WO2019210863A1 - 免疫效应细胞及其应用 - Google Patents

免疫效应细胞及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2019210863A1
WO2019210863A1 PCT/CN2019/085322 CN2019085322W WO2019210863A1 WO 2019210863 A1 WO2019210863 A1 WO 2019210863A1 CN 2019085322 W CN2019085322 W CN 2019085322W WO 2019210863 A1 WO2019210863 A1 WO 2019210863A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
runx3
cells
receptor
seq
Prior art date
Application number
PCT/CN2019/085322
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
蒋华
王华茂
李宗海
Original Assignee
科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 科济生物医药（上海）有限公司, 上海市肿瘤研究所 filed Critical 科济生物医药（上海）有限公司
Priority to CN201980030101.4A priority Critical patent/CN112074600A/zh
Priority to US17/052,425 priority patent/US20220127570A1/en
Priority to EP19797057.7A priority patent/EP3789486A4/en
Publication of WO2019210863A1 publication Critical patent/WO2019210863A1/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/844—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/852—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the expression construct further comprises an expression cassette 3 comprising a nucleic acid sequence encoding a cytokine, the sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 36, 39, or 41
  • the sequence has an amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity.
  • the RUNX3 has at least 90% identity to the sequence set forth in SEQ ID NO:20. In some embodiments, the RUNX3 is a constitutive expression. In some embodiments, the RUNX3 is an inducible expression. In some embodiments, the immune effector cells also co-express cytokines. In some embodiments, the individual cytokine is also administered. In some embodiments, the immune effector cell is a T cell. In some embodiments, the chimeric receptor is a chimeric antigen receptor. In some embodiments, the individual is also administered a chemotherapeutic drug.
  • provided herein is the use of a cell, expression construct or virus described herein in the manufacture of a medicament for inhibiting or inhibiting a pathogen.
  • Figure 1A is a plasmid map of PRRLSIN-hu9F2-28Z
  • Figure 1D is a plasmid map of pUC57-RUNX3-V2;
  • Figure 5 shows in vivo therapeutic experiments of CART cells expressing RUNX3 against a subcutaneous small-load xenograft model of B-NDG mice bearing PLC/PRF/5 hepatoma cells:
  • Figure 5A shows the detection results of the transplanted tumor volume
  • Figure 5B shows The test result of the weight of the transplanted tumor
  • FIG. 5C shows the test result of the body weight of the mouse;
  • Figure 11 is a graph showing changes in tumor volume of Hepa1-6-GPC3 subcutaneous xenografts
  • engineered and its grammatical other forms as used herein may refer to one or more changes in a nucleic acid, such as a nucleic acid within the genome of an organism.
  • engineered can refer to alterations, additions, and/or deletions of genes.
  • Engineered cells can also refer to cells having genes that are added, deleted, and/or altered.
  • provided herein is a method of increasing or ameliorating the viability of an immune effector cell expressing a chimeric receptor in an individual comprising administering to the individual the immune effector cell expressing the chimeric receptor and exogenous RUNX3 The combination.
  • the amount of exogenous RUNX3 when administered to an individual is sufficient to increase retention of the cell at a non-lymphoid site of the subject.
  • the amount of exogenous RUNX3 when administered to an individual is sufficient to increase retention of the cell in the tumor tissue of the individual.
  • the amount of exogenous RUNX3 when administered to an individual is sufficient to increase the inhibitory effect of the cell on tumor growth in the individual.
  • the amount of exogenous RUNX3 when administered to an individual is sufficient to increase the killing effect of the cell on the tumor cell in the individual.
  • T cell receptor a characteristic marker on the surface of all T cells, binds to CD3 with a non-covalent bond to form a TCR-CD3 complex.
  • the TCR is responsible for identifying antigens that bind to major tissue compatibility complex molecules.
  • TCR is a heterodimer composed of two different peptide chains, consisting of two peptide chains, ⁇ and ⁇ . Each peptide chain can be further divided into variable region (V region), constant region (C region), transmembrane. The region and the cytoplasmic region are several parts; it is characterized by a short cytoplasmic region.
  • the TCR molecule belongs to the immunoglobulin superfamily, and its antigen specificity exists in the V region; the V region (V ⁇ , V ⁇ ) has three hypervariable regions CDR1, CDR2, and CDR3, among which the CDR3 mutation is the largest, which directly determines the TCR antigen. Binding specificity. When the TCR recognizes the MHC-antigen peptide complex, CDR1, CDR2 recognizes and binds to the side wall of the MHC molecule antigen binding groove, and CDR3 binds directly to the antigen peptide.
  • TCR is divided into two categories: TCR1 and TCR2; TCR1 consists of two chains of ⁇ and ⁇ , and TCR2 consists of two chains of ⁇ and ⁇ .
  • antibody refers to a protein or polypeptide sequence derived from an immunoglobulin molecule that specifically binds an antigen.
  • Antibodies can be polyclonal or monoclonal, multi-stranded or single-stranded, or intact immunoglobulins, and can be derived from natural or recombinant sources.
  • the antibody can be a tetramer of immunoglobulin molecules.
  • cancer examples include, but are not limited to, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, nasopharyngeal cancer, colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell lung cancer, small bowel cancer, Esophageal cancer, melanoma, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, stomach cancer, testicular cancer, fallopian tube cancer, endometrial cancer, cervical cancer, vaginal cancer, thyroid cancer, parathyroid carcinoma , adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, bladder cancer, ureteral cancer, renal pelvic cancer, central nervous system (CNS) tumor, spinal tumor, glioma, pituitary adenoma, astrocytoma, said cancer Combinations and metastatic lesions of the cancer.
  • CNS central nervous system
  • refractory refers to a disease, such as a tumor, which does not respond to treatment.
  • the refractory tumor can be resistant to treatment prior to or at the beginning of treatment.
  • the refractory tumor can be resistant during treatment.
  • Refractory tumors are also known as resistant tumors.
  • refractory cancers include, but are not limited to, cancers that are insensitive to radiotherapy, relapse after radiotherapy, insensitive to chemotherapy, relapse after chemotherapy, insensitive to CAR-T therapy, or relapse after treatment.
  • the treatment regimens described herein can be used for refractory or recurrent malignancies.
  • relapsed means that after a period of improvement, such as prior effective tumor treatment, the patient reappears with signs and symptoms prior to the effective treatment.
  • the total amount of agent to be administered in practicing the methods described herein can be administered as a single dose by bolus or by infusion over a relatively short period of time, or can be administered using a fractionated treatment regimen, wherein Multiple doses are administered over a period of time.
  • One skilled in the art will recognize that the amount of composition that treats a pathological condition in a subject depends on a number of factors, including the age and general health of the subject, as well as the route of administration and the number of treatments to be administered. With these factors in mind, the technician will adjust the specific dose as needed. In general, initially, Phase I and Phase II clinical trials are used to determine the formulation of the composition as well as the route and frequency of administration.
  • the nucleic acid sequences described herein that express a CLD18A2-targeting CAR and exogenous RUNX3 can be the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 54, 55, 56.
  • Cytokines are soluble proteins produced by cells induced by immunogens or other stimulators.
  • cytokines refer to, for example, IL15, IL18, and IL21.
  • a polypeptide of a cytokine refers to a truncated fragment of a cytokine having a similar function to a cytokine.
  • the cells can be expressed by exogenous cytokines or functional fragments thereof by conventional bioengineering means.
  • the RUNX3-CAR T (CART cells expressing RUNX3) cell group that binds IL15 is superior to the control for liver cancer cells that express GPC3 at a ratio of 3:1 and 1:1.
  • Group of cells CAR T cells expressing only RUNX3; in some embodiments, the RUNX3-CAR T cell group combined with IL15 expression is superior to the control cells (CAR T cells expressing only RUNX3), of which 5 One of the mice developed tumor regression.
  • Spleen T lymphocytes of C57BL/6 mice purified mouse CD3 + T lymphocytes were added to Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28 in a volume ratio of 1:1, washed once with PBS, activated, cultured in an incubator, cultured The base was RPMI 1640 complete medium supplemented with 10% FBS serum.
  • Mouse spleen T lymphocytes activated for 24 h were inoculated into 12-well plates coated with recombinant human fibrin fragments, and retroviruses hu8E5-2I-mBBZ and hu8E5-2I-mBBZ-RUNX3 were added for infection for 12 hours, respectively, followed by culture expansion. Increase to the required amount to obtain hu8E5-2I-mBBZ CAR T cells, hu8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CAR T cells.
  • Example 4 In vitro killing toxicity detection of claudin 18.2 positive cells
  • the tumor inhibition rate was calculated according to the control group. 18 days after CAR T injection, compared with the UTD control group, the anti-tumor effect was observed in each group.
  • the inhibition rates were: 9F2-28Z CART group: 40.50%, 9F2-BBZ CART group : 56.95%, 9F2-28Z-RUNX3 CART group: 77.69%, 9F2-BBZ-RUNX3 CART group: 83.68%.
  • mice were randomly divided into groups of 6-8 weeks, each group of 5-6, respectively, Untransduced (UTD) T cells, hu8E5-2I-mBBZ CART cells, 8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CAR -T (or mBBZ-mRunX3) cell treatment group.
  • UTD Untransduced
  • the tumor inhibition rates were: vehicle group: 23.37%, Sorafenib treatment group: 27.38%, 9F2-BBZ: 56.95%, 9F2 -BBZ-RUNX3: 83.68%, 9F2-BBZ-RUNX3+Sorafenib treatment group: 95.45% (1 out of 5 mice developed tumor regression).
  • Untransduced (UTD) T cells 9F2-28Z CART cells, 9F2-BBZ CAR T cells, 9F2-28Z-RUNX3 CAR T cells, 9F2-BBZ-RUNX3 CAR T and hepatoma cell lines Huh-7, PLC/PRF/5 SK-HEP-1 cells were incubated for 24 hours at a target-to-target ratio of 1:1, and then the supernatant was used to detect the secretion levels of cytokines IL-2, TNF and IFN- ⁇ in the supernatant by CBA method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种基因工程化的细胞，所述细胞表达结合抗原的外源性受体，并且表达提高的水平的RUNX3或者外源性的RUNX3。还提供所述细胞的用途以及治疗肿瘤的方法。

Description

免疫效应细胞及其应用 技术领域
本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及表达结合抗原的外源性受体和表达提高的水平的RUNX3或外源性RUNX3的细胞，特别是免疫效应细胞。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是一种人工重组受体，通常含有位于胞外区的单克隆抗体的抗原识别结构域、跨膜区、及免疫应答细胞的胞内激活信号结构域组成。
然而，由于生物体，特别是实体瘤的微环境的复杂性，在体外表现出优良效果的候选药物，在体内往往无法表现出相应的效果。
发明内容
本文所述的目的在于提供一种基因工程改造的免疫效应细胞，增加免疫效应细胞在肿瘤组织中的驻留及其杀伤能力，进而增加抗肿瘤活性。
在一个方面，本文提供了一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达结合抗原的外源性受体，并且表达提高的水平的RUNX3或者外源性的RUNX3。在一些实施方案中，所述的细胞为免疫效应细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为T细胞。在一些实施方案中，所述的RUNX3是全长人RUNX3或具有与全长人RUNX3相同功能的人RUNX3的片段。在一些实施方案中，所述的RUNX3与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述RUNX3是组成型表达。在一些实施方案中，所述RUNX3是诱导型表达。在一些实施方案中，所述的抗原是肿瘤抗原或病原体抗原，优选的是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述的肿瘤抗原是实体瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原为GPC3或claudin18.2。在一些实施方案中，所述受体为嵌合受体，选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。在一些实施方案中，所述受体为嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述的嵌合抗原受体的细胞内结构域含有CD137的胞内共刺激信号域。 在一些实施方案中，所述受体的胞外域具有SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:22所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述受体的胞内域含有SEQ ID NO:47所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述受体的胞内域还具有SEQ ID NO:46或者SEQ ID NO:49所示的至少90％同一性的氨基酸序列，或者含有SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:49所示的至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞含有与SEQ ID NO:17、19、53、54、55、或56具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述细胞还表达外源性细胞因子受体结合蛋白，或外源性细胞因子或其多肽。在一些实施方案中，所述细胞还表达外源性细胞因子。在一些实施方案中，所述外源性细胞因子受体结合蛋白能特异性结合相应的细胞因子受体且增强受体活性。在一些实施方案中，所述外源性细胞因子或其多肽能特异性结合相应的细胞因子受体且增强受体活性。在一些实施方案中，所述的细胞因子与SEQ ID NO:39、41或36所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％。在一些实施方案中，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在非淋巴部位的滞留。在一些实施方案中，所述的细胞因子为组成型表达。在一些实施方案中，所述细胞因子是诱导型表达。在一些实施方案中，所述细胞表达外源性RUNX3。在一些实施方案中，所述受体和/或RUNX3利用病毒载体表达；较佳地，所述的病毒载体包括：慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。
本另一个方面，本文提供了一种表达构建物，其特征在于，该表达构建物包括顺序连接的：结合抗原的受体的表达盒1和RUNX3的表达盒2，其中所述表达盒之间任选地由选自F2A、PA2、T2A、和/或E2A的串联片段连接。在一些实施方案中，所述的结合抗原的受体的表达盒含有编码SEQ ID NO:57、58、59、60、61、或62所示的序列的核酸序列，所述的RUNX3的表达盒具有编码SEQ ID NO:20所示的序列的核酸序列。在一些实施方案中，所述表达构建物还含有表达盒3，所述表达盒3含有编码细胞因子的核酸序列，所述细胞因子的序列是与SEQ ID NO:36、39、或41所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本文提供了一种表达载体，其包含本文所述的表达构建物。
在另一个方面，本文提供了一种病毒，所述病毒包含本文所述的表达载体。
在另一个方面，本文提供了一种提高表达嵌合受体的免疫效应细胞在个体中的活力的方法，其特征在于，在免疫效应细胞中提高RUNX3的表达水平。在另一个方面，本文提供了一种提高表达嵌合受体的免疫效应细胞在个体中的活力的方法，其特征在于，通过使所述免疫效应细胞表达外源性的RUNX3来提高所述免疫效应细胞中RUNX3的表达水平。在一些实施方案中，所述的RUNX3是全长人RUNX3或具有与全长人RUNX3相同功能的人RUNX3的片段。在一些实施方案中，所述的RUNX3与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述RUNX3是组成型表达。在一些实施方案中，所述RUNX3是诱导型表达。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞还共表达细胞因子。在一些实施方案中，还给予所述个体细胞因子。在一些实施方案中，所述的免疫效应细胞为T细胞。在一些实施方案中，所述的嵌合受体为嵌合抗原受体。在一些实施方案中，还给予所述个体化疗药物。
在另一方面，本文提供本文所述的细胞、表达构建物或病毒在制备用于抑制肿瘤或抑制病原体的药物中的应用。
在另一方面，本文提供一种一种用于抑制肿瘤或抑制病原体的药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本文提供一种用于治疗肿瘤或病原体感染的试剂盒或药盒，所述试剂盒包含本文所述的细胞或药物组合物。
在另一方面，本文提供表达提高的水平的RUNX3或者外源性RUNX3并且表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的免疫效应细胞和化疗药物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。在一些实施方案中，所述化疗药物包括索拉菲尼。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原为GPC3或claudin18.2。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为T细胞。
在另一方面，本文提供治疗有此需要的患者中的肿瘤的方法，包括向所述患者提供本文所述的细胞。
应理解，在本文公开范围内，本文所述的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间可相互组合，这些技术特征的各种具体组合均应视为已经特别地公开。
附图说明
图1A是PRRLSIN-hu9F2-28Z的质粒图谱；
图1B是PRRLSIN-hu9F2-BBZ的质粒图谱；
图1C是MSCV-hu8E5-2I-mBBZ的质粒图谱；
图1D是pUC57-RUNX3-V2的质粒图谱；
图1E是pRRLSIN-hu9F2-28Z-F2A-huRUNX3的质粒图谱；
图1F是pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3的质粒图谱；
图1G是MSCV-hu8E5-2I-mBBZ-F2A-mRunX3的质粒图谱；
图1H是pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL15的质粒图谱；
图1I是pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL18的质粒图谱；
图1J是pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL21的质粒图谱；
图1K是pRRLSIN-hu9F2-BBZ(CD28TM)-F2A-RUNX3的质粒图谱；
图2显示了体外CAR-T细胞表型检测；
图3A显示了表达RUNX3的CAR T细胞靶向GPC3阳性细胞的体外杀伤毒性检测结果；图3B显示了联合表达RUNX3和细胞因子的CAR T细胞靶向GPC3阳性细胞的体外杀伤毒性检测结果；
图4显示了表达RUNX3的CAR T细胞靶向claudin18.2阳性细胞的体外杀伤毒性检测结果；
图5显示了表达RUNX3的CAR T细胞对荷PLC/PRF/5肝癌细胞的B-NDG小鼠皮下小负荷移植瘤模型的体内治疗实验：图5A显示了移植瘤体积的检测结果、图5B显示了移植瘤重量的检测结果、图5C显示了小鼠体重的检测结果；
图6显示了表达RUNX3的CAR T细胞对荷PLC/PRF/5肝癌细胞的NPG小鼠皮下大负荷移植瘤模型的体内治疗实验：图6A显示了移植瘤体积的检测结果、图6B显示了移植瘤重量的检测结果、图6C显示了小鼠体重的检测结果；
图7显示了表达联合细胞因子和RUNX3的CAR T细胞对GPC3阳性细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验：图7A显示了移植瘤体积的检测结果、图7B显示了移植瘤重量的检测结果、图7C显示了小鼠体重的检测结果；
图8显示了表达RUNX3的CAR T细胞对荷PANC02-A2胰腺癌细胞的小鼠皮下移植瘤模型的体内治疗实验；
图9显示了表达RUNX3的CAR T细胞联合索拉菲尼对荷PLC/PRF/5肝癌细胞的小鼠皮下移植瘤模型的体内治疗实验：图9A显示了移植瘤体积的检测结果、 图9B显示了移植瘤重量的检测结果、图9C显示了小鼠体重的检测结果；
图10显示了CAR T细胞分泌细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ的检测结果；
图11显示了Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤的肿瘤体积变化图；
图12显示了不同CAR-T细胞对Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤后肿瘤重量对比结果；
图13显示了不同CAR-T细胞治疗Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤过程中小鼠体重变化结果。
图14显示了不同的免疫效应细胞中RUNX3的表达水平对比。
具体实施方式
本文所述的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本文所述的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、97～98％和98～99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。
根据本公开内容，本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本文所述的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本文所述的各方面的举例说明)，并且应当认为，在功能上等价的方法和组分仍包括在本文所述的范围内。
除非专门定义，本文所用的所有技术和科学术语具有在基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域内的技术人员通常理解的含义。类似或等效于本文中描述的所有方法和材料都可以在本文所述的实践或测试中使用。这些技术如方法和材料充分记载于文献中，参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL，2000，Wileyand sonInc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrooketal，2001，Cold  Spring Harbor，NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是Vols.154和155(Wuetal.eds.)和Vol.185，“Gene Expression Technology”(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Hand book Of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书为准。此外，除非另有规定，本说明书中所列举的材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。
本文所用的术语“工程化”及其语法上的其他形式可以指核酸的一个或多个改变，例如生物体基因组内的核酸。术语“工程化”可以指基因的改变、添加和/或缺失。工程细胞还可以指具有加入、缺失和/或改变的基因的细胞。
本文所用的术语“基因工程化的细胞”是指通过基因工程的手段改造的细胞。在一些实施方案中，所述的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，所述的细胞是T细胞。在一些实施方案中，本文所述的基因工程化的细胞是指表达特异性结合靶抗原的外源性受体的细胞。在一些实施方案中，本文所述的基因工程化的细胞是指表达特异性结合靶抗原的外源性受体并且表达提高的水平的RUNX3或者外源性的RUNX3的细胞。在一些实施方案中，本文所述的基因工程化的细胞还可以是共表达特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体、提高的水平的RUNX3或者外源性的RUNX3及细胞因子(如IL-15、IL-18、IL-21等)的T细胞。
术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，产生免疫效应的细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞以及骨髓源性吞噬细胞。在一些实施方案中，所述的免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞。 在一些实施方案中，T细胞可以是自体T细胞、异种T细胞、或同种异体T细胞。在一些具体实施方案中，NK细胞可以是同种异体NK细胞。
正如本文中使用的那样，术语“免疫效应功能”是指免疫效应细胞的功能或反应，例如引发、增强、或调节免疫系统的激活以及免疫应答的产生。
RUNX3(Runt-related transcription factor 3)”，也称为成骨相关转录因子3，包含天然的全长RUNX3及具有RUNX3功能的RUNX3的片段。天然全长的RUNX3基因定位于染色体1p36，全长为67kb，含P1、P2两个启动子及六个外显子，基因有两个大的保守CpG岛，其中一个位于外显子6的起始位，而另一个则位于外显子2附近。
在一些实施方案中，本文所述的基因工程化的细胞表达提高的水平的RUNX3。在一些实施方案中，所述提高的表达水平是相对野生型而言。就此目的而言，野生型是指未采取本发明所述的提高RUNX3的措施的细胞。值得注意的是，野生型并非仅局限于天然存在的细胞，如个体的未经基因工程改造的免疫效应细胞，其同样可以是例如已经经过基因工程化改造的细胞。例如，在一些实施方案中，所述野生型细胞是表达结合抗原的外源性受体的细胞。在一些实施方案中，所述野生型细胞是CAR T细胞。在一些实施方案中，所述野生型细胞是个体PBMC中的免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过调控RUNX3的上游基因来提高RUNX3的表达水平。
在一些实施方案中，通过向所述免疫工程化的细胞中转入外源性的RUNX3基因来提高RUNX3的表达水平。在一些实施方案中，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％。在一些实施方案中，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在非淋巴部位的滞留。在一些实施方案中，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在肿瘤组织中的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在所述个体非淋巴部位的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在所述个体肿瘤组织的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤生长的抑制效果。在一些实施方案中，当给予个体时，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤细胞的杀伤作用。
在一些实施方案中，本文提供一种提高或者改善表达嵌合受体的免疫效应细胞在个体中的活力的方法，包括向个体给予所述表达嵌合受体的免疫效应细胞以及外源性RUNX3的组合。在一些实施方案中，在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体非淋巴部位的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体肿瘤组织的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤生长的抑制效果。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤细胞的杀伤作用。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的个体给予表达嵌合受体的免疫效应细胞以及外源性RUNX3的组合。在一些实施方案中，在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体非淋巴部位的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体肿瘤组织的滞留。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤生长的抑制效果。在一些实施方案中，当给予个体时，所述外源性RUNX3的量足以提高所述细胞在所述个体中对于肿瘤细胞的杀伤作用。
“组成型表达”(constitutive expression)又称持续表达，是指在几乎所有的生理条件下，基因都能够在细胞中持续的表达。术语“诱导型表达(inducible expression)”是指在一定条件下的表达，所述的条件例如T细胞与抗原发生结合的时候。
术语“治疗有效量”、和“有效量”在本文中可互换地使用，是指有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量，例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。当指示“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时，本文所述的免疫效应细胞或治疗剂的精确给药剂量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。有效量的免疫效应细胞是指但不限于能使免疫效应细胞抗肿瘤活性增加、增强或延长；抗肿瘤免疫效应细胞或活化免疫效应细胞数目的增加；促进IFN-γ分泌；肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的免疫效应细胞的数量。
本文使用的术语“启动子”为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。
典型的真核生物启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。
NFAT”(Nuclear factor of activated T cells，)是活化T细胞核因子。在一些具体实施方案中，NFAT在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达起着重要的作用。在一些实施方案中，RUNX3是采用诱导性启动子的诱导性表达。在一些实施方案中，所述诱导性启动子为NFAT启动子。在一些实施方案中，将RUNX3的编码序列置于与含NFAT结合基序的最小启动子的调控之下。在一些具体实施方案中，含6个NFAT结合基序的IL2最小启动子是利用6个NFAT的结合位子与IL2的最小启动子(minimal promoter)串联在一起组成的启动子。
在一些实施方案中，本文所述的结合抗原的受体是指嵌合受体。本文所用的“嵌合受体”，是指用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA连接而成的融合分子。嵌合受体通常包括胞外域、跨膜域和胞内域。可用于本发明的嵌合受体包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)。
本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域(也称为胞外区)、跨膜结构域(也称为跨膜区)和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”或“胞内区”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结 构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导。
本文所用的“跨膜结构域”，指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与嵌合受体的其它结构域中的一个有关的结构域，例如，在一种实施方式中，所述跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与表达嵌合受体的细胞的细胞表面上的另一个嵌合受体同型二聚化。跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜结构域能够向胞内结构域传导信号，无论何时所述嵌合受体与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的跨膜结构域：例如，T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在某些实施方式中，跨膜结构域可以包括至少下述跨膜区域：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至 CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质区之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供一种特别合适的接头。
本文所用的“细胞质结构域”(也称为胞内区),包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域负责其中已经引入嵌合受体的免疫细胞的免疫效应子功能的活化。免疫细胞的免疫效应功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导免疫效应功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导免疫效应功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导免疫效应功能信号的胞内信号传导结构域的截短部分。
众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与MHC抗原肽复合物的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的信号传导基序。特别地用于本文所述的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本文所述的任一个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本文所述的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。
术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激 配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及特异性地结合CD83的配体。
共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3以及特异性地结合CD83的配体等。
胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。
术语“4-1BB”(CD137)是指具有如GenBank Accession No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Accession No.AAA62478.2的氨基酸残基214～255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为来自人或者来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
术语“T细胞(抗原)受体(T cell receptor，TCR)”，为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR负责识别与主要组 织相容性复合体分子结合的抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。
术语“T细胞融合蛋白(T cell fusion protein，TFP)”，包括构成TCR的各种多肽衍生的重组多肽，其能够结合到靶细胞上的表面抗原,和与完整的TCR复合物的其他多肽相互作用，通常同定位在T细胞表面。TFP由一个TCR亚基与人或人源化抗体结构域组成的一个抗原结合结构域组成，其中，TCR亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜结构域、TCR胞内结构域的胞内信号结构域的刺激结构域；该TCR亚基和该抗体结构域有效连接，其中，TCR亚基的胞外、跨膜、胞内信号结构域来源于CD3ε或CD3γ，并且，该TFP整合进T细胞上表达的TCR。
术语“T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)”，包括三个功能结构域：1、肿瘤靶向结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPin)或其他靶向基团；2、胞外区结构域，与CD3结合的单链抗体，从而使得TAC受体与TCR受体靠近；3、跨膜区和CD4共受体的胞内区，其中，胞内区连接蛋白激酶LCK，催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。
术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab，Fab'、F(ab') 2、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(如sdAb)、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重 链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者都包括。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，能够编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。
“肿瘤抗原”指的是过度增生性疾病发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原。在某些方面，本文所述的过度增生性病症是指肿瘤。
本文所述的肿瘤抗原可以是实体瘤抗原，也可以是血液瘤抗原。
本文所述的肿瘤抗原包括但不限于：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD30；CD70；CD123；CD138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)， B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3Galp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)； 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
病原体抗原选自：病毒、细菌、真菌、原生动物，或寄生虫的抗原；病毒抗原选自：巨细胞病毒抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、人类免疫缺陷病毒抗原,或流感病毒抗原。
肿瘤”指在体外(例如经转化的细胞)或体内的过度增殖性细胞生长的广泛病症类别。可以通过本文所述的方法治疗或预防的病况包括例如各种赘生物，包括良性或恶性肿瘤，各种增生等等。癌症的具体例子包括但不限于：乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，鼻咽癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，子宫癌，卵巢癌，胃癌，睾丸癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，脊椎肿瘤，胶质瘤，垂体腺瘤，星性细胞瘤，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。
术语“特异性地结合”是指结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。
术语“难治”指的是一种疾病，例如，肿瘤，其不应答治疗。在实施方案中，难治性肿瘤可以是对治疗开始前或开始时的治疗有抗性。在其他实施方案中，难治性肿瘤可以成为治疗期间抗性的。难治性肿瘤也称为抗性肿瘤。在本发明中，难治性癌症包括但不限于放疗不敏感、放疗后复发、化疗不敏感、化疗后复发、对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的癌症。难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文中描述的治疗方案。
如本文所用“复发的”是指在一段改进期，例如在先有效肿瘤治疗后，患者又再 出现该有效治疗之前的体征和症状。
术语“个体”和“受试者”在本文中具有同等含义，可以是人和来自其他种属的动物。
术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％更多。
在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加、促进IFN-γ分泌、或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大、复发或扩散或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在，促进IFN-γ分泌、或其组合预测。
如本文公开的免疫效应细胞可以通过各种途径施用于个体，包括例如经口或肠胃外，例如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、鼻内(intravasally)、皮内或者分别使用例如皮肤贴片或透皮离子电渗疗法通过皮肤的被动或促进吸收。
在实践本文所述的方法中待施用的试剂总量可以作为单一剂量以推注或通过在相对短时间段的输注，施用于受试者，或可以使用分级治疗方案进行施用，其中在延长时间段施用多个剂量。本领域技术人员将知道治疗受试者中的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康、以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，最初，使用I期和II期临床试验测定组合物的配制以及施用途径和频率。
本文所用的“GPC3”或“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”是Glypican家族的一员，其在调控细胞生长和分化方面起重要作用。GPC3异常表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切，如在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、等中呈现异常表达。
在本发明中，免疫效应细胞靶向GPC3阳性表达的肿瘤。在具体的实施方式中， 所述肿瘤包括但不限于乳腺癌，胶质瘤，肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌。本领域技术人员知晓，有些肿瘤细胞，例如肝癌细胞对很多药物不敏感，因此，即便在体外有效的药物，有时候在体内的效果也不佳，甚至没有效果。因此，在优选的实施方式中，本文所述的GPC3阳性表达的肿瘤或GPC阳性肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。在一些实施方案中，PLC/PRF/5肝癌细胞小负荷皮下移植瘤模型中，9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3 CART组、9F2-BBZ-RUNX3 CART组都具有显著的抑瘤效果，并且相对9F2-28Z CART组、9F2-BBZ CART组而言，抑瘤效果更好。在PLC/PRF/5肝癌细胞大负荷皮下移植瘤模型中，9F2-28Z-RUNX3 CART组、9F2-BBZ-RUNX3 CART组都具有显著的抑瘤效果，并且相对9F2-28Z CART组、9F2-BBZ CART组而言，抑瘤效果显著提升。
当采用的共表达外源性RUNX3的CAR-T细胞用于受试者时，可以选择相应种属，如当用于鼠时，采用鼠源的RUNX3，构建CAR的元件如跨膜域、胞内域等也可以选择鼠源的。当受试者为人时，优选人源的RUNX3及人源的CAR的元件。
在一些实施方式中，使用的CAR的序列可以如SEQ ID NO：57、58、或59所示。
在一些实施方式中，本文所述的表达靶向GPC3的CAR和外源性RUNX3的核酸序列例如可以为如SEQ ID NO:19、17、53所示的核酸序列。术语“CLD18”指密蛋白18(Claudin 18，CLD18)，Genbank登记号：剪接变体1(CLD18A1)：NP_057453、NM016369，以及剪接变体2(CLD18A2)：NM_001002026、NP_001002026，是分子量约为27,9/27,72kD的内在跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的内在膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的一级屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。
CLD18A1(Claudin 18A1)在正常肺和胃的上皮中选择性表达，而CLD18A2(Claudin 18A2)仅在胃细胞中表达。并且，CLD18A2局限在已分化的胃上皮短寿细胞中，但在胃干细胞区中不存在。两种变体在若干癌症类型中强烈表达，包括 胃、食管、胰腺和肺的肿瘤以及人癌症细胞系。表达主要是在这些适应症的腺癌亚型中。
术语“CLD18”包括细胞天然表达的或转染了CLD18基因的细胞所表达的任何CLD18的变体(包括CLD18A1和CLD18A2)、构象、同工型(isoform)和种间同源物(specieshomologs)。优选地，“CLD18”指人CLD18，特别是CLD18A2(SEQ ID NO:51)和/或CLD18A1(SEQ ID NO:52)，更优选CLD18A2。
在一些实施方案中，表达RUNX3的靶向CLD18A2的CAR T细胞对claudin18.2表达阳性的PANC02-A2在具有显著的毒性杀伤作用，而对claudin18.2表达阴性的PANC02细胞也几乎未有杀伤作用。在一些实施方案中，表达RUNX3的靶向CLD18A2的CAR T细胞对claudin18.2表达阳性的PANC02-A2的胰腺癌细胞的皮下移植瘤模型具有显著的抑瘤效果，并且相对CLD18A2-CAR T细胞而言，抑瘤效果更好。
当采用的共表达外源性RUNX3的CAR-T细胞用于受试者时，可以选择相应种属，如当用于鼠时，采用鼠源的RUNX3或其片段，构建CAR的元件如跨膜域、胞内域等也可以选择鼠源的。当受试者为人时，优选人源的RUNX3或其片段及人源的CAR的元件。
在一些具体实施方式中，使用的CAR的序列可以如SEQ ID NO：60、61、或62所示。
在一些具体实施方式中，本文所述的表达靶向CLD18A2的CAR和外源性RUNX3的核酸序列可以为如SEQ ID NO:54、55、56所示的核酸序列。细胞因子是免疫原或其他刺激剂诱导细胞产生的可溶性蛋白质。在一些实施方案中，细胞因子是指例如IL15、IL18和IL21。细胞因子的多肽是指与细胞因子具有相似功能的细胞因子的截短片段。如与IL15具有类似生物学功能的天然全长IL15的截短片段。通过常规的生物工程手段，可以使细胞表达外源性的细胞因子或者其功能性片段。
白介素15(IL15或IL-15)，人源IL15具有4-螺旋束结构，分子量为14-15kD，含有114个氨基酸，主要在单核细胞和树突状细胞合成。其由单基因编码，定位于染色体4q31，含有8个外显子。IL-15作为一种可溶性细胞因子，在NK细胞、T细胞和B细胞的复制和分化都起着重要作用。而肿瘤的发生发展和转移的过程离不开淋巴细胞介导的免疫应答、IL-15增强T细胞分化增值和B细胞分泌抗体等特性，对于增强对肿瘤细胞的免疫应答起着关键作用。
IL-15能够与IL-15R(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-15)相互作用(例如结 合),优选来自哺乳动物(例如鼠或人)，并且具有以下特征之一：(i)天然存在的哺乳动物IL-15的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：39(人)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ ID NO：39(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-15核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：38(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iv)由与SEQ ID NO：38(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(v)由与天然存在的IL-15核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：38(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。
“增强IL-15R活性”应理解为意指本公开的IL-15R结合蛋白增强天然存在的IL-15R的任何一种或多种活性，包括但不限于刺激NK细胞的增殖、细胞毒性或成熟；刺激B细胞和T细胞的增殖或分化；刺激B细胞中的抗体产生和亲和力成熟；刺激CD8+T细胞的细胞毒性；刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ产生；抑制树突状细胞(DC)活化和成熟；抑制炎性介质从肥大细胞释放；增强巨噬细胞的吞噬作用；抑制TReg细胞的产生或存活；和刺激骨髓祖细胞的增殖。
在一些实施方案中，对高表达GPC3的肝癌细胞，在效靶比为3:1与和1:1时，联合表达IL15的RUNX3-CAR T(表达RUNX3的CAR T细胞)细胞组优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)；在一些实施方案中，联合表达IL15的RUNX3-CAR T细胞组抑瘤效果优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)，其中，5只小鼠中有1只出现肿瘤消退。
白介素18(IL-18或IL18)是IL-18多肽、白细胞介素-18多肽、IFN-γ诱导因子或干扰素-γ诱导因子或IFN-γ诱导因子的同义词，是指能够与IL-18R(NM_003855.3,NM_001282399.1)(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-18)相互作用(例如结合)的蛋白质(优选来自哺乳动物，例如鼠或人)，并且具有以下特征之一：(i)天然存在的哺乳动物IL-18的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：41(人)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ ID NO：41(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-18核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：40人)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iv)由与SEQ ID NO：40(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序 列；(v)由与天然存在的IL-18核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：40(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。贯穿本说明书，术语IL-18可互换地包括pro-IL-18(成熟IL-18在蛋白酶切割之前的前体)和成熟IL-18(蛋白酶切割后)，除非指定了意指pro-或成熟形式。
“增强IL-18R活性”应理解为意指本公开的IL-18R结合蛋白增强天然存在的IL-18R的任何一种或多种活性，包括但不限于刺激NK细胞的增殖、细胞毒性或成熟；刺激B细胞和T细胞的增殖或分化；刺激B细胞中的抗体产生和亲和力成熟；刺激CD8+T细胞的细胞毒性；刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ产生；抑制树突状细胞(DC)活化和成熟；抑制炎性介质从肥大细胞释放；增强巨噬细胞的吞噬作用；抑制TReg细胞的产生或存活；和刺激骨髓祖细胞的增殖。
在一些实施方案中，对高或中度表达GPC3的肝癌细胞,在效靶比为3:1与和1：1时,联合表达IL18的RUNX3-CAR T(表达RUNX3的CAR T细胞)细胞组优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)；在一些实施方案中，联合表达IL18的RUNX3-CAR T细胞组抑瘤效果优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)。
“白细胞介素21(IL-21或IL21)”是I类细胞因子，由活化的CD4+T细胞、NKT细胞、Tfh细胞和Th17细胞产生，与IL-2、IL-4、IL-15有较高的同源性，属于γc家族成员。hIL-21(人IL21)定位于4号染色体长臂上(4q26-27)，转录一条由642个核苷酸组成的成熟mRNA，编码162个氨基酸组成的蛋白前体，其中前31个氨基酸为信号肽，后面的131个氨基酸组成具有四螺旋结构域分子量为15KD的成熟IL-21。IL-21的5’调控区域含有三个T细胞激活核因子(NF-AT)结合位点，并且IL-21启动子的活性通过钙离子载体作用于细胞而产生。IL-21有两处DNaseI超敏位点，这两个位点在人和小鼠中都是保守的，其中一个位于IL-21启动子区，与TCR介导的IL-21转录有关。hIL-21能特异的结合人白细胞介素21受体(hIL-21R)，激活JAK/STAT等信号传递途径，表现出复杂的生物学效应，它可以调控B细胞的分化、凋亡及产生抗体的亚类，促进T细胞介导的获得性免疫，增强NK细胞的细胞毒性及产生IFN-γ的能力，介导主动免疫与被动免疫之间的转换。rhIL-21在过敏反应、炎症反应、自身免疫反应以及抗肿瘤等临床应用中的重要作用。
本文所用的术语“IL-21”或“IL-21多肽”是指能够与IL-21R(NM_021798.3)(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-21)相互作用(例如结合)的蛋白质(优选来自哺 乳动物，例如鼠或人)，并且具有以下特征之一：(i)天然存在的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：36(人)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ ID NO：36(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：35(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iv)由与SEQ ID NO：35(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(v)由与天然存在的IL-21核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：35(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。
“增强IL-21R活性”应理解为意指本公开的IL-21R结合蛋白增强天然存在的IL-21R的任何一种或多种活性，包括但不限于刺激NK细胞的增殖、细胞毒性或成熟；刺激B细胞和T细胞的增殖或分化；刺激B细胞中的抗体产生和亲和力成熟；刺激CD8+T细胞的细胞毒性；刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ产生；抑制树突状细胞(DC)活化和成熟；抑制炎性介质从肥大细胞释放；增强巨噬细胞的吞噬作用；抑制TReg细胞的产生或存活；和刺激骨髓祖细胞的增殖。
在一些实施方案中，对高或中度表达GPC3的肝癌细胞,在效靶比为3:1与和1：1时，联合表达IL21的RUNX3-CAR T(表达RUNX3的CAR T细胞)细胞组优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)；在一些实施方案中，联合表达IL21的RUNX3-CAR T细胞组抑瘤效果优于对照组细胞(仅表达RUNX3的CAR T细胞)。
在一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞与化疗药物联合应用。在一些实施方案中，所述化疗药物可以是索拉菲尼(Sorafenib)。
索拉菲尼是第一个被批准用于治疗晚期肝癌的口服化疗药物。化学名为4-(4-3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基苯氧基)-2-甲基吡啶-2-羧酰-4-甲苯磺酸盐，分子式为C21H16ClF3N4O3·C7H8O3S，分子量为637.03。其水溶性差，微溶于乙醇，溶于聚乙烯甘油400(PEG400)。作为一种多酶抑制剂，索拉菲尼能够通过抑制肿瘤细胞中MAPK通路中的多种激酶(如Raf1，BRaf)直接抑制肿瘤细胞增殖。同时，索拉菲尼还可作用于血小板源生长因子受体-β(PDGFR-β)，血管内皮生长因子受体2，3(VEGFR-2,-3)抑制肿瘤新生血管生成来抑制肿瘤生长。本文所述的索拉菲尼能以其本身安全的口服或非口服给药，或者以和药学上可接受的载体赋形 剂及其他添加剂形成的化合物(如片剂、缓释制剂、胶囊剂、注射剂、溶液剂)安全的口服或非口服给药。当口服给药时，组合物可配制成片剂、糖衣剂或胶囊。为制备口服组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为蹦解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗黏合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份蹦解添加剂组成混合物，该混合物与黏合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其他的蹦解剂，润滑剂和抗黏剂将此混合物压片。为增加溶解性可将杂环类衍生物游离后制成药学上可接受的有机酸，较好地为甲磺酸，富马酸等以有利于以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。
本发明中免疫效应细胞和索拉菲尼给予时间不分先后；可以先给予索拉菲尼再给予免疫效应细胞；也可以同时给药；还可以先给予免疫效应细胞再给予索拉菲尼。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在索拉菲尼给予之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在索拉菲尼给予之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。
在一些实施方案中，和索拉菲尼联用的9F2-BBZ-RUNX3 CAR T细胞治疗组抑瘤效果最为显著，其中，5只小鼠中有1只出现肿瘤消退，且小鼠体重无显著变化。
本文所述的嵌合抗原受体多肽可以选自按如下方式顺序连接：
胞外抗原结合区-CD8跨膜区-4-1BB-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区， CD28b代表CD28分子的胞内信号区。
本发明也包括编码所述嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还提供了包含上述嵌合抗原受体的核酸的载体。本发明还包括包含上述载体的病毒。本文所述的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
本发明还提供了嵌合抗原修饰的免疫效应细胞，其被转导有编码所述的嵌合抗原受体的核酸或被转导有上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本文所述的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养免疫效应细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本文所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)，且能够在肿瘤组织中有效存活。因此本文所述的编码嵌合抗原受体的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
本文所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达除了上述嵌合受体以外的另一种嵌合受体，该受体不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。
本文所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫细胞，还可包含药学上可接受 的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如
Figure PCTCN2019085322-appb-000001
润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。
本文所述的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可以采用注射或其它治疗方式。
本发明还提供了包含本发明免疫效应细胞的试剂盒。所述试剂盒可用于治疗或预防癌症以及病原体感染等。在一个实施方案中，试剂盒可以包括含有有效量的包含一种或多种单位剂型的免疫效应细胞的治疗或预防组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含可含有治疗或预防性组合物的无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合于保持药物的材料制成。在一些实施方案中，可以提供本发明的免疫效应细胞，免疫效应细胞给予具有发生癌症以及病原体感染的风险的受试者的说明书。说明书通常将包括关于组合物用于治疗或预防癌症和病原体感染的信息。在一些实施方案中，试剂盒可以包括约1×10 4个细胞至约1×10 6个细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括至少约1×10 5个细胞，至少约1×10 6个细胞，至少约1×10 7个细胞，至少约4×10 7个细胞，至少约5×10 7个细胞，至少约6×10 7个细胞，至少约6×10 7个细胞，8×10 7个细胞，至少约9×10 7个细胞，至少约1×10 8个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×10 8个细胞，至少约4×10 8个细胞，至少约5×10 8个细胞，至少约6×10 8个细胞，至少约6×10 8细胞，至少约8×10 8个细胞，至少约9×10 8细胞，至少约1×10 9个细胞，至少约2×10 9个细胞，至少约3×10 9个细胞，至少约4×10 9个细胞，至少约5×10 9个细胞，至少约6×10 9个细胞，至少约8×10 9个细胞，至少约9×10 9个细胞，至少约1×10 10个细胞，至少约2×10 10个细胞，至少约3×10 10个细胞，至少约4×10 10个细胞，至少约5×10 10个细胞，至少约6×10 10个细胞，至少为ab至少约9×10 10 个细胞，至少约9×10 10个细胞，至少约1×10 11个细胞，至少约2×10 11个细胞，至少约3×10 11个细胞，至少约4×10 11个细胞，至少约5×10 11个细胞，至少约8×10 11个细胞，至少约9×10 11个细胞，或至少约1×10 12个细胞。例如，可以在试剂盒中包括大约5×10 10个细胞。在另一个实例中，试剂盒可以包括3×10 6个细胞；细胞可以扩增至约5×10 10个细胞并施用于受试者。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括同种异体细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括可以包含基因组修饰的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包含“现成的”细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括可以扩展用于临床使用的细胞。在某些情况下，试剂盒可能包含用于研究目的的内容物。
在一些实施方案中，说明书包括以下中的至少一个：治疗剂的描述；用于治疗或预防肿瘤、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的剂量方案和给药；预防措施、警示、禁忌症、过量信息、不良反应、动物药理学、临床研究、和/或引用文献。说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或作为容器上的标签，或作为容器内或容器中提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹打印。在一些实施方案中，说明书提供施用本发明所述的免疫效应细胞用于治疗或预防肿瘤、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的方法。在某些情况下，说明书提供了施用化学治疗剂之前、之后或同时给予本发明的免疫效应细胞的方法。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒中还包含化疗药物。在一些实施方案中，本发明的试剂盒中包含索拉菲尼。
本文所述的优点：
1.本文所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可有效地增加所述免疫效应细胞在肿瘤内的存活及功能；
2.本文所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞对实体瘤也能实现更优异的细胞杀伤，与不共表达RUNX3的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞相比，在体内对实体瘤细胞具备更优异的杀伤效果以及体外扩增性能。
3.本文所述的共表达RUNX3的靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体细胞表达细胞因子如IL15或IL18或IL21后，进一步提高了抗肿瘤的能力。
4.本文所述的共表达RUNX3和靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的细胞与索拉菲尼联用，具有协同抗肿瘤作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本文所述的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本文所述的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、国际专利申请公开号WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018/018958A1中公开的全文内容。
实施例1.表达嵌合抗原受体的T细胞的构建
1.PRRLSIN-hu9F2-28Z、PRRLSIN-hu9F2-BBZ、MSCV-hu8E5-2I-mBBZ质粒及慢病毒的构建
采用本领域常规分子生物学方法，以pRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达人源化抗体hu9F2的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，PRRLSIN-hu9F2-28Z(质粒图见图1A)和PRRLSIN-hu9F2-BBZ(质粒图见图1B)。
hu9F2-28Z序列(SEQ ID NO：57)由CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示)、hu9F2 scFV(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示)、CD8 hinge(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示)、CD28跨膜域(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示)和CD28胞内域(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示)以及CD3的胞内段CD3ξ(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示)组成。将PRRLSIN-hu9F2-28Z转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-28Z。
hu9F2-BBZ(SEQ ID NO：58)序列由CD8α信号肽、hu9F2 scFV、CD8 hinge、CD8跨膜域(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示)和CD137胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示)以及CD3的胞内段CD3ξ组成。将PRRLSIN-hu9F2-BBZ转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ。
以MSCV.pBABE 5为载体，构建了表达二代嵌合抗原受体的逆转录病毒质粒MSCV-hu8E5-2I-mBBZ(质粒图见图1C)。hu8E5-2I-mBBZ序列由鼠CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)、靶向 claudin18.2的scFv(核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)、鼠CD8 hinge和跨膜区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)和鼠4-1BB胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示)以及鼠CD3的胞内段CD3ζ(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示)组成。将MSCV-hu8E5-2I-mBBZ转染293T包装逆转录病毒，得到逆转录病毒hu8E5-2I-mBBZ。
2.pRRLSIN-hu9F2-28Z-F2A-huRUNX3、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL15、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL18、pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL21、MSCV-hu8E5-2I-mBBZ-F2A-mRunX3质粒构建
2.1 PCR克隆目的基因
以pRRLSIN-hu9F2-28Z质粒为模板，引物GC33-28bbz-LF(SEQ ID NO:9)
&CD3Z-F2A-R(SEQ ID NO:10)扩增，得到基因片段F1(SEQ ID NO:11)(hu9F2-28Z，并带上同源臂和部分F2A序列)；
以pUC57-RUNX3-V2质粒(图1D)为模板，引物F2A-RUNX3-F(SEQ ID NO:12)&RUNX-SalI-R(SEQ ID NO:13)扩增基因片段F2(SEQ ID NO:14)(RUNX3带上同源臂)；再以基因片段F2为模板，引物F2A-F(SEQ ID NO:15)&RUNX-SalI-R(SEQ ID NO:13)扩增基因片段F3(SEQ ID NO:16)(F2A-RUNX3带上同源臂)；
以片段F1和F3为模板，进行PCR搭桥拼接全长，引物GC33-28bbz-LF(SEQ ID NO:9)&RUNX-SalI-R(SEQ ID NO:13)扩增，获得全长基因片段hu9F2-28Z-F2A-huRUNX3(SEQ ID NO:17)(图1E)；
以pRRLSIN-hu9F2-BBZ质粒为模板，引物GC33-28bbz-LF(SEQ ID NO:9)&CD3Z-F2A-R(SEQ ID NO:10)扩增基因片段F4(SEQ ID NO:18)(hu9F2-BBZ，并带上同源臂和部分F2A序列)；
以片段F4和F3为模板，进行PCR搭桥拼接全长，引物GC33-28bbz-LF(SEQ ID NO:9)&RUNX-SalI-R(SEQ ID NO:13)扩增，获得全长基因片段hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3(SEQ ID NO:19(图1F)。
2.2酶切获得载体和片段
使用限制性内切酶MluI&SalI进行双酶切载体pRRLSIN-hu9F2-28Z，获得线性 化载体pRRLSIN-MluI&SalI。
使用同源重组酶进行载体pRRLSIN-MluI&SalI与片段hu9F2-28Z-F2A-huRUNX3的环化，形成质粒pRRLSIN-hu9F2-28Z-F2A-huRUNX3。转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-28Z-RUNX3。
使用同源重组酶进行载体pRRLSIN-MluI&SalI与片段hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3的环化，形成质粒pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3。转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ-RUNX3。
MSCV-hu8E5-2I-mBBZ质粒的基础上插入了F2A-mRunx3序列，构建了表达靶向Claudin18.2的二代嵌合抗原受体以及相应的逆转录病毒质粒MSCV-hu8E5-2I-mBBZ-F2A-mRunX3(图G)。F2A-mRunX3由F2A(核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)、mouse RUNX3(核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)组成。将MSCV-hu8E5-2I-mBBZ-F2A-mRunX3分别转染293T包装逆转录病毒，得到逆转录病毒hu8E5-2I-mBBZ-RUNX3。
在pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3质粒的基础上插入了6个连续NFAT(SEQ ID NO：37)和IL15(核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示)，构建了质粒hu9F2-BBZ-RUNX3-IL15(质粒图如图1H所示)。转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ-RUNX3-IL15。
在pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3质粒的基础上插入了6个连续NFAT(SEQ ID NO：37)和IL18(核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示)，构建了质粒hu9F2-BBZ-huRUNX3-IL18(质粒图如图1I所示)。转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ-huRUNX3-IL18。
在pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3质粒的基础上插入了6个连续NFAT(SEQ ID NO：37)和IL21(核苷酸序列如SEQ ID NO：35，氨基酸序列如SEQ ID NO：36)，构建了质粒pRRLSIN-hu9F2-BBZ-F2A-huRUNX3-NFAT-IL21(质粒图如图1J所示)。转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ-huRUNX3-IL21。
采用同上方法，以pRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了慢病毒质粒，PRRLSIN-hu9F2-BBZ(CD28TM)-F2A-huRUNX3(质粒图如图1K所示)。hu9F2-BBZ(CD28TM)-F2A-huRUNX3序列由CD8α信号肽、hu9F2 scFV、CD8 hinge、CD28跨膜域和CD137胞内信号结构域、CD3的胞内段CD3ξ以及F2A(核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)、人RunX3(核苷 酸序列如SEQ ID NO：50所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示)组成。将PRRLSIN-hu9F2-BBZ(CD28TM)-F2A-huRUNX3转染293T包装慢病毒，得到慢病毒hu9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3。
2.3 T细胞活化：取人PBMC培养于AIM-V培养基，添加2％人AB型血清，500U/mL重组人IL-2，并加入CD3/CD28抗体结合磁珠活化48h。将所得的慢病毒hu9F2-28Z、hu9F2-BBZ、hu9F2-28Z-RUNX3、hu9F2-BBZ-RUNX3、hu9F2-BBZ-RUNX3-IL15、hu9F2-BBZ-huRUNX3-IL18、hu9F2-BBZ-huRUNX3-IL21、hu9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3分别感染活化的T细胞，得到9F2-28Z CART细胞、9F2-BBZ CART细胞、9F2-28Z-RUNX3 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL15 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL18 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL21 CART细胞、9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3 CART细胞。
C57BL/6小鼠的脾脏T淋巴细胞，将纯化的小鼠CD3 +T淋巴细胞按1：1的体积比加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28，PBS清洗一次，活化，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基，添加10％FBS血清。将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于重组人纤维蛋白片段包被的12孔板中，分别加入逆转录病毒hu8E5-2I-mBBZ和hu8E5-2I-mBBZ-RUNX3感染12小时，随后培养扩增至需要的数量，得到hu8E5-2I-mBBZ CAR T细胞、hu8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CAR T细胞。
实施例2.体外CAR-T细胞表型检测
根据细胞表型表达的不同，可以将记忆性T细胞分为两种类型：中枢性记忆性T细胞(Tcm)和效应性记忆性T细胞(Tem)。中枢性记忆性T细胞与初始T细胞有类似的地方，高表达淋巴归巢分子L-选择素(CD62L)。记忆性干细胞样T细胞是一群CD8+T细胞，这群细胞低表达透明质烷受体CD44和高表达CD62L以及干细胞抗原Sca-1。
取感染四天的hu8E5-2I-mBBZ CART细胞和hu8E5-2I-mBBZ-RunX3 CAR-T细胞进行Tcm(中枢性记忆性T细胞)以及Tscm(记忆性干细胞样T细胞)的检测，利用抗体染色进行流式检测，结果如图2所示。
从流式结果图2中可以看出，不同CAR-T细胞CD8阳性的细胞中表达CD62L和CD44的Tcm，以及低表达CD44、高表达CD62L和Sca-1的Tscm的比例都没 有明显差别。
实施例3.靶向GPC3阳性细胞的体外杀伤毒性检测
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
1.表达RUNX3的CAR T细胞
效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced(UTD)T细胞、9F2-28Z CART细胞、9F2-BBZ CART细胞、9F2-28Z-RUNX3 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞于96孔板。
靶细胞：分别接种50μL 2×10 5/mL的(GPC3表达阳性)Huh7与PLC/PRF/5细胞、(GPC3表达阴性)SK-HEP-1细胞到相应的96孔板。
每组均设置5个复孔。将培养板置于细胞培养箱中孵育18h。
其中各实验组及各对照组设置如下：实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞；对照组1：靶细胞最大释放LDH；对照组2：靶细胞自发释放LDH；对照组3：效应细胞自发释放LDH。计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。实验结果如图3A所示。
上述CAR-T与对照组UTD相比，对GPC3表达阳性的Huh7与PLC/PRF/5细胞在效靶比为3:1和1:1都有显著的毒性杀伤作用，在效靶比为1:3时，基本都没有杀伤。对GPC3表达阴性的SK-HEP-1细胞也几乎未有杀伤作用。其中9F2-28Z-RUNX3 CART组以及9F2-BBZ-RUNX3 CART组的杀伤效果与9F2-28Z CART组的毒性杀伤效果相当；但是均显著优于9F2-BBZ CART组毒性杀伤效果。
2.联合表达RUNX3和细胞因子的CAR T细胞
效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced(UTD)、9F2-BBZ CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL15 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL18 CART细胞、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL21 CART细胞于96孔板。
靶细胞：分别接种50μL 2×10 5/mL的(GPC3表达阳性)Huh7与PLC/PRF/5细胞、(GPC3表达阴性)SK-HEP-1细胞到相应的96孔板。
每组均设置5个复孔。将培养板置于细胞培养箱中孵育18h。
其中各实验组及各对照组设置如下：实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受 体的T淋巴细胞；对照组1：靶细胞最大释放LDH；对照组2：靶细胞自发释放LDH；对照组3：效应细胞自发释放LDH。计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。实验结果如图3B所示。
CAR-T与对照组UTD相比，对高表达GPC3的huh7,在效靶比为3:1与和1：1时,联合表达IL15、IL18、IL21的CAR T细胞组优于9F2-BBZ-RUNX3 CAR T细胞组；对中度表达GPC3的PLC/PRF/5，在效靶比为3:1与和1：1时,联合表达IL-18与IL-21的CAR-T细胞组优于其他细胞组。
实施例4.靶向claudin18.2阳性细胞的体外杀伤毒性检测
具体方法参照实施例3。
效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced(UTD)T细胞、hu8E5-2I-mBBZ CART细胞、hu8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CAR-T细胞于96孔板。
靶细胞：分别接种50μL 2×10 5/mL的小鼠胰腺癌细胞系PANC02-A2(claudin18.2表达阳性)与PANC02(claudin18.2表达阴性)细胞到相应的96孔板。
实验结果如图4所示，与hu8E5-2I-mBBZ CART细胞相比，表达RUNX3的CAR-T细胞对claudin18.2表达阳性的PANC02-A2在效靶比为3:1和1:1都有显著的毒性杀伤作用，对claudin18.2表达阴性的PANC02细胞也几乎未有杀伤作用。
实施例5.GPC3阳性细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验
1.PLC/PRF/5肝癌细胞小负荷皮下移植瘤模型
1)实验分组：B-NDG小鼠(百奥赛图)6-8周龄随机分为5组，每组5只，分别为Untransduced(UTD)、9F2-28Z CART细胞对照组、9F2-BBZ CART细胞对照组、9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3 CART细胞治疗组、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1.5×10 7/mL，用注射器在B-NDG小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种3×10 6的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)CAR-T细胞回输：当肿瘤平均体积约为158mm 3时，即接种肿瘤后第11天， 注射2.5×10 6/只CAR-T细胞或未经转导的T细胞对照。
下瘤的体积变化情况，瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽 2)/2，结果如图图5A所示。实验结果如
给予小鼠安乐死处理，剥离皮下瘤，称量肿瘤重量，结果如图5B所示。
参照对照组计算肿瘤抑制率，CAR T注射后27天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：9F2-28Z CART组：85.09％，9F2-BBZ CART组：66.78％，9F2-BBZ-RUNX3 CART组：97.71％(5只小鼠有4只出现肿瘤消退)，9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3 CART组：98.83％(5只小鼠有4只出现肿瘤消退)。
给予CAR-T细胞后，各组小鼠的体重变化曲线如图5C所示，9F2-28Z和9F2-BBZ组小鼠体重与UTD相比稍有降低，9F2-BBZ(CD28TM)-RUNX3以及9F2-BBZ-RUNX3治疗组小鼠体重具有生长优势。
2.PLC/PRF/5肝癌细胞大负荷皮下移植瘤模型
1)实验分组：NPG(维通达)小鼠6-8周龄随机分为5组，每组5只，分别为Untransduced(UTD)、9F2-28Z CART细胞对照组、9F2-BBZ CART细胞对照组、9F2-28Z-RUNX3 CART细胞治疗组、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1.5×10 7/mL，用注射器在NPG小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种3×10 6的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)CAR-T细胞回输：当肿瘤平均体积约为260mm 3时，即接种肿瘤后第14天，注射2.0×10 6/只CAR-T细胞或未经转导的T细胞对照。
每周测量并记录两次小鼠皮下瘤的体积变化情况，瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽 2)/2，结果如图图6A所示。
6B所示。参照对照组计算肿瘤抑制率，CAR T注射后18天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：9F2-28Z CART组：40.50％，9F2-BBZ CART组：56.95％，9F2-28Z-RUNX3 CART组：77.69％，9F2-BBZ-RUNX3 CART组：83.68％。
给予CAR-T细胞后，各组小鼠的体重变化曲线如图6C所示，9F2-28Z组小鼠体重与UTD相比稍有降低，9F2-28Z-RUNX3以及9F2-BBZ-RUNX3治疗组小鼠体重具有生长优势。
实施例6.联合细胞因子对GPC3阳性细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验
PLC/PRF/5皮下移植瘤模型
1)实验分组：NPG小鼠6-8周龄随机分为6组，每组5只，分别为Untransduced(UTD)、9F2-BBZ CART细胞对照组、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞治疗组、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL15 CART细胞治疗组、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL18 CART细胞治疗组、9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL21 CART细胞治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1.5×10 7/mL，用注射器在NPG小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种3×10 6的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)注射CAR T：皮下接种肿瘤细胞后D14天，肿瘤平均体积约260mm 3。注射CAR T细胞，注射剂量：2.0×10 6/只。
CAR T注射后D18天，UTD组肿瘤体积已达2000mm 3，将小鼠实施安乐死。图7A、7B可见，与二代CAR T相比，携带RUNX3以及细胞因子的CAR T均具有一定的治疗优势，图7B为小鼠剥取的肿瘤称重重量，与UTD对照组相比，各组抑瘤率均为：9F2-BBZ：56.95％，9F2-BBZ-RUNX3：83.68％，9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL15：90.25％(5只小鼠中有1只出现肿瘤消退)，9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL18：90.64％，9F2-BBZ-RUNX3-NFAT-IL21：90.34％。
说明同时携带RUNX3和细胞因子IL15、IL18或IL21的CAR T细胞组抑瘤效果最好，其中，同时携带RUNX3和细胞因子IL15的CAR T细胞组中5只小鼠中有1只出现肿瘤消退；单独携带RUNX3的CAR T细胞组的抑瘤效果其次。
图7C可见，小鼠体重与UTD相比，各治疗组小鼠体重均具有一定的生长优势，可能受益于CAR T较好的抑瘤效果。
实施例7.靶向claudin18.2阳性细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗
PANC02-A2皮下移植瘤模型
1)实验分组：C57BL/6小鼠6-8周龄随机分组，每组5-6只、分别为Untransduced(UTD)T细胞、hu8E5-2I-mBBZ CART细胞、8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CAR-T(或称为mBBZ-mRunX3)细胞治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的 PANC02-A2细胞，用PBS洗涤1次后，调整细胞密度为6×10 6/mL，用注射器在C57BL/6小鼠右侧腋部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种1.2×10 6的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)CAR-T细胞回输：皮下接种肿瘤细胞后D11天，肿瘤平均体积约150mm 3。注射CAR T细胞，注射剂量：5×10 6/只。
肿瘤体积的曲线图如图8所示，显示共表达RUNX3显示出更优异的抗肿瘤效果。
计算各组的抑瘤率，CAR-T注射后14天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：hu8E5-2I-mBBZ CART组：38.08％，hu8E5-2I-mBBZ-mRunX3 CART组组：51.8％。
实施例8.联合索拉菲尼对GPC3阳性细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验
PLC/PRF/5皮下移植瘤模型
1)实验分组：NPG小鼠6-8周龄随机分为6组，每组5只，分别为UTD组、溶媒组、索拉菲尼(Sorafenib)组、9F2-BBZ CART细胞组、9F2-BBZ-RUNX3 CART细胞组、9F2-BBZ-RUNX3+Sorafenib联合治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的PLC/PRF/5细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1.5×10 7/mL，用注射器在NPG小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种3×10 6的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)注射CAR T：皮下接种肿瘤细胞后D14天，肿瘤平均体积约260mm 3。注射CAR T细胞，注射剂量：2.0×10 6/只。皮下接种肿瘤细胞后D1-D14天，进行索拉菲尼或灌胃，给药剂量为75mg/kg，灌胃体积200ul,每天1次，连续灌胃14天，同时以溶媒作为阴性对照。
CAR T注射后D18天，UTD组肿瘤体积已达2000mm3，将小鼠实施安乐死。图9A、9B可见，9F2-BBZ-RUNX3以及9F2-BBZ-RUNX3联合Sorafenib治疗组均具有明显杀伤肿瘤的效果，图9C为小鼠剥取的肿瘤称重重量。与UTD对照组相比，9F2-BBZ-RUNX3+Sorafenib联合治疗组抑瘤效果最为显著，抑瘤率分别为：溶媒组：23.37％，Sorafenib治疗组：27.38％，9F2-BBZ：56.95％，9F2-BBZ-RUNX3：83.68％，9F2-BBZ-RUNX3+Sorafenib治疗组：95.45％(5只小鼠中有1只出现肿瘤消退)。
溶媒组与Sorafenib治疗组小鼠体重与UTD相比,在治疗起始，肿瘤体重有所下降，考虑溶媒组与Sorafenib对小鼠肯能有一定的毒副作用，但在治疗终点体重有所恢复。9F2-BBZ-RUNX3+Sorafenib联合治疗组与UTD相比无显著变化,9F2-BBZ以及9F2-BBZ-RUNX3治疗组小鼠体重具有一定的生长优势，可能受益于该CAR T较好的抑瘤效果。
实施例9.体外细胞因子检测
将Untransduced(UTD)T细胞、9F2-28Z CART细胞、9F2-BBZ CAR T细胞、9F2-28Z-RUNX3 CAR T细胞、9F2-BBZ-RUNX3 CAR T与肝癌细胞系Huh-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1细胞按照效靶比1:1共孵24h后收上清后采用CBA方法流式检测上清中细胞因子IL-2，TNF，IFN-γ的分泌水平。
图10可见，IL-2，TNF，IFN-γ细胞因子的释放中BBZ形式的CAR T细胞因子释放量优于28Z形式的CAR T(9F2-BBZ优于9F2-28Z；9F2-BBZ-RUNX3优于9F2-28Z-RUNX3)。此外，IL-2，TNF，IFN-γ三种细胞因子在GPC3阳性细胞中释放较高，其中Huh-7细胞中释放最高，在GPC3阴性细胞SK-HEP-1细胞中几乎没有释放。
实施例10 Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤模型的抗肿瘤治疗
1、9F2-mBBZ CAR T细胞和9F2-mBBZ-mRunX3 CAR T细胞的制备
参照实施例1的操作，制备9F2-mBBZ CAR T细胞和9F2-mBBZ-mRunX3 CAR-T细胞。
以MSCV.pBABE 5为载体，构建逆转录病毒质粒MSCV-9F2-mBBZ。9F2-mBBZ序列由鼠CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)、scFv(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)、鼠CD8 hinge和跨膜区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)和鼠4-1BB胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示)以及鼠CD3的胞内段CD3ζ(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示)组成。将MSCV-9F2-mBBZ转染293T包装逆转录病毒，得到逆转录病毒9F2-mBBZ。
在MSCV-9F2-mBBZ质粒的基础上插入了F2A-mRunx3序列，构建了表达CAR及RUNX3的逆转录病毒质粒MSCV-9F2-mBBZ-mRunX3。F2A-mRunX3由F2A(核 苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)、mouse RUNX3(核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)组成。将MSCV-9F2-mBBZ-mRunX3转染293T包装逆转录病毒，得到逆转录病毒9F2-mBBZ-mRunX3。
取C57BL/6小鼠的T细胞，活化后分别感染逆转录病毒9F2-mBBZ和9F2-mBBZ-mRunX3，得到9F2-mBBZ CAR T细胞和9F2-mBBZ-mRunX3 CAR T细胞。
2、Hepa1-6-GPC3皮下移植瘤模型的杀伤
1)实验分组：将免疫完善小鼠C57BL/6小鼠6-8周龄随机分组，每组5-6只、分别为Untransduced(UTD)T细胞、9F2-mBBZ CAR T细胞、9F2-mBBZ-mRunX3 CAR-T(或称为mBBZ-mRunX3)细胞治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的Hepa1-6-GPC3细胞，用PBS洗涤1次后，调整细胞密度为5×10 7/mL，用注射器在C57BL/6小鼠右侧腋部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种1×10 7的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)CAR-T细胞回输：皮下接种肿瘤细胞后D6天，肿瘤平均体积约300mm3。注射CAR T细胞，注射剂量：1.5×10 6/只。
每周测量并记录两次小鼠皮下瘤的体积变化情况，瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽 2)/2，结果如图11所示。
参照对照组计算肿瘤抑制率，CAR-T注射后20天，与UTD对照组相比，各组均见明显抑瘤效果，抑制率分别为：9F2-mBBZ CART组：70.7％，9F2-mBBZ-mRunX3 CART组：95.8％。
给予小鼠安乐死处理，剥离皮下瘤，称量肿瘤重量，结果如图12所示。
监测小鼠的体重变化，结果如图13所示，9F2-BBZ组和9F2-mBBZ-mRunX3 CART组小鼠体重与UTD相比无显著差异。
实施例11免疫效应细胞中RUNX3的表达水平。
收集细胞后抽提细胞蛋白，取20μg相应细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。使用5％牛奶封闭液室温封闭1小时，然后孵育anti-RUNX3抗体和GAPDH抗体，4℃放置过夜。一抗敷育结束后，用0.1％PBST洗涤三次，之后，孵育羊抗鼠IgG(H&L)-HRP抗体，室温放置1小时。洗涤后使用Super Signal West Pico化学发光 检测试剂盒进行显色成像。如图14中所示，将本发明的免疫效应细胞与9F2-28Z-RUNX3、9F2-BBZ-RUNX3与未转染RUNX3的免疫效应细胞相比，本发明的免疫效应细胞中RUNX3的表达水平提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本文所述的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure PCTCN2019085322-appb-000002
Figure PCTCN2019085322-appb-000003
Figure PCTCN2019085322-appb-000004
Figure PCTCN2019085322-appb-000005
Figure PCTCN2019085322-appb-000006
Figure PCTCN2019085322-appb-000007
Figure PCTCN2019085322-appb-000008
Figure PCTCN2019085322-appb-000009
Figure PCTCN2019085322-appb-000010
Figure PCTCN2019085322-appb-000011
Figure PCTCN2019085322-appb-000012
Figure PCTCN2019085322-appb-000013
Figure PCTCN2019085322-appb-000014
Figure PCTCN2019085322-appb-000015
Figure PCTCN2019085322-appb-000016
Figure PCTCN2019085322-appb-000017
Figure PCTCN2019085322-appb-000018

Claims (52)

  1. 一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达结合抗原的外源性受体，并且表达提高的水平的RUNX3或者外源性的RUNX3。
  2. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为免疫效应细胞。
  3. 如权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。
  4. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的RUNX3是全长人RUNX3或具有与全长人RUNX3相同功能的人RUNX3的片段。
  5. 如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述的RUNX3与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少90％的同一性。
  6. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述RUNX3是组成型表达。
  7. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述RUNX3是诱导型表达。
  8. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的抗原是肿瘤抗原或病原体抗原，优选的是肿瘤抗原。
  9. 如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述的肿瘤抗原是实体瘤抗原。
  10. 如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述肿瘤抗原为GPC3或claudin18.2。
  11. 如权利要求1-10任一所述的细胞，其特征在于，所述受体为嵌合受体，选自：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。
  12. 如权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述受体为嵌合抗原受体。
  13. 如权利要求12所述的细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的细胞内结构域含有CD137的胞内共刺激信号域。
  14. 如权利要求1-13任一所述的细胞，其特征在于，所述受体的胞外域具有SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:22所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
  15. 如权利要求1-14任一所述的细胞，其特征在于，所述受体的胞内域含有SEQ ID NO:47所示的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
  16. 如权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述受体的胞内域还具有SEQ ID NO:46或者SEQ ID NO:49所示的至少90％同一性的氨基酸序列，或者含有SEQ  ID NO:46和SEQ ID NO:49所示的至少90％同一性的氨基酸序列。
  17. 如权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述细胞含有与SEQ ID NO:17、19、53、54、55、或56具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。
  18. 如权利要求1-17任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达外源性细胞因子受体结合蛋白，或外源性细胞因子或其多肽。
  19. 如权利要求18所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达外源性细胞因子。
  20. 如权利要求18所述的细胞，其特征在于，所述外源性细胞因子受体结合蛋白能特异性结合相应的细胞因子受体且增强受体活性。
  21. 如权利要求18所述的细胞，其特征在于，所述外源性细胞因子或其多肽能特异性结合相应的细胞因子受体且增强受体活性。
  22. 如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述的细胞因子与SEQ ID NO:39、41或36所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
  23. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％。
  24. 如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述RUNX3的表达水平相对于野生型提高的量足以提高所述细胞在非淋巴部位的滞留。
  25. 如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述的细胞因子为组成型表达。
  26. 如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述细胞因子是诱导型表达。
  27. 如权利要求1-26任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞表达外源性RUNX3。
  28. 如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述受体和/或RUNX3利用病毒载体表达；较佳地，所述的病毒载体包括：慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。
  29. 一种表达构建物，其特征在于，该表达构建物包括顺序连接的：结合抗原的受体的表达盒1和RUNX3的表达盒2，其中所述表达盒之间任选地由选自F2A、PA2、T2A、和/或E2A的串联片段连接。
  30. 如权利要求29所述的表达构建物，其特征在于，所述的结合抗原的受体的表达盒含有编码SEQ ID NO:57、58、59、60、61、或62所示的序列的核酸序 列，所述的RUNX3的表达盒具有编码SEQ ID NO:20所示的序列的核酸序列。
  31. 如权利要求29所述的表达构建物，其特征在于，所述表达构建物还含有表达盒3，所述表达盒3含有编码细胞因子的核酸序列，所述细胞因子的序列是与SEQ ID NO:36、39、或41所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
  32. 一种表达载体，其包含权利要求29-31所述的表达构建物。
  33. 一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求32所述的表达载体。
  34. 一种提高表达嵌合受体的免疫效应细胞在个体中的活力的方法，其特征在于，在免疫效应细胞中提高RUNX3的表达水平。
  35. 一种提高表达嵌合受体的免疫效应细胞在个体中的活力的方法，其特征在于，通过使所述免疫效应细胞表达外源性的RUNX3来提高所述免疫效应细胞中RUNX3的表达水平。
  36. 如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述的RUNX3是全长人RUNX3或具有与全长人RUNX3相同功能的人RUNX3的片段。
  37. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述的RUNX3与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少90％同一性。
  38. 如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述RUNX3是组成型表达。
  39. 如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述RUNX3是诱导型表达。
  40. 如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述免疫效应细胞还共表达细胞因子。
  41. 如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，还给予所述个体细胞因子。
  42. 如权利要求34-41所述的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞为T细胞。
  43. 如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述的嵌合受体为嵌合抗原受体。
  44. 如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，还给予所述个体化疗药物。
  45. 权利要求1-27任一所述的细胞，或权利要求29-31任一所述的表达构建物，或权利要求33所述的病毒在制备用于抑制肿瘤或抑制病原体的药物中的应用。
  46. 一种用于抑制肿瘤或抑制病原体的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-27任一所述的细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。
  47. 用于治疗肿瘤或病原体感染的药盒，其特征在于，所述药盒中包含：权利 要求1-27任一所述的细胞或权利要求46所述的药物组合物。
  48. 表达提高的水平的RUNX3或者外源性RUNX3并且表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的免疫效应细胞和化疗药物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
  49. 根据权利要求48所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括索拉菲尼。
  50. 如权利要求47所述的应用，其特征在于，所述肿瘤抗原为GPC3或claudin18.2。
  51. 如权利要求47-48所述的应用，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。
  52. 治疗有此需要的患者中的肿瘤的方法，包括向所述患者提供如权利要求1-27之一所述的细胞。
PCT/CN2019/085322 2018-05-03 2019-04-30 免疫效应细胞及其应用 WO2019210863A1 (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980030101.4A CN112074600A (zh) 2018-05-03 2019-04-30 免疫效应细胞及其应用
US17/052,425 US20220127570A1 (en) 2018-05-03 2019-04-30 Immune effector cell and use thereof
EP19797057.7A EP3789486A4 (en) 2018-05-03 2019-04-30 MANIPULATED IMMUNE EFFECTOR CELLS AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810415367.8 2018-05-03
CN201810415367 2018-05-03
CN201811038855 2018-09-06
CN201811038855.8 2018-09-06
CN201811431644 2018-11-27
CN201811431644.0 2018-11-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019210863A1 true WO2019210863A1 (zh) 2019-11-07

Family

ID=68386308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2019/085322 WO2019210863A1 (zh) 2018-05-03 2019-04-30 免疫效应细胞及其应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220127570A1 (zh)
EP (1) EP3789486A4 (zh)
CN (1) CN112074600A (zh)
WO (1) WO2019210863A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3747433A4 (en) * 2018-02-02 2021-12-22 Cafa Therapeutics Limited CELLULAR IMMUNOTHERAPY ASSOCIATION
WO2022028623A1 (zh) 2020-08-07 2022-02-10 佧珐药业有限公司 工程化改造的细胞以及工程化改造细胞的方法
WO2022214089A1 (zh) 2021-04-08 2022-10-13 克莱格医学有限公司 细胞免疫治疗的应用
WO2023274303A1 (zh) 2021-06-29 2023-01-05 科济生物医药（上海）有限公司 调控细胞生理活动的嵌合多肽

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117288933A (zh) * 2023-09-21 2023-12-26 桂林医学院附属医院 检测car-t细胞杀伤力的方法

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CN104140974A (zh) 2013-05-08 2014-11-12 上海益杰生物技术有限公司 编码gpc-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc-3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2015172339A1 (zh) 2014-05-14 2015-11-19 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN105194661A (zh) 2014-06-26 2015-12-30 科济生物医药（上海）有限公司 时空可调性抑制病理性靶细胞的系统
CN105315375A (zh) 2014-07-17 2016-02-10 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN105713881A (zh) 2014-12-04 2016-06-29 科济生物医药（上海）有限公司 双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用
CN106146666A (zh) 2015-03-26 2016-11-23 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
CN106397593A (zh) 2015-08-03 2017-02-15 科济生物医药（上海）有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白多糖‑3的抗体及其应用
CN106467573A (zh) 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞
CN106519037A (zh) 2015-09-11 2017-03-22 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
CN106554414A (zh) 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN107058354A (zh) 2013-04-01 2017-08-18 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2018006882A1 (zh) 2016-07-08 2018-01-11 科济生物医药（上海）有限公司 抗密蛋白18a2的抗体及其应用
WO2018018958A1 (en) 2016-04-22 2018-02-01 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Compositions and methods of cellular immunotherapy
WO2018115865A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Autolus Limited Cell expressing a car and a transcription factor and its use

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100475649B1 (ko) * 2001-01-29 2005-03-10 배석철 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３ 유전자 및 그의 용도
GB201621891D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Autolus Ltd Transcription system
CN109111528B (zh) * 2018-09-20 2021-06-22 杭州普略生物科技有限公司 以msln为靶点的嵌合抗原受体
CN109096405B (zh) * 2018-09-20 2021-07-09 杭州普略生物科技有限公司 以gd2为靶点的嵌合抗原受体及药物组合物

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195B1 (zh) 1986-01-30 1990-11-27 Cetus Corp
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CN107058354A (zh) 2013-04-01 2017-08-18 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN104140974A (zh) 2013-05-08 2014-11-12 上海益杰生物技术有限公司 编码gpc-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc-3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN107460201A (zh) 2013-05-08 2017-12-12 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2015172339A1 (zh) 2014-05-14 2015-11-19 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN105194661A (zh) 2014-06-26 2015-12-30 科济生物医药（上海）有限公司 时空可调性抑制病理性靶细胞的系统
CN105315375A (zh) 2014-07-17 2016-02-10 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN105713881A (zh) 2014-12-04 2016-06-29 科济生物医药（上海）有限公司 双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用
CN106146666A (zh) 2015-03-26 2016-11-23 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
CN106397593A (zh) 2015-08-03 2017-02-15 科济生物医药（上海）有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白多糖‑3的抗体及其应用
CN106467573A (zh) 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞
CN106519037A (zh) 2015-09-11 2017-03-22 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
CN106554414A (zh) 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
WO2018018958A1 (en) 2016-04-22 2018-02-01 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Compositions and methods of cellular immunotherapy
WO2018006882A1 (zh) 2016-07-08 2018-01-11 科济生物医药（上海）有限公司 抗密蛋白18a2的抗体及其应用
WO2018115865A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Autolus Limited Cell expressing a car and a transcription factor and its use

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. AAA62478.2
"Genbank", Database accession no. NP_001002026
"Hand book Of Experimental Immunology", vol. 1-4, 1986, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology", vol. 154-155, 1987, ACADEMIC PRESS, INC.
B. PERBAL: "A Practical Guide To Molecular Cloning", 1984
DAVIES JK. ET AL.: "Combining CD 19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies", CANCER RES, vol. 70, no. 10, 2010, pages 1 - 10, XP055250493, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-3845
FREDERICK M. AUSUBEL: "Current Protocols in Molecular Biology", 2000, WILEY AND SON INC, LIBRARY OF CONGRESS
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning Experiment Guide", 2002, SCIENCE PRESS
KAZUYOSHI, K. H. ET AL.: "Overexpression of the Runx3 Transcription Factor Increases the Proportion of Mature Thymocytes of the CD 8 Single-Positive Lineage", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 5, no. 174, 1 March 2005 (2005-03-01), pages 2627 - 2636, XP055649257 *
MJ GAITED., OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, 1984
RI FRESHNEY: "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells", vol. 185, 1987, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, article "Gene Expression Technology"
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP3789486A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3747433A4 (en) * 2018-02-02 2021-12-22 Cafa Therapeutics Limited CELLULAR IMMUNOTHERAPY ASSOCIATION
WO2022028623A1 (zh) 2020-08-07 2022-02-10 佧珐药业有限公司 工程化改造的细胞以及工程化改造细胞的方法
WO2022214089A1 (zh) 2021-04-08 2022-10-13 克莱格医学有限公司 细胞免疫治疗的应用
WO2023274303A1 (zh) 2021-06-29 2023-01-05 科济生物医药（上海）有限公司 调控细胞生理活动的嵌合多肽

Also Published As

Publication number Publication date
CN112074600A (zh) 2020-12-11
EP3789486A4 (en) 2022-03-30
EP3789486A1 (en) 2021-03-10
US20220127570A1 (en) 2022-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101890638B1 (ko) Car 발현 벡터 및 car 발현 t 세포
US20220127372A1 (en) Tcr fusion protein and cell expressing tcr fusion protein
WO2019210863A1 (zh) 免疫效应细胞及其应用
WO2019219029A1 (zh) 基因工程化的细胞及应用
EP3331913A1 (en) Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
WO2019052562A1 (zh) Il-4r的融合蛋白及其应用
WO2021057906A1 (zh) 表达il-15的免疫效应细胞
US20230143947A1 (en) Immune effector cell in which expression is regulated by cytokines
US20220152101A1 (en) Cellular immunotherapy combination
CN110468105B (zh) 表达il-18r结合蛋白的免疫效应细胞
WO2020057641A1 (zh) 表达有趋化因子的细胞及用途
CN110438082B (zh) 表达il-21r结合蛋白的免疫效应细胞
WO2021232200A1 (en) Il-12 armored immune cell therapy and uses thereof
WO2021027785A1 (zh) 共表达趋化因子受体的免疫效应细胞
US20220133792A1 (en) Signaling platforms for chimeric antigen receptor t cells
WO2022095903A1 (zh) 靶向pd-1h(vista)的抗肿瘤免疫治疗方法
WO2022033483A1 (zh) 多功能的免疫效应细胞及其应用
WO2023235440A2 (en) Compositions and methods comprising chimeric adaptor polypeptides
WO2022037562A1 (en) Engineered immunoresponsive cells and uses thereof
EP4194472A1 (en) Chimeric antigen receptor comprising novel co-stimulatory domain and use thereof
US20230321242A1 (en) Chimeric antigen receptor (car)-expressing cells recognizing cea
JP2023540022A (ja) チェックポイント阻害分子及び免疫刺激性サイトカインをコードするキメラ抗原受容体構築物、並びにＣＤ４４ｖ６を認識するＣＡＲ発現細胞
WO2022057941A1 (zh) 表达il-7r结合蛋白的免疫效应细胞
CN113490689B (zh) Tcr融合蛋白及表达tcr融合蛋白的细胞

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19797057

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019797057

Country of ref document: EP

Effective date: 20201203