WO2018178474A2

WO2018178474A2 - Método de diagnóstico de demencia frontotemporal y enfermedad de alzheimer

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Publication number: WO2018178474A2
Application number: PCT/ES2018/070261
Authority: WO
Inventors: Pedro CARMONA HERNÁNDEZ; Adolfo TOLEDANO GASCA; Eduardo LÓPEZ TOBAR; Marina Molina Santos
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2018-10-04
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: WO2018178474A3

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para el diagnóstico de demencia frontotemporal, un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer, un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer y un método para el diagnóstico de Alzheimer, dichos métodos basados en espectroscopia Raman y/o infrarrojo que comprenden registrar un espectro Raman y/o infrarrojo de una muestra de sangre.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DEMENCIA FRONTOTEMPORAL Y

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos de diagnóstico de demencia frontotemporal y enfermedad de Alzheimer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se estima que aproximadamente 25 millones de personas en todo el mundo tienen actualmente demencia, y se prevé que la población afectada aumente a más de 40 millones en 2040. La demencia frontotemporal (DFT) es un síndrome clínico causado por la degeneración del lóbulo frontal del cerebro humano, que puede extenderse al lóbulo temporal. Es uno de los tres síndromes provocados por la degeneración lobular frontotemporal, y la segunda causa más común de la demencia de inicio temprano tras la enfermedad de Alzheimer. El diagnóstico de la DFT es fundamentalmente de tipo clínico (incluyendo cambios conductuales y alteraciones en el lenguaje) y tests neuropsicológicos (Liscic et al. Arch. Neurol. 64, 535-540 (2007)) con resultados de diagnósticos correctos inferiores al 80%. También se utilizan técnicas de neuroimagen, que requieren personal muy especializado y son muy costosas. Por otra parte, la enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia más común y aproximadamente una de cada ocho personas mayores de sesenta y cinco años de edad están en riesgo. La EA es una enfermedad neurodegenerativa de comienzo insidioso y relacionada con la edad y su patogénesis puede afectar a los cerebros de los pacientes mucho antes de que los síntomas se expresen completamente, posiblemente años e incluso décadas anteriores al diagnóstico. El diagnóstico clínico de la EA se basa principalmente en la exclusión de otras enfermedades (Struyfs et al. Front. Neurol. 6, article 138 (2015)), y en relación con la confirmación por autopsia los criterios de diagnóstico clínico de la EA alcanzan en promedio 81 % de sensibilidad y 70% de especificidad (Knopman et al. Neurology 56, 1 143-53 (2001 )). Sin embargo, estas cifras en su mayoría proceden de centros clínicos especializados y de diagnósticos basados en periodos de seguimiento de varios años. En las primeras etapas de la enfermedad y cuando el trabajo de diagnóstico se realiza en centros no especializados, se puede esperar una precisión diagnóstica muy inferior. Por tanto el

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) diagnóstico definitivo de la EA se puede realizar solamente a través de un examen patológico post-mortem del cerebro. Además, un solo tipo de patología puede producir resultados cognitivos diferentes, haciendo el diagnóstico difícil. El reto de encontrar tratamientos eficaces para la EA y otras demencias es paralelo a explorar la detección de cambios preclínicos los más precozmente posible e identificar con exactitud la patología (o patologías) responsable. El análisis de niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) de péptidos amiloides de 42 aminoácidos (Αβ^) y proteína tau (T-tau) aumenta la certeza diagnóstica para la EA (Blennow et al. Nat. Rev. Neurol. 6,131-44 (2010)). Sobre la base de la confirmación por autopsia, se demostró que en la mayoría de pacientes con diagnóstico clínico ambiguo (cuando las pruebas de diagnóstico clínico no eran capaces de discriminar entre la EA y una demencia no EA), un correcto diagnóstico se habría establecido en el 82% mediante el uso de dichos biomarcadores del LCR, lo que indica que los biomarcadores del LCR pueden tener un valor diagnóstico añadido particular en pacientes con diagnósticos clínicos ambiguos (Le Bastard et al. Neurobiol. Aging 31 , 1867-76 (2010)). En comparación con los controles, en la EA se encuentran concentraciones de Αβ _₄₂ menores y de T-tau mayores. Sin embargo, cuando se comparan con demencias no EA las diferencias son menos obvias porque las concentraciones de estos biomarcadores en pacientes con demencias no EA son generalmente intermedias entre controles sanos y pacientes de la EA, en particular en demencia con cuerpos de Lewy (DCL), demencia frontotemporal (DFT), demencia vascular (DV) y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Por otra parte, la tomografía por emisión de positrones con fluorodesoxiglucosa ha demostrado en un estudio de diagnóstico la capacidad de distinguir la EA (n = 31 ) de la DFT (n = 14) con confirmación patológica y una sensibilidad de 86% y especificidad de 98% (Foster et al. Brain 130, 2616-2635 (2007)). Sin embargo, las técnicas de imagen de resonancia magnética (IRM) y tomografía por emisión de positrones (PET) son técnicas de diagnóstico muy caras y la disponibilidad de esta instrumentación no está muy extendida.

Por consiguiente, estas consideraciones plantean grandes retos a la sociedad y sistemas de salud, y de ahí la necesidad de la investigación de biomarcadores que permitan la detección precoz de estas enfermedades para la administración de un tratamiento adecuado y poder seguir con exactitud su evolución. Para ello se requiere el desarrollo de métodos sensibles y fiables, fáciles de realizar y repetir, y de bajo

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) coste. En este aspecto, la espectroscopia vibracional (infrarroja y Raman) proporciona información específica sobre la composición y estructura molecular de los componentes de tejidos biológicos, tales como por ejemplo proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Esta información estructural es única para cada sustancia biológica y por tanto la espectroscopia vibracional puede proporcionar información de tipo "huella dactilar" sobre el estado bioquímico global de un tejido biológico como puede ser la sangre, y por tanto puede proporcionar pruebas clínicas útiles que son simples, rápidas y mínimamente invasivas.

La espectroscopia infrarroja se ha utilizado con objetivos de diagnóstico de la EA mediante análisis de linfocitos (Carmona et al. Anal. Bioanal. Chem. 402, 2015-2021 (2012)) y plasma sanguíneo (Peuchant et al. Translat. Res. 152, 103-1 12 (2008); Carmona et al. J. Alzheimer's Dis. 34, 91 1 -920 (2013)), pero en ninguno de estos trabajos se aborda el diagnóstico diferencial entre la DFT y la EA.

La espectroscopia Raman se ha aplicado para el diagnóstico de la EA mediante la medida de espectros en tejido cerebral, encontrándose como cambios bioquímicos el depósito de péptido Αβ-amiloide, aumento de colesterol y proteína hiperfosforilada tau (Archer et al. European Conference on Biomedical Optics (ECBO), Munich, Germany, 2007; Chen et al. Appl. Optics 48, 4743-4748 (2009). Sin embargo, en este trabajo se omite la especificidad y sensibilidad de esta técnica para detectar la EA en tejido cerebral, y además éste no es tan accesible como la sangre periférica, que como se sabe es un líquido biológico de fácil extracción. Asimismo la espectroscopia Raman se ha utilizado también para el estudio de plaquetas de sangre periférica obtenidas de ratones transgénicos (Chen et al. Láser Phys. Lett. 8, 547-552 (201 1 )), pero todos estos trabajos de espectroscopia Raman carecen de estudios encaminados al diagnóstico diferencial entre la EA y la DFT. Tan sólo un estudio de suero sanguíneo de humanos para el diagnóstico de la EA (Ryzhikova et al. J. Biophotonics, 1-13 (2014)) incluyó la distinción entre pacientes de la EA y de DFT mediante la determinación de intensidad o alturas de los espectros originales, pero con la particularidad de que el número de sujetos con DFT estudiados fue muy bajo (n = 3). A la vista de estas consideraciones, existe la necesidad de desarrollar técnicas analíticas que permitan encontrar marcadores espectroscópicos de sangre humana

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) ligados a la demencia frontotemporal, con el fin de distinguir entre sujetos sanos, pacientes con esta enfermedad y pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de demencia frontotemporal mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre que comprende:

a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

b) obtener un valor espectral Raman de al menos una de las siguientes regiones del espectro Raman:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar demencia frontotemporal por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de demencia frontotemporal mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) b) obtener un valor espectral infrarrojo de al menos una de las siguientes regiones del espectro infrarrojo:

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1 en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia, un valor de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar demencia frontotemporal por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de demencia frontotemporal según el aspecto 1 que comprende adicionalmente las etapas de un método según el aspecto 2 aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer que comprende:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y

c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por el promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm-1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm-1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8). En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

b) obtener un valor espectral infrarrojo de al menos una de las siguientes regiones del espectro infrarrojo: IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre absorbancia, intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1(VIR2) y la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1 171 cm^"1(VIR3).

En un sexto aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer según el cuarto aspecto que comprende adicionalmente las etapas de un método según el quinto aspecto aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En un séptimo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa de entre demencia frontotemporal o Alzheimer que comprende

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con valores espectrales Raman de referencia correspondiente.

En un octavo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

b) obtener un valor espectral infrarrojo de al menos una de las siguientes regiones del espectro infrarrojo:

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1 en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de absorbancia, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer, por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia que permita la distinción entre demencia frontotemporal y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Alzheimer, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con valores espectrales de referencia infrarrojos de demencia frontotemporal o Alzheimer. En un noveno aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer según el séptimo aspecto que comprende adicionalmente las etapas de un método según el octavo aspecto aplicado sobre una muestra del mismo sujeto. El décimo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre que comprende:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^'1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre, un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^"1(VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) . En un undécimo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1 en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia, un valor de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar Alzheimer por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia infrarrojo correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1 158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR6).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En un duodécimo aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer según el décimo aspecto que comprende adicionalmente las etapas de un método según el undécimo aspecto aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En un decimotercer aspecto, la invención se relaciona con un aparato para el análisis de plasma que comprende:

(i) un receptáculo para recibir una muestra de plasma,

(ii) al menos un espectrómetro seleccionado de un espectrómetro Raman y un espectrómetro IR

(iii) un sistema informático que comprende medios para la implementación de un método de diagnóstico de la invención.

En un decimocuarto aspecto, la invención se relaciona con un programa de ordenador que comprende un código adecuado para la realización de los métodos diagnósticos según la invención.

En un decimoquinto aspecto, la invención se relaciona con un soporte de ordenador que contiene el programa de ordenador según la invención. En un decimosexto aspecto, la invención se relaciona con un compuesto adecuado para el tratamiento de demencia frontotemporal para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado una demencia frontotemporal mediante un método según la invención.

En un decimoséptimo aspecto, la invención se relaciona con un compuesto adecuado para el tratamiento de Alzheimer para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado Alzheimer mediante un método según la invención.

EXPLICACIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Figura 1. Espectros medios Raman, en la región 3150-350 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve

(^■-)■

Figura 2. Espectros medios Raman, en la región 1680-1650 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve (^■■■■).

Figura 3. Espectros medios Raman, en la región 770-730 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve

(·-)■ Figura 4. Espectros medios Raman, en la región 1570-1500 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve (····).

Figura 5. Espectros medios Raman, en la región 3100-2800 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve (····).

Figura 6. Espectros medios Raman expresados en primera derivada, en la región 496- 490 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT (— ) y EA leve (····).

Figura 7. Espectros medios infrarrojos, expresados en segunda derivada en la región 1640-1620 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT (— ) y EA leve (^■■■■)■

Figura 8. Espectros medios infrarrojos en la región 1 185-1 140 cm^"1, de plasma de sangre periférica obtenida de controles sanos (— ) y de pacientes con DFT ( ) y EA leve (^■■■■)■ Figura 9. Curva ROC de la función discriminante canónica de la combinación de espectros infrarrojos y Raman de muestras de plasma de sangre periférica. Clasificación de 151 controles sanos (clase I) frente a 74 pacientes de DFT y 70 pacientes de la EA (clase ll+lll).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Figura 10. Curva ROC de la función discriminante canónica de la combinación de espectros infrarrojos y Raman de muestras de plasma de sangre periférica. Clasificación de 74 pacientes de DFT (clase II) frente a 70 pacientes de la EA (clase III).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores, han desarrollado unos métodos de diagnóstico que permite clasificar las muestras de plasma entre pacientes de DFT y pacientes de la EA o sujetos sanos con una sensibilidad y especificidad superiores al 80%. Método para el diagnóstico de clemencia frontotemporal

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de demencia frontotemporal mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre (primer método de la invención) que comprende: a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida; b) obtener un valor espectral Raman de al menos una de las siguientes regiones del espectro Raman:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1 R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar demencia frontotemporal por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente.

"Método de diagnóstico" o "Diagnosticar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a tanto el proceso de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir el procedimiento de diagnóstico, como a la opinión a la que se llega mediante este proceso, es decir la opinión de diagnóstico. Como tal, también puede considerarse como un intento de clasificación del estado de un individuo en categorías distintas y separadas que permiten que se tomen decisiones médicas sobre el tratamiento y el pronóstico. Tal como entenderán los expertos en la técnica, el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer, aunque se prefiere que sea así, no es necesario que sea correcto para el 100% de los sujetos que van a diagnosticarse o evaluarse. Sin embargo, el término requiere que pueda identificarse que una parte estadísticamente significativa de los sujetos padecen enfermedad de Alzheimer. Si una parte es estadísticamente significativo puede determinarse sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, de 0,05, 0,01 , 0,005 o inferior.

"Demencia frontotemporal" define como una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por un cambio progresivo en la personalidad y el comportamiento y/o una alteración temprana y progresiva del lenguaje. La demencia frontotemporal es causada cuando las células nerviosas en los lóbulos temporales del cerebro mueren y las vías que les conectan cambian; también se produce la pérdida de mensajeros químicos. Con el tiempo, el tejido cerebral de los lóbulos frontales y temporales se encoge. En las primeras fases suelen ser no específicos y difíciles de reconocer como primeras manifestaciones de una demencia. Así, suelen sugerirse otras explicaciones, como trastornos depresivos, episodios maniacos o problemas psicosociales. El estado de ánimo de euforia, en especial cuando se asocia con un aumento de la locuacidad y la agitación, puede confundirse en un primer momento con un estado de manía o hipomanía. En la fase inicial de la enfermedad, estas alteraciones de conducta y de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) personalidad suelen prevalecer sobre los déficits cognitivos, lo que dificulta la posibilidad de un diagnóstico precoz. En los estadios precoces, la exploración neurológica convencional es normal y las pruebas complementarias que arrojan información son la resonancia magnética y la exploración neuropsicológica "El término "sujeto" o "individuo" o "paciente" se refiere a un ser humano.

Los métodos de diagnóstico de la presente invención son métodos espectroscópicos vibracionales. "Método espectroscópico vibracional" tal como se usa en el presente documento, se refiere al análisis de las propiedades moleculares basándose en vibraciones a nivel molecular. En particular, Raman es una técnica de dispersión/dispersiva eficaz en el intervalo de 50 - 4.000 cm ¹ e implica un desplazamiento en frecuencia de la luz incidente (desplazamiento de Raman). Alternativamente, el espectro electromagnético puede analizarse en la zona del infrarrojo que comprende desde 100 a 5000 cm^"1 y en donde se producen excitaciones vibracionales y rotacionales. La orientación óptica del rayo de luz que entra al monocromador (rayo dispersado) respecto al rayo de luz incidente en la muestra puede ser de 90 grados o 180 grados (retro-reflexión). En una realización particular, la luz dispersa Raman se analiza mediante una óptica de retro-reflexión.

La etapa a) del primer método de la invención comprende registrar un espectro Raman en una muestra de sangre humana previamente obtenida. En el alcance de la presente invención, la expresión "espectro de Raman" se refiere a la colección de números de onda que comprende la región espectral comprendida entre 300 y 3100 cm^"1, aunque la región espectral puede ser más amplia siempre que comprenda dicha región espectral anterior. De hecho, en la región espectral comprendida entre 390 y 3100 cm^"1, los autores de la presente invención han encontrado la presencia de 3 regiones espectrales que se correlacionan con la presencia o no de demencia frontotemporal, que comprenden las regiones definidas en R.1 a R.3.

En una realización preferida, el espectro Raman se registra utilizando una línea de láser excitatriz de 785 nm.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) La etapa b), comprende obtener un valor espectral Raman de al menos una de las siguientes regiones del espectro Raman:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1 R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia.

El término "valor espectral", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier parámetro medible que pueda obtenerse a partir de un espectro y que pueda usarse para comparar varios espectros.

De acuerdo al primer método de la invención, el valor espectral a determinar se selecciona de entre valor de intensidad, valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, valor de área de una región espectral y un valor de frecuencia. El término "valor de intensidad" se refiere a la intensidad de un pico a un número de onda dado.

En el alcance de la presente invención, la expresión "banda alrededor de un valor de frecuencia expresado en cm^"1" se refiere a la banda en el espectro vibracional de Raman cuya intensidad se obtiene en el intervalo de frecuencia determinado por vi ± X cm^"1, en donde X es un valor de frecuencia variable que es al menos 1 , al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 cm^"1 o mayor. En una realización preferida, X tiene un valor de 2. Por tanto una banda alrededor de un valor de frecuencia de, por ejemplo, 2936 cm^"1 se refiere a la banda máxima que se obtiene en el intervalo de 2934 a 2938 cm^"1. En la presente memoria descriptiva, dicho término puede denominarse también "banda que se aproxima a un valor de frecuencia expresado en cm^"1". El aumento de ± X cm^"1 en una frecuencia de banda se indica para definir una amplitud de intervalo de frecuencia de una misma banda que puede medirse en diversos espectrómetros que difieren en la precisión de medición de la frecuencia. Por tanto, debe entenderse que el valor de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) frecuencias vi que aparecen en esta memoria descriptiva puede variar en ± X cm^'1 con respecto a dicho valor de frecuencia dependiendo del espectrómetro usado.

Por consiguiente, el término "intensidad Raman obtenida alrededor de un valor de frecuencia vi expresado en cm^"1" se entiende que se refiere al valor de intensidad del espectro Raman obtenido en el máximo de la banda que aparece en el intervalo de frecuencia determinado por vi ± X cm^"1. En el caso de que X tenga un valor de 2, una intensidad Raman obtenida alrededor de un valor de frecuencia de 2936 cm^"1 corresponde al valor de intensidad del máximo obtenido en el intervalo de frecuencia comprendido entre 2934 cm^"1 y 2938 cm^"1. La intensidad Raman de una banda en esta invención se entiende como altura de dicha banda, puesto que la intensidad de una banda es proporcional a su altura.

"Relación de intensidades entre bandas", se refiere al cociente entre dos intensidades.

El término "área", tal como se usa en el presente documento, se refiere a uso del área definida por un pico del espectro que puede calcularse dibujando una línea base a través del pico y midiendo el área encerrada en el pico. La línea base se dibuja normalmente basándose en los puntos antes y después del pico en el espectro. En una realización, el área usada para la normalización es el área de la región espectral comprendida entre 600 y 3100 cm^"1, o el área de la banda amida I comprendida en la región entre 1700 y 1600 cm^"1. El término "frecuencia" utilizado en esta memoria se refiere al denominado "número de ondas", que es una magnitud de frecuencia que indica el número de veces que vibra una onda en una unidad de distancia. La unidad utilizada en esta invención es ciclos por centímetro o centímetros recíprocos, cm^"1.

En una realización particular, el primer método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo que consiste en

- VR1 : la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1;

- VR2: la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 1671 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) - VR3: promedio de la primera derivada de la intensidad a 1662 cm^"1 y 1660 cm^"

1.

- VR4: el área de la banda hacia 1525 cm^"1;

- VR5: la altura de la banda hacia 1525 cm^"1; - VR6: el área de la banda hacia 1555 cm^"1;

- VR7: la altura de la banda hacia 1555 cm^"1;

- VR8: la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1:

- VR9: la relación de la altura de la banda hacia 1525 cm^"1 a la altura de la banda hacia 1555 cm^"1;

- VR10: el área del perfil espectral comprendido entre 980 y 910 cm^"1;

- VR1 1 : la frecuencia de la banda comprendida en la región entre 740 y 750 cm^"

1.

- VR12: promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y 744 cm^"1; - VR13: el valor de la primera derivada de la intensidad a 747 cm^"1;

- VR14: el valor de la primera derivada de la intensidad a 757 cm^"1;

- VR15: el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1;

- VR16: el valor de la primera derivada de la intensidad a 761 cm^"1;

- VR17: el valor de la primera derivada de la intensidad a 762 cm^"1 ; - VR18: la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 a la intensidad a 744 cm^"1;

- VR19: la relación de la altura de la banda hacia 644 cm^"1 a la altura de la banda hacia 622 cm^"1;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) - VR20: la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1;

- VR21 : el valor de la primera derivada de la intensidad a 412 cm

- VR22: el valor de la primera derivada de la intensidad a 413 cm - VR23: el valor de la primera derivada de la intensidad a 414 cm

- VR24: el valor de la primera derivada de la intensidad a 415 cm

- VR25: el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm

- VR26: el valor de la primera derivada de la intensidad a 417 cm

- VR27: el valor de la primera derivada de la intensidad a 430 cm - VR28: el valor de la primera derivada de la intensidad a 496 cm^"1;y

- VR29: la relación de la intensidad a 409 cm^"1 a la intensidad a 423 cm^"1.

En otra realización, el primer método de la invención comprende determinar al menos dos valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente. En otra realización, el primer método de la invención comprende determinar al menos tres, preferiblemente al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28 o 29 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VR1 a VR29.

En una realización aún más preferida el primer método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo que consiste en la relación del área del perfil espectral Raman comprendido entre 910 y 980 cm^"1 (VR10), la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro entre 740 y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) 750 cm^"1 (VR1 1 ), la relación de las intensidades Raman obtenidas en el máximo de la banda hacia 758 cm-1 y a 744 cm-1 (VR18), la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7), el área de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR6), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25) y la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 409 cm^"1 y 423 cm^"1 (VR29).

En una realización aún más preferida, el primer método de la invención comprende determinar la relación del área del perfil espectral Raman comprendido entre 910 y 980 cm^"1 (VR10), la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro entre 740 y 750 cm^"1 (VR11 ), la relación de las intensidades Raman obtenidas en el máximo de la banda hacia 758 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR18), la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25) y la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 409 cm^"1 y 423 cm^"1 (VR29).

En otro aspecto, el método de diagnóstico de demencia frontotemporal en una muestra de sangre está basado en espectroscopia infrarroja (segundo método de la invención) y comprende

a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia o de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar demencia frontotemporal por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente.

"Espectroscopia infrarroja" En el ámbito de la presente invención, la expresión "espectro infrarrojo (IR)" hace referencia a un espectro IR que comprende las regiones espectrales entre 1000 y 1200 cm^"1 y entre 1600-1700 cm^"1, pudiendo dicho espectro consistir en una región espectral más amplia que comprenda las regiones espectrales anteriores, resultando preferidos aquellos espectros que comprenden al menos la región espectral entre 910 y 1700 cm^"1.

La etapa a) del segundo método déla invención comprende registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida.

Análogamente y según la invención, el "valor espectral infrarrojo", se refiere a un valor obtenido a partir del perfil espectral infrarrojo de una de las regiones definidas en IR.1 e IR. 2, como por ejemplo son entre otros un porcentaje de área de una banda componente del perfil espectral de dicha región, un valor de absorbancia o el área normalizada del perfil espectral de dicha región.

De acuerdo al segundo método de la invención, el valor espectral infrarrojo se selecciona de entre un valor de absorbancia o intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral. Los términos "banda alrededor de una frecuencia expresado en cm-¹", "valor de intensidad" y "valor de área" han sido definidos anteriormente y son igualmente aplicables a espectros infrarrojos.

La "absorbancia" (llamada también densidad óptica) se define como la relación (logarítmica) entre la intensidad de luz infrarroja que incide sobre una muestra y la intensidad de esa misma luz que es transmitida a través de esa muestra. Cuando el espectro infrarrojo se expresa en absorbancias, la absorbancia de una banda a una frecuencia dada es directamente proporcional a la altura de dicha banda. Por consiguiente, las relaciones de áreas entre dos bandas es equivalente a las relaciones de alturas entre dichas bandas. Finalmente el porcentaje de área entre bandas es una manera de expresar las relaciones de áreas entre esas mismas bandas.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización particular, el segundo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en:

-VIR1 : porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada.

-VIR2: la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1;

- VIR3: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1171 cm^"1; -VIR4: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de la intensidad hacia 1 171 cm^"1;

-VIR5: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 156 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de la intensidad hacia 1171 cm^"1;

-VIR6: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1;

-VIR7: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1160 cm^"1 y 1 162 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1; -VI R8: relación del área entre 1165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada; y

-VI R9: relación del área entre 1166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1;

En otra realización particular, el segundo método de la invención comprende determinar al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o 9 valores espectrales infrarrojos seleccionados del grupo que consiste en VIR1 a VIR9 tal y como se han definido anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VIR1 a VIR9.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización preferida del segundo método de la invención, comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ), la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 respecto a la absorbancia del máximo hacia 1171 cm^"1 (VI R2) y la relación de la primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1171 cm^"1 (VIR3).

En otra realización aún más preferida el segundo método de la invención comprende determinar el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ) y la relación de la absorbancia a 1156 cm^"1 respecto a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VI R2).

Un tercer método de diagnóstico de demencia frontotemporal comprende las etapas del primer método de la invención y adicionalmente las etapas del segundo método de la invención aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En una realización particular el tercer método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente y al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en VIR1 a VIR9. La invención contempla cualquier combinación de VR1 a VR29 junto con VIR1 a VIR9.

En otra realización particular, el tercer método de la invención comprende determinar preferiblemente al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28 o 29 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente y al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VIR1 a VIR9 tal y como se definen anteriormente.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Cualquier combinación de VR1 a VR29 y VIR1 a VIR9 están contemplados en la presente invención.

En una realización preferida, el tercer método de la invención comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25), el área de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR6) y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la absorbancia a 1156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2), la relación de la primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR3) y el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ).

Los métodos de la presente invención, con el fin de obtener un valor espectral pueden contemplar la normalización y deconvolución de los espectros.

Un experto en la técnica entenderá que, según el método de la invención, en una realización preferida, la invención contempla preferiblemente corregir la línea base del espectro de Raman y/o espectro infrarrojo y normalizar dicho espectro con respecto a su área total o respecto al área de la banda amida I con el fin de determinar el valor espectral.

El término "normalización", tal como se usa en el presente documento se refiere a la eliminación de diferencias sistemáticas entre mediciones. Una de las fuentes más significativas de error sistemático en mediciones espectrales de Raman e infrarrojo surge de las variaciones de intensidad total. La normalización puede ser útil para evitar que las diferencias en el valor espectral se deban a diferencias en la cantidad de muestra sometida a ensayo o debidas a la variabilidad en la calidad de la muestra usada así como para eliminar fuentes no deseadas de variación sistemática en mediciones de Raman, y similares.

Un experto en la técnica entenderá que el método de la invención también contempla la normalización del espectro de Raman y/o infrarrojo. La normalización puede llevarse a cabo usando cualquier banda que no cambie entre pacientes con demencia frontotemporal y pacientes que no padecen demencia frontotemporal. En una realización preferida, la normalización puede llevarse a cabo dividiendo el valor del

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) espectro del pico de interés entre el valor del espectro completo. Preferiblemente la región espectral completa está comprendida entre la longitud de onda de 600 y 3100 cm-1.

En otra realización particular, tras la etapa a) del método de la invención, se corrige la línea base del espectro Raman y/o infrarrojo y se normaliza dicho espectro respecto al área de la banda amida I.

"Amida I", tal y como se usa en la presente invención se refiere a la región 1700-1600 cm-1.

Se entenderá que con el fin de obtener el valor espectral se usa cualquiera de los valores de normalización mencionados anteriormente. El valor de referencia se normaliza preferiblemente usando el mismo valor de normalización. Por ejemplo, si el valor de referencia es la intensidad de la banda de Raman a una frecuencia de alrededor de 2936 cm^"1 en un paciente control (es decir, un paciente que no padece demencia frontotemporal), entonces la intensidad de la banda del espectro control tiene que obtenerse normalizando de la misma manera que la intensidad de la banda de la muestra en estudio. En este caso, el valor de referencia que va a usarse en la etapa c) para determinar si la intensidad de la banda aumenta es el valor de referencia normalizado.

En una realización preferida, el valor de intensidad se determina tras normalizar el valor del espectro con respecto al área total del perfil espectral Raman.

El término "deconvolución", tal como se usa en la presente invención, se refiere a un método mediante el cual el espectro se resuelve en sus elementos constituyentes, permitiendo de ese modo la identificación de señales que de lo contrario permanecerían enmascaradas. Con el fin de obtener mejores resultados con el método descrito en la presente invención, es conveniente eliminar las señales de fluorescencia generadas en el espectro por sustancias biológicas contenidas en las muestras de sangre que enmascaran al menos parcialmente los espectros de Raman de las muestras en cuestión. Aunque la fluorescencia de los espectros de Raman generados con excitación de Raman con líneas de láser en el espectro visible puede minimizarse por

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) medio de la optimización del microespectrómetro que va a usarse, la supresión de la fluorescencia no puede ser del 100%. Por tanto, es conveniente obtener el espectro por medio del uso de líneas de láser con excitación en el infrarrojo cercano, tal como una línea de láser de neodimio-YAG a 1064 nm por ejemplo. En una realización preferida, el espectro de Raman se registra usando una línea de excitación con láser en el infrarrojo cercano a 750-1400 nm.

La etapa c) de los métodos de la invención comprende comparar el valor espectral de Raman y/o infrarrojo obtenido en la etapa b) con un valor espectral de referencia correspondiente o por comparación mediante análisis multivariante, y más preferiblemente se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales.

En una realización preferida la etapa c) comprende comparar el valor espectral de Raman y/o infrarrojo obtenido en la etapa b) con un valor espectral de referencia correspondiente.

En una realización preferida "valor espectral de referencia" se refiere al valor de corte (asociado a la mayor sensibilidad y especificidad) obtenido mediante la curva ROC para la variable espectral de una región. Cuando la clasificación de la etapa c se lleva a cabo mediante análisis multivariante considerando dos o más regiones espectrales de las definidas anteriormente (regiones Raman R.1 a R.3 y/o regiones infrarrojas IR.1 e IR.2), los valores espectrales de referencia se refieren al correspondiente punto de corte discriminante (C), es decir, al valor medio de los centroides de los dos grupos I y II (DI y Dll); siendo cada centroide la puntuación discriminante (valor de la función discriminante) para los promedios de cada una de las variables discriminantes en cada grupo. Es decir, el centroide de un grupo es un punto cuyas coordenadas son los promedios, en el grupo, de cada una de las variables discriminantes. Si la puntuación discriminante Di para la muestra i es tal que la diferencia Di-DI en valor absoluto es menor que la diferencia C-DI en valor absoluto, dicha muestra se considera que pertenece al grupo I, y pertenecerá al grupo II en caso contrario .

Tal como se usa en el presente documento valor espectral de referencia se refiere a un valor de laboratorio usado como referencia para los valores/datos obtenidos a partir de muestras. El valor de referencia (o nivel de referencia) puede ser un valor absoluto, a un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, una serie de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) valores, un valor promedio, una mediana, un valor medio, o un valor expresado mediante referencia a un valor de referencia o control. Un valor de referencia puede basarse en el valor obtenido de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra de estudio pero obtenido en un punto en el tiempo anterior. El valor de referencia puede basarse en un alto número muestras, tales como los valores obtenidos en una población de muestras o basados en un conjunto de muestras incluyendo o excluyendo la muestra que va a someterse a prueba. En una realización aún más preferida, cuando la muestra de referencia se obtiene a partir de un conjunto de muestras, entonces las muestras son del mismo tipo de muestra que la muestra obtenida del sujeto en estudio, es decir si el espectro de Raman del sujeto en estudio se ha obtenido de plasma, entonces el valor de referencia se obtiene de un espectro de Raman obtenido de un conjunto de muestras de plasma.

En una realización preferida, el valor espectral de referencia es el valor espectral de una muestra obtenida de un paciente control, más particularmente de un sujeto que no padece demencia frototemporal, y más preferiblemente de un sujeto sano. En una realización aún más preferida, la muestra de referencia obtenida de un paciente control tal como se definió anteriormente es el mismo tipo de muestra que la muestra obtenida del sujeto en estudio, es decir si el espectro de Raman del sujeto en estudio se ha obtenido de plasma, entonces el valor de referencia se obtiene de un espectro de Raman obtenido de una muestra de plasma en el sujeto control. En otra realización, el valor espectral de referencia es el valor espectral de una muestra obtenida del paciente en estudio pero obtenida en un punto en el tiempo anterior y, en particular, en un punto en el tiempo en el que el paciente no mostraba ningún síntoma de la enfermedad. En una realización aún más preferida, la muestra de referencia obtenida de un paciente en un punto en el tiempo anterior tal como se definió anteriormente es el mismo tipo de muestra que la muestra obtenida del sujeto en estudio, es decir: si el espectro de Raman del sujeto en estudio se ha obtenido de plasma, entonces el valor de referencia se obtiene de un espectro de Raman obtenido de una muestra de plasma del mismo sujeto en el punto en el tiempo anterior. Lo equivalente aplica para determinar un espectro infrarrojo.

Los valores de referencia pueden ser los puntos de corte de las curvas ROC, ya sean curvas ROC construidas con un solo parámetro espectral o curvas ROC construidas con combinaciones lineales (funciones discriminantes) de varios parámetros

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) espectrales. En una realización particular los puntos de corte son los incluidos en las Tablas 1-3. Ahora bien, el experto en la materia sabe que los puntos de corte se pueden elegir en función de la especificidad o sensibilidad que se desee y para ello es importante el área bajo la curva ROC (AUC) como criterio de calidad de un método de diagnóstico en la clasificación de muestras.

En una realización preferida, la etapa c) de comparación del valor obtenido en la etapa b con un valor de referencia correspondiente se realiza por comparación mediante análisis multivariante, y más preferiblemente se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales. En una realización particular del primer, segundo y/o tercer método de la invención, el valor de referencia Raman y/o infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

Alternativamente, a modo de ejemplo ilustrativo no limitativo un incremento del valor espectral VR6, VIR1 y/o VIR2 es indicativo de que el sujeto padece demencia frontotemporal. Un valor espectral Raman se considera "incrementado" o "aumentado", cuando el valor Raman de una banda alrededor de, a modo de ejemplo ilustrativo no limitativo 2396 cm-1 , en comparación con el valor espectral de referencia correspondiente es al menos el 1 ,5%, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 1 10%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o más.

A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR1 1 , VR25, y/o VIR3 disminuido es indicativo de que el sujeto padece demencia frontotemporal.

Un valor espectral Raman se encuentra "disminuido", cuando un valor espectral Raman concreto, en comparación con el valor espectral de referencia correspondiente se encuentra reducido en al menos el 1 ,5%, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%,

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 1 10%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o más. Alternativamente, la etapa c) de los métodos de la invención comprende comparar mediante análisis multivariante el valor espectral Raman y/o infrarrojo obtenido en la etapa b) con un valor espectral de referencia Raman y/o infrarrojo correspondiente.

En el ámbito de la presente invención, la "comparación mediante análisis multivariante" hace referencia a la comparación mediante uno de estos tres métodos alternativos: análisis discriminante, análisis de conglomerados y redes neurales. Resulta preferida la comparación mediante análisis discriminante como modelo compuesto por una función discriminante (para dos grupos en esta invención) basada en combinaciones lineales de las variables predictoras que proporcionan la mejor discriminación posible entre los grupos, ya que dicho análisis discriminante proporciona mejores resultados de clasificación de muestras que los obtenidos mediante los otros métodos alternativos de comparación. El experto en la materia conoce cómo obtener la función discriminante, a modo de ejemplo se describe en manuales de análisis multivariante o en el programa informático SPSS de IBM.

La determinación de los métodos de la invención se llevan a cabo en una muestra de sangre.

En una realización preferida de los métodos de la invención, la muestra de sangre es una muestra de plasma.

Tal como se entiende en la invención, "plasma" se refiere al elemento líquido de la sangre, que representa el 60% del volumen sanguíneo total y que carece de glóbulos rojos y blancos.

La presente invención puede llevarse a cabo en plasma sustancialmente libre de plaquetas. Alternativamente, se prefiere una muestra de plasma rico en plaquetas. Tal como se usa en la presente invención, "plasma rico en plaquetas" se refiere a plasma que se ha enriquecido con plaquetas y contiene generalmente más de 300-350.000 plaquetas/μΙ. Pueden usarse diversos métodos en el estado de la técnica para obtener

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) plasma rico en plaquetas. Los diversos métodos consisten en obtener sangre en tubos con anticoagulante y someterlos a diferentes condiciones de centrifugación según los diferentes protocolos, de manera que la sangre se separa en sus componentes básicos dependiendo de la densidad, seleccionando la fracción correspondiente al plasma rico en plaquetas.

Según la invención, la fracción de plasma sanguíneo que va a analizarse puede obtenerse previamente a partir de una muestra de sangre humana (preferiblemente sangre periférica humana) ya obtenida por medio de cualquiera de los procedimientos de fraccionamiento de sangre convencionales, tales como fraccionamiento por centrifugación-filtración por ejemplo.

En una realización adicional, la muestra de plasma es plasma deshidratado "Fluido biológico deshidratado", tal como se usa en el presente documento se refiere a una muestra de fluido biológico que muestra una eliminación del contenido en agua. En una realización preferida, la eliminación de agua es completa. En una realización preferida, la muestra de plasma se procesa antes del registro del espectro de Raman y/o infrarrojo. En una realización aún más preferida, el procesamiento se lleva a cabo mediante deshidratación. En una realización preferida, la deshidratación se lleva a cabo mediante evaporación. En otra realización, la deshidratación se lleva a cabo hasta la sequedad. En otra realización preferida, el fluido biológico deshidratado es plasma deshidratado.

En otra realización preferida, la muestra se cristaliza.

En otra realización preferida, la muestra de la fracción de plasma sanguíneo se prepara para registrar su espectro Raman e infrarrojo siguiendo un procedimiento que comprende: a) Tomar una cantidad adecuada de plasma que se depositan bien extendidos sobre un cristal de CaF₂;

b) Secar a temperatura ambiente la muestra depositada en forma de película líquida.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización preferida, el plasma deshidratado se prepara siguiendo un procedimiento que comprende extender un volumen de entre 6 y 100 μΙ de una fracción de plasma sanguíneo sobre un cristal de CaF₂ o ZnSe o sobre un soporte metálico y dejarla que se evapore completamente hasta sequedad a una temperatura comprendida entre 10 y 25°C, preferiblemente entre 15 y 25°C.

El experto en la técnica sabe que el volumen de muestra dependerá del tipo de soporte, por ejemplo cristal de CaF₂ o ZnSe o soporte metálico. En una realización preferida el volumen de fracción de plasma sanguíneo es de entre 6 y 14 μΙ o entre 10- 100 μΙ. En una realización más preferida, el volumen es de entre 10-20 μΙ, 20-30 μΙ, 30-40 μΙ, 40-50 μΙ, 50-60 μΙ, 60-70 μΙ, 70-80 μΙ, 80-90 μΙ o 90-100 μΙ. En una realización aún más preferida, el volumen de una fracción de plasma sanguíneo es de 10 μΙ.

En otra realización preferida, la superficie del cristal o soporte metálico es de entre 0,5 y 2 cm², preferiblemente 1 cm². En otra realización preferida, se usa el cristal de CaF₂.

"Cristal de CaF₂", tal como se usa en el presente documento se refiere a un cristal cúbico con una única línea de Raman de primer orden de 322 cm-1 a 300°K, muestra alta transmitancia en el intervalo de UV lejano a IR medio, bajo índice de refracción, alta resistencia mecánica y alto umbral de daño por láser. "Cristal de ZnSe", tal como se usa en el presente documento se refiere a un producto químicamente inerte, no higroscópico y altamente puro que es muy eficaz en muchas aplicaciones ópticas debido a sus pérdidas de volumen extremadamente bajas, alta resistencia al choque térmico y estabilidad en prácticamente todos los entornos, se mecaniza fácilmente. En otra realización preferida se usa un soporte metálico, siendo preferiblemente el metal Ag, Au y Cu. La preparación de la superficie puede ser a través de corrugación electroquímica, recubrimiento metálico de un sustrato nanoestructurado o deposición de nanopartículas metálicas.

La evaporación hasta la sequedad del volumen de dicha fracción puede realizarse a una temperatura comprendida entre 10 y 25°C sin observar ninguna alteración de las

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) muestras para el fin de la presente invención. La evaporación se realiza preferiblemente a entre 15 y 25°C, incluyéndose ambos límites, para el fin de una evaporación más rápida de la muestra.

Generalmente y de una manera no limitante, cuando se usa inicialmente una muestra de sangre humana no fraccionada, la muestra de fracción de sangre (preferiblemente una muestra de plasma sanguíneo) adecuada para el análisis espectroscópico de Raman de la presente invención puede prepararse antes de adquirir los datos espectroscópicos según un procedimiento que comprende las siguientes etapas: a. obtener dicha fracción de sangre (preferiblemente la fracción de plasma sanguíneo) de una muestra de sangre periférica humana obtenida previamente por medio de cualquiera de los procedimientos de fraccionamiento de sangre por centrifugación-filtración conocidos usados normalmente; b. extender la muestra de plasma sobre un soporte metálico o cristal de CaF₂ o ZnSe de superficie cuadrada de 0,5 a 2 cm², preferiblemente 1 cm²; c. evaporar completamente hasta sequedad un volumen de la fracción anterior, aproximadamente 10 μΙ, para obtener 1 g de un residuo sólido seco de dicha fracción, en donde la evaporación de dicho volumen de fracción se realiza a temperaturas relativamente bajas, específicamente en el intervalo de temperatura comprendido entre 10 y 25°C, más preferiblemente entre 15 y 25°C, incluyéndose dichos límites.

Métodos para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o Alzheimer.

En otro aspecto la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa mediante espectroscopia Raman (cuarto método de la invención) en una muestra de sangre en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer que comprende: a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) b) obtener un valor espectral Raman de al menos una de las siguientes regiones del espectro Raman:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1 R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por el promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8).

Los términos "método de diagnóstico", "demencia frontotemporal", "sujeto", "método espectroscópico vibracional", "espectro Raman", "valor espectral", "valor de intensidad", "banda alrededor de un valor de frecuencia expresado en cm^"1, intensidad Raman obtenida alrededor de un valor de frecuencia vi expresado en cm^"1, "relación de intensidades entre bandas", "área", "frecuencia" al igual que sus particularidades han sido definidos previamente, y son igualmente aplicables a los métodos de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa que es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) "Enfermedad neurodegenerativa" en el contexto de la presente invención hace referencia a demencia frontotemporal y a Alzheimer. En ciertas ocasiones dichas enfermedades no son fácilmente diferenciables, sin embargo los métodos de la invención si permiten diferenciarlo de manera eficaz. El término "enfermedad de Alzheimer" o "AD" o "Alzheimer", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un deterioro mental asociado con enfermedad cerebral degenerativa específica que se caracteriza por placas seniles, ovillos neurofibrilares y pérdida neuronal progresiva que se manifiesta clínicamente en déficits de memoria progresivos, confusión, problemas de comportamiento, incapacidad para cuidar de uno mismo, deterioro físico gradual y, en última instancia, muerte. Normalmente, los pacientes que padecen AD se identifican usando los criterios de la NINCDS-ADRDA (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and the Alzheimer^" s Disease and Related Disorders Association): Clasificación de demencia clínica (CDR) = 1 ; examen de estado mini mental (MMSE) = 16-24 puntos y atrofia temporal medial (determinada mediante obtención de imágenes por resonancia magnética, MRI) >3 puntos en la escala de Scheltens.

Tal como se usa en el presente documento, el término AD pretende incluir todos los estadios de la enfermedad, incluyendo, sin limitación, los siguientes estadios definidos por los criterios de Alzheimer de la NINCDS-ADRDA para diagnóstico en 1984 (McKhann et al., 1984, Neurology 34:939-44):

AD definida: El paciente cumple los criterios de AD probable y tiene evidencias histopatológicas de AD por medio de autopsia o biopsia.

AD probable o prodrómica: Se ha establecido la demencia mediante examen clínico y neuropsicológico. Las alteraciones cognitivas también tienen que ser progresivas y estar presentes en dos o más zonas de cognición. La aparición de los déficits ha sido entre las edades de 40 y 90 años y finalmente debe haber una ausencia de otras enfermedades que puedan producir un síndrome de demencia.

AD posible o no prodrómica: Hay un síndrome de demencia con una aparición, presentación o progresión atípica; y sin una etiología conocida; pero no se cree que enfermedades comórbidas que puedan producir demencia estén en el origen de la misma.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Adicionalmente, el National Institute on Aging y la Alzheimer's Association revisaron en 201 1 los criterios de diagnóstico en los criterios de NIA-AA para enfermedad de Alzheimer (El término AD también pretende incluir los estadios definidos por estos criterios. En una realización preferida, el cuarto método de la invención comprende determinar además de al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por el promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8), al menos otro valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por

- VR1 : la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1; - VR2: la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 1671 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1;

- VR4: el área de la banda hacia 1525 cm^"1;

- VR5: la altura de la banda hacia 1525 cm^"1;

- VR6: el área de la banda hacia 1555 cm^"1; - VR7: la altura de la banda hacia 1555 cm^"1;

- VR10: el área del perfil espectral comprendido entre 980 y 910 cm^"1;

- VR13: el valor de la primera derivada de la intensidad a 747 cm^"1;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) VR14: el valor de la primera derivada de la intensidad a 757 cm^'1;

VR16: el valor de la primera derivada de la intensidad a 761 cm^"1;

VR17: el valor de la primera derivada de la intensidad a 762 cm^"1;

VR18: la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 a la intensidad a 744 cm^"1;

VR19: la relación de la altura de la banda hacia 644 cm^"1 a la altura de la banda hacia 622 cm^"1;

VR20: la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1;

VR21 : el valor de la primera derivada de la intensidad a 412 cm

VR22: el valor de la primera derivada de la intensidad a 413 cm

VR23: el valor de la primera derivada de la intensidad a 414 cm

VR24: el valor de la primera derivada de la intensidad a 415 cm

VR26: el valor de la primera derivada de la intensidad a 417 cm

VR27: el valor de la primera derivada de la intensidad a 430 cm

VR28: el valor de la primera derivada de la intensidad a 496 cm^"1; y VR29: la relación de la intensidad a 409 cm-1 a la intensidad a 423

En otra realización particular el cuarto método de la invención comprende determinar adicionalmente al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23 o al menos 24 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1-VR2, VR4-VR7, VR9-VR14, VR16-24, VR 26-29 tal y como se han definido anteriormente. La invención contempla cualquier

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) combinación de VR3, VR12, VR15, VR25 y VR8 junto con VR1 -VR2, VR4-VR7, VR9- VR14, VR16-24, VR 26-29.

En una realización más preferida, el método comprende determinar adicionalmente un valor espectral de la región del espectro Raman seleccionado del grupo formado por la frecuencia de la banda Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ) y la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 y la intensidad a 744 cm^"1 (VR18).

En otra realización más particular, el cuarto método de la invención comprende determinar los valores Raman correspondientes al promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8), la frecuencia de la banda Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ) y la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 y la intensidad a 744 cm^"1 (VR18).

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja (quinto método de la invención) en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida; b) obtener un valor espectral infrarrojo de al menos una de las siguientes regiones del espectro infrarrojo: IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1 en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre absorbancia, intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación de la absorbancia a 1156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1(VIR2) y la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1171 cm^"1(VIR3).

En una realización particular, el quinto método de la invención comprende determinar adicionalmente al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en:

-VIR4: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de la intensidad hacia 1 171 cm^"1;

-VIR5: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 156 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de la intensidad hacia 1 171 cm^"1; -VIR6: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1;

-VIR7: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1 160 cm^"1 y 1 162 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1;

-VI R8: relación del área entre 1165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada; y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) -VI 9: relación del área entre 1166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1;

En otra realización particular, el quinto método de la invención comprende determinar al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 y al menos 7 valores espectrales infrarrojos seleccionados del grupo que consiste en VIR1 , VIR4-VIR9 tal y como se ha definido anteriormente. La invención comprende cualquier combinación de VIR2, VR3 con VIR1 , WIR4-VR9.

En una realización más particular, el quinto método de la invención comprende determinar adicionalmente el valor espectral de la región del espectro infrarrojo correspondiente al porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ).

En otra realización más particular, el quinto método de la invención comprende determinar los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la absorbancia a 1156 cm-1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1(VIR2) y el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer (sexto método de diagnóstico) que comprende las etapas según el cuarto método de la invención y adicionalmente las etapas del quinto método de la invención aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En una realización particular, el sexto método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por el promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación de la absorbancia a 1 156 cm^" ¹ a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1(VIR2) y la relación de la primera

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) derivada de la intensidad a 1152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1171 cm^"1(VIR3). En otra realización más particular el sexto método de la invención comprende determinar al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 valores espectrales seleccionados del grupo formado por VR3,VR12,VR15,VR25 y VR8 y al menos 1 o los 2 valores espectrales seleccionados del grupo formado por VIR2 y VIR3. La invención comprende cualquier combinación VR3,VR12,VR15,VR25 y VR8 junto con VIR2, VIR3.

En otra realización particular, el sexto método de la invención comprende determinar adicionalmente al menos 1 , al menos 2 , al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 valores espectrales seleccionados del grupo formado por VR1-VR2, VR4- VR7, VR9-VR11 , VR13-VR14, VR16-VR24, VR26-VR29 y adicionalente al menos 1 , al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 valores espectrales infrarrojos seleccionados del grupo formado por VIR1 , VIR4-VIR9 tal y como se ha definido anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de

VR3, VR12, VR15, VR25 y VR8 junto con VR1-VR2, VR4-VR7, VR9-VR1 1 , VR13- VR14, VR16-VR24, VR26-VR29 y adicionalmente con VIR2-VIR3 junto con VIR1 , VIR4-VIR9.

En una realización particular, el sexto método de la invención comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm-1 (VR15); la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y los valores espectrales Infrarrojos correspondientes a la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2); la relación de la primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR3); y porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^" ¹ respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ).

A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR15 y/o VIR3 disminuido es indicativo de que el sujeto padece una enfermedad neurodegenerativa en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) de Alzheimer. A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR8, VIR1 y/o VIR2 incrementado es indicativo de que dicho sujeto padece una enfermedad neurodegenerativa en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer. Los términos "espectroscopia infrarroja", "valor espectral infrarrojo", "valor de absorbancia", "valor de intensidad", "valor de área de dicha región espectral", "valor de porcentaje de área entre bandas" y sus particularidades han sido descritos previamente y son igualmente aplicables a estos métodos de la invención.

En una realización particular del cuarto, quinto y sexto método de diagnóstico, el valor de referencia Raman y/o Infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

En una realización preferida del cuarto, quinto y sexto método de la invención, la etapa c) se realiza por comparación mediante análisis multivariante, y más preferiblemente se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales.

Método de diagnóstico diferencial En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia Raman (séptimo método de la invención) en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa de entre demencia frontotemporal o Alzheimer que comprende

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con valores espectrales Raman de referencia correspondiente.

El término "diagnóstico diferencial", tal y como se usa en la presente invención se refiere al procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier estado de salud o enfermedad mediante la exclusión de otras posibles causas que presenten un cuadro clínico semejante al que el paciente padece.

Los términos "demencia frontotemporal", "alzheimer", "sujeto", "muestra de sangre" "método espectroscópico vibracional", "espectro Raman", "valor espectral", "valor de intensidad", "banda alrededor de un valor de frecuencia expresado en cm-1 , intensidad de Raman obtenida alrededor de un valor de frecuencia vi expresado en cm -1 , "Relación de intensidades entre bandas", "área", "frecuencia" y sus particularidades han sido definidos previamente, y son igualmente aplicables a los métodos de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa que es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer.

En una realización particular, el séptimo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo que consiste en

-VR1 : la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1;

1.

- VR4: el área de la banda hacia 1525 cm^"1;

- VR7: la altura de la banda hacia 1555 cm^"1;

- VR10: el área del perfil espectral comprendido entre 980 y 910 cm^"1;

1.

- VR14: el valor de la primera derivada de la intensidad a 757 cm^"1;

- VR15: el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1;

- VR16: el valor de la primera derivada de la intensidad a 761 cm^"1;

- VR17: el valor de la primera derivada de la intensidad a 762 cm^"1; - VR18: la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 a la intensidad a 744 cm^"1;

- VR19: la relación de la altura de la banda hacia 644 cm^"1 a la altura de la banda hacia 622 cm-1 ;

- VR21 : el valor de la primera derivada de la intensidad a 412 cm

- VR24: el valor de la primera derivada de la intensidad a 415 cm

- VR25: el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm

- VR26: el valor de la primera derivada de la intensidad a 417 cm

- VR27: el valor de la primera derivada de la intensidad a 430 cm - VR28: el valor de la primera derivada de la intensidad a 496 cm^"1; y

- VR29: la relación de la intensidad a 409 cm^"1 a la intensidad a 423 cm^"1.

En otra realización, el séptimo método de la invención comprende determinar al menos dos valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente. En otra realización, el séptimo método de la invención comprende determinar al menos 3, preferiblemente al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28 o 29 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VR1 a VR29.

En una realización más particular el séptimo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por la relación de intensidades obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ), el valor

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15) y la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1 (VR20).

En otra realización particular, el séptimo método de la invención comprende determinar el valor espectral Raman correspondiente a la relación de intensidades obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ).

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja (octavo método de la invención) en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de absorbancia, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer, por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia que permita la distinción entre demencia frontotemporal y Alzheimer, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con valores espectrales de referencia infrarrojos de demencia frontotemporal y Alzheimer

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización particular el octavo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en:

- VIR1 : porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^'1 respecto al área entre 1672 cm^'1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada. - VIR2: la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1;

-VIR3: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1171 cm^"1;

-VIR6: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1158 cm^"1 y 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1;

-VIR7: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1160 cm^"1 y 1 162 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm-1 ;

En una realización particular, el octavo método de la invención comprende determinar al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o 9 valores espectrales infrarrojos seleccionados del grupo que consiste en VIR1 a VIR9 tal y como se han definido anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VIR1 a VIR9.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización más particular el octavo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación del área entre 1 165 cm^'1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^'1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación del área entre 1 166 cm^" ¹ y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9) y la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de intensidad hacia 1 171 cm^"1 (VIR4).

En otra realización más particular, el octavo método de la invención comprende determinar los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8) y la relación del área entre 1 166 cm^"1 y 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9).

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer (noveno método de la invención) comprende las etapas del séptimo método de la invención y adicionalmente las etapas del octavo método de la invención aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

En una realización particular, el noveno método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente y al menos un valor espectral seleccionado del grupo que consiste en VIR1 a VIR9.

En otra realización, el noveno método de la invención comprende determinar preferiblemente al menos dos , al menos tres, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28 o 29 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1 a VR29 tal y como se definen anteriormente y al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VIR1 a VIR9 tal y como

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) se definen anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VR1 a VR29 junto con VIR1 a VIR9.

En una realización más particular, el noveno método comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes a la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1 (VR20); y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la primera derivada a la intensidad 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8) y la relación del área entre 166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9). A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, un valor espectral VR20 y/o VIR8 disminuido es indicativo de que el sujeto padece demencia frontotemporal. A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR1 , VR15, VIR4 y/o VIR9 aumentado es indicativo de que el sujeto padece demencia frontotemporal. En una realización particular de los métodos de diagnóstico diferencial séptimo, octavo y noveno, el paciente ha sido diagnosticado previamente de una enfermedad neurodegenerativa mediante un método de diagnóstico según el cuarto, quinto o sexto método de la invención. Alternativamente los métodos de diagnóstico diferencial séptimo, octavo y noveno se aplican a una muestra de un sujeto que tiene síntomas de demencia frontotemporal y/o Alzheimer tales como pérdida memoria.

En una realización particular del séptimo, octavo y noveno método de la invención el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido de un sujeto que ha sido previamente diagnosticado de demencia frontotemporal o en un sujeto que ha sido previamente diagnosticado de Alzheimer.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización preferida del séptimo, octavo y noveno método de la invención, la etapa c) se realiza por comparación mediante análisis multivariante, y más preferiblemente se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales.

Métodos para el diagnóstico de Alzheimer

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia Raman (décimo método de la invención) en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida; b) obtener un valor espectral Raman de al menos una de las siguientes regiones del espectro Raman:

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1 R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre, un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) intensidad 416 cm^"1(VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) .

Los términos "método de diagnóstico", "alzheimer", "sujeto", "método espectroscópico vibracional", "espectro Raman", "valor espectral", "valor de intensidad", "banda alrededor de un valor de frecuencia expresado en cm-1 , intensidad de Raman obtenida alrededor de un valor de frecuencia vi expresado en cm^"1 , "relación de intensidades entre bandas", "área", "frecuencia" y sus particularidades han sido definidos previamente, y son igualmente aplicables a los métodos de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer. En una realización preferida, el décimo método de la invención comprende determinar además de al menos un valor seleccionado del grupo formado por por promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^"1(VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8), determinar adicionalmente al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por

- VR1 : la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 ;

- VR2: la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 1671 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 ;

- VR4: el área de la banda hacia 1525 cm^"1 ;

- VR5: la altura de la banda hacia 1525 cm^"1 ; - VR6: el área de la banda hacia 1555 cm^"1 ;

- VR9: la relación de la altura de la banda hacia 1525 cm^"1 a la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 ;

- VR10: el área del perfil espectral comprendido entre 980 y 910 cm^"1;

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) VR1 1 : la frecuencia de la banda comprendida en la región entre 740 y 750 cm

VR13: el valor de la primera derivada de la intensidad a 747 cm ;

VR14: el valor de la primera derivada de la intensidad a 757 cm^"1;

VR16: el valor de la primera derivada de la intensidad a 761 cm^"1;

VR17: el valor de la primera derivada de la intensidad a 762 cm^"1;

VR19: la relación de la intensidad de la banda hacia 644 cm a la intensidad de la banda hacia 622 cm^"1;

VR20: la relación de la intensidad a 494 cm^" a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1;

VR21 : el valor de la primera derivada de la intensidad a 412 cm

VR22: el valor de la primera derivada de la intensidad a 413 cm - VR23: el valor de la primera derivada de la intensidad a 414 cm

- VR24: el valor de la primera derivada de la intensidad a 415 cm

VR26: el valor de la primera derivada de la intensidad a 417 cm

VR27: el valor de la primera derivada de la intensidad a 430 cm

VR28: el valor de la primera derivada de la intensidad a 496 cm ; y VR29: la relación de la intensidad a 409 cm-1 a la intensidad a 423

En otra realización particular el décimo método de la invención comprende determinar adicionalmente al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 1 1 , al menos 12, al menos 13, al

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21 , al menos 22 o al menos 23 valores espectrales seleccionados del grupo que consiste en VR1-VR2, VR4-VR6, VR9-VR11 , VR13-14, VR 16-24, VR26-VR29 tal y como se han definido anteriormente. La invención contempla cualquier combinación de VR3, VR12, VR15, VR25, VR7 y VR8 junto con VR1-VR2, VR4-VR6, VR9-VR11 , VR13-14, VR 16-24, VR26-VR29.

En una realización particular, el décimo método de la invención comprende obtener los valores espectrales Raman correspondientes al promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^" ¹(VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8). En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer (undécimo método de la invención) mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia, un valor de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar Alzheimer

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia infrarrojo correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1145 cm^'1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1 158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR6).

En una realización particular, el undécimo método de la invención, además de la determinación de al menos 1 , al menos 2 o los 3 valores espectrales infrarrojo seleccionados del grupo formado por relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1 158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR6), comprende determinar adicionalmente al menos un valor seleccionado del grupo formado por

- VI R1 : porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada.

- VIR2: la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1; - VIR3: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1171 cm^"1;

- VIR5: la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 156 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de la intensidad hacia 1171 cm^"1;

- VIR7: promedio de la primera derivada de la intensidad hacia 1 160 cm^"1 y 1 162 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada de la intensidad en el mínimo hacia 1 171 cm^"1; y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) - VI R9: relación del área entre 1 166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1;

En otra realización particular, el undécimo método de la invención además de la determinación de al menos 1 , al menos 2 o los 3 valores espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm-1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1 158 cm-1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm-1 (VIR6) comprende determinar al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 valores espectral infrarrojos seleccionados del grupo formado por VIR1-VIR3, VIR5, VIR7 y VIR9. Cualquier combinación de VIR8, VIR4, VIR6 y VIR1 -VIR3, VIR5, VIR7 y VIR9 están contemplados en la presente invención. En una realización particular, el undécimo método de la invención comprende los valores espectral infrarrojo correspondientes a la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VI R8) y el porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ). En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer (duodécimo método de la invención) que comprende la etapas del décimo método de la invención y adicionalmente las etapas de undécimo método de la invención aplicado sobre una muestra del mismo sujeto. En una realización particular el duodécimo método de la invención comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo que consiste en (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^"1(VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por relación del área entre 1165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1171 cm^"1 (VIR6).

Alternativamente el duodécimo método de la invención comprende determinar adicionalmente al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por VR1 - VR2, VR4-VR6, VR9-VR1 1 , VR13-14, VR 16-24, VR26-VR29 y adicionalmente al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por VIR1 -VIR3, VIR5, VIR7 y VIR9.

En una realización más particular el duodécimo método de la invención, comprende obtener los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm-1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la primera derivada a la intensidad 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1 171 cm^"1 (VIR4) promedio de la primera derivada hacia la intensidad 1 158 cm^"1 y la intensidad 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1 171 cm^"1 (VIR6) y porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ).

A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR15 y/o VIR4 disminuido es indicativo de que el sujeto padece Alzheimer. A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, un valor espectral VR8, VIR1 y/o VIR6 aumentado es indicativo de que el sujeto padece Alzheimer.

En una realización particular del décimo, undécimo y duodécimo método de la invención, donde el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

En una realización preferida del décimo, undécimo y duodécimo método de la invención, la etapa c) se realiza por comparación mediante análisis multivariante, y más preferiblemente se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales. Aparato para el análisis de muestras de plasma

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En otro aspecto, la invención se refiere a un aparato para el análisis de plasma que comprende:

(i) un receptáculo para recibir una muestra de plasma,

(ii) al menos un espectrómetro seleccionado de un espectrómetro Raman o un espectrómetro IR

(iii) un sistema informático que comprende medios para la implementación un método de diagnóstico de la invención según la invención.

Los dispositivos que forman el espectrómetro Raman son conocidos en el estado de la técnica, básicamente un láser y un CCD (dispositivos de carga acoplada) fotomultiplicador. El equipo puede estar formado por dos fuentes de luz monocromática intercambiables (por ejemplo láser He-Ne, láser de Ar y diodo láser) conectadas a una fibra óptica de excitación que guía la luz hasta el cabezal óptico y éste la focaliza sobre la muestras. La luz dispersada por la muestra se recoge a través del mismo cabezal óptico y mediante la fibra óptica de colección es guiada hasta el monocromador que la separa espacial y espectralmente. El CCD detecta la señal difractada por el monocromador y transforma los fotones de la luz dispersada en señal eléctrica digital y el espectro es remitido a un ordenador.

El fin del sistema informático del aparato de la invención es, entre otros, controlar la adquisición de la señal de Raman dispersada y su análisis posterior, incluyendo el procesamiento matemático. El sistema informático también realiza el control de los parámetros del CCD, el sistema de enfoque del haz de láser y su potencia, entre otros. El sistema informático puede permitir adicionalmente un determinado grado de manipulación de los espectros, tal como por ejemplo corrección de la línea base, comparación entre varios espectros, cálculos de áreas y transformadas de Fourier, comparación del valor espectral de la muestra que va a analizarse con el valor espectral de referencia o comparación por análisis multivariante con valores que permiten diferenciar entre una muestra de sangre asociada con enfermedad de Alzheimer o demencia frontotemporal y una muestra de sangre asociada con enfermedad de Alzheimer, entre otras.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En una realización particular el aparato de la invención comprende un espectrómetro Raman y un espectrómetro IR. El espectrómetro IR puede ser de tipo dispersivo o de transformación de Fourier. En una realización preferida, cuando el aparato de la invención comprende un espectrómetro IR, dicho espectrómetro IR es un espectrómetro de transformada de Fourier.

En otra realización particular, el aparato de la invención comprende adicionalmente un microscopio. En otra realización preferida, el aparato de la invención comprende adicionalmente un videomicroscopio que tiene un divisor de haz que permite dirigir la luz tanto a una cámara web como a un cabezal de Raman. Con el fin de enfocar el láser y colimar la luz de Raman, se puede usar un objetivo de un microscopio.

Los términos descritos en detalle en el contexto de los métodos de diagnóstico de la invención y sus definiciones y particularidades se aplican igualmente a este aspecto de la invención.

Programa informático y soporte de datos En otro aspecto, la invención se relaciona con un programa de ordenador que comprende un código adecuado para la realización de cualquiera de los métodos diagnósticos de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte de ordenador que contiene el programa de ordenador de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema informático dotado de medios para implementar el método de diagnóstico según la invención. El sistema informático puede incluir:

(a) al menos una memoria que contiene al menos un programa informático adecuado para controlar el funcionamiento del sistema informático para implementar un método que incluye: (i) recibir datos de espectros de Raman y/o infrarrojo sobre la muestra del paciente y (ii) asignar el paciente como un sujeto sano o como un paciente con enfermedad de Alzheimer o como un paciente con demencia frontotemporal basándose en el grado de identidad entre el espectro obtenido de la muestra del sujeto y el espectro del sujeto de referencia y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) (b) al menos un procesador para ejecutar el programa informático.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un programa informático para controlar un sistema informático para realizar las etapas según cualquiera de los métodos de la invención. El sistema informático puede incluir uno o más procesadores generales o procesadores que tienen fines particulares y memoria asociada, incluyendo dispositivos de memoria volátil y no volátil.

Los medios de almacenamiento físico legibles por máquina útiles en varias realizaciones de la invención pueden incluir cualquier medio de almacenamiento físico legible por máquina, por ejemplo memoria de estado sólido (tal como memoria flash), dispositivos y medios de almacenamiento magnético y óptico legibles por máquina, y memoria que usa otras tecnologías de almacenamiento persistente. En algunas realizaciones, un medio legible por máquina puede ser cualquier medio tangible que permita al ordenador acceder a programas informáticos y datos. Los medios legibles por máquina pueden incluir medios volátiles y no volátiles tangibles borrables o no borrables implementados en cualquier método o tecnología que pueda almacenar información, tal como instrucciones legibles por máquina, módulos de programa, programas, datos, estructuras de datos e información de bases de datos. En algunas realizaciones de la invención, el medio legible por máquina incluye pero no se limita a RAM (memoria de acceso aleatorio), ROM (memoria de sólo lectura), EPROM (memoria de sólo lectura programable borrable), EEPROM (memoria de sólo lectura programable borrable eléctricamente), memoria flash u otra tecnología de memoria, CD-ROM (memoria de sólo lectura de disco compacto), DVD (discos versátiles digitales) u otro medio de almacenamiento óptico, casetes magnéticos, cinta magnética, almacenamiento en disco magnético u otro medio de almacenamiento magnético, otros tipos de memoria volátil y no volátil, y cualquier otro medio tangible que pueda usarse para almacenar información y pueda leerse por máquina, incluyendo cualquier combinación adecuada de los anteriores.

La presente invención puede implementarse en un ordenador autónomo o como parte de un sistema informático en red.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En algunas realizaciones de la presente invención, los espectros de Raman y/o Infrarrojos usados como referencia pueden usarse para grabar, registrar y recuperar electrónica o digitalmente.

En algunas realizaciones de este aspecto y todos los otros aspectos de la presente invención, el sistema puede comparar los datos en un "módulo de comparación" que puede usar una variedad de programas y formatos de software disponibles para comparación operativa para comparar espectros determinados en el módulo de determinación con datos de referencia. En otra realización, el módulo de comparación está configurado para usar técnicas de reconocimiento de patrones para comparar la información de secuencias de una o más entradas con uno o más patrones de datos de referencia. El módulo de comparación puede estar configurado para usar software desechable o disponible comercialmente existente para comparar patrones y puede optimizarse para comparaciones de datos particulares que se realizan.

En algunas realizaciones, el módulo de comparación proporciona un resultado de comparación legible por máquina que puede procesarse en la forma legible por máquina por medio de criterios predefinidos, o criterios definidos por el usuario, para proporcionar un informe que comprende contenido basado en parte en el resultado de comparación que puede almacenarse y al que puede acceder según se requiera un usuario usando un módulo de presentación visual. En algunas realizaciones, un módulo de presentación visual permite presentar visualmente el contenido basado en parte en el resultado de comparación para el usuario, en el que el contenido es un informe indicativo de los resultados de la comparación del espectro obtenido a partir de la muestra del paciente de interés con el espectro de un sujeto sano.

En algunas realizaciones, el módulo de presentación visual permite presentar visualmente un informe o contenido basado en parte en el resultado de comparación para el usuario final, en el que el contenido es un informe indicativo de los resultados de la comparación del espectro del paciente con el espectro de referencia. En algunas realizaciones de este aspecto y todos los otros aspectos de la invención, el módulo de comparación, o cualquier otro módulo de la invención, puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX, Windows) en el que se ejecutan un sistema de gestión de bases de datos relaciónales, una aplicación de Internet y una aplicación de servidor de Internet. La aplicación de Internet puede incluir el código ejecutable necesario para

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) generar instrucciones de lenguaje de la base de datos [por ejemplo, instrucciones de lenguaje de consulta convencional (SQL)].

Las instrucciones informáticas pueden implementarse en software, firmware o hardware e incluir cualquier tipo de etapa programada emprendida por módulos del sistema de procesamiento de información. El sistema informático puede estar conectado a una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN).

En algunas realizaciones de este aspecto y todos los otros aspectos de la presente invención, un módulo de comparación proporciona datos legibles por máquina que pueden procesarse de una manera legible por máquina por medio de criterios predefinidos, o criterios definidos por el usuario, para proporcionar contenido recuperado que puede almacenarse y al que puede accederse según se requiera usando un módulo de presentación visual.

Según algunas realizaciones de la invención, el sistema informatizado puede incluir o puede estar conectado operativamente a un módulo de presentación visual, tal como un monitor de ordenador, una pantalla táctil o un sistema de presentación visual en vídeo. El módulo de presentación visual permite presentar al usuario instrucciones al usuario del sistema, permitiendo que el usuario observe las entradas del sistema y permitiendo que el sistema muestre los resultados al usuario como parte de una interfaz de usuario. El sistema informatizado puede incluir opcionalmente o puede estar conectado operativamente a un dispositivo de impresión para realizar copias impresas de la información proporcionada por el sistema.

En algunas realizaciones de la presente invención, puede usarse un navegador de Internet para proporcionar una interfaz de usuario para permitir que el usuario interaccione con el sistema para introducir información, para realizar peticiones y para mostrar el contenido recuperado. Además, los diversos módulos funcionales del sistema pueden estar adaptados para usar un navegador web para proporcionar una interfaz de usuario. Usando un navegador web, un usuario puede realizar peticiones para recuperar datos de fuentes de datos, tales como bases de datos, e interaccionar con el módulo de comparación para realizar comparaciones y buscar coincidencias de patrones. El usuario puede indicar y hacer click sobre elementos de la interfaz de usuario tales como botones, menús desplegables, líneas de desplazamiento, etc., usados convencionalmente en interfaces gráficas de usuario para interaccionar con el

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) sistema y hacer que el sistema lleve a cabo los métodos de la invención. Las peticiones realizadas con el navegador web de usuario pueden transmitirse en una red a una aplicación web que puede procesar o dar formato a la petición para realizar una consulta en una o más bases de datos que pueden usarse para proporcionar la información relevante referente a los espectros generados, el contenido recuperado, procesar esta información y generar los resultados.

Los términos descritos en detalle en el contexto de los métodos de diagnóstico de la invención y sus definiciones y particularidades se aplican igualmente a este aspecto de la invención. Terapia personalizada

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto adecuado para el tratamiento de demencia frontotemporal para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado una demencia frontotemporal mediante un método cualquiera según la invención. Alternativamente, la invención se relaciona un compuesto adecuado para el tratamiento de demencia frontotemporal para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado demencia frontotemporal mediante un método cualquiera según la invención

Alternativamente, la invención se refiere a un método de tratamiento de demencia frontotemporal en un sujeto que comprende administrar un compuesto adecuado para tratar demencia frontotemporal al sujeto que lo necesita, en el que dicho sujeto ha sido diagnosticado de demencia frontotemporal según un método de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto adecuado para el tratamiento de Alzheimer para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado Alzheimer mediante un método cualquiera según la invención.

Alternativamente, la invención se relaciona con un compuesto adecuado para el tratamiento de Alzheimer para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado Alzheimer mediante un método cualquiera según la invención.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Alternativamente, la invención se relaciona con un método de tratamiento de Alzheimer en un sujeto que comprende administrar un compuesto adecuado para tratar Alzheimer al sujeto que lo necesita, en el que dicho sujeto ha sido diagnosticado de Alzheimer según un método de la invención. Los términos "demencia frontotemporal" y "Alzheimer" han sido definidos con anterioridad y son igualmente aplicables a estos aspectos de la invención.

"Compuesto adecuado para tratar demencia frontotemporal" se refiere a cualquier fármaco o compuesto que permita tratar demencia frontotemporal, es decir reducir, mejorar, ralentizar el progreso o eliminar los síntomas de la demencia frontotemporal. En una realización particular el compuesto adecuado para tratar demencia frontotemporal es un compuesto adecuado para tratar Alzheimer. En otra realización más particular el compuesto adecuado para tratar demencia frontotemporal es un compuesto adecuado para tratar Alzheimer no es un inhibitdor de colinesterasa tales como as donepezil (Aricept®), rivastigmine (Exelon®) and galantamine (Razadyne®) que son inhibidores de acetilcolina esterasa, ni benzodiacepinas tales como estazolam (ProSom®), diazepam (Valium®), flurazepam (Dalmane®), midazolam (Dormicum®, Versed®), temazepam (Restoril®, Normison®), triazolam (Halcion®), alprazolam (Xanax®), chlordiazepoxide (Librium®), clonazepam (Rivotril®, Klonopin®), clorazepate (Tranxene®), lorazepam (Ativan®, Temesta®, Tavor®), oxazepam (Serax®, Serepax®), prazepam (Centrax®, Lysanxia®)

Ejemplos ilustrativos no limitativos de compuestos que pueden emplearse para el tratamiento de demencia frontotemporal, son por ejemplo inhibidores de la recaptación de serotonina (SSRI) tales como fluoxetine (Prozac®), sertraline (Zoloft®), paroxetine (Paxil®), fluvoxamine (Luvox®), citalopram (Celexa®), escitalopram (Lexapro®). otros antidepresivos que no son SSRI también podrían ser usados tales como trazodone (Desyrel®), venlafaxine (Effexor®), duloxetine (Cymbalta®), bupropion (Wellbutrin®) o mirtazapine (Remeron®). En otra realización es posible usar antisicóticos que bloquean el efecto de dopamina, tales como olanzapine (Zyprexa®), quetiapine (Seroquel® or Ketipinor®), risperidone (Risperdal®), ziprasidone (Geodon®), aripiprazole (Abilify®), paliperidone (INVEGA®).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) "Compuesto adecuado para tratar Alzheimer" comprende cualquier fármaco que permita tratar Alzheimer, es decir, un tratamiento para reducir, mejorar, ralentizar el progreso o eliminar síntomas de la enfermedad de Alzheimer.

En una realización preferida, la terapia adecuada para tratar enfermedad de Alzheimer se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de colinesterasa, un antagonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), ¡nmunoterapia anti-p-amiloide, un inhibidor de gamma-secretasa y una terapia anti-tau.

"Inhibidor de colinesterasa" se refiere a un compuesto químico que inhibe la colinesterasa o anticolinesterasa, que impide la destrucción de la acetilcolina liberada, provocando de ese modo un aumento en la concentración y en la duración de los efectos del neurotransmisor. Los dos tipos de colinesterasa son acetilcolinesterasa (ACHE) y butirilcolinesterasa (BCHE). La secuencia de colinesterasa completa en seres humanos tiene el número de registro P06276 en la base de datos Uniprot (20 de enero de 2016). En una realización preferida, el compuesto usado según la invención es un inhibidor de acetilcolinesterasa.

Hay evidencias a partir de estudios preclínicos y algunos estudios en seres humanos de que la inhibición de colinesterasa afecta a procesos básicos que se han implicado en la patogénesis de AD. Por ejemplo, la inhibición de acetilcolinesterasa (AChE) puede afectar a la expresión de isoformas de AChE y aumentar la expresión de receptores de nicotina, estando ambos correlacionados con mejoras cognitivas en pacientes con AD. También se ha mostrado que la inhibición de AChE afecta al procesamiento de la proteína precursor de amiloide (APP) y atenúa la toxicidad inducida por Αβ por medio de mecanismos que incluyen la interrupción de la producción de Αβ, la alteración de los niveles de Αβ 1 -40 y Αβ 1 -42 y la formación de la forma soluble de la proteína precursora de amiloide. Por tanto, a modo de ilustración no limitativa, las terapias adecuadas para tratar AD de leve a moderada comprenden inhibidores de colinesterasa tales como Cognex® (tacrina), Aricept (donepezilo), Exelon® (rivastigmina) o Razadine® (galantamina), entre otros. La AD de moderada a grave puede tratarse con Namenda® (memantina), que actúa como antagonistas de receptores de NMDA. Puesto que los antagonistas de NMDA funcionan de manera diferente de los inhibidores de colinesterasa, ambos tipos de medicamentos pueden

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) recetarse en combinación. Estos medicamentos pueden ayudar a retrasar o prevenir que los síntomas de AD empeoren. Las terapias según la presente invención incluyen adicionalmente terapia con música, terapia física, educación psicomotora, terapia ocupacional o terapia con animales, entre otras. Se comercializan actualmente en todo el mundo tres inhibidores de colinesterasa para tratar la enfermedad de Alzheimer, específicamente donepezilo, galantamina y rivastigmina. Donepezilo (1-bencil-4-[(5,6-dimetoxi-1 -indanon)-2-il]-metil-piperidina) es un inhibidor de acetilcolinesterasa (AChE) reversible. Galantamina ([4aS- (4a□ ,6□ ,8aR^*)]-4a,5,9, 10,1 1 ,12-hexahidro-3-metoxi-1 1 -metil-6H-benzofuro[3a,3,2- ef]benzacepin-6-ol) es un alcaloide aislado de campanilla de invierno, Galanthus nivalis. Es un inhibidor de acetilcolinesterasa altamente selectivo, reversible y competitivo. Rivastigmina ((S)-N-etil-3-[1-(dimetilamino)etil]-N-metil-fenil-carbamato) es un inhibidor de acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa reversible, no competitivo.

También se han realizado ensayos clínicos y/o preclínicos para otros inhibidores de colinesterasa, específicamente para clorhidrato de tacrina (CI-970, THA.HCI), huperzlna A, acotiamida, dimebollna, DEBIO 9902, IN 101 , tartrato de fenserina, R- fenserina, clorhidrato de estacofilina (S-9977, S-9977-2), NP-61 , bisnorcimserina, COL-204, SPH 1371 , SPH 1373, SPH 1375, SP 04, CM 2433, metrifonato, 7- metoxitacrina (7 MEOTA), P 1 1149, arisugacina, FR 152558, HUP 13, isovanihuperzina A (IVHA), MHP 133, NP 7557, P 10358, P 1 1012, salicilato de fisostigmina, maleato de velnacrina (HP-029, P83-6029A), tartrato de epastigmina (L- 693487), ipidacrina, zanapezilo, ganstigmina, maleato de icopezilo (CP-1 18954, CP- 118954-1 1 ), KW 5092, quilostigmina (HP-290, NXX-066), SM 10888, T 82, TAK 802, zifrosilona MDL-73745), BGC 201259, CHF 2060, Cl 1002, E 2030, ER 127528, ET 142, F 3796, huprina X, MF 247, bitartrato de MF 268, MF 8615, P 26, PD 142012, RO 465934, SS 20, tiatolserina, tartrato de tolserina, UR 1827, (ADIS R&D Insight, 25/02/2010) y los anteriores podrían usarse para tratar AD según la invención.

Se han descrito compuestos adicionales para inhibir colinesterasas, por ejemplo edrofonio, demecario, ambenonio, bromuro de neostigmina, cloruro de deshidroevodiamina, eserolina, imperatorina, escopoletina (SCT), huperizina A (Hup A), tartrato de heptilstigmina (MF-201 ), maleato de suronacrina (HP-128), UCB-1 1056, yoduro de berberina, norpiridostigmina, quilostigmina (HP-290, NXX-066), THB-013,

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) PD-142676, tartrato de terestigmina (CHF-2060), tiacimserina, MF-8615, bitartrato de MF-268, clorhidrato de anseculina (KA-672.HCI), clorhidrato de ensaculia, maleato de icopezilo (CP-1 18954), salicilato de eserina, salicilato de fisostigmina, JWS-USC-75IX, P1 1467, P-10358, bis(7)-tacrina, HMR-2420, CP-126998, TV-3279, MSF, THA-C8, ácido subergórgico, suberogorgina, SPH-1286, huperzina B (Hup B), bromuro de piridostigmina (Ro-1 -5130), huprina Y, coronaridina, RS-1233, kobofenol A, bis(12)- huperina, RS-1259, ITH-4012, TK-19, T-81 , TH-171 , TH-185, bromuro de distigmina (BC-51 ), bromuro de (-)-9-deshidrogalantaminio, memoquina, 7-O-beta-D- glucopiranósido de escopoletina (NSC-404560), escopolina (SCN), escopolósido, BW- 284c51 , witaferina A (NSC-101088), witaferina (NSC-273757), (+)-corinolina, corinolina, (S)-(-)-oxipeucedanina, oxipeucedanina, (-)-voacangina, carbometoxiibogaína, voacangina, dieckol, florofucofuroeckol (PFF), florofucofuroeckol A, clorhidrato de (-)-3-0-acetilespectalina y rafiasaponina 1 , o sales, bases libres, racematos o enantiómeros de los mismos, y podrían usarse para tratar AD según la invención.

Tal como se usa en la presente invención, "antagonista de receptor de NMDA" se refiere a un compuesto químico que inhibe la reacción generada por la descarga polisináptica de fibras aferentes primarias nociceptivas. Memantina (3,5- dimetiltriciclo[3.3.1 .13,7]decan-1 -amina o 3,5-dimetiladamantano-1 -amina) destaca entre los antagonistas.

Otros antagonistas de NMDA son nimodipina (3-(2-metoxietil)5-propan-2-ilo 2,6- dimetil-4-(3-nitrofenil)-1 ,4-dihidropiridin-3,5-dicarboxilato), dizocilpina, AP-5 (ácido 2- amino-5-fosfonopentanoico), AP-7 (ácido 2-amino-7-fosfonoheptanoico), CHF 3381 (clorhidrato de n-(2-indanil)-glicinamida) e ifenprodilo (4-[2-(4-bencilpiperidin-1 -il)-1 - hidroxipropil]fenol) y podrían usarse para tratar AD según la invención.

Tal como se usa en la presente invención, "inmunoterapia anti β-amiloide", se refiere a una terapia que usa el sistema inmunitario para ralentizar o detener los daños provocados por la acumulación de β-amiloide. Dicha inmunoterapia comprende la administración de anticuerpos anti-beta-amiloide. Los anticuerpos anti-beta-amiloide útiles para el tratamiento según la presente invención incluyen los que destruyen directamente la placa de amiloide (se estimula la microglía mediante inmunización y devora las placas de amiloide ya previamente formadas), los que capturan el amiloide

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) (la formación del complejo antígeno-anticuerpo en sangre periférica secuestra el amiloide fuera del cerebro e impide la deposición) o los que inhiben la agregación (la formación del complejo antígeno-anticuerpo impide que el amiloide se agregue en placas seniles). Alternativamente, la inmunoterapia anti^-amiloide comprende el uso de composiciones inmunogénicas que comprenden uno o varios péptidos de β- amiloide (por ejemplo Αβ(1 -5), Αβ (1-6), Αβ (1 -12), Αβ (13-28), Αβ (25-35), Αβ (35-42), Αβ (33-42) y Αβ (33-40)) (la expresión Αβ (Χ-Υ) se refiere a un péptido derivado del péptido de beta-amiloide que consiste en los aminoácidos en la posición X al aminoácido en la posición Y). Los péptidos de beta-amiloide pueden administrarse o bien en forma de conjugados (por ejemplo, conjugados a KLH o una albúmina) o bien en forma de una composición con un adyuvante (por ejemplo, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, QS21 , gel de hidróxido de aluminio, MF59, fosfato de calcio, liposina, saponina, escualeno, L121 , monofosforil lípido A (MPL) en Emulsigen, polisorbato 80, toxina del cólera (CT), LTK y LTK63). A modo de ejemplo ilustrativo, una vacuna útil en la presente invención sería la vacuna AN-1972, que consiste en A42 que es una copia artificial de la proteína beta-amiloide humana, que cuando se inyecta estimula el sistema inmunitario para limpiar depósitos anómalos del cerebro de roedores enfermos. Esto estimula la formación de anticuerpos que se adhieren a las placas neuríticas para digerirse posteriormente por los elementos celulares del sistema inmunitario (microglía, astrocitos).

Alternativamente, es posible usar inhibidores de gamma secretasa, siendo la gamma secretasa una enzima implicada en la síntesis de β amiloide.

"Inhibidores de gamma secretasa" tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto que inhibe la gamma secretasa que es una enzima implicada en la síntesis de β amiloide. Inhibidores de gamma secretasa útiles en la presente invención son, entre otros, LY-450139 (n.° CAS 425386-60-3), también denominado Semagacestat, DAPT (n.° CAS 208255-80-5), CTS-21166 o MK 8931.

Una "terapia anti-tau" sería análoga a una inmunoterapia anti-amiloide-beta contra placas extracelulares. Tal terapia incluye inhibidores de tau quinasas, la potenciación de la actividad fosfatasa para potenciar la estabilidad de los microtúbulos, alteración o bloqueo de la hiperfosforilación de tau, disminución o inhibición de agregados de tau y formación de filamentos. En una realización preferida, el compuesto es un anticuerpo

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) anti-tau, tal como los dados a conocer en Yanamandra K. et al., Annals of clinical and translational Neurology, volumen 2, tema 3, páginas 278-288, marzo de 2015.

La invención se ilustra a continuación basándose en los siguientes ejemplos proporcionados a modo de ilustración no limitativa del alcance de la invención.

Materiales y métodos

Ejemplo 1. Procedimiento para la obtención de fracción de plasma de sangre periférica.

Para obtener la fracción de plasma a partir de una muestra de sangre obtenida se procede como sigue.

Se toman 4 mL de sangre obtenida de extracciones de sangre venosa de controles sanos y de pacientes con DFT o la EA en un tubo BD Vacutainer con heparina-litio y se centrifugan a 1700g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante corresponde a la fracción de plasma sanguíneo.

Ejemplo 2. Medida de espectros Raman e Infrarrojos de la fracción de plasma sanguíneo.

Las medidas espectrales Raman se realizaron siguiendo los siguientes pasos: a) Preparación de muestras

Con una micropipeta se toman 5 microlitros de plasma que se depositan bien extendidos sobre un cristal de CaF₂ de aproximadamente 2 mm de espesor y 25 mm de diámetro. Después se deja secar la película líquida a temperatura ambiente durante 10 minutos aproximadamente. b) Condiciones de registro espectral

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Los espectros Raman se han medido en la región de 3150-350 cm^"1 mediante un espectrómetro dispersivo de la firma Renishaw, modelo InVia Raman microscope, usando la línea láser de 785 nm de potencia máxima 500 mw y una potencia efectiva en la muestra del 10%. El objetivo microscópico utilizado fue Leica 100X / 0,85 N Plan Epi (corta distancia). Los espectros analizados son el promedio de seis acumulaciones con resolución de 2 cm^"1 y 21 s de tiempo de exposición.

La Figura 1 muestra espectros Raman de plasma de controles sanos y pacientes con DFT y EA leve, moderada. Mostrando la totalidad de la escala espectral, estos espectros no muestran grandes diferencias entre ellos, y por tanto es necesario considerar pequeños intervalos espectrales para observar diferencias significativas. La Figura 2 muestra que la intensidad Raman hacia 1671 cm^"1 aumenta ligeramente al pasar de controles sanos a pacientes con DFT o la EA, debido a la formación de estructura polipeptídica en lámina-β. También se advierte una pequeña disminución de intensidad del máximo hacia 1658 cm^"1 al pasar de controles sanos a sujetos enfermos, debido a una disminución relativa de estructura proteica a-helicoidal.

En la Figura 3 se advierte que la banda situada hacia 744 cm^"1 en el espectro de controles sanos sufre un ligero desplazamiento hacia frecuencias superiores al pasar a los espectros de pacientes con DFT o la EA. Asimismo este cambio espectral va acompañado por un aumento de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1. Estos resultados se pueden interpretar en términos de cambios en la estructura terciaria de proteínas asociada a cadenas laterales de triptófano y de un aumento del contenido en globulinas del plasma.

En la Figura 4 se pone de manifiesto una menor intensidad de la banda hacia 1525 cm^"1, que se asigna a carotenoides, en comparación con los espectros correspondientes a la DFT y EA. Esta disminución de intensidad en los espectros de estas enfermedades degenerativas se puede atribuir al estrés oxidativo presente en estas enfermedades, ya que los radicales libres generados en el estrés oxidativo hacen disminuir la conjugación electrónica de los carotenoides y por tanto la intensidad de la citada banda. Esta figura muestra también un cambio de intensidad de la banda hacia 1555 cm^"1 que se puede deber a una alteración en la concentración de proteínas que contienen triptófano o a un cambio en la estructura terciaria de estas proteínas con residuos aminoacídicos de triptófano.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) La Figura 5 muestra una clara diferencia en la intensidad de la banda de tensión CH hacia 2936 cm^"1 entre el espectro de la DFT y el de la EA, lo que significa que esta banda tiene poder clasificatorio para distinguir pacientes de DFT de los pacientes con la EA, y por tanto es útil para el diagnóstico diferencial de esta invención. Esta variación de la intensidad de tensión CH se puede atribuir también a variaciones en la estructura terciaria proteica. La intensidad que cambia también de manera significativa al pasar de DFT a la EA es a 494 cm^"1 como muestra la Figura 6, y por tante también esta señal contribuye al diagnóstico diferencial entre la DFT y la EA.

Las medidas de los espectros infrarrojos se realizaron siguiendo los siguientes pasos: a) Preparación de muestras

Los espectros infrarrojos se midieron en un espectrómetro de transformada de Fourier Perkin-Elmer, modelo 1725X. Las condiciones de registro fueron las siguientes: intervalo de registro: 4000-400 cm^"1; acumulación de 32 espectros; resolución espectral de 2 cm^"1. La posible contribución de bandas de vapor de agua ambiental se corrigió restando el espectro de vapor de agua con un factor adecuado hasta conseguir ausencia de bandas de vapor en la región entre 2000-1800 cm^"1.

La Figura 7 muestra los espectros medios de plasma de controles sanos y de pacientes con DFT y EA leve, en donde se aprecia que la intensidad del perfil entre 1640 y 1623 cm^"1 del el espectro de controles sanos es inferior a la del espectro de DFT y EA. Finalmente en la Figura 8 se advierte una clara diferencia entre DFT y EA en el perfil espectral comprendido entre 1 166 y 1 145 cm^"1, y por tanto esta región contribuye al diagnóstico diferencial entre estas dos enfermedades neurodegenerativas.

Ejemplo 3. Curvas ROC de la función discriminante canónica de espectros Raman de muestras de plasma de sangre periférica

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) La Tabla 1 incluye las áreas bajo las curvas ROC resultantes de las comparaciones de dos grupos de sujetos, utilizando solamente espectroscopia Raman. Cada curva ROC corresponde a la función discriminante canónica obtenida del análisis discriminante comparando dos grupos de sujetos, con un intervalo de confianza del 95%. Este análisis discriminante se realizó mediante la modalidad de inclusión por pasos y usando el método de lambda de Wilks, y partiendo de todos los valores o variables espectrales definidas anteriormente en las regiones R.1 , R.2 y R.3. Se consideró como variable dependiente o de agrupación (Var. Agrup.) la clase I, II o III, o la clase (II + III), relativa al estado cognitivo, y como variables independientes los parámetros espectroscópicos (valores espectrales) mencionados anteriormente. Todos los análisis discriminantes se realizaron utilizando el correspondiente programa informático del SPSS, versión 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). ). Un parámetro de las curvas ROC para evaluar la bondad de pruebas diagnóstico es el área bajo la curva que tomará valores entre 1 (prueba perfecta) y 0,5 (prueba inútil). Puede demostrarse que este área se puede interpretar como la probabilidad de que ante un par de individuos, uno enfermo y el otro sano, la prueba los clasifique correctamente. A la vista de estas consideraciones, de la comparación de muestras de DFT o EA frente a muestras de controles sanos se pueden obtener clasificaciones aceptables en torno al 80%, pero el diagnóstico diferencial de la DFT frente a la EA utilizando solamente espectroscopia Raman da como resultado un bajo porcentaje de clasificaciones correctas (59,2%). En la práctica se utiliza el punto de corte de una escala continua que determina la sensibilidad y especificidad más alta conjuntamente, y es aquel punto de corte que presenta el mayor índice de Youden, calculado según la fórmula (sensibilidad + especificidad - 1 ). Gráficamente, éste corresponde al punto de la curva ROC más cercano al ángulo superior-izquierdo del gráfico (punto 0,1 ), es decir, más cercano al punto del gráfico cuya sensibilidad = 100% y especificidad = 100% (Figs. 9-10). Por ejemplo, el punto de corte de la curva ROC que compara a controles sanos frente al grupo integrado por pacientes con DFT y pacientes con EA (-0,4450, Tabla 1 ) indica que aquellas muestras de plasma sanguíneo con función discriminante igual o superior a -0,4450 serían positivas, correspondientes a pacientes con DFT o EA, y las muestras con función discriminante inferior a este valor corresponderían a controles sanos. La clasificación según este método sería de 80% de sensibilidad y 68% de especificidad (Tabla 1 ).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Tabla 1. Areas bajo las curvas ROC resultantes de la comparación de diferentes grupos de sujetos por espectroscopia Raman. Los valores VR corresponden a los valores Raman definidos anteriormente,

Ejemplo 4. Curvas ROC de la función discriminante canónica de espectros infrarrojos de muestras de plasma de sangre periférica. La Tabla 2 incluye las áreas bajo las curvas ROC resultantes de las comparaciones de dos grupos de sujetos, utilizando solamente espectroscopia infrarroja. Cada curva ROC corresponde a la función

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) discriminante canónica obtenida del análisis discriminante comparando dos grupos de sujetos. Este análisis discriminante se realizó mediante la modalidad de inclusión por pasos y usando el método de lambda de Wilks, y partiendo de todos los valores o variables espectrales definidas anteriormente en las regiones IR.1 e IR.2. Se consideró como variable dependiente o de agrupación (Var. Agrup.) la clase I, II, o III o la clase (II + III), relativa al estado cognitivo, y como variables independientes los parámetros espectroscópicos (valores espectrales) mencionados anteriormente. De la comparación de muestras de DFT o EA frente a muestras de controles sanos se obtienen clasificaciones aceptables superiores al 80%, pero el diagnóstico diferencial de la DFT frente a la EA utilizando solamente espectroscopia infrarroja da como resultado un bajo porcentaje de clasificaciones correctas (68,8%).

Tabla 2. Areas bajo las curvas ROC resultantes de la comparación de diferentes grupos de sujetos por espectroscopia infrarroja. Los valores VIR corresponden a los valores infrarrojos definidos anteriormente.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Ejemplo 5. Curvas ROC de la función discriminante canónica de la combinación de espectros infrarrojos y Raman de muestras de plasma de sangre periférica. La Tabla 3 incluye las áreas bajo las curvas ROC resultantes de las comparaciones de dos grupos de sujetos, utilizando la combinación de la espectroscopia infrarroja con la espectroscopia Raman. Cada curva ROC corresponde a la función discriminante canónica obtenida del análisis discriminante comparando dos grupos de sujetos. Este análisis discriminante se realizó mediante la modalidad de inclusión por pasos y usando el método de lambda de Wilks, y partiendo de todos los valores o variables espectrales definidas anteriormente en las regiones Raman (R.1 , R.2 y R.3) e infrarrojas (IR.1 e IR.2). Se consideró como variable dependiente o de agrupación (Var. Agrup.) la clase I, II ó III, o la clase (II + III), relativa al estado cognitivo, y como variables independientes los parámetros espectroscópicos (valores espectrales) mencionados anteriormente. De la comparación de muestras de DFT o EA frente a muestras de controles sanos se obtienen clasificaciones correctas aceptables cercanas al 90% (Tabla 3, Figura 9), y el diagnóstico diferencial de la DFT frente a la EA utilizando ambas espectroscopias da como resultado un buen porcentaje de clasificaciones correctas (81 ,5%, Tabla 3, Figura 10).

Tabla 3. Areas bajo las curvas ROC resultantes de la comparación de diferentes grupos de sujetos mediante la combinación de la espectroscopia infrarroja y la espectroscopia Raman. Los valores VR corresponden a los valores Raman definidos anteriormente y los valores VIR corresponden a los valores infrarrojos definidos anteriormente.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) 6.739VIR2-

9,371VIR3+0,143VIR1 - 10,139

D = -0,208VR11- 0,31279

151 C. sanos => 74 0,888

4193,059VR25 85% (S), 80% (E) DFT

+53,633VR6+9,591VIR2- 7.115VIR3

+0,146VIR1 + 145,963

0,30014,

151 C. sanos => 70 EA 0,898 D = - 84% (S), 83% (E)

4246.208VR15+0,144VR8- 1 1 ,099VIR4+7,006VIR6+0,

204VIR1 -5,700

D = 0.28841.

70 EA => 74 DFT 0,815

0,672VR1 +5910,718VR15 72% (S), 90% (E) -10,755VR20+1 1 ,906VIR4- 9,525VIR8+77,209VIR9+1 1

,829

La Tabla 3 muestra que la combinación de ambas técnicas espectroscópicas conduce a una notable mejora de la clasificación correcta de las muestras cuando se trata de comparar no solamente controles sanos con pacientes de la clase II, III, o la clase (ll+lll), sino también pacientes de DFT frente a pacientes con la EA, lo cual es de especial interés bajo el punto de vista de un diagnóstico diferencial DFT-EA fiable. A la vista de estas consideraciones, la diferenciación entre pacientes con DFT y pacientes con EA combinando la espectroscopia Raman y la infrarroja se puede realizar de dos maneras: a) utilizando la curva ROC que compara a controles sanos frente a pacientes con DFT, y la curva ROC que compara a controles sanos frente a pacientes con la EA; y b) la curva ROC que compara a controles sanos frente a la clase integrada por DFT y EA, y la curva ROC que compara a pacientes con EA frente a pacientes con DFT.

De la consideración de las áreas bajo las curvas ROC (AUC, Tabla 4) se concluye que mediante la espectroscopia infrarroja y/o Raman se pueden distinguir grupos de muestras de plasma sanguíneo correspondientes a sujetos sanos, pacientes con DFT

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) y pacientes con EA, con porcentajes de clasificaciones correctas superiores al 80% (Tabla 4).

Tabla 4. Cambios de los parámetros espectrales infrarrojos y Raman clasificatorios, en la comparación de grupos de muestras de plasma pertenecientes a sujetos sanos, pacientes con DFT y pacientes con la EA, y áreas bajo las curvas ROC respectivas utilizables para clasificaciones diagnósticas. Los valores VR corresponden a los valores Raman definidos anteriormente y los valores VIR corresponden a los valores infrarrojos definidos anteriormente.† indica aumento, i indica disminución.

La interpretación molecular de los cambios de los parámetros espectrales clasificatorios en la comparación de grupos se describe como sigue.

El grupo de sujetos sanos se distingue del grupo integrado por pacientes con DFT y la EA (DFT+EA) mediante varios parámetros, entre ellos el VR8 que puede estar asociado al estrés oxidativo porque la banda situada hacia 1525 cm^"1 (Fig. 4) es atribuible a vibraciones de tensión de dobles enlaces carbono-carbono con conjugación electrónica, como ocurre en los carotenoides. La disminución de la intensidad de esta banda al pasar de controles sanos al grupo integrado de pacientes (DFT+EA) se puede explicar por la acción del estrés oxidativo que está presente en

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) estas enfermedades neurodegenerativas. Por otra parte y en comparación con los controles sanos es característico el aumento de la concentración de estructura β- proteica en los pacientes con DFT o con EA (VIR1 , Fig. 7). Estos cambios en la estructura secundaria proteica pueden comportar obviamente cambios en la estructura terciaria como revela el parámetro clasificatorio VR15 relacionado con la cadena lateral del triptófano (Tabla 4, Fig. 3). Finalmente los cambios de los parámetros VIR2 y VIR3 (en la región 1200-1000 cm^"1 que incluye bandas vC-O, Fig. 8) pueden ser debidos a un aumento de compuestos hidroxilados generados en el estrés oxidativo de pacientes con estas enfermedades neurodegenerativas. De la comparación del grupo de controles sanos con el grupo integrado por pacientes con estas enfermedades neurodegenerativas (DFT+EA) se obtiene una curva ROC con un área bajo la curva (Fig. 9, Tabla 4) indicativa de que estos dos grupos se pueden diferenciar con un porcentaje de clasificaciones correctas de muestras superior al 85% (AUC = 0,873) Los grupos DFT y EA individualmente considerados contienen mayor concentración de estructura β-proteica en comparación con los controles sanos (VIR1 , Fig. 7), como ocurre con el grupo integrado por DFT y EA, aunque el resto de los parámetros son diferentes entre DFT y EA. En comparación con los controles sanos se advierten cambios mencionados anteriormente generados por estrés oxidativo y el triptófano en diferente estructura terciaria (VR8, VR6, VR1 1 , VR15, Fig. 4). Mediante el uso de las curvas ROC (Tabla 4) se obtiene también clasificaciones correctas de las muestras superiores al 85% (AUC = 888, 898).

La distinción entre DFT y EA se logra mejor comparando directamente los pacientes de EA con los DFT (diagnóstico diferencial). Una diferencia molecular importante se pone de manifiesto a través del cambio de intensidad relativa de la banda hacia 2936 cm^"1 (VR1 , Fig. 5, Tabla 4) que puede ser debido a diferentes estructuras terciarias de proteínas o a la presencia, en pacientes con DFT, de proteínas más ricas en grupos CH (por ejemplo, glicoproteínas) que en los pacientes con EA. Son consistentes con esta segunda interpretación los cambios de los parámetros infrarrojos VIR4, VIR8 y VIR9 (región 1200-1000 cm^"1, Fig. 8) relacionados con bandas de tensión C-O generadas por compuestos hidroxilados. Finalmente los cambios de los parámetros Raman clasificadores VR15 y VR20 se pueden atribuir a diferentes estructuras terciarias de cadenas laterales de triptófano y de esqueleto respectivamente. La curva

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) ROC correspondiente (Fig. 10, Tabla 4) indica que las muestras de plasma de pacientes con DFT se pueden diferenciar de las de pacientes de EA, con un porcentaje de clasificaciones correctas superior al 80% (AUC = 0,815).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES

1 - Método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre, un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral seleccionado del grupo formado por la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7), la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8), promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15) y el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^"1 (VR25).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)

2- Método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 crn^-1

IR2 1200-1000 cm^"1 en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia, un valor de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar Alzheimer por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia infrarrojo correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación de la primera derivada a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); promedio de la primera derivada hacia 1158 cm^"1 y 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR6).

3- Método para el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente las etapas de un método según la reivindicación 2 aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

4- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 que comprende obtener los valores espectrales Raman correspondientes al promedio de la primera derivada a la

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); promedio de la primera derivada a la intensidad 745 cm^"1 y la intensidad 744 cm^"1 (VR12), el valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada a la intensidad 416 cm^"1 (VR25); la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8).

5- Método según la reivindicación 2 o 3 que comprende determinar los valores espectral infrarrojo correspondientes a la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VI 8) y el porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ).

6- Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende obtener los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la primera derivada a la intensidad 760 cm^"1 (VR15) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la primera derivada a la intensidad 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1 171 cm^"1 (VIR4) promedio de la primera derivada hacia la intensidad 1 158 cm^"1 y la intensidad 1 160 cm^"1 normalizadas respecto a la primera derivada en el mínimo hacia la intensidad 1 171 cm^"1 (VIR6) y porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ).

7- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

8- Método para el diagnóstico de demencia frontotemporal mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

9.- Método para el diagnóstico de demencia frontotemporal mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de absorbancia, un valor de intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar demencia frontotemporal

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente.

10- Método para el diagnóstico de demencia frontotemporal según la reivindicación 8 que comprende adicionalmente las etapas de un método según la reivindicación 9 aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

1 1- Método según las reivindicaciones 8 y 10 que comprende determinar al menos un valor espectral aman seleccionado del grupo que consiste en la relación del área del perfil espectral Raman comprendido entre 9 0 y 980 cm^"1 (VR10), la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ), la relación de las intensidades Raman obtenidas en el máximo de la banda hacia 758 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR18), la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7), el área de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR6), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25) y la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 409 cm^"1 y 423 cm^"1 (VR29).

12.- Método según la reivindicación 1 1 que comprende determinar el área relativa o normalizada del perfil espectral Raman comprendido entre 910 y 980 cm^"1 (VR10), la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ), la relación de las intensidades Raman obtenidas en el máximo de la banda hacia 758 cm^"1 y en la intensidad a 744 cm^"1 (VR18), la altura de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR7), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25) y la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 409 cm^"1 y 423 cm^"1 (VR29).

13-Método según las reivindicaciones 9 a 12 que comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo que consiste en el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ), la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 respecto a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2) y la relación de la

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VI R3).

14- Método según la reivindicación 13 que comprende determinar el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ) y la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 respecto a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2).

15- Método según cualquiera de las reivindicaciones 10, 1 1 y 13 que comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la frecuencia de la banda comprendida en la región del espectro Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ), el valor de la primera derivada de la intensidad hacia 416 cm^"1 (VR25), el área de la banda hacia 1555 cm^"1 (VR6) y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2), la relación de la primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VI R3) y el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ).

16- Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en donde el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

17- Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer que comprende:

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y

c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia Raman correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por el promedio de la primera derivada a la intensidad 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8).

18. -Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre absorbancia, intensidad, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de demencia frontotemporal y alzheimer por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor espectral infrarrojo de referencia correspondiente, en donde dicho método comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación de la absorbancia a 1156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2) y la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1171 cm^"1(VIR3).

19- Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en donde la enfermedad neurodegenerativa es demencia frontotemporal o enfermedad de

Alzheimer según la reivindicación 17 que comprende adicionalmente las etapas de un método según la reivindicación 18 aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

20- Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 19 en donde el método comprende determinar adicionalmente un valor espectral de la región del espectro

Raman seleccionado del grupo formado por la frecuencia de la banda Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ) y la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 y la intensidad a 744 cm^"1 (VR18).

21- Método según la reivindicación 20 en donde el método comprende determinar los valores Raman correspondientes al promedio de la primera derivada de la intensidad a 1662 cm^"1 y 1660 cm^"1 (VR3); el promedio de la primera derivada de la intensidad a 745 cm^"1 y a 744 cm^"1 (VR12); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) cm^"1 (VR15); el valor de la primera derivada de la intensidad a 416 cm^"1 (VR25) y la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 respecto al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8), la frecuencia de la banda Raman entre 740 y 750 cm^"1 (VR1 1 ) y la relación de la intensidad del máximo hacia 758 cm^"1 y la intensidad a 744 cm^"1 (VR18.

22- Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en donde el método comprende adicionalmente determinar el valor espectral de la región del espectro infrarrojo correspondiente al porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VI 1 ).

23- Método según la reivindicación 22 que comprende determinar los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la absorbancia a 1 156 cm^"1 a la absorbancia del máximo hacia 1 171 cm^"1 (VIR2) y el porcentaje de área del perfil espectral entre 1639 y 1623 cm^"1 con respecto al área entre 1672-1623 cm^"1 expresado en segundas derivadas (VIR1 ).

24 - Método según cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, o 22 que comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes al valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); la relación del área de la banda hacia 1555 cm^"1 al área de la banda hacia 1525 cm^"1 (VR8) y los valores espectrales Infrarrojos correspondientes a la absorbancia a 1 156 cm^"1 y a la absorbancia del máximo hacia 1171 cm^"1 (VIR2); la relación de la primera derivada a 1 152 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR3); y porcentaje del área entre 1639 cm^"1 y 1623 cm^"1 respecto al área entre 1672 cm^"1 y 1623 cm^"1 en el espectro expresado en segunda derivada (VIR1 ).

25- Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24 en donde el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido en un sujeto sano.

26- Método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia Raman en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa de entre demencia frontotemporal o Alzheimer que comprende

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) a) registrar un espectro Raman de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

R1 región comprendida entre 3100-2800 cm^"1

R2 región comprendida entre 1700-1500 cm^"1

R3 región comprendida entre 1000-390 cm^"1 en donde dicho valor espectral se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de una relación de intensidades Raman entre bandas, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de una frecuencia, y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer por comparación del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con un valor espectral de referencia correspondiente, o por comparación mediante análisis multivariante del valor espectral Raman obtenido en la etapa b con valores espectrales Raman de referencia correspondiente.

27- Método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer mediante espectroscopia infrarroja en una muestra de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa que comprende: a) registrar un espectro infrarrojo de una muestra de sangre humana previamente obtenida;

IR1 1700-1600 cm^"1

IR2 1200-1000 cm^"1

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) en donde dicho valor espectral infrarrojo se selecciona entre un valor de intensidad, un valor de absorbancia, un valor de área de dicha región espectral y/o un valor de porcentajes de áreas entre bandas de dicha región espectral; y c) diagnosticar diferencialmente demencia frontotemporal o Alzheimer, por comparación del valor espectral infrarrojo obtenido en la etapa b con un valor infrarrojo de referencia que permita la distinción entre demencia frontotemporal y Alzheimer, o por comparación mediante análisis multivariante del valor infrarrojo obtenido en la etapa b con valores espectrales de referencia infrarrojos demencia frontotemporal o Alzheimer.

28- Método para el diagnóstico diferencial de demencia frontotemporal y Alzheimer según la reivindicación 26 que comprende adicionalmente las etapas de un método según la reivindicación 27 aplicado sobre una muestra del mismo sujeto.

29- Método según las reivindicaciones 26 o 28 que comprende determinar al menos un valor espectral Raman seleccionado del grupo formado por la relación de intensidades obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ), el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15) y la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1 (VR20).

30- Método según la reivindicación 29 que comprende determinar el valor espectral Raman correspondiente a la relación de intensidades obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ).

31- Método según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que comprende determinar al menos un valor espectral infrarrojo seleccionado del grupo formado por la relación del área entre 1165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8), la relación del área entre 1166 cm^" ¹ y 1 145 cm^"1 al área entre 1185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9) y la relación de la primera derivada de la intensidad a 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo de intensidad hacia 1171 cm^"1 (VIR4).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) 32- Método según la reivindicación 31 que comprende determinar los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1180 cm^"1 y 1165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8) y la relación del área entre 1 166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9).

33- Método según cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 o 31 que comprende determinar los valores espectrales Raman correspondientes a la relación de las intensidades Raman obtenidas hacia 2936 cm^"1 y hacia 1658 cm^"1 (VR1 ); el valor de la primera derivada de la intensidad a 760 cm^"1 (VR15); la relación de la intensidad a 494 cm^"1 a la intensidad del máximo hacia 512 cm^"1 (VR20); y los valores espectrales infrarrojos correspondientes a la relación de la primera derivada a la intensidad 1 154 cm^"1 a la primera derivada en el mínimo hacia 1 171 cm^"1 (VIR4); la relación del área entre 1 165 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 180 cm^"1 y 1 165 cm^"1 expresado el espectro en segunda derivada (VIR8) y la relación del área entre 1166 cm^"1 y 1 145 cm^"1 al área entre 1 185 cm^"1 y 1 145 cm^"1 (VI R9).

34- Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en donde al paciente se le ha diagnosticado previamente una enfermedad neurodegenerativa mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25.

35- Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34 en donde el valor de referencia Raman y/o valor de referencia infrarrojo ha sido obtenido de un sujeto que ha sido previamente diagnosticado de demencia frontotemporal o en un sujeto que ha sido previamente diagnosticado de Alzheimer.

36- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 en donde la muestra de sangre es una muestra de una fracción de plasma sanguíneo.

37-Método según la reivindicación 36 en donde la muestra de la fracción de plasma sanguíneo se prepara para registrar su espectro Raman e infrarrojo siguiendo un procedimiento que comprende:

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) a) Tomar una cantidad adecuada de plasma que se depositan bien extendidos sobre un cristal de CaF₂;

b) Secar a temperatura ambiente la muestra depositada en forma de película

líquida.

38- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 en donde comparación mediante análisis multivariante se realiza mediante combinaciones lineales de los valores espectrales.

39- Un aparato para el análisis de plasma que comprende de plasma que comprende: (i) un receptáculo para recibir una muestra de plasma,

(iii) un sistema informático que comprende medios para la implementación un método de diagnóstico de la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38. 40-Programa de ordenador que comprende un código adecuado para la realización de los métodos diagnósticos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38.

41- Soporte de ordenador que contiene el programa de ordenador según la reivindicación 40.

42- Compuesto adecuado para el tratamiento de demencia frontotemporal para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado una demencia frontotemporal mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 8-16, 17- 25- 26-38.

43- Compuesto adecuado para el tratamiento de Alzheimer para su uso en el tratamiento de un sujeto al que le ha sido diagnosticado Alzheimer mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 17-25, 26- 38.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)