is known to increase the prevalence of illness and mental illness. Therefore, it was investigated by elemental analysis whether or not the pups affected by maternal immune activation could be determined, that is, whether or not developmental disorders, addictions, and psychiatric disorders could be determined. Specifically, it was carried out as follows.
  • RNA poly (I: C) or saline was intraperitoneally administered.
  • the poly (I: C) reagent manufactured by Sigma-Aldrich
  • physiological saline so that the poly (I: C) dose is 20 mg / kg (Chow).
  • Example 1-2 Elemental analysis of serum samples> 25 ⁇ L of serum was placed in a measuring container, and an acid (a mixture of nitric acid and hydrogen peroxide) was added thereto for thermal decomposition. Dilute with ultrapure water so that the serum is 100-fold diluted, and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS, PerkinElmer NexION350, software used: NexION® software version 1.5 (build 1.5.2434.1) ) Measured the amount of 19 kinds of elements (Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Cs). .. An operation blank was obtained by performing the same operation with ultrapure water instead of serum.
  • ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry
  • Test example 2 Correlation between impaired social communication and metallom
  • the pups obtained in Test Example 1-1 were measured for the degree of impaired social communication before blood sampling (7 days old). Specifically, it was measured as follows. It was performed by measuring ultrasonic vocal communication between mother and child. A 7-day-old pup is taken out of the cage feeding with the mother, placed in a 500 ml beaker and placed in a soundproof box, and the ultrasonic sound emitted by the pup from above is heard from the microphone. Collected and analyzed (UltraSoundGate 116H (manufactured by AviSoft)). The measurement time was 3 minutes, and the number of voices rang in 3 minutes was recorded. After the measurement, the pups were promptly returned to the feeding cage where the mother was.
  • FIG. 1 shows the results of examining the correlation between the measured values and the amounts of some elements (Se, Rb, and Mo). As shown in FIG. 1, it was found that the degree of social communication disorder and the amount of elements correlate.
  • Test example 3 Judgment of Autism Spectrum Disorder ⁇ Test Example 3-1.
  • Terumo's Venoject II vacuum blood collection tube blood collection volume 5 ml containing EDTA-2Na
  • model number VP-NA050K model number
  • Example 3-2 Elemental analysis of plasma samples> 50 ⁇ L of plasma was placed in a measuring container, and an acid (a mixture of nitric acid and hydrogen peroxide) was added thereto for thermal decomposition.
  • Inductively coupled plasma mass analysis ICP-MS, Agilent 7800, software used: Mass Hunter 4.3 Workstation Software for 7800 ICP-MS version C.01.03 (Build: 505.16)) 21 kinds of elements (Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, The amount of Ba, Ti) was measured.
  • An operation blank was obtained by performing the same operation with ultrapure water instead of plasma.
  • the discrimination coefficient for each element was obtained by linear discriminant analysis.
  • the discrimination coefficient of each element used for discrimination was multiplied by the measured value of each element, and the sum of these and the constant was used as the discrimination score.
  • FIG. 2 when plotting the discrimination score of each sample, a line that can most efficiently distinguish between the typical development group and the autism spectrum disorder group is set, and if the score is higher than that, it is regarded as the autism spectrum disorder group. Judgment was made, and if the score was lower than that, it was judged to be a typical development group.
  • (Li discrimination coefficient x Li actual measurement value) + (Na discrimination coefficient x Na actual measurement value) + ⁇ ⁇ ⁇ + (TI discrimination coefficient x TI actual measurement value) + constant discrimination score.
  • a discriminant using 19 elements (Na, Mg, P, S, K, Ca, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, Ti) is used.
  • the discriminant predictive value was 87.01%, and the discriminant predictive value when using the discriminant using 9 elements (Li, Na, P, Mn, Fe, Co, Se, Rb, Ba) was 88.31.
  • the discriminant predictive value was 84.42% when the discriminant using 8 elements (Na, P, Fe, Co, As, Se, Rb, Ba) was used.
  • Test example 4 Judgment of drug addiction model mouse ⁇ Test Example 4-1.
  • Preparation of drug addiction model mouse, sample preparation> A 6-week-old male mouse (C57BL / 6JJmsSlc) was obtained from Nippon SLC Co., Ltd. Methamphetamine or saline, which is a stimulant, was intraperitoneally administered for 5 consecutive days from the 7th week of age.
  • the method of intraperitoneal administration of methamphetamine is to adjust methamphetamine hydrochloride (product name: Hiropon) (manufactured by Sumitomo Dainippon Pharma) with physiological saline so that the dose of methamphetamine is 2 mg / kg, and use an insulin syringe (Myjector).
  • a drug addiction model mouse was prepared by continuously administering the drug once a day for 5 days. Blood was collected directly from the heart under anesthesia 6 hours after administration on the 5th day, and the obtained blood was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, then centrifuged at 1200 G for 10 minutes at room temperature, and the supernatant was separated. It was collected in a tube and used as a serum sample.
  • Example 4-2 Elemental analysis of plasma samples> 25 ⁇ L of serum was placed in a measuring container, and an acid (a mixture of nitric acid and hydrogen peroxide) was added thereto for thermal decomposition.
  • Inductively coupled plasma mass spectrometry ICP-MS, Agilent 7800, software used: Mass Hunter 4.3 Workstation Software for 7800 ICP-MS version C.01.03 (Build: 505.16)) 19 kinds of elements (Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Cs) was measured.
  • An operation blank was obtained by performing the same operation with ultrapure water instead of serum.

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Abstract

発達障害、依存症、及び精神疾患をより効率的に検査する技術を提供すること。 （1）被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素を検出する工程を含む、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患を検査する方法。

Description

発達障害、依存症、及び精神疾患を検査する方法
　本発明は、発達障害、依存症、及び精神疾患を検査する方法等に関する。
　ウイルスなどの感染症や強い精神的なストレスは母体免疫活性化（MIA: Maternal Immune Activation）を惹起し、生まれる児の自閉スペクトラム症（ASD）等の発達障害の罹患率を上昇させ、思春期では依存症、成人期では統合失調症、うつ病などの精神疾患の罹患率を上昇させることが知られている。妊娠中の母体での強い免疫活性化が胎盤などを通じて胎児の脳に波及することで脳の発生・発達を障害し、小児期から成人期までの神経回路やシナプスの発達にも影響を与えると考えられている。
　MIAによって発症する脳疾患の例として、ASDが挙げられる。ASDは社会性コミュニケーションの障害、限定・反復された行動・興味、感覚過敏や感覚鈍麻を示す発達障害であり、我が国の有病率は約1～3%と推測されている。ASDには根本的治療法がなく、対症療法のみである。早期介入によりASDの症状が改善することが報告されているが、臨床現場で使用できるバイオマーカーは存在しない。血液検査などの生化学的なデータに基づいた客観的な診断ではなく、米国精神医学会が作成しているDSM（精神疾患の分類と診断の手引）の第5版を用い、専門医の診察によって診断されているのが現状である。
　特許文献１では、視覚刺激として呈示される視対象と聴覚刺激として呈示される環境音の音源とが一致するか否かを判断するプライミング課題に従事する被験者の事象関連電位を指標とすることにより、自閉スペクトラム症を客観的に評価することが提案されている。しかしながら、この方法は、各検査対象をプライミング課題に従事させる必要があり、効率面に課題を有する。
特開2018-175530号公報
　本発明は、自閉スペクトラム症をより効率的に検査する技術を提供することを課題とする。さらに、自閉スペクトラム症のみならず、自閉スペクトラム症を含む発達障害、依存症、及び精神疾患をより効率的に検査する技術を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意県有を進めた結果、被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素を検出することにより、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患を検査できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　（1）被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素を検出する工程を含む、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患を検査する方法。
　項２．　（2）前記工程（1）で検出されたミネラル元素の量又は濃度に基づいて、前記被検体が前記疾患に罹患しているか否か、及び／又は前記被検体が前記疾患に今後罹患する可能性を判定する工程、
を含む、項１に記載の方法。
　項３．　前記工程（2）において、ミネラル元素の量又は濃度に基づいて作成された判別式を使用して前記判定を行う、項２に記載の方法。
　項４．　前記疾患が発達障害である、項１～３のいずれかに記載の方法。
　項５．　前記疾患が自閉スペクトラム症である、項１～４のいずれかに記載の方法。
　項６．　前記工程（2）において前記被検体が依存症及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種に今後罹患する可能性を判定する、項２又は３に記載の方法。
　項７．　前記ミネラル元素がLi、Na、Mg、P、S、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、及びTiからなる群より選択される少なくとも1種を含む、項１～６のいずれかに記載の方法。
　項８．　前記ミネラル元素がアルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、遷移金属元素、半金属元素、及び非金属元素を含む、項１～７のいずれかに記載の方法。
　項９．　前記体液試料が全血、血清、及び血漿からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～８のいずれかに記載の方法。
　項１０．　前記被検体がヒトである、項１～９のいずれかに記載の方法。
　項１１．　被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
　項１２．　被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
　本発明によれば、発達障害、依存症、及び精神疾患をより効率的に検査する技術を提供することができる。
試験例2の結果を示す。縦軸は社会性コミュニケーション障害の程度を表す指標値を示し、横軸は元素量を示す。各プロットは、各検体の値を示す。 試験例3の結果を示す。横軸は体液試料におけるミネラル元素を解析し、統計処理によって得られたスコアを示した群別散布図を示す。各プロットは、各検体の値を示す。 試験例4の結果を示す。横軸は体液試料におけるミネラル元素を解析し、統計処理によって得られたスコアを示した群別散布図を示す。各プロットは、各検体の値を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．疾患の検査方法
　本発明は、その一態様において、（1）被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素を検出する工程を含む、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患を検査する方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　1-1．工程（1）
　検査対象である疾患（発達障害、依存症、及び精神疾患。以下、これらをまとめて「対象疾患」と示すこともある。）の種類は特に制限されない。発達障害としては、例えば自閉スペクトラム症、注意欠陥多動性障害、学習障害等が挙げられ、依存症としては、例えば薬物依存症、アルコール依存症、砂糖依存症、ギャンブル依存症、ゲーム依存症、インターネット依存症、買い物依存症、性依存症等が挙げられ、精神疾患としては、例えば統合失調症、うつ病、双極性障害、不安障害、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（PTSD）、睡眠障害、摂食障害等が挙げられる。これらの中でも、本発明の検査方法の対象として、好ましくは発達障害が挙げられ、より好ましくは自閉スペクトラム症が挙げられる。対象疾患の各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージ等は特に制限されない。
　被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、チンパンジー、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
　被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば対象疾患に罹患しているかどうか不明な検体、対象疾患に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、対象疾患に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、対象疾患の治療中の検体、将来の対象疾患への罹患が疑われる検体等が挙げられる。
　体液試料は、ミネラル元素を含有し得るものであれば特に制限されない。体液試料としては、例えば全血、血清、血漿、卵胞液、経血、唾液、骨髄液、関節液、尿、組織液、汗、涙、唾液、臍帯血、脳脊髄液などの体液や、これらの体液由来の試料が挙げられる。体液由来の試料としては、体液から調製される試料である限り特に制限されず、例えば体液から、該体液に含まれるミネラル元素を濃縮、精製などして得られる試料などが挙げられる。体液としては、好ましくは全血、血清、血漿などが挙げられ、より好ましくは血清、血漿等が挙げられる。体液試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　体液試料は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
　工程（1）の検出対象は、ミネラル元素である。ミネラル元素は、生体内元素の内、O（酸素）、C（炭素）、H（水素）、及びN（窒素）の4つの主要元素以外の元素であり、この限りにおいて特に制限されない。ミネラル元素としては、好ましくはLi、Na、Mg、P、S、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、Ti等が挙げられる。工程（1）においてミネラル元素は、1種のみでもよいが、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、又は21種以上であることができる。より多くの対象バイオマーカーを組み合わせることにより、対象疾患の検査等を、より正確に行うことが可能になる。
　本発明の好ましい一態様においては、検出対象であるミネラル元素は、Li、Na、Mg、P、S、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、及びTiからなる22種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、又は21種以上）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Li、Na、Mg、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、及びTiからなる21種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、又は21種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Na、Mg、P、S、K、Ca、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、及びTiからなる19種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、又は19種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Li、Na、Mg、P、S、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、及びCsからなる19種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、又は19種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Li、Na、P、Mn、Fe、Co、As、Se、Rb、及びBaからなる10種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Li、Na、P、Mn、Fe、Co、Se、Rb、及びBaからなる9種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、又は9種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、Na、P、Fe、Co、As、Se、Rb、及びBaからなる8種の元素群より選択される少なくとも1種（より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、又は8種）を含む。
　本発明の好ましい一態様においては、ミネラル元素は、アルカリ金属元素（例えば、Li、Na、K、Rb、Cs等）、アルカリ土類金属元素（例えば、Mg、Ca、Sr、Ba等）、遷移金属元素（例えば、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Mo、Ag等）、半金属元素（例えば、As、Se等）、及び非金属元素（例えば、P、S等の非ハロゲン且つ非希ガス元素）を含む。
　検出は、ミネラル元素の量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
　ミネラル元素を検出する方法としては、体液試料内の微量元素を測定可能な方法である限り、特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば誘導結合プラズマ質量分析法、誘導結合プラズマ発光分析法、原子吸光分光法、X線光電子分光法、エネルギー分散型X線分析、スパーク放電OES法、二次イオン質量分析法等の各種元素分析法が挙げられる。これらの中でも、感度の観点、簡便に採取できる体液を分析できるという観点等から、誘導結合プラズマ質量分析法が特に好ましい。
　工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、対象疾患の検出指標であるミネラル元素（バイオマーカー）の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより対象疾患の検出などを補助することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、対象疾患の病態解明、対象疾患の予後予測、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）等に利用し得る。
　1-2．工程（2）
　本発明の検査方法は、一態様として、さらに、（2）前記工程（1）で検出されたミネラル元素の量又は濃度に基づいて、前記被検体が前記疾患に罹患しているか否か、及び／又は前記被検体における前記疾患の罹患可能性を判定する工程、を含む。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、対象疾患を判定することが可能となる。
　判定方法としては、例えばミネラル元素の量又は濃度に基づいて作成された判別式を使用する方法、BM1B及び／又はBM2Bの量又は濃度のカットオフ値を使用する方法等が挙げられる。本発明においては、複数のミネラル元素の量又は濃度を指標とすることが好ましく、このような場合には判別式を使用する方法が特に好ましい。
　判別式は、対象疾患と健常とを区別的に判別する判別式を作成することができる任意の判別分析法、例えばフィッシャーの線形判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ディープラーニング、ニューラルネットワーク、Support Vector Machine（SVM）などの機械学習、人工知能（AI）等を用いて作成できるが、これらの具体例に限定されない。工程（2）において、例えばニューラルネットワーク、k-近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を利用して判定することもできる。判別式は、別の被検体から測定されたミネラル元素の量又は濃度に基づいて予め作成したものを使用することもできるし、工程（1）の被検体から測定されたミネラル元素の量又は濃度に基づいて作成したものを使用することもできる。
　カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、対象疾患に罹患していない被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、対象疾患に罹患していない被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば0.5～2倍の値とすることができる。
　工程（2）において、好適には、被検体が発達障害（特に、自閉スペクトラム症）に罹患しているか否かを判定することができる。また、別の好ましい態様においては、被検体が依存症及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種に今後罹患する可能性（今後罹患する可能性がある（又は高い若しくは低い）か否か）を判定することができる。
　2．疾患のより高い精度での診断
　工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が対象疾患に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに対象疾患の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で対象疾患を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に対象疾患を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「対象疾患に罹患している」と診断できる。
　3．疾患の予防、対策、治療
　工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が対象疾患に罹患している、及び／又は対象疾患に今後罹患する可能性があると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．疾患のより高い精度での診断」に記載の様に対象疾患に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）対象疾患に罹患している（又は今後罹患する可能性がある）と判定又は診断された被検体に対して、該疾患の予防及び／又は治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を予防及び／又は治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に対象疾患を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程（3）を組み合わせることによって、対象疾患に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療でき、また対象疾患を将来発症する可能性がある被検体に対して、より効率的に、より確実に、予防処置又は対策を施すことができる。
　対象疾患の予防／治療方法としては、特に制限されないが、例えば行動療法、投薬治療等が挙げられる。治療方法は1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えば精神刺激薬（ノバルティスファーマ・リタリン、ヤンセンファーマ・コンサータ、日本イーライリリー・ストラテラなど）、抗精神病薬（大日本住友製薬・セレネース、鶴原製薬・クロルプロマジン、アステラス製薬・オーラップなど）、非定型抗精神病薬（ヤンセンファーマ・リスパダール、日本イーライリリー・ジプレキサ、大塚製薬・エビリファイなど）、抗うつ薬（選択的セロトニン再取り込み阻害薬（アッヴィ・ルボックス、グラクソスミスクライン・パロキセチン）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（旭化成ファーマ・トレドミン）、三環系抗うつ薬（田辺三菱製薬・イミドール、アルフレッサファーマ・アナフラニール）など）、抗不安薬（ベンゾジアセピン系（武田テバ薬品・セルシン、第一三共・セパゾン）、ファイザー・ワイパックス、太陽ファルマ・リボトリール）など、てんかん薬（サンファーマ・テグレトール、協和発酵キリン・デパケンなど）、抗ヒスタミン薬（ファイザー・アタラックス、武田テバファーマ・シプロヘプタジンなど）、循環器用薬（日本ベーリンガーインゲルハイム・カタプレス、アストラゼネカ・インデラル、塩野義製薬・インチュニブなど）、その他（コリンエステラーゼ阻害薬（エーザイ・アリセプト））等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
　4．疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液試料、ミネラル元素、疾患、ミネラル元素の量又は濃度の測定等については、上記「1．疾患の検査方法」における定義と同様である。
　動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、チンパンジー、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。好適には対象疾患モデル動物（例えば、妊娠中に母体免疫活性化した母親動物から生まれた子動物）を使用することができる。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、本発明の検査方法の工程（2）で得られる判別式又はカットオフ値を使用することができる。ミネラル元素の量又は濃度を判別式又はカットオフ値に当てはめて、対象疾患に罹患していないと判定される場合、前記被検物質を対象疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む。
　5．疾患の誘発性又は増悪性の評価方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液試料、ミネラル元素、疾患、ミネラル元素の量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．疾患の検査方法」及び「4．疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
　本発明の毒性評価方法は、より具体的には、本発明の検査方法の工程（2）で得られる判別式又はカットオフ値を使用することができる。ミネラル元素の量又は濃度を判別式又はカットオフ値に当てはめて、対象疾患に罹患していると判定される場合、前記被検物質を対象疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．母体免疫活性化の影響を受けた仔マウスの判定
　妊娠中の母体免疫活性化は、生まれる児の発達障害（自閉スペクトラム症、注意欠陥多動性障害等）を惹起し、また成長後の依存症及び精神疾患の罹患率を上昇させることが知られている。そこで、母体免疫活性化の影響を受けた仔マウスを判定可能か否か、すなわち発達障害、依存症、及び精神疾患を判定可能か否かを、元素分析により調べた。具体的には以下のようにして行った。
　＜試験例1-1．母体免疫活性化モデルマウスの作製、サンプル調製＞
　妊娠7日目のマウス（C57BL/6JJmsSlc）を日本エスエルシー株式会社より入手した。妊娠12日目に二本鎖RNAであるpoly(I:C)もしくは生理食塩水を腹腔内投与した。poly(I:C)の腹腔内投与方法は、poly(I:C)投与量が20mg/kgになるようにpoly(I:C)試薬（シグマアルドリッチ製）を生理食塩水で調整し（Chow KH, et al., J Vis Exp. 2016 Mar 25;(109):e53643. doi: 10.3791/53643）、インスリン用シリンジ（マイジェクター）を用いて投与した。そのまま自然出産させることにより母体免疫活性化の影響を受けた仔マウスを作製した。なお、仔マウスについて、自閉スペクトラム症様行動について調べた結果、この行動を示すことが確認された。生後7日齢の仔マウスの断頭採血を行い、得られた血液を30分室温にて静置した後、1200G、10分間、室温で遠心分離を行い、上清を別チューブに回収して血清サンプルとした。
　＜試験例1-2．血清サンプルの元素分析＞
　血清25μLを測定容器に取り分け、そこへ酸（硝酸と過酸化水素の混合物）を加えて加熱分解を行った。血清に対し100倍希釈になるように超純水で希釈を行い、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS、PerkinElmer社製NexION350、使用ソフト：NexION（登録商標）ソフトウェア バージョン1.5（ビルド 1.5.2434.1））で19種の元素（Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Cs）の量を測定した。血清の代わりに超純水で同様の操作を行ったものを操作ブランクとした。
　＜試験例1-3．判別式の作成、及び判定＞
　統計処理はエクセル統計 BellCurve for Excel（version 2.21）を用いて、多変量分散分析ウィルクスのラムダ分布（Wilks' lambda distribution）を行った。
　生理食塩水を投与したコントロール群（n=60）とpoly(I:C)を投与した母体免疫活性化の影響を受けた群（母体免疫活性化群（n=78））の各元素の値を用い、線形判別分析で各元素に対する判別係数を求めた。判別に使用する各元素の判別係数と各元素の実測値の掛け算を行い、それらと定数の和を判別スコアとした。各検体の判別スコアをプロットした時、コントロール群と母体免疫活性化群を最も効率よく区別できるラインを設定し、そのスコアよりも低ければ母体免疫活性化の影響を受けた仔マウスと判定し、そのスコアよりも高ければコントロール群と判定した。
Ex. (Liの判別係数x Liの実測値)+(Naの判別係数x Naの実測値)+・・・+( Csの判別係数 x Csの実測値) +定数=判別スコア。
　＜結果＞
　19元素（Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Cs）全てを使用した判別式を用いた場合に最も判別能が良く、この場合の判別的中率（＝的中数／判定対象数）は92.24%であった。
　試験例2．社会性コミュニケーションの障害とメタロームとの相関
　試験例1-1で得られた仔マウスについて、採血前（生後7日齢）に、社会性コミュニケーション障害の程度を測定した。具体的には、次のようにして測定した。母子間における超音波発声コミュニケーションの測定により行った。母親と一緒に哺乳しているケージから生後7日齢の仔マウスを1匹取り出し、500mlビーカー内に入れて防音箱の中に入れ、上部から仔マウスが発した超音波の鳴声をマイクから収集して解析した（UltraSoundGate 116H（AviSoft社製））。測定時間は3分間で3分間に鳴いた声の回数を記録した。測定後は仔マウスを速やかに母親のいる哺乳ケージに戻した。測定値と、一部の元素（Se、Rb、及びMo）の量との相関を調べた結果を図１に示す。図１に示されるように、社会性コミュニケーション障害の程度と元素量は相関することが分かった。
　試験例3．自閉スペクトラム症の判定
　＜試験例3-1．サンプル調製＞
　定型発達群（TD, n=59）と自閉スペクトラム症群（ASD, n=18）のヒト被検体を準備した。自閉スペクトラム症の診断はDSM-5に基づく。事前にインフォームドコンセントと書面による同意を得たのち、空腹時の午前に採血を行った。採血管はテルモ製ベノジェクトII真空採血管（EDTA-2Na入り採血量5ml）型番VP-NA050Kを使用し、得られた血液を30分室温にて静置した後、1200G、10分間、室温で遠心分離を行い、上清を別チューブに回収して血漿検体とした。
　＜試験例3-2．血漿サンプルの元素分析＞
　血漿50μLを測定容器に取り分け、そこへ酸（硝酸と過酸化水素の混合物）を加えて加熱分解を行った。血漿に対し50倍希釈になるように超純水で希釈を行い、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS、Agilent社製 Agilent7800、使用ソフト：Mass Hunter 4.3 Workstation Software for 7800 ICP-MS バージョンC.01.03（ビルド：505.16））で21種の元素（Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, Ti）の量を測定した。血漿の代わりに超純水で同様の操作を行ったものを操作ブランクとした。
　＜試験例3-3．判別式の作成、及び判定＞
　統計処理はエクセル統計 BellCurve for Excel（version 2.21）を用いて、多変量分散分析ウィルクスのラムダ分布（Wilks' lambda distribution）を行った。
　定型発達群と自閉スペクトラム症群の各元素の値を用い、線形判別分析で各元素に対する判別係数を求めた。判別に使用する各元素の判別係数と各元素の実測値の掛け算を行い、それらと定数の和を判別スコアとした。図２に示されるように、各検体の判別スコアをプロットした時、定型発達群と自閉スペクトラム症群を最も効率よく区別できるラインを設定し、そのスコアよりも高ければ自閉スペクトラム症群と判定し、そのスコアよりも低ければ定型発達群と判定した。
Ex. (Liの判別係数x Liの実測値)+(Naの判別係数x Naの実測値)+・・・+(TIの判別係数 x TIの実測値) +定数=判別スコア。
　＜結果＞
　図２に示されるように、21元素（Li, Na, Mg, P, S, K, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, Ti）全てを使用した判別式を用いた場合に最も判別能が良く、この場合の判別的中率（＝的中数／判定対象数）は90.91%であった。
　また、19元素（Na, Mg, P, S, K, Ca, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cs, Ba, Ti）を使用した判別式を用いた場合の判別的中率は87.01%であり、9元素（Li, Na, P, Mn, Fe, Co, Se, Rb, Ba）を使用した判別式を用いた場合の判別的中率は88.31%であり、8元素（Na, P, Fe, Co, As, Se, Rb, Ba）を使用した判別式を用いた場合の判別的中率は84.42%であった。
　試験例4．薬物依存症モデルマウスの判定
　＜試験例4-1．薬物依存症モデルマウスの作製、サンプル調製＞
　6週齢のオスマウス（C57BL/6JJmsSlc）を日本エスエルシー株式会社より入手した。7週齢目から5日間連続で覚醒剤であるメタンフェタミンもしくは生理食塩水を腹腔内投与した。メタンフェタミンの腹腔内投与方法は、メタンフェタミン投与量が2mg/kgになるようにメタンフェタミン塩酸塩（製品名：ヒロポン）（大日本住友製薬製）を生理食塩水で調整し、インスリン用シリンジ（マイジェクター）を用いて1日1回、5日間連続投与しすることで薬物依存症モデルマウスを作製した。５日目の投与後6時間後に麻酔下で心臓から直接採血を行い、得られた血液を30分室温にて静置した後、1200G、10分間、室温で遠心分離を行い、上清を別チューブに回収して血清サンプルとした。
　＜試験例4-2．血漿サンプルの元素分析＞
　血清25μLを測定容器に取り分け、そこへ酸（硝酸と過酸化水素の混合物）を加えて加熱分解を行った。血清に対し50倍希釈になるように超純水で希釈を行い、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS、Agilent社製 Agilent7800、使用ソフト：Mass Hunter 4.3 Workstation Software for 7800 ICP-MS バージョンC.01.03（ビルド：505.16））で19種の元素（Li , Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As , Se, Rb, Sr, Mo, Cs）の量を測定した。血清の代わりに超純水で同様の操作を行ったものを操作ブランクとした。
　＜試験例4-3．判別式の作成、及び判定＞
　統計処理はエクセル統計 BellCurve for Excel（version 2.21）を用いて、多変量分散分析ウィルクスのラムダ分布（Wilks' lambda distribution）を行った。
　コントロール群と薬物依存症群の各元素の値を用い、線形判別分析で各元素に対する判別係数を求めた。判別に使用する各元素の判別係数と各元素の実測値の掛け算を行い、それらと定数の和を判別スコアとした。図３に示されるように、各検体の判別スコアをプロットした時、コントロール群と薬物依存症群を最も効率よく区別できるラインを設定し、そのスコアよりも高ければ薬物依存症群と判定し、そのスコアよりも低ければコントロール群と判定した。
Ex. (Liの判別係数x Liの実測値)+(Naの判別係数x Naの実測値)+・・・+(TIの判別係数 x TIの実測値) +定数=判別スコア。
　＜結果＞
　図３に示されるように、19元素（Li , Na, Mg, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As , Se, Rb, Sr, Mo, Cs）を使用した判別式を用いた場合、判別的中率は90.53%であった。

Claims (12)

  1. （1）被検体から採取された体液試料におけるミネラル元素を検出する工程を含む、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患を検査する方法。
  2. （2）前記工程（1）で検出されたミネラル元素の量又は濃度に基づいて、前記被検体が前記疾患に罹患しているか否か、及び／又は前記被検体が前記疾患に今後罹患する可能性を判定する工程、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（2）において、ミネラル元素の量又は濃度に基づいて作成された判別式を使用して前記判定を行う、請求項２に記載の方法。
  4. 前記疾患が発達障害である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記疾患が自閉スペクトラム症である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記工程（2）において前記被検体が依存症及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種に今後罹患する可能性を判定する、請求項２又は３に記載の方法。
  7. 前記ミネラル元素がLi、Na、Mg、P、S、K、Ca、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Ag、Cs、Ba、及びTiからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ミネラル元素がアルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、遷移金属元素、半金属元素、及び非金属元素を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記体液試料が全血、血清、及び血漿からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記被検体がヒトである、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
  12. 被検物質で処理された動物から採取された体液試料における、ミネラル元素の量又は濃度を指標とする、発達障害、依存症、及び精神疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
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