WO2020008158A1 - Utilisation de peptides en tant qu'agents insecticides - Google Patents

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WO2020008158A1
WO2020008158A1 PCT/FR2019/051679 FR2019051679W WO2020008158A1 WO 2020008158 A1 WO2020008158 A1 WO 2020008158A1 FR 2019051679 W FR2019051679 W FR 2019051679W WO 2020008158 A1 WO2020008158 A1 WO 2020008158A1
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peptide
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amino acids
cell
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PCT/FR2019/051679
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Pedro Da Silva
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Institut National Des Sciences Appliquees De Lyon
Institut National De La Recherche Agronomique
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance

Definitions

  • the present invention relates to insecticidal peptides and their uses, in particular as phytosanitary agents.
  • the objective of the present invention is to provide new insecticidal agents effective in particular against aphids, which can be used as phytosanitary agents and therefore capable of replacing the current treatments using neonicotinoids.
  • the present invention thus relates to the use as a pesticidal agent, preferably as an insecticidal agent, of a peptide comprising the sequence of formula
  • Xi represents a sequence of 1 to 9 amino acids
  • X 2 represents a sequence of 2 amino acids
  • X 3 represents a sequence of 3 amino acids
  • X 4 represents a sequence of 3 amino acids
  • X5 represents a sequence of 3 to 5 amino acids
  • X 6 represents a sequence of 4 and 6 amino acids
  • X 7 represents an amino acid
  • C d represents a sequence of 9 amino acids
  • X9 represents a sequence of 2 amino acids
  • X10 represents a sequence of 2 to 16 amino acids
  • Xi represents the sequence (Z) m - [G / S], preferably the sequence (Z) m -G, where Z is an amino acid independently chosen for each of the m occurrences and m is 0 or an integer between 1 and 8; and or
  • X 2 represents the sequence [F / Y] -Z, preferably the sequence FZ, where Z is an amino acid; and or
  • X 4 represents the sequence [S / D / N] -ZZ, preferably [S / D] -ZZ, and more particularly the sequence S -ZZ, where Z is an amino acid independently chosen for each occurrence; and or
  • X5 represents the sequence (Z) n - [L / V], preferably the sequence (Z) n -V, where Z is an amino acid independently chosen for each of the n occurrences and n is an integer between 2 and 4, and or
  • Xe represents the sequence [G / N] - (Z) P , preferably N- (Z) P , where Z is an amino acid independently chosen for each of the p occurrences and p is an integer between 3 and 5; and or
  • X 8 represents the sequence Z- [E / Q] -ZZZZZ- [D / G] -Z (SEQ ID NO: 7), preferably the sequence ZEZZZZZDZ (SEQ ID NO: 8), where Z is an amino acid independently chosen for each occurrence; and or X 9 represents the sequence [P / A] - [Y / H], preferably the sequence PY.
  • Xi can represent the sequence Z 1 -Z 2 -Z 3 -Z 4 -Z 5 -Z 6 -Z 7 -Z 8 -Z 9 where
  • Zi is absent or is D, preferably is D,
  • Z 2 is absent or is F or I, preferably is F
  • Z 3 is absent or is D, preferably is D,
  • Z 4 is absent or is P or Y, preferably is P,
  • Z 5 is absent or is T, N or H, preferably is T,
  • Z 6 is absent or is E, T or Y, preferably is E,
  • Z 7 is absent or is F, L or I, preferably is F,
  • Z 8 is absent or is K, R or E, preferably is K, and
  • Z 9 is G or S, preferably G; and or
  • X 2 can represent the sequence [F / Y] - [P / E / Q / F], preferably FP; and / or X 3 may represent the sequence [FK / R] - [E / Y / F] - [I / N / G / F], preferably IEI; and or
  • X 4 can represent the sequence [S / D / N] - [K / T / N / R] - [Y / H / V / I], preferably S-
  • X5 can represent the sequence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 where
  • Z 10 is absent or is E, preferably is absent
  • Zi 1 is absent or is Y, preferably is absent,
  • Z 12 is A, N, Y or H, preferably is A,
  • Z 13 is V or K, preferably V
  • Z 14 is V or F, preferably V; and or
  • X 6 can represent the sequence Z15-Z16-Z17-Z18-Z1 9 -Z20
  • Z15 is N or G, preferably N,
  • Zi 6 is absent or is Y, preferably is Y,
  • Z 17 is absent or is T, A, K or D, preferably T,
  • Zi 8 is S, I, R or E, preferably is S,
  • Z 19 is R, F, D, V, A or F, preferably R, and
  • Z 20 is P, H, A or V, preferably P; and or
  • X 7 can represent Y, I, S or A, preferably Y.
  • X8 can represent the sequence [V / I / S
  • X9 can represent the sequence [P / A] - [Y / H], preferably the sequence P-Y; and or
  • X10 can represent the sequence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32- Z33-Z34-Z35-Z36 where
  • Z21 is Y, R, A, Q or P, preferably Y,
  • Z22 is D, T, E or N, preferably D,
  • Z23 is absent or is G, preferably is absent,
  • Z24 is absent or is G, S, H, Q or K, preferably is absent,
  • Z25 is absent or is P or A, preferably is absent
  • Z26 is absent or is A, E or S, preferably is absent,
  • Z27 is absent or is M, Q, E or V, preferably is absent
  • Z28 is absent or is L, M, E or V, preferably is absent
  • Z29 is absent or is M or L, preferably is absent
  • Z30 is absent or is H, preferably is absent,
  • Z31 is absent or is N, Q or D, preferably is absent,
  • Z32 is absent or is F, preferably is absent,
  • Z33 is absent or is L, preferably is absent
  • Z34 is absent or is T or S, preferably is absent
  • Z35 is absent or is S or N, preferably is absent
  • Z36 is absent or is P, preferably is absent.
  • the peptide is chosen from the group consisting of:
  • peptide comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 6, and
  • a peptide comprising, or consisting of, a sequence of formula (I) having at least 50%, preferably at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99%, of sequence identity with one of the sequences SEQ ID NO: 1 to 6, and having a pesticidal activity, preferably an insecticidal activity.
  • the peptide comprises, or consists of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 6, preferably comprises, or consists of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 4, and very particularly preferably comprises, or consists of, the sequence d amino acids SEQ ID NO: 1.
  • the peptide preferably has a size between 40 and 100 amino acids, preferably between 40 and 70 amino acids.
  • the peptide can be used as an insecticidal agent against hemiptera, lepidoptera, beetles and / or diptera, preferably against hemiptera and more particularly aphids, in particular Acyrthosiphon pisum.
  • the present invention also relates to a non-human host cell comprising a heterologous nucleic acid encoding a peptide as used according to the invention, said nucleic acid being placed under the control of a transcriptional promoter allowing the expression of said nucleic acid in said cell.
  • the cell can be a plant cell, preferably a legume plant or cereal plant cell, and more particularly a legume plant cell chosen from the group consisting of soybeans, beans, peas, chickpeas, peanuts, lentils. , alfalfa, broad bean and carob or a grain plant cell selected from the group consisting of wheat and corn.
  • the cell can also be an entomopathogenic microorganism, preferably an entomopathogenic bacterium or fungus.
  • the present invention further relates to an entomopathogenic virus comprising a heterologous nucleic acid encoding a peptide as used according to the invention, said nucleic acid being placed under the control of a transcriptional promoter allowing the expression of said nucleic acid in the insect infected with the virus.
  • the present invention also relates to a transgenic plant or multicellular plant structure comprising at least one cell according to the invention, as well as to a process for producing such a transgenic plant comprising the introduction into a plant cell of a heterologous nucleic acid. encoding a peptide as used according to the invention, and the reconstitution of said organism from said cell.
  • the present invention further relates to a phytosanitary composition
  • a phytosanitary composition comprising at least one peptide as used according to the invention or one of its phytosanitary acceptable salts, a host cell and / or a virus according to the invention, and a phytosanitary acceptable support and / or excipient.
  • the composition can further comprise one or more additional phytosanitary agents, preferably chosen from insecticides, bactericides, fungi, virucides, growth regulators or stimulators of the plant's natural defenses.
  • FIG. 2 ESI-HRMS spectrum (A) and HPLC chromatogram (B) of the BCR4 peptide (Retention time 22.5 min).
  • the inventors have identified a new family of natural insecticidal peptides which can be used as an alternative to conventional chemical pesticides.
  • BCRs Bacillus subtilis factor receptors
  • cysteine a new class of proteins rich in cysteine
  • BCRs Bacteiocyte Cysteine Rich
  • the BCRs contain 67 to 108 residues, with six or eight cysteine residues and there are seven of them. They are coded by orphan genes and expressed exclusively in the bacteriocytes of aphids. These host cells are home to Buchnera aphidicola, the primary symbiotic bacteria of aphids.
  • the sequences of BCRs show no significant similarity with other proteins of sequenced organisms and a comparative analysis has confirmed that these peptides are limited to the line of aphids.
  • the present invention relates to the use as a pesticidal agent, and more particularly as an insecticidal agent, of a peptide comprising, or consisting of, the sequence of formula (I)
  • Xi represents a sequence of 1 to 9 amino acids
  • X2 represents a sequence of 2 amino acids
  • X3 represents a sequence of 3 amino acids
  • X 4 represents a sequence of 3 amino acids
  • X5 represents a sequence of 3 to 5 amino acids
  • X 6 represents a sequence of 4 to 6 amino acids
  • X 7 represents an amino acid
  • Xs represents a sequence of 9 amino acids
  • X9 represents a sequence of 2 amino acids
  • X10 represents a sequence of 2 to 16 amino acids
  • the connecting lines between the different cysteine residues represent the disulfide bridges.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide
  • protein protein
  • amino acid refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T), to rare natural amino acid residues (for example hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, alloisisoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine or aminobutyric acid) and non-natural amino acids (e.g.
  • norleucine, norvaline and cyclohexyl-alanine refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E , D, S and T).
  • Amino acids are represented here by their one-letter or three-letter code according to the following nomenclature: A: alanine (Ala); C: cysteine (Cys); D: aspartic acid (Asp); E: glutamic acid (Glu); F: phenylalanine (Phe); G: glycine (Gly); H: histidine (His); I: isoleucine (Ile); K: lysine (Lys); L: leucine (Leu); M: methionine (Met); N: asparagine (Asn); P: proline (Pro); Q: glutamine (Gln); R: arginine (Arg); S: serine (Ser); T: threonine (Thr); V: valine (Val); W: tryptophan (Trp) and Y: tyrosine (Tyr).
  • A alanine
  • C cysteine
  • D aspartic acid
  • Glu glutamic acid
  • F
  • amino acids constituting the peptide used according to the invention can be of L or D configuration, preferably of L configuration.
  • Xi represents the sequence (Z) m - [G / S], preferably the sequence (Z) m -G, where Z is an amino acid independently chosen for each of the m occurrences and m is 0 or an integer between 1 and 8; and or
  • X 2 represents the sequence [F / Y] -Z, preferably the sequence FZ, where Z is an amino acid; and or
  • X 4 represents the sequence [S / D / N] -ZZ, preferably [S / D] -ZZ, and more particularly the sequence S -ZZ, where Z is an amino acid independently chosen for each occurrence; and or
  • X5 represents the sequence (Z) n - [L / V], preferably the sequence (Z) n -V, where Z is an amino acid independently chosen for each of the n occurrences and n is an integer between 2 and 4, and or
  • X 6 represents the sequence [G / N] - (Z) P , preferably N- (Z) P , where Z is an amino acid independently chosen for each of the p occurrences and p is an integer between 3 and 5; and or
  • X 8 represents the sequence Z- [E / Q] -ZZZZZ- [D / G] -Z (SEQ ID NO: 7), preferably the sequence ZEZZZZZDZ (SEQ ID NO: 8), where Z is an amino acid independently chosen for each occurrence; and or
  • X 9 represents the sequence [P / A] - [Y / H], preferably the sequence PY.
  • Xi represents the sequence Z 1 -Z 2 -Z 3 -Z 4 - Z 5 -Z 6 -Z 7 -Z 8 -Z 9 where
  • Zi is absent or is D, preferably is D,
  • Z 2 is absent or is F or I, preferably is F
  • Z 3 is absent or is D, preferably is D,
  • Z 4 is absent or is P or Y, preferably is P,
  • Z 5 is absent or is T, N or H, preferably is T,
  • Z 6 is absent or is E, T or Y, preferably is E,
  • Z 7 is absent or is F, L or I, preferably is F,
  • Zs is absent or is K, R or E, preferably is K, and
  • Z 9 is G or S, preferably G; and or
  • X 2 represents the sequence [F / Y] - [P / E / Q / L], preferably FP; and or
  • X 3 represents the sequence [I / K / R] - [E / Y / F] - [I / N / G / L], preferably IEI; and / or X 4 represents the sequence [S / D / N] - [K / T / N / R] - [Y / H / V / I], preferably SKY; and or
  • X5 represents the sequence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14
  • Z 10 is absent or is E, preferably is absent
  • Zi 1 is absent or is Y, preferably is absent,
  • Z 12 is A, N, Y or H, preferably is A,
  • Z 13 is V or K, preferably V
  • Z 14 is V or L, preferably V; and or
  • X 6 represents the sequence Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20
  • Z 15 is N or G, preferably N,
  • Zi 6 is absent or is Y, preferably is Y,
  • Z 17 is absent or is T, A, K or D, preferably T,
  • Zi 8 is S, I, R or E, preferably is S,
  • Z 19 is R, L, D, V, A or F, preferably R, and
  • Z 20 is P, H, A or V, preferably P; and or
  • X 7 represents Y, I, S or A, preferably Y; and or
  • X 8 represents the sequence [V / FS] - [E / Q] - [A / Y / D] - [A / H / D / R / K] - [K / S / A / R] - [E / M / Q / L] - [R / E / L / N / K] - [D / G] - [Q / L / H / M] (SEQ ID NO: 9), preferably VEAAK- ERDQ (SEQ ID NO: 10); and or
  • X 9 represents the sequence [P / A] - [Y / H], preferably the sequence P-Y; and or Xio represents the sequence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33- Z34-Z35-Z36 where
  • Z21 is Y, R, A, Q or P, preferably Y,
  • Z22 is D, T, E or N, preferably D,
  • Z23 is absent or is G, preferably is absent,
  • Z24 is absent or is G, S, H, Q or K, preferably is absent,
  • Z25 is absent or is P or A, preferably is absent
  • Z26 is absent or is A, E or S, preferably is absent,
  • Z27 is absent or is M, Q, E or V, preferably is absent
  • Z28 is absent or is L, M, E or V, preferably is absent
  • Z29 is absent or is M or L, preferably is absent
  • Z30 is absent or is H, preferably is absent,
  • Z31 is absent or is N, Q or D, preferably is absent,
  • Z32 is absent or is F, preferably is absent,
  • Z33 is absent or is L, preferably is absent
  • Z34 is absent or is T or S, preferably is absent
  • Z35 is absent or is S or N, preferably is absent
  • Z36 is absent or is P, preferably is absent.
  • Xi is selected from the group consisting of sequences G, S, YHYIES (SEQ ID NO: 11), YFES (SEQ ID NO: 12), DFDPTEFKG (SEQ ID NO: 13), DIDPNTLRG (SEQ ID NO: 14); and or
  • X2 is selected from the group consisting of sequences FL, FQ, FE, FP and YP; and or
  • X 3 is chosen from the group consisting of the sequences KYL, RYN, RFG, KYN, IEI and KEI; and or
  • X 4 is chosen from the group consisting of the sequences DRV, NNI, DNV, DTH, SKY; and or
  • X5 is chosen from the group consisting of the sequences HKL, YKL, NKL, AVV and EYNVV (SEQ ID NO: 15); and or
  • Xe is chosen from the group consisting of the sequences GDEFV (SEQ ID NO: 16), GSAA (SEQ ID NO: 17), GKRVP (SEQ ID NO: 18), GKIDH (SEQ ID NO: 19), NYTSRP (SEQ ID NO : 20) and GASLP (SEQ ID NO: 21); and or X 7 represents Y, I, S or A; and or
  • X 8 is chosen from the group consisting of the sequences IQYKSLKGL (SEQ ID NO: 22), SQYRSLKGM (SEQ ID NO: 23), VQYDAMNGL (SEQ ID NO: 24), IQYHSMEGL (SEQ ID NO: 25), VEAAKERDQ (SEQ ID NO: 26) and VQDARQLDH (SEQ ID NO: 27); and or
  • X 9 is chosen from the group consisting of sequences PH, PY and AY; and or
  • X 10 is chosen from the group consisting of the sequences PTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO: 28), ANGQAAQVLHNFLSN (SEQ ID NO: 29), QEGHAAEELHQF (SEQ ID NO: 30), RTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO: 31), YD and YDGGPEML SEQ ID NO: 32).
  • the peptide is chosen from the group consisting of a peptide comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences
  • AAEELHQFL (SEQ ID NO: 6),
  • the peptide is chosen from the group consisting of a peptide comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 4, and functional variants thereof .
  • the peptide is chosen from the group consisting of a peptide comprising, or consisting of, the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, and functional variants thereof.
  • the term "functional variant” refers to a peptide of formula (I) and whose sequence differs from the parent protein by at least one substitution, insertion or deletion but which retains a pesticidal activity, preferably an insecticidal activity.
  • the functional variants have at least 50% of sequence identity with the parent sequence, more particularly preferably at least 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% or 85% of sequence identity with the parent sequence, and very particularly preferably at least 90%, 95%, 98% or 99% sequence identity with the parent sequence.
  • sequence identity refers to the number (%) of matches (identical amino acid residues) at positions from an alignment of two polypeptide sequences. Sequence identity is determined by comparing the sequences when they are aligned to maximize overlap and identity while minimizing sequence interruptions. In particular, the sequence identity can be determined using any of the many global or local alignment algorithms, depending on the length of the two sequences. Sequences of similar length are preferably aligned using global alignment algorithms (eg Needleman & Wunsch, J. Mol.
  • Biol 48: 443, 1970 which optimally align the sequences over the entire length, while sequences substantially different lengths are preferably aligned using a local alignment algorithm, for example the Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) or the Altschul algorithm (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul et al (2005) FEBS J. 272: 5101-5109). Alignment for the purpose of determining the percentage of amino acid sequence identity can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example using software available on Internet sites such as http: // blast.ncbi.nlm.
  • the functional variants can differ from the parent sequence by 1 to 10, ie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 to 10, substitutions, insertions and / or deletions of amino acids, preferably 1 to 5, ie 1, 2, 3, 4 or 5, substitutions, insertions and / or deletions of amino acids.
  • substitution designates the replacement of one amino acid residue with another chosen from among 20 natural standard amino acid residues, rare natural amino acid residues and amino acid residues unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue with another chosen from among the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C , F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
  • the substitution (s) can be conservative or non-conservative substitutions.
  • substitution refers to a substitution of one amino acid residue with another that has similar chemical or physical properties (size, charge or polarity).
  • conservative substitutions are made among (i) basic amino acids (arginine, lysine and histidine), (ii) acid amino acids (glutamic acid and aspartic acid), (iii) polar amino acids (glutamine and asparagine or serine, threonine and tyrosine), (iv) hydrophobic amino acids (methionine, leucine, isoleucine and valine), (v) aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan) and (vi) small amino acids (glycine, alanine).
  • the substitution (s) are conservative substitutions.
  • the peptide comprises, or consists of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 6, preferably comprises, or consists of, an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to 4, and more particularly preferably comprises, or consists of, the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • the peptide used according to the invention preferably has a size between 40 and 100 amino acids, more particularly preferably between 40 and 80 amino acids, and even more particularly preferably between 40 and 70 amino acids. According to a particular embodiment, the peptide used according to the invention has a size of 50 to 60 amino acids.
  • the peptide used according to the invention can comprise the sequence of formula (I) fused with another protein domain. This protein domain can for example be a signal sequence or a tag (or label).
  • the peptide can be a precursor which undergoes post-translational modifications making it possible to obtain the mature and active form of the peptide. It can thus include a translocation signal sequence and recognition and / or cleavage sites allowing it to undergo these post-translational modifications.
  • the peptide is a precursor of a mature pesticidal or insecticidal peptide, said precursor comprising an N-terminal translocation signal sequence.
  • the signal sequence can in particular be the sequence M- [R / K] -LL- [Y / H] -GFLIIMLT- [M / I] - [Y / H] -LS - [V / I] -Q (SEQ ID NO: 33).
  • the peptide can also comprise, in N-terminal or C-terminal, a tag (or label) useful for the purification or the immobilization of the peptide.
  • tags are well known to those skilled in the art and include, for example, the histidine (His 6 ), FLAG, HA (epitope derived from hemagglutinin influenza virus), MYC (epitope derived from proto-oncoprotein) tags human MYC) or GST (glutathione-S-transferase).
  • the peptide may include a site for cleavage by a protease or a chemical agent making it possible to remove this tag.
  • the peptide used according to the invention may have one or more post-translational modifications and / or chemical modifications, in particular glycosylation, amidation, acylation, acetylation and / or methylation.
  • protective groups can be added at the C- and / or N-terminal ends.
  • the protective group at the N-terminal end may be an acylation or an acetylation and the protective group at the C-terminal end may be an amidation or an esterification.
  • a phytosanitary acceptable salt is a salt which does not present any notable toxicity, at the dose where it is used, vis-à-vis the plant, the environment or man.
  • the salts can be, for example, the salts with acceptable mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; salts with acceptable organic acids such as acetic acid, citric acid, maleic acid, malic acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid; salts with acceptable mineral bases such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium salts; or salts with organic bases which have salifiable nitrogen.
  • the salt is an ammonium sulfate. These salts are commonly used and their preparation methods are well known to those skilled in the art.
  • the invention relates to the use of the peptide as described above as a pesticidal agent, and more particularly as an insecticidal agent, preferably for phytosanitary applications.
  • pesticide refers to a compound intended to control organisms considered to be pests. When these organisms are insects, we speak of "insecticide”.
  • Crop products are understood to mean products picked or harvested, in particular vegetables, fruits, flowers, or seeds, and processed products derived therefrom, in particular flour.
  • the peptide is used as an insecticidal agent in a phytosanitary treatment.
  • a peptide is considered to have insecticidal activity when it presents a TL50 (lethal time when 50% of the individuals die) of less than 5 days on insect larvae, preferably pea aphid larvae, at a concentration of 100 mM, preferably at a concentration of 50 mM.
  • TL50 lethal time when 50% of the individuals die
  • the insecticidal activity of the peptide of formula (I) is preferably against harmful insects selected from the group consisting of hemiptera, lepidoptera, beetles and diptera.
  • hemiptera examples include, but are not limited to, aphid species such as Acyrtho siphon pisum, Aphis gossypii, Aulacorthum solani, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae and Rhopalosiphum padi, species of mealybugs such as Planococcus citri whiteflies such as Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci, or bedbug species such as Lygocoris pabulinus, Liocoris tripustulatus, Lygus rugulipennis and Corythucha ciliata.
  • aphid species such as Acyrtho siphon pisum, Aphis gossypii, Aulacorthum solani, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae and Rhopalosiphum padi
  • mealybugs such as Planococcus citri whiteflies such as Trial
  • lepidoptera examples include, but are not limited to, species of caterpillars of several butterflies such as Chrysodeixis chalcites, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Clepsis speclrana, Cacoecimorpha pronuhana, Duponchelia fovealis, Tuta absoluta, Cydia pomonella, Lobesia botrana and Eupoella.
  • species of caterpillars of several butterflies such as Chrysodeixis chalcites, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Clepsis speclrana, Cacoecimorpha pronuhana, Duponchelia fovealis, Tuta absoluta, Cydia pomonella, Lobesia botrana and Eupoella.
  • beetles include, but are not limited to, weevil species such as Sitophilus spp. and wireworm species such as Agriotes spp.
  • diptera examples include, but are not limited to, species of flies such as Sciarkhe spp., Musca domestica, Stomoxys calcitrans and Liriomyza spp.
  • the peptide is used as an insecticidal agent against one or more hemiptera, and more particularly of one or more aphids, in particular Acyrthosiphon pisum.
  • the peptide described above can be used alone or in combination with one or more other active agents.
  • the additional active agent (s) can in particular be chosen from the other peptides described above and of formula (I) and other pesticides, insecticides or phytosanitary agents, preferably with one or more other insecticidal agents.
  • the peptide is used in combination with one or more other insecticidal peptides.
  • the peptide is used in combination with the insecticidal peptide AG41 (WO2015087238, Table II).
  • the present invention also relates to an expression cassette comprising a nucleic acid coding for a peptide as described above and of formula (I), operably linked to a heterologous transcriptional promoter.
  • expression cassette denotes a nucleic acid construct comprising an encoding region and a regulatory region, operably linked.
  • the expression “operably linked” indicates that the elements are combined so that expression of the coding sequence is under the control of the transcriptional promoter. Typically, the promoter sequence is placed upstream of the gene of interest, at a distance from the latter compatible with expression control.
  • the cassette can also comprise other regulatory elements such as a transcription terminator, the sequence of a transit peptide and / or an activator sequence called "enhancer”.
  • heterologous transcriptional promoter refers to a promoter which in nature is not associated with the nucleic acid encoding the peptide.
  • the cassette according to the invention is therefore a recombinant cassette.
  • the transcriptional promoter can be easily chosen by a person skilled in the art according to the nature of the host cell in which the expression is envisaged.
  • This promoter can in particular be an inducible or constitutive promoter, prokaryotic or eukaryotic, systemic or tissue-specific.
  • the transcriptional promoter is a promoter allowing the expression of the peptide in a host cell of a plant or an entomopathogenic microorganism.
  • the cassette is intended to be inserted into a viral vector and the transcriptional promoter is a promoter allowing expression of the peptide in a host cell infected with said vector, preferably a cell of a harmful insect.
  • the expression cassettes according to the invention can be constructed by conventional techniques of molecular biology, well known to those skilled in the art.
  • the present invention further relates to an expression vector comprising an expression cassette according to the invention.
  • This expression vector can be used to transform a host cell and allow the expression of the nucleic acid coding for a peptide as described above and of formula (I) in said cell.
  • the vector can be DNA or RNA, circular or not, single- or double-stranded. It is advantageously chosen from a plasmid, a phage, a phagemid, a virus, a cosmid and an artificial chromosome.
  • the vector may also comprise elements allowing its selection in the host cell such as, for example, a gene for resistance to an antibiotic or to a herbicide, or a selection gene ensuring the complementation of the respective gene deleted in the genome of the cell. host.
  • elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the vectors according to the invention may also comprise an origin of replication and / or a sequence allowing targeted insertion into the genome of the host cell.
  • the vectors according to the invention can be constructed by conventional techniques of molecular biology, well known to those skilled in the art.
  • the vector is a viral vector, preferably an entomopathogenic virus.
  • an entomopathogenic virus comprising a nucleic acid coding for a peptide as described above and of formula (I), said nucleic acid being placed under the control of a transcriptional promoter allowing the expression of said nucleic acid in the virus-infected host cell, the host cell preferably being an insect cell.
  • the entomopathogenic virus can be chosen from Baculoviridae, Reoviridae, Poxviridae, Iridoviridae, Parvoviridae, Picomoviridae, and Rhabdoviridae.
  • the entomopathogenic virus belongs to the family of Baculoviridae.
  • the transcriptional promoter can be easily chosen by a person skilled in the art according to the target cell.
  • the present invention also relates to the use of an expression cassette or an expression vector according to the invention for transforming or transfect a cell.
  • the host cell can be transiently or stably transformed / transfected and the cassette or vector can be contained in the cell as an episome or as a chromosome.
  • the present invention relates to a non-human host cell comprising a cassette or an expression vector according to the invention.
  • a host cell comprising a heterologous nucleic acid (which is not naturally present in the cell) coding for a peptide as described above and of formula (I).
  • Said nucleic acid is preferably placed under the control of a transcriptional promoter allowing the expression of said nucleic acid in the cell.
  • This promoter can be an endogenous promoter (naturally present in the cell) or a heterologous promoter (which is not naturally present in the cell).
  • the host cell can be chosen in particular to act as a vector for propagating the peptide of formula (I) or for the purpose of producing the peptide.
  • the host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the host cell can in particular be a plant cell, an animal cell, a fungal cell or a bacterium.
  • the host cell is an animal cell.
  • the animal cell to be chosen in particular from mammalian cells such as COS or CHO cells, insect cells such as Sf9, Sf2l or Hi5 cells, protozoan or nematode cells.
  • the protozoa and nematode cells are preferably chosen from the entomopathogenic families, in particular the families used in biological control such as for example the families of protozoa Amoebidae and Nosematidae or the nematode species Steinermatidae and Heterorhabditidae.
  • the host cell is a microorganism cell, preferably an entomopathogenic microorganism cell and more particularly preferably an entomopathogenic bacteria or fungus cell.
  • bacteria have been described as entomopathogens.
  • the bacteria can be chosen from bacteria of the Bacillaceae families, Enterobacteriaceae and Pseudomonaceae.
  • the bacterium is chosen from Bacillus thurengiensis and Bacillus sphaericus.
  • the fungus can be chosen from the mushrooms of the Beauveria genera, for example Beauvaria bassiana, Metharizium, for example Metharizium anisopliae, Verticillium, Erynia, Hirsutella, Entomophtora and Entomophaga.
  • the host cell is a plant cell, preferably a legume plant or cereal plant cell.
  • the plant cell can be a legume plant cell selected from the group consisting of soybeans, beans, peas, chickpeas, peanuts, lentils, alfalfa, beans and carob.
  • the plant cell can also be a cereal plant cell selected from the group consisting of wheat and corn.
  • the plant cell can also be a Nicotianea, for example Nicotiana sylvestris or Nicotiana tabacum.
  • heterologous nucleic acid into these different types of cells (plant cell, animal cell, fungal cell or bacteria) are well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a transgenic multicellular organism comprising a host cell according to the invention, that is to say a cell comprising a heterologous nucleic acid coding for a peptide as described above and of formula (I), in particular comprising a cassette or an expression vector according to the invention.
  • the organism is a protozoan or a nematode.
  • the organism is a transgenic plant or a multicellular plant structure
  • multicellular plant structure refers to plant parts such as flowers, seeds, leaves, stems, fruit, pollen, tubers, wood, or multicellular structures such as calluses, plant organs or immature embryos (eg explants used for trans genesis).
  • plant parts such as flowers, seeds, leaves, stems, fruit, pollen, tubers, wood, or multicellular structures such as calluses, plant organs or immature embryos (eg explants used for trans genesis).
  • the reconstitution of a transgenic plant or a multicellular plant structure as defined above from a transfected or transformed plant cell uses routine techniques well known to those skilled in the art.
  • the peptide can be expressed ubiquitously (in all tissues of the plant) or only in certain tissues or organs, in particular the tissues or organs which are the targets of the pest.
  • the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant or a multicellular plant structure comprising a host cell according to the invention, said method comprising the introduction into a plant cell of a nucleic acid encoding a peptide as described above and of formula (I), of an expression cassette or of a vector according to the invention, and the reconstitution of said plant or structure from said cell.
  • the method can also include a step of selecting plants or structures containing the nucleic acid, the cassette or the vector.
  • This selection can be carried out by any method known to a person skilled in the art, in particular by DNA amplification methods.
  • the present invention also relates to a method for producing a peptide as described above and of formula (I) comprising the transformation or transfection of a cell with a nucleic acid encoding said peptide or a cassette or expression vector according to the invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the peptide produced by said cell.
  • the methods of producing recombinant peptides are well known to those skilled in the art.
  • the cell used for the production of the peptide can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the cell is a bacterium, in particular E. coli.
  • the bacteria used is capable of performing oxidative folding peptide, such as for example a strain of E. coli SHuffle (Lobstein et al. Microbial Cell Factories. 20l2; ll: 56).
  • the present invention also relates to a method for producing a peptide as described above and of formula (I) comprising obtaining a transgenic plant according to the invention and expressing the peptide, the culture of this plant and the harvesting of the peptide produced by said plant.
  • the transgenic plant is a Nicotianea, for example Nicotiana sylvestris or Nicotiana tabacum.
  • the present invention also relates to a method for producing a peptide as described above and of formula (I) comprising the insertion of a nucleic acid encoding said peptide, of a cassette or of an expression vector according to the invention in an in vitro expression system also called acellular and the harvest of the peptide produced by said system.
  • an in vitro expression system also called acellular and the harvest of the peptide produced by said system.
  • Many in vitro or acellular expression systems are commercially available and the use of these systems is well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a phytosanitary composition
  • a phytosanitary composition comprising at least one peptide as described above and of formula (I), a host cell or a transgenic organism according to the invention and / or a virus according to the invention, and an excipient phytosanitary acceptable.
  • the invention further relates to the use of a peptide as described above and of formula (I), a host cell or a transgenic organism according to the invention and / or a virus according to the invention, for the preparation of '' a phytosanitary composition.
  • the phytosanitary composition can be of any type. It can be an aqueous or hydro-alcoholic solution, a paste, a gel in particular an aqueous gel (or hydrogel), a glue, a foam, a water-emulsion in oil or oil-in-water, a multiple emulsion, a micro- or nano-emulsion, a micellar solution, a suspension, or a colloid.
  • the phytosanitary composition can also be solid, for example in the form of a powder or of granules directly applicable by "Dusting" or to be dissolved or dispersed in a suitable solvent before application.
  • phytosanitary acceptable excipient means an excipient which does not present any significant toxicity, at the dose in which it is used, with regard to the plant, the environment and man.
  • the excipients which can be used in phytosanitary compositions are well known to those skilled in the art and include, among other things, diluents and fillers, wetting agents, surfactants, for example ionic, amphoteric or nonionic surfactants , dispersing agents, thickening agents, gelling agents, agents allowing controlled release of the active agents, for example encapsulation or micellar agents such as phospholipids, thixotropic adjuvants, dyes, antioxidant agents, preservatives, stabilizing agents, film-forming agents, vehicles in particular solvents such as water and lower alcohols, oils of mineral, vegetable or animal origin, resins, waxes, rosin, latexes, gums such as gum arabic, anti-foaming agents, and adhesive agents.
  • the phytosanitary composition according to the invention can also comprise one or more additional phytosanitary agents.
  • the additional phytosanitary agent (s) can be chosen, for example, from insecticides, bactericides, fungals, virucides, growth regulators or stimulators of the plant's natural defenses such as elicitors.
  • the dosage form and the excipients of the phytosanitary composition according to the present invention can be easily chosen by a person skilled in the art and depend essentially on the infestation to be treated and / or on the mode of administration.
  • the present invention also relates to the use of a peptide as described above and of formula (I) or of a phytosanitary composition according to the invention for treating or preventing the infestation of a plant and / or a product of culture by harmful organisms, preferably by insects, the method comprising bringing the peptide as described above and of formula (I) into contact with said plant, culture product or harmful organism
  • SEQ ID NO: 1 non-functional were obtained from the company Proteogenix (Strasbourg, France).
  • the oxidative folding of the peptide in vitro was carried out by following the protocol previously described (cf. Da Silva et al, 2009). Briefly, the oxidative folding was carried out by incubating the reduced peptide (10 mg) in an oxygenated buffer containing 0.1 mM of oxidized glutathione (10 equiv.), 1 mM of glutathione (100 equiv.), 1 mM of EDTA , TRIS 100 mM, pH 8.5, at 20 ° C, for 48 h under an argon atmosphere (final concentration of the peptide 30 mM).
  • the reaction was acidified by adding TFA (200 m ⁇ ) and the crude mixture was purified by semi-preparative HPLC to give pure BCR4 (2.2 mg or 22% yield).
  • the purity of the BCR4 peptide was evaluated by RP-HPLC, its mass was obtained by high resolution mass spectrometry (ESI-HRMS).
  • the concentration of the peptide was determined by measuring its RP-HPLC peak area at 214 nm.
  • aphids from the parthenogenetic clone of pea aphid LL01 which contains only the primary symbiont B. aphidicola.
  • Aphids are raised and kept on bean plants (Vicia faba L., Aquadulce variety) under controlled climatic conditions (temperature of 21 +/- l ° C, relative humidity of 70%, photoperiod of 16h), in order to obtain aphids reproducing only by viviparous parthenogenesis.
  • aphids come from a synchronized breeding. For this, adult aphids ready to laying eggs are placed on bean plants.
  • the young larvae are recovered and deposited on an artificial medium containing or not containing the peptide of interest.
  • the manipulation is carried out with a negative control composed only of artificial medium and a positive control representing one of the concentrations of the range studied with aphids.
  • the range studied includes different media containing the BCR4 peptide studied at several concentrations varying from 5 to 80 mM.
  • the experiments were carried out on thirty larvae per condition divided into three distinct groups of ten individuals.
  • BCR proteins were recovered using a combination of TBLASTN and BLASTP (Johnson et al, 2008) against the aphid genomes available in the AphidBase database (voni et al, 2010) and the entire databases of NCBI non-redundant proteins, nucleotides and ESTs. BCR proteins were subjected to multiple sequence alignments using the MUSCLE program (Edgar et al, 2004).
  • the purity of the BCR4 peptide was evaluated by RP-HPLC and its mass was obtained by high resolution mass spectrometry (ESI-HRMS): the theoretical calculated mass of BCR4 is 5891.5400 g.mol-l, experimental mass obtained is 5891.5437 g.mol-1 ( Figure 2A).
  • the concentration of the peptide was determined by measuring its RP-HPLC peak area at 214 nm ( Figure 2B).
  • the measurement of the insecticidal activity of BCR4 was carried out by incorporating increasing doses of peptides into the nutritive medium of the aphids and the monitoring of their mortality was carried out over 7 days.
  • a very significant effect of dose response on the survival time of aphids was observed (TL50: Lethal time when 50% of individuals die) (Table 1).
  • Table 1 Toxicity of the BCR4 peptide on the pea aphid Acyrthosiphon visum. TL50 in days, with confidence intervals, obtained by survival analysis with a normal logarithmic adjustment.
  • the dose response effect begins very early, from the first day after ingestion, with high mortality.
  • This range of activity (5-80 mM) is similar to that of the peptide AG41, a promising entomotoxic peptide of plant origin (cf. WO2015087238).
  • NCBI BLAST a better web interface. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 2008 Jul l; 36 (Web Server issue): W5-9.

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Abstract

La présente invention concerne des peptides insecticides et leurs utilisations, notamment en tant qu'agents phytosanitaires. Elle concerne également des organismes transgéniques, notamment des plantes transgéniques, exprimant lesdits peptides.

Description

Utilisation de peptides en tant qu’ agents insecticides
La présente invention concerne des peptides insecticides et leurs utilisations, notamment en tant qu’ agents phytosanitaires. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION
L’impact économique des pertes de récoltes dues aux insectes nuisibles est extrêmement important et se chiffre en milliards de dollars chaque année.
À ce jour, la protection des cultures repose quasi exclusivement sur des traitements chimiques de plus en plus utilisés mais largement critiqués du fait de leur rémanence dans l’environnement et de leur toxicité vis-à-vis d’organismes non cibles tels que les amphibiens, la faune aquatique, les insectes auxiliaires ou encore les agriculteurs utilisateurs de ces produits. Ainsi, les insecticides les plus utilisés à ce jour contre les pucerons, à savoir les néonicotinoïdes, seront très prochainement interdits dans l’union européenne en raison de leur dangerosité avérée à l’encontre des pollinisateurs.
Outre ces préoccupations sociétales et sanitaires, il est également à noter que ces dernières décennies ont vu l’émergence d’insectes ravageurs capables de résister aux traitements classiques.
Le développement de nouvelles molécules insecticides efficaces, d’origine naturelle, non toxiques pour l’homme et plus respectueuses de l’environnement apparaît indispensable afin de limiter l’utilisation des insecticides conventionnels issus de la chimie de synthèse.
RÉSUMÉ DE L’INVENTION
L’objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux agents insecticides efficaces notamment contre les pucerons, pouvant être utilisés en tant qu’ agents phytosanitaires et donc aptes à remplacer les traitements actuels utilisant des néonicotinoïdes.
La présente invention concerne ainsi G utilisation en tant qu’ agent pesticide, de préférence en tant qu’ agent insecticide, d’un peptide comprenant la séquence de formule
(I)
Figure imgf000002_0001
(I)
dans laquelle
Xi représente une séquence de 1 à 9 acides aminés,
X2 représente une séquence de 2 acides aminés,
X3 représente une séquence de 3 acides aminés,
X4 représente une séquence de 3 acides aminés,
X5 représente une séquence de 3 à 5 acides aminés,
X6 représente une séquence de 4 et 6 acides aminés,
X7 représente un acide aminé,
Cd représente une séquence de 9 acides aminés,
X9 représente une séquence de 2 acides aminés,
X10 représente une séquence de 2 à 16 acides aminés,
ou d’un sel dudit peptide acceptable sur le plan phytosanitaire.
De préférence,
Xi représente la séquence (Z)m-[G/S], de préférence la séquence (Z)m-G, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des m occurrences et m est 0 ou un nombre entier entre 1 et 8 ; et/ou
X2 représente la séquence [F/Y] -Z, de préférence la séquence F-Z, où Z est un acide aminé ; et/ou
X4 représente la séquence [S/D/N] -Z-Z, de préférence [S/D] -Z-Z, et de manière plus particulièrement préférée la séquence S -Z-Z, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou
X5 représente la séquence (Z)n-[L/V], de préférence la séquence (Z)n-V, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des n occurrences et n est un nombre entier entre 2 et 4, et/ou
Xe représente la séquence [G/N]-(Z)P, de préférence N-(Z)P, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des p occurrences et p est un nombre entier entre 3 et 5 ; et/ou
X8 représente la séquence Z-[E/Q]-Z-Z-Z-Z-Z-[D/G]-Z (SEQ ID NO : 7), de préférence la séquence Z-E-Z-Z-Z-Z-Z-D-Z (SEQ ID NO : 8), où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou X9 représente la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y.
En particulier
Xi peut représenter la séquence Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9 où
Zi est absent ou est D, de préférence est D,
Z2 est absent ou est F ou I, de préférence est F,
Z3 est absent ou est D, de préférence est D,
Z4 est absent ou est P ou Y, de préférence est P,
Z5 est absent ou est T, N ou H, de préférence est T,
Z6 est absent ou est E, T ou Y, de préférence est E,
Z7 est absent ou est F, L ou I, de préférence est F,
Z8 est absent ou est K, R ou E, de préférence est K, et
Z9 est G ou S, de préférence G ; et/ou
X2 peut représenter la séquence [F/Y]-[P/E/Q/F], de préférence F-P ; et/ou X3 peut représenter la séquence [FK/R]-[E/Y/F]-[I/N/G/F], de préférence I-E-I ; et/ou
X4 peut représenter la séquence [S/D/N]-[K/T/N/R]-[Y/H/V/I], de préférence S-
K-Y ; et/ou
X5 peut représenter la séquence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 où
Z10 est absent ou est E, de préférence est absent,
Zi 1 est absent ou est Y, de préférence est absent,
Z12 est A, N, Y ou H, de préférence est A,
Z13 est V ou K, de préférence V,
Z14 est V ou F, de préférence V ; et/ou
X6 peut représenter la séquence Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20 où
Z15 est N ou G, de préférence N,
Zi6 est absent ou est Y, de préférence est Y,
Z17 est absent ou est T, A, K ou D, de préférence T,
Zi8 est S, I, R ou E, de préférence est S,
Z19 est R, F, D, V, A ou F, de préférence R, et
Z20 est P, H, A ou V, de préférence P ; et/ou
X7 peut représenter Y, I, S ou A, de préférence Y. X8 peut représenter la séquence [ V/I/S |-[ E/Q|-[ A/Y/D |-[ A/H/D/R/K |-[ K/S/ A/R |- [E/M/ Q/L] - [R/E/L/N/K] - [D/ G] -[Q/L/H/M] (SEQ ID NO: 9), de préférence V-E-A-A-K- E-R-D-Q (SEQ ID NO: 10) ; et/ou
X9 peut représenter la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y ; et/ou
X10 peut représenter la séquence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32- Z33-Z34-Z35-Z36 où
Z21 est Y, R, A, Q ou P, de préférence Y,
Z22 est D, T, E ou N, de préférence D,
Z23 est absent ou est G, de préférence est absent,
Z24 est absent ou est G, S, H, Q ou K, de préférence est absent,
Z25 est absent ou est P ou A, de préférence est absent,
Z26 est absent ou est A, E ou S, de préférence est absent,
Z27 est absent ou est M, Q, E ou V, de préférence est absent,
Z28 est absent ou est L, M, E ou V, de préférence est absent,
Z29 est absent ou est M ou L, de préférence est absent,
Z30 est absent ou est H, de préférence est absent,
Z31 est absent ou est N, Q ou D, de préférence est absent,
Z32 est absent ou est F, de préférence est absent,
Z33 est absent ou est L, de préférence est absent,
Z34 est absent ou est T ou S, de préférence est absent,
Z35 est absent ou est S ou N, de préférence est absent,
Z36 est absent ou est P, de préférence est absent.
De manière plus préférée, le peptide est choisi dans le groupe constitué
- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’ acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et
- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence de formule (I) présentant au moins 50%, de préférence au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% ou au moins 99%, d’identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et présentant une activité pesticide, de préférence une activité insecticide.
De manière tout particulièrement préférée, le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, de préférence comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et de manière tout particulièrement préférée comprend, ou consiste en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
Le peptide a de préférence une taille comprise entre 40 et 100 acides aminés, de préférence comprise entre 40 et 70 acides aminés.
Le peptide peut être utilisé comme agent insecticide à l’encontre d’hémiptères, lépidoptères, coléoptères et/ou diptères, de préférence à l’encontre d’hémiptères et plus particulièrement de pucerons, notamment Acyrthosiphon pisum.
La présente invention concerne également une cellule hôte non-humaine comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans ladite cellule.
La cellule peut être une cellule de plante, de préférence une cellule de plante légumineuse ou de plante céréalière, et de manière plus particulièrement préférée une cellule de plante légumineuse choisie dans le groupe constitué du soja, haricot, pois, pois chiche, arachide, lentille, luzerne, fève et caroubier ou une cellule de plante céréalière choisie dans le groupe constitué du blé et du maïs.
La cellule peut également être un microorganisme entomopathogène, de préférence une bactérie ou un champignon entomopathogène.
La présente invention concerne en outre un virus entomopathogène comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans l’insecte infecté par le virus.
La présente invention concerne également une plante transgénique ou structure végétale multicellulaire comprenant au moins une cellule selon l’invention, ainsi qu’un procédé de production d’une telle plante transgénique comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule.
La présente invention concerne par ailleurs une composition phytosanitaire comprenant au moins un peptide tel qu’utilisé selon l’invention ou l’un de ses sels acceptables sur le plan phytosanitaire, une cellule hôte et/ou un virus selon l’invention, et un support et/ou excipient acceptable sur le plan phytosanitaire. La composition peut comprendre en outre un ou plusieurs agents phytosanitaires additionnels, de préférence choisis parmi les insecticides, les bactéricides, les fongiques, les virucides, les régulateurs de croissance ou les stimulateurs des défenses naturelles de la plante.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1 : Séquence du peptide BCR4 avec représentation des ponts disulfure Cl-
C5, C2-C4 et C3-C6.
Figure 2: Spectre ESI-HRMS (A) et chromatogramme HPLC (B) du peptide BCR4 (Temps de rétention 22,5 min).
Figure 3 : Alignement multiple des membres de la famille BCR1-2-4-5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les inventeurs ont identifié une nouvelle famille de peptides insecticides naturels pouvant être utilisés comme alternative aux pesticides chimiques conventionnels.
Ces peptides appartiennent à une nouvelle classe de protéines riches en cystéine appelées « Bactériocyte Cysteine Rich » (BCRs) et récemment identifiée chez le puceron de pois Acyrthosiphon pisum (Shigenobu et al. 2013). Dans cet organisme, les BCRs contiennent de 67 à 108 résidus, avec six ou huit résidus de cystéines et sont au nombre de sept. Elles sont codées par des gènes orphelins et exprimées exclusivement dans les bactériocytes des pucerons. Ces cellules de l'hôte abritent Buchnera aphidicola, la bactérie symbiotique primaire des pucerons. Les séquences de BCRs ne montrent aucune similarité significative avec d'autres protéines d’organismes séquencés et une analyse comparative a confirmé que ces peptides sont limités à la lignée des pucerons.
Dans la présente demande, les inventeurs ont démontré que le peptide BCR4, appartenant à la sous-famille BCR1 -2-4-5, présente une activité insecticide exceptionnelle contre le puceron du pois avec une plage d'activité (5-80 mM) semblable à celle du peptide AG41, un peptide entomotoxique prometteur d’origine végétale (WO2015087238A1). Les peptides de cette famille constituent donc une alternative efficace à l’utilisation de pesticides issus de la chimie de synthèse Selon un premier aspect, la présente invention concerne l’utilisation en tant qu’ agent pesticide, et plus particulièrement en tant qu’ agent insecticide, d’un peptide comprenant, ou consistant en, la séquence de formule (I)
Figure imgf000008_0001
dans laquelle
Xi représente une séquence de 1 à 9 acides aminés,
X2 représente une séquence de 2 acides aminés,
X3 représente une séquence de 3 acides aminés,
X4 représente une séquence de 3 acides aminés,
X5 représente une séquence de 3 à 5 acides aminés,
X6 représente une séquence de 4 à 6 acides aminés,
X7 représente un acide aminé,
Xs représente une séquence de 9 acides aminés,
X9 représente une séquence de 2 acides aminés,
X10 représente une séquence de 2 à 16 acides aminés,
ou d’un sel dudit peptide acceptable sur le plan phytosanitaire.
Dans la formule (I), les traits de liaison entre les différents résidus cystéine représentent les ponts disulfures.
Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d’ acide aminé constituant cette chaîne.
Tel qu’utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N- éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine ou l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T).
Les acides aminés sont ici représentés par leur code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante: A: alanine (Ala); C: cystéine (Cys); D: acide aspartique (Asp); E: acide glutamique (Glu); F: phénylalanine (Phe); G: glycine (Gly); H: histidine (His); I: isoleucine (Ile); K: lysine (Lys); L: leucine (Leu); M: méthionine (Met); N: asparagine (Asn); P: proline (Pro); Q: glutamine (Gln); R: arginine (Arg); S: sérine (Ser); T: thréonine (Thr); V: valine (Val); W: tryptophane (Trp) et Y: tyrosine (Tyr).
Les acides aminés constituant le peptide utilisé selon l'invention peuvent être de configuration L ou D, de préférence de configuration L.
Selon un mode de réalisation,
Xi représente la séquence (Z)m-[G/S], de préférence la séquence (Z)m-G, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des m occurrences et m est 0 ou un nombre entier entre 1 et 8 ; et/ou
X2 représente la séquence [F/Y] -Z, de préférence la séquence F-Z, où Z est un acide aminé ; et/ou
X4 représente la séquence [S/D/N] -Z-Z, de préférence [S/D] -Z-Z, et de manière plus particulièrement préférée la séquence S -Z-Z, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou
X5 représente la séquence (Z)n-[L/V], de préférence la séquence (Z)n-V, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des n occurrences et n est un nombre entier entre 2 et 4, et/ou
X6 représente la séquence [G/N]-(Z)P, de préférence N-(Z)P, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des p occurrences et p est un nombre entier entre 3 et 5 ; et/ou
X8 représente la séquence Z-[E/Q]-Z-Z-Z-Z-Z-[D/G]-Z (SEQ ID NO : 7), de préférence la séquence Z-E-Z-Z-Z-Z-Z-D-Z (SEQ ID NO : 8), où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou
X9 représente la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y. Selon un mode de réalisation particulier, Xi représente la séquence Z1-Z2-Z3-Z4- Z5-Z6-Z7-Z8-Z9 où
Zi est absent ou est D, de préférence est D,
Z2 est absent ou est F ou I, de préférence est F,
Z3 est absent ou est D, de préférence est D,
Z4 est absent ou est P ou Y, de préférence est P,
Z5 est absent ou est T, N ou H, de préférence est T,
Z6 est absent ou est E, T ou Y, de préférence est E,
Z7 est absent ou est F, L ou I, de préférence est F,
Zs est absent ou est K, R ou E, de préférence est K, et
Z9 est G ou S, de préférence G ; et/ou
X2 représente la séquence [F/Y]-[P/E/Q/L], de préférence F-P ; et/ou
X3 représente la séquence [I/K/R]-[E/Y/F]-[I/N/G/L], de préférence I-E-I ; et/ou X4 représente la séquence [S/D/N] -[K/T/N/R]-[Y/H/V/I], de préférence S-K-Y ; et/ou
X5 représente la séquence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 où
Z10 est absent ou est E, de préférence est absent,
Zi 1 est absent ou est Y, de préférence est absent,
Z12 est A, N, Y ou H, de préférence est A,
Z13 est V ou K, de préférence V,
Z14 est V ou L, de préférence V ; et/ou
X6 représente la séquence Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20 où
Z15 est N ou G, de préférence N,
Zi6 est absent ou est Y, de préférence est Y,
Z17 est absent ou est T, A, K ou D, de préférence T,
Zi8 est S, I, R ou E, de préférence est S,
Z19 est R, L, D, V, A ou F, de préférence R, et
Z20 est P, H, A ou V, de préférence P ; et/ou
X7 représente Y, I, S ou A, de préférence Y ; et/ou
X8 représente la séquence [V/FS]-[E/Q]-[A/Y/D]-[A/H/D/R/K]-[K/S/A/R]- [E/M/ Q/L] - [R/E/L/N/K] - [D/ G] -[Q/L/H/M] (SEQ ID NO: 9), de préférence V-E-A-A-K- E-R-D-Q (SEQ ID NO: 10) ; et/ou
X9 représente la séquence [P/A]-[Y/H], de préférence la séquence P- Y ; et/ou Xio représente la séquence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33- Z34-Z35-Z36 où
Z21 est Y, R, A, Q ou P, de préférence Y,
Z22 est D, T, E ou N, de préférence D,
Z23 est absent ou est G, de préférence est absent,
Z24 est absent ou est G, S, H, Q ou K, de préférence est absent,
Z25 est absent ou est P ou A, de préférence est absent,
Z26 est absent ou est A, E ou S, de préférence est absent,
Z27 est absent ou est M, Q, E ou V, de préférence est absent,
Z28 est absent ou est L, M, E ou V, de préférence est absent,
Z29 est absent ou est M ou L, de préférence est absent,
Z30 est absent ou est H, de préférence est absent,
Z31 est absent ou est N, Q ou D, de préférence est absent,
Z32 est absent ou est F, de préférence est absent,
Z33 est absent ou est L, de préférence est absent,
Z34 est absent ou est T ou S, de préférence est absent,
Z35 est absent ou est S ou N, de préférence est absent,
Z36 est absent ou est P, de préférence est absent.
Selon un autre mode de réalisation particulier,
Xi est choisi dans le groupe constitué des séquences G, S, YHYIES (SEQ ID NO : 11), YFES (SEQ ID NO : 12), DFDPTEFKG (SEQ ID NO : 13), DIDPNTLRG (SEQ ID NO : 14) ; et/ou
X2 est choisi dans le groupe constitué des séquences FL, FQ, FE, FP et YP ; et/ou
X3 est choisi dans le groupe constitué des séquences KYL, RYN, RFG, KYN, IEI et KEI ; et/ou
X4 est choisi dans le groupe constitué des séquences DRV, NNI, DNV, DTH, SKY ; et/ou
X5 est choisi dans le groupe constitué des séquences HKL, YKL, NKL, AVV et EYNVV (SEQ ID NO : 15) ; et/ou
Xe est choisi dans le groupe constitué des séquences GDEFV (SEQ ID NO : 16), GSAA (SEQ ID NO : 17), GKRVP (SEQ ID NO : 18), GKIDH (SEQ ID NO : 19), NYTSRP (SEQ ID NO : 20) et GASLP (SEQ ID NO : 21) ; et/ou X7 représente Y, I, S ou A ; et/ou
X8 est choisi dans le groupe constitué des séquences IQYKSLKGL (SEQ ID NO : 22), SQYRSLKGM (SEQ ID NO : 23), VQYDAMNGL (SEQ ID NO : 24), IQYHSMEGL (SEQ ID NO : 25), VEAAKERDQ (SEQ ID NO : 26) et VQDARQLDH (SEQ ID NO : 27) ; et/ou
X9 est choisi dans le groupe constitué des séquences PH, PY et AY ; et/ou
X10 est choisi dans le groupe constitué des séquences PTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO : 28), ANGQAAQVLHNFLSN (SEQ ID NO : 29), QEGHAAEELHQF (SEQ ID NO : 30), RTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO : 31), YD et YDGGPEMLM (SEQ ID NO : 32).
Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences
DFDPTEFKGPFPTIEICSKY C A VV CNYTSRPC Y C VEAAKERDQWFP YC Y
D (SEQ ID NO : 1),
GPFLTKYLCDRVCHKLCGDEFVCSCIQYKSLKGLWFPHCPTGKASVVLH NFLTSP (SEQ ID NO : 2),
YFESPFETKYNCDTHCNKLCGKIDHCSCIQYHSMEGLWFPHCRTGSAAQ MLHDFLSNP (SEQ ID NO : 3),
DIDPNTLRGPYPTKEICSKYCEYNVVCGASLPCICVQDARQLDHWFAYC YDGGPEMLM (SEQ ID NO : 4),
SPFQTRYNCNNICHKLCGSAACACSQYRSLKGMWFPHCANGQAAQVLH NFLSN (SEQ ID NO : 5), et
YHYIESPFETRFGCDNVCYKLCGKRVPCSCVQYDAMNGLWFPHCQEGH
AAEELHQFL (SEQ ID NO : 6),
et des variants fonctionnels de celui-ci.
De préférence, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et des variants fonctionnels de celui-ci.
De manière plus particulièrement préférée, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1, et des variants fonctionnels de celui-ci. Le terme « variant fonctionnel » se réfère à un peptide de formule (I) et dont la séquence diffère de la protéine parente par au moins une substitution, insertion ou délétion mais qui conserve une activité pesticide, de préférence une activité insecticide.
De préférence, les variants fonctionnels présentent au moins 50% d’identité de séquence avec la séquence parente, de manière plus particulièrement préférée au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% d’identité de séquence avec la séquence parente, et de manière tout particulièrement préférée au moins 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité de séquence avec la séquence parente.
Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'Altschul (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. T /homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme « Protein BLAST » (ou Blastp) dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut (Expect threshold : 10, Word size : 6, Matrix = BLOSUM62, Gap Costs : Existence = 11, Extension = 1 , Conditional compositional score matrix adjustment). Selon certains modes de réalisation, les variants fonctionnels peuvent différer de la séquence parente par 1 à 10, i.e. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 à 10, substitutions, insertions et/ou délétions d’acides aminés, de préférence par 1 à 5, i.e. 1, 2, 3, 4 ou 5, substitutions, insertions et/ou délétions d’ acides aminés.
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu’utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d’un résidu d’acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives se font parmi (i) les acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), (ii) les acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), (iii) les acides aminés polaires (glutamine et asparagine ou sérine, thréonine et tyrosine ), (iv) les acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), (v) les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane) et (vi) les petits acides aminés (glycine, alanine). De préférence, la ou les substitutions sont des substitutions conservatives.
Selon un mode de réalisation particulier, le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, de préférence comprend, ou consiste en, une séquence d’ acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et de manière plus particulièrement préférée comprend, ou consiste en, la séquence d’ acides aminés SEQ ID NO : 1.
Le peptide utilisé selon l’invention a de préférence une taille comprise entre 40 et 100 acides aminés, de manière plus particulièrement préférée comprise entre 40 et 80 acides aminés, et de manière encore plus particulièrement préférée comprise entre 40 et 70 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide utilisé selon l’invention a une taille de 50 à 60 acides aminés. Le peptide utilisé selon l’invention peut comprendre la séquence de formule (I) fusionnée à un autre domaine protéique. Ce domaine protéique peut par exemple être une séquence signal ou un tag (ou étiquette).
En particulier, le peptide peut être un précurseur qui subit des modifications post- traductionnelles permettant d’obtenir la forme mature et active du peptide. Il peut ainsi comprendre une séquence signal de translocation et des sites de reconnaissance et/ou de clivage lui permettant de subir ces modifications post-traductionnelles.
Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est un précurseur d’un peptide pesticide ou insecticide mature, ledit précurseur comprenant une séquence signal de translocation en N-terminal. La séquence signal peut notamment être la séquence M- [R/K] -L-L- [ Y/H] -G-F-L-I-I-M-L-T- [M/I] - [ Y/H] -LS - [ V/I] -Q (SEQ ID NO : 33).
Le peptide peut également comprendre, en N-terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l’immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l’homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His6), FLAG, HA (épitope dérivé de l’hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto-oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.
Le peptide utilisé selon l’invention peut présenter une ou plusieurs modifications post-traductionnelles et/ou modifications chimiques en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation et/ou une méthylation.
Afin d’augmenter la résistance du peptide aux peptidases, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N-terminale. Par exemple, le groupement protecteur à l’extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l’extrémité C -terminale peut être une amidation ou une estérification. L’action des protéases peut également être contrecarrée, par exemple, par G utilisation d’acides aminés de configuration D ou de liaisons pseudo peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH, telles que CHOH- CH2, NHCO, CH2-0, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S.
L’invention couvre également G utilisation de sels dudit peptide, de préférence de sels acceptables sur le plan phytosanitaire. Un sel acceptable sur le plan phytosanitaire est un sel qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé, vis-à-vis de la plante, de l’environnement ou de l’homme. Les sels peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable. Selon certains modes de réalisation préférés, le sel est un sulfate d’ammonium. Ces sels sont couramment utilisés et leurs méthodes de préparation sont bien connues de l’homme du métier.
L’invention concerne l’utilisation du peptide tel que décrit ci-dessus en tant qu’ agent pesticide, et plus particulièrement en tant qu’ agent insecticide, de préférence pour des applications phytosanitaires.
Tel qu’utilisé ici, le terme « pesticide » se réfère à un composé destiné à lutter contre des organismes considérés comme nuisibles. Lorsque ces organismes sont des insectes, on parle d’ « insecticide ».
Tel qu’utilisé ici, le terme « application phytosanitaire» se réfère à une action destinée à protéger les végétaux et les produits de culture contre des organismes nuisibles, en particulier des insectes, et/ou à assurer la conservation des produits de culture. On entend par « produits de culture » les produits cueillis ou récoltés, notamment les légumes, les fruits, les fleurs, ou les graines, et les produits transformés qui en sont dérivés, notamment les farines.
De préférence, le peptide est utilisé en tant qu’ agent insecticide dans un traitement phytosanitaire.
L’activité insecticide du peptide peut être aisément testée par l’homme du métier, notamment en observant la survie de larves d’insecte, par exemple de larves de puceron du pois, sur un milieu liquide contenant le peptide à tester. Cette technique de routine est illustrée dans la partie expérimentale de la présente demande. De préférence, un peptide est considéré comme ayant une activité insecticide lorsqu’il présente une TL50 (temps létal où 50% des individus meurent) de moins de 5 jours sur des larves d’insecte, de préférence des larves de puceron du pois, à une concentration de 100 mM, préférence à une concentration de 50mM.
L’activité insecticide du peptide de formule (I) est de préférence à l’encontre d’insectes nuisibles sélectionnés dans le groupe constitué des hémiptères, lépidoptères, coléoptères et diptères.
Des exemples d’hémiptères incluent, sans y être limités, des espèces de pucerons telles qa’Acyrtho siphon pisum, Aphis gossypii, Aulacorthum solani, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae et Rhopalosiphum padi, des espèces de cochenilles telles que Planococcus citri , des espèces d’aleurodes telles que Trialeurodes vaporariorum et Bemisia tabaci, ou des espèces de punaises telles que Lygocoris pabulinus, Liocoris tripustulatus, Lygus rugulipennis et Corythucha ciliata.
Des exemples de lépidoptères incluent, sans y être limités, des espèces de chenilles de plusieurs papillons telles que Chrysodeixis chalcites, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Clepsis speclrana, Cacoecimorpha pronuhana, Duponchelia fovealis, Tuta absoluta, Cydia pomonella, Lobesia botrana et Eupoecillia ambiguella.
Des exemples de coléoptères incluent, sans y être limités, des espèces de charançons telles que Sitophilus spp. et des espèces de taupins telles que Agriotes spp.
Des exemples de diptères incluent, sans y être limités, des espèces de mouches telles que Sciarkhe spp., Musca domestica, Stomoxys calcitrans et Liriomyza spp.
Selon certains modes de réalisation préférés, le peptide est utilisé en tant qu’ agent insecticide à l’encontre d’un ou plusieurs hémiptères, et plus particulièrement d’un ou plusieurs pucerons, notamment Acyrthosiphon pisum.
Le peptide décrit ci-dessus peut être utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres agents actifs. Le ou les agents actifs additionnels peuvent notamment être choisis parmi les autres peptides décrits ci-dessus et de formule (I) et d’autres agents pesticides, insecticides ou phytosanitaires, de préférence avec un ou plusieurs autres agents insecticides.
De préférence, le peptide est utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autres peptides insecticides. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est utilisé en combinaison avec le peptide insecticide AG41 (WO2015087238, tableau II). La présente invention concerne également une cassette d’expression comprenant un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), lié de manière opérationnelle à un promoteur transcriptionnel hétérologue.
Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle du promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de l'expression.
La cassette peut en outre comprendre d’autres éléments régulateurs tels qu’un terminateur de transcription, la séquence d’un peptide de transit et/ou une séquence activatrice dite « enhancer ».
Tel qu’utilisé ici, le terme « promoteur transcriptionnel hétérologue » se réfère à un promoteur qui, dans la nature, n’est pas associé à l’acide nucléique codant pour le peptide. La cassette selon l’invention est donc une cassette recombinante.
Le promoteur transcriptionnel peut être aisément choisi par l’homme du métier selon la nature de la cellule hôte dans laquelle l’expression est envisagée. Ce promoteur peut notamment être un promoteur inductible ou constitutif, procaryote ou eucaryote, systémique ou tissu-spécifique.
De préférence, le promoteur transcriptionnel est un promoteur permettant l’expression du peptide dans une cellule hôte de plante ou d’un microorganisme entomopathogène.
De manière alternative, la cassette est destinée à être insérée dans un vecteur viral et le promoteur transcriptionnel est un promoteur permettant l’expression du peptide dans une cellule hôte infectée par ledit vecteur, de préférence une cellule d’un insecte nuisible.
Les cassettes d’expression selon l'invention peuvent être construites par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne en outre un vecteur d’expression comprenant une cassette d’expression selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l’expression de l’acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) dans ladite cellule. Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double- brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide, un virus, un cosmide et un chromosome artificiel.
L’homme du métier peut aisément choisir le vecteur le plus approprié notamment au regard de la cellule hôte ciblée, du niveau d’expression et de la stabilité recherchés, du mode choisi pour introduire le vecteur dans la cellule hôte, etc.
Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans la cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou à un herbicide, ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Les vecteurs selon l'invention peuvent comprendre, en outre, une origine de réplication et/ou une séquence permettant une insertion ciblée dans le génome de la cellule hôte.
Les vecteurs selon l'invention peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur est un vecteur viral, de préférence un virus entomopathogène. Ainsi, la présente invention concerne un virus entomopathogène comprenant un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’une promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans la cellule hôte infecté par le virus, la cellule hôte étant de préférence une cellule d’insecte.
Le virus entomopathogène peut être choisi parmi les Baculoviridae, les Reoviridae, les Poxviridae, les Iridoviridae, les Parvoviridae, les Picomoviridae, et les Rhabdoviridae.
De préférence, le virus entomopathogène appartient à la famille des Baculoviridae.
Le promoteur transcriptionnel peut être aisément choisi par l’homme du métier selon la cellule cible.
La présente invention concerne également G utilisation d’une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d’épisome ou sous forme chromosomique.
La présente invention concerne une cellule hôte non-humaine comprenant une cassette ou un vecteur d’expression selon l’invention.
Elle concerne également une cellule hôte comprenant un acide nucléique hétérologue (qui n’est pas naturellement présent dans la cellule) codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I). Ledit acide nucléique est de préférence placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans la cellule. Ce promoteur peut être un promoteur endogène (naturellement présent dans la cellule) ou un promoteur hétérologue (qui n’est pas naturellement présent dans la cellule).
La cellule hôte peut être choisie notamment pour agir en tant que vecteur de propagation du peptide de formule (I) ou à des fins de production du peptide.
La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. La cellule hôte peut notamment être une cellule de plante, une cellule animale, une cellule fongique ou une bactérie.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule animale. La cellule animale pour être notamment choisie parmi les cellules de mammifères telles que les cellules COS ou CHO, les cellules d’insectes telles que les cellules Sf9, Sf2l ou Hi5, les cellules de protozoaires ou de nématodes.
Les cellules de protozoaires et de nématodes sont préférentiellement choisies parmi les familles entomopathogènes, en particulier les familles utilisées en lutte biologique telles que par exemple les familles de protozoaires Amoebidae et Nosematidae ou les espèces de nématodes Steinermatidae et Heterorhabditidae.
Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de microorganisme, de préférence une cellule de microorganisme entomopathogène et de manière plus particulièrement préférée une cellule bactérie ou de champignon entomopathogène.
De nombreuses bactéries ont été décrites comme entomopathogènes. En particulier, la bactérie peut être choisie parmi les bactéries des familles Bacillaceae, Enterobacteriaceae et Pseudomonaceae. De préférence, la bactérie est choisie parmi Bacillus thurengiensis et Bacillus sphaericus.
De même, de nombreux champignons ont été décrits comme entomopathogènes. En particulier, le champignon peut être choisi parmi les champignons des genres Beauveria, par exemple Beauvaria bassiana, Metharizium, par exemple Metharizium anisopliae, Verticillium, Erynia, Hirsutella, Entomophtora et Entomophaga.
Selon encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de plante, de préférence une cellule de plante légumineuse ou de plante céréalière.
La cellule de plante peut être une cellule de plante légumineuse choisie dans le groupe constitué du soja, haricot, pois, pois chiche, arachide, lentille, luzerne, fève et caroubier.
La cellule de plante peut également être une cellule de plante céréalière choisie dans le groupe constitué du blé et du maïs.
La cellule de plante peut également être une Nicotianée, par exemple Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tabacum.
Les techniques pour introduire une acide nucléique hétérologue dans ces différents types de cellules (cellule de plante, cellule animale, cellule fongique ou bactérie) sont bien connues de l’homme du métier.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également un organisme multicellulaire transgénique comprenant une cellule hôte selon l’invention, c’est-à-dire une cellule comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), en particulier comprenant une cassette ou un vecteur d’expression selon l’invention.
Selon un mode de réalisation, l’organisme est un protozoaire ou un nématode.
Selon un mode de réalisation préféré, l’organisme est une plante transgénique ou une structure végétale multicellulaire
Tel qu’utilisé ici, le terme « structure végétale multicellulaire» se réfère à des parties de plante telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, du bois, ou des structures multicellulaires telles que des cals, des organes de plante ou des embryons immatures (e.g. explants utilisés pour la trans genèse). La reconstitution d’une plante transgénique ou d’une structure végétale multicellulaire telle que définie ci-dessus à partir d’une cellule de plante transfectée ou transformée fait appel à des techniques de routine bien connues de l’homme du métier.
Le peptide peut être exprimé de manière ubiquitaire (dans tous les tissus de la plante) ou seulement dans certains tissus ou organes, en particulier les tissus ou organes qui sont les cibles de l’organisme nuisible.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
La présente invention concerne également un procédé de production d’une plante transgénique ou d’une structure végétale multicellulaire comprenant une cellule hôte selon l’invention, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), d'une cassette d'expression ou d’un vecteur selon l’invention, et la reconstitution de ladite plante ou structure à partir de ladite cellule.
Optionnellement, le procédé peut également comprendre une étape de sélection des plantes ou structures contenant l’acide nucléique, la cassette ou le vecteur. Cette sélection peut être réalisée par toute méthode connue de l’homme du métier, notamment par des méthodes d’amplification de l’ADN.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant la transformation ou transfection d’une cellule par un acide nucléique codant ledit peptide ou une cassette ou vecteur d’expression selon l’invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du peptide produit par ladite cellule. Les méthodes de production de peptides recombinants sont bien connues de l’homme du métier.
La cellule utilisée pour la production du peptide peut être une cellule procaryote ou eucaryote.
Selon un mode de réalisation particulier, la cellule est une bactérie, en particulier E. coli. De préférence, la bactérie utilisée est capable d’effectuer le repliement oxydatif du peptide, telle que par exemple une souche d’E. coli SHuffle (Lobstein et al. Microbial Cell Factories. 20l2;l l :56).
La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant l’obtention d’une plante transgénique selon l’invention et exprimant le peptide, la culture de cette plante et la récolte du peptide produit par ladite plante.
De préférence, la plante transgénique est une Nicotianée, par exemple Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tabacum.
Les méthodes de production de peptides recombinants à partir de plantes transgéniques sont bien connues de l’homme du métier.
La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant l’insertion d’un acide nucléique codant ledit peptide, d’une cassette ou d’un vecteur d’expression selon l’invention dans un système d’expression in vitro également appelé acellulaire et la récolte du peptide produit par ledit système. De nombreux systèmes d’expression in vitro ou acellulaires sont disponibles dans le commerce et G utilisation de ces systèmes est bien connue de l’homme du métier.
La présente invention concerne également une composition phytosanitaire comprenant au moins un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), une cellule hôte ou un organisme transgénique selon l’invention et/ou un virus selon l’invention, et un excipient acceptable sur le plan phytosanitaire. L’invention concerne en outre G utilisation d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), une cellule hôte ou un organisme transgénique selon l’invention et/ou un virus selon l’invention, pour la préparation d’une composition phytosanitaire.
La composition phytosanitaire peut être de tout type. Il peut s’agir d’une solution aqueuse ou hydro-alcoolique, d’une pâte, d’un gel en particulier un gel aqueux (ou hydrogel), d’une glue, d’une mousse, d’une émulsion eau-dans huile ou huile-dans-l’eau, d’une émulsion multiple, d’une micro- ou nano-émulsion, d’une solution micellaire, d’une suspension, ou d’un colloïde. La composition phytosanitaire peut aussi être solide, par exemple sous forme d’une poudre ou de granulés directement applicables par « poudrage » ou devant être dissous ou dispersés dans un solvant adapté avant application.
On entend par « excipient acceptable sur le plan phytosanitaire » un excipient qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé, vis-à-vis de la plante, de l’environnement et de l’homme. Les excipients utilisables dans les compositions phytosanitaires sont bien connus de l’homme du métier et regroupent, entre autres, les diluants et les charges, les agents mouillants, les tensio-actifs, par exemple les tensio- actifs ioniques, amphotères ou non-ioniques, les agents dispersants, les agents épaississants, les agents gélifiants, des agents permettant une libération contrôlée de l’actifs, par exemple des agents d’encapsulation ou micellaires tels que les phospholipides, les adjuvants thixotropes, les colorants, les agents antioxydants, les agents conservateurs, les agents stabilisants, des agents filmogènes, les véhicules en particulier les solvants comme l’eau et les alcools inférieurs, les huiles d’origine minérale, végétale ou animale, les résines, les cires, le colophane, les latex, les gommes telles que la gomme arabique, les agents anti-mousses, et les agents adhésifs.
La composition phytosanitaire selon l’invention peut comprendre, en outre, un ou plusieurs agents phytosanitaires additionnels. Le ou les agents phytosanitaires additionnels peuvent être choisis par exemple parmi les insecticides, les bactéricides, les fongiques, les virucides, les régulateurs de croissance ou les stimulateurs des défenses naturelles de la plante tels que les éliciteurs.
La forme galénique et les excipients de la composition phytosanitaire selon la présente invention peuvent être aisément choisis par l’homme du métier et dépendent essentiellement de l’infestation à traiter et/ou du mode d’administration.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) ou d’une composition phytosanitaire selon l’invention pour traiter ou prévenir l’infestation d’une plante et/ou d’un produit de culture par des organismes nuisibles, de préférence par des insectes, le procédé comprenant la mise en contact du peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) avec ladite plante, produit de culture ou organisme nuisible
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLES
Matériel et méthodes Synthèse et purification du peptide BCR4
Dix milligrammes de peptide brut réduit BCR4 (DFDPTEFKGPFPTIEICSKY C A VV CNYTSRPC Y C VEAAKERDQWFPY C YD ;
SEQ ID NO : 1) non fonctionnel ont été obtenus auprès de la société Proteogenix (Strasbourg, France). Le repliement oxydatif du peptide in vitro a été réalisé en suivant le protocole précédemment décrit (cf. Da Silva et al, 2009). Brièvement, le repliement oxydatif a été effectué en incubant le peptide réduit (10 mg) dans un tampon désoxygéné contenant 0,1 mM de glutathion oxydé (10 équiv.), 1 mM de glutathion (100 équiv.), 1 mM d'EDTA, TRIS 100 mM, pH 8,5, à 20°C, pendant 48 h sous atmosphère d'argon (concentration finale du peptide 30 mM). La réaction a été acidifiée en ajoutant du TFA (200 mΐ) et le mélange brut a été purifié par HPLC semi-préparative pour donner du BCR4 pur (2,2 mg soit 22% de rendement). La pureté du peptide BCR4 a été évaluée par RP- HPLC, sa masse a été obtenue par spectrométrie de masse haute résolution (ESI-HRMS). La concentration du peptide a été déterminée en mesurant sa surface de pic RP-HPLC à 214 nm. Tests insecticides
Les expérimentations ont été réalisées sur des pucerons provenant du clone parthénogénétique du puceron du pois LL01 qui contient uniquement le symbiote primaire B. aphidicola. Les pucerons sont élevés et maintenus sur des plants de fèves (Vicia faba L., variété Aquadulce) sous conditions climatiques contrôlées (température de 21 +/- l°C, humidité relative de 70%, photopériode de l6h), afin d’obtenir des pucerons se reproduisant uniquement par parthénogénèse vivipare. Pour réduire la variabilité liée à T utilisation d’individus à différents stades de développement, les pucerons sont issus d’un élevage synchronisé. Pour cela, des pucerons adultes et prêts à pondre sont déposés sur des plants de fèves. Après 24 heures, les jeunes larves sont récupérées et déposées sur du milieu artificiel contenant ou non le peptide d’intérêt. La manipulation s’effectue avec un témoin négatif composé seulement de milieu artificiel et un témoin positif représentant une des concentrations de la gamme étudiée avec des pucerons. La gamme étudiée comprend différents milieux contenant le peptide BCR4 étudié à plusieurs concentrations variant de 5 à 80 mM. Les expériences ont été réalisées sur trente larves par condition répartis en trois groupes distincts de dix individus.
Analyses statistiques
Toutes les données sur la mortalité des pucerons ont été analysées statistiquement par un traitement de survie standard. Toutes les concentrations de BCR4 ont été analysées séparément dans une analyse de survie paramétrique avec un ajustement logarithmique normal.
Analyses de séquences
Les séquences orthologues des protéines BCR ont été récupérées en utilisant une combinaison de TBLASTN et BLASTP (Johnson et al, 2008) contre les génomes des pucerons disponibles dans la base de données AphidBase (Legeai et al, 2010) et les bases de données entières de protéines, nucléotides et EST non redondantes du NCBI. Les protéines BCR ont été soumises à de multiples alignements de séquences en utilisant le programme MUSCLE (Edgar et al, 2004).
Résultats
Synthèse et purification du peptide BCR4
2,2 mg de peptide pur de BCR4 ont été obtenu par une synthèse chimique en phase solide suivie d’un repliement oxydatif permettant de mettre en place les ponts disulfures C1-C5, C2-C4 et C3-C6 (Figure 1).
La pureté du peptide BCR4 a été évaluée par RP-HPLC et sa masse a été obtenue par spectrométrie de masse haute résolution (ESI-HRMS) : la masse théorique calculée de BCR4 est de 5891.5400 g.mol-l, masse expérimentale obtenue est de 5891.5437 g.mol-l (Figure 2A). La concentration du peptide a été déterminée en mesurant sa surface de pic RP-HPLC à 214 nm (Figure 2B).
Tests insecticides
La mesure de l’activité insecticide de BCR4 a été réalisée en incorporant des doses croissantes de peptides dans le milieu nutritif des pucerons et le suivi de leur mortalité a été effectué sur 7 jours. Un effet très significatif de dose réponse sur le temps de survie des pucerons a été observée (TL50 : Temps létal où 50 % des individus meurent) (Tableau 1). Tableau 1 : Toxicité du peptide BCR4 sur le puceron du pois Acyrthosiphon visum. TL50 en jours, avec des intervalles de confiance, obtenus par analyse de survie avec un ajustement logarithmique normal.
Concentration (mM)
Figure imgf000027_0001
TL50 1.16 1.76 1 .94: 3.24 3.48 1 J .3 > 20
(joui·*) (0.98 - 1.37) [1 27 - 2 42] [1 .47 - 2.57] [2 22 - 4.72] [2.28 - 5.31 (4 16 - 30.81
L’effet dose réponse commence très tôt, dès le premier jour après ingestion, avec une mortalité élevée. Cette plage d'activité (5-80 mM) est semblable à celle du peptide AG41, un peptide entomotoxique prometteur d’origine végétale (cf. WO2015087238).
Analyses de séquences
Grâce à une recherche exhaustive des bases de données nucléotidiques et protéiques du NCBI couplée à une inspection spécifique des espèces de pucerons séquencées disponibles dans AphidBase (Legeai et al, 2010), les inventeurs ont récupéré un total de 32 séquences de BCR. Toutes ces séquences ont été identifiées chez des espèces de pucerons. Les 32 séquences de BCR ont été utilisées pour l'alignement des séquences d'acides aminés et, d’après les motifs consensus obtenus à la suite de ces alignements, il apparaît que les séquences BCR peuvent être regroupées en quatre sous- familles comprenant les séquences (i) BCR1-2-4-5, (ii) BCR3, (iii) BCR6 et (iv) BCR8 (Tableau 2). Tableau 2 : Caractéristiques des quatre sous-familles de BCR.
Orthoiogucs identifies che*
Nombre tk*
Motif consensus“ les pucerons dont le génome résidus cystéine
est séi uence
BCR1-2-4-5 6 C (3) C (3-5) C (4-6) C ( I ) C (13) C Apis (4), Dnox ( 1 )
Agly (1 ), Apis ( 1 ), Dnox (2),
BCR3 6 C (3) C (6) C (21 -25) C (6) C (4) C
Mcer ( I ). Mper ( 1 ), Rpad ( ! ) Apis ( 1), Dnox (2 ), Mcer (1 ),
BCR6 8 C ( 15) C (3) C (3) C (10) C (10) C ( l) CC
Mper (1 )
Agly ( 1 ), Apis ( 1 ), Dnox ( 1 ),
BCR8 6 C (3-4) C (10) C ( 1 7) C ( f ) CC
Mcer (1), Mper ( 1). Rp3d il) a : Le nombre de résidus entre les cystéines sont notés entre parenthèses
b : Abréviations: Agly, Aphis glycines, Apis, Acyrthosiphon pisum, Dnox, Diuraphis noxia, Mcer, Myzus cerasi, Mper, Myzus persicae, Rpad, Rhopalosiphum padi.
Les peptides BCR1 (SEQ ID NO : 2), BCR2 (SEQ ID NO : 3), BCR4 (SEQ ID NO : 1) et BCR5 (SEQ ID NO : 4) à’ Acyrthosiphon pisum, ainsi que deux peptides <X Acyrtho siphon kondoi (SEQ ID NO : 6) et de Diuraphis noxia (SEQ ID NO : 5), appartiennent à la sous-famille BCR1-2-4-5 qui présente un motif consensus strictement conservé (Figure 3).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Johnson M et al, 2008. NCBI BLAST: a better web interface. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 2008 Jul l ;36(Web Server issue):W5-9.
Legeai F et al, 2010. AphidBase: a centralized bioinformatic resource for annotation of the pea aphid genome. Insect Mol. Biol. 19, 5-12.
Shigenobu and Stern. Proc. R. Soc. B. 2013 280, 20121952.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation en tant qu’agent insecticide d’un peptide choisi dans le groupe constitué
- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et
- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence de formule (I), présentant au moins 80% d’identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et présentant une activité insecticide, ladite la séquence de formule (I) étant
Figure imgf000029_0001
dans laquelle
Xi représente une séquence de 1 à 9 acides aminés,
X2 représente une séquence de 2 acides aminés,
X3 représente une séquence de 3 acides aminés,
X4 représente une séquence de 3 acides aminés,
X5 représente une séquence de 3 à 5 acides aminés,
Xe représente une séquence de 4 et 6 acides aminés,
X7 représente un acide aminé,
X8 représente une séquence de 9 acides aminés,
X9 représente une séquence de 2 acides aminés,
X10 représente une séquence de 2 à 16 acides aminés,
ou d’un sel dudit peptide acceptable sur le plan phytosanitaire.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6.
3. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4.
4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le peptide comprend, ou consiste en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le peptide a une taille comprise entre 40 et 100 acides aminés.
6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le peptide a une taille comprise entre 40 et 70 acides aminés.
7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le peptide est utilisé comme agent insecticide à l’encontre d’hémiptères, lépidoptères, coléoptères et/ou diptères.
8. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le peptide est utilisé comme agent insecticide à l’encontre d’hémiptères.
9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le peptide est utilisé comme agent insecticide à l’encontre de pucerons, de préférence à’ Acyrthosiphon pisum.
10. Cellule hôte non-humaine comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans ladite cellule.
11. Cellule hôte selon la revendication 10, dans laquelle la cellule est une cellule de plante, de préférence une cellule de plante légumineuse ou de plante céréalière, et de manière plus particulièrement préférée une cellule de plante légumineuse choisie dans le groupe constitué du soja, haricot, pois, pois chiche, arachide, lentille, luzerne, fève et caroubier ou une cellule de plante céréalière choisie dans le groupe constitué du blé et du maïs.
12. Plante transgénique ou structure végétale multicellulaire comprenant au moins une cellule selon la revendication 10 ou 11.
13. Procédé de production d’une plante transgénique selon la revendication 12, comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule.
14. Cellule hôte selon la revendication 10, dans laquelle la cellule est un microorganisme entomopathogène, de préférence une bactérie ou un champignon entomopathogène.
15. Virus entomopathogène comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans l’insecte infecté par le virus.
16. Composition phytosanitaire comprenant au moins un peptide tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 9 ou l’un de ses sels acceptables sur le plan phytosanitaire, une cellule hôte telle que définie dans l’une quelconque des revendications 10, 11 et 14, et/ou un virus selon la revendication 15, et un support et/ou excipient acceptable sur le plan phytosanitaire.
17. Composition phytosanitaire selon la revendication 16, comprenant en outre un ou plusieurs agents phytosanitaires additionnels, de préférence choisis parmi les insecticides, les bactéricides, les fongiques, les virucides, les régulateurs de croissance ou les stimulateurs des défenses naturelles de la plante.
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