WO2020228612A1 - 酪氨酸血症i型猴模型及其建立方法和应用 - Google Patents

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Definitions

  • the invention also discloses a tyrosinemia type I monkey model obtained by the method for establishing a tyrosinemia type I monkey model.
  • A is the ratio of the two gene mutation types in each tissue; B is the sequencing results of the two mutation types; the underlined letters are the target sequences of TALEN cutting; the italic letters represent the inserted bases; --- represents the missing Base; WT represents the wild-type gene sequence; MT1 and MT2 represent the two mutant forms of the FAH mutant cynomolgus monkey genome.
  • A is FAH immunohistochemical staining
  • B is HE staining
  • Bar 50 ⁇ m

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Abstract

提供了一种酪氨酸血症I型猴模型及其建立方法和应用，该方法包括FAH基因TALEN靶点的设计，FAH基因敲除TALEN质粒的构建，基因打靶RNA片段的获取、筛选及FAH基因敲除猴模型的制备。该模型的建立可为后续开展基因治疗、细胞治疗此类遗传性代谢缺陷疾病的研究和临床转化带来可靠的标准动物模型，也为传统药物的筛选及有效性安全性评价等提供更接近于患者的动物模型。

Description

酪氨酸血症I型猴模型及其建立方法和应用 技术领域
本发明涉及医学动物疾病模型技术领域，特别是涉及一种酪氨酸血症I型猴模型及其建立方法和应用。
背景技术
酪氨酸血症I型(hereditary tyrosinemia type 1，HT1)(OMIM276700)是一种典型的遗传性代谢缺陷(Inborn errors of metabolism，IEM)疾病。HT1是由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)基因突变造成的，属于常染色体隐性遗传病，编码该基因的序列位于15q23-q25,含有14个外显子，迄今为止共发现96种FAH基因突变，其中将近84种为致病基因型。该基因是酪氨酸代谢通路的最后一个代谢酶，其缺失导致体内酪氨酸及琥珀酰丙酮等大量蓄积，引起高酪氨酸血症表型，对机体造成严重损伤并危及生命。血或尿琥珀酰丙酮增高是诊断HT1的必要条件。急性HT1多发于出生后6个月内，病情可迅速进展为肝衰竭并导致死亡；慢性型病情相对稳定，但长期的慢性肝、肾功能损害通常导致患者在10岁左右因肝衰竭或肝细胞瘤而死亡。
HT1在临床上尚无有效的根治方式，主要依赖减少酪氨酸及苯丙酮酸的摄入。Nitisinone(2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己烷二酮，2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione,NTBC)是近年来开发的用于减轻该疾病症状的药物，为4-羟基苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，相当于将HT1转变为酪氨酸血症Ⅲ型患者，可减轻患者的疾苦，其4年存活率可达88％，但也有研究表明该药物在缓解症状的同时会增加罹患肝癌的风险。同时此类药物价格相当高昂，按1岁幼儿平均10kg体重计算，每天服用1mg/kg，一年仅药物费用就高达17万美元。除此之外，还存在部分患者对药物无反应或者服药后仍导致肝癌，最终需要选择肝移植进行治疗。然而供体器官的严重短缺已成为一个世界性的难题，且术后仍摆脱不了终身进行免疫抑制治疗。
基因治疗技术的出现给HT1的治疗带来了希望，HT1患者不存在不可逆的发育损伤，有可能通过修复肝细胞而得到有效的根治。研究表明，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修复FAH基因敲除小鼠不足1％的肝细胞，这些正常 细胞就能逐渐再生富集、恢复肝脏功能并达到治愈疾病的目的，这在威尔逊氏病、B型血友病等IEM疾病小鼠模型的研究中也都得到证实，因此发展基因治疗这一新的疗法对延长IEM患者的生命有着非常重要的意义。
尽管啮齿类动物模型为人类疾病研究做出了重要的贡献，但一些遗传性疾病小鼠模型并不能完全重现患者的表型。啮齿类动物不仅难以模拟与人类认知及大脑发育相关的疾病类型，对部分其他组织器官疾病的模拟也存在局限性，例如携带与人类Fanconi贫血相同基因缺陷的转基因小鼠没有表现出人类骨髓发育缺陷的典型症状。FAH基因敲除小鼠、大鼠、兔子及猪等模型已有报道，但这些模型在个体及发病进程等方面与HT1患者存在较多差异，仅能初步评价基因治疗的有效性，不是最佳的基因治疗临床前评价动物模型。因此迫切需要寻求更接近人的动物模型来建立全面的评价体系。
灵长类动物其平均寿命较长，在解剖、生理机能及生化代谢等方面与人类十分相似，因此可能更适于评价基因治疗的有效性及长期的安全性，有望建立基因治疗临床前的评价体系。传统的基因敲除技术繁琐耗时，在生殖周期长的灵长类动物中几乎无法实现。而新型的基因编辑技术的出现得以通过对受精卵的直接基因改造快速获得基因敲除猴模型。TALEN基因编辑技术具有靶向特异、脱靶效应低等特点，是制备基因缺陷动物的良好工具。
然而，目前FAH基因敲除食蟹猴模型尚未见报道。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种酪氨酸血症I型猴模型及其建立方法和应用，本申请中应用TALEN基因编辑技术建立了定向FAH基因敲除的方法，建立了HT1猴模型，为后续开展基因治疗、细胞治疗此类遗传性代谢缺陷疾病的研究和临床转化带来可靠的标准动物模型，也为传统药物的筛选及有效性安全性评价等提供更接近于患者的动物模型。
一种酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)针对FAH基因进行分析设计，以外显子EXON1和/或EXON2作为切割位点，构建TALEN靶向修饰基因载体质粒，合成TALEN mRNA；
(2)将上述得到的TALEN mRNA以原核显微注射方式注入猴受精卵；
(3)将上述经显微注射的受精卵进行体外培养，植入代孕母猴，孕育至生殖；
(4)取上述新生猴组织，进行验证，通过即得酪氨酸血症I型猴模型。
上述验证可通过获取新生猴组织获取基因组DNA，通过基因型检测、蛋白表达检测、血液学检测及组织病理学检测等手段进行验证，并且该具体验证手段可以根据情况调整。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，所述TALEN靶向修饰基因载体中，靶点识别的碱基序列为16-17bp，spacer间隔序列为14-16bp之间。由于靶点针对的外显子在病人中存在有效的功能失活突变，并容易造成后续的移码突变，通过上述设计容易获得具有明显的表型的疾病模型；同时该序列设计在兼顾有效性的同时能有效减少脱靶效应的产生。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，所述TALEN靶向修饰基因载体质粒中，靶向FAH基因的TALEN左臂和右臂序列如下：
TALEN-T1左臂：GCTCGCCAGCATGTCCT(SEQ ID NO.1)；
TALEN-T1右臂：GGGGAAGTCGGAATCCT(SEQ ID NO.2)；
TALEN-T2左臂：CCACAACCTGCCCTAC(SEQ ID NO.3)；
TALEN-T2右臂：GCTCACGTCGCCTCTG(SEQ ID NO.4)；
TALEN-T3左臂：CCTAGCCAAGACTGAGG(SEQ ID NO.5)；
TALEN-T3右臂：CCAGGATCTGGTCGCC(SEQ ID NO.6)。
以上述TALEN左臂和右臂序列进行切割敲除，具有较高的切割活性。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，通过以下方法将TALEN靶向修饰基因载体质粒线性化并进行体外转录，得到TALEN mRNA：
a)线性化：先通过酶切上述得到的TALEN靶向修饰基因载体质粒，使其线性化，再使用QIAquick PCR Purification Kit回收、纯化线性化的TALEN靶向修饰基因载体质粒，得线性化产物；
b)体外转录：取上述线性化产物，以mMESSAGE mMACHINE TM SP6 Transcription Kit进行体外转录，得到TALEN mRNA。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，所述猴受精卵通过以下方法得到：
通过向母猴连续注射重组人促卵泡激素和重组人促性腺激素，超数排卵获得卵母细胞，利用电刺激采精法获得食蟹猴精子，通过胞质内精子注射，进行人工授精，即得猴受精卵。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，向所述猴受精卵注射10-50pl TALEN  mRNA左右臂混合液，所述混合液中左臂序列浓度为10-50ng/μl，右臂序列浓度为10-50ng/μl。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中，将上述经显微注射的受精卵置于培养箱中，继续培养至囊胚或移植入代孕母猴体内。
在其中一个实施例中，所述步骤(4)中，所述验证包括：
a)基因型鉴定：提取食蟹猴胚胎基因组DNA，以下述引物组进行PCR扩增目的基因序列，随后进行测序鉴定；
上游引物Fah T3F：GGGAACACAGATTCTTTTCCGTT(SEQ ID NO.7)；
下游引物Fah T3R：TTGTCTGTCTCAAAACAACCCCAA(SEQ ID NO.8)；
b)蛋白表达检测：通过细胞Western blot及组织免疫化学检测蛋白表达；
c)血液学检测：通过分离血清检测肝功能及全血检测凝血功能及氨基酸浓度；
d)组织病理学检测：通过穿刺取得肝脏样品，进行组织固定及切片处理，获得电镜、组织切片HE染色检测结果。
可以理解的，上述进行PCR扩增方法按照常规条件即可，如可利用DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304)获得基因组DNA，通过加入上述特定PCR引物及DNA聚合酶(Thermo Scientific TM，EP0041)在Bio-Rad PCR仪上运行相应程序。再通过将PCR产物进行T7en1酶切电泳检测及制备TA克隆测序。且上述试剂厂家型号也并非是唯一指定的，常规的试剂同样可以达到类似的目的。
本发明还公开了上述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法得到的酪氨酸血症I型猴模型。
本发明还公开了上述的酪氨酸血症I型猴模型在用于酪氨酸血症I型疾病的研究和药物的筛选及有效性、安全性评价研究中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明是一种酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，通过对FAH基因进行TALEN靶点设计，FAH基因敲除TALEN质粒的构建，基因打靶RNA片段的获取、筛选及FAH基因敲除猴模型的制备，对所得到的新生猴进行基因型鉴定分析，以及生理、病理表型分析，明确其具有人类酪氨酸血症I型患者的疾病表现，经检测鉴定最终获得FAH基因敲除猴模型，并该模型的建立有望为后续开展基因治疗、细胞治疗此类遗传性代谢缺陷疾病的研究和临床转化带来可靠的标 准动物模型，也为传统药物的筛选及有效性安全性评价等提供更接近于患者的动物模型。
且该方法所优选构建的HT1猴模型的靶点，具有高效、低脱靶及表型清楚的特点。
附图说明
图1为实施例1中TALEN质粒载体的图谱。
图2为实施例1中Luciferase SSA检测TALEN活性示意图。
其中：A为TALEN活性检测示意图；B为FAH各靶点活性检测结果。
图3为实施例1中TALEN mRNA注射后受精卵正常发育示意图。
其中：A，B和C分别代表2细胞，4细胞和囊胚阶段。
图4为实施例1中FAH-T3 mRNA在食蟹猴受精卵的靶向效率。
其中：A:T7en1酶切验证FAH-T3 mRNA在食蟹猴受精卵基因组的打靶情况；
B:FAH-T3 mRNA在食蟹猴受精卵基因组的靶向效率的TA克隆测序结果；
1-11代表11个受精卵；WT代表对照的野生型受精卵；M为marker；下划线字母为TALEN切割的靶点序列；斜体字母小写字母代表插入/替换的碱基；---代表缺失的碱基。
图5为实施例1中FAH突变食蟹猴各组织和细胞基因组的TA克隆测序示意图。
其中：A为两种基因突变类型在各组织中的比例；B为两种突变类型的测序结果；下划线字母为TALEN切割的靶点序列；斜体字母代表插入的碱基；---代表缺失的碱基；WT代表野生型基因序列；MT1、MT2代表FAH突变食蟹猴基因组的两种突变形式。
图6为实施例1中FAH突变食蟹猴FAH蛋白表达检测Western blot结果示意图。
其中，WT为对照组，FAH-/-代表纯合子，FAH+/-代表杂合子；Dfs为皮肤成纤维细胞；PBMCs为外周血细胞。
图7为实施例2中FAH突变食蟹猴肝脏组织病理检测。
其中：A为FAH免疫组化染色；B为HE染色；(Bar＝50μm)。
图8为实施例2中透射电镜观察对照组与FAH突变食蟹猴肝脏组织的亚细 胞结构。
其中：放大倍数分别为2400x和13500x。
图9为实施例2中FAH突变食蟹猴体重变化和血液氨基酸代谢检测结果。
图10为实施例2中FAH突变食蟹猴血液生化指标和凝血功能检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中所用原料，除非特别说明外，均为市售购得。
实施例1
一种酪氨酸血症I型猴模型，通过以下方法建立得到：
1、针对FAH基因进行分析设计，以外显子EXON1和/或EXON2作为切割位点，构建TALEN靶向修饰基因载体质粒，合成TALEN mRNA；具体如下：
(1)靶点选择。
通过对FAH基因序列进行分析，设计了3对TALEN靶向载体，靶点识别的碱基序列为16-17bp，spacer间隔序列为14-16bp之间；靶向切割位点均选择在靠前的外显子EXON1和EXON2上，以期形成DNA编码序列移码或突变，达成基因敲除目的。
设计的靶向Fah基因的TALEN左臂和右臂序列：
TALEN-T1左臂：GCTCGCCAGCATGTCCT(SEQ ID NO.1)；
TALEN-T1右臂：GGGGAAGTCGGAATCCT(SEQ ID NO.2)；
TALEN-T2左臂：CCACAACCTGCCCTAC(SEQ ID NO.3)；
TALEN-T2右臂：GCTCACGTCGCCTCTG(SEQ ID NO.4)；
TALEN-T3左臂：CCTAGCCAAGACTGAGG(SEQ ID NO.5)；
TALEN-T3右臂：CCAGGATCTGGTCGCC(SEQ ID NO.6)。
(2)构建TALEN靶向修饰基因载体质粒。
参考维尚立德公司的TALEN载体构建试剂盒操作说明，通过酶切连接的方式构建TALEN质粒载体。
载体的基本结构如图1所示，构建成功的载体用下表1所示引物作双向测序。
表1. TALE repeat序列测序引物
Figure PCTCN2020089238-appb-000001
(3)TALEN靶点活性评估。
体外检TALEN活性采用的是单链复性(Single-strand annealing，SSA)方法，SSA报告载体中报告基因为荧光素(Luciferase)基因。
将TALEN质粒、SSA报告质粒、Renilla plasmid共转染293细胞(购自ATCC)，1-2天后裂解收集细胞，检测荧光素酶活性，评估TALEN的切割活性，结果如图2所示。
图2中A为TALEN活性检测示意图；B为FAH各靶点活性检测结果；A中方块1代表终止密码子序列，方块2代表TALEN靶点序列。
从上述结果中可以看出，三对打靶序列均具有切割活性，且FAH-T1具有最佳的切割活性，利用成纤维细胞进一步验证证实FAH-T3效率最高最稳定，后续实验采用该打靶序列进行。
(4)合成TALEN mRNA。
a)线性化：
先通过酶切上述得到的TALEN靶向修饰基因载体质粒，使其线性化，线性化TALEN质粒酶切体系如下表所示，在37℃恒温水浴3h。
表2.线性化TALEN质粒酶切体系
Figure PCTCN2020089238-appb-000002
再使用QIAquick PCR Purification Kit回收、纯化线性化的TALEN靶向修饰基因载体质粒，得线性化产物，具体步骤如下：
I.酶切体系中加入250μl Buffer PB，充分混匀，颜色为淡黄色；
II.将QIAquick柱子放入2ml收集管内，将混合液加入到柱子里，13000rpm离心1分钟；
III.丢弃废液，加入0.75ml Buffer PE，13000rpm离心1分钟；
IV.再次丢弃废液，13000rpm离心2分钟；将柱子放入干净的1.5ml EP管，室温晾干5分钟；
V.加入30μl RNase-Free H 2O，室温放置5分钟，13000rpm离心1分钟；
VI.取2μl回收产物用Nanodrop测量线性质粒的浓度及纯度，产物在-20℃保存。
b)体外转录：
取上述线性化产物，以mMESSAGE mMACHINE TM SP6 Transcription Kit，参照其说明书操作，进行体外转录，操作过程中使用RNase-Free EP管和RNase-Free枪头，反应体系如下表，得到TALEN mRNA。
表3. TALEN mRNA体外转录反应体系
Figure PCTCN2020089238-appb-000003
具体操作为：放入PCR仪，37℃恒温反应6h；反应结束后，加入1μl TURBO Dnase，混匀离心，37℃恒温反应15min。
(5)利用MEGAclear TM Kit纯化。
回收TALEN mRNA体外转录产物，操作如下：
a)向上一步的祥品中加入Elution Solution至总体积为100μl，充分混匀后，转移至RNase-Free EP管中；
b)加入350μl Binding Solution，充分混匀；再加入250μl无水乙醇，充分混 匀；
c)将混合液全部加入到吸附柱中，10000×g离心30s；
d)丢弃收集管中的废液，向吸附柱中加入0.75ml Wash Solution，10000×g离心30s，重复操作一次；
e)再次丢弃废液，10000×g离心2分钟；
f)将吸附柱转移至新的1.5ml RNase-Free EP管中；室温晾干5min；
g)往吸附柱中加入50μl预热的Elution Solution，室温放置5min，10000×g离心1min；取2μl回收的mRNA产物用Nanodrop测量浓度及纯度，mRNA产物分装后在-80℃保存。
2、将上述得到的TALEN mRNA以原核显微注射方式注入猴受精卵；具体如下：
(1)食蟹猴受精卵获取。
通过连续注射重组人促卵泡激素和重组人促性腺激素超数排卵获得卵母细胞，利用电刺激采精法获得食蟹猴的精子，进行胞质内精子注射，进行人工授精，获得猴受精卵。
(2)TALEN mRNA注射。
在进行胞质内精子注射(ICSI)8-12h后，往受精卵显微注射TALEN mRNA左右臂混合液(每种浓度为10-50ng/μl)，置于培养箱中继续培养至囊胚或移植入代孕母猴体内。
将体外转录的TALEN mRNA载体注射入食蟹猴受精卵细胞后，早期胚胎的发育时间和生长状态均无明显的改变，说明注射TALEN mRNA无毒副作用，不影响胚胎的正常发育，结果如图3所示，图中：A，B和C分别代表2细胞，4细胞和囊胚阶段。
3、将上述经显微注射的受精卵进行体外培养，植入代孕母猴，孕育至生殖，得酪氨酸血症I型猴模型。
(1)食蟹猴胚胎基因组DNA提取和基因敲除效率检测。
利用玻璃毛细吸管将食蟹猴胚胎细胞收集到PCR管，5000rpm离心1min，吸弃培养液，管底留大约2-5μl液体；用单细胞基因组提取试剂盒提取胚胎细胞的DNA：蛋白酶K和Lysis Buffer以体积比1:17配置成10x Lysis Buffer；稀释成1x Lysis Buffer，加入到装有食蟹猴胚胎的PCR管中，轻轻混匀，50℃反应1h， 99℃反应5min；收集产物在-20℃保存。
通过PCR扩增目的基因序列后进行TA克隆测序鉴定。加入特定PCR引物(上游引物Fah T3F：GGGAACACAGATTCTTTTCCGTT(SEQ ID NO.7)及下游引物Fah T3R：TTGTCTGTCTCAAAACA ACCCCAA(SEQ ID NO.7))及DNA聚合酶(Thermo Scientific TM，EP0041)，充分混匀，在Bio-Rad PCR仪上运行程序为1：95℃，5min；2：95℃，20s；3：55～65℃，30s；4：72℃，1-2min；重复第2歩到第4步，30-32个循环；5：72℃，10min；6：12℃保存。
结果如图4所示，图中，A为T7en1酶切验证FAH-T3 mRNA在食蟹猴受精卵基因组的靶向效率；B为FAH-T3 mRNA在食蟹猴受精卵基因组的靶向效率的TA克隆测序结果；1-11代表11个受精卵；WT代表野生型的对照；M为marker；下划线字母为TALEN切割的靶点；斜体字母代表插入碱基；---代表缺失的碱基序列。
从上述T7en1酶切结果表明，73％的胚胎(11个受精卵中的8个)DNA能被错配酶识别并切割，进一步DNA测序结果显示除E2、E7、E11外其他胚胎均含有突变基因，其中E4、E5、E6、E10未检测到野生型基因序列，可能是类似纯合子的双等位基因突变类型或者嵌合体。
(2)FAH突变食蟹猴DNA测序分析。
总共从各组织细胞PCR产物中挑选约200个TA克隆菌落进行sanger测序，结果显示，FAH突变食蟹猴属于双等位基因突变，各组织细胞基因组的两种突变形式接近1:1，未检测到野生型FAH基因序列(图5A)；其中一条染色体在敲除位点缺少了12个碱基(MT1)；另一条染色体则缺少了92个碱基，随机插入1个碱基(MT2)，结果见图5B。
(3)蛋白免疫印迹(Western blot)。
a)收集食蟹猴DFs和PBMCs细胞，加入蛋白酶抑制剂和RIPA溶液，混匀放置于冰上30min后再超声充分裂解细胞，12000rpm，4℃离心1min，取上清蛋白质溶液测定浓度。取等量的蛋白加入loading buffer，100℃变性10min，取样进行SDS-PAGE垂直电泳分离；
b)将分离的蛋白条带恒流200mA，2h转膜到硝酸纤维素膜上，用5％BSA室温封闭1h，加入一抗过夜孵育，用TBST洗3次，5min/次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，用TBST洗3次，5min/次；于暗房中显影、定影。
结果如图6所示，提取了食蟹猴皮肤成纤维细胞和外周血细胞的总蛋白分析FAH蛋白的表达情况：与对照组相比，FAH+/-杂合子食蟹猴的皮肤成纤维细胞中FAH蛋白的表达量明显减少，FAH-/-纯合子突变中几乎不表达FAH蛋白；在PBMCs细胞中FAH+/-杂合子的FAH蛋白表达与WT组差别不大，FAH-/-纯合子突变则没有检测到FAH蛋白的表达。
以上结果显示，通过本实施例的方法成功建立了酪氨酸血症I型猴模型。
实施例2
FAH基因敲除食蟹猴肝脏组织病理和生理指标检测。
(1)免疫组织化学：
a)石蜡切片放置于60℃烘箱2h，立即放入二甲苯中洗脱三次，10min/次；依次放入梯度酒精：100％，5min；95％，5min；80％，5min；70％，5min；再两次放入蒸馏水中，10min/次。
b)抗原修复：加入柠檬酸盐缓冲液，加热至96℃维持15min，室温冷却。
c)加入过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，避光室温10min，PBS洗2次，5min/次；
d)滴加山羊血清封闭10min；加入适当浓度的一抗孵育过夜；
e)PBS洗2次，5min/次；依照迈新免疫组化和DAB显色试剂盒操作说明，依次加入B液、C液、D液，显色后用苏木素复染细胞核。
f)使用70％-100％酒精梯度脱水，二甲苯透明15min后用中性树脂封片，显微镜下观察及拍照。
结果如图7A所示，与对照组相比，FAH突变猴肝脏细胞中几乎不表达FAH蛋白。
(2)HE染色：
a)肝脏组织切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染色5min,自来水冲洗；
b)0.5％盐酸乙醇(0.5mlHCl+100ml70％乙醇)分化30s；
c)自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min；
d)置伊红液2min；
e)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)1min→95％乙醇(Ⅱ)5min→100％乙醇(I)5min→100％乙醇(Ⅱ)5min→二甲苯乙醇(1:1)5min→二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→二甲苯(Ⅲ)5min→中性树脂封固片。
结果如图7B所示，FAH-/-纯合子突变食蟹猴部分肝脏细胞发生肿胀，细胞间隙缩小，肝血窦减少。
(3)肝脏活检：
将食蟹猴用氯胺酮麻醉后，采用侧卧姿势，在B超引导下，用规格12G的活检针取样约1-1.5cm长度的肝脏组织。
将上述肝脏组织进行透射电镜检测，具体方法为：肝脏活检的样品取出后，截取1/3立即放入含2.5％戊二醛的固定液中，制片并拍照观察肝脏亚细胞结构。
结果如图8所示，FAH-/-纯合子突变食蟹猴出现细胞肿胀，细胞间隙减小，细胞器特别是内质网数量减少，糖原堆积，部分细胞出现核固缩，核膜不整，线粒体有轻度肿胀等肝脏细胞损伤的表型。
(4)血液氨基酸检测：
取静脉血滴在专用的检测卡片上，待完全浸透晾干后送达安基因公司检测。
结果如图9所示，在NTBC撤药(NTBC off)后，FAH-/-纯合子突变猴体重增长缓慢至平台期(图9A)，继续给药后，体重开始恢复增长；血清中酪氨酸(Tyr)和琥珀酰丙酮(SA)都显著高于对照组(图9B)。
(5)血清肝功能指标：
静脉抽取1.5-2ml血液，取部分10000rpm/min室温离心5min分离血清用于检测其中的甲胎蛋白(AFP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标，另外通过全血检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。
结果如图10所示，FAH突变猴谷草转氨酶(AST)升高了近1倍，甲胎蛋白(AFP)远高于对照组，提示可能存在肝细胞损伤；活化部分凝血活酶时间(APTT)延长，提示可能存在凝血功能障碍。
从上述结果可以看出，实施例1建立的酪氨酸血症I型猴模型，明确具有人类酪氨酸血症I型患者的疾病表现，确认模型构建成功。
并且该模型的建立可为后续开展基因治疗、细胞治疗此类遗传性代谢缺陷疾病的研究和临床转化带来可靠的标准动物模型，也为传统药物的筛选及有效性安全性评价等提供更接近于患者的动物模型。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

  1. 一种酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
    (1)针对FAH基因进行分析设计，以外显子EXON1和/或EXON2作为切割位点，构建TALEN靶向修饰基因载体质粒，合成TALEN mRNA；
    (2)将上述得到的TALEN mRNA以原核显微注射方式注入猴受精卵；
    (3)将上述经显微注射的受精卵进行体外培养，植入代孕母猴，孕育至生殖；
    (4)取上述新生猴组织，进行验证，通过即得酪氨酸血症I型猴模型。
  2. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述TALEN靶向修饰基因载体中，靶点识别的碱基序列为16-17bp，spacer间隔序列为14-16bp之间。
  3. 根据权利要求2所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述TALEN靶向修饰基因载体质粒中，靶向FAH基因的TALEN左臂和右臂序列如下：
    TALEN-T1左臂：GCTCGCCAGCATGTCCT(SEQ ID NO.1)；
    TALEN-T1右臂：GGGGAAGTCGGAATCCT(SEQ ID NO.2)；
    TALEN-T2左臂：CCACAACCTGCCCTAC(SEQ ID NO.3)；
    TALEN-T2右臂：GCTCACGTCGCCTCTG(SEQ ID NO.4)；
    TALEN-T3左臂：CCTAGCCAAGACTGAGG(SEQ ID NO.5)；
    TALEN-T3右臂：CCAGGATCTGGTCGCC(SEQ ID NO.6)。
  4. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，通过以下方法将TALEN靶向修饰基因载体质粒线性化并进行体外转录，得到TALEN mRNA：
    a)线性化：先通过酶切上述得到的TALEN靶向修饰基因载体质粒，使其线性化，再使用QIAquick PCR Purification Kit回收、纯化线性化的TALEN靶向修饰基因载体质粒，得线性化产物；
    b)体外转录：取上述线性化产物，以mMESSAGE mMACHINE TM SP6 Transcription Kit进行体外转录，得到TALEN mRNA。
  5. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述猴受精卵通过以下方法得到：
    通过向母猴连续注射重组人促卵泡激素和重组人促性腺激素，超数排卵获得卵母细胞，利用电刺激采精法获得食蟹猴精子，通过胞质内精子注射，进行人工授精，即得猴受精卵。
  6. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中，向所述猴受精卵注射10-50pl TALEN mRNA左右臂混合液，所述混合液中左臂序列浓度为10-50ng/μl，右臂序列浓度为10-50ng/μl。
  7. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将上述经显微注射的受精卵置于培养箱中，继续培养至囊胚或移植入代孕母猴体内。
  8. 根据权利要求1所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述验证包括：
    a)基因型鉴定：提取食蟹猴胚胎基因组DNA，以下述引物组进行PCR扩增目的基因序列，随后进行测序鉴定；
    上游引物Fah T3F：GGGAACACAGATTCTTTTCCGTT(SEQ ID NO.7)；
    下游引物Fah T3R：TTGTCTGTCTCAAAACAACCCCAA(SEQ ID NO.8)；
    b)蛋白表达检测：通过细胞Western blot及组织免疫化学检测蛋白表达；
    c)血液学检测：通过分离血清检测肝功能及全血检测凝血功能及氨基酸浓度；
    d)组织病理学检测：通过穿刺取得肝脏样品，进行组织固定及切片处理，获得电镜、组织切片HE染色检测结果。
  9. 权利要求1-8任一项所述的酪氨酸血症I型猴模型的建立方法得到的酪氨酸血症I型猴模型。
  10. 权利要求9所述的酪氨酸血症I型猴模型在用于酪氨酸血症I型疾病的研究和药物的筛选及有效性、安全性评价研究中的应用。
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