WO2019065901A1 - びまん性大細胞型b細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法及びキット - Google Patents

びまん性大細胞型b細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法及びキット Download PDF

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Abstract

びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法。

Description

びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法及びキット

 本発明は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法、及びキットに関する。
 本願は、2017年9月29日に出願された米国特許仮出願62/565,123に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

 全リンパ腫の3割強を占める最大病型であるびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(diffuse large B-cell lymphoma;以下、DLBCLともいう)の標準治療であるR-CHOPに対する反応性は多様であり、初発時に予後良好又は治療抵抗症例を精確に予測する層別化システムの構築が重要である。現在、予後層別化方法として、腫瘍B細胞の分化段階(COO;Cell-of-origin)に基づく分類(以下、COO分類ともいう)が主流である(非特許文献1)。

 しかしながら、最近の大規模臨床試験の結果では、COO分類に基づく層別化が必ずしも予後を反映していなかった(例えば、非特許文献2)。

Nature 403, 503-511 (2000) J. Clin. Oncol. 35(22), 2515-2526 (2017)


 R-CHOP療法の予後層別化において、従来の腫瘍B細胞のCOO分類に基づく層別化が必ずしも予後を反映していないため、COO分類による層別化では、DLBCL患者に対するR-CHOP等の化学療法の治療効果を予測できないという問題がある。
 本発明は、リンパ腫微小環境特性に基づく、DLBC患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法及びキットを提供することを目的とする。

 本発明者らは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の微小環境(microenvironment)細胞由来の遺伝子の発現により層別化でき、前記化学療法の効果を予測することができることを見出し、本発明を完成させた。

 本発明は、以下の態様を有する。
[1]びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、
 前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、
 前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、
を含む方法。
[2]前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのmRNA発現量の測定である、[1]に記載の方法。
[3]前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程が、前記マーカーのmRNA発現量が、ROC解析により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程である、[2]に記載の方法。
[4]前記化学療法が、抗CD20抗体併用化学療法である、[1]~[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]前記T細胞のマーカーが、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[1]~[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]前記T細胞が、濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh細胞)である、[1]~[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]前記Tfh細胞のマーカーが、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[6]に記載の方法。
[8]前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)及びNOD2からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[1]~[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]前記間質細胞のマーカーが、BMP2K、COL8A2、FGFR1及びOBSCNからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[1]~[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、
T細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキット。
[11]前記マーカーの発現を測定する試薬が、前記マーカーのmRNA発現量を測定する試薬である、[10]に記載のキット。
[12]前記化学療法が、抗CD20抗体併用化学療法である、[10]又は[11]に記載のキット。
[13]前記T細胞のマーカーが、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[10]~[12]のいずれか一項に記載のキット。
[14]前記T細胞が、濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh細胞)である[10]~[13]のいずれか一項に記載のキット。
[15]前記Tfh細胞のマーカーが、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[14]に記載のキット。
[16]前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)及びNOD2からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[10]~[15]のいずれか一項に記載のキット。
[17]前記間質細胞のマーカーが、BMP2K、COL8A2、FGFR1及びOBSCNからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、[10]~[16]のいずれか一項に記載のキット。

 本発明によれば、DLBLC患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法、及びキットを提供することができる。

DLBCL患者からのFFPEサンプルの48の代表的な遺伝子の発現レベルを、nCounter(登録商標)システムを用いて解析した図である。 R-CHOP療法後、予後良好、又は、予後不良となったそれぞれ15名のDLBCL患者の生存曲線を示した図である。 DLBCL患者からのFFPE組織における、予後良好と予後不良を示す症例間で発現が異なる免疫系、ガン経路系、及び、キナーゼ系に関連する遺伝子を示した図である。図中の「Regulation」の欄において、「up」は予後不良患者で発現が上昇した遺伝子、「down」は予後不良患者で発現が減少した遺伝子をそれぞれ示す。 DLBCL患者からのFFPE組織における、予後良好と予後不良を示す症例間で発現が異なる免疫系、ガン経路系、及び、キナーゼ系に関連する遺伝子の数を示した図である。 本発明におけるnCounterシステムを用いた場合のDLBCL患者の遺伝子発現解析の全体像を示した図である。 トランスクリプトーム解析により抽出された予後因子候補の遺伝子を示した図である。 予後因子候補の遺伝子の遺伝子オントロジー分析の結果を示した図である。 統計学的有意性(マン-ホウィットニーU検定からの-log10 p値)と、予後良好症例と予後不良症例との間の遺伝子発現レベルのフォールド変化(fold change)の大きさとのボルケーノプロットを示した図である。 MYC、PAICS、FKBP4、PDXP、GARSの各遺伝子の高発現又は低発現患者の生存曲線を示した図である。 DLBCL患者における、PAICSの発現とPDXPの発現との相関性、FKBP4の発現とMYCの発現との相関性を示した図である。 MYC、PAICS、FKBP4、PDXP、GARSの各遺伝子の正常リンパ節(LN)サンプル、DLBCLサンプル、及びDLBCL細胞株での発現を示した図である。 予後良好因子候補の遺伝子の遺伝子オントロジー分析の結果を示した図である。 IL-21、BCL6、及びPD-1のCD4T細胞の各画分における発現を示した図である。 IL-21のCD8T細胞における発現を示した図である。 IL-21の発現と、標準的なTfhマーカーの発現との間の相関係数を示した図である。 DLBCL組織における、CD20、CD3、ICOSの各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。 増悪患者又は無増悪患者のDLBCL患者組織における、ICOS遺伝子の発現の頻度を示した図である。 DLBCL組織における、CD20、CD68、CD11cの各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。 増悪患者又は無増悪患者のDLBCL患者組織における、CD11cマクロファージの発現の頻度を示した図である。 DLBCL組織における、FGFR1、CD20、CD68、CD3の各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。 ICOS、CD11c、及びFGFR1の各遺伝子の、DLBCL細胞株、DLBCL組織、及び正常リンパ節での発現を示した図である。 良性リンパ節腫脹と診断された患者から得られた反応性リンパ節中の、ICOS、CD11c、及びFGFR1の存在を示した図である。 正常リンパ節及び反応性リンパ節中の、ICOS、CD11c、及びFGFR1の存在を示した図である。 反応性リンパ節のGC領域、及び正常リンパ節の濾胞中の、ICOS、CD11c、及びFGFR1の発現の頻度を示した図である。 ICOS、CD11c、又はFGFR1の発現の有無による生存曲線を示した図である。 DMSスコアの計算方法と計算されたDMSスコアによる生存曲線を示した図である。図中、「pt」は「ポイント」を表す。 DMSスコアと予後不良関連微小環境遺伝子の発現との関係を示した図である。 DLBCL患者のICOS、CD11c、FGFR1の各遺伝子の発現を示した図である。 DMSスコアによる生存曲線を示した図である。 DMSの各グループ(DMSスコア0~3の各グループ)の、Lymph2Cxによる分類、及びハンス基準(Hans Criteria)による分類を示した図である。 DMSの各グループ(DMSスコア0~3の各グループ)の、IPIリスクスコアによる分類を示した図である。 ハンス基準(Hans Criteria)による分類、及びLymph2Cxによる分類での生存曲線を示した図である。 DMSの各グループのハンス基準に基づくグループでの生存曲線を示した図である。 DMSの各グループのLymph2Cx分類に基づくグループでの生存曲線を示した図である。 DMSの各グループのIPI分類に基づくグループでの生存曲線を示した図である。 性別、バイオプシー領域、ハンス基準による分類、Lymph2Cxによる分類、IPIリスクスコア、及びDMSスコアの多変量解析の結果を示した図である。 DMSスコアのランダム再サンプリング技術によるパーミューテンションテストの結果を示した図である。 免疫関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルの教師なし(unsupervised)階層的クラスター解析の結果を示した図である。 DMSスコア、ICOS、CD11c、及びFGFR1の発現の程度と、コピー数改変(CNA)を伴う遺伝子数との相関を示した図である。

[DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法]
 1実施形態において、本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法を提供する。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記患者から得た検体は、本発明の方法に用いることができる検体であれば特に制限はないが、例えば、リンパ腫組織、末梢血などの血液、及びリンパ液等が挙げられる。前記患者から得たリンパ腫組織は、本発明の方法に用いることができるリンパ腫組織であれば特に制限はないが、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed paraffin-embedded:FFPE)組織等が挙げられる。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マーカーの発現を測定する工程は、前記マーカーの発現を測定することができる工程であれば特に制限はない。例えば、前記マーカーの発現の測定には、前記マーカーのmRNAの発現量の測定及び前記マーカーのタンパク質の発現量の測定等が挙げられるが、前記マーカーのmRNA発現量の測定であることが好ましい。前記マーカーのmRNA発現量の測定方法としては、トランスクリプトーム解析法(transcriptome analysis)等が挙げられるが、リンパ腫組織として、前記FFPE組織を用いる場合、FFPE組織に含まれるmRNAは断片化、又は変性している程度が高いため、前記FFPE組織を用いる場合は、トランスクリプトーム解析法のひとつである、nCounter(登録商標)システムが好ましい。nCounterシステムは、顕微鏡によって識別可能なバーコード配列を有するプローブ対を標的RNA分子に結合させ、顕微鏡によってバーコードの数を直接数えることで、増幅や逆転写することなく、多数の遺伝子を高感度、且つ高精度で解析するシステムであり、mRNAが断片化、又は変性している場合であっても、その感度及び精度を保つことができる。nCounterシステムで用いるプローブとして、NanoString社が提供しているプローブを用いてもよい。あるいは、NanoString社のカスタム合成サービスによりプローブを合成してもよい。前記マーカーのタンパク質の発現量の測定方法としては、ウェスタンブロッティングや免疫組織化学等が挙げられる。前記マーカーの発現の測定は、検体(例えば、リンパ腫組織)中にT細胞、マクロファージ又は樹状細胞、あるいは間質細胞が含まれたままの状態で行ってもよく、検体(例えば、末梢血)からこれらの細胞を単離した後に行ってもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのmRNA発現量の測定である場合、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程としては、前記マーカーのmRNA発現量が、受信者動作特性解析(Receiver Operating Characteristic analysis;以下、ROC解析という)により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程が挙げられる。あるいは、前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのmRNA発現量の測定である場合、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程としては、前記マーカーのmRNA発現量が、ROC解析により決定したカットオフ値未満であることが、前記治療による予後が不良であることを示す工程が挙げられる。カットオフ値は、ROC解析でのROCカーブの曲線下面積を求め、ヨーデンインデックス(Youden indeex)を最大化することによって決定することができる。予後の例としては、例えば、無増悪生存率(PFS)、無増悪生存期間、生存率(OS)、生存期間、無事象生存率(EFS)、無事象生存期間等が挙げられる。

 例えば、前記マーカーのmRNAのそれぞれの発現量が、ROC解析により決定したカットオフ値以上である場合、スコアを1とし、カットオフ値未満である場合、スコアを0として計算したときに、スコアの合計が高い程、予後が良好であると示すことができる。本明細書において、前記マーカーのmRNAのそれぞれの発現量が、ROC解析により決定したカットオフ値以上である場合、スコアを1とし、カットオフ値未満である場合、スコアを0として計算されるスコアを、DMS(DLBCL Microenvironment Signature)スコアと称する。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記化学療法としては、抗CD20抗体単剤療法や抗CD20抗体併用化学療法等が挙げられる。前記抗CD20抗体併用化学療法とは、抗CD20抗体と他の化学療法剤とを併用して用いる化学療法を意味し、R-CHOP療法、G-CHOP療法、CHASER療法、R-THP-COP療法、DA-EPOCH-R療法等が挙げられる。
 前記抗CD20抗体併用化学療法に用いられる、抗CD20抗体としては、リツキシマブ(製品名:リツキサン(登録商標))、オファツムマブ(製品名:アーゼラ(登録商標))、オビヌツズマブ(製品名:ガザイバ(登録商標))、イブリツモマブ チウキセタン(製品名:ゼヴァリン(登録商標))、オクレリズマブ、ヴェルツズマブ等が挙げられる。
 前記抗CD20抗体と併用して用いられる他の化学療法剤としては、シクロホスファミド(製品名:エンドキサン(登録商標))、シタラビン(製品名:キロサイド(登録商標))、エトポシド(製品名:ラステット(登録商標))、デキサメタゾン(製品名:デキサート(登録商標))、ドキソルビシン、ビンクリスチン(製品名:オンコビン(登録商標))、プレドニゾロン(製品名:プレドニン(登録商標))、ピラルビシン(製品名:テラルビシン(登録商標))、ベンダムスチン(トレアキシン(登録商標))等が挙げられる。
 CHOP療法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンを用いる治療方法であり、R-CHOP療法は、CHOP療法にさらにリツキシマブを加えた治療方法である。G-CHOP療法は、CHOP療法にさらにオビヌツズマブを加えた治療方法である。CHASER療法は、シクロホスファミド、シタラビン、エトポシド、デキサメタゾン、及びリツキシマブを用いる治療方法である。R-THP-COP療法は、リツキシマブ、ピラルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンを用いる治療方法である。DA-EPOCH-R療法は、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾン、及びリツキシマブを用いる治療方法である。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記T細胞のマーカーとしては、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1、TNFRSF4等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 また、前記T細胞としては、本発明の方法に用いることができるT細胞であれば特に制限はないが、濾胞性ヘルパーT細胞(follicular helper T cell;以下、Tfh細胞という)が好ましい。Tfh細胞のマーカーとしては、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1、TNFRSF4等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーとしては、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)、NOD2等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記間質細胞のマーカーとしては、BMP2K、COL8A2、FGFR1、OBSCN等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程、及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程は、いずれか1つの工程であってもよいし、2つ以上の工程を組み合せてもよいが、2つ以上の工程を組み合わせることが好ましく、3つの工程を全て組み合わせることがより好ましい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記3つの工程、即ち、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程、及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程の全てを組み合わせた方法としては、例えば、T細胞マーカーとしてICOS、樹状細胞マーカーとしてCD11c、間質細胞マーカーとしてFGFR1の発現を測定する工程を組み合わせた方法が挙げられる。

 上記ICOS、CD11c及びFGFR1のmRNA発現量を測定する工程を組み合わせた、本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法の具体例としては、上記ICOS、CD11c及びFGFR1の各mRNAの発現量を測定し、ROC解析により決定したカットオフ値、具体的には、ICOSについては543.65、CD11cについては2428.88、FGFR1については886.37の各数値以上である場合、各マーカーのスコアを1とし、前記数値未満である場合、各マーカーのスコアを0として、前記DMSスコアを算出し、DMSスコアが0、1、2、3と上昇するにしたがって、前記治療による予後(例えば、PFS又はOS)が良好となると示す方法を挙げることができる。

[DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキット]
 1実施形態において、本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、T細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキットを提供する。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記化学療法としては、抗CD20抗体併用化学療法等が挙げられる。前記抗CD20抗体併用化学療法としては、R-CHOP療法、G-CHOP療法、CHASER療法、R-THP-COP療法、DA-EPOCH-R療法等が挙げられる。抗CD20抗体、及び抗CD20抗体と併用して用いられる他の化学療法剤としては、前記DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において挙げたものが用いられる。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記T細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記T細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記T細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、DNAやRNA等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。
 前記キットに用いられるT細胞のマーカーとしては、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1、TNFRSF4等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 また、前記T細胞としては、本発明のキットに用いることができるT細胞であれば特に制限はないが、Tfh細胞が好ましい。Tfh細胞のマーカーとしては、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1、TNFRSF4等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、DNAやRNA等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーとしては、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)、NOD2等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記間質細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、DNAやRNA等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記間質細胞のマーカーとしては、BMP2K、COL8A2、FGFR1、OBSCN等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットには、T細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬の他に、他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、nCounterシステムで用いられる試薬、及び免疫組織化学やウェスタンブロッティング等で用いられる試薬(例えば、緩衝液、洗浄液、検出試薬等)が挙げられる。

 また、本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットには、前記DMSスコアを計算するための指示書が含まれていてもよい。前記指示書には、各マーカーの前記カットオフ値等を記載してもよい。
 また、本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットを用いて測定した各マーカーの発現量を、インターネットやイントラネット等のネットワークを介してコンピュータ等の装置に入力し、前記装置により、各マーカーの前記カットオフ値からDMSスコアを計算し、このDMSスコアの数値より、前記化学療法に対する治療効果を予測し、その予測結果を、前記ネットワークを介して他のコンピュータやタブレット等の装置に出力することもできる。

 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットは、本発明のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法に用いることができる。

 また、本発明は、前記DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、予後が良好と予測された場合には、前記DLBCL患者に対し、前記化学療法を実施することを含むDLBCL患者の治療方法を提供する。
 本実施形態のDLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、予後が良好と予測された場合には、前記DLBCL患者に対し、前記化学療法を実施してDLBCL患者を治療することにより、前記DLBCL患者の予後を良好にすることができる。

 本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法における使用のための、検体中の、T細胞のマーカー、マクロファージ又は樹状細胞のマーカー、及び間質細胞のマーカーを提供する。

 また、本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットの製造のための、検体中の、T細胞のマーカー、マクロファージ又は樹状細胞のマーカー、及び間質細胞のマーカーの使用を提供する。さらに、本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットの製造のための、T細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬の使用を提供する。

 以下、実施例等により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例等に限定されるものではない。

(実施例1)予後因子候補遺伝子の遺伝子発現
 DLBCL患者からのFFPEサンプルの下記表1に示す、48の代表的な遺伝子の発現レベルを、nCounterシステムを用いて解析した。その結果を図1Aに示す。図1Aに示したように、レアな微小環境構成要素に由来すると考えられるかなり低発現な転写物が、非常に高い再現性をもって定量されることが確認された。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

 次に、R-CHOP療法を実施し、予後良好、又は、予後不良となったそれぞれ15名のDLBCL患者(図1B)を含む30のDLBCL症例からのFFPE組織を用いて、免疫系、ガン経路系、キナーゼ系に関連する1900の遺伝子の発現量を、nCounterシステムを用いて調べた。その結果を、図1Cに示す。図1Cに示したように、予後良好と予後不良を示す症例間で統計的に有意に発現が異なる遺伝子が同定された。
 前記予後良好と予後不良を示す症例間で統計的に有意に発現が異なる遺伝子は、免疫系パネルで富化されていた(図1D)。これらのほとんどは腫瘍B細胞起源の遺伝子でなく、T細胞で発現される遺伝子、NK細胞で発現される遺伝子(KLRB1)、及びその他の微小環境細胞で発現される遺伝子(ITGAX、AIRE)を含む微小環境関連遺伝子であった。その他の微小環境関連予後遺伝子は、FGFR1(線維芽細胞成長因子レセプター1)とCOL4A4(コラーゲン・タイプIVアルファ4)であった。細胞周期、アポトーシス及び細胞形質転換で重要な役割を有するものとしてよく知られている、がん遺伝子MYCは、ガン経路系パネルでトップランクの予後因子として抽出された(図1C)。

 nCounterシステムにより解析される遺伝子の数は、1アッセイ当たり最大800の遺伝子であるため、nCounterシステムによるスクリーニングで解析されなかった遺伝子を補完するために、RNAシークエンシングによるトランスクリプトーム解析を実施した(図1E)。その結果、予後良好群及び予後不良群について、発現が異なる56の遺伝子が、予後因子候補として抽出された(図1F)。この56遺伝子中、12遺伝子は、nCounterシステムによるスクリーニングでも抽出された遺伝子であった。

 上記予備的コフォートにおける2つのスクリーニングの結果に基づいて、248の予後因子候補の遺伝子を選択し、次のnCounterシステムによる評価コフォートのためのプローブセットをカスタム合成(NanoString社)により設計した。遺伝子オントロジー(Gene Ontology;以下、GOとも称する)分析の結果、これらの候補遺伝子の殆どが免疫系において富化されている遺伝子であることが明らかとなった(図1G)。このことは、免疫状態が、DLBCL患者の臨床結果と密接に関連していることを示唆している。

(実施例2)予後不良因子の同定
 2006~2013年にR-CHOPまたはR-CHOP様の化学療法で処置された170のDLBCLサンプル(年齢、中央値71歳[範囲、23-89歳];IPI(国際予後指標):低リスクと低中間リスク 51.5%、高中間リスクと高リスク:48.3%、観察期間、中央値3.3年)で、nCounterシステムを用いて実施例1で同定された予後因子候補遺伝子の遺伝子発現を分析した。

 その結果、統計学的有意性(マン-ホウィットニーU検定からの-log10 p値)と、予後良好症例と予後不良症例との間の遺伝子発現レベルのフォールド変化(fold change)の大きさとのボルケーノプロットでいくつかの予後因子が確認された(図2A)。

 最も有意な予後不良因子の一つはMYCであった。MYCの状態は、遺伝子再編成状態だけでなくタンパク質発現についても、臨床結果を予測することが報告されている。この報告と一致して、MYC mRNAの高発現は、生存不良を強く予測した(図2B)。

 他の予後不良因子は、デノボのプリン生合成に重要な役割を果たすホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase)、及びホスホリボシルイミダゾールスクシノカルボキシアミドシンターゼ(phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide(PAICS)、ビタミンB6代謝に関連する、グリシルtRNA合成酵素(GARS)とピリドキサール・ホスファターゼ(PDXP)であった(図2B)。これらの遺伝子の上方制御は同時に起こっており(図2C)、これらの遺伝子の上方制御がリンパ腫細胞の高活性化を示している。実際、これらの遺伝子の発現は、正常リンパ節サンプル、DLBCLサンプル、DLBCL細胞株の順で上方制御されており(図2D)、潜在的な治療ターゲットとなる可能性がある。

(実施例3)予後良好因子の同定
 実施例2と同様にして、p値とフォールド変化とに関して、予後良好臨床経過を伴う患者において上方制御されている、予後良好因子を同定した(図2A)。これらの予後良好因子は、免疫関連GO階層、特に免疫反応階層で富化されていた(図2E)。予後良好因子の殆どはT細胞またはNK細胞関連遺伝子、マクロファージまたは樹状細胞(以下、マクロファージ/DCともいう)関連遺伝子、細胞外マトリックス(以下、ECMともいう)関連遺伝子であり、これらは、おそらく腫瘍微小環境構成要素により発現されていると思われる。

 この中で、Tfh細胞の主要マーカーであるICOS、マクロファージ/DCの主要マーカーであるCD11c、及び間質性細胞の主要マーカーであるFGFR1に注目し、これらの遺伝子が同一細胞によって共発現されているかを確認するために、C1システム(フリューダイム社製)とBiomark(登録商標)システム(フリューダイム社製)を使用して、浸入するT細胞の超高感度単一細胞GEPを実施した。

 その結果、Tfh細胞の特異的マーカーであり、実施例1及び2において、予後因子の一つとして特定されたIL-21が、とCD4T細胞のレアな画分に限定的に発現しており(図3A)、CD8T細胞では発現しておらず(図3B)、OX40、PD-1、BCL-6、PD-1、CXCR5、ICOS、SLAMF1のような標準的なTfhマーカーと共発現されていた(図3C)。このことは、Tfh細胞がDLBCL微小環境で予後良好を予測する主要な構成要素の1つであることを示唆している。

 さらに、Mantra(登録商標)組織標本定量ワークステーション(パーキン-エルマー社製)を用いた、多重蛍光免疫染色によるDLBCL組織の視覚化を行い、ICOSTfh細胞が無増悪患者サンプルで顕著に侵入することを確認した(図3D、図3E)。

 DLBCL組織の多重蛍光免疫染色像において、CD11c陽性細胞は、CD3細胞またはCD20細胞でなく、CD68細胞と完全に一致した(図3F)。このことは、CD11cCD68マクロファージ/DC由来のこの予後因子が、アポトーシス性B細胞スカベンジャーとして機能するGC微小環境の主要な因子であることを示唆している。これらの細胞構成要素の定量的解析により、CD11cCD68マクロファージ/DCが富化されていることが、無増悪長期生存と関係していることが視覚的に確認された(図3G)。

 その他の微小環境関連の予後良好遺伝子であるFGFR1(線維芽細胞成長因子1)陽性細胞は、CD20、CD68、CD11c、CD3のようなリンケージ特異的マーカーとは融合せず、細胞間隙に存在していた(図4A)。このことから、FGFR1がECM関連の遺伝子であることが確認された。

 これらの予後因子の遺伝子の発現は、DLBCL細胞株で観察されなかった(図4B)。このことから、これらの予後因子はDLBCL組織の微小環境に由来すると考えられる。さらに正常リンパ節と比較してDLBCLサンプルで低発現であることは、Tfh細胞、CD11cCD68マクロファージ/DC、FGFR1間質細胞のような特定の微小環境特性の損失がDBLCLの発症と関係していることを示している。

(実施例4)微小環境に基づく組織起源とDLBCL患者の臨床結果との関係
 Mantra(登録商標)組織標本定量ワークステーション(パーキン-エルマー社製)を使用して、良性リンパ節腫脹と診断された患者から得られた反応性リンパ節中の、微小環境由来予後因子の存在を解析した(図5A)。その結果、ICOSTfh細胞、CD11cCD68マクロファージ/DC、及びFGFR1間質細胞は、GC領域に明瞭に存在した。これらの遺伝子は、GCがない正常のリンパ節のB細胞濾胞で殆ど又は全く発現していなかった(図5B)。

 デジタル定量分析で、これらの予後微小環境細胞がGC領域で富化されることを確認した(図5C)。これらの結果から、これらの微小環境細胞の富化がGC特性を反映し、リンパ腫細胞の起源ではなく、DLBCL組織の起源、所謂、「組織起源」を定義することが示唆された。さらに、図5Dに示すように、これらのGC微小環境細胞はそれぞれ、それ自体でDLBCL患者の予後の強力な予測因子であった。

 この「組織起源」の概念に基づき、リンパ腫微小環境を表す新たなスコアリングシステムである、DMSスコアを構築した。このシステムはGC微小環境の3つの構成要素の存在によって定義される。このDMSスコアの一例としては、図6Aに示すように、nCounterからICOS、CD11c、及びFGFR1の発現状態によって計算されるものが挙げられ、このDMSスコアは、DLBCL患者を層別化し、明確に患者の予後を反映した。

 このように、DMSスコアが高いグループでは、これらのTfh関連マーカーの富化が確認されるのに対し、予後不良関連微小環境遺伝子である、IL-21、PD-1、CXCL-13、CTLA-4、及びFOXP3は上方制御されないか、下方制御された(図6B)。

 更に、R-CHOP療法で処置されたDLBCL患者の72の症例を追加し、上記と同様にして、臨床結果と、ICOS、CD11c、FGFR1の各遺伝子の発現量の関係について調べた。その結果、無増悪患者において、ICOS、CD11c、及びFGFR1の遺伝子の発現が上昇していたのに対し、増悪患者においては、いずれの遺伝子も発現が上昇していなかった(図6C)。この結果からも、ICOS、CD11c、及びFGFR1は、DLBCL患者の予後の強力な予測因子であることが分かる。
 また、これらの72症例について、DMSスコアを算出し、カプラン・マイヤー法により生存率曲線を描画した(図6D)。図6Dから明らかなように、DMSスコアが高い程、無増悪生存率が高いことから、DMSスコアは、DLBCL患者を層別化し、明確に患者の予後を反映することが確認された。

 DMSの各々のグループ(DMSスコア0~3の各グループ)は、ハンス基準(Hans Criteria)による標準的なCOO分類によって一定の割合で分類されるGCBタイプと非GCタイプを含むが、調和した相関性は観察されなかった(図6E)。他方、改良されたCOO分類モデルであるLymph2Cxスコアで分類されるGCB症例は、統計的有意性をもってDMSスコアが高いグループで高かった。このことは、DMSスコアとLymph2Cxスコアの両方が、各々微小環境とリンパ腫細胞特性の視点から、GC様特性を反映することを示唆している。

 IPIリスクとDMSスコアによるサブグループ間の相関は見られた(図6F)が、DMSスコアは標準的なCOOベースの層別化モデルよりも正確に患者の予後を予測することができた(図6A、図6D、図6G)。そこで、DMSスコアが標準的な臨床予後指標の予後価値を増加することができるかどうかを検討した。
 その結果、図7A~図7C示すように、DMSスコアは、ハンス基準の全てのサブグループ(GCBと非GC)、Lymph2Cxの全てのサブグループ(GCBとABC)とIPI分類(高リスク(3-5)、低リスク(0-2))において、予後を予測することができた。さらに、多変量解析により、DMSスコアが独立した予後因子であることが確認された(図7D)。ランダム再サンプリング技術によるパーミューテンションテスト(permutation test)では、ログランク検定からのp値の99.50%が0.00063未満であり、これは、予後モデルとしてDMSスコアの検出力を表している(図7E)。このように、GC微小環境特性の量によって定義される「組織起源」分類は、標準的なCOO分類とIPIとは独立して、デノボで無処置のDLBCLの臨床結果を予測することができた。

(実施例5)DLBCLのGC微小環境特性と遺伝子変異状態の関係
 447の免疫関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルと、臨床的に確認されているシークエンスプラットホーム(OncoPanel、ダナ-ファーバーキャンサーインスティテュート社製)を使用して、106のDLBCL症例のターゲット捕捉シークエンスから得られる体細胞変異状態との間の相関関係を調べた。その結果、遺伝子発現プロファイルの教師なし(unsupervised)階層的クラスター解析では、2つの主要な集団が特定され、主にDMSスコアが高い患者と低い患者で構成された(図8A)。レーザー捕獲顕微解剖した反応性リンパ節からのGC組織の遺伝子発現パターンは、DMSスコアが高い人の遺伝子発現パターンに似ていた。このことから、DMSスコアがGC微小環境組織を正確に評価することが確認された。

 また、DMSスコアが最も高い患者(GC微小環境特性が高い患者)は、DMSが最も低い患者と互いに相容れず、MYC、CDK4、E2F1のようなリンパ腫活動と細胞周期に関連した遺伝子の低発現によって特徴づけられ、予後良好であることを反映していた(図8A)。

 ABCまたは非GCサブタイプにおいて富化されていることが繰り返し報告されている、BCRシグナル経路は、DMSスコアが低い患者に顕著に集中しており、このことは、微小環境特性に基づくサブタイプが、変異に基づくサブタイプと相関することを示唆している。また、高いDMSスコア、特に3つの微小環境因子の中でICOSの高発現は、コピー数改変(CNA)の減少数と顕著に相関していた(図8B)。このことから、DLBCLのGC微小環境特性は、体細胞変異で定義されるDLBCLサブタイプ、及びCNAを伴う遺伝子数と相関し、おそらく発病または臨床予後を反映すると思われる。

 本発明は、DLBCL患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法を提供する。本発明は、新規なDLBCLの予後モデルの開発とDLBCLの病態生理学における微小環境構成要素の役割の解明に貢献するものである。

Claims (17)

  1.  びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、
     前記患者から得た検体中のT細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、
     前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、
    を含む方法。
  2.  前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのmRNA発現量の測定である、請求項1に記載の方法。
  3.  前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程が、前記マーカーのmRNA発現量が、ROC解析により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程である、請求項2に記載の方法。
  4.  前記化学療法が、抗CD20抗体併用化学療法である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5.  前記T細胞のマーカーが、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
  6.  前記T細胞が、濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh細胞)である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
  7.  前記Tfh細胞のマーカーが、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項6に記載の方法。
  8.  前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)及びNOD2からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
  9.  前記間質細胞のマーカーが、BMP2K、COL8A2、FGFR1及びOBSCNからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
  10.  びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、
    T細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキット。
  11.  前記マーカーの発現を測定する試薬が、前記マーカーのmRNA発現量を測定する試薬である、請求項10に記載のキット。
  12.  前記化学療法が、抗CD20抗体併用化学療法である、請求項10又は11に記載のキット。
  13.  前記T細胞のマーカーが、CCR4、CD2、CD3D、CD3E、CD6、CD7、CD96、FAS、IL2、IL2RB、IL2RG、IL7R、ITK、ITPKB、TNFRSF9、TRAF1、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項10~12のいずれか一項に記載のキット。
  14.  前記T細胞が、濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh細胞)である請求項10~13のいずれか一項に記載のキット。
  15.  前記Tfh細胞のマーカーが、CD40LG、CTLA4、CXCL13、ICOS、IL21、PDCD1、SH2D1A、SLAMF1及びTNFRSF4からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項14に記載のキット。
  16.  前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、CD80、HLA-DRB1、CD11c(ITGAX)及びNOD2からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項10~15のいずれか一項に記載のキット。
  17.  前記間質細胞のマーカーが、BMP2K、COL8A2、FGFR1及びOBSCNからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項10~16のいずれか一項に記載のキット。
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