WO2020101136A1 - Jak2-stat3-kdm3a 신호전달 경로를 표적으로 하는 암치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Jak2-stat3-kdm3a 신호전달 경로를 표적으로 하는 암치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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김동하
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Definitions

  • JAK2 (Janus tyrosine kinase 2) -signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling pathways are essential pathways for cell development, cell differentiation and homeostasis regulation, and JAK2-STAT3 pathway regulation disorders are associated with cancer development It is known to be related.
  • JAK2 is a non-receptor tyrosine phosphorylase that induces the cytoplasmic signal transduction process
  • JAK2 is also present in the nucleus of human hematopoietic cells and is known to act as a direct phosphorylase of histone H3Y41. When JAK2 is activated, it activates transcription factor STAT3.
  • STAT3 is phosphorylated by JAK2 and forms a stable homodimer or heterodimer to induce local activation of the target gene.
  • This abnormal response of the JAK2-STAT3 signaling pathway has been shown to induce abnormal cell proliferation, migration and anti-cell death in various types of cancer (Griffiths DS , et al. (2011) LIF-independent JAK signaling to chromatin in embryonic stem cells uncovered from an adult stem cell disease.Nature cell biology 13 (1): 13-21 .; Marotta LL , et al.
  • KDM3A is known to activate androgen receptor target genes such as PSA and NKX3.1 by regulating the process of transcription activation in metabolism and sperm formation, and Korea Patent Publication No. 2017-0112755 uses the KDM3A gene as a marker for diagnosing blood cancer. It starts.
  • KDM3A and JAK2-STAT3 signaling are unknown. Furthermore, no regulatory mechanism for KDM3A transcriptional activation and inhibition related to the JAK2-STAT3 signaling pathway during cancer development or progression has been identified.
  • This application aims to identify essential epigenetic factors necessary for the development of therapeutic agents for cancer related to activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway.
  • the present application discloses a method for screening a substance for treating cancer associated with an abnormality in the signal transducer and activator of transcription 3 (JAK2) signaling pathway via lysine-specific demethylase 3A (KDM3A) -STAT3. .
  • the method will inhibit phosphorylation of the JAK2 protein and the KDM3A protein comprising the 1101 th tyrosine residue based on the sequence of SEQ ID NO: 1 that can be phosphorylated by the JAK2 protein.
  • a first step of culturing in the presence of the expected test substance A second step of measuring the phosphorylation degree of the tyrosine residue of the KDM3A protein; And a third step of selecting phosphorylation of the KDM3A protein when treated with a test substance as a candidate substance capable of inhibiting the growth of cancer cells when compared to a control group not treated with the test substance as a result of the measurement. do.
  • sequence number herein is used as a reference for indicating the residue to be phosphorylated, the actual residue number may vary depending on the specific species used in the method according to the present application, but those skilled in the art can easily identify the corresponding residue between species. You will be able to.
  • the method further comprises measuring the activity of the KDM3A protein as a cofactor for the STAT2 protein in the first step, wherein the first step further comprises a STAT3 protein, and the 3 In the step, as compared to a control group not treated with a test substance as a result of the measurement, when treated with a test substance, the activity of the KDM3A protein as a cofactor for the STAT3 protein, when the transcriptional activity of the STAT3 protein is reduced, It further comprises selecting as a candidate substance for inhibiting the growth of cancer cells.
  • the first step further comprises a histone 3 protein (H3K9, Histone 3 Lysine 9) methylated with a ninth lysine residue based on SEQ ID NO: 4, in the second step.
  • further comprising measuring the demethylation activity of the KDM3A protein for H3K9, and compared to the control group not treated with the test result in the measurement step in step 3, when the test material is treated with the H3K9 deproteinization When methylation is reduced it further comprises selecting it as a candidate for inhibiting the growth of cancer cells.
  • the first and second steps are performed in eukaryotic cells expressing the respective proteins, and the cells are further added as a substance capable of activating the JAK2-STAT signaling pathway. Is processed.
  • the first and second steps are performed on eukaryotic cells expressing the respective proteins, in particular mammalian eukaryotic cells, particularly cancer-derived mammalian eukaryotic cells, such as Hela cells, wherein the cells are JAK2.
  • eukaryotic cells expressing the respective proteins
  • mammalian eukaryotic cells particularly cancer-derived mammalian eukaryotic cells, such as Hela cells
  • the cells are JAK2.
  • -A substance capable of activating the STAT signaling pathway, and gp (glycoprotein) 130 including IL (Interleukin) -6, IL-11, or Oncostatin M (OSM) may be activated as a mediating signal transduction substance.
  • the material screened according to the method according to the present application can be developed and used as a treatment for solid cancer, including solid cancer, including cervical cancer, ovarian cancer, breast cancer, kidney cancer, and stomach cancer.
  • the present application also provides an antibody or antigen-binding fragment that specifically recognizes KDM3A phosphorylated with the 1101 th tyrosine residue based on the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the KDM3A protein 1101 th tyrosine residue is phosphorylated KMpYNAYGLI based on the sequence of SEQ ID NO: 1 (a short code representing amino acid residues, lysine, methionine, phosphorylated tyrosine, asparagine, alanine, tyrosine, glycine, respectively) , Represents leucine and isoleucine)
  • SEQ ID NO: 1 a short code representing amino acid residues, lysine, methionine, phosphorylated tyrosine, asparagine, alanine, tyrosine, glycine, respectively
  • Antibodies specifically recognizing epitopes or antigen-binding fragments thereof are provided.
  • the antibody may be a polyclonal or monoclonal antibody.
  • JAK2-STAT3 is essential for regulating cell development, differentiation and homeostasis.
  • dysregulation of the JAK2-STAT3 signaling system has been linked to the formation of malignant tumors in humans.
  • KDM3A serves as an essential epigenetic factor for activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway.
  • KDM3A is phosphorylated by JAK2 in the nucleus, which functions as a co-activation factor in the STAT3-dependent transcription process.
  • JAK2-KDM3A signaling system induced by IL-6 functionally and physically links between activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway and epigenetic control, thereby inducing a change in histone H3K9 methylation as an epigenetic genetic phenomenon.
  • FIG. 1 shows that JAK2 phosphorylates KDM3A to the tyrosine 1101 residue.
  • A Identification of tyrosine phosphorylation site on KDM3A by LC-MS / MS.
  • B Schematic diagram of KDM3A showing zinc finger (ZF) and Jumanji (JmjC) domains. The sequence around the tyrosine residue (Y, shown in red) is conserved between Drosophila (d), rat (m) and human (h).
  • C The protein extract obtained from HeLa cells was pulled down with a tyrosine phosphorylated antibody, and phosphorylation of KDM3A was confirmed by immunoblot with a KDM3A antibody.
  • KDM3A-Y1101p Operation of KDM3A (KDM3A-Y1101p) phosphorylated antibody was confirmed by dot blotting of unmodified KDM3A and phosphorylated KDM3A peptide.
  • E HeLa cells knock down KDM3A using shRNA and transfect HA-KDM3A WT (WT R ) or HA-KDM3A Y1101A mutant (YA R ) resistant to shRNA.
  • KDM3A was immunoprecipitated using HA antibody and analyzed by immunoblot with KDM3A phosphorylated antibody.
  • J Transfecting wild type (WT) of JAK2, continuously activated mutant (CA) or functionally inactive mutant (DN) into HeLa cells.
  • Cell lysates were immunoprecipitated with KDM3A antibody, followed by immunoblot analysis with KDM3A phosphorylated antibody to confirm phosphorylated KDM3A.
  • K In vitro phosphorylation analysis using JAK2 CA or DN mutants using recombinant KDM3A protein.
  • L-0 HeLa cells were treated with IL-6 (50 ng / ml) for the time indicated, and the phosphorylation level of KDM3A was reduced with the JAK2 activity inhibitor AG490 (10 ⁇ M) (L) or TG101348 (2.5 ⁇ M) (M). It was confirmed by immunoblotting with KDM3A phosphorylated antibody according to the presence or absence of treatment with the Src family inhibitor PP2 (10 ⁇ M) (N) or the Abl inhibitor Asciminib (250 nM) (O).
  • FIG. 2 is a result showing that KDM3A phosphorylation by JAK2 increases the demethylase activity of KDM3A.
  • A The degree of H3K9me2 was analyzed in HeLa and HEK293T cells after IL-6 treatment.
  • B JAK2 was knocked down with shRNA, and the degree of H3K9me2 according to the presence or absence of IL-6 treatment was confirmed by immunoblot.
  • C A representative image of JAK2 knock-down with shRNA, and the degree of H3K9me2 depending on the presence or absence of IL-6 treatment was confirmed by immunostaining. Cells were stained with H3K9me2 or JAK2 antibody. Nuclei are marked with DAPI. Scale bar, 10 ⁇ m.
  • the protein extract of HeLa cells was knocked down with KDM3A shRNA, and KDM3A WT R or YA R was transfected to confirm the degree of H3K9me2 according to the presence or absence of IL-6 treatment by immunoblot.
  • OSM Oncostatin M
  • KDM3A functions as a transcriptional coactivator of STAT3 in the JAK-STAT signaling pathway.
  • A The interaction between STAT3 and KDM3A with or without IL-6 treatment was confirmed by coimmunoprecipitation in HeLa cells.
  • B ChIP analysis was performed on the MYC promoter using ILK treatment in HeLa cells, followed by JAK2, STAT3 phosphorylation, KDM3A phosphorylation and H3K9me2 antibodies. ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001 (Student's t -test).
  • FIG. 4 is a result showing that KDM3A phosphorylation increases cell proliferation and mobility.
  • A Micrograph of KDM3A knock-down with shRNA in HeLa cells, and scratch-mobility analysis with and without IL-6 treatment. Scratch closure was monitored in HeLa cells for 48 hours at 24 hour intervals. Cell migration (%) was quantified by calculating the scratch width as shown in the right panel graph. *** P ⁇ 0.001 (Student's t -test).
  • B KDM3A was knocked down with shRNA in HeLa cells, and cell proliferation according to the presence or absence of IL-6 treatment was monitored and confirmed every 6 hours. The cell culture area was calculated as shown in the graph to quantify the proliferation efficiency (%).
  • KDM3A acts as a major epigenetic factor for JAK2-STAT3 activation in cancer cells.
  • KDM3A is phosphorylated at residue 1101 by JAK2, and phosphorylated KDM3A acts as a co-activator for transcriptional activation of a STAT3 target gene such as MYC with a decrease in demethylation activity for histone 3 protein (H3K9me2) and cancer cells. It was found to increase the proliferation of.
  • KDM3A phosphorylation may serve as a target for the development of new therapeutic agents that inhibit cancer development and / or progression that control the carcinogenic effects of the JAK2-STAT3 signaling pathway.
  • the present application relates to a method of screening for a cancer therapeutic or cell proliferation inhibitor acting on the JAK2-STAT3 pathway, which is identified herein, which plays an important role in the development and / or progression of cancer.
  • the method is a method for screening a substance for treating cancer related to a signal transducer and activator of Transcription 3 (JAS2) -STAT (Janus tyrosine kinase 2) -STAT signaling pathway, and the method includes the following steps: JAK2 protein And a KDM3A (lysine-specific demethylase 3A) protein comprising the 1101 th tyrosine residue based on the sequence of SEQ ID NO: 1 that can be phosphorylated by the JAK2 protein is expected to inhibit phosphorylation of the tyrosine residue by the JAK2.
  • JAK2 protein and a KDM3A (lysine-specific demethylase 3A) protein comprising the 1101 th tyrosine residue based on the sequence of SEQ ID NO: 1 that can be phosphorylated by the JAK2 protein is expected to inhibit phosphorylation of the tyrosine residue by the JAK2.
  • KDM3A lysine-specific de
  • a first step of culturing in the presence of a test substance A second step of measuring the phosphorylation degree of the tyrosine residue of the KDM3A protein; And a third step of selecting as a candidate substance capable of inhibiting the growth of cancer cells when phosphorylation of the KDM3A protein decreases when treated with a test substance, compared to a control group not treated with a test substance as a result of the measurement.
  • JAK2-STAT3 pathway to cancer and the relevance of KDM3A to cancer are known, the function of KDM3A as an essential epigenetic gene for activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway was first identified herein.
  • the specifically activated JAK2-KDM3A signaling cascade provides a functional and mechanical link between activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway and epigenetic control by bringing about a major epigenetic event, H3K9 methylation.
  • JAK2 (Janus tyrosine kinase 2) signal transducer and STAT3 (activator of transcription 3) signaling pathways are essential pathways for cell development, cell differentiation and homeostasis regulation.
  • JAK2 is a non-receptor tyrosine phosphorylase that induces the cytoplasmic signal transduction process
  • JAK2 is also present in the nucleus of human hematopoietic cells and is known to act as a direct phosphorylase of histone H3Y41 (tyrosine residue 41 of histone 3).
  • histone H3Y41 tyrosine residue 41 of histone 3
  • STAT3 is phosphorylated by JAK2 and forms a stable homodimer or heterodimer to induce local transcriptional activation of the target gene.
  • This abnormal response of the JAK2-STAT3 signaling pathway has been shown to induce abnormal cell proliferation, migration, and anti-cell death in various types of cancer, including cervical cancer, ovarian cancer, gastric cancer and breast cancer (Griffiths DS , et al. (2011) ) LIF-independent JAK signaling to chromatin in embryonic stem cells uncovered from an adult stem cell disease.Nature cell biology 13 (1): 13-21 .; Marotta LL , et al.
  • KDM3A serves as an epigenetic factor essential for activation of the JAK2-STAT3 signaling pathway. Specifically, KDM3A is phosphorylated at the 1101 th tyrosine residue based on the sequence of SEQ ID NO: 1 by JAK2, and phosphorylated KDM3A is a STAT3 target gene such as MYC with a decrease in H3K9me2 (histone 3 where lysine at the 9th residue is methylated). It was found that it acts as a STAT3-dependent co-activator for the transcriptional activation of cancer cells and increases the proliferation of cancer cells.
  • KDM3A (Lysine (K) -Specific Demethylase 3A) is a protein that demethylates H3K9me1 or H3K9me2 (one or two methylation at the ninth lysine residue of histone 3) and is overexpressed in many cancers including bladder cancer and lung cancer. (Hyun-Soo Cho et al. International Journal of Cancer Int. J. Cancer: 131, E179-E189 (2012) VC 2011 UICC).
  • JAK2, STAT3 and KDM3A gene and protein sequences used in the method according to the present application are known, for example the human protein sequence is KDM3A: NP_060903.2; JAK2: NP_001309123.1; STAT3: NP_644805.1; HISTONE 3: AAN39284.1, known to the NCBI. It will be apparent to those skilled in the art that once the protein sequence is known, the nucleic acid sequence can be easily derived therefrom.
  • each protein sequence is disclosed herein as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • full-length or fragments having various origins and protein sequences of each origin and sequences substantially identical thereto may be used. Substantially the same applies to all Egyptian, protein and nucleic acid sequence levels, and may have one or more substitutions, deletions, or additions to base or amino acid residues compared to the reference or reference sequence, but the overall difference in function It means having a level of functionality that does not or does not degrade the function.
  • Homology aligns the target sequence to the maximum possible correspondence, and when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, at least 61% homology, more preferably 70% phase Refers to a sequence that exhibits homology, even more preferably 80% homology, most preferably 90% or more, particularly 95% or more. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. See, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482 ; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48: 443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol.
  • the protein may be provided in the form of cells expressing it.
  • a mammalian cell expressing a protein for example, but not limited to, the protein expressing and acting cancer cells may be used, including humans Either from an animal such as a mammal or an established cell line can be used.
  • eukaryotic cells are used.
  • cancer cells or cancer cell lines are used, for example, Hela or HEK293 cell lines may be used.
  • the cell line may be used by transferring the plasmid expressing the protein using a known method or a method described in Examples herein.
  • JAK2-STAT pathway when the JAK2-STAT pathway is activated in the presence of a stimulus, JAK2 phosphorylates residue 1101 of the KDM3A protein.
  • inhibition of the JAK2-STAT3 signaling pathway can be measured by reducing or inhibiting phosphorylation of the KDM3A protein by JAK2.
  • the degree of phosphorylation inhibition can be measured using a known method, for example, can be confirmed using a protein blot method.
  • antibodies can be used.
  • Antibodies that can specifically recognize the phosphorylated 1101 residue of the KDM3A protein can be used.
  • a known antibody that does not specifically recognize the phosphorylated 1101 residue can be used as a control or comparative bacterium. Compared to the control group (when the test substance is not treated), one that suppresses the phosphorylation degree of the KDM3A protein can be selected as a candidate for treatment.
  • the protein can be labeled using a variety of markers for ease of detection, such as protein tags, biotin, fluorescent substances, acetylation, methods known in the art, such as radioisotopes, or commercially available protein labeling kits. It can be detected using a detector suitable for the labeled substance.
  • markers for ease of detection such as protein tags, biotin, fluorescent substances, acetylation, methods known in the art, such as radioisotopes, or commercially available protein labeling kits. It can be detected using a detector suitable for the labeled substance.
  • KDM3A demethylates H3K9
  • inhibition of the JAK2-STAT signaling pathway can also be measured by reducing the demethylation activity of KDM3A for methylated H3K9, i.e., reducing the demethylation of methylated H3K9.
  • Detection of methylation or demethylation in the method according to the present application can be performed using known methods, including, but not limited to, the use of antibodies specifically recognizing methylated proteins or demethylated proteins. , See also examples herein.
  • KDM3A phosphorylated by JAK2 has activity as a cofactor for STAT3 protein
  • inhibition of the JAK2-STAT signaling signaling pathway can also be measured by a decrease in the transcriptional activity of the STAT3 protein.
  • STAT3 protein is a transcription factor (Transcription Factor) that binds to a promoter capable of binding to STAT and promotes expression of a gene operably linked thereto into transcription RNA, and phosphorylated KDM3A acts as a cofactor in this process.
  • Transcription Factor Transcription Factor
  • the activity as a cofactor for the STAT3 protein in the method according to the present application can thus be measured by the transcriptional activity of the STAT3 protein, and this method can be performed in consideration of the examples and technical knowledge of the present application.
  • a plasmid operably linked to the STAT3 promoter to a target gene, such as Myc can be used, and transcriptional activity from the plasmid can be detected through various methods for determining the amount of target mRNA, for example, reverse transcription PCR. It can, but is not limited to.
  • the JAK2-STAT signaling pathway can be activated.
  • JAK2-STAT signaling pathway can be activated, especially when the method according to the invention is performed in cells.
  • a substance acting on activation of the JAK2-STAT signaling pathway mediated by the glycoprotein 130 (gp130) receptor is used, and a substance sharing the gp130 mediated signaling molecule is similar to activating the JAK2-STAT signaling pathway.
  • Function (Sriram K et al. , The Journal of Biological Chemistry 279, 19936-19947, 2004). Therefore, various known substances having the above effects can be used for activation, and IL (Interleukin) -6, IL-11 or Oncostatin M (Osm) can be used. In other embodiments, IL-6 can be used.
  • treatment with a test substance expected to inhibit the JAK2-STAT pathway via KDM3A can be measured by one or more methods of reducing or inhibiting phosphorylation of KDM3A protein, reducing or inhibiting transcriptional activity of STAT3 protein, reducing or inhibiting demethylation of H3K9 protein, as described above.
  • Means inhibition or reduction as compared to a control not treated with a test substance and those skilled in the art will readily be able to determine the degree of inhibition or reduction based on the content disclosed herein and / or common knowledge in the art.
  • test materials used in the methods herein will act on the JAK2-STAT pathway signaling system to reduce phosphorylation of KDM3A, thereby inhibiting the activity of a substance or STAT3 protein that is expected to specifically inhibit the demethylation of H3K9.
  • a low molecular compound may be used as a test substance.
  • the test substance can be obtained from a library of synthetic or natural compounds and methods for obtaining a library of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA) and Sigma-Aldrich (USA), and libraries of natural compounds are available from Pan Laboratories (USA) and Available from MycoSearch (USA).
  • Test materials can be obtained by a variety of combinatorial library methods known in the art, e.g., biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, deconvolution It can be obtained by the required synthetic library method, the "1-bead 1-compound” library method, and the synthetic library method using affinity chromatography screening. Methods for the synthesis of molecular libraries are described in DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem.
  • a compound having a low molecular weight therapeutic effect may be used for the purpose of screening a drug.
  • a compound having a weight of about 1000 Da, such as 400 Da, 600 Da or 800 Da, may be used for the purpose of screening a drug.
  • Such compound libraries include peptides, peptoids and other cyclic or linear oligomeric compounds, and low molecular compounds based on templates, such as benzodiazepine, hydantoin, viaryl, carbocycle and polycycle compounds (e.g. naphthalene, phenothi) Azine, acridine, steroid, etc.), carbohydrate and amino acid derivatives, dihydropyridine, benzhydryl and heterocycles (such as triazine, indole, thiazolidine, etc.), but this is merely exemplary It is not limited to this.
  • templates such as benzodiazepine, hydantoin, viaryl, carbocycle and polycycle compounds (e.g. naphthalene, phenothi) Azine, acridine, steroid, etc.), carbohydrate and amino acid derivatives, dihydropyridine, benzhydryl and heterocycles (such as triazine, indole
  • Biologics can also be used for screening, for example.
  • Biologics refers to a cell or a biomolecule
  • a biomolecule refers to a substance produced by using a protein, nucleic acid, carbohydrate, lipid, or cell system in vivo and ex vivo.
  • Biomolecules may be provided alone or in combination with other biomolecules or cells.
  • Biomolecules include, for example, polynucleotides, peptides, antibodies, or other proteins or biological organic substances found in plasma.
  • a substance that inhibits the reduction of phosphorylation of KDM3A, demethylation of H3K9, or a substance that inhibits activity as a cofactor of STAT3 protein in the presence of the test substance is selected as a candidate substance as compared to a control group not in contact with the test substance.
  • About 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, or about 100% or more or a decrease in this abnormality may be selected as a candidate material.
  • Proteins as used herein can be prepared using methods known in the art. In particular, it uses genetic recombination technology. For example, a plasmid containing a corresponding gene encoding the protein may be transferred to a prokaryotic or eukaryotic cell, for example, an insect cell or a mammalian cell, and then overexpressed and purified.
  • the plasmid can be used, for example, by transfecting an animal cell line as used in the exemplary embodiment of the present application, and then purifying the expressed protein, but is not limited thereto.
  • the protein can be labeled using a variety of markers for convenience of detection, such as biotin, fluorescent substance, acetylation, radioisotope, or a commercially available protein labeling kit. It can be detected using a detector suitable for.
  • markers for convenience of detection such as biotin, fluorescent substance, acetylation, radioisotope, or a commercially available protein labeling kit. It can be detected using a detector suitable for.
  • the DNA or RNA sequence encoding the screening protein is expressed in an appropriate host cell to make the cell lysate, or the mRNA of the screening protein is translated in vitro, and then the screening protein can be purified by a protein separation method known in the art. Can be. Usually, to remove cell debris, etc., after centrifuging the cell debris or the in vitro translated product, precipitation, dialysis, and various column chromatography are applied. Ion exchange chromatography, gel-permeation chromatography, HPLC, reverse phase-HPLC, preparation SDS-PAGE, affinity columns, etc. are examples of column chromatography. Affinity columns can be made, for example, using anti-screening protein antibodies.
  • test substances used in the above method may be referred to the aforementioned.
  • Candidates selected by the method according to the present application can be developed / used as an inhibitor of unregulated cell growth or as a therapeutic agent for cancer.
  • Cancers caused by JAK-STAT signaling abnormalities are not limited herein, but are solid cancers, particularly cervical cancers.
  • treatment is a concept that includes inhibition, elimination, alleviation, alleviation, amelioration, and / or prevention of a disease or symptom or condition resulting from a disease.
  • the present application relates to an antibody that specifically recognizes KDM3A phosphorylated with the 1101 th tyrosine residue.
  • KDM3A is specifically phosphorylated at lysine residue 1101, and the antibody according to the present application has been shown to specifically recognize the phosphorylated KDM3A without cross-reactivity.
  • the antibody of the present invention includes a complete antibody, an antigen-binding fragment of an antibody molecule, and an antibody or fragment functionally equivalent thereto.
  • the antibody of the present invention may be of IgG, IgM, IgD, IgE, IgA or IgY type, and may be of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 or IgA2 class or subclass thereof.
  • Antibodies of the invention include monoclonal, polyclonal, chimeric, short chain, bispecific, anthropogenic and humanized antibodies and active fragments thereof.
  • a complete antibody is a structure having two light chains and two heavy chains, and each light chain is connected by a heavy chain and a disulfide bond.
  • the heavy chain constant regions have gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3) ), Gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
  • antigen-binding fragments or active fragments of antibodies that bind antigens include Fv, ScFv, Fab, Fab 'and F (ab') 2.
  • Fab has a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (CH1) of a heavy chain, and has one antigen-binding site.
  • the F (ab ') 2 antibody is produced by cysteine residues in the hinge region of Fab' forming disulfide bonds.
  • sFv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombinant technique for generating an Fv fragment is disclosed in PCT International Patent Application Publication Nos. WO 88/10649, WO 88/106630 and the like.
  • double-chain Fv two-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond
  • sFv single-chain Fv
  • the variable region of the heavy chain and the variable region of the single chain are commonly covalently linked through a peptide linker. Or directly connected at the C-terminus to form a dimer structure such as a double chain Fv.
  • antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the whole antibody with papain yields Fab and cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragment), gene It can be produced through recombinant technology.
  • proteolytic enzymes e.g., restriction digestion of the whole antibody with papain yields Fab and cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragment
  • F (ab ') 2 fragment F (ab ') 2 fragment
  • the term “functionally equivalent antibody” is an antibody capable of specifically recognizing phosphorylated KDM3A comprising at least one major functional property, ie, other mutations in which the 1101th residue exhibits phosphorylated KDM3A effect, of any of the aforementioned types. , Including classes or fragments, including antibodies produced by various methods such as phage display, any individual and cell, such as bacteria, insect cells, mammalian cells, etc., to produce the desired antibody.
  • Antibodies of the invention can be obtained by animal serum, cell culture or recombinant DNA technology.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, and methods for preparing the polyclonal antibody are known in the art.
  • the antibody of the invention is a monoclonal antibody.
  • Methods for the production of monoclonal antibodies are known in the art and can be prepared through traditional cloning and cell fusion methods.
  • the antigen is administered to a transgenic mouse engineered to produce a wild-type mouse or in-breed mouse (BALB / c or C57BL / 6), rat, rabbit or other mammalian or wild-type or human antibody (eg subcutaneous or intraperitoneal). Administration).
  • the antigen can be administered alone or in combination with an adjuvant, and the antigen can be expressed in a vector or introduced in the form of a fusion protein capable of inducing DNA or an immune response.
  • Fusion proteins include peptides capable of inducing an immune response, including carrier proteins such as beta-galactosidase, glutathione, S-transferase, keyholelimpet hemocyanin (KLH) and fetal bovine serum. .
  • carrier proteins such as beta-galactosidase, glutathione, S-transferase, keyholelimpet hemocyanin (KLH) and fetal bovine serum.
  • KLH keyholelimpet hemocyanin
  • fetal bovine serum fetal bovine serum.
  • HEK293T and HeLa cells were incubated with 10% FBS (Gibco) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welgene) with penicillin (100 U / mL) and streptomycin (100 ⁇ g / mL).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • IL-6 (R & D system, 50 NG / mL), OSM (R & D system, 20 NG / mL), IL-11 (R & D system, 5 NG / mL) AG490 (Sigma 10 ⁇ M) TG101348 (Selleckchem, 2.5 ⁇ M), Asciminib (Selleckchem, 250 nM) or PP2 (Sigma, 10 ⁇ M) was treated for the indicated time.
  • JAK1 (# 3332), JAK2 (# 3230), phospho-STAT3 (# 9131) and H3K9me2 (# 9753, # 4658, ab1220) (Cell Signaling Technology, Abcam); STAT3 (sc-8019) (Santa Cruz); KDM3A (nb100-77282) (Novus); phospho-Tyrosine 4G10 (05-1050) (Millipore); HA (MMS-101R) (Covance); And FLAG (F3165, Sigma).
  • Antibodies that specifically recognize KDM3A phosphorylated with the 1101 th residue herein were first prepared herein.
  • the antibody was prepared in rabbits using 4 mg of peptide KM-pY-NAYGLI (a peptide in which the 1101 th tyrosine residue was phosphorylated based on SEQ ID NO: 1) as an antigen, and was prepared by requesting Peptron (Korea).
  • M67 (4X-STAT response factor) -lucifer raise activity was measured using a luminometer 48 hours after transfection and normalized to ⁇ -galactosidase activity. At least three independent experiments were performed.
  • ChIP primers for the STAT binding elements of hMYC were used in PCR reactions: forward 5'-GCCTCTGGCCCAGCCCTCCCGCTGAT-3 ', reverse 5'-GCAAAGTGCCCGCCCGCTGCTATGG-3'.
  • Tryptic digest of KDM3A was analyzed by nanoelectrospray LC-MS / MS.
  • High pressure liquid chromatography separation was performed on an Ultimate instrument equipped with Famous Autosampler (LC Packings).
  • the column was composed of fused silica capillaries having an outer diameter of 360 ⁇ m and an inner diameter of 75 ⁇ m, and a length of 15 cm was used using a 300-mm C18 beads (Grace Vydac) having a diameter of 5 ⁇ m.
  • the exit of the nanocolumn was connected inline to a distal coated silica PicoTip needle (New Objective).
  • the solvent system consisted of solvent A (0.1% formic acid and 5% acetonitrile) and solvent B (0.1% formic acid and 90% acetonitrile). The gradient was linear in 0-40% solvent B over 50 minutes, then 90% solvent B for 5 minutes. Tandem mass spectra were recorded on an API QSTAR Pulsar Q-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems) in an information dependent acquisition mode. The MS / MS spectrum was used to search the National Center for Biotechnology Information and the expressed sequence tag database using Mascot (Matrix Science). The identified phosphorylated peptides were manually verified.
  • HeLa cells were cultured on a cover slip and washed with PBS. Cells were fixed with 2% paraform aldehyde for 10 minutes at room temperature and made permeable three times with 0.5% Triton X-100. After blocking, Flag, JAK2 and H3K9me2 antibodies were labeled with Alexa Fluor 594 and 488 mouse and rabbit IgG labeling kits (Molecular Probe), respectively.
  • Wound healing scratching motility assay was performed on pLKO.1 control vector or HeLa cells transfected with pLKO.1-shKDM3A. Cells were seeded in 6-well culture plates and cultured until confluence. Cells were scraped with a 200 ⁇ l micropipette tip and incubated at 37 ° C. for 48 hours. Micrographs of closed gaps were taken at 0, 24 and 48 hours using an EVOS xl transmission light microscope (AMG, Bothell, WA). Cell travel distance was quantified by gap distance using Graph Prism software.
  • the pLKO.1 vector or pLKO.1-shKDM3A was transfected into HeLa cells with lipofectamine reagent. One day after transfection, the presence or absence of IL-6 treatment was separated, and the cells were separated and cultured in a 24-well plate. Cell proliferation was counted for each 6 hour using JuLiTM stage live imaging equipment (NanoEnTek Inc) and analyzed with JuLiTM STAT software according to the manufacturer's guide.
  • KDM3A-Y1101p an antibody specific for KDM3A phosphorylated at the residues Y1101
  • FIG. 1D we prepared an antibody specific for KDM3A phosphorylated at the residues Y1101 (KDM3A-Y1101p) and confirmed that cross-reaction does not occur and efficacy by immunoblot analysis (FIG. 1D).
  • KDM3A-Y1101 phosphorylation antibody we found that in the case of the Y1101A (YA) mutant form of KDM3A where the 1101th amino acid residue tyrosine was replaced with alanine, tyrosine phosphorylation of KDM3A did not appear ( Figure 1E).
  • KDM3A tyrosine phosphorylases responsible for KDM3A phosphorylation. Because KDM3A is mainly localized in the nucleus, we sought tyrosine phosphorylases in the nucleus. We hypothesized that JAK1, JAK2, Src, and Abl1 are present in the nucleus and cytoplasm, so they can phosphorylate KDM3A in the nucleus. Immunoprecipitation data confirmed that KDM3A binds to both JAK1 and JAK2 in the presence of IL-6, a well-known high-level physiological signal for JAK activation and nuclear transfer ( Figures 1F and G).
  • JAK2 is known to exclude HP-1 ⁇ from the STAT target gene for transcriptional activation in human hematopoietic cells, it has not been determined whether JAK2 signaling modulates KDM3A-dependent H3K9 demethylation (transcriptional activity marker). Therefore, in the present invention, it was confirmed that JAK2-dependent phosphorylation of KDM3A is induced by IL-6 treatment to confirm whether the degree of methylation of H3K9me2 changes during IL-6 treatment. Indeed, H3K9me2 was reduced during IL-6 treatment in HeLa and HEK293T cells with increased KDM3A phosphorylation and STAT3 phosphorylation ( Figure 2A).
  • KDM3A knock-down cells were transfected with a shRNA resistant form of KDM3A WT R or YA R mutation. Interestingly, it was confirmed by immunostaining assay that the YA mutant of KDM3A significantly reduced the enzyme activity on H3K9me2 compared to WT of KDM3A (FIG. 2E).
  • JAK2 activates the STAT3 target gene by interacting with STAT3. Activated JAK2 migrates to the nucleus to induce STAT3 phosphorylation for transcriptional activation. In addition, it is known that JAK2 entering the nucleus acts as a tumor-inducing factor by acting on other specific substrates such as histones other than STAT3 in the nucleus.
  • KDM3A phosphorylated KDM3A can function as a transcriptional coactivator of the JAK2-STAT3 signaling pathway. It was first investigated whether KDM3A binds to STAT3. It was confirmed through immunoprecipitation that binding between KDM3A and STAT3 was significantly improved by IL-6 treatment (FIG. 3A).
  • ChIP chromatin immunoprecipitation
  • KDM3A phosphorylation increases the M67 promoter-luciferase reporter activity in the presence of the persistent active form of STAT3 (STAT3 CA), but the activity of STAT3 is not seen.
  • STAT3 DN In the non-form (STAT3 DN), it failed to bind to the STAT3 response element (FIG. 3G).
  • STAT3-dependent luciferase reporter activity was attenuated by KDM3A knock-down (Figure 3H), but increased by KDM3A overexpression ( Figure 3I).
  • Example 4 Increase of cell proliferation and mobility by KDM3A phosphorylation and offset effect by KDM3A knockdown
  • KDM3A phosphorylation by JAK2 activated by IL-6 is involved in regulating cancer cell growth, proliferation, mobility, and colony formation, because dysregulation of the JAK2-STAT3 signaling system is associated with malignant tumor induction in humans.
  • Cell mobility analysis according to the presence or absence of treatment with IL-6 that induces KDM3A phosphorylation was performed. It was confirmed that the mobility was increased by IL-6 treatment, and the interval was narrowed after about 48 hours.
  • the cell mobility of KDM3A shRNA is significantly reduced in cells in which KDM3A is knocked down (FIG. 4A).
  • KDM3A provides a functional and mechanical link between intracellular JAK2-STAT3 signaling to the upper stimulus signal and lower epigenetic genetic mechanism. It was also suggested that the regulation of H3K9 demethylation by tyrosine phosphorylated KDM3A induced by JAK2 is one of the main epigenetic phenomena that induces proliferation and mobility of cancer cells.
  • the results herein identified the JAK2-KDM3A-H3K9me2 signal transduction axis in the nucleus induced by IL-6 that has never been reported previously, and that this signaling pathway increases cancer cell mobility, proliferation and growth.
  • JAK2 activation allows phosphorylated KDM3A to bind strongly to STAT3 and act as a co-activator of STAT3 through increased H3K9 demethylase function. It is known that dysregulation of the JAK2-STAT3 signaling system has serious consequences, such as degenerative diseases and cancer, because the JAK2-STAT3 signaling pathway is evolutionarily well preserved in maintaining cell homeostasis. Therefore, signal-dependent regulation of epigenetic modulators such as KDM3A and identification of their dysregulation can provide new insights into the mechanism of cancer progression and open a challenging path for new drug development.

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Abstract

본원은 JAK2-STAT3- KDM3A 신호 전달 경로를 표적으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법은 KDM3A 인산화의 저해를 통해 악성 종양의 발생 및 진행과 밀접한 연관이 있는 JAK2-STAT3 신호 전달 경로를 제어할 수 있어 효과적인 새로운 암 치료제 개발을 가능하게 한다.

Description

JAK2-STAT3-KDM3A 신호전달 경로를 표적으로 하는 암치료제 스크리닝 방법
JAK2-STAT3 특이적 신호전달 경로에서 작용하는 분자 기전에 근거한 암치료 개발과 관련된 것이다.
JAK2(Janus tyrosine kinase 2)-신호 전달자(transducer) 및 STAT3(activator of transcription 3) 신호전달 경로는 세포 발생, 세포 분화 및 항상성 조절에 필수적인 경로로서, JAK2-STAT3 경로 조절 장애는 암의 발생과 깊은 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 JAK2는 세포질 신호 전달 과정을 유도하는 비 수용체 타이로신 인산화 효소이며 JAK2는 인간 조혈 세포의 핵에도 존재하여 히스톤 H3Y41의 직접적인 인산화 효소로 작용하는 것으로 알려져 있다. JAK2가 활성화되면 전사 인자 STAT3를 활성화시킨다. STAT3은 JAK2에 의해 인산화되고 안정적인 동종 이량체 또는 이종 이량체를 형성하여 표적 유전자의 국지적 활성화를 유도한다. 이러한 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 비정상적 반응은 다양한 종류의 암에서 비정상적인 세포 증식, 이동 및 항-세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(Griffiths DS, et al. (2011) LIF-independent JAK signalling to chromatin in embryonic stem cells uncovered from an adult stem cell disease. Nature cell biology 13(1):13-21.; Marotta LL, et al. (2011) The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. The Journal of clinical investigation 121(7):2723-2735.; Yu H, Kortylewski M, & Pardoll D (2007) Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment. Nature reviews. Immunology 7(1):41-51.).
따라서 JAK2-STAT3 신호 전달 축의 억제는 암 치료의 표적이 될 수 있지만, 보다 효과적인 치료제의 개발을 위해서는 상기 신호 전달 경로에서 특이적으로 작용하는 하위 조절자 및 그 기전의 규명이 필요하다. KDM3A는 신진 대사와 정자 형성에서 전사 활성화 과정을 조절하는 것으로 PSA와 NKX3.1과 같은 안드로겐 수용체 표적 유전자를 활성화시키는 것으로 알려져 있고, 대한민국 공개특허 2017-0112755는 KDM3A 유전자의 혈액암 진단용 마커로서의 용도를 개시한다.
하지만 KDM3A의 JAK2-STAT3 신호 전달과의 관련성에 대해서는 알려진 바 없다. 나아가 암의 발생 또는 진행 과정에서 JAK2-STAT3 신호 전달 경로와 관련된 KDM3A 전사 활성화 및 억제에 대한 조절 기전에 대해서는 전혀 규명된 바 없다.
본원에서는 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화와 관련된 암의 치료제 개발에 필요한 필수 후성 유전인자를 규명하고자 한다.
한 양태에서 본원은 KDM3A(lysine-specific demethylase 3A)을 경유하는 JAK2(Janus tyrosine kinase 2)-STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3) 신호전달 경로 이상과 관련된 암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 개시한다.
일 구현예에서 상기 방법은 JAK2 단백질 및 상기 JAK2 단백질에 의해 인산화 될 수 있는 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기를 포함하는 KDM3A 단백질을 상기 JAK2에 의한 상기 타이로신 잔기의 인산화를 억제할 것으로 기대되는 시험물질의 존재 중에서 배양하는 제1 단계; 상기 KDM3A 단백질의 타이로신 잔기의 인산화 정도를 측정하는 제2 단계; 및 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 KDM3A 단백질의 인산화가 감소한 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 후보물질로 선별하는 제3 단계를 포함한다.
본원에서 서열번호는 인산화되는 잔기를 표시하기 위한 기준으로 사용된 것으로 본원에 따른 방법에 사용되는 구체적 종(species)에 따라서 실제 잔기 번호는 달라질 수 있으나, 당업자라면 종간에서 상응하는 잔기를 용이하게 특정할 수 있을 것이다.
다른 구현예에서 상기 방법은 상기 제1 단계가 STAT3 단백질을 추가로 포함하며, 상기 제2 단계에서 상기 KDM3A 단백질의 상기 STAT2 단백질에 대한 보조인자로서의 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 그리고 상기 3 단계에서, 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 KDM3A 단백질의 상기 STAT3 단백질에 대한 보조인자로서의 활성으로서, 상기 STAT3 단백질의 전사 활성이 감소된 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제하는 후보물질로 선별하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 상기 모든 방법에 있어서, 상기 제1 단계에서 서열번호 4를 기준으로 9번째 라이신 잔기가 메틸화된 히스톤 3 단백질(H3K9, Histone 3 Lysine 9)을 추가로 포함하며, 상기 제2 단계에서 상기 KDM3A 단백질의 H3K9에 대한 탈메틸화 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 그리고 상기 3 단계에서 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3K9 단백질의 탈메틸화가 감소된 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제하는 후보물질로 선별하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 상기 모든 방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 단계는 상기 각 단백질을 발현하는 진핵세포에서 수행되고, 상기 세포는 상기 JAK2-STAT 신호전달 경로를 활성화 할 수 있는 물질로 추가로 처리된다.
또 다른 구현예에서 상기 모든 방법에서 상기 제1 및 제2 단계는 상기 각 단백질을 발현하는 진핵세포, 특히 포유류 진핵세포, 특히 암 유래 포유류 진핵세포 예를 들면 Hela 세포에서 수행되고, 상기 세포는 JAK2-STAT 신호전달 경로를 활성화 할 수 있는 물질로 IL(Interleukin)-6, IL-11 또는 Oncostatin M(OSM)을 포함하는 gp(glycoprotein) 130을 매개 신호 전달 물질로 활성화될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에 따라 스크리닝된 물질은 고형암 예를 들면 자궁경부암, 난소암, 유방암, 신장임 및 위암을 포함하는 고형암의 치료제로 개발되어 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 본원에서는 처음으로 JAK2-STAT 신호전달 경로에서 특이적으로 작용하는 하위 조절자인 1101번 잔기에서 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 개발하였다.
또 다른 양태에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 KDM3A 단백질 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 KMpYNAYGLI(아미노산 잔기를 나타내는 단문자 코드, 각각 순서대로 라이신, 메티오닌, 인산화된 타이로신, 아스파라진, 알라닌, 타이로신, 글라이신, 루이신 및 아이소루이신을 나타냄) 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구현예에서 상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 일 수 있다.
본원은 JAK2-STAT3- KDM3A 신호 전달 경로를 표적으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. JAK2-STAT3은 세포 발달, 분화 및 항상성 조절에 필수적이다. 따라서 JAK2-STAT3 신호 전달 체계의 조절 장애는 사람의 악성 종양 형성과 연관되어있다. 본 발명에서는 KDM3A가 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화를 위한 필수 후성 유전인자로서 역할 하는 것을 확인하였다. 구체적으로 KDM3A는 핵에서 JAK2에 의해 인산화 되고, 이는 STAT3 의존성 전사과정에서 보조 활성화 인자로서 기능한다는 것을 규명하였다. IL-6에 의해 유도 된 JAK2-KDM3A 신호 전달 체계는 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화와 후성 유전 제어 사이의 기능적 및 물리적으로 연결하고, 이를 통해서 후성 유전 현상으로서 히스톤 H3K9 메틸화의 변화를 유도함을 발견하였다. 이는 본 발명은 KDM3A 인산화의 저해가 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 발암 효과를 제어하는 강력한 치료 전략이 될 수 있음을 보여준다.
도 1은 JAK2는 타이로신 1101 잔기에 KDM3A를 인산화시키는 것을 나타내는 결과이다. (A) LC-MS/MS에 의한 KDM3A상의 타이로신 인산화 부위의 동정. (B) 징크 핑거(ZF) 및 주만지(JmjC) 도메인을 나타내는 KDM3A의 개략도. 타이로신 잔기(Y, 적색으로 표시) 주변의 서열은 초파리(d), 쥐(m) 및 사람(h) 사이에서 보존됨. (C) HeLa 세포로부터 얻은 단백질 추출물을 타이로신 인산화 항체로 풀다운 시키고, KDM3A의 인산화를 KDM3A 항체로 면역블롯하여 확인함. (D) 비변형된 KDM3A와 인산화 된 KDM3A 펩타이드의 도트블롯팅을 통하여 KDM3A (KDM3A-Y1101p) 인산화 항체의 작동을 확인함. (E) HeLa 세포에서 shRNA를 이용하여 KDM3A를 knock-down하고, shRNA에 내성을 갖는 HA-KDM3A WT (WTR) 또는 HA-KDM3A Y1101A 돌연변이체 (YAR)를 트랜스팩션함. KDM3A는 HA 항체를 사용하여 면역 침전시키고 KDM3A 인산화 항체로 면역블롯하여 분석함. (F 및 G) HeLa 세포에서 JAK1 (F) 또는 JAK2 (G)와 KDM3A의 면역침강법(Co-IP) 분석은 2시간 동안 IL-6 처리(50 ng/ml)의 유무에 따라 수행함. (H) JAK1 또는 JAK2와 인산화 된 KDM3A의 Co-IP 분석은 2시간 동안 IL-6로 처리 된 HeLa 세포에서 수행함. KDM3A의 인산화 정도는 KDM3A 인산화 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의해 확인함. (I) shRNA를 이용하여 JAK2를 knock-down시킨 후, 2시간 동안 IL-6 처리를 하거나 하지않은 HeLa 세포에서 KDM3A 인산화 항체를 이용한 면역블롯 분석을 통해 KDM3A의 인산화 정도를 확인함. (J) JAK2의 야생형(WT), 지속적으로 활성화된 돌연변이체(CA) 또는 기능적으로 작동하지 않는 돌연변이체(DN)를 HeLa 세포에 트랜스팩션함. 세포 용해물을 KDM3A 항체로 면역 침강시킨 후 KDM3A 인산화 항체로 면역블롯 분석하여 인산화 된 KDM3A를 확인함. (K) 재조합 KDM3A 단백질을 이용한 JAK2 CA 또는 DN 돌연변이체를 이용한 in vitro 인산화 분석. (L-0) HeLa 세포를 IL-6(50 ng/ml)로 표시된 시간 동안 처리 하고, KDM3A의 인산화 수준을 JAK2 활성 억제제인 AG490(10μM) (L) 또는 TG101348(2.5μM) (M)와 Src 계열 억제제 PP2(10μM) (N) 또는 Abl 억제제 Asciminib(250nM) (O)의 처리 유무에 따라 KDM3A 인산화 항체로 면역블롯하여 확인함.
도 2는 JAK2에 의한 KDM3A 인산화는 KDM3A의 탈메틸화 효소 활성을 증가시키는 것을 나타내는 결과이다. (A) IL-6 처리 후 HeLa 및 HEK293T 세포에서 H3K9me2의 정도를 분석함. (B) shRNA로 JAK2를 knock-down하고, IL-6의 처리 유무에 따른 H3K9me2의 정도를 면역블롯으로 확인함. (C) shRNA로 JAK2를 knock-down하고, IL-6의 처리 유무에 따른 H3K9me2의 정도를 면역염색법으로 확인한 대표적인 이미지. 세포를 H3K9me2 또는 JAK2 항체로 염색함. 핵은 DAPI로 표시함. 스케일 바, 10μm. (D) H3K9me2의 탈메틸화는 JAK2에 의해 유도되었고, KDM3A의 knock-down은 IL-6를 처리하였을 때 JAK2 의존적 H3K9me2의 탈메틸화가 망가지는 것을 확인함. (E) HeLa 세포를 KDM3A shRNA에 의해 knock-down시키고 shRNA 내성 형태의 KDM3A WT (WTR) 또는 Y1101A (YAR)를 트랜스팩션함. 트랜스팩션된 세포는 H3K9me2 및 Flag 항체로 염색함. 세포핵은 DAPI로 염색함. 화살표는 KDM3A를 발현하는 세포 및 H3K9me2의 정도를 나타냄. 스케일 바, 10μm. (F) IL-6에 의해 유도 된 H3K9me2의 탈메틸화는 KDM3A에 의존함. HeLa 세포의 단백질 추출물을 KDM3A shRNA로 knock-down시키고, KDM3A WTR 또는 YAR를 트랜스팩션하여 IL-6의 처리 유무에 따른 H3K9me2의 정도를 면역블롯으로 확인함. (G 및 H) 세포에서 gp130 매개 신호 전달 분자를 공유하는 IL-6를 제외한 Oncostatin M (OSM) (20 ng/ml) (G) 또는 IL-11 (5 ng/ml) (H), 등의 다른 사이토카인의 처리 후 H3K9me2의 정도를 HeLa 세포에서 확인 함.
도 3은 KDM3A는 JAK-STAT 신호 전달 경로에서 STAT3의 전사적 보조 활성화인자로서 기능하는 것을 나타내는 결과이다. (A) IL-6 처리 유무에 따른 STAT3와 KDM3A 간의 상호작용을 HeLa 세포에서 공동 면역침강법으로 확인함. (B) ChIP 분석은 HeLa 세포에서 IL-6 처리 후 JAK2, STAT3 인산화, KDM3A 인산화 및 H3K9me2 항체를 사용하여 MYC 프로모터상에서 수행함. ** P <0.01, *** P <0.001 (Student’s t-test). (C) HeLa 세포에서 IL-6 처리 후 shRNA로 KDM3A를 knock-down 후 MYC mRNA 발현의 정량적 RT-PCR 분석. *** P <0.001 (Student’s t-test). (D) HeLa 세포에서 IL-6 처리 후 shRNA로 KDM3A를 knock-down 후 MYC 단백질의 면역블롯 분석. (E) HeLa 세포에서 IL-6의 처리 후 shRNA로 KDM3A를 knock-down 후 내성 형태의 KDM3A WTR 또는 YAR를 트랜스팩션하여 MYC mRNA 레벨을 정량적 RT-PCR로 확인함. * P <0.05 (Student’s t-test). (F) HeLa 세포에서 IL-6의 처리 후 shRNA로 KDM3A를 knock-down 후 내성 형태의 KDM3A WTR 또는 YAR를 트랜스팩션하여 MYC 단백질 레벨을 면역블롯으로 확인함. (G-I) STAT에 반응하는 M67 프로모터-루시퍼레이즈 리포터 플라스미드로 HEK293T 세포에 표시와 같이 트랜스팩션함. 루시퍼레이즈 리포터 활성은 트랜스팩션 후 48시간에 측정되었고 β-갈락토시다아제 활성에 의해 표준화함. 세 번의 독립적인 실험을 진행. * P <0.05, ** P <0.01 (Student’s t-test).
도 4는 KDM3A 인산화는 세포 증식 및 이동성을 증가 시키는 것을 나타내는 결과이다. (A) HeLa 세포에서 shRNA로 KDM3A를 knock-down하고, IL-6의 처리 유무에 따른 스크래치-이동성 분석을 수행한 현미경 사진. 스크래치 봉합은 HeLa 세포에서 48시간 동안 24시간 간격으로 모니터링함. 세포 이동(%)은 우측 패널 그래프에 나타낸 바와 같이 스크래치 폭을 계산하여 정량화함. *** P <0.001 (Student’s t-test). (B) HeLa 세포에서 shRNA로 KDM3A를 knock-down하고, IL-6의 처리 유무에 따른 세포증식을 6시간 간격으로 모니터링하여 확인함. 세포 배양 면적을 그래프에 나타낸 바와 같이 계산하여 증식 효율(%)을 정량화 하였다. *** P <0.001 (Student’s t-test). (C) BrdU로 염색 된 세포의 대표적인 이미지. IL-6 처리 후 증가 된 BrdU 양성 (BrdU +) 세포의 비율은 shRNA에 의한 KDM3A의 knock-down 후 감소함. HeLa 세포에서 shRNA로 KDM3A를 knock-down 후 내성 형태의 KDM3A WTR 또는 YAR를 트랜스팩션한 후 IL-6의 처리 유무에 따른 BrdU 양성 (BrdU +) 세포를 면역염색법으로 확인함. 핵은 DAPI로 염색함. 스케일 바, 10μm. *** P <0.001 (Student’s t-test). (D) HeLa 세포에서 shRNA로 KDM3A를 knock-down하고, MYC을 함께 트랜스팩션하는 것의 유무와 IL-6의 처리 유무에 따른 세포의 콜로니 형성 분석. 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색함. 콜로니 수는 그래프와 같이 정량화함. *** P <0.001 (Student’s t-test). (E) JAK2-KDM3A-STAT3 신호 전달 축을 묘사한 도식 모델. JAK2에 의한 KDM3A 인산화로 유도되는 H3K9 탈메틸화의 조절은 STAT3 표적 유전자의 전사 조절에서 가장 중요한 후성 유전 현상 중 하나임.
본원은 KDM3A가 암세포에서 JAK2-STAT3 활성화를 위한 주요 후성 인자로 작용한다는 발견에 근거한 것이다. 구체적으로 KDM3A는 JAK2에 의해 1101 잔기에서 인산화되며, 인산화된 KDM3A는 히스톤 3 단백질(H3K9me2)에 대한 탈메틸화 활성의 감소와 함께 MYC과 같은 STAT3 표적 유전자의 전사 활성화를 위한 공동 활성인자로서 작용하여 암세포의 증식을 증가시킨다는 것을 규명하였다.
이는 KDM3A 인산화의 저해가 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 발암 효과를 제어하는 암 발생 및/또는 진행을 억제하는 새로운 치료제 개발의 표적으로 작용할 수 있음을 나타낸다.
따라서 한 양태에서 본원은 본원에서 규명된, 암의 발생 및/또는 진행에서 중요한 역할을 하는 JAK2-STAT3 경로에 작용하는 암 치료제 또는 세포 증식 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 방법은 JAK2(Janus tyrosine kinase 2)-STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription 3) 신호전달 경로 이상과 관련된 암 치료용 물질 스크리닝 방법으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: JAK2 단백질 및 상기 JAK2 단백질에 의해 인산화 될 수 있는 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기를 포함하는 KDM3A(lysine-specific demethylase 3A) 단백질을 상기 JAK2에 의한 상기 타이로신 잔기의 인산화를 억제할 것으로 기대되는 시험물질의 존재 중에서 배양하는 제1 단계; 상기 KDM3A 단백질의 타이로신 잔기의 인산화 정도를 측정하는 제2 단계; 및 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 KDM3A 단백질의 인산화가 감소한 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 후보물질로 선별하는 제3 단계.
JAK2-STAT3 경로의 암과의 관련성 및 KDM3A과 암과의 관련성은 알려져 있으나 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화를 위한 필수 후성 유전자로서의 KDM3A의 기능은 본원에서 처음 규명된 것이다. 구체적으로 활성화된 JAK2-KDM3A 신호 전달 캐스캐이드는 주요한 후성적 이벤트인 H3K9 메틸화에 변화를 가져옴으로써 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화와 후성 유전 제어 사이의 기능적 및 기계적 연결을 제공한다.
JAK2(Janus tyrosine kinase 2) 신호 전달자(transducer) 및 STAT3(activator of transcription 3) 신호전달 경로는 세포 발생, 세포 분화 및 항상성 조절에 필수적인 경로이다. 구체적으로 JAK2는 세포질 신호 전달 과정을 유도하는 비 수용체 타이로신 인산화 효소이며 JAK2는 인간 조혈 세포의 핵에도 존재하여 히스톤 H3Y41(히스톤 3의 41번 타이로신 잔기)의 직접적인 인산화 효소로 작용하는 것으로 알려져 있다. JAK2가 활성화되면 이는 전사 인자 STAT3를 활성화시킨다. STAT3은 JAK2에 의해 인산화되고 안정적인 동종 이량체 또는 이종 이량체를 형성하여 표적 유전자의 국지적 전사 활성화를 유도한다. 이러한 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 비정상적 반응은 자궁경부암, 난소암, 위암 및 유방암 등 다양한 종류의 암에서 비정상적인 세포 증식, 이동 및 항-세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(Griffiths DS, et al. (2011) LIF-independent JAK signalling to chromatin in embryonic stem cells uncovered from an adult stem cell disease. Nature cell biology 13(1):13-21.; Marotta LL, et al. (2011) The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. The Journal of clinical investigation 121(7):2723-2735.; Yu H, Kortylewski M, & Pardoll D (2007) Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment. Nature reviews. Immunology 7(1):41-51.).
본원에서는 KDM3A가 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 활성화를 위해 필수적인 후성 유전인자로서 역할하는 것을 규명하였다. 구체적으로 KDM3A는 JAK2에 의해 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101 번째 타이로신 잔기에서 인산화되며, 인산화된 KDM3A는 H3K9me2(9번째 잔기의 라이신이 메틸화된 히스톤 3)의 감소와 함께 MYC과 같은 STAT3 표적 유전자의 전사 활성화를 위해 STAT3-의존성 공동 활성인자로서 작용하여 암세포의 증식을 증가시킨다는 것을 규명하였다.
KDM3A(Lysine(K)-Specific Demethylase 3A)는 H3K9me1 또는 H3K9me2(히스톤 3의 9번째 라이신 잔기에 한 개 또는 두 개의 메틸화)를 탈메틸화(demethylation)시키는 단백질로서, 방광암이나 폐암을 포함한 여러 암에서 과발현되어 있다고 알려져 있다(Hyun-Soo Cho et al.International Journal of Cancer Int. J. Cancer: 131, E179-E189 (2012) VC 2011 UICC).
본원에 따른 방법에 사용되는 JAK2, STAT3 및 KDM3A 유전자 및 단백질 서열은 공지된 것으로 예를 들면 인간 단백질 서열은 KDM3A: NP_060903.2; JAK2: NP_001309123.1; STAT3: NP_644805.1; HISTONE 3: AAN39284.1로 NCBI에 공지되어 있다. 단백질 서열이 알려지면, 핵산 서열은 이로부터 용이하게 도출될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
일 구현예에서 상기 각 단백질 서열은 본원에서 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 개시된다.
본원에 따른 방법에서는 상기와 같은 기능을 갖는 한 다양한 유래, 그리고 각 유래의 단백질 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 전장 또는 단편이 사용될 수 있다. 실질적으로 동일한 이란, 단백질 및 핵산 서열 수준에 모두 적용되며, 참조 또는 기준이 되는 서열과 비교하여, 염기 또는 아미노산 잔기에 하나 이상의 치환, 결손, 또는 부가가 있을 수 있으나, 전체적으로 볼 때 기능에 차이가 없거나 기능을 나쁘게하지 않는 수준의 기능을 갖는 것을 의미한다. 상동성은 대상이 되는 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상, 특히 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
일 구현예에서 상기 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다.
예를 들면 단백질을 발현(Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 상기 단백질이 발현되며, 작용할 수 있는 암 세포가 사용될 수 있으며 예를 들면 인간을 포함한 포유류와 같은 동물에서 채취한 것 또는 확립된 세포주를 사용할 수 있다.
일 구현예에서는 진핵세포가 사용된다. 다른 구현예에서는 암세포 또는 암세포주가 사용되며, 예를 들면 Hela 또는 HEK293 세포주가 사용될 수 있다. 상기 세포주는 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 공지된 방법 또는 본원의 실시예에 기재된 방법을 이용하여 전달이입하여 사용할 수 있다.
본원에 따른 상기 방법에서 자극 존재시 JAK2-STAT 경로가 활성화되면, JAK2는 KDM3A 단백질의 1101 잔기를 인산화시킨다. 따라서, 일 구현예에서 본원에 따른 방법에서, JAK2-STAT3 신호전달 경로의 억제는 상기 JAK2에 의한 KDM3A 단백질의 인산화 감소 또는 억제로 측정될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 인산화 억제 정도는 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있으며, 예를 들면 단백질 블랏 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 일 구현예에서는 항체가 사용될 수 있다. KDM3A 단백질의 인산화된 1101 잔기를 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 또한 대조군 또는 비교균으로서 상기 인산화된 1101 잔기를 특이적으로 인식하지 않는 공지의 항체가 사용될 수 있다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, KDM3A 단백질의 인산화 정도를 억제한 것을 치료제 후보물질로 선별할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.
또한 상기 KDM3A는 H3K9을 탈메틸화 시키기 때문에, 상기 JAK2-STAT 신호전달 신호 전달 경로의 억제는 또한 KDM3A의 메틸화된 H3K9에 대한 탈메틸화 활성 감소, 즉 메틸화된 H3K9의 탈메틸화 감소로 측정될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 메틸화 또는 탈메틸화의 검출은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 메틸화된 단백질 또는 탈메틸화된 단백질을 특이적으로 인식하는 항체의 사용을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 또한 본원 실시예를 참조할 수 있다.
또한 상기 JAK2에 의해 인산화된 KDM3A는 STAT3 단백질에 대한 보조인자로서의 활성을 갖기 때문에, 상기 JAK2-STAT 신호전달 신호 전달 경로의 억제는 또한 상기 STAT3 단백질의 전사 활성의 감소로 측정될 수 있다. STAT3 단백질은 전사인자(Transcription Factor)로서 STAT이 결합할 수 있는 프로모터에 결합하여 이에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 RNA로의 발현을 촉진하며, 인산화된 KDM3A 이 과정에서 보조인자(cofactor)로 작용한다.
본원에 따른 방법에서 STAT3 단백질에 대한 보조인자로서의 활성은 따라서 STAT3 단백질의 전사 활성으로 측정될 수 있으며, 이러한 방법은 본원 실시예 및 기술분야의 지식을 고려하여 수행될 수 있다. 예를 들면 STAT3 프로모터를 표적 유전자 예를 들면 Myc에 작동가능하게 연결된 플라스미드가 사용될 수 있으며, 상기 플라스미드로부터의 전사 활성은 표적 mRNA의 양을 결정하는 다양한 방법 예를 들면 역전사 PCR 방법 등을 통해 검출될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 방법에서 JAK2-STAT 신호전달 경로는 활성화될 수 있다. 특히 본원에 따른 방법이 세포에서 수행될 때, JAK2-STAT 신호전달 경로는 활성화될 수 있다. 일 구현예에서는 glycoprotein 130(gp130) 수용체를 매개로 하는 JAK2-STAT 신호전달 경로의 활성화에 작용하는 물질이 사용되며, gp130 매개 신호 전달 분자를 공유하는 물질은 JAK2-STAT 신호전달 경로를 활성화에 유사한 기능을 나타낸다(Sriram K et al., The Journal of Biological Chemistry 279, 19936-19947, 2004). 따라서 상기 효과를 갖는 공지된 다양한 물질이 활성화에 사용될 수 있으며, IL(Interleukin)-6, IL-11 또는 Oncostatin M(Osm)이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 IL-6가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서는 KDM3A를 경유하는 JAK2-STAT 경로를 억제할 것으로 기대되는 시험물질로 처리된다. 상기 경로의 억제는 상술한 바와 같은, KDM3A 단백질의 인산화 감소 또는 억제, STAT3 단백질의 전사 활성이 감소 또는 억제, H3K9 단백질의 탈메틸화 감소 또는 억제의 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다. 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 억제 또는 감소를 의미하며, 당업자라면 본원에 개시된 내용 및/또는 당업계의 상식을 근거로 억제 또는 감소된 정도를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
본원의 방법에 사용되는 시험물질은 JAK2-STAT 경로 신호전달시스템에 작용하여 KDM3A의 인산화를 감소시켜 H3K9의 탈메틸화를 조절 특히 억제할 것으로 기대되는 물질 또는 STAT3 단백질의 보조인자로서의 활성을 억제할 것으로 기대되는 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme) 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 저분자화합물이 시험물질로 사용될 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은 DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다. 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물(예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클(예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 KDM3A의 인산화 감소, H3K9의 탈메틸화를 억제하는 물질 또는 STAT3 단백질의 보조인자로서의 활성을 억제하는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상, 또는 이 이상이 감소된 것을 후보물질로 선별할 수 있다.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 동물 세포주에 트랜스팩션한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.
또는 스크리닝 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.
그 외 상기 방법에 사용되는 시험물질의 종류 등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 방법에 의해 선별된 후보물질은 조절되지 않은 세포 성장의 억제 또는 암 치료제로 개발/사용될 수 있다.
본원에서는 JAK-STAT 신호전달 이상에 의한 암은 이로 제한하는 것은 아니지만, 고형암, 특히 자궁경부암이다.
본원에서 사용된 용어 "치료"란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.
또 다른 양태에서 본원은 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.
본원에서는 본원 도 1의 D 등에 나타난 바와 같이 KDM3A가 1101번 라이신 잔기에서 특이적으로 인산화되고, 본원에 따른 항체는 교차 반응성이 없이, 상기 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식하는 것으로 나타났으며, 상기 잔기가 타이로신으로 변이된 KDM3A는 인식하지 않아, 특이성이 매우 뛰어나다.
본 발명의 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편을 포함하는 것이다.
완전한 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항원에 결합하는, 항체의 항원 결합 단편 또는 활성 단편의 예는 Fv, ScFv, Fab, Fab' 및 F(ab')2를 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. sFv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 sFv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 이러한 방법에 관한 자세한 사항은 예를 들면 Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press (1986)에 기재된 것을 참조할 수 있다.
용어 “기능적으로 동등한 항체”는 적어도 하나의 주요한 기능적 특성, 즉 1101번째 잔기가 인산화된 KDM3A 효과를 나타내는 기타 변이를 포함하는 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식할 수 있는 항체로 상기 언급한 임의의 타입, 클래스 또는 단편을 포함하며, 다양한 방법 예컨대 파아지 디스플레이, 임의의 개체 및 세포 예를 들면 박테리아, 곤충세포, 포유류 세포 등 목적하는 항체를 생산할 수 있는 다양한 방법에 의해 생산되는 항체를 포함하는 것이다.
본 발명의 항체는 동물 혈청, 세포배양물 또는 재조합 DNA 기술로 수득될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서 본 발명의 항체는 폴리클론 항체로, 폴리클론 항체의 제조방법은 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 한 구현예에서 본 발명의 항체는 모노클론 항체이다. 모노클론 항체의 제조방법은 기술분야에 공지되어 있으며 전통적인 클로닝 및 세포융합 방법을 통하여 제조될 수 있다. 통상적으로 항원을 야생형 마우스 또는 인브레드 마우스(BALB/c 또는 C57BL/6), 래트, 토끼 또는 기타 포유류 또는 야생형 또는 인간 항체를 제조할 수 있도록 조작된 형질전환 마우스에 투여(예를 들면 피하 또는 복강투여)한다. 항원은 단독으로 또는 애주번트와 함께 투여할 수 있으며, 항원은 벡터에서 발현되도록 하거나, DNA 또는 면역반응을 유도할 수 있는 융합단백질의 형태로 도입될 수 있다. 융합단백질은 면역반응을 유도할 수 있는 펩타이드를 포함하며, 예를 들면 베타갈락토사이데이즈, 글루타치온, S-트랜스퍼라제, 키홀림펫헤모시아닌(KLH) 및 소태아혈청과 같은 담체 단백질을 포함한다. 동물을 이러한 항체로 2-3회 부스트 한 후에 지라를 축출하고 이를 미엘로마 세포주(예를 들면 미국 ATCC사의 SP2/O)와 폴리에틸렌글리콜과 같은 융합촉진제의 존재하에서 융합하여 하이브리도마 세포주를 생성할 수 있으며, 보다 자세한 방법은 Kohler and Milstein. Nature 256: 495-497 (1975) 및 Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)을 참조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험방법 및 재료
세포 배양 및 시약
세포를 37℃, 5% (v/v) CO2의 환경에서 배양 하였다. HEK293T와 HeLa 세포는 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토 마이신(100 ㎍/mL)로 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지(DMEM, Welgene)에 10% FBS(Gibco)로 배양하였다. IL-6(R&D system, 50 NG/㎖), OSM(R&D system, 20 NG/㎖), IL-11(R&D system, 5 NG/㎖) AG490(Sigma 10μM) TG101348(Selleckchem, 2.5μM), Asciminib(Selleckchem, 250 nM) 또는 PP2(Sigma, 10μM)를 지시 된 시간 동안 처리하였다. JAK1(# 3332), JAK2(# 3230), phospho-STAT3(# 9131) 및 H3K9me2(# 9753, # 4658, ab1220) (Cell Signaling Technology, Abcam); STAT3(sc-8019) (Santa Cruz); KDM3A(nb100-77282) (Novus); phospho-Tyrosine 4G10(05-1050) (Millipore); HA(MMS-101R) (Covance); 및 FLAG(F3165, Sigma).
본원에서 1101번째 잔기가 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식하는 항체는 본원에서 처음으로 제조되었다. 상기 항체는 4mg의 펩타이드 KM-pY-NAYGLI (서열번호 1을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 펩타이드)를 항원으로 하여 토끼에서 제조되었으며 Peptron(대한민국)에 의뢰하여 제작하였다.
리포터 분석
루시퍼 레이즈 시스템(Promega)을 사용하여, M67 (4X-STAT 반응 요소)-루시퍼 레이즈 활성을 트랜스팩션 후 48시간에 루미노미터를 사용하여 측정하고 β-갈락토시다아제 활성으로 표준화시켰다. 최소 3회 독립적인 실험을 수행하였다.
Quantitative RT-PCR
qRT-PCR 분석을 위해 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 추출하고 RevertAid™ Reverse Transcriptase(Enzynomics)를 사용하여 역전사 시켰다. 하기 프라이머를 PCR 반응에 사용 하였다 : hMYC : 정방향 5'-GAAGACGGGCTCCTTTGA-3 ', 역방향 5'-CAGCACTAAGCTCTGATACA-3'; hHPRT; 정방향 5'-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3 ', 역방향 5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3'; SYBR Green(Molecular Probes)을 갖는 ABI 프리즘 7300 시스템에 의해 mRNA를 검출하여 분석하였다.
ChIP assay
hMYC의 STAT 결합 요소에 대한 다음 ChIP 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다: 정방향 5'-GCCTCTGGCCCAGCCCTCCCGCTGAT-3', 역방향 5'-GCAAAGTGCCCGCCCGCTGCTATGG-3'.
LC-MS/MS에 의한 인산화 부위의 동정
KDM3A의 Tryptic digest는 nanoelectrospray LC-MS/MS로 분석하였다. 고압 액체 크로마토 그래피 분리는 Famous Autosampler(LC Packings)가 장착된 Ultimate 기기에서 수행되었다. 컬럼은 외경이 360μm 이고 내경이 75μm 인 용융 실리카 모세관으로 구성되었으며 직경이 5μm 인 300-Å C18 구슬(Grace Vydac)을 사용하여 길이 15cm를 사용하였다. 나노 컬럼의 출구는 원위 코팅 된 실리카 PicoTip 바늘에 인라인으로 연결되었다(New Objective). 용매 시스템은 용매 A(0.1% 포름산 및 5% 아세토 니트릴) 및 용매 B(0.1% 포름산 및 90% 아세토 니트릴)로 구성되었다. 구배는 50분에 걸쳐 0~40% 용매 B, 이어서 5분 동안 90% 용매 B에서 선형이었다. 탠덤 질량 스펙트럼은 정보 의존적 획득 모드에서 API QSTAR Pulsar Q-TOF 질량 분석기(Applied Biosystems)에 기록되었다. MS/MS 스펙트럼은 마스코트(Matrix Science)를 사용하여 National Center for Biotechnology Information 및 발현 된 서열 태그 데이터베이스를 검색하기 위해 사용되었다. 확인 된 인산화 펩타이드는 수동으로 검증하였다.
면역 세포 염색법
HeLa 세포를 커버 슬립상에서 배양시키고 PBS로 세척하였다. 세포를 실온에서 10분간 2% 파라포름 알데히드로 고정시키고 0.5% Triton X-100으로 3회 투과성을 만들었다. Blocking 후, Flag, JAK2 및 H3K9me2 항체를 각각 Alexa Fluor 594 및 488 마우스 및 토끼 IgG 표지 키트(Molecular Probe)로 표지하였다.
In vitro cell motility assay
Wound healing scratching motility assay는 pLKO.1 대조군 벡터 또는 pLKO.1-shKDM3A로 트랜스팩션된 HeLa 세포에서 수행하였다. 세포를 6-well 배양 플레이트에 접종하고 합류 할 때까지 배양하였다. 세포를 200μl 마이크로 피펫 팁으로 긁어내고 37℃에서 48시간 동안 배양했다. EVOS xl 투과광 현미경(AMG, Bothell, WA)을 사용하여 0시간, 24시간 및 48시간에 폐쇄 된 갭의 현미경 사진을 촬영하였다. 세포의 이동 거리는 그래프 프리즘 소프트웨어를 사용하여 갭 거리에 의해 정량화 하였다.
세포 증식 분석
pLKO.1 벡터 또는 pLKO.1-shKDM3A를 lipofectamine 시약에 의해 HeLa 세포로 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 하루 뒤에 IL-6의 처리 유무를 구분하고, 세포를 분리하여 24-well 플레이트에서 계대 배양하였다. JuLiTM stage 라이브 영상 장비(NanoEnTek Inc)를 사용하여 각 6시간 동안 세포 증식정도를 계수하고 제조사 가이드에 따라 JuLiTM STAT 소프트웨어로 분석하였다.
통계분석
시험 샘플과 대조 샘플 사이의 통계적 차이는 Student’s t-test에 의해 결정되었다. ANOVA는 여러 샘플의 비교를 수행했다. 그래프의 막대 그래프는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. Graphpad Prism software가 모든 분석에 사용되었다.
실시예 1. JAK2에 의한 KDM3A의 타이로신 1101 잔기의 인산화
액체 크로마토 그래피-질량 분석/질량 분석(LC-MS/MS) 분석에 따르면 KDM3A는 타이로신 1101(Y1101) 잔기에 인산화되었다(도 1A). 흥미롭게도, Y1101 잔기와 KDM3A의 주변 아미노산은 종간에 잘 보존되어있다(도 1B). 인산화 타이로신 특이적 항체를 이용한 공동면역침강(Co-IP) 분석은 KDM3A가 타이로신 잔기에 인산화됨을 보여준다(도 1C). 따라서 우리는 Y1101 잔기(KDM3A-Y1101p)에서 인산화된 KDM3A에 특이적 항체를 제작하고 면역블롯 분석(도 1D)에 의해 교차 반응이 일어나지 않는 것과 효능을 확인하였다. KDM3A-Y1101 인산화 항체를 이용하여 우리는 1101번째 아미노산 잔기 타이로신이 알라닌으로 대체 된 KDM3A의 Y1101A(YA) 돌연변이 형태의 경우 KDM3A의 타이로신 인산화가 나타나지 않는 것을 발견했다(도 1E). 이들 데이터는 KDM3A가 Y1101 타이로신 잔기에서 인산화됨을 나타낸다.
다음으로 우리는 KDM3A 인산화를 담당하는 상위 타이로신 인산화 효소들을 탐색하기로 결정했다. KDM3A가 주로 핵 내에 국한되어 존재하기 때문에 우리는 핵 내에 존재하는 타이로신 인산화 효소들을 모색했다. JAK1, JAK2, Src, Abl1이 핵과 세포질에 존재하기 때문에 핵에서 KDM3A를 인산화시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 면역침강 데이터는 KDM3A가 JAK 활성화 및 핵으로의 이동에 대한 잘 알려진 상위 생리학적 신호인 IL-6의 존재 하에 JAK1 및 JAK2 둘 모두에 결합함을 확인하였다(도 1F 및 G). 다음으로 우리는 IL-6 처리에 의해 활성화 된 JAK1 또는 JAK2가 KDM3A 인산화를 유도하는지 조사하였다. 우리는 JAK2가 IL-6 처리 후에 KDM3A 타이로신 인산화를 증가시키는 것을 발견했지만 JAK1에 의해서는 KDM3A 인산화가 증가되지 못하는 것을 확인하였다(도 1H). 이는 KDM3A Y1101 타이로신 잔기의 인산화가 JAK2 특이적인 작용이라는 것을 나타낸다. 또한 IL-6 처리 후에 KDM3A-Y1101 인산화 항체로 확인하였을 때 KDM3A의 인산화가 유도되었지만, JAK2를 knock-down하게 되면 IL-6 처리하여 JAK2에 의해 유도되는 KDM3A 인산화가 망가지는 것을 확인하였다(도 1I).
JAK2 효소 활성이 KDM3A 인산화에 중요한지 알아보기 위해 HeLa 세포에서 JAK2의 야생형(WT), 지속적으로 활성화 된 V617F 돌연변이체(CA) 및 인산화-비활성 돌연변이체(DN)를 비교하여 분석하였다. JAK2 WT 및 CA 돌연변이체는 in vivo(도 1J) 및 in vitro(도 1K) 모두에서 KDM3A에 대해 인산화 활성을 나타낸 반면, DN 돌연변이체에서는 인산화 활성이 나타나지 않았다. 실제로 IL-6에 의해 유도된 KDM3A 인산화는 JAK2 저해제 인 AG490 및 TG101348(도 1L 및 M)를 처리하였을 때 사라지는 것을 확인하였지만, Src 계통 저해제 인 PP2(도 1N) 또는 Abl 저해제 인 Asciminib(도 10)등의 다른 저해제로는 인산화가 거의 사라지지 않았다. 종합해 보면, 이 데이터를 통해서 핵 내에서 KDM3A가 JAK2에 의해 타이로신에 인산화되는 것을 in vivo 및 in vitro 모두에서 확인하였다.
실시예 2. IL-6에 의해 유도 된 KDM3A 인산화에 의한 탈메틸화 효소 활성 증가
JAK2가 인간 조혈 세포에서 전사 활성화를 위한 STAT 표적 유전자로부터 HP-1α를 배제하는 것으로 알려져 있지만 JAK2 신호 전달이 KDM3A-의존성 H3K9 탈메틸화(전사적 활성 마커)를 조절하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 본 발명에서는 IL-6 처리 시 H3K9me2의 메틸화 정도가 변화하는지 여부를 확인하기 위해 IL-6 처리에 의해 KDM3A의 JAK2 의존성 인산화가 유도된다는 사실을 확인하였다. 실제로, H3K9me2는 증가된 KDM3A 인산화 및 STAT3 인산화와 함께 HeLa 및 HEK293T 세포에서 IL-6 처리 동안 감소되었다(도 2A). 다음으로, IL-6에 의해 활성화가 유도된 JAK2가 H3K9me2 레벨 감소의 원인인지 여부를 조사하였다. 실제로, IL-6 처리하면 H3K9me2 레벨이 감소했지만, shRNA에 의해 JAK2를 knock-down한 경우에는 IL-6 처리를 하여도 H3K9me2 레벨의 감소가 나타나지 않는 것을 면역침강법(도 2B) 및 면역 염색 분석법(도 2C)으로 확인하였다.
또한 JAK2에 의해 매개되는 H3K9의 탈메틸화가 KDM3A에 의존하는지 여부를 조사하였다. IL-6 처리에 의해서 JAK2 의존적인 H3K9me2 레벨의 감소는 KDM3A를 knock-down한 경우에는 나타나지 않았다(도 2D). JAK2에 의한 KDM3A의 인산화가 본질적인 히스톤 탈메틸화 활성에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, KDM3A knock-down한 세포에서 shRNA 내성 형태의 KDM3A WTR 또는 YAR 돌연변이를 트랜스팩션했다. 흥미롭게도, KDM3A의 YA 돌연변이체는 KDM3A의 WT에 비해 H3K9me2에 대한 효소 활성이 현저히 감소하는 것을 면역 염색 분석법으로 확인하였다(도 2E). 또한, KDM3A WTR 또는 YAR 돌연변이를 IL-6 처리 여부에 따라 KDM3A knock-down 세포에 도입 시켰을 때, H3K9me2의 레벨은 IL-6 처리 한 경우에만 KDM3A WT에서 감소했지만 YA 돌연변이체에서는 감소하지 않았다(도 2F).
또한 IL-6 외에 다른 사이토카인을 세포에 처리하여 H3K9me2 레벨의 감소와 함께 KDM3A 인산화를 유도하는지 여부를 조사했다. 실제로, KDM3A 인산화는 STAT3 활성화의 다른 자극 신호인 Oncostatin M(OSM) 및 IL-11에 의해서도 H3K9me2의 탈메틸화와 함께 유도되었다(도 2G 및 H). IL-6, IL-11 및 OSM은 수용체로서 gp130 매개 신호 전달 분자를 공유하므로, 이들은 KDM3A 인산화에 유사한 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 그러나 각 STAT3 활성화 자극에 의해 특정한 작용 방식과 하위 표적 유전자가 차별적으로 조절 될 수 있는 가능성을 배제 할 수 없다. 이러한 데이터는 KDM3A의 JAK2 의존적인 타이로신 인산화가 향상된 효소 활성을 유도하여 H3K9me2 레벨을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 3. JAK2-STAT3 신호 전달 경로에서 KDM3A의 전사 보조 활성 인자로서의 기능 규명
JAK2는 STAT3와 상호작용을 통해 STAT3 표적 유전자를 활성화 시킨다. 활성화된 JAK2는 핵으로 이동하여 전사 활성화를 위해 STAT3 인산화를 유도한다. 또한, 핵으로 들어간 JAK2는 핵 내의 STAT3 이외에 히스톤과 같은 다른 특정 기질에 작용함으로써 종양유발 인자로서 기능하는 것으로 알려져 있다. 인산화된 KDM3A가 JAK2-STAT3 신호 전달 경로의 전사 보조 활성제로서 기능할 수 있는지를 시험하기 위해, 먼저 KDM3A가 STAT3에 결합하는지 여부를 조사하였다. 면역침강법을 통해 KDM3A와 STAT3 사이의 결합이 IL-6 처리에 의해 유의하게 향상되었음을 확인하였다(도 3A).
KDM3A가 STAT3를 통해 JAK2-STAT3 표적 프로모터에 결합되는지 여부를 조사하기 위해, 기능적 STAT 결합 부위를 포함하는 MYC 프로모터에서 염색질 면역 침전(ChIP) 분석을 수행하였다. ChIP 분석을 통해 IL-6 처리에 따른 H3K9me2 레벨의 감소와 함께 MYC 프로모터에서 JAK2, 인산화된 STAT3 및 인산화된 KDM3A이 모두 함께 나타는 것을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과는 인산화된 KDM3A가 IL-6에 의해 유도된 JAK2-STAT3 표적 유전자의 전사 활성화에 직접 관여함을 나타낸다. 또한, shRNA에 의한 KDM3A의 knock-down을 통해 IL-6에 의해 유도된 MYC mRNA 및 단백질 레벨을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 3C 및 D). 뿐만 아니라, KDM3A의 knock-down 후 shRNA 내성 형태의 KDM3A WT와 YA 돌연변이체를 도입한 경우 KDM3A WT를 도입한 경우에만 IL-6 처리 시 STAT3의 표적인 MYC mRNA 및 단백질 레벨을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3E 및 F).
또한, 기능적 STAT3 반응 요소를 포함하는 M67 프로모터-루시퍼레이즈 리포터를 사용한 분석에서 KDM3A 인산화가 STAT3의 지속적 활성 형태(STAT3 CA)의 존재 하에서 M67 프로모터-루시퍼레이즈 리포터 활성을 증가시키지만, STAT3의 활성이 나타나지 않는 형태(STAT3 DN)에서는 STAT3 응답 요소에 결합하지 못하였다(도 3G). STAT3 의존적인 루시퍼레이즈 리포터 활성은 KDM3A knock-down에 의해 약화되었지만(도 3H), KDM3A 과발현에 의해 상승하였다(도 3I). 종합해 보면, 이들 데이터는 KDM3A 기능이 STAT3의 전사 보조 활성인자로서 IL-6에 의해 활성화되는 JAK2-STAT3의 표적 유전자 발현에 중요하다는 것을 나타낸다.
실시예 4. KDM3A 인산화에 의한 세포 증식 및 이동성 증가 및 KDM3A 낙다운에 의한 효과 상쇄
JAK2-STAT3 신호 전달 체계의 조절 장애가 사람의 악성 종양유발과 관련이 있기 때문에 IL-6로 활성화된 JAK2에 의한 KDM3A 인산화가 암세포 성장, 증식, 이동성 및 콜로니 형성을 조절하는데 관여 하는지를 조사하였다. KDM3A 인산화를 유도하는 IL-6의 처리 유무에 따른 세포 이동성 분석을 수행하였다. IL-6 처리에 의해 세포의 이동성이 증가하여 48시간 정도 후에 간격이 좁혀지는 것을 확인하였다. 반면, KDM3A shRNA에 의해 KDM3A가 knock-down된 세포는 세포의 이동성이 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 4A). 이 데이터는 KDM3A가 IL-6의 처리 시 세포 이동성의 증진에 관여한다는 것을 나타낸다.
다음으로 세포의 성장 곡선 분석과 BrdU 염색 및 콜로니 형성 분석을 통해 세포 증식 효율을 측정하였다. 세포 증식 효율에서도 세포의 이동성 분석의 경우에서와 유사한 결과를 얻게 되었다. IL-6 처리한 경우 세포 성장과 BrdU 결합이 증가 되었으나, KDM3A를 낙다운한 경우에는 IL-6를 처리하였음에도 세포 성장과 BrdU 결합이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 4B 및 C). KDM3A 낙다운 세포에서 KDM3A WTR과 YAR 돌연변이를 도입하였을 때, KDM3A WTR의 경우에서만 IL-6 처리 시에 BrdU 결합의 증가가 회복되는 것을 확인하였다(도 4C). IL-6 처리 유무와 KDM3A 낙다운의 유무에 따른 MYC의 도입이 콜로니 형성에 미치는 영향을 분석하였다. KDM3A knock-down 세포에서 MYC을 도입한 경우에는 IL-6 처리 시 콜로니 형성 능력이 감소되었다(도 4D).
이러한 데이터는 IL-6 처리에 따라 KDM3A에 의해 활성화된 MYC의 발현이 암 진행을 유도할 수 있다는 것을 콜로니 형성 증가를 통해 잠재적으로 암시한다. 종합적으로, 이 데이터는 인산화된 KDM3A가 IL-6에 의해 매개되는 세포 성장을 촉진시켜 세포 생존과 암 진행을 조절함을 나타낸다(도 4E).
본 발명에서는 상위 자극신호에 대한 세포 내 JAK2-STAT3 신호 전달과 하위 후성 유전적 기작 사이에서 KDM3A가 기능적 및 기계적 연결을 제공한다는 것을 밝혔다. 또한 JAK2에 의해 유도된 타이로신 인산화된 KDM3A에 의해 H3K9 탈메틸화의 조절이 암세포의 증식과 이동성을 유도하는 주된 후성 유전 현상 중 하나임을 제안하였다. 본원의 결과는 이전에 보고된 적이 없는 IL-6에 의해 유도된 핵에서의 JAK2-KDM3A-H3K9me2 신호 전달 축을 규명하였고, 이러한 신호전달 경로가 암세포 이동성, 증식 및 성장을 증가 시킨다는 것을 규명하였다. JAK2 활성화는 인산화된 KDM3A가 STAT3와 강하게 결합하고, H3K9 탈메틸화효소 기능의 증가를 통해 STAT3의 보조 활성화인자로서 작용하도록 한다. JAK2-STAT3 신호 전달 경로가 세포 항상성 유지에 진화적으로 잘 보존되어 있기 때문에 JAK2-STAT3 신호 전달 체계의 조절 장애는 퇴행성 질환 및 암과 같은 심각한 결과를 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서 KDM3A와 같은 후성 유전 조절인자의 신호 의존적 조절과 그 조절 장애의 규명은 암 진행 기작에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 신약 개발을 위한 도전적인 길을 열어 줄 수 있다.
주만지(JmjC) 도메인을 보유한 KDM 패밀리는 30가지 이상이 알려져 있다. 지난 10년 동안 주만지(JmjC) 도메인을 함유한 KDM의 경우 임상 표적 후보 물질의 개발이 두드러지지 않았지만, LSD1과 같은 다른 탈메틸화 효소에 대해서는 4가지 화합물이 이미 임상 시험 중에 있다. 주만지(JmjC) 도메인 함유 KDM을 조절하는 선택적 화합물의 개발에 대한 큰 장애물은 높은 구조적 유사성 및 패밀리 구성원 간의 잠재적인 기능적 중복성이다. 우리가 JAK2-KDM3A-H3K9me2의 새로운 신호 전달 축을 제시하였기 때문에, JAK2에 의한 KDM3A 인산화를 표적으로 하는 중요한 발암 신호 전달 계통의 조절을 통해 새로운 치료 전략을 제공할 수 있을 것이다.
연구비 사사
This work was supported by Creative Research Initiatives Program (Research Center for Epigenetic Code and Diseases, NRF-2017R1A3B1023387).
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

  1. KDM3A(lysine-specific demethylase 3A)을 경유하는 JAK2(Janus tyrosine kinase 2)-STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3) 신호전달 경로 이상과 관련된 암 치료용 물질의 스크리닝 방법으로, 상기 방법은
    JAK2 단백질 및 상기 JAK2 단백질에 의해 인산화 될 수 있는 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기를 포함하는 KDM3A 단백질을 상기 JAK2에 의한 상기 타이로신 잔기의 인산화를 억제할 것으로 기대되는 시험물질의 존재 중에서 배양하는 제 1 단계;
    상기 KDM3A 단백질의 타이로신 잔기의 인산화 정도를 측정하는 제2 단계; 및
    상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 KDM3A 단백질의 인산화가 감소한 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 후보물질로 선별하는 제 3 단계를 포함하는, JAK2-STAT3 신호전달 이상에 의한 암 치료용 물질 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 단계는 STAT3 단백질을 추가로 포함하며,
    상기 제 2 단계에서 상기 KDM3A 단백질의 상기 STAT2 단백질에 대한 보조인자로서의 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하며,
    상기 3 단계에서, 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 KDM3A 단백질의 상기 STAT3 단백질에 대한 보조인자로서의 활성으로서, 상기 STAT3 단백질의 전사 활성이 감소된 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제하는 후보물질로 선별하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 단계는 서열번호 4를 기준으로 9번째 라이신 잔기가 메틸화된 히스톤 3 단백질(H3K9, Histone 3 Lysine 9)을 추가로 포함하며,
    상기 제 2 단계에서 상기 KDM3A 단백질의 H3K9에 대한 탈메틸화 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하며,
    상기 3 단계에서 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3K9 단백질의 탈메틸화가 감소된 경우, 이를 암 세포의 성장을 억제하는 후보물질로 선별하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 단계는 상기 각 단백질을 발현하는 진핵세포에서 수행되고, 상기 세포는 상기 JAK2-STAT 신호전달 경로를 활성화 할 수 있는 물질로 추가로 처리되는 것인, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 JAK2-STAT 신호전달 경로를 활성화 할 수 있는 물질은 IL(Interleukin)-6, IL-11 또는 Oncostatin M(OSM)을 포함하는 gp(glycoprotein) 130을 매개 신호 전달 분자인, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 자궁경부암, 난소암, 유방암, 신장임 및 위암을 포함하는 고형암인, 방법.
  7. 서열번호 1의 서열을 기준으로 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 KDM3A를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  8. 서열번호 1의 서열을 기준으로 KDM3A 단백질 1101번째 타이로신 잔기가 인산화된 KMpYNAYGLI 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 Fv, ScFv, Fab, Fab' 및 F(ab')2인, 항체 또는 항원 결합 단편.
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