WO2020122311A1 - 고정화 효소 칵테일을 사용한 바이오매스의 당화 및 발효 방법 - Google Patents

고정화 효소 칵테일을 사용한 바이오매스의 당화 및 발효 방법 Download PDF

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라훌 굽타쿠마르
오타리사친
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for saccharification and fermentation of biomass using an immobilized enzyme cocktail, and relates to the production of bioethanol from biomass using magnetic nanoparticles immobilized with an enzyme cocktail.
  • Biofuel is a sustainable energy source made from biomass in the natural world.Biomass is a concept that encompasses organic matters of organisms such as animals, plants, and microorganisms. There are many types of food waste, industrial waste based on living things, and crops grown for the purpose of producing biofuels (energy crops). The biomass can be converted into solid, liquid, and gaseous biofuels by applying physical, chemical, and biological technologies. Examples of biofuels include bioalcohols, such as bioethanol, bioethanol, biomethanol, and biobutanol, which can be used as alternative gasoline, and biodiesel, as an alternative fuel for diesel.
  • bioalcohols such as bioethanol, bioethanol, biomethanol, and biobutanol, which can be used as alternative gasoline, and biodiesel, as an alternative fuel for diesel.
  • the bioethanol production process is largely composed of collection and pretreatment of raw crops, saccharification using enzymes, fermentation process of the produced sugar, and pure separation of the produced ethanol.
  • saccharification enzyme is used at the production cost. The ratio is about 30-50%, and it is difficult to reduce the production cost of wood-based bioethanol without improving the enzyme production process in a domestic environment where all the glycosylated enzymes produced by a specific company are imported.
  • biomass saccharification process cellulose is converted into glucose or hemicellulose is broken down into xylose or mannose, and enzymes such as cellulase and hemicellulase act as catalysts.
  • the enzymes used in the saccharification process are very expensive materials and are a major cause of increasing the cost of total bioenergy production or biorefinery.
  • the saccharification process of biomass takes a considerable time (72 to 144 hours).
  • the three-dimensional structure of the enzyme is modified and loses the enzyme activity. There are many. This makes it difficult to use the enzyme repeatedly, which increases the cost of the entire saccharification process.
  • the enzyme is used alone, it is difficult to recover the used enzyme, which causes a decrease in the reuse rate of the enzyme.
  • lignocellulosic biomass produced in agriculture is recognized worldwide as a low-cost source for producing bioethanol due to its high availability (Tye, YY, Lee, TK, Abdullah, WWN, Leh, CP, The world availability of non-wood lignocellulosic biomass for the production of cellulosic ethanol and potential pretreatments for the enhancement of enzymatic saccharification Renew Sust Energ Rev, 2016, 60, 155-172.).
  • rice straw is one of the world's major crops and produces vast residues, making it attractive as a source of bioethanol production.
  • An object of the present invention is to provide an enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing bioethanol.
  • the present invention provides an enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex.
  • the present invention provides a method for preparing an enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex.
  • the present invention provides a method for saccharifying biomass.
  • the present invention provides a method for producing bioethanol.
  • the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex of the present invention can enhance stability and suppress the inhibition of the process through enzyme immobilization, and when the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex of the present invention is used, agricultural waste resources Since it can produce biofuels economically and efficiently by saccharifying and fermenting with high efficiency, it can be applied to various application fields.
  • A Fe 3 O 4 nanoparticles
  • FIG. 2 shows Fe 3 O 4 nanoparticles modified with APTES and GLA (Fe 3 O 4 +APTES + GLA), and Fe 3 O 4 nanoparticles modified with APTES and GLA with immobilized laccase (Fe 3 O 4 + laccase).
  • Fe 3 O 4 nanoparticles modified with APTES and GLA immobilized with BGL Fe 3 O 4 + BGL
  • Fe 3 O 4 nanoparticles modified with APTES and GLA immobilized with celluclast 1.5 L (Fe 3 O 4 + Celluclast 1.5L) is a diagram confirming the FT-IR spectrum.
  • 3 is a diagram confirming the enzyme immobilization of the enzyme-immobilized double-modified magnetic nanoparticles by confocal laser scanning microscopy image:
  • D-F A-C phase difference image.
  • 4 is a diagram confirming the activity of liberated or immobilized enzymes at various pH and temperature ranges.
  • FIG. 5 is a view showing the total phenol production (A) and saccharification yield (B) according to the concentration of pretreated acid in rice straw.
  • Figure 6 shows the Lacise in an enzyme cocktail containing free enzymes. This is a diagram confirming the total phenol reduction effect:
  • Peak 8 ferulic acid.
  • FIG. 7 is a diagram showing the HPLC profile (280 nm) of a standard phenolic compound:
  • Peak 4 caffeic acid
  • Peak 7 ferulic acid.
  • A ethanol production by fermentation
  • Magnetic nanoparticles with immobilized enzyme cocktail (celluclast 1.5L, BGL and laccase).
  • terminal are terms used to properly represent a preferred embodiment of the present invention, which may vary according to a user, an operator's intention, or customs in the field to which the present invention pertains. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout the specification. Throughout the specification, when a part “includes” a certain component, it means that the component may further include other components, not to exclude other components, unless otherwise stated.
  • the present invention relates to an enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex wherein an enzyme cocktail is immobilized on magnetic nanoparticles.
  • the magnetic nanoparticles can be modified with glutaraldehyde (Glutaraldehyde, GLA) or 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), glutaraldehyde and 3-aminopropyltrie It may be modified in the order of oxysilane. In one example, it was higher in both IY and IE for immobilization of enzyme cocktails in APTES-GLA double-modified nanoparticles compared to GLA-modified nanoparticles.
  • glutaraldehyde Glutaraldehyde, GLA
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the enzyme cocktail is endo- ⁇ -1,4-glucanase (endo- ⁇ -1,4-gulcanase), cello-biohydrolase, and endoxylanase , ⁇ -glucosidase ( ⁇ -glucosidase) and may be a mixture of two or more enzymes selected from the group consisting of laccase, endo- ⁇ -1,4-glucanase, ⁇ -glucosidase, More preferably, it consists of cello-biohydrolase and lacase.
  • the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex immobilized with the enzyme cocktail of the present invention is celluclast 1.5 L, which is a mixture of endo- ⁇ -1,4-glucanase, ⁇ -glucosidase, and cello-biohydrolase. , ⁇ -glucosidase (BGL) and magnetic nanoparticles were prepared with the racase immobilized.
  • the inclusion of an enzyme cocktail in the lacise significantly reduces the phenolic compound produced during the pretreatment process of the biomass and subsequently increased in the enzymatic saccharification process, negatively affecting enzymatic hydrolysis (glycosylation), reducing sugar yield. (About 58.3%) to reduce the effect of improving the saccharification yield.
  • the magnetic nanoparticles may be Fe 3 O 4 nanoparticles.
  • the present invention comprises the steps of preparing Fe 3 O 4 nanoparticles; Modifying the nanoparticles; And comprising the step of immobilizing the enzyme cocktail, enzyme cocktail-relates to a method for preparing a magnetic nanoparticle complex.
  • the modification of the magnetic nanoparticles can be modified with glutaraldehyde or 3-aminopropyltriethoxysilane, and can be double modified with glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane. .
  • the enzyme cocktail is endo- ⁇ -1,4-glucanase (endo- ⁇ -1,4-gulcanase), cello-biohydrolase, and endoxylanase , ⁇ -glucosidase ( ⁇ -glucosidase) and may be a mixture of two or more enzymes selected from the group consisting of laccase, endo- ⁇ -1,4-glucanase, ⁇ -glucosidase, More preferably, it consists of cello-biohydrolase and lacase.
  • the present invention comprises the steps of pre-treating the biomass; And comprising the step of saccharifying the enzyme cocktail of claim 1-magnetic nanoparticle complex, relates to a method for saccharification of biomass.
  • separating the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex from the saccharification reaction can continuously perform saccharification (hydrolysis reaction).
  • the pretreatment may be 0.2 to 0.9% of H 2 SO 4 treatment and heating, and more preferably 0.5% of H 2 SO 4 pretreatment. In one embodiment, when pre-treated with 0.5% H 2 SO 4 , it was found that there was an effect of minimizing the level of phenol compound production during saccharification.
  • saccharification may be performed at pH 4 to 6 and 40 to 60° C. under conditions of 150 to 250 rpm.
  • the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex may be a magnetic nanoparticle complex immobilized with endo- ⁇ -1,4-glucanase, ⁇ -glucosidase, cello-biohydrolase, and lacase.
  • the present invention comprises the steps of pre-treating the biomass; The step of saccharifying with the enzyme cocktail-magnetic nanoparticle complex of claim 1; And it relates to a method for producing bioethanol comprising the step of fermentation.
  • Fe 3 O 4 particles (0.5) were functionalized with GLA (Glutaraldehyde) (2%) in phosphate buffer (100 mM, pH 7.0) and incubated at 25° C. for 2 hours. Then, functional modification was performed in toluene using 2% (v/v) 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) and incubated at 200° C. for 12 hours at 25° C. The particles were then washed sequentially with acetone, ethanol and distilled water. Thereafter, APTES-modified particles were further activated using GLA (2%) to obtain APTES-GLA-modified particles.
  • GLA Glutaraldehyde
  • phosphate buffer 100 mM, pH 7.0
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the enzyme was immobilized on APTES-GLA-modified magnetic nanoparticles by incubating at 150 rpm for 24 hours at 4°C in a buffer solution (50 mM). After collecting NPs using an external magnetic field, the concentration of the supernatant enzyme was determined by the Bradford method.
  • the immobilization yield (IY) and efficiency (IE) of APTES-GLA-modified magnetic nanoparticles and enzymes were calculated through Equations 1 and 2 below.
  • the effect of pH on the activity of enzyme immobilized APTES-GLA-modified magnetic nanoparticles and free enzyme was confirmed at a pH in the range of 3.0-7.0.
  • activity at a temperature in the range of 30-60° C. was also confirmed (at each optimum pH value).
  • the immobilization yield was 18.2-94.0, 28.2-83.3 and 38.0-79.3%, respectively, of celluclast 1.5 L, BGL and laccase (Table 2).
  • the optimal pH values for celluclast 1.5 L, BGL and laccase immobilized on Fe 3 O 4 particles modified by GLA were found to be 7.0, 4.0 and 5.0, respectively, and immobilized on the double modified particles with APTES-GLA.
  • the cases were 7.0, 4.5 and 5.5, respectively.
  • the optimal immobilization yield was 78.3, 73.2 and 62.7%, respectively, in celluclast 1.5 L, BGL and laccase immobilized on GLA-modified particles (Table 2), and IE was 65.8, 94.2 and 71.4%, respectively.
  • APTES-GLA double-modified particles were higher in both IY and IE than in GLA-modified particles (94.0 and 93.2%, respectively, of IY and IE for celluclast 1.5L, 83.3 and 94.6% for BGL and 79.3 and 88.2% for laccase, respectively).
  • the immobilized celluclast 1.5L, BGL and laccase showed higher optimal pH values compared to the respective free enzymes (pH5.0, 4.5 and 4.0), and higher optimal Temperature values are shown (immobilized enzymes: 55.0, 55.0 and 45°C, respectively, and free enzymes: 50.0, 50.0 and 40°C, respectively).
  • immobilized enzymes retained higher residual activity over a wide pH range and temperature range compared to free enzymes (FIG. 4 ).
  • rice straw (Oryza sativa L) (Phygen Co. Ltd., Daejeon, Republic of Korea) was dried, sliced to a length of 5 cm, and then crushed and sieved to 4 mm. The moisture content and other ingredients of rice straw were confirmed according to the standard protocol of the National Renewable Energy Laboratory (NREL USA).
  • dilute acid H 2 SO 4 , 0.5%)
  • the rice straw (20 g) are mixed with three different concentrations of sulfuric acid (0.1, 0.5 and 1.0%), and water is added to the final ratio. Achieve 1:6 (v/v).
  • the slurry was heated at 121° C. for 60 minutes.
  • the solid biomass was collected by filtration, washed with water until the pH became neutral, and then dried at 60°C. Thereafter, the components of the biomass before and after pretreatment were confirmed.
  • the biomass contained 35.5% cellulose, 25.6% hemicellulose, and 16% lignin as the main components, and the total dry biomass ash content was 9.0%, but 0.1, 0.5%.
  • hemicellulose was found to be 13.2, 8.5 and 6.2%, respectively, while cellulose was 48.0, 53.0 and 46.0%, respectively, and lignin was significantly increased to 19.4, 21.2 and 22.7%, respectively.
  • the cellulose content in the pretreatment process was lower than that of 1.0% H 2 SO 4 (46%) compared to 0.5% H 2 SO 4 (53%).
  • saccharification was performed by reacting 0.4 g of biomass and 1.5 L of free enzyme 15 FPU celluclast and 15 IU BGL per gram of biomass in 20 mL of 0.05 M sodium citrate buffer (pH 5.0) in a 100 mL flask. Tween 80 (0.2%) was added as a surfactant, and tetracycline (40 mg/L) and cycloheximide (30 mg/L) were added to prevent microbial contamination. The reaction mixture was incubated at 50°C at 200 rpm for 48 hours. Samples were collected from the reaction mixture at time intervals, and then centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes to separate the liquid fraction.
  • the saccharification yield (SY) was calculated by the following equation (3).
  • temperature, pH and stirring speed were used as parameters. The range of temperature, pH and stirring speed were 35-55°C, 3.5-5.5 and 100-250 rpm, respectively.
  • the concentration of phenol compounds produced during saccharification of biomass pretreated with 0.1, 0.5 and 1.0% H 2 SO 4 was 48 hours after saccharification at initial concentrations of 0.29, 0.36 and 0.41 g/L of phenol compounds at each concentration. 0.61, 0.84, and 1.1 g/L, respectively, and the level of phenol compound production during saccharification was different according to the pre-treated H 2 SO 4 concentration (FIG. 5).
  • the yield of saccharification after 48 hours of saccharification of biomass pretreated with 0.1, 0.5 and 1.0% H 2 SO 4 was 53.0, 63.5 and 67.0%, respectively (FIG. 5).
  • the saccharification yield of the biomass pretreated with 0.5 and 1.0% acid did not show a significant difference, but the concentration of phenolic compound was higher (23.6%) in the biomass pretreated with 1.0% acid.
  • the biomass pretreated with cellulose content of 1.0% acid was lower than that pretreated with 0.5% acid, after which biomass pretreated with 0.5% H 2 SO 4 was used.
  • the optimum temperature, pH and stirring speed were shown at pH 5.0, 50°C and 200 rpm.
  • saccharification was performed only with celluclast 1.5L and BGL as the optimal saccharification conditions derived in Example 3-1, or , Saccharification was performed by adding laccase to compare saccharification yield and reducing sugar content.
  • Enzyme cocktails containing laccase contained 43.0%, 60.4%, 47.7%, 45.0%, and 94.2 gallic acid, 4-hydroxybenzoic acid, vanic acid, caffeic acid, siring acid, p-coumarinic acid, and ferulic acid, respectively, after 48 hours of saccharification. % And 48.2% ( Figures 6C and D, and Table 5).
  • the enzyme immobilized magnetic nanoparticles were recovered from the reaction mixture with an external magnetic field, and then washed with sodium citrate buffer (pH 5.0). After that, the recovered enzyme cocktail immobilized magnetic nanoparticles were repeatedly used for saccharification of biomass, and the saccharification profile and total phenol concentration were confirmed. In addition, the super-paramagnetic properties of the immobilized or not Fe 3 O 4 particles were confirmed, and the Fe 3 O 4 particles without immobilization of enzymes had a magnetization saturation value of 27.0 emu/g. The Fe 3 O 4 particles immobilized with the enzyme showed 16.9 emu/g (FIG. 8C ). The magnetic separation process of Fe 3 O 4 particles immobilized with an enzyme cocktail was inserted in FIG. 8C.
  • each rice hydrolyzate is reduced sugar. Concentrate until the concentration increases to 50 g/L. Thereafter, it was supplemented with a nutrient medium necessary for the growth of yeast during the fermentation process.
  • the nutrient medium consisted of 5 g/L yeast extract, 10 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 4.5 g/L KH 2 PO 4 and 1.0 g/L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, adjusted to pH 5.0 It was then sterilized at 110°C for 10 minutes.
  • Saccharomyces cerevisiae was inoculated. Fermentation was carried out at 200 rpm at 30° C. and analyzed for hourly ethanol concentration, reducing sugar content, and yeast cell growth pattern.
  • samples were collected at regular time intervals in a fermentation flask, followed by step dilution with saline (0.85% NaCl), spread on a YEPD agar plate, and incubated at 30°C for 48 hours. It was measured by growing yeast colonies to evaluate CFU (colony forming unit) on the medium.
  • fermentation efficiency (%) and ethanol productivity (g/L/h) were calculated using the following equations 4 and 5.
  • Theoretical ethanol yield (g/g) glucan concentration ⁇ 0.51, where 0.51 is a coefficient for converting glucose to ethanol.

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Abstract

본 발명은 효소 칵테일이 고정화된 자성 나노입자를 이용하여 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 것에 관한 것으로, 본 발명의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체는 효소 고정화를 통해, 안정성을 높이고 공정의 저해를 억제할 수 있으며, 본 발명의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 이용하면, 농산 폐자원을 고효율로 당화 및 발효하여 경제적 및 효율적으로 바이오연료를 생산할 수 있으므로, 이를 다양한 응용 분야에 적용할 수 있다.

Description

고정화 효소 칵테일을 사용한 바이오매스의 당화 및 발효 방법
본 발명은 고정화 효소 칵테일을 이용한 효율적인 바이오매스의 당화 및 발효 방법에 관한 것으로, 효소 칵테일이 고정화된 자성 나노입자를 이용하여 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 것에 관한 것이다.
고유가와 에너지안보, 온실가스 규제강화를 배경으로 대체에너지 개발이 화두로 떠오른 가운데, 차세대 연료로서 바이오연료의 보급이 급속히 진행되고 있다. 바이오 연료는 자연계에 있는 바이오매스(Bio mass)로부터 만들어지는 지속가능한 에너지원을 말하며, 바이오매스란 동물, 식물, 미생물 등 생물체의 유기물을 총망라하는 개념으로 각종 동식물을 비롯하여 농림업에서 나온 부산물 및 폐기물, 음식물 쓰레기, 생물체에 기초한 산업폐기물, 바이오 연료 생산을 목적으로 재배된 작물(에너지 작물) 등 그 종류가 매우 다양하다. 이러한 바이오매스는 물리, 화학, 생물학적 기술들이 적용되어 고체, 액체, 기체 상태의 바이오연료로 전환될 수 있다. 바이오 연료로서는 기존 휘발유 대체연료로 사용할 수 있는 바이오에탄올, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 등 바이오알코올과, 경유의 대체연료로서 바이오디젤 등을 들 수 있다.
일반적으로 바이오에탄올 생산공정은 크게 원료작물의 수집과 전처리, 효소를 이용한 당화, 제조된 당의 발효공정 및 제조된 에탄올의 순수분리과정으로 이루어지는데, 목질계 바이오에탄올 생산에 있어 당화효소가 생산 비용에서 차지하는 비율은 약 30-50%로 특정회사에서 독과점으로 생산되고 있는 당화효소를 전량 수입해야 하는 국내 환경에서 효소 생산 공정의 개선 없이는 목질계 바이오에탄올의 생산비용 절감이 어려운 상태이다. 바이오매스의 당화(saccharification) 공정은 셀룰로오스를 분해해서 글루코스로 변환하거나 헤미셀룰로오스를 분해해서 자일로스나 만노스(mannose) 등으로 분해하는 공정으로 셀룰라아제나 헤미셀룰라아제 같은 효소가 촉매로 작용한다. 이때, 상기 당화 공정에 사용되는 효소들은 매우 고가의 물질로서 전체 바이오에너지 생산이나 바이오리파이너리(biorefinery)의 비용을 증가시키는 주요 원인이 되고 있다. 또한, 바이오매스의 당화 공정은 상당한 시간(72~144시간)이 소요되는데 상기 당화 공정을 수행하는 동안 수용액 상에서 쉐이킹(shaking)되면서 효소의 3차원 구조가 변형되어 효소 활성(activity)을 잃게 되는 경우가 많다. 이는 효소의 반복적인 사용을 어렵게 만들어 전체 당화공정의 소요비용을 높이게 되며, 이 외에도 효소를 단독으로 사용하는 경우 사용된 효소를 회수하기가 쉽지 않아 효소의 재사용률이 낮아지는 원인이 되고 있다.
현재 대부분의 연료 에탄올은 효모(Saccharomyces cerevisiae)(맥주 또는 포도주 발효 효모)를 이용하여 옥수수 전분이나 사탕수수 시럽 등의 6탄당으로부터 바이오에탄올을 미생물과 효소를 이용한 생물학적 공정으로 생산하고 있으며, 기본적으로 당화합물로부터 만들어지므로 전분 이외의 탄수화물로도 생산이 가능하다. 그러나 이러한 당들은 생물원료 당으로서는 비교적 비싼 공급원이며 식품으로서의 경쟁적인 가치도 가지고 있고, 옥수수나 사탕수수 등의 곡물의 사용량이 증가함에 따라 곡물가격의 급등 등의 문제도 발생한다. 전분과 당은 식물 중 총 탄화수소의 단지 일부를 차지할 뿐이며, 줄기, 잎, 외피, 깍지, 속대 등에 존재하는 식물 탄화수소의 주된 형태는 구조적 세포벽, 중합체, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스이다. 따라서, 옥수수나 사탕수수가 아니라 식물 또는 나무의 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및 리그닌 등의 리그노셀룰로오스로부터 에탄올을 생산하는 기술에 대한 요구가 있어왔다. 풀이나 목재 등의 식물체는 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 및 리그닌으로 이루어진 복합체인 리그노셀룰로스로 이루어져 있는데, 탄수화물부분인 셀룰로스와 헤미셀룰로스가 리그닌과 강하게 결합되어 있고 생화학적 분해에 대한 특유의 견고성 때문에 셀룰라제(cellulase)와 같은 섬유소 분해효소로 처리하더라도 당으로의 분해 수율이 이론적 수율의 20% 정도밖에 분해되지 않는 문제점이 있었다.
일반적으로 농업에서 생산된 리그노셀룰로오스 바이오 매스는 고가용성으로 인해 바이오 에탄올을 생산하기 위한 저렴한 공급원으로서 전 세계적으로 인정받고 있다 (Tye, Y. Y., Lee, T. K., Abdullah, W. W. N., Leh, C. P., The world availability of non-wood lignocellulosic biomass for the production of cellulosic ethanol and potential pretreatments for the enhancement of enzymatic saccharification Renew　Sust Energ　Rev, 2016, 60, 155-172.). 농업 폐기물로서, 볏짚은 세계 주요 작물 중 하나이고 방대한 잔여물을 생산하기 때문에 바이오에탄올 생산 원천으로 매력적이다. 셰계식량농업기구 (FOA)에 따르면 2017 년 세계 쌀 생산량은 7 억 5 천 9 백만 톤이었으며, 이로 인해 약 11 억 4 천만 톤의 볏짚이 생성되었다 (Satlewal, A., Agrawal, R., Bhagia, S., Das, P., Ragauskas, A. J., Rice straw as a feed stock for biofuels: Availability, recalcitrance and chemical properties. Biofuels Bioprod Bioref, 2018, 12, 83-107.).
본 발명의 목적은 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 바이오매스의 당화 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 바이오에탄올의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이오매스의 당화 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 바이오에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체는 효소 고정화를 통해, 안정성을 높이고 공정의 저해를 억제할 수 있으며, 본 발명의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 이용하면, 농산 폐자원을 고효율로 당화 및 발효하여 경제적 및 효율적으로 바이오연료를 생산할 수 있으므로, 이를 다양한 응용 분야에 적용할 수 있다.
도 1은 효소 고정화된 이중 개질된 자성 나노입자의 FE-SEM 이미지를 확인한 도이다:
A: Fe3O4 나노입자;
B: Laccase 고정화된 Fe3O4 나노입자;
C: BGL 고정화된 Fe3O4 나노입자; 및
D: Celluclast 1.5L 고정화된 Fe3O4 나노입자.
도 2는 APTES 및 GLA로 개질된 Fe3O4 나노입자(Fe3O4 +APTES + GLA), laccase가 고정화된 APTES 및 GLA로 개질된 Fe3O4 나노입자(Fe3O4 + laccase), BGL가 고정화된 APTES 및 GLA로 개질된 Fe3O4 나노입자(Fe3O4 + BGL) 및 celluclast 1.5L가 고정화된 APTES 및 GLA로 개질된 Fe3O4 나노입자(Fe3O4 + celluclast 1.5L)의 FT-IR 스펙트럼을 확인한 도이다.
도 3은 효소 고정화된 이중 개질된 자성 나노입자의 효소 고정화를 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 이미지로 확인한 도이다:
A: FITC-표지된 laccase를 고정화한 나노입자;
B: FITC-표지된 BGL을 고정화한 나노입자;
C: FITC-표지된 celluclast 1.5L를 고정화한 나노입자; 및
D-F: A-C의 위상차 이미지.
도 4는 다양한 pH 및 온도 범위에서의 유리된 또는 고정화된 효소의 활성을 확인한 도이다.
도 5는 볏짚의 전처리 산 농도에 따른 총 페놀 생성 (A) 및 당화 수율(B)을 나타낸 도이다.
도 6은 유리 효소들을 함유하는 효소 칵테일에서 라케이즈의 총 페놀 감소 효과를 확인한 도이다:
A: 총 페놀 함량;
B: 당화 수율;
C: 라케이즈 없이 얻은 가수분해 용액의 HPLC 프로파일 (280 nm);
D: 라케이즈로 얻은 가수분해 용액의 HPLC 프로파일 (280 nm);
피크 1 및 4: unknown;
피크 2: gallic acid;
피크 3: 4-hydroxybenzoic acid;
피크 5: vanillic acid;
피크 6: syringic acid;
피크 7: p-coumaric acid; 및
피크 8: ferulic acid.
도 7은 표준 페놀 화합물의 HPLC 프로파일 (280 nm)을 나타낸 도이다:
피크 1: gallic acid;
피크 2: 4-hydroxybenzoic acid;
피크 3: vanillic acid;
피크 4: caffeic acid;
피크 5: syringic acid;
피크 6: p coumaric acid; 및
피크 7: ferulic acid.
도 8은 효소 고정화 자성 나노입자를 이용한 당화 특성을 확인한 도이다:
A: 총 페놀 함량;
B: 당화 수율;
C: 자기 특성(Magnetic property); 및
D: 고정화된 효소의 재사용성.
도 9는 바이오에탄올 생산 특성을 확인한 도이다:
A: 발효에 의한 에탄올 생산;
B: 발효 기간 중의 효모 성장 특성;
■: 유리 celluclast 1.5L 및 BGL;
●: 유리 효소 칵테일 (celluclast 1.5L, BGL 및 laccase); 및
▲: 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자.
않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 자성 나노입자에 효소 칵테일이 고정화된 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 자성 나노입자는 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde, GLA) 또는 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)으로 개질될 수 있으며, 글루타르알데하이드 및 3-아미노프로필트리에톡시실란의 순서로 이중 개질될 수 있다. 일 실시예에서, GLA-개질된 나노입에 비해 APTES-GLA 이중-개질된 나노입자에서 효소 칵테일의 고정화에 대해 IY 및 IE 모두에서 더 높게 나타났다.
일 구현예에서, 상기 효소 칵테일은 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-gulcanase), 셀로-비오하이드롤레이즈(cello-biohydrolase), 엔도자이라네이즈(endoxylanase), β-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 라케이즈(laccase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물일 수 있으며, 엔도-β-1,4-글루카나아제, β-글루코시데이즈, 셀로-비오하이드롤레이즈 및 라케이즈로 이루어진 것이 더욱 바람직하다. 일 실시예에서, 본 발명의 효소 칵테일이 고정화된 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체는 엔도-β-1,4-글루카나아제, β-글루코시데이즈, 셀로-비오하이드롤레이즈의 혼합물인 celluclast 1.5 L, β-글루코시데이즈(BGL) 및 라케이즈가 고정화된 자성 나노입자를 제조하였다. 일 실시예에서, 라케이즈를 효소 칵테일이 포함시킴으로써, 바이오매스의 전처리 과정 중에 생산되고 이 후의 효소 당화 과정에서 증가하며 효소 가수분해 (당화)에 부정적인 영향을 주어 당 수율을 감소시키는 페놀 화합물을 현저히 (약 58.3%) 감소시켜, 당화 수율을 향상시키는 효과가 있다.
일 구현예에서, 자성 나노입자는 Fe3O4 나노입자일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 Fe3O4 나노입자를 제조하는 단계; 상기 나노입자를 개질하는 단계; 및 효소 칵테일을 고정화하는 단계를 포함하는, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 자성 나노입자의 개질은 글루타르알데하이드 또는 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 개질될 수 있으며, 글루타르알데하이드 및 3-아미노프로필트리에톡시실란의 순서로 이중 개질될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 효소 칵테일은 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-gulcanase), 셀로-비오하이드롤레이즈(cello-biohydrolase), 엔도자이라네이즈(endoxylanase), β-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 라케이즈(laccase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물일 수 있으며, 엔도-β-1,4-글루카나아제, β-글루코시데이즈, 셀로-비오하이드롤레이즈 및 라케이즈로 이루어진 것이 더욱 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 바이오매스를 전처리하는 단계; 및 제 1항의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체로 당화하는 단계를 포함하는, 바이오매스의 당화 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 당화하는 단계 이후에, 당화 반응물에서 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 분리하는 단계; 및 분리한 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 세척하여 재사용하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단계를 반복하여 당화 (가수분해 반응)을 연속적으로 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전처리는 0.2 내지 0.9%의 H2SO4를 처리하고 가열하는 것일 수 있으며, 0.5%의 H2SO4로 전처리 한 것이 더욱 바람직하다. 일 실시예에서, 0.5%의 H2SO4로 전처리 한 경우에 당화 중 페놀 화합물 생성 수준이 최소화되는 효과가 있는 것으로 나타났다.
일 구현예에서, 당화는 pH 4 내지 6 및 40 내지 60℃에서 150 내지 250 rpm의 조건으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체는 엔도-β-1,4-글루카나아제, β-글루코시데이즈, 셀로-비오하이드롤레이즈 및 라케이즈가 고정화된 자성 나노입자 복합체일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 바이오매스를 전처리하는 단계; 제 1항의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체로 당화하는 단계; 및 발효하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
1. 효소 고정화-자성 나노입자 제조
1-1. APTES 개질된 Fe3O4 자성 나노입자 제조
Fe3O4 입자 (0.5)를 인산완충액 (100 mM, pH 7.0) 중의 GLA(Glutaraldehyde) (2%)로 기능화하였고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 2% (v/v) 3-aminopropyltriethoxysilane(APTES)을 이용하여 톨루엔에서 기능적 개질을 수행하고 25℃에서 12시간 동안 200 rpm으로 인큐베이션하였다. 그 후 입자들을 아세톤, 에탄올 및 증류수로 차례로 세척하였다. 그 후, APTES-개질된 입자들을 추가로 GLA (2%)을 이용하여 활성화시켜 APTES-GLA-개질된 입자를 얻었다.
1-2. 효소 고정화 APTES 개질된 자성 나노입자 제조 및 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자들과 효소 celluclast 1.5 L (EG, BGL, 및 CBH의 혼합), BGL(β-glucosidase), 및 laccase를 각각 100 mg/g을 완충 용액(50 mM)에서 4℃에서 24시간 동안 150rpm으로 인큐베이션함으로써 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자에 효소를 고정화하였다. 외부 자기장을 이용하여 NPs를 수집한 후 상등액 효소의 농도를 브래드포드 방법으로 결정하였다.
TGA 분석을 통해, 효소가 고정화되지 않은 APTES-GLA-개질된 입자가 7.8% 감소한 것에 비해 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase가 고정화된 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자의 경우 유의미한 중량 감소 (각각 16.8, 15.7 및 15.1%)를 나타내어, 효소의 고정화를 확인할 수 있었다 (표 1). 또한, FE-SEM으로 Fe3O4 나노입자에 효소가 고정화된 것을 확인하였다 (도 1). 추가로, APTES-GLA-개질된 나노입자에 고정화된 효소를 FTIR 분석으로 확인함으로써 효소의 Fe3O4 자성 나노입자로의 고정화를 확인하였다 (도 2). 아울러, APTES-GLA-개질된 나노입자 상의 고정화한 효소 celluclast 1.5L, BGL 및 laccase를 각각 FITC로 표지하고 CLSM으로 관찰한 결과, 녹색 형광이 명확하게 관찰되어, 개질된 나노입자의 표면에 효소가 적재된 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
[표 1]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-tb1
또한, APTES-GLA-개질된 자성 나노입자들과 효소들의 고정화 수율 (IY) 및 효율 (IE)은 하기 수학식 1 및 2를 통해 계산되었다. 효소 고정화된 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자 및 유리 효소의 활성에 대한 pH의 영향을 3.0-7.0 범위의 pH에서 확인하였다. 또한, 이와 유사하게, 30-60℃ 범위의 온도에서의 활성도 확인하였다 (각각의 최적 pH 값에서).
[수학식 1]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-math1
[수학식 2]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-math2
그 결과, 고정화 수율은 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase 각각 18.2-94.0, 28.2-83.3 및 38.0-79.3%로 나타났다 (표 2). GLA에 의해 개질된 Fe3O4 입자에 고정화된 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase에 대한 각각의 최적 pH값은 각각 7.0, 4.0 및 5.0로 나타났으며, APTES-GLA로 이중 개질된 입자에 고정화된 경우 각각 7.0, 4.5 및 5.5로 나타났다. 최적 고정화 수율은 GLA-개질된 입자에 고정화된 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase에서 각각 78.3, 73.2 및 62.7%로 나타났고 (표 2), IE는 각각 65.8, 94.2 및 71.4%로 나타났다. celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase의 고정화에 대해 IY 및 IE 모두에서 GLA-개질된 입자에 비해 APTES-GLA 이중-개질된 입자가 더 높게 나타났다 (celluclast 1.5L에 대해 IY 및 IE 각각 94.0 및 93.2%, BGL에 대해 각각 83.3 및 94.6%, 및 laccase에 대해 각각 79.3 및 88.2%).
[표 2]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-tb2
1-3. 효소 고정화 APTES 개질된 자성 나노입자의 온도 및 pH 영향 확인
상기 실시예에서 제조한 효소 고정화된 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자에 대한 온도 및 pH의 영향을 평가하였다. 구체적으로, 온도별 또는 pH별 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase 각각의 유리된 상태 또는 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자에 고정화된 상태에서의 효소 활성을 확인하였다. celluclast 1.5 L의 활성을 확인하기 위해 FPU로 표현되는 여과지 분석(filter paper assay)을 수행하였으며, BGL 활성은 p-NPG (p-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside; Sigma-Aldrich)를 이용하여 Ramachandran, P., Nguyen, N. P. T., Choi J. H., Kang, Y. C., et al., Optimization of βProduction by a strain of Stereum hirsutum and its Application in enzymatic saccharification. J. Microbiol. Biotechnol. 2013, 23, 351-356.에 기재된 방법으로 분석하였다. Laccase 활성은 Patel, S. K. S., Anwar, M. Z., Kumar, A., Otari, S. V. et al., Fe2O3 yolk-shel particle-based laccase biosensor for efficient detection of 2,6-dimethoxyphenol. Biochem. Eng. J. 2018, 132, 1-8.에 기재된 바와 같이 1 mM의 2,6-DMP를 이용하여 분광광도계로 측정하였다. 그 결과, 고정화된 celluclast 1.5L, BGL 및 laccase (pH5.5, 5.0 및 4.5)가 유리된 각각의 효소 (pH5.0, 4.5 및 4.0)에 비해 더 높은 최적 pH 값을 나타냈으며, 더 높은 최적 온도값을 나타냈다 (고정화된 효소: 각각 55.0, 55.0 및 45℃, 유리된 효소: 각각 50.0, 50.0 및 40℃). 전체적으로 고정된 효소가 유리 효소에 비해 넓은 pH 범위 및 온도 범위에서 더 높은 잔류 활성을 유지했다 (도 4). 또한, 25℃에서의 유리 효소들 laccase, BGL 및 celluclast 1.5L의 반감기 (t1/2)는 각각 17.2, 89.2 및 43.5 h인 반면, 고정화 후에는 각각 146, 625 및 371 h까지 향상되어, 효소의 안정성이 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자에 고정화된 후 현저히 향상된 것을 알 수 있었다.
2. 바이오매스 전처리
바이오매스로 볏짚 (Oryza sativa L) (Phygen Co. Ltd., Daejeon, Republic of Korea)을 사용하여, 이를 건조하고 5cm 길이로 조각낸 후 4mm로 분쇄 및 체질하였다. 볏짚의 수분 함량 및 다른 성분들을 National Renewable Energy Laboratory (NREL USA)의 표준 프로토콜에 따라 확인하였다. 바이오매스 전처리를 위해, 묽은 산 (H2SO4, 0.5 %)과 상기 볏짚 (20 g)을 세 가지 다른 농도의 황산 (0.1, 0.5 및 1.0%)과 혼합한 뒤, 물을 첨가하여 최종비 1:6 (v/v)를 달성하였다. 이 슬러리를 121℃에서 60분 동안 가열하였다. 전처리 후, 여과하여 고체 바이오매스를 수집한 뒤, pH가 중성이 될 때까지 물로 세척한 후, 60℃에서 건조하였다. 그 후, 전처리 전/후의 바이오매스의 성분을 확인하였다.
[표 3]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-tb3
그 결과, 상기 표 3과 같이, 전처리 전에 바이오매스는 주요 성분으로 셀룰로오스 35.5%, 헤미셀룰로오스25.6%, 및 리그닌 16%을 포함하고 있었고 총 건조 바이오매스의 회분 9.0%로 나타났으나, 0.1, 0.5% 및 1.0%의 황산으로 전처리한 후, 헤미셀룰로오스는 각각 13.2, 8.5 및 6.2%로 나타난 반면, 셀룰로오스는 각각 48.0, 53.0 및 46.0%로, 리그닌은 각각 19.4, 21.2 및 22.7%로 함량이 유의적으로 증가하였다. 또한, 전처리 과정에서 셀룰로오스 함량은 1.0% H2SO4 (46%)이 0.5% H2SO4 (53%)에 비해 더 낮게 나타났다. 이를 통해, 묽은 산의 전처리 동안 헤미셀룰로오스와 산 가용성 리그닌이 분해되어 제거된 것을 알 수 있었다.
3. 바이오매스의 당화
3-1. 전처리 조건에 따른 당화
상기 전처리 후 바이오매스에 존재하는 잔류 리그닌은 당화 중에 더 분해되어 페놀 화합물로 전환되며, 페놀 화합물은 바이오매스의 효소 가수분해에 부정적인 영향을 주어 당 수율을 감소시킨다. 페놀 화합물은 일반적으로 전처리 과정 중에 생산되며, 이의 농도는 이후의 효소 당화 단계에서 증가된다. 이에, 전처리에서 사용된 0.1-1.0 % 농도의 H2SO4와 이 후의 당화 과정에서 생산되는 페놀 화합물의 관계를 확인하였다. 상기 실시예 2에서 세 가지 농도의 H2SO4로 전처리한 바이오매스를 celluclast 1.5L 및 BGL로 당화하고, 당화 중 페놀 화합물 생성 정도를 확인하였다. 구체적으로, 100mL 플라스크에 0.05 M 시트르산 나트륨 완충액 (pH 5.0) 20mL에 바이오매스 0.4 g과 바이오매스 1그램 당 유리 효소 15 FPU celluclast 1.5 L 및 15 IU BGL를 넣어 반응시킴으로써 당화를 수행하였다. 여기에 Tween 80(0.2 %)를 계면활성제로서 첨가하고, 미생물 오염을 방지하기 위해 테트라사이클린 (40 mg/L) 및 사이클로헥시미드 (30 mg/L)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 200rpm으로 48시간 인큐베이션하였다. 샘플을 시간 간격을 두고 반응 혼합물에서 수집한 뒤 7000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 액상 분획을 분리하였다. 분리한 상등액을 이용하여 환원당 및 페놀 화합물 농도를 분석하였다. 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteau 방법에 따라 분석하였으며, 환원당 함량은 DNS 방법으로 확인하였다. 당화 수율 (SY)은 하기 수학식 3으로 계산하였다. 또한, 당화 공정을 최적화하기 위해, 온도, pH 및 교반 속도를 매개 변수로 사용하였다. 온도, pH 및 교반 속도의 범위는 각각 35-55℃, 3.5-5.5 및 100-250 rpm이었다.
[수학식 3]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-math3
그 결과, 0.1, 0.5 및 1.0%의 H2SO4를 이용하여 전처리한 바이오매스의 당화 중 페놀 화합물 생성 농도는 각 농도별 페놀 화합물의 초기 농도 0.29, 0.36 및 0.41 g/L에서 당화 48시간 후 각각 0.61, 0.84 및 1.1 g/L로 나타나, 전처리한 H2SO4 농도에 따라 당화 중 페놀 화합물 생성 수준이 다르게 나타났다 (도 5). 또한, 0.1, 0.5 및 1.0%의 H2SO4를 이용하여 전처리한 바이오매스의 당화 48시간 후 당화 수율은 각각 53.0, 63.5 및 67.0%로 나타났다 (도 5). 즉, 0.5 및 1.0%의 산으로 전처리된 바이오매스의 당화 수율은 유의적인 차이를 나타내지 않았으마, 페놀 화합물 농도는 1.0% 산을 전처리한 바이오매스에서 더 높게 (23.6%) 나타났다. 또한, 셀룰로오스의 함량이 1.0% 산으로 전처리한 바이오매스가 0.5% 산으로 전처리한 것에 비해 낮아, 이 후에는 0.5%의 H2SO4로 전처리한 바이오매스를 이용하였다. 아울러, 최적 온도, pH 및 교반 속도는 pH5.0, 50℃및 200 rpm으로 나타났다.
3-2. 효소 종류에 따른 당화
당화 및 폐놀 화합물의 환원에 대한 laccase의 영향 및 이의 최적 농도 (5-15 IU/기질g)를 확인하기 위해, 상기 실시예 3-1에서 도출한 최적 당화 조건으로 celluclast 1.5L 및 BGL만으로 당화하거나, 여기에 laccase를 추가하여 당화하여 당화 수율 및 환원당 함량을 비교하였다.
[표 4]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-tb4_co
그 결과, celluclast 1.5L 및 BGL에 laccase를 첨가한 경우 당화 결과 페놀 화합물의 농도가 감소되었으며 SY는 증가하였다. 가장 높은 당화 수율 및 환원당 함량인 76.5% 및 기질 g 당 환원당 521 mg이 최적 pH, 온도 및 교반 속도와 건조 중량 기준 laccase 최적 용량 10 IU/g 기질에서 나타났으나, laccase 없이는 SY가 63.5% 및 기질 g 당 환원당 434 mg으로 나타났다 (표 4). 또한, 시간에 따른 페놀 함량에서, celluclast 1.5 L 및 BGL를 조합하여 당화한 경우 48시간까지 페놀 함량이 증가했으나 (48시간 후 총 페놀 함량 0.84 g/L), laccase를 함께 이용하여 당화한 경우 58.3% 감소된 총 페놀 함량 0.35 g/L을 나타냈다 (도 6A). 또한, laccase가 없는 경우 더 낮은 SY (63.5%)를 나타냈으며, laccase를 함께 사용하여 당화한 경우에는 SY가 76.5%로 나타났으며 (도 6B), 이는 페놀 화합물의 농도에 따른 것으로 유추되었다. 아울러, 볏짚 가수분해물에서 페놀 화합물을 동정하고, 페놀 함량의 감소에 대한 laccase의 영향을 HPLC로 확인한 결과, laccase가 없는 대조군 샘플에서 페놀 화합물의 농도가 인큐베이션 시간에 따라 증가하였으나, 10U의 laccase를 사용해서 볏짚을 가수분해한 샘플에서는 페놀 함량이 감소하였다. 볏짚 바이오매스의 당화 혼합물 내에 존재하는 페놀 화합물을 HPLC로 정량한 결과, 갈산(gallic acid) (8.41 분), 4-하이드록시벤조산(hydroxybenzoic acid) (16.44 분), 바닐릭산(vanillic acid) (20.40 분), 카페익산(caffeic acid) (20.02 min), 시링산(syringic acid) (23.60 분), p-쿠마린산(coumaric acid) (27.12 분) 및 페룰산(ferulic acid) (29.58 분)이 존재하는 것으로 나타났다 (도 7). laccase를 포함하는 효소 칵테일은 당화 48시간 후에 갈산, 4-하이드록시벤조산, 바닐릭산, 카페익산, 시링산, p-쿠마린산 및 페룰산을 각각 43.0%, 60.4%, 47.7%, 45.0%, 94.2% 및 48.2%까지 감소시켰다 (도 6C 및 D, 및 표 5).
[표 5]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-tb5
3-3. 효소 고정화 자성 나노입자를 이용한 당화
상기 실시예를 통해 laccase를 추가하는 것이 페놀 화합물을 감소시켜 바이오매스의 SY를 유의적으로 증가시키는 것을 알 수 있으나, 가용성 형태의 유리 효소는 반응 혼합물 내에서 불안정하며 재사용이 불가능하다. 따라서, 상기 실시예 1에서 제조한 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자에 celluclast 1.5 L, BGL 및 laccase (15 FPU celluclast 1.5 L, 15 IU BGL 및 10 IU laccase)를 고정화하여 전처리한 바이오매스의 당화를 48시간 동안 진행하였다. 대조군으로, 유리 효소들, 및 laccase가 없이 celluclast 1.5 L 및 BGL만이 고정화된 APTES-GLA-개질된 자성 나노입자를 이용하였다.
그 결과, 당화 초기 36시간까지 고정화 효소 칵테일이 유리 효소 칵테일에 비해 당화가 느리게 진행되는 것으로 나타났으나, 48시간 후에, 고정화 효소 칵테일의 SY가 유리 효소 칵테일에 비해 높게 나타났다. 또한, laccase가 포함된 효소 칵테일이 고정된 나노입자의 경우 당화 48시간 후 최대 SY 값은 84.6%로 나타났으나, laccase가 없는 효소 칵테일이 고정된 나노입자의 경우 SY가 68.2%에 불과하였다 (도 8A). 또한, laccase가 없이 효소 칵테일이 고정된 나노입자의 경우, 초기 페놀 화합물의 농도 0.34 g/L가 48시간 당화 후 0.88 g/L로 증가하여 61.4%의 증가율을 나타냈으나, laccase가 함께 고정된 나노입자의 경우 0.23 g/L의 페놀 화합물 농도를 나타냈다 (도 8B). 즉, 고정화된 효소 칵테일에 laccase가 존재하면 총 페놀 농도가 73.8% 감소하고 SY가 19.8% 증가한 것으로 나타났다. 이를 통해, laccase가 함께 고정화된 나노입자는 당화 반응에서 페놀 화합물을 감소시키고 당화 효율을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
3-4. 효소 고정화 자성 나노입자의 재사용
상기 실시예 3-3의 당화 후, 효소 고정화 자성 나노입자를 재사용하기 위해, 외부 자기장으로 반응 혼합물로부터 효소 고정화 자성 나노입자를 회수한 뒤, 시트르산 나트륨 완충액 (pH 5.0)으로 세척하였다. 그 후 회수한 상기 효소 칵테일이 고정화된 자성 나노입자를 바이오매스의 당화에 반복 사용하면서, 당화 프로파일 및 총 페놀 농도를 확인하였다. 또한, 고정화되거나 되지 않은 Fe3O4 입자의 초상자성(super-paramagnetic) 특성을 확인하였으며, 효소가 고정화되지 않는 Fe3O4 입자는 27.0 emu/g의 자기화 포화 값(magnetization saturation value)을 나타냈으며, 효소가 고정화된 Fe3O4 입자는 16.9 emu/g를 나타냈다 (도 8C). 효소 칵테일이 고정화된 Fe3O4 입자의 자기 분리 과정을 도 8C에 삽입하였다.
그 결과, 재사용 당화는 8 사이클까지 수행되었으며, 전처리된 바이오매스의 당화는 효소의 76.0% 이상을 재사용 4 사이클까지 유지하였으며, 8 사이클 후에 61.6%로 감소하였다. 재사용 4 사이클 및 8 사이클 후의 상대적인 SY는 각각 90.0% 및 73.4%로 나타났다 (도 8D).
3. 바이오매스의 발효를 통한 바이오에탄올 생산
유리 celluclast 1.5L 및 BGL, 유리 효소 칵테일 (celluclast 1.5L, BGL 및 laccase), 및 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자를 이용한 당화 후에, 각각의 볏짚 가수분해물을 환원당 농도가 50 g/L로 증가할 때까지 농축하였다. 그 후, 이를 발효 과정 중에 효모의 성장에 필요한 영양 배지로 보충되었다. 영양배지는 5 g/L yeast extract, 10 g/L (NH4)2 SO4, 4.5 g/L KH2PO4 및 1.0 g/L MgSO4·7H2O로 이루어졌으며, pH5.0로 맞춘 뒤 110℃에서 10분 동안 멸균하였다. 배지를 식힌 뒤, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하였다. 발효는 30℃에서 200rpm으로 수행되었으며, 시간별 에탄올 농도, 환원당 함량 및 효모 세포 성장 패턴에 대해 분석하였다. 볏짚 가수분해물에서의 효모 세포의 생존능 및 성장은 발효 플라스크에서 일정 시간 간격으로 샘플을 수집한 뒤 식염수 (0.85% NaCl)로 단계 희석하여 YEPD 아가 플레이트에 스프레딩한 뒤 이를 30℃에서 48시간 동안 배양하여 효모 콜로니를 성장시켜 배지 상의 CFU(colony forming unit)를 평가함으로써 측정되었다. 또한, 발효 효율 (%) 및 에탄올 생산성 (g/L/h)이 하기 수학식 4 및 5를 이용하여 계산되었다.
[수학식 4]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-math4
이론적 에탄올 수율 (g/g)=글루칸 농도× 0.51, 상기 0.51는 글루코오스를 에탄올로 전환시키는 계수임.
[수학식 5]
[규칙 제91조에 의한 정정 25.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-math5
그 결과, 유리 celluclast 1.5L 및 BGL; 및 유리 효소 칵테일 (celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)로 당화한 가수분해물을 이용한 사카로마이세스 세레비지에에 의한 발효 결과, 최대 에탄올 생산량은 각각 42시간 및 48시간 후에 관찰되었다. 또한, 유리 celluclast 1.5L 및 BGL를 이용한 당화물로 발효한 경우, 수득한 에탄올 농도, 생산성 및 발효 효율은 각각 12.9 g/L, 0.27 g/L/h 및 58.7%로 나타났으며, 유리 효소 칵테일 (celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)을 이용한 당화물을 발효한 경우에는 각각 15.8 g/L, 0.376 g/L/h 및 72.0%로 나타났다. 또한, 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자를 이용한 당화물을 발효한 경우에는 발효 36시간 후에 수득한 에탄올 농도, 생산성 및 발효 효율이 각각 17.2 g/L, 0.478 g/L/h 및 78.3%로 나타났다 (도 9A). 효모 세포 성장 패턴을 분석한 결과, S. cerevisiae의 성장이 발효 48시간까지 관찰되었으며, 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자를 이용한 당화물을 발효한 경우에 효모의 최대 성장이 관찰되었고, 유리 celluclast 1.5L 및 BGL를 이용한 당화물을 발효한 경우에 효모의 최소 성장이 관찰되었다 (도 9B). 유리 celluclast 1.5L 및 BGL, 및 유리 효소 칵테일 (celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)로 당화한 가수분해물을 이용하여 24시간 발효 후에 세포 밀도는 각각 8.1 × 106 및 6.5 × 106 CFU/mL로 나타났으며, 발효 48시간 후 세포 생존율은 각각 7.6 × 106 및 5.8 × 106 CFU/mL로 감소하였다. 반면, 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자를 이용한 당화물을 발효한 경우에는 발효 24시간 및 48시간에 각각 8.7 × 106 및 8.0 × 106 CFU/mL의 세포 생존율을 나타내, 효소 칵테일(celluclast 1.5L, BGL 및 laccase)이 고정화된 자성 나노입자를 이용하여 당화한 당화물을 사용하여 발효하는 경우 효모 세포의 성장 및 생존에 유리한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 자성 나노입자에 효소 칵테일이 고정화된 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체.
  2. 제 1항에 있어서, 자성 나노입자는 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) 및 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane)으로 개질된, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체.
  3. 제 1항에 있어서, 효소 칵테일은 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-gulcanase), 셀로-비오하이드롤레이즈(cello-biohydrolase), 엔도자이라네이즈(endoxylanase), β-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 라케이즈(laccase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물인, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체.
  4. 제 1항에 있어서, 자성 나노입자는 Fe3O4 나노입자인, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체.
  5. a) Fe3O4 나노입자를 제조하는 단계;
    b) 상기 나노입자를 개질하는 단계; 및
    c) 효소 칵테일을 고정화하는 단계를 포함하는, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 나노입자의 개질은 글루타르알데하이드 및 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 순차적으로 이중 개질하는, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 고정화된 효소 칵테일은 엔도-β-1,4-글루카나아제, 셀로-비오하이드롤레이즈, 엔도자이라네이즈, β-글루코시데이즈 및 라케이즈로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물인, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체의 제조 방법.
  8. a) 바이오매스를 전처리하는 단계; 및
    b) 제 1항의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체로 당화하는 단계를 포함하는, 바이오매스의 당화 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 당화하는 단계 이후에
    1) 당화 반응물에서 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 분리하는 단계; 및
    2) 분리한 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체를 세척하여 재사용하는 단계를 추가로 포함하는, 바이오매스의 당화 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 전처리는 0.2 내지 0.9%의 H2SO4를 처리하고 가열하는 것인, 바이오매스의 당화 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 당화는 pH 4 내지 6 및 40 내지 60℃에서 150 내지 250 rpm의 조건으로 수행되는, 바이오매스의 당화 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체는 엔도-β-1,4-글루카나아제, β-글루코시데이즈, 셀로-비오하이드롤레이즈 및 라케이즈가 고정화된 자성 나노입자 복합체인, 바이오매스의 당화 방법.
  13. a) 바이오매스를 전처리하는 단계;
    b) 제 1항의 효소 칵테일-자성 나노입자 복합체로 당화하는 단계; 및
    c) 발효하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102616471B1 (ko) 2021-10-28 2023-12-21 충북대학교 산학협력단 나노입자를 이용한 리그노셀룰로오스 바이오매스 전처리 방법
KR20230171299A (ko) 2022-06-13 2023-12-20 충북대학교 산학협력단 나노입자 또는 나노입자와 효소의 조합을 이용한 리그노셀룰로오스 바이오매스로부터의 발효가능 당 생산 방법
KR20240091548A (ko) 2022-12-14 2024-06-21 건국대학교 산학협력단 메탄산화세균에 의한 메탄올 생산을 향상시키기 위한 바이오 폐기물의 암발효 및 혐기성 소화에 유래한 바이오가스 공동 소화

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130046205A (ko) * 2011-10-27 2013-05-07 전남대학교산학협력단 맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법
KR20170044778A (ko) * 2015-10-15 2017-04-26 금오공과대학교 산학협력단 당화효소-자성 나노입자 복합체 및 이의 제조방법
KR20170109152A (ko) * 2016-03-18 2017-09-28 금오공과대학교 산학협력단 당화효소-자성 나노입자-그래핀 옥사이드 나노혼성 복합체 및 이의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101946882B1 (ko) * 2017-01-31 2019-02-13 고려대학교 산학협력단 셀룰로오스계 바이오매스 당화용 조성물 및 이를 이용한 당화율 개선 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130046205A (ko) * 2011-10-27 2013-05-07 전남대학교산학협력단 맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법
KR20170044778A (ko) * 2015-10-15 2017-04-26 금오공과대학교 산학협력단 당화효소-자성 나노입자 복합체 및 이의 제조방법
KR20170109152A (ko) * 2016-03-18 2017-09-28 금오공과대학교 산학협력단 당화효소-자성 나노입자-그래핀 옥사이드 나노혼성 복합체 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIA, J. ET AL.: "Novel magnetic cross-linked cellulase aggregates with a potential application in lignocellulosic biomass bioconversion", MOLECULES, vol. 22, no. 269, 2017, pages 1 - 14, XP055717625 *
SONG, Q. ET AL.: "Cellulase immobilization on superparamagnetic nanoparticles for reuse in cellulosic biomass conversion", AIMS BIOENGINEERING, vol. 3, no. 3, 17 July 2016 (2016-07-17), pages 264 - 276, XP055717627 *

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