WO2020004802A1 - 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 방법에 의한 인간백혈구항원 형별 검사에서 인간백혈구항원의 최종 형별 판정 방법 - Google Patents

서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 방법에 의한 인간백혈구항원 형별 검사에서 인간백혈구항원의 최종 형별 판정 방법 Download PDF

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    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an analytical method capable of quickly and accurately determining the final typing of human leukocyte antigen in human leukocyte antigen typing by using a sequence-specific oligonucleotide probe.
  • HLA Human Leukocyte Antigen
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • HLA types of patients and donors must be consistent. If the HLA is inconsistent, the transplanted hematopoietic stem cells are considered foreign to the patient, resulting in a rejection that is attacked, or conversely, a graft-versus-host disease in which the donor's T-lymphocytes treat the patient as foreign and attacks the patient Symptoms such as skin disease, diarrhea and liver dysfunction can be caused and, in severe cases, can lead to death. In both cases, HLA typing is an essential test before organ and hematopoietic stem cell transplantation.
  • Sequence specific oligonucleotide probe (SSOP) method used for medium resolution analysis is a method of determining the result based on the hybridization reaction with the probe fixed to the strip after PCR amplification.
  • the SSOP method has the advantage of being slightly readable due to less ambiguity due to cross reactions and weak reactivity, which are commonly found in serological tests, and the ability to simultaneously process a large amount of samples.
  • the most suitable allele pair is compared by comparing the 'probe probe pattern' of the candidate allele pairs with the 'measured probe pattern', which is a combination of approximately 100 SSO probes and the subject's HLA gene PCR product. Since it is selected, it takes a long time to make the final determination of HLA type. Therefore, it is necessary to use a fast and accurate data analysis method for final HLA classification in HLA classification by SSOP method.
  • One aspect of the present invention provides a method for determining human leukocyte antigen (HLA) type of an individual comprising the following steps: (a) Hybridizing an HLA allele amplification product and a sequence-specific oligonucleotide probe of an individual To obtain a measurement probe pattern; (b) grouping alleles having the same predictive probe pattern among the HLA alleles into one allele group; (c) removing, from the candidate list, allele groups that violate probes that have a definite negative response (eg, percent deviation less than -60%) in the grouped candidate allele group list; (d) combining the remaining two HLA allele groups to form allele pairs, and in this list of candidate allele pairs, allele pairs that violate the probe with a positive positive response (e.g., a percentage deviation of at least + 60%); Removing from the candidate list; And (e) comparing the predicted probe pattern of the individual allele pair remaining in the candidate allele pair list with the measurement probe pattern of the subject to score a match, and
  • the method may be to remove from the list of candidate alleles alleles in which (c) the percentage deviation violates the probe belonging to the lower third.
  • the method may be to remove from the list of candidate allele pairs alleles in which (d) the percentage deviation violates the probe belonging to the upper half.
  • Filtering and Scoring (FnS) method (HLA type determination algorithm) according to an embodiment of the present invention can determine the final human leukocyte antigen type of the individual quickly and accurately regardless of race, HLA type
  • the FnS method can be applied to analysis software provided with commercial test kits for testing.
  • Figure 3 shows an example of determining the HLA-B type of the individual by using a filtering and scoring (FnS) method.
  • FnS filtering and scoring
  • Figure 4 shows the result of comparing the time to analyze the HLA type using the EPM (exact pattern matching) and FnS (Filtering and Scoring) method.
  • an aspect of the present invention provides a “Filtering and Scoring (FnS)", which is a method for screening a human leukocyte antigen (HLA) type of individual comprising the following steps:
  • HLA human leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA gene the product of which is called HLA.
  • HLA is expressed on the surface of all tissue cells in the human body and is also expressed on blood cells such as white blood cells and platelets.
  • HLA is known to be involved in self and non-self cognition, immune responses to antigenic stimulation, regulation of cellular and humoral immunity and susceptibility to disease.
  • HLA genes are classified into classes I, II, and III according to the structure and function of antigens, of which class I includes genes such as HLA-A, B, and C, and class II contains HLA-DR, DQ, and DP genes. Included.
  • class I includes genes such as HLA-A, B, and C
  • class II contains HLA-DR, DQ, and DP genes. Included.
  • Each loci of HLA has a large number of alleles, indicating the most severe polymorphism of human genes. Since the HLA genes are present in close proximity to each other on chromosome 6, they are inherited in a cluster when inherited from parent to child, and the combination of these alleles is called HLA haplotype.
  • the HLA allele amplification product in (a) may be produced by a polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, PCR) known in the art.
  • amplifying the HLA allele and hybridizing with the probe may use a commercially available HLA typing kit.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid sequence that exhibits specificity for human HLA gene sequence. According to one embodiment of the present invention, the probe may use Lifecodes HLA-SSO typing kits (Immucor, USA).
  • the term 'probe hybridization pattern' refers to a pattern obtained by allocating positive / negative patterns according to hybridization of HLA alleles amplified in an individual's blood and individual probes, and measuring probes Also called patterns or complete reaction patterns for all probes (CRPoAPs).
  • the term 'predictive probe pattern' is a pattern that combines the positive / negative status of known individual probes (approximately 100) for individual or two allele pairs, and provides information about the HLA kit manufacturer. .
  • the HLA type determination method comprises a probe (e.g., a probe or percent deviation of less than -60% or less) Alleles that violate the probe belonging to 3) can be removed from the candidate list.
  • a probe e.g., a probe or percent deviation of less than -60% or less
  • the HLA type determination method is a probe (e.g., a probe with a percent deviation of at least + 60% or a percent deviation of at least one of which is considered a positive positive (absolute positive) in (c)). And removing the allele pair that violates the probe belonging to 2) from the candidate list.
  • a probe e.g., a probe with a percent deviation of at least + 60% or a percent deviation of at least one of which is considered a positive positive (absolute positive) in (c)).
  • the term 'percent deviation' is a measure of probe response, which assigns positive numbers for positive and negative values for individual probes. The percent deviation is expressed as a percentage after subtracting the cutoff value from the corrected median fluorescent intensity (MFI) value divided by the cutoff value (Equation 2).
  • the calibrated MFI value of each probe can be calculated by dividing the original MFI value by subtracting the control blandk for probe MFI value from the consensus MFI value by subtracting the MFI value of the control blank for consensus. have.
  • HLA typing human leukocyte antigen typing, histocompatibility testing; 119 HLA-A, 124 HLA-B, 130 HLA-DR and HLA-DQ) for 152 patients who needed a kidney transplant at Kyungpook National University Hospital. 134) test results were used. HLA typing results were anonymously assigned a new serial number.
  • Hybridization reaction was carried out by mixing 15 ⁇ l of the probe mix and 5 ⁇ l of the PCR product, for 5 minutes at 97 ° C, 30 minutes at 47 ° C, and 10 minutes at 56 ° C. 170 ⁇ l of the streptavidin-phycoerythrin solution diluted 1: 200 with the hybrid reactant was mixed and analyzed within 30 minutes using a Luminex 200 system (Luminex Corp.).
  • the complete reaction pattern (CRO) of the probe is constructed from positive / negative based on probes at the HLA-A, -B, -DR and -DQB1 loci, and complete reaction pattern for all probes (CRPoAPs). Is also called a probe hit pattern, a measurement probe pattern.
  • Figure 1 shows the results of identifying CRPoAPs using Lifecodes HLA-B typing kits in the subject to determine the HLA type.
  • FIG. 1A shows the results of an allele and probe hit showing a portion of the expected CRPoAP of a homozygous allele pair.
  • 1B is the Match It! The relationship between the CRPoAP calibration value and the probe name of the sample analyzed by DNA software is shown in FIG. 1B: green graph means negative probe, red graph means positive probe, grid graph means probe and black adjusted with positive probe Dots represent cutoff values for each probe.
  • the CRPoAPs of the samples were compared with the expected CRPoAPs of allele pairs.
  • the allele pair is a combination of all alleles or common well-documented alleles based on the IPDIMGT / HLA sequence database release 3.11.0.
  • probes suspected of showing false positive / negative reactions were changed before comparing the two patterns. For certain probes, the lower the absolute percentage deviation, the higher the probability of causing a false response.
  • a dedicated software program based on the FnS method was written in Visual Basic version 6.0 (Microsoft Co.).
  • the software uses Farpoint Spread version 3.0 (GrapeCity, Sendai, Japan) as a spreadsheet and grid component, and built a Korean HLA database in Access (Microsoft Co.).
  • the probes with absolute positive and absolute negative responses were defined as probes with absolute percent deviations of 60% or greater in the measurement results for the samples: absolute positive probes> + 60% and absolute negative probes ⁇ -60%.
  • Partial reaction pattern with only definite probes PRPwoDP was defined as a pattern consisting of the following probes: positive PRPwoDP consisting of absolute positive probes and negative PRPwoDP consisting of absolute negative probes.
  • the standard method of finding the best-fit allele for the sample CRPoAP of Korean subjects is as follows: (1) The second or third of alleles is based on the presence or absence of alleles previously identified in Korean individuals; Filter by resolution level; (2) filter out individual alleles based on negative PRPwoDP: for probes belonging to the negative PRPwoDP, if the predictive response of one candidate allele is positive, then remove the allele from the candidate allele list; (3) combine the two remaining alleles to obtain a list of allele pairs; (4) allele pairs are filtered based on positive PRPwoDP: for probes belonging to the positive PRPwoDP, if the predictive response of one candidate allele pair is negative, remove the allele pair from the list of candidate allele pairs; (5) A mismatch score is obtained by comparing the raw sample CRPoAP obtained from the subject with the expected CRPoAP of the individual allele pair remaining in the candidate allele pair list.
  • mismatch score consists of the sum of the number of mismatch probes and the percent deviation ( ⁇ % deviation), and the sum of the percent deviations is calculated according to the following equation:
  • FIG. 2 shows an example of typing HLA-B type using an alternative method (filtering and scoring method).
  • An allele indicated in yellow in FIG. 2 means a CWD allele.
  • Table 1 below compares the standard and alternative methods for typing HLA types.
  • the time required for data analysis was compared between Match It! DNA (EPM) and FnS software, and the analysis time was defined as the time (minutes: seconds) from the click for sample analysis to the final typing decision.
  • the average analysis time (minutes: seconds) for the FnS method is shown as 00:21 (00: 08-01: 47), which is 01:04 (00: 15-) of the standard analysis method EPM method. 23:45) was found to be shorter ( P ⁇ 0.05).
  • EPM 00:35 (00: 15-02: 31) 01:06 (00: 15-04: 23) 01:54 (00: 36-05: 06) 02:54 (00: 35-05: 29) 03:39 (00: 32-08: 39) 11:02 (01: 36-23: 45) 17:00 15:00 01:04 (00: 15-23: 45)
  • FnS 00:19 (00: 08-01: 01) 00:23 (00: 11-01: 08) 00:27 (00: 09-01: 34) 00:36 (00: 11-01: 47) 00:41 (00: 25-01: 30) 00:35 (00: 17-00: 52) 00:38 00:43 00:21 (00: 08-01: 47)
  • the FnS method for typing HLA types could increase the accuracy of the analysis while reducing the analysis time.
  • the FnS method can type HLA typing of individuals regardless of race.

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Abstract

본 발명은 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 인간백혈구항원(Human Leukocyte Antigen, HLA) 형별 검사에서 인간백혈구항원의 최종 형별을 신속, 정확하게 판정할 수 있는 분석 방법인 필터링 및 스코어링(Filtering and Scoring, FnS)에 관한 것으로, 상기 방법을 이용하면 피검자의 인종과 무관하게 신속 정확한 HLA 형별판정이 가능하다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 17.05.2019]　서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 방법에 의한 인간백혈구항원 형별 검사에서 인간백혈구항원의 최종 형별 판정 방법
본 발명은 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브(sequence-specific oligonucleotide probe)를 이용한 인간백혈구항원(Human Leukocyte Antigen) 형별 검사에서 인간백혈구항원의 최종 형별을 신속, 정확하게 판정할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다.
사람의 주조직적합성항원 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC)의 일종인 인간백혈구항원(Human Leukocyte Antigen, HLA)은 조혈모세포(골수) 및 장기 등의 이식에서 거부 반응을 일으키는 주요 인자를 생성하는 면역 반응 조절 유전자이다. 타인의 골수 세포나 바이러스 등 외래 물질이 신체에 들어올 경우 사람의 신체는 자신을 보호하기 위하여 이를 제거하기 위한 행동을 취하게 되며, 이때, 그 물질이 자기 자신과 같은 것인지 여부의 판단에서 중요한 역할을 하는 것이 HLA이다.
골수나 장기 이식 성공률을 높이기 위해서는 환자와 공여자의 HLA 형별이 일치되어야 한다. 만약 HLA가 불일치할 경우 이식된 조혈모세포가 환자로부터 이물질로 간주되어 공격을 당하는 거부 반응이 일어나거나 또는 반대로 공여자의 T-림프구가 환자를 이물질로 간주하고 환자를 공격하는 이식편대숙주 질환이 발생하여 피부 질환, 설사, 간 기능 이상 등의 증상이 유발되고 심할 경우는 사망을 초래할 수 있다. 두 경우 모두 조혈모세포나 장기 이식을 실패로 만드는 요인이기 때문에 HLA 형별 검사는 장기 및 조혈모세포 이식 전 필수적인 검사로 시행되고 있다.
현재 시행되고 있는 HLA 검사 방법으로는 검사의 해상도(resolution)에 따라 저해상도(low resolution), 중해상도(middle/intermediate resolution), 고해상도(high resolution)로 분류된다. 저해상도 분석인 혈청학적 방법은 고도의 숙련된 기술과 경험이 요구되며, DNA 검사법들과 비교하여 불일치하는 결과가 보고되면서, 점차 소규모 검사실에서도 쉽게 수행할 수 있는 DNA 검사법이 기존의 혈청학적 검사 방법을 급속히 대체하고 있다.
중해상도 분석을 위해 이용되는 SSOP(sequence specific oligonucleotide probe) 방법은 PCR 증폭 후에 스트립에 고정된 프로브와의 혼성화 반응 양상을 토대로 결과를 판정하는 방법이다. SSOP 방법은 혈청학적 검사법에서 흔히 보이는 교차 반응 및 약한 반응성 등으로 인해 모호한 결과가 보이는 현상이 적어 판독이 다소 용이하다는 점과 많은 양의 검체를 동시에 처리할 수 있는 장점이 있다. 그러나 약 100개의 SSO 프로브와 피검자의 HLA 유전자 PCR 산물의 혼성화 여부에 따라 양성/음성을 할당하여 종합한 '측정 프로브 패턴'과 후보 대립유전자쌍들의 '예측 프로브 패턴'을 비교하여 가장 적합한 대립유전자쌍을 선택하므로 HLA 형별을 최종 판정하기까지 많은 시간이 소요된다. 따라서, SSOP 방법에 의한 HLA 형별검사에서 최종 HLA 형별판정을 위한 신속하고 정확한 데이터 분석 방법을 사용하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 인간백혈구항원 형별 검사에서 인간백혈구항원의 형별을 최종 판정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 하기 단계를 포함하는 개체의 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) 형별 판정 방법을 제공한다: (a) 개체의 HLA 대립유전자 증폭 산물과 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시켜 측정 프로브 패턴을 얻는 단계; (b) HLA 대립유전자들 중에서 동일한 예측 프로브 패턴을 나타내는 것끼리 하나의 대립유전자군으로 그룹핑하는 단계; (c) 그룹핑한 후보 대립유전자군 리스트에서 확실한 음성 반응(예: 퍼센트편차(percent deviation)가 -60% 이하)인 프로브에 위배되는 대립유전자군을 후보 리스트에서 제거하는 단계; (d) 남아 있는 HLA 대립유전자군을 두 개씩 조합하여 대립유전자쌍을 만들고, 이 후보 대립유전자쌍 리스트에서 확실한 양성 반응(예: 퍼센트편차가 +60% 이상)인 프로브에 위배되는 대립유전자쌍을 후보 리스트에서 제거하는 단계; 및 (e) 후보 대립유전자쌍 리스트에 남아 있는 개별 대립유전자쌍의 예측 프로브 패턴과 피검자의 측정 프로브 패턴을 비교하여 일치 여부를 점수화하고, 최소 불일치를 보이는 대립유전자쌍을 피검자의 HLA 형별로 최종 선정하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 (c)에서 퍼센트편차가 하위 1/3에 속하는 프로브에 위배되는 대립유전자를 후보 대립유전자군 리스트에서 제거하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 (d)에서 퍼센트편차가 상위 1/2에 속하는 프로브에 위배되는 대립유전자를 후보 대립유전자쌍 리스트에서 제거하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 필터링 및 스코어링 (Filtering and Scoring, FnS) 방법(HLA 형별 판정 알고리즘)을 사용하면 인종과 무관하게 신속하고 정확하게 개체의 최종 인간백혈구항원 형별을 판정할 수 있으며, HLA 형별검사를 위한 상업용 검사키트와 함께 제공되는 분석 소프트웨어에 본 FnS 방법을 적용할 수 있다.
도 1 및 도 2는 한 피검자의 HLA 형별검사에서 Lifecodes HLA-B typing kits를 이용하여 CRPoAPs(complete reaction pattern for all probes)를 얻은 결과를 나타낸다.
도 3은 필터링 및 스코어링(Filtering and Scoring, FnS) 방법을 이용하여 개체의 HLA-B 형별을 판정하는 일 예를 나타낸다.
도 4는 EPM (exact pattern matching) 및 FnS (Filtering and Scoring) 방법을 이용하여 HLA 형별을 분석하는 시간을 비교한 결과를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 하기 단계를 포함하는 개체의 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) 형별판정 방법인 "필터링 및 스코어링(Filtering and Scoring, FnS)"을 제공한다:
(a) 개체의 HLA 대립유전자 증폭 산물과 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시켜 측정 프로브 패턴을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자를 동일한 예측 프로브 패턴을 나타내는 대립유전자끼리 하나의 대립유전자군으로 그룹핑하는 단계;
(c) 그룹핑한 후보 대립유전자군 리스트에서 확실한 음성반응(예: 퍼센트편차(percent deviation)가 -60% 이하)인 프로브에 위배되는 대립유전자군을 제거하는 단계;
(d) 남아 있는 HLA 대립유전자군을 두 개씩 조합하여 대립유전자쌍을 만들고, 이렇게 만든 후보 대립유전자쌍 리스트에서 확실한 양성반응(예: 퍼센트편차가 +60% 이상)인 프로브에 위배되는 대립유전자쌍을 제거하는 단계; 및
(e) 후보 리스트에 남아 있는 개별 대립유전자쌍의 예측 프로브 패턴과 피검자의 측정 프로브 패턴을 비교하여 일치 여부를 점수화하고, 최소 불일치를 보이는 대립유전자쌍을 피검자의 HLA 형별로 최종 선정하는 단계.
본 명세서에 사용된 용어, '인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA)'은 주조직적합성복합체(major histocompatibility complex, MHC) 유전자에 의해 생성되는 당단백 분자로서, 모든 척추동물에 존재하며 사람의 MHC 유전자를 HLA 유전자, 이의 산물을 HLA라고 한다. HLA는 인체 내 모든 조직세포의 표면에 발현되며 백혈구, 혈소판 등 혈액세포에서도 발현된다. HLA는 자기(self) 및 비자기(non-self)의 인지, 항원 자극에 대한 면역반응, 세포성 면역과 체액성 면역의 조절 및 질병에 대한 감수성에 관여하는 것으로 알려져 있다.
HLA 유전자는 항원의 구조와 기능에 따라 클래스 I, II, III로 분류되며, 이중 클래스 I에는 HLA-A, B, C 등의 유전자가 포함되고, 클래스 II에는 HLA-DR, DQ, DP 유전자가 포함된다. HLA의 각 유전자좌(loci)에는 다수의 대립유전자(allele)가 존재하므로 사람이 가진 유전자중 가장 심한 다형성을 나타낸다. 상기 HLA 유전자들은 6번 염색체 위에 서로 근접해서 존재하므로 부모에서 자식으로 유전될 때 하나의 덩어리로 묶여서 유전되며, 이러한 대립유전자들의 조합을 HLA 일배체형(haplotype)이라고 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (a)에서 HLA 대립유전자 증폭 산물은 당업계에 알려진 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의하여 생성될 수 있다. 또한, HLA 대립유전자를 증폭하여 프로브와 혼성화시키는 것은 상업적으로 판매되는 HLA 형별검사 키트를 이용할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '프로브(probe)'는 인간의 HLA 유전자 서열에 특이성을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 Lifecodes HLA-SSO typing kits(Immucor, 미국)를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '프로브 혼성화 패턴(probe hybridization pattern)'은 개체의 혈액에서 증폭한 HLA 대립유전자와 개별 프로브의 혼성화 여부에 따라 양성/음성을 할당하여 종합한 패턴을 의미하며, 측정 프로브 패턴 또는 CRPoAPs(complete reaction pattern for all probes)라고도 불리운다.
본 명세서에 사용된 용어, '예측 프로브 패턴'은 개별 혹은 두 대립유전자쌍에 대하여 알려진 개별 프로브(약 100개)의 양성/음성 여부를 종합한 패턴으로, HLA 키트 제조원에서 이에 대한 정보를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 HLA 형별 판정 방법은 (b)에서 확실한 음성 반응(절대 음성)으로 간주되는 프로브(예를 들어, 퍼센트편차가 -60% 이하인 프로브 또는 퍼센트편차가 하위 1/3에 속하는 프로브)에 위배되는 대립유전자를 후보 리스트에서 제거할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 HLA 형별 판정 방법은 (c)에서 확실한 양성 반응(절대 양성)으로 간주되는 프로브(예를 들어, 퍼센트편차가 +60% 이상인 프로브 또는 퍼센트편차가 상위 1/2에 속하는 프로브)에 위배되는 대립유전자쌍을 후보 리스트에서 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '퍼센트편차(percent deviation)'는 프로브 반응에 대한 측정치로서, 개별 프로브에 대하여 이 수치가 양수이면 양성, 음수이면 음성을 할당한다. 퍼센트편차는 보정된 MFI(median fluorescent intensity, 중간 형광 강도) 수치에서 컷오프 수치를 빼고, 이 값을 컷오프 수치로 나눈 후 백분율로 나타낸다(수학식 2).
각 프로브의 보정된 MFI 수치는 원본 MFI 수치에서 대조군(control blandk for probe)의 MFI 수치를 뺀 값을 컨센서스 프로브의 MFI 수치에서 대조군(control blank for consensus)의 MFI 수치를 뺀 값으로 나누어 산출할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. HLA 타이핑 대상
경북대학교 병원에 내원한 신장 이식이 필요한 152명의 환자에 대한 507건의 HLA 타이핑(human leukocyte antigen typing, 조직적합성 검사; HLA-A 119건, HLA-B 124건, HLA-DR 130건 및 HLA-DQ 134건) 검사 결과를 이용하였다. HLA 타이핑 결과는 새로운 일련번호를 부여하여 익명으로 처리하였다.
2. 역방향 SSOP HLA 타이핑
중간 해상도의 역방향 SSOP HLA 타이핑(reverse sequence-specific oligonucleotide probe HLA typing)은 하기 방법으로 수행하였다. 말초 혈액(peripheral blood) 샘플로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 이후 제조사의 프로토콜에 따라 Lifecodes HLA-SSO typing kits (Immucor)를 이용하여 HLA-A, -B, -DR 및 -DQB1 타이핑을 수행하였다. PCR 반응액은 Lifecodes Master Mix(Immucor) 15 ㎕, 게놈 DNA 200 ng 및 Taq polymerase 2.5 U을 혼합한 뒤 최종 부피를 50 ㎕로 맞추어 준비하였다. PCR은 변성 반응을 95℃에서 5분 수행하고, 증폭 단계는 95℃에서 30초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 8 사이클 수행하고, 95℃에서 30초, 63℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 32 사이클 수행한 후 72℃에서 15분 동안 신장 반응을 수행하였다. 혼성 반응(hybridization reaction)은 프로브 믹스 15 ㎕와 PCR 결과물 5 ㎕를 혼합하여 97℃에서 5분, 47℃에서 30분 및 56℃에서 10분 동안 수행하였다. 상기 혼성 반응물과 1:200으로 희석한 스트렙타아비딘-피코에리트린 용액(streptavidin-phycoerythrin solution) 170 ㎕를 혼합한 후 Luminex 200 시스템(Luminex Corp.)으로 30분 이내에 분석하였다.
분석 결과 데이터인 프로브의 CRO (complete reaction pattern)는 HLA-A, -B, -DR 및 -DQB1 유전자좌(loci)에서의 프로브에 기초한 양성/음성 여부로부터 구축되며, CRPoAPs (complete reaction pattern for all probes)는 프로브 히트 패턴(probe hit pattern), 측정 프로브 패턴으로도 불리운다.
3. HLA 타이핑을 위한 데이터 분석
3-1. 초기 공통 단계(Initial shared steps)
데이터 분석을 위한 공통 분석 단계는 Lifecodes의 소프트웨어인 EPM(exact pattern matching)과 실험실에서 개발한 소프트웨어인 FnS(Filtering and Scoring)를 이용하여 동일한 조건에서 수행하였다. 소프트웨어 실행 전, Luminex 200 및 이의 xPONENT 소프트웨어(Luminex Corp.)를 이용하여 각 웰에 있는 마이크로스피어(microsphere)의 형광을 측정함으로써 혼성화 패턴을 확인하고, csv(comma-separated values) 파일을 작성하였다. 상기 csv 파일은 각각의 데이터 분석 소프트웨어로 임포트(import)하여 이용하였다. 상기 csv 파일에는 각 프로브(마이크로스피어)에 대한 MFI(median fluorescent intensity, 중간 형광 강도) 수치가 포함되어 있다. 획득된 MFI 수치는 프로브의 양성 또는 음성 반응성 평가에 이용하였다. 품질 관리(quality control)를 위하여, 컨센서스(consensus) SSO 프로브의 MFI 수치는 패키지 인서트 시트(package insert sheet)에 정의된 역가 수치(threshold value)를 초과해야 한다. 이후 랏-특이적 백그라운드 대조군 수치(Lot-specific background control values)를 샘플의 원본 MFI 수치(raw MFI value)로부터 뺀 후 백그라운드-교정 데이터(background-corrected data)를 만들었다. 다음으로 하기 수학식 1에 따라 MFI 수치를 보정하여 정규화된 데이터(normalized data)를 생성하였다.
Figure PCTKR2019005046-appb-M000001
특정 프로브에 대한 퍼센트편차(percent deviation)는 하기 수학식 2에 따라 산출하였다.
Figure PCTKR2019005046-appb-M000002
도 1은 HLA 형별을 결정하고자 하는 개체에서 Lifecodes HLA-B typing kits를 이용하여 CRPoAPs를 확인한 결과를 보여준다.
도 1의 A는 동형 접합 대립유전자쌍의 예상 CRPoAP의 일부를 나타내는 대립유전자와 프로브 히트(probe hit) 결과를 나타낸다. 도 1의 B는 Match It! DNA 소프트웨어로 분석한 샘플의 CRPoAP 보정 수치와 프로브 이름의 관계를 나타낸다: 도 1의 B에서 녹색 그래프는 음성 프로브, 적색 그래프는 양성 프로브를 의미하고, 그리드 그래프는 양성 프로브로 조정된 프로브 및 검은색 점은 각 프로브에 대한 컷오프 수치를 나타낸다.
3-2. EPM with Match It! 소프트웨어를 이용한 분석
샘플의 CRPoAPs는 대립유전자쌍(allele pairs)의 예상 CRPoAPs와 비교하였다. 상기 대립유전자쌍은 IPDIMGT/HLA sequence database release 3.11.0에 기반한 모든 대립유전자 또는 CWD(common well-documented) 대립유전자의 조합이다. 정확히 일치하는 대립유전자를 찾기 위하여, 거짓 양성/음성 반응(false positive/negative reaction)을 나타내는 것으로 의심되는 프로브는 두 패턴을 비교하기 전에 변경하였다. 특정 프로브에 대하여, 절대 퍼센트편차가 낮을수록 거짓 반응을 일으킬 확률이 높아진다.
3-3. FnS 소프트웨어를 이용한 분석
FnS 방법을 기반으로 하는 전용 소프트웨어 프로그램은 Visual Basic version 6.0(Microsoft Co.)으로 제작하였다. 상기 소프트웨어는 스프레드시트 (spreadsheet) 및 그리드 구성 요소로 Farpoint Spread version 3.0 (GrapeCity, Sendai, Japan)을 사용하고, Access(Microsoft Co.)에 한국인 HLA 데이터베이스를 구축하였다.
절대 양성 및 절대 음성 반응인 프로브는 샘플에 대한 측정 결과가 절대 퍼센트편차가 60% 이상인 프로브로 정의하였다: 절대 양성 프로브는 >+60% 및 절대 음성 프로브는 <-60%. PRPwoDP(partial reaction pattern with only definite probes)는 하기 프로브로 구성되는 패턴으로 정의하였다: 절대 양성 프로브로 구성되는 양성 PRPwoDP 및 절대 음성 프로브로 구성되는 음성 PRPwoDP.
한국인 피검자의 표본 CRPoAP에 가장 적합한 대립유전자(best-fit allele)를 찾는 표준 방법은 하기와 같다: (1) 개별 대립유전자를 한국인 개체에서 이전에 확인된 대립유전자의 존재 유무에 기반하여 두번째 또는 세번째 해상도 수준(resolution level)으로 필터링한다; (2) 음성 PRPwoDP에 기초하여 개별 대립유전자를 필터링한다: 음성 PRPwoDP에 속하는 프로브에 대하여, 한 후보 대립유전자의 예측 반응이 양성이면, 후보 대립유전자 리스트에서 그 대립유전자를 제거한다; (3) 남은 대립유전자들을 두 개씩 조합하여 대립유전자쌍(allele pairs) 리스트를 얻는다; (4) 대립유전자쌍은 양성 PRPwoDP에 기반하여 필터링한다: 양성 PRPwoDP에 속하는 프로브에 대하여, 한 후보 대립유전자쌍의 예측 반응이 음성이면, 후보 대립유전자쌍 리스트에서 그 대립유전자쌍을 제거한다; (5) 피검자로부터 얻은 수정하지 않은 CRPoAP(raw sample CRPoAP)와 후보 대립유전자쌍 리스트에 남아 있는 개별 대립유전자쌍의 예상 CRPoAP를 비교하여 미스매치 스코어(mismatch score)를 얻는다.
대안 방법은 인종적으로 다양하거나 혼합된 인구 집단을 위해 고안하였다(표 1): 인종-기반 필터링 단계(ethnicity-based filtering step)는 개별 대립유전자를 동일한 프로브 히트 패턴(same probe hit pattern)에 따라 그룹핑(grouping)하는 단계로 대체하였다. 그룹핑 단계 및 인종-기반 필터링 단계는 소프트웨어의 데이터베이스에 새로운 랏(new lot)의 정보가 들어왔을 때, 데이터 분석 전 1회 수행하였다. 따라서, 상기 두 단계를 수행하는데 소요되는 시간은 데이터 분석 시간에 포함되지 않는다.
미스매치 스코어는 샘플 CRPoAP 및 특정 후보 대립유전자쌍의 예상 CRPoAP에 대해 개별적으로 계산하였다. 미스매치 스코어는 미스매치 프로브의 수와 퍼센트편차의 합(Σ% deviation)으로 이루어지며, 퍼센트편차의 합은 하기 수학식 3에 따라 계산하였다:
Figure PCTKR2019005046-appb-M000003
이러한 스코어링을 남아있는 모든 유전자쌍에 대하여 반복하고, 미스매치 스코어 중에서 가장 작은 값을 갖는 대립유전자쌍을 가장 적합한 대립유전자쌍으로 선택하였다. 최종 HLA 형별 선정은 CWD 대립유전자를 모두 포함하는 대립유전자쌍에 우선순위를 두어 결정하였다. 미스매치된 프로브의 수가 3 이상일 경우 HLA 타이핑의 정확도를 확인하기 위하여, 동일한 방법 및 HLA-SBT를 사용하여 테스트를 반복하였다.
도 2는 대안 방법(필터링 및 스코어링 방법)을 이용하여 HLA-B 형별을 타이핑하는 일 예를 보여준다. 도 2에서 노란색으로 표시된 대립유전자는 CWD 대립유전자를 의미한다.
하기 표 1에 HLA 형별 타이핑에 대한 표준 방법과 대안 방법을 비교하였다.
단 계 설 명 표준 방법 대안 방법
개별 대립유전자 대립유전자쌍 개별 대립유전자 대립유전자쌍
1 초기 공통 단계 3,958 7,834,861 3,958 7,834,861
2 동일한 프로브 히트 패턴을 갖는 대립유전자끼리 그룹핑하는 단계 NA NA 1,771 1,569,106
3 한국인에서 확인되는 대립유전자의 존재 여부에 따라 필터링하는 단계 239 28,680 NA NA
4 음성 PRPwoDP에 기반하여 필터링하는 단계(퍼센트편차가 <-60%인 절대 음성 프로브) 16 - 135 -
5 남아 있는 대립유전자들을 대립유전자쌍으로 조합하는 단계 - 136 - 9,180
6 양성 PRPwoDP에 기반하여 필터링하는 단계(퍼센트편차가 >+60%인 절대 양성 프로브) - 10 - 92
7 피검자 샘플의 원본 CRPoAP와 잔여 후보 대립유전자쌍의 예상 CRPoAP 사이에서 미스매치 스코어를 계산하는 단계 - 1 - 1
3-4. 역방향 SSOP HLA 타이핑에 대한 결과 분석 시간의 비교
데이터 분석에 필요한 시간을 EPM(Match It! DNA) 및 FnS 소프트웨어 사이에서 비교하였으며, 분석 시간은 샘플 분석을 위한 클릭부터 최종 타이핑 결정까지 소요되는 시간(분:초)으로 정의하였다.
총 507건의 HLA 타이핑 테스트의 절반에 대하여 두 명의 전문가가 서로 다른 방법을 사용하여 동시에 데이터 분석을 수행하였다. 나머지 절반에 대해서는 서로 방법을 바꾸어 데이터 분석을 수행하였다. 최종 HLA 형별 결정의 정확도(correctness)는 다음 기준에 따라 결정하였다: 가장 작은 미스매치 스코어를 갖는 모든 후보 CWD 대립유전자쌍을 최종 HLA 형별 또는 주어진 HLA 유전자좌의 형별로 결정하였다.
3-5. 통계 분석
통계 분석은 엑셀 2013을 이용하였으며, 두 방법은 paired p-test로 비교하였다. P 값이 0.05 이하인 경우(P<0.05) 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하고, 결과는 평균값(mean)으로 기재하였다.
실험 결과
1. 데이터 분석 시간
하기 표 2에 기재된 바와 같이 FnS 방법에 대한 평균 분석 시간(분:초)은 00:21(00:08-01:47)로 나타나, 표준 분석 방법인 EPM 방법의 01:04(00:15-23:45)보다 짧은 것을 확인할 수 있었다(P<0.05).
분석시간(분:초) 미스매치 프로브의 수(샘플 수)
0 (334) 1 (98) 2 (49) 3 (11) 4 (10) 5 (3) 6 (1) 7 (1) 합계(507)
EPM 00:35(00:15-02:31) 01:06(00:15-04:23) 01:54(00:36-05:06) 02:54(00:35-05:29) 03:39(00:32-08:39) 11:02(01:36-23:45) 17:00 15:00 01:04(00:15-23:45)
FnS 00:19(00:08-01:01) 00:23(00:11-01:08) 00:27(00:09-01:34) 00:36(00:11-01:47) 00:41(00:25-01:30) 00:35(00:17-00:52) 00:38 00:43 00:21(00:08-01:47)
또한, 도 3에 나타난 바와 같이 EPM 방법을 이용하면 미스매치 프로브의 수가 증가함에 따라 분석 시간이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 반면, FnS 방법을 이용하면 미스매치 프로브의 수에 관계 없이 분석 시간이 상대적으로 일정한 것을 확인할 수 있었다.
2. HLA 타이핑의 정확도(accuracy)
하기 표 3에 나타난 바와 같이 507개의 HLA 타이핑 샘플 중 4개 샘플에서 EPM 방법 및 FnS 방법의 결과가 불일치하였다. 한국인에서 나타나는 대립유전자 빈도, 불일치 프로브의 수 및 퍼센트편차의 합을 고려할 때, FnS 방법으로 HLA 타이핑을 수행한 것이 4개 샘플 모두에서 정확했다.
구체적으로 EPM 방법을 사용한 경우, 2개 샘플에서는 가장 작은 퍼센트편차의 합을 갖는 복수의 CWD 대립유전자쌍을 확인할 수 없었다. 다른 2개 샘플에서는 가장 작은 수의 미스매치 프로브를 갖거나 또는 가장 작은 퍼센트편차의 합을 갖는 단일 후보 CWD 대립유전자쌍을 확인할 수 없었다.
HLA 유전자좌 EPM 방법 FnS 방법 HLA 최종 타이핑 방법
지정된 대립유전자쌍 미스매치스코어 지정된 대립유전자쌍 미스매치스코어
샘플 1 HLA-A A*24:02, 24:02 0, 0 A*24:02, 24:02 0, 0 FnS
A*24:02, 24:20 0, 0 A*24:20, 24:20 0, 0
A*24:20, 24:20 0, 0
샘플 2 HLA-A A*24:02, 24:02 0, 0 A*24:02, 24:20 0, 0 FnS
A*24:02, 24:20 0, 0 A*24:20, 24:20 0, 0
A*24:20, 24:20 0, 0
샘플 3 HLA-B B*35:01, 55:01 2, 105 B*35:01, 55:02 1, 11 FnS
샘플 4 HLA-DQ DQB1*04:01, 04:02 3, 73 DQB1*04:01, 04:01 2, 55 FnS
상기 실험 결과를 통하여 HLA 형별 타이핑시 FnS 방법을 이용하면, 분석 시간은 줄이면서 분석의 정확도를 높일 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, FnS 방법은 인종과 상관없이 개체의 HLA 형별을 타이핑할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (3)

  1. 하기 단계를 포함하는 개체의 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) 형별 판정 방법:
    (a) 개체의 HLA 대립유전자 증폭 산물과 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시켜 측정 프로브 패턴을 얻는 단계;
    (b) HLA 대립유전자들 중에서 동일한 예측 프로브 패턴을 나타내는 것끼리 하나의 대립유전자군으로 그룹핑하는 단계;
    (c) 그룹핑한 후보 대립유전자군 리스트에서 확실한 음성 반응(예: 퍼센트편차(percent deviation)가 -60% 이하)인 프로브에 위배되는 대립유전자군을 후보 리스트에서 제거하는 단계;
    (d) 남아 있는 HLA 대립유전자군을 두 개씩 조합하여 대립유전자쌍을 만들고, 이 후보 대립유전자쌍 리스트에서 확실한 양성 반응(예: 퍼센트편차가 +60% 이상)인 프로브에 위배되는 대립유전자쌍을 후보 리스트에서 제거하는 단계; 및
    (e) 후보 대립유전자쌍 리스트에 남아 있는 개별 대립유전자쌍의 예측 프로브 패턴과 피검자의 측정 프로브 패턴을 비교하여 일치 여부를 점수화하고, 최소 불일치를 보이는 대립유전자쌍을 피검자의 HLA 형별로 최종 선정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c)에서 퍼센트편차가 하위 1/3에 속하는 프로브에 위배되는 대립유전자를 후보 대립유전자군 리스트에서 제거하는 것인 개체의 HLA 형별 판정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (d)에서 퍼센트편차가 상위 1/2에 속하는 프로브에 위배되는 대립유전자를 후보 대립유전자쌍 리스트에서 제거하는 것인 개체의 HLA 형별 판정 방법.
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