WO2018203280A1 - Mezclas de nucleótidos para la amplificación y secuenciación de polimeros de ácidos nucleícos - Google Patents

Mezclas de nucleótidos para la amplificación y secuenciación de polimeros de ácidos nucleícos Download PDF

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WO2018203280A1
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amplification
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Inventor
Carlos Jaime BARRIOS HERNÁNDEZ
Lola Xiomara BAUTISTA ROZO
Juan Antonio GONZÁLEZ BARRIOS
Daniel MARTÍNEZ FONG
Francisco José MARTÍNEZ PÉREZ
Enrique Mejía Ospino
Néstor Martin MUNIVE ARGÜELLES
Gabriel Rodrigo PEDRAZA FERREIRA
Silvia Daniela RAMÍREZ ARDILA
Wellman Antonio RIBÓN GÓMEZ
Refugio RODRÍGUEZ VÁZQUEZ
Stephen Tobe
Lina María VERA CALA
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University of Toronto
Industrial University of Santander
Instituto De Seguridad Y Servicios Sociales De Los Trabajadores Del Estado
Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del Instituto Politecnico Nacional
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University of Toronto
Industrial University of Santander
Instituto De Seguridad Y Servicios Sociales De Los Trabajadores Del Estado
Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del Instituto Politecnico Nacional
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention belongs to the area of biotechnology, biomedicine and basic science, particularly mixtures of nucleotides and / or their analogues in different proportions and / or molar concentration of each of them, to be used in amplification and sequencing processes of polymers of nucleic acids.
  • nucleic acid polymers and their sequence has been one of the fields of Biology that has revolutionized civilization. The success of this process is the result of several discoveries and achievements of biochemistry, of nucleic acid purification systems from biological or environmental sources and of the chemical synthesis of nucleic acids.
  • the essence of the reaction is at the level of its components, since any variant of nucleotide polymerization invariably requires, in addition to a suitable equipment, the nucleic acid segment from which the polymers will be obtained, a DNA or RNA polymerase to perform the binding of the respective nucleotides, a reaction buffer, one or two oligonucleotides to indicate the beginning and end of the polymer to be obtained and nucleotides or also called dNTPs that make up the polymer.
  • nucleotide polymerization reaction Even in the simplicity of the development and execution of the nucleotide polymerization reaction, in many cases, unwanted nucleotide polymers are obtained and / or do not correspond to the expected size. On other occasions, the nucleotide sequence obtained may have errors, generated by the same reaction, whereby the polymer obtained is not functional.
  • the previous problem is because the nature of each Nucleotide sequence is unique, therefore, following a common protocol for a set of nucleotide polymers of any origin is sometimes inappropriate, since the physicochemical characteristics of any of them will be determined by their concentration and nucleotide distribution.
  • nucleotide polymerization reaction Another way to carry out the nucleotide polymerization reaction is that in which each of the nucleotides and components are commercialized independently so that the user performs the mixture according to his need.
  • the DNA polymerase, its buffer and its cofactor are sold separately from the nucleotides, which are commercially available either individually, or in a single mixture, with equal (equimolar) molar concentrations of each one of them.
  • nucleotide mixtures with equimolar concentrations can be used to carry out nucleotide polymerization, it is often not possible to obtain complete and efficient polymerization, due to differences in nucleotide proportions of nucleotide polymers present in a biotechnological process and in each of the beings of nature.
  • the invention relates to mixtures of nucleotides (dNTPs), adenine, thymine, uracil, guanine and cytosine and / or their analogues, in different proportions and / or molar concentrations of each of them, to be used in the polymerization of nucleic acids.
  • dNTPs nucleotides
  • the invention also contemplates a process for the amplification and sequencing of nucleic acid polymers employing said mixtures.
  • FIG. 1 Comparison of polymers of the complementary DNA of Bos taurus bovine muscle beta and Gallus gallus bird when using Blend B and Blend D (lanes 2-5) with respect to a commercial mixture (lanes 6-9) .
  • FIG 2. Screening in the RACE type library for the identification of cDNAs related to the codon sequence for the FGLamide neuropeptide in the Flour Beetle. From lanes 1-8. M 100 bp marker (Invitrogen), Pl and P2 screening with the Oligonucleotides for FGLamide. C amplification controls. ES control without nucleotides.
  • FIG 3. Identification by PCR, using Mixture D, of some of the clones in recombinant plasmids whose inserts correspond to cDNAs related to the codons of the FGLamide of the brain and nervous system of the T. molitor meal beetle obtained from screening in the RACE Library indicated in FIG. 2. Recombinant plasmids generate amplicons larger than the polilinker (lane 5). Only clones larger than 400 bp were sequenced from this group.
  • FIG 6. Comparison of sequencing of nucleotide polymers with mixtures of nucleotides suggested by commercial house for genomes rich in GC (upper) and Mixture L with adjuvant (lower). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the invention relates to mixtures of nucleotides (dNTPs), adenine, thymine, uracil, guanine and cytosine (dNTPs) and / or their analogues, with different proportions and / or molar concentration (mol / mol) of each of them, which It provides a simple, fast and simple option to obtain and sequence nucleic acid polymers (eg DNA and RNA), even in nucleotide regions whose organization and physicochemical properties prevent their characterization with current methods and reagents.
  • dNTPs nucleotides
  • dNTPs adenine, thymine, uracil, guanine and cytosine
  • the term "and its analogs" refers to similar compounds of nitrogenous bases, which can be defined as nitrogenous bases with some modification or inclusion in their structure.
  • analogs there may be mentioned aminoalyl nucleotides, fluorophores, nucleotides bound to a thiol group or linked to a biotin and 2-aminopurine.
  • the proportion and / or molar concentration of the dNTPs in the mixtures of the present invention is established according to a bioinformatic model that allows analyzing the characteristics of the DNA or RNA polymers and their nucleotide content.
  • the molar concentration of each of the dNTPs can be between 5.0% and 45.0%.
  • Table 1 shows the ranges of each of the nucleotides.
  • the first value corresponds to the minimum and the second to the maximum of each nucleotide.
  • the molar ratio of Adenine-Thymine or Adenine-Uracil, like that of Guanine-Cytokine, is always 1: 1 and the total sum of the percentages of them is 100.0%.
  • the percentage of Adenine is 20, 1%
  • the percentage Timina is also 20, 1%, so, to complete 100%, the percentages of Guanine and Cytokine would have to be , each, of 29.9%.
  • the molar concentration of each of the dNTPs in the mixtures of the invention will be determined, in each case, by the nucleotide proportions of the nucleic acid polymers with which it must react.
  • the different molar concentration ranges of dNTPs in the mixtures of the invention allow them to be used to amplify and / or sequence nucleotide polymers with a dNTP content close to equality (eg 26, 1% AT and 23.9% GC ) or significantly different (eg 5.0% AT and 45.0 GC).
  • the mixtures of the invention may contain one or more adjuvants to favor the amplification and sequencing reactions of nucleic acid polymers.
  • adjuvants there may be mentioned solvents, diluents, salts, pH regulators, cofactors, enzymes and chemical compounds such as dimethylsulfoxide, ethylammonium tetrachloride (TAE-C1), methylammonium tetrachloride (TAM-C1), in concentrations between 0, 1% and 99.9% p / p.
  • mixtures of dNTPs may be accompanied by an acceptable carrier or vehicle, which should favor the stability and chemical properties of nucleotides.
  • acceptable vehicle for purposes of the present invention can be defined as a substance or mixture of substances (eg solvents, solutions) capable of containing dNTPs and / or adjuvants, without affecting their ability to perform the function. desired.
  • the determination of the nucleotide ratio of the polymer to be amplified or sequenced can be determined by the user according to his selection criteria.
  • Table 2 illustrates the nucleotide relationship of genomes, chromosomes and mitochondrial genomes in some bacteria, fungi, plants, animals and humans. With the result value you can select the most appropriate dNTP mix. Given the versatility of the mixtures of the invention, they can be used for polymerization reactions of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, nucleotide polymer generation systems or their sequencing in all its variants.
  • the first value corresponds to the minimum and the second to the maximum of each nucleotide.
  • the mixtures of the invention (Mixtures B, D, E, L and W) have the percentages of dNTPs indicated in Tables 3 and 4.
  • the present invention also contemplates a process for the amplification and sequencing of nucleic acid polymers characterized in that it employs one or more mixtures of dNTPs indicated in Tables 1, 3 and 4.
  • the amplification and sequencing can be carried out by applying molecular techniques that include: hybridization, synthesis of complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), nucleic acid amplification, nucleic acid sequencing, prediction by means of electronic, computer or manual technologies that allow determining the complementarity between nucleotide sequences and the concentration of their components in the polymer.
  • the process of the invention comprises the following steps: a) Purify the nucleotide polymers present in a sample of any origin;
  • c) Carry out a synthesis reaction of complementary nucleotide polymers and / or their amplification or sequencing under suitable conditions of reaction medium, pH and temperature. d) Establish whether the nucleotide polymer obtained corresponds to the size, composition and nucleotide order expected directly or indirectly, to be applied according to the user's selection.
  • the invention also contemplates the use of dNTP mixtures of the invention to amplify and sequence nucleic acid polymers by conventional and unconventional enzymatic methods.
  • EXAMPLE 1 Preparation of a mixture of different concentration of dNTPs.
  • EXAMPLE 2 Preparation of a mixture of different concentration of dNTPs with adjuvants for PCR. Similarly to the preparation described in Example 1, from stock solutions a mixture of dNTPs for one-step PCR will be prepared consisting of: 1 reaction buffer IX (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4) 2S04, 10 mM KC1, 2 mM MgS04, 0.1% Triton X-100 pH 8.8 at 25 ° C), 2 Units of Deep Vent DNA polymerase (New England Biolabs 2 ®), 150 ⁇ of Adenine, 150 ⁇ of Thymine, 350 ⁇ of Guanine and 350 ⁇ of Cytokine and 5% of DMSO.
  • 1 reaction buffer IX (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4) 2S04, 10 mM KC1, 2 mM MgS04, 0.1% Triton X-100 pH 8.8 at 25 ° C
  • 2 Units of Deep Vent DNA polymerase New
  • EXAMPLE 4 RT-PCR amplification of the complementary DNA segment immersed between the first and second universal domain of the bovine muscle beta actin Bos taurus and the Gallus gallus bird.
  • the obtaining and purification of total ribonucleic acid (RNA) from bovine and poultry muscle was carried out with the Trizol reagent according to the manufacturer's instructions (Invitrogen® 3 ).
  • the quantification and purity index was obtained by spectrophotometric standard methods, while the integrity of the total RNA was made by visualizing the ribosomal RNAs by their agarose gel staining.
  • the cDNA synthesis was performed with total RNA of each sample with the enzyme reverse transcriptase (SuperScript III Rt Invitrogen®) using a 21 thymine oligonucleotide and with equimolar nucleotide concentrations as polymerization initiator.
  • the reaction conditions, enzyme inactivation and removal of the tempered mRNA were carried out according to conventional enzymatic and physical methods.
  • Nucleotide polymer amplification was performed with a cofactor, a buffer, DNA polymerase (Taq Platinum Invitrogen®), a pair of sense and antisense oligonucleotides that hybridize approximately in the region of the first and second universal domain of beta actin (Joseph J., Fey P. et al. The actinome of Dictyostelium
  • EXAMPLE 5 Identification and characterization of cDNA polymers related to the precursor of the FGLamide nervous system of the Tenebrio molitor flour beetle.
  • RNA extraction was performed by standard tissue extraction techniques and then the extraction and purification of total RNA from all tissues was performed. Of the total total RNA set, only the 5'-end adapter oligonucleotide was attached to the messenger RNA by enzymatic methods.
  • This construction for this invention is called the RACE Library, which is amplified in two steps: 1) complementary DNA synthesis with a 3 'RACE oligonucleotide and 2) RT-PCR amplification with oligonucleotides for adapters.
  • screening in the RACE library is performed by an oligonucleotide for the nucleotide polymer to be found and another oligonucleotide for one of the adapters.
  • the products are cloned into plasmids and sequenced by standard methods to obtain the nucleotide polymer sequence.
  • the tissue was obtained using conventional dissection methods based on national and international biosafety and bioethics protocols for handling laboratory animals. From these tissues the total RNA was obtained analogously to that described in Example 4.
  • RNA oligonucleotide Prior to the synthesis of complementary DNA to obtain the RACE Library, the 5 'end of all messenger RNAs was modified by removing 7-methyl guanocin (CAP) and subsequently incorporating at this end an RNA oligonucleotide by enzymatic methods according to the Kit GeneRacer® 5 .
  • CAP 7-methyl guanocin
  • Complementary DNA synthesis was carried out with a 3 'RACE oligonucleotide in the same manner as in Example 4, but two mixtures of nucleotides were used: the first, a commercial mixture of Invitrogen® with equimolar concentrations of nucleotides , and the second, a mixture of nucleotides (Mixture E, Table 3) corresponding to the specific nucleotide composition for the Red Flour Beetle (TGSC 2008), which also included 5% dimethylsulfoxide (DMSO) as an adjuvant.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the polymerization conditions were 28 cycles with a denaturation temperature of 95 ° C for 20 seconds, alignment of 62 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 120 seconds.
  • the products were purified by column exclusion methods established by QIAGEN® and visualized on agarose gel.
  • the resulting nucleotide polymers were called the RACE Library.
  • the polymerization procedure indicated in the previous paragraph was performed, but using as a screening vehicle and polymerization initiator a degenerated oligonucleotide whose nucleotides correspond to the codons for the last FGLamide amino acids and the basic amino acid pair for propeptide processing (Mart ⁇ nez-Pérez F, Bendena WG, Chang BS, Tobe SS. FGLamide Allatostatin genes in Arthropoda: introns early or late? Peptides. 2009 Jul; 30 (7) : 1241-8; Ellott KL, Chan KK & Stay B.
  • the positive bacterial colonies were cultured independently in liquid medium with the selection drug and then the recombinant plasmids were purified by conventional chemical-enzymatic methods.
  • the selection of the positive plasmids of the false positives was carried out by PCR according to the amplification procedure of the RACE library, but with a pair of oligonucleotides flanking the polilinker region of each plasmid and for 20 cycles.
  • the amplicons were visualized on agarose gel as indicated in the screening RT-PCR reaction of the RACE library (FIG. 3).
  • FIG. 4 shows a couple of graphs of the luminosity pattern of the sequencing of three of the recombinant plasmids using the nucleotide mixture of the commercial product, where it is clearly observed that there was no sequencing reaction since there was no polymerization reaction.
  • sequencing the same recombinant plasmids for GC-rich nucleotide polymers generated amplicons without a biological agreement to any open messenger RNA reading frame, as shown in FIG. 5. Improper polymerization was corrected using Mixture E.
  • the result of the commercial mixture did not produce a sequence according to a biological pattern, as did the mixture E, in which the polymerization pattern is that expected for any nucleotide polymer regardless of its concentration and order of nucleotides (FIG. 6).
  • nucleotide polymers that could not be identified by the existing methods for the genomic sequencing of homologous species was confirmed (TGSC, 2008), but of which there were reports of the biological activity of the products proteins synthesized from the polymer corresponding nucleotide (Mart ⁇ nez-Pérez F, Bendena WG, Chang BS, Tobe SS.
  • EXAMPLE 6 Third generation genomic sequencing of the Kocuria rhizophila bacteria genome.
  • the bacterial species Kocuria rhizophila ATCC 9341 was selected, whose approximate nucleotide composition is AT 29.8% - GC 71, 2% (Takarada H, Sekine M, Kosugi H, Matsuo Y, Fujisawa T, Omata S, Kishi E, Shimizu A, Tsukatani N, Tanikawa S, Fujita N, Harayama S. Complete genome sequence of the soil actinomycete Kocuria rhizophila. J Bacteriol Jun 2008; 190 (12): 4139-46) and Mixture L was used (Table 3).
  • Genomic sequencing was performed with the Flx + 454-ROCHE 8 system in 1x550 format.
  • the Library was built with 1500 bp inserts and its titration was carried out according to the protocol proposed by the Rapid Library Preparation Manual GS FLX + and GS Junior + Series - XL 9 .
  • EXAMPLE 7 In vitro transcription of nucleotide polymers.
  • any commercial Kit containing the nucleotides (dNTPs) and an RNA polymerase can be used.
  • dNTPs nucleotides
  • MEGAscript® T7 Transcription kit 12 that includes the four nucleotides independently to obtain any of the mixtures mentioned in Examples 1 to 6.
  • a mixture of dNTPs is prepared with the proportions of the W Mix , as indicated in Table 4.
  • the RNA is purified and recovered following the indications of the product or by conventional chemical or physical methods.

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Abstract

La presente invención se refiere a mezclas de nucleótidos dNTPs y/o sus análogos, en diferentes proporciones y/o concentración molar de cada uno de ellos, que permite una óptima polimerización de ácidos nucleicos independientemente de su contenido y distribución dentro del polímero. La invención también contempla un proceso para la amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos caracterizado porque emplea una o más de estas mezclas de dNTPs. Las mezclas pueden ser utilizadas en la generación de polímeros nucleotídicos en cualquiera de las variantes de PCR, RT-PCR, o en la secuenciación de ellos por los métodos convencionales, pirosecuenciación o secuenciación de tercera generación.

Description

MEZCLAS DE NUCLEÓTIDOS PARA LA AMPLIFICACIÓN Y
SECUENCIACIÓN DE POLIMEROS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención pertenece al área de la biotecnología, biomedicina y ciencia básica, particularmente a mezclas de nucleótidos y/o sus análogos en diferentes proporciones y/o concentración molar de cada uno de ellos, para ser empleadas en procesos de amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La obtención de polímeros de ácidos nucleicos y su secuencia ha sido uno de los campos de la Biología que ha revolucionado a la humanidad. El éxito de este proceso es el resultado de varios descubrimientos y logros de la bioquímica, de los sistemas de purificación de ácidos nucleicos de fuentes biológicas o ambientales y de la síntesis química de ácidos nucleicos.
Independiente de todas las variantes que se han desarrollado para la obtención de polímeros de ácidos nucleicos, con cualquiera de sus aplicaciones e interpretación, la esencia de la reacción es a nivel de sus componentes, ya que cualquier variante de polimerización nucleotídica invariantemente requiere, además de un equipo adecuado, el segmento de ácidos nucleicos del que se obtendrán los polímeros, una ADN o ARN polimerasa para realizar la unión de los respectivos nucleótidos, un amortiguador de reacción, uno o dos oligonucleótidos para indicar el comienzo y el final del polímero a obtener y los nucleótidos o también llamados dNTPs que conforman al polímero.
Aún en lo sencillo del desarrollo y ejecución de la reacción de polimerización nucleotídica, en muchos casos, se obtienen polímeros nucleotídicos indeseados y/o que no corresponden al tamaño esperado. En otras ocasiones, la secuencia nucleotídica obtenida puede tener errores, generados por la misma reacción, por lo que el polímero obtenido no es funcional. La problemática anterior es debido a que la naturaleza de cada secuencia nucleotídica es única, por lo tanto, seguir un protocolo común para un conjunto de polímeros nucleotídicos de cualquier origen resulta a veces inapropiado, ya que las características fisicoquímicas de cualquiera de ellos estarán determinadas por su concentración y distribución nucleotídica.
Para solucionar esta problemática, la comunidad científica ha demostrado que en ocasiones se debe: 1) modificar la temperatura que se aplica para la desnaturalización previa y posterior en la polimerización, 2) incluir proteínas como la albúmina, que contribuyen a la calidad final del polímero nucleotídico (Montgomery JL, Rejali N, Wittwer CT. The influence of nucleotide sequence and temperature on the activity of thermostable DNA polymerases . J Mol Diagn. 2014 May; 16(3):305-13) y 3) adicionar agentes químicos como el dimetilsulfóxido, bebentina (Jensen MA, Fukushima M, Davis RW. DMSO and betaine greatly improve amplification ofGC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS One. 2010 Jun 11; 5(6):el l024) y formamida (Montgomery JL, Wittwer CT. Influence of PCR reagents on DNA polymerase extensión rates measured on real-time PCR instruments . Clin Chem. 2014 Feb;60(2):334-40) para favorecer la especificidad de la reacción. Con todos estos elementos se ha logrado la amplificación y secuenciación de millones de polímeros de ácidos nucleicos, cuya sumatoria de una especie se interpreta biológicamente como cromosomas, genomas o su expresión como ARN.
Pero, aun cuando se han mostrado todos estos logros, la realidad es que persisten muchas regiones genómicas y otros polímeros nucleotídicos desconocidos, dado que la eficiencia de polimerización en diversas regiones nucleotídicas es muy limitada con los protocolos científicos reportados y los kits comerciales disponibles. Actualmente, estos últimos proporcionan todos los elementos para realizar una reacción de polimerización exitosa.
Algunas casas comerciales distribuyen una presentación denominada Master Mix PCR one step® o RT-PCR one step® (Thermofisher Scientific1) para realizar la reacción, con las cuales, el usuario únicamente dispone el ADN o ARN que se desea clonar junto con los
1 www.thermofisher.com cebadores, para obtener una reacción de polimerización o la secuencia de un segmento de ADN o ADNc.
Otra forma para realizar la reacción de polimerización nucleotídica es aquella en la que cada uno de los nucleótidos y componentes se comercializan de forma independiente para que el usuario realice la mezcla de acuerdo a su necesidad. Para este caso, la ADN polimerasa, su amortiguador y su cofactor se comercializan por separado de los nucleótidos, los cuales se encuentran disponibles en el mercado bien sea de forma individual, o en una sola mezcla, con concentraciones molares iguales (equimolares) de cada uno de ellos.
Si bien se pueden emplear las mezclas de nucleótidos con concentraciones equimolares para llevar a cabo la polimerización nucleotídica, muchas veces no es posible obtener una polimerización completa y eficiente, debido a las diferencias en las proporciones nucleotídicas de los polímeros nucleotídicos presentes en un proceso biotecnológico y en cada uno de los seres de la naturaleza.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a mezclas de nucleótidos (dNTPs), adenina, timina, uracilo, guanina y citosina y/o sus análogos, en diferentes proporciones y/o concentraciones molares de cada uno ellos, para ser empleadas en la polimerización de ácidos nucleicos. La invención también contempla un procedimiento para la amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos que emplea dichas mezclas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Comparación de polímeros del ADN complementario de la beta actina de músculo bovino Bos taurus y del ave Gallus gallus al emplear la Mezcla B y la Mezcla D (carriles 2-5) con respecto a una mezcla comercial (carriles 6-9).
FIG 2. Tamizaje en la librería tipo RACE para la identificación de ADNc relacionados a la secuencia de codones para el neuropéptido FGLamida en el Escarabajo de la harina. De los carriles 1-8. M Marcador de 100 pb (Invitrogen), Pl y P2 tamizaje con los Oligonucleótidos para la FGLamida. C controles de amplificación. ES control sin nucleótidos.
FIG 3. Identificación por PCR, empleando la Mezcla D, de algunos de los clones en plásmidos recombinantes cuyos insertos corresponden a los ADNc relacionados a los codones de la FGLamida del cerebro y sistema nervioso del Escarabajo de la harina T. molitor obtenidos del tamizaje en la Biblioteca RACE que se indica en la FIG. 2. Los plásmidos recombinantes generan amplicones mayores al polilinker (carril 5). De este grupo únicamente se secuenciaron los clones mayores a 400 pb. FIG 4. Ejemplos (3) de la ausencia de polimerización y concomitantemente la obtención de la secuencia del polímero nucleotídico al hacer la reacción con mezclas de nucleótidos equimolares de productos comerciales, donde se muestra la ausencia de polimerización en todos los plásmidos recombinantes seleccionados. FIG 5. Resultados de la secuenciación de un par de los amplicones con mezclas de nucleótidos sugerida por casa comercial para genomas ricos en G-C.
FIG 6. Comparación de secuenciación de polímeros nucleotídicos con mezclas de nucleótidos sugerida por casa comercial para genomas ricos en G-C (superior) y la Mezcla L con coadyuvante (inferior). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a mezclas de nucleótidos (dNTPs), adenina, timina, uracilo, guanina y citosina (dNTPs) y/o sus análogos, con diferentes proporciones y/o concentración molar (mol/mol) de cada uno de ellos, que provee una simple, rápida y sencilla opción para obtener y secuenciar polímeros de ácidos nucleicos (v.g. ADN y ARN), incluso en regiones nucleotídicas cuya organización y propiedades fisicoquímicas impiden su caracterización con los métodos y reactivos actuales.
Para efectos de la presente invención, el término "y sus análogos", se refiere a compuestos análogos de las bases nitrogenadas, los cuales se pueden definir como bases nitrogenadas con alguna modificación o inclusión en su estructura. Entre los análogos se pueden mencionar los aminoalil nucleótidos, fluoróforos, nucleótidos unidos a un grupo tiol o unidos a una biotina y la 2-aminopurina.
La proporción y/o concentración molar de los dNTPs en las mezclas de la presente invención se establece según un modelo bioinformático que permite analizar las características de los polímeros de ADN o ARN y su contenido nucleotídico. La concentración molar de cada uno de los dNTPs puede estar entre el 5,0% y el 45,0%. En la Tabla 1 se muestran los rangos de cada uno de los nucleótidos.
Tabla 1
Figure imgf000007_0001
1 El primer valor corresponde al mínimo y el segundo al máximo de cada nucleótido.
En las mezclas de acuerdo a la presente invención, la proporción molar de Adenina-Timina o Adenina-Uracilo, al igual que la de Guanina-Citocina, siempre es 1 : 1 y la sumatoria total de los porcentajes de ellos es 100,0%. Así, por ejemplo, si en una mezcla de dNTPs el porcentaje de Adenina es 20, 1%, el porcentaje Timina también es 20, 1%, por lo que, para completar el 100%, los porcentajes de Guanina y Citocina tendrían que ser, cada uno, del 29,9%.
La concentración molar de cada uno de los dNTPs en las mezclas de la invención estará determinada, en cada caso, por las proporciones nucleotídicas de los polímeros de ácidos nucleicos con los que debe reaccionar. Los diferentes rangos de concentración molar de dNTPs en las mezclas de la invención permiten que éstas puedan ser empleadas para amplificar y/o secuenciar polímeros nucleotídicos con un contenido de dNTPs cercano a la igualdad (v.g. 26, 1% A-T y 23,9% G-C) o significativamente distinto (v.g. 5,0% A-T y 45,0 G-C).
Las mezclas de la invención pueden contener uno o más coadyuvantes para favorecer las reacciones de amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos. Entre los coadyuvantes se pueden mencionar solventes, diluyentes, sales, reguladores de pH, cofactores, enzimas y compuestos químicos tales como dimetilsulfóxido, tetracloruro de etilamonio (TAE-C1), tetracloruro de metilamonio (TAM-C1), en concentraciones entre el 0, 1% y el 99,9% p/p.
Adicionalmente, las mezclas de dNTPs pueden estar acompañadas de un portador o vehículo aceptable, el cual debe favorecer la estabilidad y propiedades químicas de los nucleótidos. El término "vehículo aceptable" para efectos de la presente invención, se puede definir como una sustancia o mezcla de sustancias (v.g. disolventes, soluciones) capaces de contener los dNTPs y/o los coadyuvantes, sin que se afecte su capacidad para realizar la función deseada.
La determinación de la proporción nucleotídica del polímero que se desea amplificar o secuenciar puede ser determinada por el usuario según sus criterios de selección. En la Tabla 2 se ilustra la relación nucleotídica de genomas, cromosomas y genomas mitocondriales en algunas bacterias, hongos, plantas, animales y humanos. Con el valor del resultado se puede seleccionar la mezcla de dNTPs más apropiada. Dada la versatilidad de las mezclas de la invención, estas pueden ser empleadas para reacciones de polimerización de ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico, sistemas de generación de polímeros nucleotídicos o su secuenciación en todas sus variantes.
Tabla 2
Figure imgf000009_0001
1 (% mol/mol). El primer valor corresponde al mínimo y el segundo al máximo de cada nucleótido.
2 El número en paréntesis al lado derecho de cada organismo indica la cantidad de cromosomas que tienen la respectiva proporción molar.
En una modalidad preferida, las mezclas de la invención (Mezclas B, D, E, L y W) tienen los porcentajes de dNTPs indicados en las Tablas 3 y 4.
Tabla 3.
Figure imgf000009_0002
Tabla 4.
Figure imgf000010_0001
Para la preparación de las mezclas de acuerdo a la invención, se puede partir de composiciones independientes de cada uno de los nucleótidos (soluciones stock) y obtener la concentración deseada de cada uno de los nucleótidos siguiendo los métodos de dilución convencionales. Posteriormente se pueden incorporar los coadyuvantes y/o el vehículo para obtener así las mezclas. La presente invención también contempla un proceso para la amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos caracterizado porque emplea una o más mezclas de dNTPs indicadas en las Tablas 1, 3 y 4.
La amplificación y secuenciación se puede llevar a cabo aplicando técnicas moleculares que incluyen: hibridación, síntesis de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc), amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, predicción por medio de tecnologías electrónicas, informáticas o manuales que permitan determinar la complementariedad entre secuencias nucleotídicas y la concentración de sus componentes en el polímero. Preferiblemente, el proceso de la invención comprende las siguientes etapas: a) Purificar los polímeros nucleotídicos presentes en una muestra de cualquier origen;
b) Poner en contacto una muestra del polímero nucleotídico que se desee amplificar o secuenciar con al menos una de las mezclas de dNTPs de acuerdo a la invención; ADN o ARN polimerasa; amortiguador y cofactor, si es necesario.
c) Llevar a cabo una reacción de síntesis de polímeros nucleotídicos complementarios y/o su amplificación o secuenciación en condiciones adecuadas de medio de reacción, pH y temperatura. d) Establecer si el polímero nucleotídico obtenido corresponde en tamaño, composición y orden nucleotídico esperado de forma directa o indirecta, para ser aplicado acorde a la selección del usuario. La invención también contempla el uso de las mezclas de dNTPs de la invención para amplificar y secuenciar polímeros de ácidos nucleicos mediante métodos enzimáticos convencionales y no convencionales.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención, sin estar el concepto inventivo restringido a los mismos:
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. Preparación de una Mezcla de diferente concentración de dNTPs.
Se prepararon 1000 microlitros (μί) de la Mezcla L (Tabla 3) a partir de soluciones stock (Invitrogen®) de concentración 100 milimolar (mM) de cada uno de los nucleótidos. Se tomaron 150μί de la solución stock de Adenina, 150μ1 de la solución stock de Timina, 350μ1 de la solución stock de Guanina y 350μ1 de solución stock de Citocina para obtener así una mezcla con concentración 15mM de Adenina, 15mM de Timina, 35mM de Guanina y 35mM de Citocina.
EJEMPLO 2. Preparación de una mezcla de diferente concentración de dNTPs con coadyuvantes para PCR. De manera análoga a la preparación descrita en el Ejemplo 1, a partir de soluciones stock se prepararé una mezcla de dNTPs para PCR de un paso constituida por: 1 amortiguador de reacción IX (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2S04, 10 mM KC1, 2 mM MgS04, 0, 1% Tritón X-100 pH 8,8 a 25°C), 2 Unidades de la ADN polimerasa Deep Vent (New England Biolabs2®), 150μΜ de Adenina, 150μΜ de Timina, 350μΜ de Guanina y 350μΜ de Citocina y 5 % de DMSO .
2 https://www.neb.com EJEMPLO 3. Preparación de una Mezcla de diferente concentración de dNTPs con coadyuvantes para RT-PCR. De manera análoga a la preparación descrita en el Ejemplo 1 , a partir del kit One Taq One- Step RT-PCR New England Biolabs® se preparó una mezcla constituida por enzimas ProtoScript® II Transcriptasa Reversa, ADN Polimerasa OneTaq Hot Start, Inhibidor RNase Murino y stabilizers, 3.2 mM MgC12, l,7mM de Adenina, l,7mM de Timina, 0,8mM de Guanina y 0,8mM de Citocina y 8% de tetra cloruro de etilamina.
EJEMPLO 4. Amplificación por RT-PCR del segmento de ADN complementario inmerso entre el primer y segundo dominio universal de la beta actina de músculo bovino Bos taurus y de la ave Gallus gallus. La obtención y purificación del ácido ribonucleico total (ARN) de músculo bovino y de ave se efectuó con el reactivo Trizol de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Invitrogen®3). La cuantificación e índice de pureza se obtuvo por métodos estándares espectrofotométricos, en tanto que la integridad del ARN total se efectuó al visualizar los ARN ribosomales por su tinción en gel de agarosa.
La síntesis de ADNc se realizó con ARN total de cada muestra con la enzima transcriptasa reversa (SuperScript III Rt Invitrogen®) empleando como iniciador de polimerización un oligonucleótido de 21 timinas y con concentraciones de nucleótidos equimolares. Las condiciones de reacción, inactivación de la enzima y eliminación del ARNm templado se llevaron a cabo de acuerdo a los métodos enzimáticos y físicos convencionales.
La amplificación del polímero nucleotídico se realizó con un cofactor, un buffer, ADN polimerasa (Taq Platinum Invitrogen®), un par de oligonucleótidos en dirección sentido y antisentido que hibridan aproximadamente en la región del primer y segundo dominio universal de la beta actina (Joseph J., Fey P. et al. The actinome of Dictyostelium
https://www.thermoñsher.conVco/en/home^rands^ discoideum in comparison to actins and actin-related proteins from other organisms. PLoS One. 2008 Jul 9; 3(7):e2654.) y se empleó una mezcla de nucleótidos (mezcla B), indicada en la Tabla 3, correspondiente a la composición nucleotídica específica para el toro y el gallo. La reacción se efectuó con el protocolo estándar de la enzima durante 35 ciclos con una temperatura de alineamiento de 55°C por 30 segundos y de extensión a 72°C por 13 segundos.
El primer control de la polimerización nucleotídica se realizó con una mezcla de nucleótidos de un producto comercial (AM8200 de Invitrogen®4) que contiene la misma proporción molar A=T=G=C=25,0% y el segundo control de nucleótidos correspondió a la concentración molar inversa de la Mezcla B, con los valores proporcionales milimolares de A-T y G-C indicados en la Mezcla D (Tabla 3).
La separación y visualización de los amplicones en amortiguador y condiciones pertinentes, evidenció que al emplear tanto la Mezcla B como la Mezcla D se generó una concentración mayor de polímero nucleotídico esperado con respecto a la concentración obtenida empleando la mezcla del producto comercial. La mejora del proceso es más contundente en la muestra de bovino, donde se incrementó la polimerización nucleotídica de dos isoformas de beta actina (FIG. 1), la cual se ha demostrado su presencia en otras especies (Rivero F, Cvrcková F. Origins and evolution of the actin cytoskeleton. Adv Exp Med Biol. 2007; 607:97- 110).
EJEMPLO 5. Identificación y caracterización de polímeros de ADNc relacionados al precursor de la FGLamida de sistema nervioso del Escarabajo de harina Tenebrio molitor.
La obtención y secuenciación de amplicones relacionados a la expresión del gen de la FGLamida de cerebro y ganglios del sistema nervioso del Escarabajo se realizó siguiendo el siguiente procedimiento:
4 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM8200 Primero, se realizó la extracción de los tejidos por medio de técnicas estándar de extracción tisular y luego se efectuó la extracción y purificación de ARN total de todos los tejidos. Del conjunto de ARN total anterior, únicamente al ARN mensajero se le unió el oligonucleótido adaptador en extremo 5 ' por métodos enzimáticos. A esta construcción para esta invención se denomina Biblioteca RACE, la cual es amplificada por dos pasos: 1) síntesis de ADN complementario con un oligonucleótido tipo RACE 3' y 2) amplificación por RT-PCR con oligonucleótidos para los adaptadores.
Luego, el tamizaje en la biblioteca RACE se realiza mediante un oligonucleótido para el polímero nucleotídico que se desea encontrar y otro oligonucleótido para alguno de los adaptadores. Al final, los productos son clonados en plásmidos y secuenciados por métodos estándar para obtener la secuencia del polímero nucleotídico.
La obtención de los tejidos se efectúo por métodos de disección convencionales acogidos a protocolos de bioseguridad y bioética nacionales e internacionales para manejo de animales de laboratorio. De estos tejidos se obtuvo el ARN total de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 4.
Previo a la síntesis de ADN complementario para obtener la Biblioteca RACE, se modificó el extremo 5 ' de todos los ARN mensajeros al eliminar la 7-metil guanocina (CAP) y posteriormente incorporar en este extremo un oligonucleótido de ARN por métodos enzimáticos acorde al Kit GeneRacer®5.
La síntesis de ADN complementario se llevó a cabo con un oligonucleótido tipo RACE 3 ' de la misma manera como se realizó en el Ejemplo 4, pero se emplearon dos mezclas de nucleótidos: la primera, una mezcla comercial de Invitrogen® con concentraciones equimolares de nucleótidos, y la segunda, una mezcla de nucleótidos (Mezcla E, Tabla 3) correspondiente a la composición nucleotídica específica para el Escarabajo rojo de la harina (TGSC 2008), que incluía además dimetílsulfoxido (DMSO) al 5% como coadyuvante. El protocolo de síntesis y purificación del polímero nucleotídico fue acorde al indicado en el Ejemplo 4.
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/generacer_man.pdf Para la amplificación por RT-PCR de todos los polímeros nucleotídicos del proceso anterior, se pusieron en contacto con: un par de los oligonucleótidos que hibridan en la secuencia nucleotídica de los polilinkers que se encuentran en los extremos de los adaptadores de todos los ADNc, una mezcla de ADN polimerasas termoestables Dream7 /DeepVent (Fermentas®/New England Biolabs®) y las concentraciones de nucleótidos indicadas en la síntesis de ADNc.
Las condiciones de polimerización fueron 28 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 95 °C durante 20 segundos, alineamiento de 62°C por 30 segundos, y de extensión a 72°C por 120 segundos. Los productos se purificaron por métodos de exclusión molecular en columna establecidos por QIAGEN® y visualizados en gel de agarosa. Los polímeros nucleotídicos resultantes se les denominó Biblioteca RACE. Para la identificación de los amplicones relacionados a la FGLamida en la biblioteca RACE, se realizó el procedimiento de polimerización indicado en el párrafo anterior, pero empleando como vehículo de tamizaje e iniciador de la polimerización un oligonucleótido degenerado cuyos nucleótidos corresponden a los codones para los últimos aminoácidos de la FGLamida y el par de aminoácidos básicos para el procesamiento del propéptido (Martínez-Pérez F, Bendena WG, Chang BS, Tobe SS. FGLamide Allatostatin genes in Arthropoda: introns early or late? Peptides. 2009 Jul;30(7): 1241-8; Ellott KL, Chan KK & Stay B. Evidence for a Phe-Gly-Leu-amide-like allatostatin in the beetle Tenebrio molitor. 2010 Peptides. Mar 31(3):402-7) y el oligonucleótido antisentido al polilinker del cebador RACE 3 ' el control.
Los productos se separaron para ser visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% (FIG. 2). A diferencia de lo reportado en bases literarias en las que se sugería la inexistencia de polímeros genómicos que codificaran para ARN mensajeros relacionados a los codones para el precursor del neuropéptido, la Mezcla E generó los polímeros nucleotídicos que confirman la generación y funcionalidad de la biblioteca RACE. Las reacciones positivas se purificaron por columna de exclusión molecular de manera similar a como se indica en el Ejemplo 4 y posteriormente se clonaron en el plásmido pJet 1.2 acorde a los procedimientos establecidos por el fabricante (Thermo Scientific®). Los plásmidos recombinantes se amplificaron por transformación a la bacteria E. coli C600 en condiciones de esterilidad, temperatura y medios de cultivos nutritivos con el fármaco de selección sugerido por el distribuidor del plásmido.
Para la identificación de los plásmidos recombinantes, inicialmente las colonias bacterianas positivas se cultivaron de forma independiente en medio líquido con el fármaco de selección y luego los plásmidos recombinantes se purificaron por métodos químicos- enzimáticos convencionales. La selección de los plásmidos positivos de los falsos- positivos se realizó mediante PCR según el procedimiento de la amplificación de la biblioteca RACE, pero con un par de oligonucleótidos que flanquean la región del polilinker de cada plásmido y por 20 ciclos. Los amplicones se visualizaron en gel de agarosa como se indicó en la reacción de RT-PCR de tamizaje de la biblioteca RACE (FIG. 3).
La secuenciación de los plásmidos recombinantes se realizó utilizando el Kit GenomeLab Methods Development Kit MDK 6 , el cual permitió disponer en la reacción de secuenciación las proporciones nucleotídicas y desoxinucleotídicas de la Mezcla E para la amplificación de la librería. La secuenciación de los controles correspondió a la que empleó la mezcla del Kit CEQ Quick Start7 (Beckman Coulter®) la cual contiene nucleótidos con concentraciones equimolares. Tanto las ADN polimerasas y todos los componentes de la reacción, incluyendo el oligonucleótido de inicio de la polimerización, fueron los correspondientes a cada Kit. Así mismo, las condiciones de polimerización y purificación de los polímeros se realizaron de acuerdo a las indicaciones del Kit. La señal luminosa incorporada a cada uno de los polímeros nucleotídicos se identificó y se cuantificó por electroforesis de ocho capilares
6 Μί 5://\ν\ν\ν^εο1ίηιαηςοπ1ΐεΓ οιη/\ν5φθΐΐ3ΐ/ΐεο1ιάοο5?άοοηαηιε=608019.pdf
7 htt s://www.bεckmancoultεr.com/wsφortal/bibliogra hy?docπamε=DS9380A.pdf acoplados a rayo láser por medio del equipo GenomeLab GeXP™ Genetic Analysis System (Beckman Coulter®) y los datos fueron visualizados con el programa computacional propuesto por el fabricante. En la FIG. 4 se muestra un par de gráficas del patrón de luminosidad de la secuenciación de tres de los plásmidos recombinantes empleando la mezcla de nucleótidos del producto comercial, donde se observa claramente que no hubo reacción de secuenciación puesto que no existió reacción de polimerización. De igual manera, la secuenciación de los mismos plásmidos recombinantes para polímeros nucleotídicos ricos en G-C generó amplicones sin una concordancia biológica a cualquier marco abierto de lectura de ARN mensajeros, como se muestra en la FIG. 5. La polimerización inadecuada se corrigió empleando la Mezcla E.
La superioridad en la polimerización al emplear la Mezcla, debido a su concentración nucleotídica específica, con respecto a la mezcla comercial, también se demostró con el resultado obtenido del polímero nucleotídico del plásmido recombinante J50C3 para Escarabajo negro. La secuencia obtenida utilizando la Mezcla E fue homologa con la beta integrina del Escarabajo rojo de la harina, en tanto que el mismo polímero, pero secuenciado con la mezcla comercial, generó una secuencia sin relevancia biológica homologa a segmentos pequeños de polímeros nucleotídicos no mayores a 50 nucleótidos (pez, ácaro y genoma mitocondrial de loros).
Si bien las dos mezclas, la mezcla comercial y la Mezcla E, generaron polimerización nucleotídica, el resultado de la mezcla comercial no produjo una secuencia acorde a un patrón biológico, como sí lo produjo la Mezcla E, en la que el patrón de polimerización es el esperado para cualquier polímero nucleotídico independientemente de su concentración y orden de nucleótidos (FIG. 6).
Empleando la mezcla de la invención, se confirmó la presencia de polímeros nucleotídicos que no pudieron ser identificados por los métodos existentes para la secuenciación genómica de especies homologas (TGSC, 2008), pero de los que se tenían reportes de la actividad biológica de los productos proteicos sintetizados a partir del polímero nucleotídico correspondiente (Martínez-Pérez F, Bendena WG, Chang BS, Tobe SS.
FGLamide Allatostatin genes in Arthropoda: introns early or late? Peptides. 2009 Jul;30(7): 1241-8; Ellott KL, Chan KK & Stay B. Evidence for a Phe-Gly-Leu-amide-like allatostatin in the beetle Tenebrio molitor. 2010 Peptides. Mar 31(3):402-7).
EJEMPLO 6. Secuenciación genómica de tercera generación del genoma de la bacteria Kocuria rhizophila.
Para determinar la eficiencia de las mezclas de la invención en tecnologías de secuenciación de tercera generación a partir de polímeros nucleotídicos ricos en GC, se seleccionó la especie bacteriana Kocuria rhizophila ATCC 9341, cuya composición nucleotídica aproximada es A-T 29,8% - G-C 71,2% (Takarada H, Sekine M, Kosugi H, Matsuo Y, Fujisawa T, Omata S, Kishi E, Shimizu A, Tsukatani N, Tanikawa S, Fujita N, Harayama S. Complete genome sequence of the soil actinomycete Kocuria rhizophila. J Bacteriol. Jun 2008; 190(12):4139-46) y se empleó la Mezcla L (Tabla 3).
La secuenciación genómica se realizó con el sistema Flx + 454-ROCHE8 en formato 1x550. Para ello, la Biblioteca se construyó con insertos de 1500 pb y su titulación se realizó de acuerdo al protocolo propuesto por el manual Rapid Library Preparation Manual GS FLX+ and GS Junior+ Series - XL9.
Para la reacción de emulsión, en la cual se generan los microreactores para la incorporación de los polímeros nucleotídicos de la Biblioteca a las microesfereas, únicamente se modificó la concentración nucleotídica y se incluyó el coadyuvante en la mezcla de nucleótidos para la polimerización, el resto del proceso se realizó según el protocolo indicado en el manual emPCR Amplification Manual - Lib-L GS Júnior and GS Junior+ Series10.
8 http://454.com/products/gs-flx-system/
'http://454.com/downloads/my454/documenMion/gs-flx-plus/Rapid-Libraiy-Preparation-Me
Manual_XLPlus_May201 l.pdf
10 http://454.com/downloads/my454/documentation/gs-flx-plus/emPCR-Amp-Lib-L-LV-Method- Manual_XLPlus_May201 l.pdf La primera modificación se realizó con la Mezcla L. En la segunda, se adiciono una mezcla comercial con proporciones equimolares y DMSO al 5% (p/p) como coadyuvante. Para la tercera, se empleó la Mezcla L junto con el DMSO al 5% (p/p). Posteriormente, la secuenciación de los productos poliméricos obtenidos del proceso anterior se realizó de acuerdo al Manual Sequencing GS Júnior + Series - XL+ Kit11.
Como se puede observar en la Tabla 5, la inclusión de la Mezcla L en la emulsión cambió radicalmente la secuenciación de tercera generación en comparación con la mezcla comercial, puesto que la calidad de la polimerización a nivel de su fidelidad, respecto al genoma de referencia, fue muy alta. Con la inclusión de DMSO en la Mezcla comercial se triplicó el número de nucleótidos totales (Mb) y se duplicó el número de lecturas y la longitud promedio; mientras que, la inclusión de DMSO en la Mezcla L genera productos pequeños pero de una muy alta fidelidad.
Tabla 5
Figure imgf000019_0001
'Mezcla Comercial con cantidades equimolares de nucleótidos.
2Mezcla L A-T«G-C con proporción de nucleótidos A-T 15,0% : G-C 35,0%.
Estos resultados confirman que la presencia de DMSO en la polimerización, mejora significativamente la secuenciación de polímeros nucleotídicos por procedimientos de tercera generación y genera resultados más confiables en cuanto a la calidad del polímero obtenido.
EJEMPLO 7. Transcripción in vitro de polímeros nucleotídicos.
11 http://454.com/downloads/my454/documentation/gs-flx-plus/GS-FLXPlus_Sequencing_Method- Manual_XLPlusKit_May2011.pdf Para la producción de polímeros nucleotídicos en forma de ARN, se puede utilizar cualquier Kit comercial que contenga los nucleótidos (dNTPs) y una ARN polimerasa. Uno de estos kits puede ser MEGAscript® T7 Transcription kit12 que incluye los cuatro nucleótidos de forma independiente para obtener cualquiera de las mezclas mencionadas en los Ejemplos 1 a 6. Para ello, se prepara una mezcla de dNTPs con las proporciones de la Mezcla W, como se indica en la Tabla 4. Finalizada la polimerización, el ARN se purifica y recupera siguiendo las indicaciones del producto o por métodos químicos o físicos convencionales.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1334

Claims

REIVINDICACIONES
1) Una mezcla de nucleótidos (dNTPs) que comprende adenina (A), timina (T), uracilo (U), guanina (G) y citosina (C) y/o sus análogos, en donde la concentración molar de cada uno de los dNTPs se encuentra en los rangos de porcentaje indicados a continuación, en una proporción 1 : 1 mol/mol de A-T ó A-U y 1 : 1 mol/mol de G-C, y cuya suma total en porcentaje es 100,0%.
Figure imgf000021_0001
2) La mezcla de dNTPs de acuerdo con la Reivindicación 1, que adicionalmente comprende uno o más coadyuvantes y un vehículo aceptable.
3) La mezcla de dNTPs de acuerdo con la Reivindicación 2, donde los coadyuvantes se seleccionan de solventes, diluyentes, sales, reguladores de pH, cofactores, enzimas y compuestos químicos tales como dimetilsulfóxido (DMSO), tetracloruro de etilamonio (TAE-Cl), tetracloruro de metilamonio (TAM-Cl), en concentraciones entre 0,1% y 99,9% p/p.
4) La mezcla de la Reivindicación 1, que comprende los siguientes porcentajes de dNTPs:
Figure imgf000021_0002
5) La mezcla de la Reivindicación 1, que comprende los siguientes porcentajes de dNTPs:
Figure imgf000022_0001
6) La mezcla de dNTPs de acuerdo con la Reivindicación 4 o 5, que adicionalmente comprende uno o más coadyuvantes y un vehículo aceptable.
7) Un procedimiento para la amplificación y secuenciación de polímeros de ácidos nucleicos caracterizado porque emplea una o más de las mezclas de nucleótidos dNTPs de acuerdo con las Reivindicaciones 1 a 5.
8) El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en donde la amplificación y secuenciación se lleva a cabo aplicando técnicas moleculares que incluyen: hibridación, síntesis de ácido ribonucleico complementario (ADNc o cDNA), amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, predicción por medio de tecnologías electrónicas, informáticas o manuales que permitan determinar la complementariedad entre secuencias nucleotídicas y la concentración de sus componentes en el polímero.
9) El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, que comprende las siguientes etapas: purificar los polímeros nucleotídicos presentes en una muestra de cualquier origen;
poner en contacto una muestra del polímero nucleotídico que se desee amplificar o secuenciar con al menos una de las mezclas de dNTPs; llevar a cabo una reacción de síntesis de polímeros nucleotídicos complementarios y/o su amplificación o secuenciación en condiciones adecuadas de medio de reacción, pH y temperatura; y
establecer si el polímero nucleotídico obtenido corresponde en tamaño, composición y orden nucleotídico esperado de forma directa o indirecta.
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