WO2018236045A2 - Dna 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 - Google Patents

Dna 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vector comprising a DNA deformation inducing protein complex and a gene encoding the same.
  • tissue-specific promoters such as Cre-Lox recombination (Cre-Lox recombination) and TET system (TET system) in order to modify desired DNA at a desired site.
  • the TET system refers to a system for inducing gene expression in mammalian cultured cells and animals using a tetracycline (Tc) -resistant expression regulator in E. coli transposon Tn10.
  • Tc tetracycline
  • the first is tetracyclin-controlled transactivator (tTA), which is a protein that binds the transcription activation domain of the herpes simplex virus VP16 to the Tc repressor (tetR) and the second is the operator (tetO)
  • tTA tetracyclin-controlled transactivator
  • tTA tetracyclin-controlled transactivator
  • tetO the operator
  • the target gene is placed downstream of the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • tTA bound thereto does not bind tetO, but when Tc is removed, tTA binds with tetO to induce the expression of the target gene (TET-OFF system).
  • rtTA reverse tetracyclin-controlled ransactivator
  • Cre-Lox recombination is a site-specific recombinant enzyme technique used to carry out deletion, insertion, translocation and reversal at specific sites of cellular DNA, both in eukaryotic and prokaryotic systems, where DNA Allows modification to target specific cell types or triggered by specific external stimuli.
  • the Cre-lox recombination system is useful for neuroscientists to study the brain, where complex cell types and nerve circuits come together to generate cognition and behavior.
  • the Cas9 system has advantages in that an animal model can be manufactured at a low cost in a relatively short time and it is easy to perform precise work on DNA.
  • a method for inducing DNA transformation at a desired site Despite this necessity, the research on this is still insufficient.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for inducing DNA modification at a desired site at a desired time using Cas9 in order to solve the conventional problems as described above and found that tamoxifen Tamoxifen), the Cas9-ERT2 can be transferred from the cytoplasm to the nucleus. Thus, it is confirmed that the Cas9-ERT2 protein complex transferred into the nucleus can modify specific DNA through the guide RNA , Thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a protein complex in which ERT2 (estrogen receptor 2) is fused to Cas9 (CRISPR associated protein 9). More specifically, the ERT2 is an N-terminal of Cas9 from which nuclear localization sequence (NLS) C-terminal of the protein complex of the present invention.
  • ERT2 estrogen receptor 2
  • Cas9 Cas9
  • the present invention provides a protein complex in which ERT2 (estrogen receptor 2) is fused to Cas9 (CRISPR associated protein 9), and ERT2 is Cas9 in which NLS (nuclear localization sequence) Terminal and C-terminal of the protein complex.
  • the protein complex may be characterized in that it migrates from the cytoplasm to the nucleus by treating tamoxifen, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 encoding the protein complex.
  • the recombinant vector may further comprise a gRNA (guide RNA) and a promoter.
  • the promoter may be a CMV (cytomegalovirus) promoter, but is not limited thereto.
  • CMV cytomegalovirus
  • the present invention provides a transgenic animal prepared by implanting a embryo microinjected with the recombinant vector into a surrogate animal.
  • the transgenic animal may be a mouse but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for producing a recombinant vector comprising the steps of: a) preparing a recombinant vector of the present invention; b) microinjecting the vector into the embryo; And c) transplanting the embryo in a surgical way to the fallopian tube.
  • the recombinant vector of step a) may further comprise a gRNA and a promoter.
  • the surrogate mother animal may be a mouse but is not limited thereto.
  • the protein complex of the present invention which is characterized in that ERT2 is bound to the N-terminus and the C-terminus of Cas9 from which the nuclear localization sequence (NLS) has been removed, migrates from the cytoplasm to the nucleus at a desired point in time by treating tamoxifen There is an advantage that it can be.
  • the protein complex that has migrated into the nucleus can transform a specific DNA through a guide RNA (gRNA), thereby making it possible to perform a more elaborate DNA modification operation at a desired site at a desired point. It is expected to be used for development.
  • gRNA guide RNA
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of moving the protein complex into nucleus by treating Tamoxifen (TMX) with a Cas9-ERT2 protein complex present in the cytoplasm.
  • TMX Tamoxifen
  • FIG. 2 (a) shows a Cas9-ERT2 protein complex structure in which nuclear localization signal (NLS) has been removed and ERT2 is fused to N-terminal and C-terminal of Cas9. , U6 promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, and Cas9-ERT2.
  • NLS nuclear localization signal
  • CMV cytomegalovirus
  • FIG. 3 shows a map of a recombinant vector containing a gene encoding the protein complex of the present invention, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a process for preparing a recombinant vector according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a microinjection DNA prepared for microinjecting the recombinant vector of the present invention into an embryo according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6a The expression pattern of Cas9-ERT2 protein complex was confirmed when tamoxifen (TMX) was not treated.
  • FIG. 6B shows the expression pattern of Cas9-ERT2 protein complex when TMX was treated.
  • FIG. 7 shows a comparison between ROI 1 (up cell) and ROI 2 (down cell), in which vectors are not transfected.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of the expression patterns of ROI 1 and ROI 2 according to the intensity when tamoxifen was treated.
  • the present inventors have succeeded in transferring Cas9-ERT2 from the cytoplasm to the nucleus at a specific time point by treating tamoxifen with the Cas9-ERT2 protein complex.
  • Cas9-ERT2 protein complex transferred into the nucleus recognizes the guide RNA, And the present invention has been completed on the basis thereof.
  • the present invention relates to a protein complex in which ERT2 (estrogen receptor 2) is fused to Cas9 (CRISPR associated protein 9), wherein ERT2 is linked to N-terminal and C-terminal of Cas9 from which nuclear localization sequence (NLS) Protein complexes.
  • ERT2 estrogen receptor 2
  • Cas9 Cas9
  • CRISPR-CAS9 is an abbreviation of "CRISPR associated protein 9” and refers to “CRISPR-CAS9.”
  • CRISPR-CAS9 is a third generation gene scissors, It is useful for simple, rapid, and efficient manipulation of inserting a specific gene into a target site of a genome or stopping the activity of a specific gene.
  • ERT2 is an abbreviation of " estrogen receptor 2 ", which refers to an estrogen receptor.
  • Estrogen receptors are homologous to an estrogen responsive amplicon sequence (common sequence: 5'-AGGTCANNNTGACCT- Binds as a duplex and acts as a transcriptional regulator that promotes hormone-dependent transcription.
  • gRNA is an abbreviation of " guide RNA”
  • guide RNA refers to a small RNA of about 45 to 70 nucleotides having nucleotide sequence information that becomes a template for a modification reaction when RNA is modified.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 encoding the protein complex.
  • the term " vector" refers to a DNA capable of introducing and propagating a desired DNA fragment into a host organism in a DNA recombination experiment, and is also referred to as a cloning vehicle. And the target DNA fragment is inserted thereinto and introduced into the host microorganism.
  • the vector DNA connecting the target DNA fragments is replicated as the host bacteria are proliferated, and is distributed to the respective cysts along with the division of the bacteria, and the target DNA fragments are maintained for generations, and plasmids and phage chromosomes are mainly used.
  • the present invention also provides a transgenic animal prepared by embryos implanting a embryo microinjected with a recombinant vector produced by the present invention into a surrogate animal.
  • a method for producing a recombinant vector comprising the steps of: a) preparing a recombinant vector of the present invention; b) microinjecting the vector into the embryo; And c) transplanting the embryo in a surgical way to the fallopian tube.
  • a structure for linking Cas9 and ERT2 was designed to produce a protein complex capable of inducing DNA modification at a specific site at a desired time using Cas9 (see Example 1) ).
  • a recombinant vector comprising a gene encoding the protein complex was prepared (see Example 2).
  • the recombinant vector produced microinjected embryos to produce transgenic mice (see Example 3).
  • immunostaining was performed to confirm the expression pattern of the protein complex (see Example 4).
  • the present inventors have found that, in order to more precisely regulate Cas 9 migrating into the nucleus at the time of expression, the nuclear localization signal (NLS) of Cas 9 is removed to produce cytoplasm ), Tamoxifen (TMX) was treated with Cas9-ERT2 protein complex prepared by fusing ERT2 to N-terminal and C-terminal of Cas9 from which NLS had been removed, The structure of the Cas9-ERT2 protein complex (ERT2-Cas9-ERT2) capable of migration was envisioned (see Fig. 2a).
  • a structure in which a specific gene gRNA (guide RNA), a U6 promoter, a CMV promoter, and the Cas9-ERT2 protein complex are connected to each other is designed so that a specific gene can be modified at a desired time point (see FIG. 2B) , Ubiquitous expression is possible using the CMV promoter.
  • a recombinant vector containing a gene encoding the protein complex of the present invention was prepared (see Fig. 4). Specifically, pCAG-ERT2CreERT2 (# 13777) and pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (# 42230) plasmids were purchased from Addgene and a mouse TIF1 ⁇ CRISPR / Cas9 knockout (KO) plasmid (sc- .
  • mouse LRAT Lecithin retinol acyltransferase
  • promoter prediction http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php
  • high activity predicted sequence -5,500 to +72 bps
  • PCR was carried out using specific mouse primers as shown in Table 1 below using normal mouse DNA (C57BL / 6N) to obtain LRAT promoter.
  • Cre of the CAG promoter and pCAG-ERT2CreERT2 were replaced with the LRAT promoter and SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9), respectively, in order to generate a plasmid which is dependent on the LRAT promoter and which is regulated by tamoxifen to control the expression of the liver fibrosis inhibitory gene (TIF1 ⁇ ).
  • LRAT promoter and SpCas9 Streptococcus pyogenes Cas9
  • TIF1 gamma gRNAs of the following Table 2 with U6 promoter were then inserted into the plasmid.
  • the pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1 gamma gRNA plasmid thus prepared was confirmed by Sanger Sequencing.
  • mice in which specific gene expression is regulated at certain time by tamoxifen
  • C57BL / 6N female mice at 5-8 weeks of age are immunized with pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG) (7.5 IU) and human chorionic gonadotropin (hCG) (5 IU) were injected intraperitoneally (IP) at intervals of 48 hours to induce superovulation.
  • PMSG pregnant mare serum gonadotrophin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • IP intraperitoneally
  • Mice were crossed with male C57BL / 6N transgenic mice. Viral plugs were used to determine the pregnancy of female mice, and fertilized embryos were harvested from female mice.
  • transgenic mice three embryos were transfected with three DNAs (pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1 gamma gRNA) inducing the modulation of the expression of the hepatic fibrosis-inhibiting gene (TIF1 gamma) through tamoxifen, as shown in Fig. 5, / PvuI to be linearized and prepared for microinjection and three DNAs were microinjected into one cell staged embryo at the same concentration. Standard microinjection procedures were used to produce such transgenic mice (Macrogen, Seoul, Korea).
  • a total of 4 ng / ul of the three DNA mixtures was directly injected into the pronucleus of zygote using a micromanipulator.
  • the embryo thus microinjected into the DNA mixture was incubated at 37 DEG C for 1 to 2 hours Lt; / RTI > Fourteen to sixteen of the embryos were implanted into the fallopian tube of a pseudo-pregnant recipient mouse (ICR) using a surgical procedure.
  • ICR pseudo-pregnant recipient mouse
  • TMX Tamoxifen
  • ROI 1 up cell
  • ROI 2 down cell
  • FIGS. 7 and 8 7 show that the Cas9-ERT2 protein complex expressed in the cytoplasm was transported into the nucleus by TMX treatment.
  • ROI 1 was higher in the nucleus Cas9 than in ROI 2, higher in the cytoplasm and higher in the nucleus TIF1 gamma expression was decreased (see FIG. 8).
  • the protein complex of the present invention can transform a specific DNA through guide RNA (gRNA), and furthermore, by using a promoter of a gene which expresses a desired tissue or cell-specific expression, Do.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention is expected to be used to develop new and convenient DNA modification techniques.

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Abstract

본 발명은 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 ERT2는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단백질 복합체는 타목시펜 (Tamoxifen)을 처리함으로써 특정시점에 세포질에서 핵 내로 이동할 수 있다는 장점이 있는바, 이처럼 핵 내로 이동한 상기 단백질 복합체는 guide RNA (gRNA)를 통해 특정 DNA를 변형시킬 수 있으므로, 궁극적으로 원하는 시점에 원하는 부분에서 보다 정교한 DNA 변형 작업을 가능하게 함으로써, 본 발명은 새롭고 편리한 DNA 변형 기술을 개발하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DNA 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터
본 발명은 DNA 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
특정한 시기에, 원하는 부분에서 원하는 DNA를 변형 (modification) 시키기 위하여 현재 Cre-Lox 재조합 (Cre-Lox recombination), TET시스템 (TET system) 등에 조직 특이적 프로모터를 이용하는 방법이 존재한다.
이 중 TET시스템 (TET system)은 대장균의 전이인자 (transposon) Tn10에 있는 테트라사이클린 (Tc) 내성발현조절계를 사용한 포유류배양세포, 동물개체에서의 유전자발현유도시스템을 말하며, 2개의 요소로 구성되어 있다. 첫째는 tTA (tetracyclin-controled transactivator) 인데, 이는 Tc억제인자(tetR)에 단순 헤르페스 바이러스 VP16인 전사활성화 영역을 결합한 단백질이고, 둘째는 tetR와 결합할 수 있는 작동유전자 (operator) (tetO)와 사람세포 거대바이러스 (CMV) 촉진체의 하류에 목적유전자를 배치한 것이다. 상기 Tc존재 하에서는 그와 결합한 tTA는 tetO와 결합하지 못하지만, Tc를 제거하면 tTA가 tetO와 결합하여 표적유전자의 발현을 유도하게 된다(TET-OFF시스템). 역으로 tetO와 결합하여 표적유전자의 발현유도를 하는 rtTA (reverse tetracyclin- controlled ransactivator)를 사용한 TET-ON시스템의 구축을 위한 연구도 계속 되고 있다.
Cre-Lox 재조합(Cre-Lox recombination)은 세포 DNA의 특정 부위에서 결실, 삽입, 전좌 및 역전을 수행하는 데 이용되는 부위 특이적인 재조합 효소 기술로써, 진핵 생물과 원핵 생물 시스템에서 모두 실행되는데, DNA 변형이 특정 세포 유형을 표적으로 하거나 특정 외부 자극에 의해 촉발되도록 한다. 특히 Cre-lox 재조합 시스템은 신경 세포 학자들이 복잡한 세포 유형과 신경 회로가 함께 모여 인지와 행동을 생성하는 두뇌를 연구하는 데 있어 유용하다.
다만, 상기의 DNA 변형 방법들은 그 절차가 복잡하고, 과정에 긴 시간이 소요되며, 이를 통하여 제조된 동물모델에서 원하는 부분의 DNA 변형을 위하여 약물을 처리한 경우, 정밀한 작업이 이루어지지 않아, 그 결과를 신뢰할 수 없는 경우가 많다는 점에서 한계가 있어, 현재 단일 분자 조작에 의한 DNA 변형 (한국 특허공개번호 10-2016-0003629) 등 DNA 변형에 대한 유의성 있는 연구가 거듭되고 있다.
한편, 다양한 DNA 변형 방법 중 Cas9 system은 상대적으로 짧은 시간에 저비용으로 동물모델을 제조할 수 있고, DNA 상에서 정교한 작업이 용이하다는 장점이 있으나, 특정 시기에 원하는 부분에서의 DNA 변형을 유도하기 위한 방법이 필수적임에도 불구하고, 아직 이에 대한 연구는 미비한 실정이다.
본 발명자는 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, Cas9을 이용해 원하는 시기에 원하는 특정 부분에서 DNA 변형(modification)을 유도할 수 있는 방법에 관하여 예의 연구한 결과, Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 특정시점에 상기 Cas9-ERT2를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있으며, 이처럼 핵 내로 이동된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 guide RNA를 통해 특정 DNA를 변형 (modification) 시킬 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 ERT2는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 미세주입 된 배아를 대리모 동물에 착상시켜 제조한 형질전환 동물 및 해당 형질전환 동물의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체로서, 상기 ERT2는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 단백질 복합체는 타목시펜 (tamoxifen)을 처리함으로써 세포질에서 핵 내로 이동하는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 재조합 벡터는 gRNA (guide RNA) 및 프로모터를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 프로모터는 CMV (cytomegalovirus) 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 미세주입 된 배아를 대리모 동물에 착상시켜 제조한 형질전환 동물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 형질전환 동물은 생쥐일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 a) 본 발명의 재조합 벡터(vector)를 제조하는 단계; b) 상기 벡터를 배아에 미세주입 하는 단계; 및 c) 상기 배아를 대리모의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계를 포함하는, 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 a) 단계의 재조합 벡터는 gRNA 및 프로모터를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 대리모 동물은 생쥐일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질 복합체는 타목시펜 (Tamoxifen)을 처리함으로써 원하는 특정시점에 세포질에서 핵 내로 이동할 수 있다는 장점이 있다. 이처럼 핵 내로 이동한 상기 단백질 복합체는 guide RNA (gRNA)를 통해 특정 DNA를 변형시킬 수 있는바, 원하는 시점에 원하는 부분에서 더욱 정교한 DNA 변형 작업을 가능하게 함으로써, 본 발명은 새롭고 편리한 DNA 변형 기술을 개발하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 세포질에 존재하는 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜 (Tamoxifen; TMX)을 처리함으로써 상기 단백질 복합체가 핵 내로 이동하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 nuclear localization signal (NLS)이 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2를 융합시킨 Cas9-ERT2 단백질 복합체 구조를 나타낸 것이고, 도 2b는 억제하고자 하는 특정 유전자의 gRNA (guide RNA), U6 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, 및 Cas9-ERT2를 연결한 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 맵을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 재조합 벡터를 제조하기 위한 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 재조합 벡터를 배아에 미세주입하기 위하여 제작된 미세주입 (microinjection) 용 DNA를 나타낸 것이다.
도 6a는 타목시펜(Tamoxifen; TMX)을 처리하지 않았을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이고, 도 6b는 TMX를 처리하였을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이다.
도 7은 ROI 1 (up cell)과, 벡터의 transfection이 이루어지지 않은 세포인 ROI 2 (down cell)을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 타목시펜을 처리하였을 때, ROI 1과 ROI 2의 발현양상을 Intensity에 따라 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자는 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 특정시점에 상기 Cas9-ERT2를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있으며, 이처럼 핵 내로 이동된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 guide RNA를 인지하여 DNA를 변형 (modification) 시킬 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체로서, 상기 ERT2는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체를 제공한다.
본 발명에서 "Cas9"는 "CRISPR associated protein 9"의 약자로, "CRISPR-CAS9"을 지칭하는데, CRISPR-CAS9는 3세대 유전자가위로서, 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다.
본 발명에서 "ERT2"는 "Estrogen receptor 2"의 약자로, 에스트로겐 수용체를 지칭하는데, 에스트로겐 수용체는 표적유전자 촉진자에 존재하는 에스트로겐응답 증폭자배열(공통배열: 5′-AGGTCANNNTGACCT-3′)에 호모이합체로서 결합하여 호르몬 의존적으로 전사를 촉진하는 전사조절인자로서 작용한다.
본 발명에서 "gRNA"는 "guide RNA"의 약자로, RNA를 편집할 때 수식반응의 주형이 되는 염기순서정보를 갖는 45~70뉴클레오티드가량의 작은 RNA를 지칭하는데, gRNA의 5′측 영역은 RNA편집되는 mRNA의 일부와 상보적 순서로 되어 있고, 이 영역을 매개로 하여 mRNA에 결합되며, 3′측 영역에는 편집 후의 최종적 mRNA의 순서에 상보적 염기순서가 존재하고, 그 순서정보에 따라 우리딘 (uridine) 염기의 삽입이나 결실이라는 RNA수식반응이 일어난다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "벡터"는 DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서, 클로닝 운반체 (cloning vehicle)라고도 하는데, 벡터 (vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주균에 도입시킨다. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나가며, 플라스미드 (plasmid), 파지 염색체를 주로 사용한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 의해 제조된 재조합 벡터가 미세주입 된 배아를 대리모 동물에 착상시켜 제조한 형질전환 동물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, a) 본 발명의 재조합 벡터(vector)를 제조하는 단계; b) 상기 벡터를 배아에 미세주입 하는 단계; 및 c) 상기 배아를 대리모의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계를 포함하는, 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, Cas9을 이용하여 원하는 시기에 특정 부분에서 DNA 변형 (modification)을 유도할 수 있는 단백질 복합체를 제조하기 위하여, Cas9과 ERT2를 연결하는 구조를 구상하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제조하였으며(실시예 2 참조). 상기 재조합 벡터가 미세주입 된 배아를 생성하여, 형질전환 된 생쥐를 생산하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 단백질 복합체의 발현양상을 확인하기 위하여 면역염색법을 수행하였다(실시예 4 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. DNA 변형 유도 단백질 복합체의 제조
본 발명자는, DNA 변형 유도 단백질 복합체를 제조하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 발현 시에 핵 내로 이동하는 Cas9을 보다 정교하게 조절하고자, Cas9의 nuclear localization signal (NLS)을 제거하여 세포질 (cytoplasm)에 존재하도록 하였고, 상기 NLS이 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2를 융합시켜 제조한 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜 (tamoxifen; TMX)을 처리하여 특정시점에 핵 (nucleus) 내로 이동시킬 수 있는 Cas9-ERT2 단백질 복합체(ERT2-Cas9-ERT2)의 구조를 구상하였다(도 2a 참조).
특히, 원하는 시점에 특정한 유전자를 변형시킬 수 있도록, 특정 유전자의 gRNA (guide RNA), U6 프로모터, CMV 프로모터, 및 상기 Cas9-ERT2 단백질 복합체를 연결한 구조를 설계하였는데(도 2b 참조), 이 때, CMV promoter의 사용으로 ubiquitous expression이 가능하다.
실시예 2. 재조합 벡터의 제조
본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였다(도 4 참조). 구체적으로, Addgene으로부터 pCAG-ERT2CreERT2 (#13777)와 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (#42230) 플라스미드를 구매하였고, Santa Cruz로부터 mouse TIF1γ CRISPR/Cas9 knockout (KO) 플라스미드 (sc-430111)를 구매하였다. mouse LRAT (Lecithin retinol acyltransferase) 프로모터 시퀀스 (promoter sequence)는 promoter prediction (http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)를 사용해 높은 활성이 예측되는 시퀀스 (-5,500 to + 72 bps)를 선택하였고, 보통의 mouse DNA (C57BL/6N)를 사용하여 하기 표 1과 같은 특이적 프라이머와 함께 PCR을 수행해 LRAT 프로모터를 획득하였다.
Figure PCTKR2018005135-appb-T000001
상기 LRAT 프로모터에 의존적이면서, 타목시펜으로 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 발현 조절이 유발되는 플라스미드를 생성하기 위해, CAG 프로모터와 pCAG-ERT2CreERT2의 Cre는 LRAT 프로모터와 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9)으로 각각 대체하였다.
그 다음, U6 프로모터를 갖는 하기 표 2의 TIF1γ gRNA 3개를 상기 플라스미드에 삽입하였다.
Figure PCTKR2018005135-appb-T000002
이렇게 제조된 pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1γ gRNA 플라스미드는 생어 염기서열 분석 (Sanger Sequencing)에 의하여 확인되었다.
실시예 3. 형질전환 생쥐의 생산
타목시펜으로 특정시점에, 특정 유전자 발현이 조절되는 형질전환 (transgenic; TG) 생쥐를 생산하기 위하여, 5 내지 8주령의 C57BL/6N 암컷 생쥐에 임마혈청성 생식샘자극호르몬 (pregnant mare serum gonadotrophin; PMSG) (7.5IU) 및 인간융모막성 생식샘자극호르몬 (human chorionic gonadotropin; hCG) (5IU) 을 각 48시간 간격으로 복강내 (Intraperitoneal; IP) 주사하여 과배란을 유발시켰으며, hCG을 주사한 후, 상기 암컷 생쥐를 C57BL/6N 번식용 수컷 생쥐와 교배시켰다. virginal plug를 통해 암컷 생쥐의 임신여부를 확인하고, 암컷 생쥐로부터 수정된 배아를 수확하였다.
형질 전환 생쥐 제조의 일 실시예로, 상기 배아에, 도 5에 나타낸 바와 같이, 타목시펜을 통한 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 발현의 조절을 유발하는 DNA (pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1γ gRNA) 3개를 AvrII/PvuI으로 이중 절단 (double cut)하여 선형화 해 미세주입 (microinjection)용으로 준비하였고, 1-세포기 배아 (one cell staged embryo)에 상기 DNA 3개를 같은 농도로 미세 주입하였다. 이와 같은 형질전환 생쥐의 생산에 표준 미세주입 절차가 사용되었다(마크로젠, 서울, 대한민국).
상기 3개의 DNA 혼합물 총 4ng/ul을 접합자 (zygote)의 전핵 (pronucleus)에 미세조작기 (micromanipulator)를 사용하여 직접적으로 주입하였고, 이처럼 DNA 혼합물을 미세주입 한 배아를 37℃에서 1-2시간 동안 배양하였다. 상기 배아 중 14 내지 16개를 가상 임신한 대리모 (pseudo-pregnant recipient) 생쥐 (ICR)의 난관에 외과적 방법을 사용하여 이식하였다.
이와 같은 방법으로 생산되는 형질전환 생쥐는 ㈜마크로젠(서울, 대한민국)에서 병원체가 없는 조건 하에 교배되었으며, 모든 조작은 ㈜마크로젠의 실험동물운영위원회의 승인을 받아 수행되었다.
실시예 4. DNA 변형 유도 단백질 복합체의 발현 분석
본 발명의 DNA 변형 유도 단백질 복합체의 발현양상을 확인하기 위하여 면역염색법을 수행하였다. 이를 위하여, LX2 Cell (Human hepatic stellate cell lines)에 transfection 후, 타목시펜(Tamoxifen; TMX) 1nM을 처리한 다음, 4시간 후 상기 TMX의 처리 유무에 따른 Target 유전자 (TIF1 gamma; TIF1γ)의 감소와 반대적 유전자(alpha SMA; α-SMA)의 증가 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, TMX를 처리하지 않았을 때, 세포질 (cytosol)에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체의 핵 내로 이동이 억제되었고, α-SMA는 낮았으며, TIF1γ는 핵 내에 높게 발현되었다(도 6a 참조). 반면, TMX 처리 시 세포질에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 핵 내 이동함을 확인할 수 있었으며, α-SMA는 높았고, TIF1γ는 핵 내 발현이 감소되었다(도 6b 참조).
또한, 소프트웨어를 이용하여 Intensity에 따라 분석한 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, ROI 1 (up cell)과 벡터의 transfection이 이루어지지 않은 세포인 ROI 2 (down cell)을 비교하였을 때(도 7 참조), 세포질에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 TMX 처리로 핵 내 이동함을 확인할 수 있었고, ROI 1이 ROI 2보다 핵 내의 Cas9이 높았으며, 세포질에서 α-SMA이 높고, 핵 내 TIF1γ 발현이 감소하였다(도 8 참조).
참고로, 본 발명의 서열목록 리스트는 하기 표3과 같다.
Figure PCTKR2018005135-appb-T000003
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 단백질 복합체는 guide RNA (gRNA)를 통해 특정 DNA를 변형시킬 수 있고, 또한 원하는 조직 또는 세포 특이적 발현을 하는 유전자의 promoter를 이용함으로써 원하는 시점에 원하는 부분에서 더욱 정교한 DNA 변형 작업이 가능하다. 따라서, 본 발명은 새롭고 편리한 DNA 변형 기술을 개발하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체로서, 상기 ERT2는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 단백질 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 복합체는 타목시펜 (tamoxifen)을 처리함으로써 세포질에서 핵 내로 이동하는 것을 특징으로 하는, 단백질 복합체.
  3. 제1항의 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 gRNA (guide RNA) 및 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV (cytomegalovirus) 프로모터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  6. 제3항의 재조합 벡터가 미세주입 된 배아를 대리모 동물에 착상시켜 제조한 형질전환 동물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 동물은 생쥐인 것을 특징으로 하는, 형질전환 동물.
  8. 하기의 단계를 포함하는 형질전환 동물의 제조방법:
    a) 제3항의 재조합 벡터를 제조하는 단계:
    b) 상기 재조합 벡터를 대리모 동물의 배아에 미세주입 하는 단계; 및
    c) 상기 배아를 대리모 동물의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 a) 단계의 재조합 벡터는 gRNA 및 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 동물의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 대리모 동물은 생쥐인 것을 특징으로 하는, 형질전환 동물의 제조방법.
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