WO2018224719A1 - Sondas duales para citometría de flujo y citometría de masas - Google Patents

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Antonio DELGADO GONZÁLEZ
Rosario María SÁNCHEZ MARTÍN
Juan José DÍAZ MOCHÓN
María Teresa VALERO GRIÑÁN
Ángel ORTE GUTIÉRREZ
Emilio GARCÍA FERNÁNDEZ
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Universidad de Granada
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    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/06—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent containing organic luminescent materials
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention is in the field of cell biology analysis, within the field of cell analysis and more specifically in that of cytometry probes.
  • the field of application of the invention is cytometry, especially in flow cytometry (FACS) and mass cytometry (CyTOF).
  • FACS flow cytometry
  • CDT mass cytometry
  • the probes described can be applied to carry out barcode coding of live cells or to carry out in vivo studies of different cell lineages through cell co-cultures.
  • Flow cytometry is a technique used to list the absolute levels of cells and their subsets. It is widely used for blood cell and other clinical sample analysis and to identify bacteria pathogens
  • Flow cytometry is a mature technology that uses hydrodynamics to focus a stream of aligned particles. Optics are used to illuminate a particle with laser or other light sources and detectors to resolve scattered light as well as fluorescent signals. Specificity for a target subset of cells is achieved by attaching fluorescent markers to the subset with affinity molecules such as antibodies. The typical cost of an FACS is in the range of $ 40,000 to $ 150,000.
  • Another class of flow cytometers is the Coulter counter ( DC) By measuring the electrical impedance through an opening, the Coulter counter can measure the count of cells and volume. Coulter counters are routinely used as hematological analyzers for red and white blood cells. Other applications include cell biology, food analysis, cosmetics, metals and marine biology.
  • Mass cytometry is a novel technique that was initially developed by DVS Sciences that was acquired by the Fluidigm company.
  • Mass cytometry is an analytical tool that allows, simultaneously, the detection and quantification of dozens of markers within the same particle and / or cell [Bandura DR et al .: Mass cytometry: technique for real time single cell multi target immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.
  • Anal Chem, 2009, 81: 6813-6822 thanks to the use of heavy metals associated with mass spectroscopy detection. This gives it the high multiplexing capacity needed today in biomedical research laboratories. In addition, it allows analysis of individual cells.
  • This technique uses metals that appear in period 6 of the periodic table, usually lanthanides, such as markers.
  • markers that include, for example, palladium (102, 104, 105, 106, 108, 1 10) molecular isotopes bound to linear polymers [Zunder, ER et al, Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single -cell deconvolution algorithm, Nature Protocols, 2015, 10, 316-333], [Behbehani, GK et al .: Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A 85 (2014): 1, 01 1-1, 019], [Majonis, D. et al. Dual-purpose polymer labels for fluorescent and mass cytometric affinity bioassays. Biomacromolecules 14 (2013): 1, 503-1, 513], which are used on fixed cells. In 2015, these reagents were presented in order to be used as a barcode using palladium but with the drawback that only serves for fixed cells.
  • linear metallo-fluorescent polymers are not able to enter living cells, so they must be used on cells already fixed in order to permeabilize them and thus allow them to enter the cells. Therefore, they do not allow cell studies in vivo or co- Cell cultures.
  • polystyrene particles were developed with metals that were used as equipment calibrator [Abdelrahman Al et al., Metal-Containing Polystyrene Beads as Standards for MassCytometry, J Anal At Spectrom., 2010, 25 (3 ): 260-268].
  • These nanoparticles composed of polystyrene and polyacrylate trapped metal out during the dispersion polymerization process. They are used as an internal calibrator for cell studies by mass spectroscopy but not as cell markers per se. The authors do not report their cytotoxicity since they are used once the cells are fixed and labeled with antibodies with metals as an internal calibrator of the system.
  • microgels have been presented [Lin W. et a ⁇ .: A High-Sensitivity Lanthanide Nanoparticle Repórter for Mass Cytometry: Tests on Microgeis as a Proxy for Cells. Langmuir 2014; 30 (11): 3142-3153]. These microgels composed of poly (NIPAm / VCL / MAA) coat nanocrystalline salts of lanthanides.
  • Barcode cell coding consists of the unique and exclusive mapping of each cell line with a combination of metal isotopes.
  • the assigned code is specific, such as a fingerprint, behaving like a barcode. In such a way that each combination of isotopes is only carried by a certain type of cells, whether they are different cell lines or primary cells that come from different patients.
  • FCB fluorescence coding
  • the polymer binds to an antibody, which in turn binds to a cell surface ligand, which allows different cell types to be labeled, but at the same time prevents a study of different cell lineages since only identify cells that have a specific marker, that is, they can only bind to cells that have the chosen ligand.
  • reagents have not been studied in relation to their cytotoxicity since they are used in fixed cells.
  • the present invention describes probes comprising fluorescent and functionalized cross-linked nanoparticles with metals that are suitable for both flow cytometry (FACS) and mass cytometry (CyTOF).
  • FACS flow cytometry
  • CDT mass cytometry
  • the probes described in this invention allow co-culture of different cell lines and multiple assays.
  • the invention relates to a method of preparing the probes object of the invention.
  • the present invention relates to a barcode cellular coding method (barcoding) employing the nanoparticles of the invention.
  • the present invention relates to the use of the probes of the invention to activate pro-drugs by cytoplasmic catalysis of organometallic reactions inside living cells.
  • FIG. 1 Schematic representation of two probes of the invention in which a nanoparticle (N) is functionalized with a fluorophore (F) to which A) a metal (M) or B) is attached to several different metals or metal isotopes (M1 , M2 and M3).
  • Figure 2. Cell viability (MTT assay) of nanofected MDA-MB-231 cells for 6 days with fluoro-metallic probes expressed as a percentage of non-nanofected control cells.
  • FIG. 3 Example of a dual coding system capable of encoding up to 8 different cell lines using 4 combinations of palladium isotopes ( 102 Pd, 105 Pd, 106 Pd and 108 Pd) that can be individualized by mass cytometry and each one of them in turn with a different fluorophore (Cy3 and Cy5) capable of being differentiated by flow cytometry.
  • palladium isotopes 102 Pd, 105 Pd, 106 Pd and 108 Pd
  • Cy3 and Cy5 a different fluorophore
  • Figure 5 Scheme of the reaction caused on gemcitabine and 5-FU prodrugs by organometallic catalysis.
  • Figure 6. Graphs corresponding to the fluorescence emission in FACS, APC channel.
  • a - E A) NP control, without Cy5; B) NP-Cy5- 106 Pd; C) NP-Cy5- 110 Pd; D) NP-Cy5- 106 Pd - 110 Pd and E) NP-Cy5-Pd (OAc) 2 .
  • Figure 7 Graphs corresponding to the fluorescence emission in FACS, PE channel.
  • a - E A) NP control, without Cy3; B) NP-Cy3- 106 Pd; C) NP-Cy3- 110 Pd; D) NP-Cy3- 106 Pd - 110 Pd and E) NP-Cy3-Pd (OAc) 2 .
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being only positive for 110 Pd.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • Figure 10. Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy5- 106 Pd - 110 Pd.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for both 106 Pd and 110 Pd.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • FIG. 11 Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy5-Pd (OAc) 2.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for all of them.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • FIG. 12 Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy3- 106 Pd.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for 106 Pd.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes,
  • FIG. 13 Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy3- 110 Pd.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for 110 Pd.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes,
  • Figure 14 Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy3- 106 Pd - 110 Pd.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for io6 Pd and not pd
  • D - F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • Figure 15 Graphs corresponding to CyTOF for NP-Cy5-Pd (OAc) 2.
  • a - C Signals corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes respectively, being positive for all of them.
  • D-F Histograms corresponding to the 106 Pd, 110 Pd and 105 Pd isotopes, respectively.
  • Figure 16 A - E. Graphs corresponding to the percentage of cell viability as a function of the number of NPs per cell, after 96h of incubation.
  • Figure 17 Representative graph of the percentage of MDA-MB-231 positive cells in the APC channel after being incubated with 5,000 NPs per cell for 6h.
  • Figure 18. Graphs corresponding to MDA-MD-231 cells in CyTOF. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. Above: Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length".
  • FIG. 19 Graphs corresponding to MDA-MD-231 cells, incubated with NP-Cy5- 106 Pd in CyTOF. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. Above: Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length”.
  • FIG. 20 Graphs corresponding to MDA-MD-231 cells, incubated with NP-Cy5- 110 Pd in CyTOF. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. Above: Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length”.
  • FIG. 21 Graphs corresponding to 50% -50% mix of MDA-MB-231 NP-incubated with Cy5- Pd 106 and MDA-MB-231 cells incubated with NP-Cy5- 110 Pd. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. Above: Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length".
  • FIG. 22 Graphs corresponding to 25% -75% mix of MDA-MB-231 NP-incubated with Cy5- Pd 106 and MDA-MB-231 cells incubated with NP-Cy5- 110 Pd. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. The two graphs above show the Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length".
  • FIG. 23 Graphs corresponding to the mixture 75% -25% of MDA-MB-231 NP-incubated with Cy5- Pd 106 and MDA-MB-231 cells incubated with NP-Cy5- 110 Pd. Left: signal corresponding to the isotope channel 106 Pd. Right: signal corresponding to the 110 Pd isotope channel. Above: Pd isotope signal against the Ir cell marker. Below: Pd isotope signal against the "Event Length".
  • fluorophore refers to any fluorescent chemical compound, used as a dye, which after being excited to a given wavelength, it emits light at longer wavelengths.
  • a fluorophore is methine dyes or "polymethines" fluorescent compounds that comprise an odd number of CH linked in a zigzag-shaped conjugated carbon chain .
  • the polymetin dye is divided into different families such as the harmful o and anthocyanin.
  • cellular coding by barcode or “barcoding” (commonly used term) refers to any technique that includes the identification of different cell lines through a unique predefined combination of metal isotopes and fluorophores.
  • polymer refers to any macromolecule formed by covalent junctions of multiple units of the same molecular unit.
  • nanofection comprises any method of introducing nanoparticles into cells.
  • multiplexing in English “multiplexing” refers to the ability to simultaneously measure multiple analytes in the same sample.
  • Reporter means any component responsible for generating a signal that can be detected later.
  • cell fixation includes any manipulation of living cells that aims to keep all its structural and chemical architecture unchanged while inhibiting all its biochemical functions.
  • cell permeabilization comprises any treatment by which the entry of biomolecules, reagents or nanoparticles into the cells is favored.
  • a probe, a nanoparticle, a label or a reagent "enters” a cell when it is able to cross the plasma membrane and enter the interior of the cell without needing any specific ligand or receptor.
  • some of the chemical compounds cited in this document will use the following abbreviations or trade names:
  • HOBt Hydroxybenzotriazole. Organic compound derived from benzotriazoles that is used in the synthesis of peptides by solid phase to produce activated esters.
  • Ethyl (hydroxyimino) cyanoacetate marketed as OxymaPure®: Coupling reagent used in the synthesis of peptides by solid phase.
  • DEC ⁇ , ⁇ '-Diisopropylcarbodiimide.
  • EDC N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimidahydrochloride.
  • Water soluble carbodiimide coupling reagent used in the synthesis of peptides by solid phase.
  • DMF ⁇ , ⁇ -dimethylformamide. Liquid organic compound at room temperature, colorless, miscible with water and in most organic solvents and used as a solvent for chemical reactions.
  • a first aspect of the invention relates to a probe from now on "probe of the invention” (Fig. 1, A) comprising at least one crosslinked and functionalized polymeric nanoparticle (N), at least one conjugated fluorophore (F) with the nanoparticle and at least one metal (M) chelated to the fluorophore.
  • This characterization is equivalent to the fact that the probe of the invention comprises at least one metal and at least one chelating fluorophore, or that the probe of the invention comprises less than one metal, at least one non-chelating fluorophore and at least one chelating agent.
  • the polymeric nanoparticle comprised in the probe may be the invention of polystyrene, 4- amino styrene, styrene, amino polystyrene, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid glycoic acid (PLGA), poly (N-vinyl pyrrolidone) (PVP), polyethylene glycol (PEG) , polycaprolatone, polyacrylic acid (PAA), polymethyl methacrylate, polyacrylamide, chitosan, gelatin or sodium alginate, among other polymers.
  • the nanoparticle comprised in the probe of the invention is made of polystyrene or 4-amino styrene.
  • the nanoparticle comprised in the probe of the invention is crosslinked with divinylbenzene (DVB), 1,4-bis (4-vinylphenoxy) butane, bis (2- methacryloyl) oxyethyldisulfide, azobisisobutyronitrile (AIBN), 2-dihydrochloride , 2'-azobis (2- methylpropionamidine) or benzoylperoxide (BPO).
  • this nanoparticle is crosslinked with divinylbenzene.
  • the nanoparticle is functionalized with amino, carboxyl (in particular carboxylic acid), maleimide, azide, alkyne, tetrazine, thiol, cyclooctin, alcohol groups.
  • the nanoparticle is functionalized with amino groups (animofunctionalized).
  • the nanoparticle comprised in the probe of the invention is made of polystyrene, is crosslinked with divinylbenzene and functionalized with amino groups.
  • the probe of the invention comprises fluorophores which in turn are chelating agents, so it does not require the incorporation of additional agents.
  • the metal ions are chelated to the fluorophores.
  • the probe of the invention comprises at least one fluorophore that is not a chelating agent together with at least one chelating agent such as, for example, diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), diethylenetriamine, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the fluorophores are functionalized with sulfonate groups, which act as chelating agents.
  • the fluorophores covalently bound to the nanoparticle comprised in the probe of the invention are fluorophores of the harmful family, a synthetic family of fluorophors belonging to the group of polymetins, preferably harmful selected from the group formed by Cy3, Cy5 and Cy7.
  • the metals that are chelated to the fluorophore in the probe of the invention are isotopes of palladium or lanthanides, preferably isotopes of metals selected from the group consisting of Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy , Ho, Er, Tm, Yb, Lu and Pd, more preferably Pd.
  • the probe of the invention comprises several isotopes of the same metal (Fig. 1, B).
  • the probe comprises several metal isotopes selected from the group consisting of Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu and Pd.
  • the probe of the invention comprises several palladium isotopes.
  • the size of the nanoparticle comprised in the probe of the invention is between 100 and 2000 nm (nanometers), preferably between 1000 and 2000 nm, preferably between 100 and 300 nm, more preferably between 400 and 900 nm.
  • the probes of the invention have been designed for the development of cellular assays and serve as probes, hereinafter in both flow cytometry (FACS) and mass cytometry (CyTOF).
  • FACS flow cytometry
  • CDT mass cytometry
  • the probes presented in this invention allow live cell screening when entering the cells without offering any cytotoxicity and without the need to permeabilize the cells, in such a way that allows prolonged culture of cells labeled with these markers.
  • these probes are not specific to any cell type so they can be used for different types of cell lineages allowing them to be used to encode different cell lines and their subsequent co-culture.
  • the invention relates to a method of synthesis of probes of the invention, hereinafter "method of synthesis of the invention”.
  • the synthesis process of the invention comprises the following steps:
  • Emulsion-polymerization to obtain a cross-linked and aminofunctionalized nanoparticle.
  • the starting materials for the emulsion-polymerization process contain heterocarbon chains, (chains that contain mainly carbon and hydrogen, but also include heteroatoms such as nitrogen, oxygen or sulfur).
  • polystyrene, 4-aminostyrene, styrene, amino polystyrene, polylactic acid (PLA), acidopolylactic glycolic acid (PLGA), poly (N-vinyl pyrrolidone) (PVP), polyethylene glycol (PEG), polyproprotone, acid can be used.
  • styrene and 4-amino styrene are used as the starting material.
  • crosslinking agents suitable for carrying out the process of the invention are, divinylbenzene (DVB), 1,4-bis (4-vinylphenoxy) butane, bis (2- methacryloyl) oxyethyldisulfide, azobisisobutyronitrile (AIBN), 2-dihydrochloride , 2'-azobis (2- methylpropionamidine) or benzoylperoxide (BPO).
  • the crosslinking agent employed is divinylbenzene (DVB).
  • a functionalized nanoparticle can be obtained, that is, a nanoparticle in which the final end of the heterocarbon chains comprising the polymer that is our nanoparticle is functionalized.
  • the nanoparticle can be functionalized with amino, carboxyl (in particular carboxylic acid), thiol, maleimide, triazine, tetrazine, thiol, cyclooctin, alcohol or crlick-chemistry groups (including azide and alkyne groups).
  • the functionalization is carried out with amino groups.
  • the process of the invention consists of an emulsion-polymerization process using polystyrene or 4-aminostyrene, using divinylbenzene (DVB) as a crosslinking agent.
  • DVD divinylbenzene
  • carbon chain functionalization reactions of the nanoparticles with heterocarbon chains that can be branched and which from now on will be called "carbon chain” are carried out, by means of the reaction between the acid, amino, and carboxyl functional groups (in particular carboxylic acid), thiol, maleimide, triazine, tetrazine, thiol, cyclooctin, alcohol, azide and alkyne, among others, of the carbon chain and amino functional groups, carboxy (in particular carboxylic acid), thiol, maleimide, triazine, tetrazine , thiol, cyclooctin, alcohol, azide and alkyne of the amino functionalized nanoparticles.
  • carboxy in particular carboxylic acid
  • thiol maleimide
  • triazine tetrazine
  • thiol cyclooctin
  • alcohol azide and alkyne of the amino functionalized nanoparticles.
  • the carbon chain contains one or more suitable groups to form a covalent bond with the active molecules and at the same time generates a space between the nanoparticle and said molecules.
  • They are variable length chains which have groups capable of forming covalent bonds, in particular the orthogonal groups between them, that is, they are deprotected with different procedures during the synthesis. Its presence improves biocompatibility and decreases the interactions between the nanoparticle and the active molecules.
  • chains with a carbon number between 6 and 24 examples include chains with a carbon number between 6 and 24; chains of methoxypolyethylene glycols; dimethylsuberimidate chains; chains of polyalkyl glycols, in particular polyethylene glycols, among which the chain of 4,7,10-triossa-1, 13-tridecanediammine (PEG spacer) is preferably used.
  • the chain length can also be modified according to the needs (steric hindrance of the molecules to be bound, reaction conditions, etc.) by adding more heterocarbon chains.
  • the coupling reagent employed in the solid phase synthesis reaction is selected from HOBt, DIC, Oxyma Puré® or EDC using DMF as solvent.
  • the fluorophores used in this stage have harmful type structure, more preferably harmful selected from the group formed by Cy3, Cy5 and Cy7, and more preferably harmful selected from the group formed by Cy3, Cy5 and Cy7 functionalized with sulfonate groups.
  • the sulfonated Cy3, Cy5 and Cy7 fluorophores (Sulfo-Cy3, Sulfo-Cy5 and sulfo Cy7, respectively) are reacted through their carboxylic acid groups previously activated by an NHS ester functionalization.
  • Sulfo-Cy5 with maleimide, amine, carboxylic acid, azide, thiol, maleimide, alkyne and tetrazine can be used, which would allow using nanoparticles functionalized with thiol, carboxylic acid, and also azide.
  • a chelating agent will be incorporated previously or subsequently.
  • a branched carbon chain containing two functional groups capable of forming covalent bonds is used.
  • functional groups capable of forming covalent bonds carry orthogonal protecting groups.
  • the method comprises a phase, prior to the incorporation of the chelating agents or fluorophores, which incorporates spacers between the fluorophores and the polymer chains.
  • the acid functional groups of the chemical spacers such as polyethylene glycol or glycine
  • the amino functional groups of the aminofunctionalized nanoparticles by solid phase peptide synthesis protocols.
  • the nanoparticles of the invention can comprise metals with different atomic mass and / or isotopes of the same metal so that they can be detected by mass cytometry and can also contain several fluorophores, preferably fluorophores consisting of harmful functionalized with groups sulfonates, more preferably harmful selected from the group consisting of Cy3, Cy5 and Cy7, functionalized with sulfonate groups.
  • the present invention relates to a method of cellular coding by barcode or barcoding, hereinafter "barcoding method of the invention” which employs the nanoparticles of the invention.
  • the barcoding process of the invention allows different cell types to be discriminated based on the type of nanoparticles with which they are nanofected due to the unique, predefined combination of a fluorophore and different palladium isotopes on the same probe.
  • This unique combination detected by mass cytometry and flow cytometry, allows the probes to act as bar codes, each combination of fluorophobic and palladium isotopes being a different code from the rest. In this way you can make a simultaneous reading of different cell lines.
  • each of the coded probes ( Figure 2) must be incubated with different types of cell lines. In this way a particular cell line will have a specific combination of isotopes and / or fluorophore that can subsequently be identified by mass cytometry and / or flow cytometry. Once the cells are incubated with the probes, they "enter" the cells without the need for any specific ligand or receptor and without producing any cytotoxic effect. Once each cell line is marked, they are co-cultured under the same conditions and subsequently analyzed by mass cytometry and / or flow cytometry.
  • Another aspect is to use a single cell line that can be a primary cell line and encode different treatments that are carried out in that cell line, so that the different phenotypic responses to the different treatments can be read simultaneously.
  • the present invention relates to the use of probes of the invention to activate pro-drugs by cytoplasmic catalysis of organometallic reactions inside living cells.
  • the ability to enter living cells of the probe of the invention allows a prodrug to be introduced into a cell, releasing the active drug by an organometallic catalysis process between the probe metal and the prodrug.
  • the invention in another aspect, relates to a method of treatment comprising the administration of active ingredients bound to the probe of the invention.
  • modified drugs that can be administered together with the probe of the invention are those whose prodrugs are activated with metals such as drugs such as 5-fluoruracil (5-FU), gemcitabine, cladribine or cytarabine.
  • drugs such as 5-fluoruracil (5-FU), gemcitabine, cladribine or cytarabine.
  • the synthesis of the probes was performed following the following steps: Emulsion-polymerization to obtain a cross-linked and aminofunctionalized nanoparticle.
  • An emulsion-polymerization process of styrene and 4-amino styrene was carried out with a crosslinking agent to obtain an aminofunctionalized nanoparticle.
  • the reaction was carried out at 80 ° C in an inert atmosphere and using magnesium sulfate as a stabilizing agent. After 30 minutes from the start of the reaction, the water-soluble radical initiator, 2-dihydrochloride-2'-azobis- (2-methylpropionamide) (V-50), was added. The reaction was maintained for another two hours under stirring. In this way nanoparticles with diameters between 100 and 2000 nanometers were obtained.
  • the nanoparticles were preconditioned by washing, three times, with dimethylformamide (DMF), through suspension-centrifugation cycles (13,400 rpm, 3 minutes). Subsequently, 75 equivalents of fmoc-4,7, 10-trioxa-1, 13-tridecanediaminesuccinamic acid (Fmoc-PEG-OH) or Fmoc-Glycine were dissolved in 1 mL of DMF together with 75 equivalent of Oxyma and 75 equivalent of ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarbodiimide (DIC). The mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. After that time, the solution was added to the dried nanoparticles, suspended, and the suspension was allowed to stir at 60 ° C and 1,400 rpm for 2 hours.
  • DMF dimethylformamide
  • DIC dimethylformamide
  • the nanoparticles were washed with three suspension-centrifugation cycles (13,400 rpm, 3 minutes) to obtain the Fmoc-PEGylated nanoparticles.
  • the deprotection of the Fmoc protective group fluorenylmethoxycarbonyl was carried out by a treatment consisting of three washes. 20 minutes with 1 mL of 20% piperidine in DMF. After treatment with piperidine, three washes with 1 mL of DMF (13400 rpm, 3 minutes) were performed by suspension-centrifugation cycles.
  • cyanine fluorophore Cy3, Cy5 or Cy7
  • a stock solution of 1 mg / mL of the cyanine fluorophore (sulfo-fluorophore NHS ester) in DMF was used and a 10 mM solution of palladium acetate in DMF.
  • the same volume of fluorophore solution is taken as the volume of nanoparticles with which one is working (eg if working with 50 nanoparticles, 50 fluorophore solution is used), and 2 of de, ⁇ - are added diisopropylethylamine (DI PEA) and stir.
  • DI PEA diisopropylethylamine
  • the nanoparticles are conditioned in methanol, they are centrifuged, the supernatant is removed, 1 ml of a 10% solution of hydrazine in methanol is added to reduce the palladium (II) to palladium (0), and it is suspended. The suspension is stirred at room temperature for 30 minutes, at 1,400 rpm, at room temperature, in the absence of light.
  • the probes are centrifuged (13,400 rpm, 5 min) and washed three times with suspension-centrifugation cycles with methanol (13,400 rpm, 5 min) and three times with water (13,400 rpm, 8 min), and finally suspended in the same volume of water as the volume of nanoparticles with which work began (eg 50 ⁇ _).
  • the probes (Fig. 3) consisted of nanoparticles functionalized with a cyanine fluorophore (Sulfo-Cy5 or Sulfo-Cy3) and with a combination of three different palladium isotopes selected from group 102 Pd , 105 Pd, 106 Pd and 108 Pd, with a determined and known proportion. In this way we obtained different barcodes depending on the combination of fluorophore and palladium isotopes that each probe contains. Subsequently, a characterization was performed by flow cytometry (FACS) and mass cytometry (CyTOF) of each probe.
  • FACS flow cytometry
  • CDTOF mass cytometry
  • NP nanoparticles
  • NP nanoparticles
  • NP fluorophore
  • OAc isotope palladium
  • MDA-MB-231 cells were incubated for 6h with the metalofluorescent NPs, at increasing amounts of NPs per cell up to 10,000 NPs / cell, in 24-well plates, at 50,000 cells / well.
  • the results show that when using 5,000 NPs / cell, the NPs enter the MDA-MB-231 tumor cells and that they are detectable by FACS (Figure 17).
  • the MDA-MB-231 cells with 5,000 NPs / cell were chosen to nanofect for 3 hours, in 6-well plates, with 1,000,000 cells / well.
  • MDA-MB-231 + NP-Cy5- 106 Pd / MDA-MB-231 + NP-Cy5- 110 Pd 50% -50%):
  • the cells were incubated with each type of NP separately and, at the time of preparing the tube for CyTOF, they nanofectadas cells with NP-106 Pd and Cy5- nanofectadas cells with NP-Cy5- 110 Pd, in a proportion of 50% -50% were mixed, to achieve the same cell concentration / mL than in the previous experiments (figure 21).
  • the cells were incubated with each type of NP separately and, at the time of preparing the tube for CyTOF, they nanofectadas cells with NP-106 Pd and Cy5- nanofectadas cells with NP-Cy5- 110 Pd, in a proportion of 25% -75%, mixed until reach the same concentration of cells / mL as in the previous experiments (figure
  • MDA-MB-231 + NP-Cy5- 106 Pd / MDA-MB-231 + NP-Cy5- 110 Pd 75% -25%):
  • the cells were incubated with each type of NP separately and, at the time of preparing the tube for CyTOF, they nanofectadas cells with NP-106 Pd and Cy5- nanofectadas cells with NP-Cy5- 110 Pd, in a proportion of 75% -25% were mixed, to achieve the same cell concentration / mL than in the previous experiments (figure
  • percentage corresponds to signal a given experiment plotted against the channel signal generated in the isotope 106 Pd, when cells are nanofectadas only with NP-Cy5- 106 Pd.
  • -% 110 Pd corresponds to the percentage that the signal of a given experiment represents against the signal generated in the 110 Pd isotope channel, when the cells are nanofected only with NP-Cy5- 110 Pd.
  • each of the synthesized NPs corresponds to a specific code that can be used to encode cells
  • Metalofluorescent NPs are incorporated by cells, behaving in a non-toxic manner.
  • Metalofluorescent NPs incorporated into cells are easily detectable by flow cytometry (FACS) and by mass cytometry (CyTOF), behaving as dual probes.

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Abstract

La invención describe sondas basadas en nanopartículas entrecruzadas fluorescentes y funcionalizadas con metales que actúan como sondas duales, sirviendo tanto para la citometría de flujo (FACS) como la citometría de masas (CyTOF). Estas sondasse pueden aplicar para realizar codificación por código de barras de células vivas o para llevar a cabo estudios in vivo de diferentes linajes celulares a través de co-cultivos celulares.

Description

SONDAS DUALES PARA CITOMETRÍA DE FLUJO Y CITOMETRÍA DE MASAS CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra en el campo del análisis de la biología celular, dentro del campo del análisis de células y más concretamente en el de las sondas para citometría.
El campo de aplicación de la invención es la citometría, especialmente en el de la citometría de flujo (FACS) y citometría de masas (CyTOF). De forma particular, las sondas que se describen se pueden aplicar para realizar codificación por código de barras de células vivas o para llevar a cabo estudios in vivo de diferentes linajes celulares a través de co-cultivos celulares
ESTADO DE LA TÉCNICA
Citometría de flujo (FACS)
La citometría de flujo (FACS, del inglés "Fluorescence-activated cell sorting') es una técnica que se utiliza para enumerar los niveles absolutos de células y sus subconjuntos. Se usa ampliamente para análisis de células sanguíneas y otras muestras clínicas y para identificar bacterias patógenas. La citometría de flujo es una tecnología madura que utiliza la hidrodinámica para enfocar una corriente de partículas alineadas. Se usa la óptica para iluminar una partícula con láser u otras fuentes de luz y detectores para resolver la luz dispersa así como señales fluorescentes. La especificidad para un subconjunto diana de células se logra uniendo marcadores fluorescentes al subconjunto con moléculas de afinidad tales como anticuerpos. El coste típico de un FACS está en el rango de $ 40,000 a $ 150,000. Otra clase de citómetros de flujo es el contador Coulter (CC). Al medir la impedancia eléctrica a través de una abertura, el contador Coulter puede medir el recuento de células y el volumen. Los contadores Coulter se usan rutinariamente como analizadores hematológicos para los glóbulos rojos y blancos. Otras aplicaciones incluyen biología celular, análisis de alimentos, cosméticos, metales y biología marina.
Citometría de masas (CyTOF)
La citometría de masas (CyTOF, del inglés "Cytometryby Time-Of-Flighf.) es una técnica novedosa que se desarrolló inicialmente por DVS Sciences que fue adquirida por la empresa Fluidigm.
La citometría de masas es una herramienta analítica que permite, simultáneamente, la detección y cuantificación de docenas de marcadores dentro de una misma partícula y/o célula [Bandura DR et al.: Mass cytometry: technique for real time single cell multi target immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem, 2009, 81 :6813-6822] gracias al uso de metales pesados asociados a la detección mediante espectroscopia de masas. Esto le otorga una alta capacidad de multiplexing necesaria hoy día en los laboratorios de investigación biomédicos. Además, permite hacer análisis de células individuales. Esta técnica utiliza metales que aparecen en el periodo 6 de la tabla periódica, normalmente lantánidos, como marcadores. Estos metales se usan a modo de huella dactilares debido a que son elementos que no se encuentras en las células y sus espectros de masas son fácilmente identificables debido a sus distribuciones isotópicas específicas para cada uno de ellos. Hoy día existen 14 lantánidos comerciales, con 38 isótopos puros y estables que se utilizan para el mareaje de anticuerpos y polímeros para citometría de masas. Actualmente, la mayoría de las aplicaciones de la citometría de masas se basan en el uso anticuerpos conjugados con un isótopo específico de metal estable de masa atómica definida, que actúa como reportero [llly, N., et al. Metal-chelating polymers by anionic ring-opening polymerization and their use in quantitative mass cytometry, Biomacromolecules, 2012, 13(8): 2359-69]. Desde su introducción en el período 2008-2009, los grupos científicos que tienen acceso a esta plataforma han llevado a cabo análisis revolucionarios a nivel de células individuales usando muestras biológicas heterogéneas de una manera nunca antes vista hasta la fecha. Por ejemplo, estos grupos han publicado las respuestas inmunes a fármacos viendo la células hematopoyéticas a nivel de células individuales [Bendall SC et al.: Single-cell mass cytometry of differential i m muñe and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science, 201 1 , 332(6030):687-96], han puesto de manifiesto la heterogeneidad fenotípica de la leucemia humana [Amir el-AD et al.: viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveáis phenotypic heterogeneity of leukemia, Nature Biotechnology, 2013, 31 , 545-552] y han sido capaces de identificar la reprogramación de los reguladores de células madre, descifrando así los primeros pasos que conducen a la adquisición de la pluripotencia de las células adultas [Spitzer MH et al.: Mass Cytometry: Single Cells, Many Features. Cell, 2016, 165 (4), 780 - 791]. Estos resultados demuestran la alta especificidad y sensibilidad que ofrece esta nueva herramienta que se basa en citometría de flujo y plasma acoplado inductivamente (ICP) como fuente de ionización que están asociados a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF) (MS) - ICP-TOF MS [Liu, R. et al: \nductively coupled plasma mass spectrometry based immunoassay: A review. Mass Spectrometry Reviews, 2014, 33, 373-393]. Previo al análisis, las células se marcan con anticuerpos marcados con isótopos de metales pesados y se usan protocolos clásicos para la citometría de flujo estándar. Una vez que se lleva a cabo la incubación, las células son nebulizadas y cada célula individual es detectada por ICP-TOF MS en lugar de la fluorescencia. La creación de un espectro de masas individual por célula permite identificar y cuantificar la composición de isótopos de metales pesados. Esto permite aumentar, de forma muy significativa, la capacidad de multiplexación de los ensayos a nivel de una sola célula y con una alta sensibilidad.
Recientemente, la citometría de masas se ha aplicado para crear imágenes de muestras de tejidos. [WO 2016/090356 A1]
Uso de reactivos con metales para el mareaje celular Los metales, principales los metales pesados y los lantánidos, asociados a polímeros y anticuerpos son los elementos que se emplean en citometría de masas (CyTOF) como marcadores [llly, N., et al. Metal-chelating polymers by anionic ring-opening polymerization and their use in quantitative mass cytometry, Biomacromolecules, 2012, 13(8): 2359-69]. Existen marcadores que engloban por ejemplo isótopos de paladio (102, 104, 105, 106, 108, 1 10) molecular unidos a polímeros lineares [Zunder, E. R. et al, Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm, Nature Protocols, 2015, 10, 316-333], [Behbehani, G. K. et al.: Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A 85 (2014): 1 ,01 1-1 ,019], [Majonis, D. et al. Dual-purpose polymer labels for fluorescent and mass cytometric affinity bioassays. Biomacromolecules 14 (2013): 1 ,503-1 ,513], que se utilizan sobre células ya fijadas. En el año 2015 se presentaron estos reactivos con el objeto de ser usados como código de barras usando paladio pero con el inconveniente que sólo sirve para células fijadas.
Estos polímeros lineares metalo-fluorescences no son capaces de entrar en las células vivas por lo que deben emplease sobre células ya fijadas para poder permeabilizarlas y así permitir su entrada dentro de las células, Por tanto, no permiten realizar estudios celulares in vivo ni co- cultivos celulares.
Uso de nanopartículas de poliestireno
Al inicio del desarrollo del citómetro de masas se desarrollaron partículas de poliestireno con metales que se usaron como calibrante del equipo [Abdelrahman Al et al., Metal-Containing Polystyrene Beads as Standards for MassCytometry, J Anal At Spectrom., 2010, 25(3): 260-268]. Estas nanopartículas compuestas por poliestireno y polliacrilato atrapaban salen metálicas durante el proceso de polimerización por dispersión. Se usan como un calibrante interno para estudios celulares mediante espectroscopia de masas pero no como marcadores celulares per se. Los autores no informan de su citotoxicidad ya que se emplean una vez que las células están fijadas y marcadas con anticuerpos con metales como un calibrante interno del sistema. Recientemente, se han presentado microgeles codificados con lantánidos [Lin W. et a\.:A High- Sensitivity Lanthanide Nanoparticle Repórter for Mass Cytometry: Tests on Microgeis as a Proxy for Cells. Langmuir 2014; 30(11): 3142-3153]. Estos microgeles compuestos por poli(NIPAm/VCL/MAA) recubren a sales nanocristalinas de lantánidos.
Códigos de barras para la codificación celular
La codificación celular mediante código de barras consiste en el mareaje único y exclusivo de cada línea celular con una combinación de isótopos de metales. El código asignado es específico, como una huella dactilar, comportándose así como un código de barras. De tal forma que cada combinación de isótopos sólo la lleva un determinado tipo de células, bien sean distintas líneas celulares o células primarias que provienen de distintos pacientes.
Las perspectivas de futuro indican a un uso extendido de CyTOF para la codificación celular por código de barras debido al gran número de marcadores que esta tecnología permite por célula. Se conocen pocas referencias que presentan reactivos para llevar a cabo esta codificación mediante fluorescencia (FCB, del inglés "FluorescentCelIBarcoding") [Fluorescent CellBarcodingfor Multiplex FlowCytometry, CurrProtocCytom. 2011 Jan; CHAPTER: Unit-6.31] y aún menos, solo tres, por citometría de masas (MCB, del ingles "Mass Cell Barcoding") lineales [Zunder, E. R. et al, Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm, Nature Protocols, 2015, 10, 316-333], [Behbehani, G. K. et al.: Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A 85 (2014): 1 ,011-1 ,019], [Majonis, D. et al. Dual-purpose polymer labels for fluorescent and mass cytometric affinity bioassays. Biomacromolecules 14 (2013): 1 ,503-1 ,513]. Algunos de los reactivos desarrollados en estas investigaciones se transfirieron al mercado y desde 2015 están siendo comercializados por Fluidigim. En particular, hay un polímero linear que lleva quelado distintos isótopos de paladioque es capaz de ser usado como código de barras para ser leído por citometría de masas. Este reactivo presenta el inconveniente que sólo sirve para células fijadas. Estos códigos de barras engloban isótopos de paladio (102, 104, 105, 106, 108, 1 10) molecular. Por otro lado, existe un polímero lineal, desarrollado por DVS, que unido a anticuerpos se usa para marcar anticuerpos tanto con metales como con fluoróforos, lo que permite leerlo tanto por fluorescencia como por citometría de masas [Majonis, D. et al. Dual-purpose polymer labels for fluorescent and mass cytometric affinity bioassays. Biomacromolecules 14 (2013): 1 ,503-1 ,513]). Este polímero actúa solamente como enlace entre los metales y el fluoróforo con el anticuerpo. Sin embargo, estos polímeros metalo-fluorescentes al ser lineales y no estar en forma de nanopartículas tampoco tienen capacidad de entrar en las células. Además, el polímero se une a un anticuerpo, que a su vez se une a un ligando de superficie de las células, lo que permite el mareaje de distinto tipos celulares, pero al mismo tiempo impide realizar un estudio de linajes celulares distintas puesto que sólo identifican células que presenten un determinado marcador, es decir, sólo pueden unirse a las células que posean el ligando elegido. Estos reactivos no se han estudiado en relación a su citotoxicidad ya que se usan en células ya fijadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención describe sondas que comprenden nanopartículas entrecruzadas fluorescentes y funcionalizadas con metales que son aptas tanto para realizar citometría de flujo (FACS) como citometría de masas (CyTOF). Estas sondas son atóxicas, entran a las células per se, sin necesidad de fijarlas y permeabilizarlas y su entrada no depende de ningún perfil fenotípico especial, por lo que son útiles para el mareaje de diferentes líneas celulares. Además, es posible emplearlas en células vivas, permitiendo así el posterior co-cultivo celular. Estos co-cultivos son susceptibles de experimentación y, como las nanopartículas se encuentran dentro de las células, se puede hacer codificación celular por código de barras. Además, como son fluorescentes, después de la experimentación se puede realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia ("so/fed", en inglés) y recoger los linajes celulares que sean de interés para estudios posteriores. A diferencia de las polímeros para CyTOF mencionadas en la sección anterior, estas sondas son capaces de entrar en las células sin necesidad de permeabilizar, no son tóxicas [YusopM. R. et al.; Palladium-mediated intracellular chemistry. Nature Chemistry.201 1 , 3, 239-423], [Unciti- Broceta, A. et al. Synthesis of polystyrene microspheres and functionalization with PdO nanoparticles to períorm bioorthogonal organometallic chemistry in living cells. NatureProtocols. 2012, 7, 1207-1218], y no afectan al proteoma de las células, lo que permite realizar estudios sobre células vivas. Al atravesar las membranas de las células per se, sin necesidad de permeabilización, lo cual implica fijar las células, las sondas que se describen en esta invención permiten realizar co-cultivo de diferentes líneas celulares y ensayos múltiples.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de las sondas objeto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de codificación celular por código de barras (barcoding) que emplea las nanopartículas de la invención. En un cuarto aspecto, la a presente invención se refiere al uso de las sondas de la invención para activar pro-fármacos mediante catálisis citoplasmática de reacciones organometálicas en el interior de células vivas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representación esquemática de dos sondas de la invención en la que una nanopartícula (N) se funcionaliza con un fluoróforo (F) al que se le unen A) un metal (M) o B) varios metales o isótopos metálicos distintos (M1 , M2 y M3). Figura 2. Viabilidad celular (ensayo MTT) de células MDA-MB-231 nanofectadas durante 6 días con sondas fluoro-metálicas expresada como porcentaje de las células no nanofectadas de control.. B) Análisis de captación celular de sondas fluoro-metálico por células MDA-MB-231 a diferentes proporciones por célula, medida por citometría de flujo. C) Diagramas de dispersión representativos de CyToF del porcentaje de absorción de Pd (0) -Cy5-PEG-NPsoo Con un número creciente de nanopartículas (0, 100 y 1.000 sondas por célula). Intercalante marcado con 191 lr se utilizó para la tinción de núcleos. D) Comparación de las curvas de captación de Pd (0) -Cy5- PEG-N P500 por medio de citometría de flujo y CyToF con las mismas células. El análisis ANOVA bidireccional seguido por un test post hoc de Bonferroni no mostró diferencias entre las técnicas. (E) Imagen de microscopía confocal de una célula nanofectada representativa en una relación de 3.000 Pd (0) -Cy5-PEG-NPsoo / célula. Las flechas apuntan a sondas en el citoplasma celular.
Figura 3. Ejemplo de sistema de codificación dual capaz de codificar hasta 8 líneas celulares distintas empleando 4 combinaciones de isótopos de paladio (102Pd, 105Pd, 106Pd y 108Pd) que pueden ser individualizadas por citometría de masas y cada una de ella a su vez con una fluoróforo distinto (Cy3 y Cy5) capaces de ser diferenciados por citometría de flujo.
Figura 4. Esquema de reacción de desprotección fluorogénica de bis-aliloxicarbonil rodamina catalizada por microesferas Pd (0).
Figura 5. Esquema de la reacción provocada sobre profármacos de gemcitabina y 5-FU mediante catálisis organometálica. Figura 6. Gráficos correspondientes a la emisión de fluorescencia en FACS, canal de APC. A - E: A) NP control, sin Cy5; B) NP-Cy5-106Pd; C) NP-Cy5-110Pd; D) NP-Cy5-106Pd -110Pd y E) NP- Cy5-Pd(OAc)2.
Figura 7. Gráficos correspondientes a la emisión de fluorescencia en FACS, canal de PE. A - E: A) NP control, sin Cy3; B) NP-Cy3-106Pd ; C) NP-Cy3-110Pd; D) NP-Cy3-106Pd -110Pd y E) NP- Cy3-Pd(OAc)2.
Figura 8. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy5-106Pd. A - C: Señales
correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo solamente positivas para 106Pd. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente.
Figura 9. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy5-110Pd. A - C: Señales
correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo solamente positivas para 110Pd. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente. Figura 10. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy5-106Pd -110Pd. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas tanto para 106Pd como para 110Pd. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente.
Figura 11. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy5-Pd(OAc)2. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas para todos ellos. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente.
Figura 12. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy3-106Pd. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas para 106Pd. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd,
respectivamente.
Figura 13. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy3-110Pd. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas para 110Pd. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd,
respectivamente.
Figura 14. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy3-106Pd -110Pd. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas para io6Pd y nopd D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente.
Figura 15. Gráficos correspondientes a CyTOF para NP-Cy5-Pd(OAc)2. A - C: Señales correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd respectivamente, siendo positivas para todos ellos. D - F: Histogramas correspondientes a los isótopos 106Pd, 110Pd y 105Pd, respectivamente.
Figura 16. A - E. Gráficos correspondientes al porcentaje de viabilidad celular en función del número de NPs por célula, tras 96h de incubación.
Figura 17. Gráfico representativo del porcentaje de células MDA-MB-231 positivas en el canal APC después de haber sido incubadas con 5.000 NPs por célula durante 6h. A) y D) Células MDA-MB-231 control, sin incubar con NPs; B) y E) Células MDA-MB-231 incubadas con NPs control; C) y F) Células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-106Pd y NP-Cy5-110Pd, respectivamente. Figura 18. Gráficos correspondientes a células MDA-MD-231 en CyTOF. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Arriba: señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
Figura 19. Gráficos correspondientes a células MDA-MD-231 , incubadas con NP-Cy5-106Pd en CyTOF. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Arriba: señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
Figura 20. Gráficos correspondientes a células MDA-MD-231 , incubadas con NP-Cy5-110Pd en CyTOF. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Arriba: señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
Figura 21. Gráficos correspondientes a la mezcla 50%-50% de células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-106Pd y células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-110Pd. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Arriba: señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
Figura 22. Gráficos correspondientes a la mezcla 25%-75% de células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-106Pd y células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-110Pd. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Los dos gráficos de arriba muestran la señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
Figura 23. Gráficos correspondientes a la mezcla 75%-25% de células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-106Pd y células MDA-MB-231 incubadas con NP-Cy5-110Pd. Izquierda: señal correspondiente al canal del isótopo 106Pd. Derecha: señal correspondiente al canal del isótopo 110Pd. Arriba: señal de los isótopos de Pd frente al marcador celular Ir. Abajo: señal de los isótopos de Pd frente al "Event Length".
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones: A efectos de la presente invención se considerarán Isótopos" de un metal a otros metales que tienen su mismo número atómico pero distinta masa atómica. El término "fluoróforo" se refiere a cualquier compuesto químico fluorescente, usado como colorante, que después de excitarse a una determinada longitud de onda, emite luz a longitudes de ondas mayores. Un ejemplo de fluoróforo son los colorantes de metina o "poli metí nas' compuestos fluorescentes que comprenden un número impar de CH vinculado en una cadena de carbono conjugado en forma de zig-zag. En función de los grupos de átomos situados en el extremo de la cadena de carbono, el colorante de polimetina se divide en diferentes familias como las dañinas o y antocianina.
Así, "codificación celular por código de barras" o "barcoding" (término habitualmente empleado) se refiere a cualquier técnica que comprenda la identificación de distintas líneas celulares a través de una combinación única predefinida de isótopos metálicos y fluoróforos.
El término "polímero" se refiere a cualquier macromolécula formada por uniones covalentes de múltiples unidades de una misma unidad molecular. El término " ' nanofección" comprende cualquier procedimiento de introducción de nanopartículas en células.
El término "multiplexación" (del inglés "multiplexing") está referido a la capacidad para medir, simultáneamente, múltiples analitos en una misma muestra.
Por "reportero" se entenderá cualquier componente responsable de generar una señal que puede ser detectada posteriormente.
El concepto "fijación de células" comprende cualquier manipulación de células vivas que tenga por objeto de mantener toda su arquitectura estructural y química inalterada mientras que se inhiben todas sus funciones bioquímicas.
El término "permeabilización de células" comprende cualquier tratamiento mediante el cual se favorezca la entrada de biomoléculas, reactivos o nanopartículas dentro de las células.
También se entenderá que una sonda, una nanopartícula, un marcador o un reactivo, "entra" en una célula cuando es capaz de atravesar la membrana plasmática e introducirse en el interior de la célula sin necesitar de ningún ligando o receptor específico. Asimismo, los algunos de los compuestos químicos citados en este documento emplearán las siguientes abreviaturas o nombres comerciales:
HOBt: Hidroxibenzotriazol. Compuesto orgánico derivado de los benzotriazoles que se utiliza en la síntesis de péptidos mediante fase sólida para producir ésteres activados.
Etil(hidroxiimino)cianoacetato, comercializado como OxymaPure®: Reactivo de acoplamiento utilizado en la síntesis de péptidos mediante fase sólida.
DIC: Ν,Ν'-Diisopropilcarbodiimida. Reactivo de acoplamiento tipo carbodiimida, soluble en disolventes orgánicos, utilizado en la síntesis de péptidos mediante fase sólida.
EDC: N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidahidrocloruro. Reactivo de acoplamiento tipo carbodiimida, soluble en agua, utilizado en la síntesis de péptidos mediante fase sólida.
DMF: Ν,Ν-dimetilformamida. Compuesto orgánico líquido a temperatura ambiente, incoloro, miscible en agua y en la mayoría de disolventes orgánicos y que se utiliza como disolvente de reacciones químicas.
Finalmente, el término "comprende", que también podrá interpretarse como "consiste en", y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Sondas de la invención
Un primer aspecto de la invención se refiere a una sonda de ahora en adelante "sonda de la invención" (Fig. 1 , A) que comprende al menos una nanopartícula polimérica entrecruzada y funcionalizada (N), al menos un fluoroforo (F) conjugado con la nanopartícula y al menos un metal (M) quelado al fluoroforo.
Esta caracterización equivale a que la sonda de la invención comprende al menos un metal y al menos un fluoroforo quelante, o bien, a que la sonda de la invención comprende menos un metal, al menos un fluoroforo no quelante y al menos un agente quelante.
La nanopartícula polimérica comprendida en la sonda puede ser invención de poliestireno, 4- aminoestireno, estireno, amino poliestireno, ácido poliláctico (PLA), acidopolilacticoco-glicolico (PLGA), poli(N-vinilpirrolidona) (PVP), polietilen glicol (PEG), policaprolatona, ácido poliacrílico (PAA), poli metil metacrilato, poliacrilamida, chitosan, gelatina o alginato de sodio, entre otros polímeros. En una realización particular, la nanopartícula comprendida en la sonda de la invención es de poliestireno o 4-aminoestireno. En otra realización particular, la nanopartícula comprendida en la sonda de la invención está entrecruzada con divinilbenceno (DVB), 1 ,4-bis(4-vinilfenoxi)butano, bis(2- metacriloil)oxietildisulfuro, azobisisobutironitrilo (AIBN), dihidrocloruro de 2,2'-azobis(2- metilpropionamidina) o benzoilperoxido (BPO). De forma preferente, esta nanopartícula está entrecruzada con divinilbenceno.
En otra realización particular, la nanopartícula está funcionalizada con grupos amino, carboxilo (en particular ácido carboxílico), maleimida, azida, alquino, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol. Preferentemente la nanopartícula está funcionalizada con grupos amino (animofuncionalizada).
En una realización aún más preferente, la nanopartícula comprendida en la sonda de la invención es de poliestireno, está entrecruzada con divinilbenceno y funcionalizada con grupos amino.
En una realización preferente, la sonda de la invención comprende fluoroforos que a su vez son agentes quelantes, por lo que no necesita la incorporación de agentes adicionales. De esta forma, en la sonda de la invención los iones metálicos se encuentran quelados a los fluoroforos.
No obstante, en otra realización particular, la sonda de la invención comprende al menos un fluoróforo que no es agente quelante junto con al menos un agente quelante como, por ejemplo, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), dietilentriamino, ácido etilendiaminotetraaceético (EDTA). Así, en otra realización preferente, los fluoroforos están funcionalizados con grupos sulfonatos, que actúan como agentes quelantes.
En otra realización particular, los fluoroforos unidos covalentemente a la nanopartícula comprendida en la sonda de la invención son fluoroforos de la familia de los dañinas, una familia sintética de fluoroforos que pertenece al grupo de polimetinas, preferentemente dañinas seleccionadas del conjunto formado por Cy3, Cy5 y Cy7.
En otra realización particular los metales que se encuentran quelados al fluorórofo en la sonda de la invención son isótopos de paladio o de lantánidos, preferentemente isótopos de metales seleccionados del grupo formado por Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu y Pd, más preferentemente Pd.
En una realización particular, la sonda de la invención comprende varios isótopos del mismo metal (Fig. 1 , B). En una realización preferente, la sonda comprende varios isótopos de metales seleccionados del grupo formado por Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu y Pd. En una realización más preferente, la sonda de la invención comprende varios isótopos de paladio. El tamaño de la nanopartícula comprendida en la sonda de la invención está comprendido entre 100 y 2000nm (nanómetros), preferentemente entre 1000 y 2000nm, preferente entre 100 y 300nm más preferentemente entre 400 y 900nm.
Las sondas de la invención se han diseñado para el desarrollo de ensayos celulares y sirven como sondas, en adelante tanto en citometría de flujo (FACS) como en citometría de masas (CyTOF). La sondas presentadas en esta invención permiten el mareaje de células vivas al entrar en las células sin ofrecer ninguna citotoxicidad y sin necesidad de permeabilizar las células, de tal forma, que permite el cultivo prolongado de células marcadas con estos marcadores. Además, estas sondas no son específicas de ningún tipo celular por lo que pueden ser usadas para distintos tipos de linajes celulares permitiendo ser usadas para codificar distintas líneas celulares y su posterior co-cultivo.
Procedimiento de la invención
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de sondas de la invención, en adelante "procedimiento de síntesis de la invención".
El procedimiento de síntesis de la invención comprende las siguientes etapas:
• Emulsión y polimerización de un material que comprende un monómero conformado por cadenas heterocarbonadas, un agente de entrecruzamiento, un iniciador de la polimerización y un monómero que comprende al menos un grupo amina o carboxílico, preferentemente amina, para obtener una nanopartícula entrecruzada y funcionalizada, y preferentemente aminofuncionalizada.
• Conjugación entre los aminos de la nanopartícula resultante en la fase anterior con los grupos ácidos de fluoróforos mediante reacciones de fase sólida.
• Incorporación de metales mediante quelación de los iones metálicos con los fluoróforos
A continuación se describe con mayor detalle cada una de estas etapas:
Emulsión-polimerización para obtener una nanopartícula entrecruzada y aminofuncionalizada.
Esta etapa se basa en el proceso encuentra descrito en [Sanchez-Martin y col., 2005, ChemBioChem, 6, 1341-1345]. Los materiales de partida para el proceso de emulsión-polimerización contienen cadenas heterocarbonadas, (cadenas que contienen principalmente carbono e hidrógeno, pero que también incluyen heteroátomos como nitrógeno, oxígeno o azufre).
A modo de ejemplo se puede emplear poliestireno, 4-aminoestireno, estireno, amino poliestireno, ácido poliláctico (PLA), acidopolilacticoco-glicolico (PLGA), poli(N-vinilpirrolidona) (PVP), polietilen glicol (PEG), policaprolatona, ácido poliacrílico (PAA), poli metil metacrilato, poliacrilamida, chitosan, gelatina o alginato de sodio, entre otros polímeros.
En una realización preferente, se utilizan estireno y 4-aminoestireno como material de partida. Ejemplos de agentes de entrecruzamiento aptos para llevar a cabo el procedimiento de la invención son, divinilbenceno (DVB), 1 ,4-bis(4-vinilfenoxi)butano, bis(2- metacriloil)oxietildisulfuro, azobisisobutironitrilo (AIBN), dihidrocloruro de 2,2'-azobis(2- metilpropionamidina) o benzoilperoxido (BPO). De forma preferente, el agente de entrecruzamiento empleado es divinilbenceno (DVB).
Tras el proceso de emulsión y polimerización se puede obtener una nanopartícula funcionalizada, es decir, una nanopartícula en la que el extremo final de las cadenas heterocarbonadas que comprenden el polímero que es nuestra nanopartícula, se encuentra funcionalizado.
La funcionalización de la nanopartícula se puede realizar con grupos amino, carboxilo (en particular ácido carboxílico), tiol, maleimida, triazina, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol o mediante crlick-chemistry (incluyendo grupos azida y alquino). En una realización preferente la funcionalización se realiza con grupos amino.
En una realización preferente, el procedimiento de la invención consiste en un proceso de emulsión-polimerización usando poliestireno o 4-aminoestireno, usando divinilbenceno (DVB) como agente de entrecruzamiento.
Conjugación entre los aminos de la nanopartícula resultante en la fase anterior con los grupos ácidos de fluoróforos
En esta etapa se llevan a cabo reacciones de funcionalización de las nanopartículas con cadenas heterocarbonosas que pueden ser ramificadas, y que de ahora en adelante se llamarán "cadena de carbono", mediante la reacción entre los grupos funcionales ácido, amino, carboxilo (en particular ácido carboxílico), tiol, maleimida, triazina, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol, azida y alquino entre otros, de la cadena de carbono y los grupos funcionales amino, carboxilo (en particular ácido carboxílico), tiol, maleimida, triazina, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol, azida y alquino de las nanopartículas aminofuncionalizadas. La cadena de carbono contiene uno o más grupos adecuados para formar un enlace covalente con las moléculas activas y al mismo tiempo genera un espacio entre la nanopartícula y dichas moléculas. Son cadenas de longitud variable que tienen grupos capaces de formar enlaces covalentes, en particular los grupos ortogonales entre ellos, es decir, que se desprotegen con diferentes procedimientos durante la síntesis. Su presencia mejora la biocompatibilidad y disminuyen las interacciones entre la nanopartícula y las moléculas activas. Ejemplos de tales cadenas incluyen cadenas con un número de carbonos entre 6 y 24; cadenas de glicoles metoxipolietilénicos; cadenas de dimetilsuberimidato; cadenas de glicoles polialquílicos, en particular polietilenglicoles, entre las que preferentemente se usa la cadena de 4,7, 10-triossa-1 ,13-tridecanediammina (espaciador PEG). La longitud de la cadena también se puede modificar de acuerdo con las necesidades (impedimento estérico de las moléculas que se van a unir, condiciones de reacción, etc.) mediante la adición de más cadenas heterocarbonadas.
En una realización particular, el reactivo de acoplamiento empleado en la reacción de síntesis en fase sólida se selecciona de entre HOBt, DIC, Oxyma Puré® o EDCusando DMF como disolvente.
En una realización preferente los fluoróforos empleados en esta etapa tienen estructura tipo dañinas, más preferentemente dañinas seleccionadas del grupo formado por Cy3, Cy5 y Cy7, y más preferentemente dañinas seleccionadas del grupo formado por Cy3, Cy5 y Cy7 funcionalizadas con grupos sulfonatos. En una realización aún más preferente se hacen reaccionar los fluoróforos Cy3, Cy5 y Cy7 sulfonados (Sulfo-Cy3, Sulfo-Cy5 y sulfo Cy7, respectivamente) a través de sus grupos ácidos carboxílicos previamente activados mediante una funcionalización tipo NHS éster.
A modo de ejemplo, se puede emplear Sulfo-Cy5 con maleimida, amina, ácido carboxilico, azida, tiol, maleimida, alquino y con tetrazina, lo que permitiría usar nanoparticulas funcionalizadas con tiol, ácido carboxilico, y también por azida.
Incorporación de metales mediante quelación de los iones metálicos con los fluoróforos En esta última etapa se incorpora al menos un metal a la sonda mediante quelación de iones metálicos con los fluoróforos.
En el caso en el que los fluoróforos no sean quelantes, se incorporará previamente o posteriormente un agente quelante. En este caso se usa una cadena de carbono ramificada que contenga dos grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes. En particular, los grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes llevan grupos protectores ortogonales. Así, una vez unida la cadena de carbono a la nanopartícula se lleva a cabo el siguiente proceso: (i) desprotección de uno de los grupos funcionales de la cadena de carbono; (ii) conjugación de, o bien el fluoróforo o bien el agente quelante; (iii) desprotección del otro grupo funcional de la cadena carbonada; (iv) conjugación de, o bien el fluoróforo o bien el agente quelante. Este procedimiento permite el acoplamiento mediante enlaces amida tanto de los fluoróforos de forma directa, como de diferentes cadenas de carbono tales como polietilenglicol o lisina, que actúan de espaciadores entre las cadenas poliméricas y los fluoróforos, por lo que en una realización más preferente, el procedimiento comprende una fase, anterior a la incorporación de los agentes quelantes o de los fluoróroforos, que incorpora espaciadores entre los fluoróforos y las cadenas poliméricas. Para ello se hace reaccionar los grupos funcionales ácido de los espaciadores químicos (como polietilenglicol o glicina) con los grupos funcionales amino de las nanopartículas aminofuncionalizadas mediante protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida. La introducción de espaciadores químicos es necesario para la separación del núcleo de la nanopartícula de la biomolécula final que se acopla, para evitar problemas de impedimento estérico, no viéndose comprometida su acoplamiento a la nanopartícula ni el desarrollo de su función química o biológica. Procedimiento de "barcoding" utilizando las sondas de la invención
Como se ha indicado, las nanopartículas de la invención pueden comprender metales con distinta masa atómica y/o isótopos de un mismo metal de forma que puedan ser detectados mediante citometría de masas y también pueden contener varios fluoróforos, preferentemente fluoróroforos consistentes en dañinas funcionalizadas con grupos sulfonatos, más preferentemente dañinas seleccionadas del grupo formado por Cy3, Cy5 y Cy7, funcionalizadas con grupos sulfonatos.
Por tanto, en un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de codificación celular por código de barras o barcoding, en adelante "procedimiento de barcoding de la invención" que emplea las nanopartículas de la invención.
Concretamente, el procedimiento de barcoding de la invención permite discriminar distintos tipos celulares en función del tipo de nanopartículas con el que sean nanofectadas debido a la combinación única, predefinida, de un fluoróforo y distintos isótopos de paladio en la misma sonda. Esta combinación única, detectada mediante citometría de masas y citometría de flujo, permite que las sondas actúen como códigos de barras, constituyendo cada combinación de fluorófo e isótopos de paladio un código diferente al resto. De esta forma se puede hacer una lectura simultánea de distintas líneas celulares.
Capacidad de discriminación de códigos mediante citometría de masas y citometría de flujo. La capacidad de discriminación de cada código mediante citometría de masas y/o citometría de flujo es necesaria y fundamental para la realización posterior de co-cultivos celulares. Para ello se deberá, después de haber analizado y caracterizado cada serie de sondas codificadas por separado (apartado anterior), incubar cada una de las sondas codificadas (Figura 2) con distintos tipos de líneas celulares. De esta forma una línea celular determinada tendrá una combinación específica de isótopos y/o fluoróforo que podrán posteriormente ser identificados por la citometría de masas y/o citometría de flujo. Una vez que las células se incuban con las sondas, estas "entran" en las células sin necesidad de ningún ligando o receptor específico y sin producir ningún efecto citotóxico. Una vez marcadas cada línea celular, éstas se co-cultivan en las mismas condiciones y posteriormente se analizan por citometría de masas y/o citometría de flujo.
Otro aspecto consiste en usar una línea única celular que puede ser una línea celular primaria y codificar distintos tratamientos que se lleven a cabo en esa línea celular, de tal forma que las distintas respuestas fenotípicas a los distintos tratamientos puedan ser leídos de forma simultánea.
Liberación de fármacos en el interior de células vivas En un cuarto aspecto, la a presente invención se refiere al uso de las sondas de la invención para activar pro-fármacos mediante catálisis citoplasmática de reacciones organometálicas en el interior de células vivas.
La capacidad de entrar en células vivas de la sonda de la invención permite introducir un profármaco en el interior de una célula, liberando el fármaco activo mediante un proceso de catálisis organometálica entre el metal de la sonda y el profármaco.
De forma particular, en otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de principios activos unidos a la sonda de la invención.
Ejemplos de fármacos modificados que se pueden administrar junto con la sonda de la invención son aquellos cuyos profármacos se activan con metales como fármacos tales como 5-fluoruracilo (5-FU), gemcitabina, cladribina o citarabina.
MODOS DE REALIZACIÓN
1. Síntesis de sondas que comprenden nanopartículas entrecruzadas y aminofuncionalizadas de poliestireno (NPs), fluoróforos tipo cianinas y paladio.
La síntesis de las sondas se realizó siguiendo los siguientes pasos: Emulsión-polimerización para obtener una nanopartícula entrecruzada y aminofuncionalizada. Se llevó a cabo un proceso de emulsión-polimerización de estireno y 4-aminoestireno con un agente de entrecruzamiento para obtener una nanopartícula aminofuncionalizada. Para ello se empleó una solución acuosa de: (i) estireno como monomero principal; (ii) divinilbenzeno (DVB), como agente entrecruzante; (iii) vinilbenzilamina clorhidrato (VBAH) que se usa como el monómero que aporta los grupos aminicos.
La reacción se llevó a cabo a 80 ° C en atmosfera inerte y usando sulfato de magnesio como agente estabilizante. Pasados 30 minutos desde el inicio de la reacción se añadió el iniciador radicalario hidrosoluble, el 2-diidrocloruro-2'-azobis- (2-metilpropionamida) (V- 50). La reacción se mantuvo durante otras dos horas bajo agitación. De este modo se obtuvieron nanopartículas con diámetros comprendidos entre 100 y 2000 nanómetros.
Conjugación entre los aminos de la nanopartícula resultante en la fase anterior con los grupos ácidos de fluoróforos
Para llevar a cabo la etapa de conjugación entre los grupos aminos de las nanopartículas y los ácidos de los fluoróforos, las nanopartículas se acondicionaron previamente mediante su lavado, tres veces, con dimetilformamida (DMF), a través de ciclos de suspensión-centrifuagación (13.400 rpm, 3 minutos). Posteriormente, 75 equivalentes de ácido fmoc-4,7, 10-trioxa-1 ,13- tridecanediaminasucinamico(Fmoc-PEG-OH) o Fmoc-Glicina se disolvieron en 1 mL de DMF junto con 75 equivalente de Oxyma y 75 equivalente de Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimida (DIC). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Pasado ese tiempo, la solución se añadióa las nanopartículas secas, se suspendió, y la suspensión se dejó agitando a 60°C y 1.400 rpm durante 2 horas.
Pasadas las 2 horas, las nanopartículas se lavaron con tres ciclos de suspensión-centrifugación (13.400 rpm, 3 minutos) para obtener las nanopartículas Fmoc-PEGiladas La desprotección del grupo protector Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) se llevó a cabo mediante un tratamiento consistente en tres lavados de 20 minutos con 1 mL de 20% piperidina en DMF. Después del tratamiento con piperidina, se realizaron tres lavados con 1 mL de DMF (13400 rpm, 3 minutos) mediante ciclos de suspensión-centrifugación.
Incorporación de metales mediante quelación de los iones metálicos con los fluoróforos
Para la conjugación del fluoróforo tipo cianina (Cy3, Cy5 o Cy7) a la nanopartícula, y quelación al metal correspondiente (paladio), se utilizó una solución madre de 1 mg/mL del fluoróforo tipo cianina (sulfo-fluoróforo NHS éster) en DMF y una solución 10 mM de acetato de paladio en DMF. Se toma el mismo volumen de solución de fluoróforo que el volumen de nanopartículas con el que se está trabajando (ej. si se trabaja con 50 de nanopartículas, se usan 50 de solución de fluoróforo), y se le añaden 2 de Ν,Ν-diisopropiletilamina (DI PEA) y se agita. A la mezcla se le añade el mismo volumen de solución de paladio 10 mM en DMF y se vuelve a agitar .La mezcla se añade a las correspondientes nanopartículas con grupos polietilenglicol secas y se suspende. La suspensión se deja en agitación a temperatura ambiente, a 1.400 rpm, durante 14 horas en ausencia de luz. Al día siguiente las sondas se lavan tres veces mediante ciclos de suspensión-centrifugación con DMF (13.400 rpm, 3 minutos) y con metanol (13.400 rpm, 5 minutos). Una vez están acondicionadas las nanopartículas en metanol, se centrifugan, se elimina el sobrenadante, se añade 1 ml_ de una solución de hidrazina al 10% en metanol para reducir el paladio (II) a paladio (0), y se suspende. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos, a 1.400 rpm, a temperatura ambiente, en ausencia de luz. Inmediatamente después, se centrifugan las sondas (13.400 rpm, 5 min) y se lavan tres veces con ciclos de suspensión-centrifugación con metanol (13.400 rpm, 5 min) y tres veces con agua (13.400 rpm, 8 min), y finalmente se suspenden en el mismo volumen de agua que el volumen de nanopartículas con el que se empezó a trabajar (ej. 50 μΙ_).
Caracterización de las sondas.
Con este procedimiento, se sintetizaron dos conjuntos de sondas consistentes en nanopartículas entrecruzadas de poliestireno de 500nm aminofuncionalizadas con un fluoróforo tipo cianina funcionalizado con un grupo sulfonato (Un átomo de azufre que se une a la cadena heterocarbonada central de la cianina y que a su vez va unido a tres átomos de oxígeno) (Sulfo- Cy5 o Sulfo-Cy3) y con tres isótopos de paladio distintos (Pd105, Pd106, Pd108 o Pd102, Pd105, Pd108)
2. Uso como marcadores intracelulares en células vivas.
Como prueba de concepto se evaluó la eficiencia de las sondas sintetizadas como marcadores intracelulares en células vivas. Se realizaron tres evaluaciones de sondas marcadas con una mezcla de isótopos de paladio a la vez que marcadas con el fluoróforo Cy5:
(i) Eficiencia de nanofección, número de nanopartículas/sondas necesarias para alcanzar≥95% de nanofección.
(ii) Biocompatibilidad: Para descartar una posible toxicidad celular del paladio se realizaron estudios de proliferación celular en células de cáncer de mama MDA-MB-231 durante seis días en contacto con sondas cargadas con paladio control (Fig. 2, A). La ausencia de diferencias significativas demuestra la alta biocompatibilidad de estas sondas y su inocuidad como marcadores en co-cultivo (Fig. 2, A).
(iii) Ensayos de nanofección: Utilizando esta misma línea de cáncer de mama se determinó la eficiencia en la captación de las sondas a diferentes tiempos y concentraciones de sondas mediante citometría de flujo y citometría de masas, validando los resultados de las dos técnicas y su alta reproducibilidad. En ambos casos las células que captan sondas aparecen como positivas (Fig. 2, B-D). c. Número de sondas necesario para conseguir≥95% de Nanofección (MNF≥95%) [Unciti-Broceta, JD et al: Number of Nanoparticles per Cell Through a Spectophotometric Method - A key parameter to Assess Nanoparticle-based Cellular Assays. Scientific Reports, 5 (2015) 10091]. Incrementando progresivamente el número de nanopartículas se consigue saturar el sistema, apareciendo≥95% de células cargadas con nanopartículas duales. Este número de sondas es el necesario para realizar con éxito el mareaje por código de barras de diferentes isótopos de paladio.
3.- Codificación Celular por Código de Barras
El experimento base para Codificación Celular por Código de Barras consistió en:
1. Funcionalización con isótopos de paladio y fluoróforos: las sondas (Fig. 3) consistieron en nanopartículas funcionalizadas con un fluoróforo tipo cianina (Sulfo-Cy5 o Sulfo-Cy3) y con una combinación de tres isótopos de paladio distintos seleccionados del grupo 102Pd, 105Pd, 106Pd y 108Pd, con una proporción determinada y conocida. De esta forma obtuvimos diferentes códigos de barras en función de la combinación de fluoróforo e isótopos de paladio que contiene cada sonda. Posteriormente, se llevó a cabo una caracterización mediante citometría de flujo (FACS) y citometría de masas (CyTOF) de cada sonda.
2. Ensayo celular primario: Sobre un cultivo de células vivas, se añadió al medio un tipo de sonda (código de barra), que fueron internalizadas por las células al cabo de un periodo de tiempo establecido. Pasado ese tiempo, se procedió al análisis de dichas células, comparadas con un control de células con nanopartículas sin funcionalizar y células sin nanopartículas, mediante citometría de flujo (FACS) y citometría de masas (CyTOF).
3. Ensayo celular secundario: Una vez validada la detección del código de barras correspondiente en las células, se procedió a realizar un análisis de varios códigos de barras en distintos tipos celulares. Para ello, se eligieron 2 códigos de barras diferentes y se añadieron, por separado, cada código a un tipo celular concreto. Posteriormente, ambos cultivos celulares fueron mezclados y analizados por citometría de flujo (FACS) y citometría de masas (CyTOF). Se han sintetizado y caracterizado 8 tipos diferentes de nanopartículas (NP), incluyendo, al menos, un fluoróforo (Cy5 o Cy3) y un isótopo de paladio (106Pd, 110Pd y Pd(OAc)2 -una mezcla de isótopos-): NP-Cy5-106Pd, NP-Cy5-110Pd, NP-Cy5-Pd(OAc)2, NP-Cy5-106Pd-110Pd, NP-Cy3-106Pd, NP-Cy3-110Pd, NP-Cy3-Pd(OAc)2 y NP-Cy3-106Pd-110Pd. En total, 8 códigos de barras.
Caracterización mediante citometría de flujo (FACS) y citometría de masas (CyTOF)
Primeramente se llevó a cabo la caracterización mediante citometría de flujo (FACS), debido a la presencia del fluoróforo (Figuras 6 y 7). Posteriormente, se llevó a cabo la caracterización de las nanopartículas mediante citometría de masas (CyTOF) para comprobar la presencia específica del isótopo 106Pd (figuras 8 y 12) y del isótopo 110Pd (figuras 9 y 13), de la mezcla de los isótopos 106Pd y 110Pd (figuras 10 y 14), y de todos los isótopos (se eligieron 106Pd, 110Pd y 105Pd) en el caso de las NPs funcionalizadas con Pd(OAc)2 (figuras 1 1 y 15). Ensayos de viabilidad celular
Para evaluar la toxicidad de las NPs se realizaron ensayos de viabilidad celular basados en resarzurina sódica. Se utilizaron células tumorales MDA-MB-231 incubadas durante 96h, hasta con 40.000 Np por célula, en placas de 96 pocilios, con 3.000 células por pocilio. Los ensayos de viabilidad celular muestran una viabilidad similar entre las NPs metalofluorescentes y las NPs control, sin funcionalizar, demostrando que no son tóxicas (figura 16).
Caracterización de células tumorales MDA-MB-231 nanofectadas con NPs metalofluorescentes Para la nanofección de las células, se realizaron ensayos de uptake celular, con el objetivo de determinar la cantidad óptima de NPs necesarias para obtener una señal adecuada mediante FACS..
Se incubaron las células MDA-MB-231 durante 6h con las NPs metalofluorescentes, a cantidades crecientes de NPs por célula hasta 10.000 NPs/célula, en placas de 24 pocilios, a 50.000 células/pocilio. Los resultados muestran que al utilizar 5.000 NPs/célula, las NPs entran en las células tumorales MDA-MB-231 y que son detectables mediante FACS (figura 17).
En cuanto a los ensayos de caracterización mediante CyTOF, se eligió nanofectar las células MDA-MB-231 con 5.000 NPs/célula, durante 3h, en placas de 6 pocilios, con 1.000.000 células/pocilio.
Se realizaron 5 experimentos diferentes, por duplicado, de células MDA-MB-231 nanofectadas con NPs metalofluorescentes, utilizando como control células MDA-MB-231 que no habían sido incubadas con nanopartículas (figura 18). Para ello, las células MDA-MB-231 se incubaron con las NPs durante el tiempo establecido, para, posteriormente, realizar un mareaje de los núcleos celulares con Iridio (Ir), siguiendo protocolos ya establecidos por Fluidigm para CyTOF:
1. MDA-MB-231 + NP-Cy5-106Pd (figura 19)
2. MDA-MB-231 + NP-Cy5-110Pd (figura 20)
3. MDA-MB-231 + NP-Cy5-106Pd / MDA-MB-231 + NP-Cy5-110Pd (50%-50%): En este caso, se incubaron las células con cada tipo de NP por separado y, en el momento de preparar el tubo para CyTOF, se mezclaron las células nanofectadas con NP-Cy5-106Pd y las células nanofectadas con NP-Cy5-110Pd, en una proporción de 50%-50%, hasta alcanzar la misma concentración de células/mL que en los experimentos anteriores (figura 21).
4. MDA-MB-231 + NP-Cy5-106Pd / MDA-MB-231 + NP-Cy5-110Pd (25%-75%): En este caso, se incubaron las células con cada tipo de NP por separado y, en el momento de preparar el tubo para CyTOF, se mezclaron las células nanofectadas con NP-Cy5-106Pd y las células nanofectadas con NP-Cy5-110Pd, en una proporción de 25%-75%, hasta alcanzar la misma concentración de células/mL que en los experimentos anteriores (figura
22) .
5. MDA-MB-231 + NP-Cy5-106Pd / MDA-MB-231 + NP-Cy5-110Pd (75%-25%): En este caso, se incubaron las células con cada tipo de NP por separado y, en el momento de preparar el tubo para CyTOF, se mezclaron las células nanofectadas con NP-Cy5-106Pd y las células nanofectadas con NP-Cy5-110Pd, en una proporción de 75%-25%, hasta alcanzar la misma concentración de células/mL que en los experimentos anteriores (figura
23) .
El análisis de CyTOF se realizó con FlowJo, seleccionando la población celular que contenía las NPs metalofluorescentes. Para la interpretación de los resultados obtenidos de CyTOF, se tuvo en cuenta el porcentaje de señal positiva para cada isótopo de Pd respecto de Iridio y de la longitud del evento ("Event Length"), en los duplicados, obteniendo, por tanto, 4 datos de porcentaje de señal positiva para cada canal. De esta forma, se analizó tanto la población Ir/Pd ++, correspondiente a las NPs presentes en las células, como a la población Event Length/Pd +, que representa "cuentas" de las señales de Pd obtenidas a lo largo del experimento, dentro de la población 191 lr/193lr ++ (células). Los resultados obtenidos pueden observarse en la Tabla 1.
Figure imgf000022_0001
Tabla 1.- Resultados del análisis CyTOF para cada canal - Canal 106Pd: representa el porcentaje de la población positiva para el isótopo 106Pd
- Canal 110Pd: representa el porcentaje de la población positiva para el isótopo 110Pd
- % 106Pd: corresponde al porcentaje que la señal de un experimento determinado representa frente a la señal generada en el canal del isótopo 106Pd, cuando las células son nanofectadas solo con NP-Cy5-106Pd.
- % 110Pd: corresponde al porcentaje que la señal de un experimento determinado representa frente a la señal generada en el canal del isótopo 110Pd, cuando las células son nanofectadas solo con NP-Cy5-110Pd.
Se observa como el isótopo 110Pd genera una señal más baja que el isótopo 106Pd, aproximadamente, la mitad.
Se identifica claramente como la señal de ambos isótopos se disminuye hasta la mitad, cuando se utiliza una mezcla al 50% de células conteniendo las NP-Cy5-106Pd y las NP-Cy5-110Pd. Cuando se utiliza una mezcla de 25% de células conteniendo NP-Cy5-106Pd y un 75% de células conteniendo NP-Cy5-110Pd, se observa como la señal del isótopo 106Pd cae hasta un 36%, mientras que la señal del isótopo 110Pd aumenta hasta un 83%. Este descenso de un isótopo y el aumento de señal del otro corresponden a un resultado cualitativo esperado.
Lo mismo ocurre cuando se utiliza una mezcla de 75% de células conteniendo NP-Cy5-Pd106Pd, y 25% de células conteniendo NP-Cy5-Pd110Pd, donde se produce un aumento hasta el 100% de la señal para el isótopo 106Pd, y una caída hasta el 27% de la señal del isótopo 110Pd.
Con estos resultados se concluye que:
1) Hemos sido capaces de sintetizar y caracterizar NPs metalofluorescentes con diferentes fluoróforos (Cy5 y Cy3) y con diferentes isótopo de Pd (106, 1 10, 106+1 10 y una mezcla de isótopos). Además, cada una de las NPs sintetizadas corresponde a un código específico que puede ser utilizado para codificar células
2) Las NPs metalofluorescentes son incorporadas por las células, comportándose de manera no tóxica.
3) Las NPs metalofluorescentes incorporadas dentro de las células son fácilmente detectables mediante citometría de flujo (FACS) y mediante citometría de masas (CyTOF), comportándose como sondas duales.
4) Hemos conseguido realizar los primeros ensayos de codificación celular mediante citometría de masas, donde la utilización de un código u otro (NP-Cy5-106Pd y NP-Cy5-110Pd) o la mezcla en diferentes proporciones de ambos códigos (50%-50%, 25%-75% y 75%-25%) generara señales totalmente diferentes en CyTOF.
4. Ensayos de liberación de fármacos mediante catálisis organometálica.
Se produjeron varias sondas que comprenden Pd (0) como metal y Cy5-PEG-NPsoo como fluoroforo mediante la reducción in situ de Pd (II) a Pd (0). La síntesis de estas partículas siguió el mismo protocolo para el acoplamiento de sulfo-Cy5 y quelación con Pd (II) descrito en el ejemplo 1.
A continuación, para conseguir que se produzca la organocatálisis, Pd (II) se redujo a Pd (0) mediante la adición de 150 μΙ de hidrazina al 10% en metanol. La mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 30 min. Después se lavaron los NP con tres ciclos de centrifugación en suspensión con metanol (13.400 rpm, 5 min) y agua (13.400 rpm, 8 min), antes de finalmente suspenderse en agua. La eficacia de la reducción de paladio se evaluó mediante la reacción de desprotección mediada por Pd (0) del compuesto bis-aliloxicarbonil rodamina (Figura 4). Este compuesto no es fluorescente en esa forma mientras que sí lo es cuando se encuentra en contacto con Pd (0). En el caso de gemcitabina y 5-FU, se comprobó que sus pro-farmacos entraron en contacto con la sonda de paladio, la catálisis organometálica provoca su activación al entrar en contacto con el paladio (Figura 5), lo que permite que se liberen en el interior de la célula.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Sonda para realizar citometria de flujo y/o citometría de masas que comprende al menos una nanopartícula polimérica entrecruzada y funcionalizada, al menos un fluoróforo conjugado con la nanopartícula y al menos un metal quelado al fluoróforo.
2. Sonda según reivindicación anterior caracterizada por que la nanopartícula es de poliestireno o de 4-aminoestireno.
3. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que la nanopartícula está entrecruzada con divinilbenceno (DVB), 1 ,4-bis(4-vinilfenoxi)butano, bis(2-metacriloil)oxietildisulfuro, azobisisobutironitrilo (AIBN), dihidrocloruro de 2,2'- azobis(2-metilpropionamidina) o benzoilperoxido (BPO), preferente entrecruzada con divinilbenceno.
4. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que la nanopartícula está funcionalizada con grupos amino, carboxilo, tiol, maleimida, tiazina, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol, azida o alquino, preferentemente funcionalizada con grupos amino.
5. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que los fluoróforos que comprende son agentes quelantes.
6. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende al menos un fluoróforos no es un agente quelante junto con al menos un agente quelante.
7. Sonda según reivindicación anterior caracterizada por que los fluoróforos que comprende están funcionalizados con grupos sulfonados.
8. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que los fluorórofos son dañinas, preferentemente dañinas seleccionadas del conjunto formado por Cy3, Cy5 y Cy7.
9. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que los metales que se encuentran quelados al fluorórofo son isótopos de paladio o de lantánidos
10. Sonda según reivindicación anterior en la que los metales son mezcla de isótopos de metales seleccionados del grupo formado por Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu y Pd, preferentemente Pd.
1 1. Sonda según reivindicación anterior en la que los metales son isótopos específicos de metales seleccionados del grupo formado por Pr, Nd, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu y Pd, preferentemente 102Pd, 104Pd 105Pd, 106Pd, 108Pd, 110Pd
12. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que su tamaño está comprendido entre 100 y 2000nm, preferentemente entre 1000 y 2000nm, preferente entre 100 y 300nm más preferentemente entre 400 y 900nm.
13. Procedimiento para sintetizar sondas según reivindicaciones 1 a 1 1 que comprende las siguientes etapas: • Emulsión y polimerización de un material que comprende un monómero conformado por cadenas heterocarbonadas, un agente de entrecruzamiento, un iniciador de la polimerización y un monómero que comprende al menos un grupo está funcionalizada con grupos amino, carboxilo (en particular ácido carboxílico), tiol, maleimida, tiazina, tetrazina, tiol, ciclooctino, alcohol, azida o alquino, preferentemente amina, para obtener una nanopartícula entrecruzada aminofuncionalizada.
• Conjugación entre los aminos de la nanopartícula resultante en la fase anterior con los grupos ácidos de fluoróforos mediante reacciones de fase sólida.
• Incorporación de metales mediante quelación de los iones metálicos con los fluoróforos
14. Procedimiento según reivindicación anterior caracterizado por que emplea estireno y 4- aminoestireno como material de partida.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 caracterizado por que el agente de entrecruzamiento empleado divinilbenceno.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 caracterizado por que los fluoróroforos empleados son Cy3, Cy5 y Cy7 sulfonados y se conjugan al hacerlos reaccionar a través de sus grupos ácidos carboxílicos previamente activados mediante una funcionalización tipo NHS éster.
17. - Procedimiento de codificación celular por código de barras que emplea al menos una de las sondas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1.
18. - Procedimiento de reacción organometálica citoplasmática que emplea al menos una de las sondas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11
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