WO2018147257A1 - ステロイド産生細胞の製造方法 - Google Patents

ステロイド産生細胞の製造方法 Download PDF

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健二 長船
正勝 曽根
暢也 稲垣
一和 中尾
松尾　浩司
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Kyoto University NUC
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing steroidogenic cells. Specifically, the method of the present invention is characterized by inducing differentiation induction of steroid-producing cells by treating intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist or the like.
  • Steroid hormones are essential for survival. If sufficient amounts of steroid hormones are not produced from the adrenal cortex, adrenal insufficiency will result, leading to a crisis of survival. In such a case, emergency treatment is required.
  • Glucocorticoid replacement therapy is standard as such treatment, but there are serious side effects such as adrenal injury, obesity, osteoporosis, hypertension and glucose intolerance, and the burden on the patient is very large.
  • Non-patent Document 1 mouse embryonic stem cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Examples include obtaining steroid-producing cells (Non-Patent Documents 2 to 6) and examples in which steroid-producing cells are derived from human pluripotent stem cells (Non-Patent Document 7).
  • these studies have problems such as limited steroid production or insufficient characterization of steroidogenic cells.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and found that treatment of intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist or the like induces differentiation into steroidogenic cells, thereby completing the present invention. It came to. In addition, it has also been found that by using 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase as an indicator, it is possible to screen for intermediate mesoderm cells that produce steroids.
  • the invention therefore relates to the following: (1) Including differentiation induction into steroid-producing cells by treating intermediate mesoderm cells with one or more substances selected from the group consisting of dopamine D1 receptor agonist, adrenocorticotropic hormone (ACTH) and dopamine , A method for producing steroidogenic cells; (2) The method according to (1), wherein the substance contains a dopamine D1 receptor agonist; (3) The method according to (1) or (2), wherein the substance comprises a dopamine D1 receptor agonist and ACTH; (4)
  • a dopamine D1 receptor agonist is represented by the following formulas (I) to (III): (I) [Wherein R 1 and R 2 are independently hydrogen, hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen, and R 3 is (CH 2 ) m NR x R y , where R x and R y Is independently hydrogen or C 1-3 alkyl), m is an integer from 1 to 3, and A may have an unsaturated bond and is substituted with hydroxy
  • any one of (1) to (4) which is more than that; (6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the intermediate mesoderm cell is obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell; (7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the intermediate mesoderm cell is derived from a human; (8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the intermediate mesoderm cell is one in which the SF-1 gene is forcibly expressed; (9) A kit for producing steroidogenic cells from intermediate mesoderm cells, comprising a dopamine D1 receptor agonist; (10) A screening method for a substance that induces differentiation of steroid-producing cells from intermediate mesoderm cells, which comprises using the expression of 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase as an index; (11) a steroidogenic cell culture obtained by the method according to any one of (1) to (8); and (12) a steroid obtained by the method according to any one of (1) to (8)
  • steroidogenic cells can be induced to differentiate efficiently and efficiently from intermediate mesoderm cells. Therefore, differentiation can be efficiently induced from pluripotent stem cells to steroidogenic cells in large quantities. Furthermore, according to the present invention, it is possible to easily screen for intermediate mesoderm cells that produce steroids.
  • FIG. 1a shows the results of examining steroidogenic enzyme mRNA expression in OSR1 + cells.
  • FIG. 1b schematically shows a screening method for nominal molecular compounds that promote the differentiation of human iPS cell-derived intermediate mesoderm cells into steroidogenic cells.
  • FIG. 1c shows the proportion of cultures treated with cabergoline and control 3 ⁇ -HSD positive cells.
  • FIG. 1d shows cabergoline concentration dependent 3 ⁇ -HSD mRNA expression.
  • FIG. 2a shows the results of examining dopamine D2 receptor expression in OSR1 + cells.
  • FIG. 2b shows the results of examining 3 ⁇ -HSD expression when OSR1 + cells were treated with a dopamine D2 receptor agonist.
  • FIG. 1a shows the results of examining steroidogenic enzyme mRNA expression in OSR1 + cells.
  • FIG. 1b schematically shows a screening method for nominal molecular compounds that promote the differentiation of human iPS cell-derived intermediate mesoderm cells into steroidogenic
  • FIG. 2 c shows the results of examining the effect of metoclopramide, a dopamine D2 receptor antagonist, on OSR1 + cells.
  • FIG. 3a shows the results of examining dopamine D1 receptor expression in OSR1 + cells.
  • FIG. 3b shows the results of examining 3 ⁇ -HSD expression when OSR1 + cells were treated with a dopamine D1 receptor agonist.
  • FIG. 3c shows that the promoting effect of cabergoline was blocked by the D1 receptor antagonist (SKF83566).
  • FIG. 3d shows the results of investigating the influence of cabergoline and SKF83566 on the increase in cAMP by cabergoline.
  • FIG. 4 shows the results of examining the mRNA expression of steroidogenic enzymes gene OSR1 + IM cells and SF-1 that were not transfected with SF-1 in the OSR1 + IM transfected cells.
  • FIG. 5 shows the results of examining the effects of a dopamine D1 receptor agonist and ACTH on steroid synthase mRNA expression in SF-1 transfected IM cells.
  • the present invention provides a steroid-producing cell by treating intermediate mesoderm cells with one or more substances selected from the group consisting of a dopamine D1 receptor agonist, an adrenocorticotropic hormone (ACTH) and dopamine.
  • a method for producing a steroidogenic cell comprising inducing differentiation is provided.
  • each of the dopamine D1 receptor agonist, ACTH, or dopamine may be used alone, or two or all of these may be used in combination.
  • Intermediate mesoderm cells may be treated using substances other than the above substances and combinations thereof.
  • the substance comprises a dopamine D1 receptor agonist.
  • intermediate mesoderm cells may be treated with only a dopamine D1 receptor agonist, or intermediate mesoderm cells may be treated with a substance other than a dopamine D1 receptor agonist.
  • the substance comprises a dopamine D1 receptor agonist and ACTH.
  • intermediate mesoderm cells may be treated with dopamine D1 receptor agonist and ACTH alone, or intermediate mesoderm cells may be treated with a substance other than dopamine D1 receptor agonist and ACTH. Treatment of intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist and ACTH will be described later.
  • Intermediate mesoderm cells are cells that can differentiate into the anterior kidney, intermediate kidney, intermediate renal canal, metanephros, adrenal cortex and gonads.
  • the origin of the intermediate mesoderm cell is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a human.
  • the intermediate mesoderm cell used in the present invention may be an already established cell (for example, a cell distributed from a research institution), or may be a cell derived from differentiation from a pluripotent stem cell. .
  • a pluripotent stem cell is a stem cell that can be differentiated into all cells existing in a living body and also has proliferative ability.
  • Pluripotent stem cells are known to those skilled in the art, and are induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), cloned embryo-derived ES cells (nt ES cells) obtained by nuclear transfer, sperm stem cells (GS cells), embryonic germ cells (EG cells) and the like, but are not limited thereto.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • nt ES cells cloned embryo-derived ES cells obtained by nuclear transfer
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • iPS cells can be obtained by introducing nuclear reprogramming factors into somatic cells.
  • the nuclear reprogramming factor basically includes an Oct family gene or the gene product, a Klf family gene or the gene product, a Sox family gene or the gene product, and a Myc family gene or the gene product.
  • the induction efficiency of iPS cells may be increased by introducing Lin28 gene or the gene product, nanog gene or the gene product into somatic cells.
  • Methods for introducing nuclear reprogramming factors into somatic cells are also known.
  • iPS cell establishment efficiency may be increased by treating cells with a histone deacetylase (HDAC) inhibitor after introduction of a nuclear reprogramming factor.
  • HDAC histone deacetylase
  • iPS cells can also be obtained from, for example, iPS Cell Research Institute (CiRA), Kyoto University.
  • ES cells can be obtained by removing the inner cell mass from the blastocyst of the fertilized egg of the subject animal and culturing. Techniques and culture methods for this are also known. Human ES cells can also be obtained from, for example, the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • a method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to intermediate mesoderm cells is also known.
  • the method described in Araoka et al., PLoS One: 9 (1) (e84881), the method described in Mae et al., Nat. Commun. 4, 1367 (2013), and the like can be used.
  • the method described in Japanese Patent No. 5896360 may be used.
  • Odd-skipped retaled 1 (OSR1) can be used.
  • intermediate mesoderm cells may be obtained by introducing a GFP gene linked to the OSR1 gene into human iPS cells, inducing differentiation, and sorting using a cell sorter.
  • Dopamine receptors are mainly distributed in the central nervous system and cause various physiological actions by binding to the neurotransmitter dopamine.
  • the dopamine D1 receptor is one of five currently known dopamine receptors.
  • a D1 receptor agonist is an agonist that acts on the dopamine D1 receptor and exhibits the same function as dopamine.
  • the dopamine D1 receptor agonist used in the present invention may act not only on the dopamine D1 receptor but also on the dopamine D2-D5 receptors. Further, the dopamine D1 receptor agonist used in the present invention may be one type or two or more types.
  • Dopamine D1 receptor agonists preferably used in the present invention include the following formulas (I) to (III): (I) [Wherein R 1 and R 2 are independently hydrogen, hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen, and R 3 is (CH 2 ) m NR x R y , wherein R x And R y is independently hydrogen or C 1-3 alkyl), m is an integer of 1-3, A may have an unsaturated bond, hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen Means a saturated or unsaturated carbocyclic group optionally substituted by (II) [Wherein R 4 , R 5 , R 6 , R 7 are independently hydrogen, hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen, or R 6 and R 7 together are hydroxy, Forms a pyrrole ring optionally substituted with C 1-6 alkyl or halogen, R 8 is hydrogen, C 1-6 alkyl or CH 2 CHCH 2 , R 9 is hydrogen, hydroxy, C 1-6
  • Examples of preferred compounds of formula (I) include R 1 is hydrogen or hydroxy, R 2 is hydrogen or hydroxy, R 3 is CH 3 NH 2 , A is hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen And a compound which may be a benzene ring or an adamantyl ring.
  • Specific examples of preferred compounds represented by formula (I) include, but are not limited to, A68930 and A77636.
  • Examples of preferred compounds of formula (II) include R 4 is hydrogen or hydroxy, R 5 is hydrogen or hydroxy, R 6 is hydrogen, R 7 is hydrogen, or R 6 and R 7 together are hydroxy Forms a pyrrole ring optionally substituted with C 1-6 alkyl or halogen, R 8 is prime or CH 2 CHCH 2 , R 9 is CH 2 —S—CH 3 or And R 10 is hydrogen, or R 9 and R 10 together form a benzene ring optionally substituted with hydroxy, C 1-6 alkyl or halogen.
  • Specific examples of preferred compounds represented by formula (II) include, but are not limited to, cabergoline, CY208-243, pergolide, dihydrexidine and the like.
  • Examples of preferred compounds of formula (III) include those in which R 11 is hydrogen or halogen, R 12 is hydrogen or hydroxy, R 13 is hydrogen or hydroxy, R 14 is hydrogen, methyl or CH 2 CHCH 2 Can be mentioned.
  • Specific examples of the preferred compound represented by the formula (III) include, but are not limited to, fenoldopam, SKF38393, SKF77434, SKF83822, SKF83959, SKF81297, SKF82958, and the like.
  • a salt or solvate of the above compound may be used.
  • the salt of the above compound include, but are not limited to, hydrochloride, hydrobromide, maleate, mesylate and the like.
  • solvates of the above compounds include, but are not limited to, hydrates.
  • halogen includes chlorine, bromine and iodine.
  • C 1-6 alkyl means an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the compounds of formulas (I) to (III) used in the present invention include all structural isomers and stereoisomers.
  • Intermediate mesoderm cells treated with a dopamine D1 receptor agonist may be provided as a purified cell population or may be provided as a cell population containing other types of cells.
  • Treating intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist means placing the intermediate mesoderm cell dopamine D1 receptor and dopamine D1 agonist in a state where they can interact.
  • the intermediate mesoderm cells are typically contacted by contacting the intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 agonist, more typically by culturing the intermediate mesoderm cells in a medium containing a dopamine D1 receptor agonist. It can be treated with a dopamine D1 receptor agonist.
  • the medium for treatment of intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist to induce differentiation into steroidogenic cells may be any animal cell culture medium that contains a dopamine D1 receptor agonist.
  • EMEM Examples include, but are not limited to, a medium, a DMEM medium, an RPMI 1640 medium, a Ham's F12 medium, a Medium 199 medium, and a modified medium thereof, and a mixed medium thereof.
  • a culture vessel treated with a coating agent can be used.
  • Coating agents include, but are not limited to, Matrigel TM , collagen, gelatin, etc., and combinations thereof.
  • the amount of dopamine D1 receptor agonist in the medium can be appropriately determined by measuring the expression and / or enzymatic activity of the steroid synthase gene in the cell and / or the amount of steroids produced from the cell. .
  • the amount of dopamine D1 receptor agonist in the medium can be about 0.1 ⁇ M to several tens of ⁇ M.
  • Various conditions for inducing differentiation into steroidogenic cells by culturing intermediate mesoderm cells in a medium containing a dopamine D1 receptor agonist can also be determined as appropriate.
  • the culture may be performed in a medium containing a dopamine D1 receptor agonist at 37 ° C. in the presence of 5 to 10% carbon dioxide for about 2 to about 30 days.
  • cells may be subcultured as necessary.
  • one kind of dopamine D1 receptor agonist may be used, or two or more kinds of dopamine D1 receptor agonists may be used.
  • a steroid synthase gene in a cell can be measured using a method such as quantitative real-time PCR (qRT-PCR).
  • steroid synthase include, but are not limited to, steroidogenic acute regulatory protein (StAR), CYP11A1, CYP21A2, CYP11B1, CYP17 and 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD).
  • StAR steroidogenic acute regulatory protein
  • CYP11A1, CYP21A2, CYP11B1, CYP17 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD).
  • a method for measuring the activity of steroid synthase is also known.
  • Steroids secreted into the medium can be measured, for example, by enzyme immunoassay. Kits for such enzyme immunoassays are also commercially available.
  • the steroidogenic cell in the present invention is an intermediate mesoderm cell that has been induced to differentiate by treatment with a dopamine D1 receptor agonist, and compared to a case in which differentiation is induced without treatment with a dopamine D1 receptor agonist. It is a cell in which the productivity of the species is increased as a whole.
  • steroids include, but are not limited to, glucocorticoids such as cortisol, mineralocorticoids such as aldosterone, androgens such as dehydroepiandrosterone (DHEA) and testosterone.
  • the amount of steroid produced from cells can be further increased by treating intermediate mesoderm cells with a dopamine D1 receptor agonist and ACTH.
  • the intermediate mesoderm cells may be treated with ACTH at the same time as or before or after treatment of the intermediate mesoderm cells with the dopamine D1 receptor agonist.
  • intermediate mesoderm cells are cultured in a medium containing a dopamine D1 receptor agonist and ACTH to induce differentiation into steroidogenic cells.
  • the amount of ACTH added to the medium can be appropriately determined by measuring, for example, the amount of steroids produced by differentiation-induced cells, but is generally about 0.1 ⁇ M to several tens of ⁇ M. it can.
  • the amount of steroid produced can be further increased by using an intermediate mesoderm cell in which SF-1 is forcibly expressed.
  • SF-1 is a major regulator in transcription of steroid synthesis genes.
  • the forced expression of SF-1 can be performed by a known method such as transfection using an expression vector.
  • the present invention provides a kit for producing steroidogenic cells from intermediate mesoderm cells comprising a dopamine D1 receptor agonist.
  • the kit of the present invention may contain intermediate mesoderm cells, a culture vessel, a medium, etc. in addition to the dopamine D1 receptor agonist.
  • an instruction manual is attached to the kit.
  • the present invention provides a screening method for a substance that induces differentiation of steroidogenic cells from intermediate mesoderm cells, which comprises using the expression level of 3 ⁇ -HSD as an index. Since 3 ⁇ -HSD is an essential enzyme for corticosteroid synthesis, there is a correlation between the expression level of this enzyme and the steroidogenic ability of cells. The expression level of this enzyme can be measured using, for example, qRT-PCR.
  • the present invention provides a screening kit for a substance that induces differentiation of steroid-producing cells from intermediate mesoderm cells, including means for measuring the expression level of 3 ⁇ -HSD.
  • the kit may contain, for example, primers necessary for qRT-PCR for measuring the expression level of 3 ⁇ -HSD.
  • an instruction manual is attached to the kit.
  • the present invention provides a steroidogenic cell culture obtained by the production method of the present invention.
  • a person skilled in the art can cultivate steroid-producing cells by appropriately selecting a culture method and culture conditions.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising steroidogenic cells obtained by the production method of the present invention.
  • Those skilled in the art can produce the pharmaceutical composition of the present invention by appropriately selecting carriers, excipients, additives and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for the treatment of adrenal insufficiency. Therefore, in one specific example of this aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising steroidogenic cells obtained by the production method of the present invention for the treatment of adrenal dysfunction.
  • the present invention provides a method for treating adrenal insufficiency in a patient, comprising administering the steroidogenic cells obtained by the production method of the present invention to a patient with adrenal insufficiency.
  • the present invention provides the use of a steroidogenic cell obtained by the production method of the present invention in the manufacture of a medicament for the treatment of adrenal dysfunction.
  • the present invention provides a steroidogenic cell obtained by the production method of the present invention, which is used for the treatment of adrenal dysfunction.
  • RNA expression of steroidogenic enzymes in the OSR1 + cells was examined.
  • Reverse transcription PCR (RT-PCR) analysis showed StAR and 3 ⁇ -HSD mRNA expression, but mRNA expression of other steroid synthases such as cytochrome P450 (CYP) 11A1, CYP21A2, CYP11B1, CYP11B2, CYP17 Not shown in IM cells (FIG. 1a). Since 3 ⁇ -HSD is an essential enzyme for the production of corticosteroids, it was considered to be an appropriate marker. Then, primary screening of small molecule compounds that promote differentiation of human iPS cell-derived IM cells into steroidogenic cells was performed using immunostaining of 3 ⁇ -HSD. The outline is shown in FIG.
  • IM cells were induced via embryoid body (EB) formation according to the method described in Mae et al., Nat. Commun. 4, 1367 (2013).
  • Isolated OSR1-GFP + cells were seeded in 348 well plates (8000 / well) and the next day each compound was added to each well.
  • Four days after compound addition cells were stained with 3 ⁇ -HSD antibody.
  • Wells that showed 3 ⁇ -HSD positivity (%) 10 times or more than cells treated with carrier (1% DMSO) were considered hits in the primary screening.
  • carrier 1% DMSO
  • the percentage of 3 ⁇ -HSD positive cells in the cabergoline-treated culture was 1.59%, higher than the DMSO-treated control (0.07 ⁇ 0.01%) (FIG. 1c).
  • qRT-PCR analysis also showed that 3 ⁇ -HSD mRNA expression increased in a dose-dependent manner at the concentrations tested (cabergoline 1 nM-20 ⁇ M) (FIG. 1d).
  • Cabergoline up-regulates 3 ⁇ -HSD mRNA expression
  • Cabergoline is known as an effective and high-affinity agonist of the dopamine D2 receptor. Therefore, it was considered that dopamine D2 signaling upregulated 3 ⁇ -HSD mRNA expression in OSR1 + cells.
  • RT-PCR was used to examine the expression of dopamine D2 receptor in OSR1 + cells, it was found that the expression level was equivalent to that of human adrenal gland (FIG. 2a).
  • dopamine D2 receptor agonists 10 ⁇ M quinpirole, 1 ⁇ M bromocriptine and 10 ⁇ M propylnorapomorphine
  • RT-PCR analysis revealed that dopamine D1 receptor was not expressed in undifferentiated human iPS cells but was expressed in OSR1 + cells (FIG. 3a).
  • OSR1 + cells were treated with 3 types of dopamine D1 receptor agonists (10 ⁇ M pergolide, 10 ⁇ M A68930, 1 ⁇ M SKF83822) for 4 days, and all were confirmed to up-regulate 3 ⁇ -HSD mRNA expression (FIG. 3b).
  • qRT-PCR analysis showed that the promoting effect of cabergoline (20 ⁇ M) was blocked by the D1 receptor antagonist (10 ⁇ M SKF83566) (FIG.
  • cabergoline activated the dopamine D1 receptor. It was suggested that this promotes 3 ⁇ -HSD mRNA expression.
  • cabergoline acts by activation of dopamine D1 receptor
  • cells were treated with cabergoline and SKF83566, and then intracellular cyclic AMP known as the second messenger of dopamine D1 receptor ( cAMP) assay.
  • cAMP dopamine D1 receptor
  • Cabergoline significantly increased intracellular cAMP, but co-administration with SKF83566 ceased to increase cAMP by cabergoline (FIG. 3d). Taken together, these results indicate that dopamine D1 receptor signaling increases intracellular cAMP and promotes differentiation into steroidogenic cells.
  • IM cells For transfection, about 5 ⁇ 10 5 OSR1 + IM cells were transfected with 2 ⁇ g of an expression plasmid (pCMFlag-hsNR5A1; RIKEN BRC, Saitama, Japan) encoding SH-F-1 driven by a cytomegalovirus promoter. . Transfection was performed using electroporation with Nucleofector TM (Lonza, Basel, Switzerland). The transfection efficiency was about 60%.
  • the present invention is very useful in the field of producing cells used for regenerative medicine and disease research.

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Abstract

本発明は、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストで処理してステロイド産生細胞に分化誘導することを含む、ステロイド産生細胞の製造方法、ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を製造するためのキット、３β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの発現を指標とすることを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する物質のスクリーニング方法、上記製造方法にて得られたステロイド産生細胞培養物、ならびに上記製造方法にて得られたステロイド産生細胞を含む医薬組成物を提供する。

Description

ステロイド産生細胞の製造方法
　本発明は、ステロイド産生細胞の製造方法に関する。詳細には、本発明の方法は、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニスト等で処理してステロイド産生細胞を分化誘導することを特徴とする。
　ステロイドホルモンは生存に必要不可欠なものである。副腎皮質から十分な量のステロイドホルモンが産生されないと、副腎機能不全となり、生存の危機に瀕することとなる。このような場合には、緊急の処置が必要となる。かかる処置としてはグルココルチコイド補充療法が標準的なものであるが、副腎の損傷、肥満、骨粗鬆症、高血圧およびグルコース不耐症などの重大な副作用があり、患者の負担も非常に大きい。
　このような処置に代わるものとして、多能性幹細胞を用いる再生医療に期待が寄せられている。多能性幹細胞からのステロイド産生細胞の製造例としては、マウス胚性幹細胞からステロイド産生細胞を誘導した例（非特許文献１）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）においてＳＦ－１を強制発現させてステロイド産生細胞を得た例（非特許文献２～６）、ヒト多能性幹細胞からステロイド産生細胞を誘導した例（非特許文献７）などがある。しかしながら、これらの研究においては、ステロイド産生が限定的である、あるいはステロイド産生細胞の特徴付けが十分でないといった問題があった。
Crawford, P.A., Sadovsky, Y. & Milbrandt, J. Nuclear receptor steroidogenic factor 1 directs embryonic stem cells toward the steroidogenic lineage. Mol Cell Biol. 17, 3997-4006 (1997). Yanase, T. et al. Differentiation and regeneration of adrenal tissues: An initial step toward regeneration therapy for steroid insufficiency. Endocr. J. 53, 449-459 (2006). Tanaka, T. et al. Steroidogenic factor 1/adrenal 4 binding protein transforms human bone marrow mesenchymal cells into steroidogenic cells. J. Mol. Endocrinol 39, 343-350 (2007). Yazawa, T. et al. Differentiation of adult stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells. Endocrinology 147, 4104-4111 (2006). Gondo, S. et al. Adipose tissue-derived and bone marrow-derived mesenchymal cells develop into different lineage of steroidogenic cells by forced expression of steroidogenic factor 1. Endocrinology 149, 4717-4725 (2008). Gondo, S. et al. SF-1/Ad4BP transforms primary long-term cultured bone marrow cells into ACTH-responsive steroidogenic cells. Genes Cells 9, 1239-1247 (2004). Sonoyama, T. et al. Differentiation of human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells into steroid-producing cells. Endocrinology 153, 4336-4345 (2012).
　ステロイド産生量が多く、十分に特徴付けされたステロイド産生細胞を、中間中胚葉細胞から大量かつ効率的に分化誘導する必要がある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニスト等で処理すると、ステロイド産生細胞に分化誘導されることを見出し、本発明を完成させるに至った。併せて、３β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを指標とすることにより、ステロイドを産生する中間中胚葉細胞のスクリーニングを行うことができることも見出した。
　したがって、本発明は、以下に関するものである：
　（１）中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニスト、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびドパミンからなる群より選択される１またはそれ以上の物質で処理してステロイド産生細胞に分化誘導することを含む、ステロイド産生細胞の製造方法；
　（２）該物質がドパミンＤ１受容体アゴニストを含むものである、（１）記載の方法；
　（３）該物質がドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨを含むものである、（１）または（２）記載の方法；
　（４）ドパミンＤ１受容体アゴニストが下式（Ｉ）～（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、Ｒ１およびＲ２は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ３は（ＣＨ２）ｍＮＲｘＲｙであり（ここに、ＲｘおよびＲｙは独立して水素またはＣ１～３アルキルである）、ｍは１～３の整数であり、Ａは不飽和結合を有していてもよく、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい飽和または不飽和の炭素環式の基を意味する］、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）
［式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ６とＲ７は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいピロール環を形成し、Ｒ８は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｒ９は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキル、ハロゲン、ＣＨ２－Ｓ－Ｒａ（ここに、ＲａはＣ１－６アルキルである）、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは独立して水素またはＣ１－６アルキルであり、ｎは１～３の整数である）
であり、Ｒ１０は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ９とＲ１０は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環を形成する］、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ１４は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｂはヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環である］
で示される化合物、ならびにこれらの塩および溶媒和物からなる群より選択される１種またはそれ以上のものである、（１）～（３）のいずれかに記載の方法；
　（５）ドパミンＤ１アゴニストがＡ６８９３０、Ａ７７６３６、カベルゴリン、ＣＹ２０８－２４３、ペルゴリド、フェノルドパム、ＳＫＦ３８３９３、ＳＫＦ７７４３４、ＳＫＦ８３８２２、ＳＫＦ８３９５９、ＳＫＦ８１２９７、ＳＫＦ８２９５８、ならびにこれらの塩および水和物からなる群より選択される１種またはそれ以上のものである、（１）～（４）のいずれかに記載の方法；
　（６）中間中胚葉細胞が多能性幹細胞を分化誘導して得られたものである、（１）～（５）のいずれかに記載の方法；
　（７）中間中胚葉細胞がヒト由来のものである、（１）～（６）のいずれかに記載の方法；
　（８）中間中胚葉細胞が、ＳＦ－１遺伝子を強制発現されているものである、（１）～（７）のいずれかに記載の方法；
　（９）ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を製造するためのキット；
　（１０）３β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの発現を指標とすることを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する物質のスクリーニング方法；
　（１１）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で得られたステロイド産生細胞培養物；ならびに
　（１２）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で得られたステロイド産生細胞を含む医薬組成物。
　本発明によれば、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を大量かつ効率的に分化誘導することができる。したがって、多能性幹細胞からステロイド産生細胞に大量かつ効率的に分化誘導することができる。さらに、本発明によれば、ステロイドを産生する中間中胚葉細胞のスクリーニングを容易に行うことができる。
図１ａは、ＯＳＲ１＋細胞におけるステロイド産生酵素のｍＲＮＡ発現について調べた結果を示す。図１ｂは、ヒトｉＰＳ細胞由来の中間中胚葉細胞のステロイド産生細胞への分化を促進する称分子化合物のスクリーニング法を模式的に示す。図１ｃは、カベルゴリン処理された培養物およびコントロールの３β－ＨＳＤ陽性細胞の割合を示す。図１ｄは、カベルゴリン濃度依存的な３β－ＨＳＤ　ｍＲＮＡ発現を示す。 図２ａは、ＯＳＲ１＋細胞におけるドパミンＤ２受容体発現について調べた結果を示す。図２ｂは、ドパミンＤ２受容体アゴニストにてＯＳＲ１＋細胞を処理した場合の３β－ＨＳＤ発現を調べた結果を示す。図２ｃは、ドパミンＤ２受容体アンタゴニストであるメトクロプラミドをＯＳＲ１＋細胞に与えた影響を調べた結果を示す。 図３ａは、ＯＳＲ１＋細胞におけるドパミンＤ１受容体発現について調べた結果を示す。図３ｂは、ドパミンＤ１受容体アゴニストにてＯＳＲ１＋細胞を処理した場合の３β－ＨＳＤ発現を調べた結果を示す。図３ｃは、Ｄ１受容体アンタゴニスト（ＳＫＦ８３５６６）によって、カベルゴリンの促進効果がブロックされたことが示す。図３ｄは、カベルゴリンとＳＫＦ８３５６６との同時投与がカベルゴリンによるｃＡＭＰ増加に及ぼす影響について調べた結果を示す。 図４は、ＳＦ－１をトランスフェクションしなかったＯＳＲ１＋ＩＭ細胞およびＳＦ－１をトランスフェクションしたＯＳＲ１＋ＩＭ細胞におけるステロイド合成酵素遺伝子のｍＲＮＡ発現について調べた結果を示す。 図５は、ＳＦ－１をトランスフェクションしたＩＭ細胞におけるステロイド合成酵素のｍＲＮＡ発現に対するドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨの効果を調べた結果を示す。
　以下において本発明を説明するが、特に断らない限り、用語は再生医療や生化学分野において通常に理解されている意味に解される。
　本発明は、１の態様において、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニスト、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびドパミンからなる群より選択される１またはそれ以上の物質で処理してステロイド産生細胞に分化誘導することを含む、ステロイド産生細胞の製造方法を提供する。上記方法において、ドパミンＤ１受容体アゴニスト、ＡＣＴＨまたはドパミンをそれぞれ単独で用いてもよく、あるいはこれらのうち２つまたはこれらすべてを組み合わせて用いてもよい。上記物質およびそれらの組み合わせ以外の物質を併用して中間中胚葉細胞を処理してもよい。
　本発明の上記態様の１具体例において、上記物質はドパミンＤ１受容体アゴニストを含む。かかる具体例において、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストのみで処理してもよく、ドパミンＤ１受容体アゴニスト以外の物質を併用して中間中胚葉細胞を処理してもよい。
　本発明の上記態様のさらなる具体例において、上記物質はドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨを含む。かかる具体例において、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨのみで処理してもよく、ドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨ以外の物質を併用して中間中胚葉細胞を処理してもよい。ドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨにて中間中胚葉細胞を処理することについては、後ほど説明する。
　中間中胚葉細胞は、前腎、中腎、中腎管、後腎、副腎皮質および生殖腺へ分化しうる細胞である。中間中胚葉細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来である。
　本発明に用いられる中間中胚葉細胞は、すでに確立されている細胞（例えば研究機関などから分譲されたもの）であってもよく、あるいは多能性幹細胞から分化誘導されたものであってもよい。
　多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能であり、かつ、増殖能を併せ持つ幹細胞である。多能性幹細胞は当業者に公知であり、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植によって得られたクローン胚由来のＥＳ細胞（ｎｔ　ＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞およびｎｔ　ＥＳ細胞である。
　多能性幹細胞の作成方法も公知である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に核初期化因子を導入することにより得ることができる。核初期化因子は、基本的にはＯｃｔファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、Ｋｌｆファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、およびＭｙｃファミリー遺伝子または当該遺伝子産物を含む。これらの因子に加えて、Ｌｉｎ２８遺伝子または当該遺伝子産物、ｎａｎｏｇ遺伝子または当該遺伝子産物など体細胞に導入して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めてもよい。核初期化因子の体細胞への導入方法も公知である。また、核初期化因子導入後にヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤で細胞を処理することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めてもよい。核初期化因子を導入した体細胞の培養方法、ｉＰＳ細胞の検出・選択方法についても公知である。ｉＰＳ細胞は、例えば京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）などから入手することもできる。
　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出して培養することにより得ることができる。そのための手技や培養方法も公知である。ヒトＥＳ細胞は、例えば京都大学再生医科学研究所などから入手することもできる。
　多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法も公知である。例えばAraokaら、PLoS One: 9(1)(e84881) に記載された方法、Maeら、Nat. Commun. 4, 1367 (2013)に記載された方法などを用いることができる。多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への好ましい分化誘導方法として、日本国特許第５８９６３６０に記載された方法を用いてもよい。中間中胚葉細胞の好ましいマーカーとしては、Odd-skipped retaled 1（ＯＳＲ１）を用いることができる。例えば、ＯＳＲ１遺伝子にＧＦＰ遺伝子を連結したものをヒトｉＰＳ細胞に導入し、分化誘導し、セルソーターを用いて分取することにより、中間中胚葉細胞を得てもよい。
　ドパミン受容体は主に中枢神経系に分布しており、神経伝達物質であるドパミンと結合することにより様々な生理作用を引き起こす。ドパミンＤ１受容体は、現在知られている５つのドパミン受容体の１つである。Ｄ１受容体アゴニストは、ドパミンＤ１受容体に作用して、ドパミンと同様の機能を示す作動薬である。本発明において使用されるドパミンＤ１受容体アゴニストは、ドパミンＤ１受容体のみならずドパミンＤ２～Ｄ５受容体に作用するものであってもよい。また、本発明において使用されるドパミンＤ１受容体アゴニストは、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
　本発明において好ましく用いられるドパミンＤ１受容体アゴニストは下式（Ｉ）～（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ３は（ＣＨ２）ｍＮＲｘＲｙであり（ここに、ＲｘおよびＲｙは独立して水素またはＣ１～３アルキルである）、ｍは１～３の整数であり、Ａは不飽和結合を有していてもよく、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい飽和または不飽和の炭素環式の基を意味する］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）
［式中、式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ６とＲ７は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいピロール環を形成し、Ｒ８は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｒ９は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキル、ハロゲン、ＣＨ２－Ｓ－Ｒａ（ここに、ＲａはＣ１－６アルキルである）、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは独立して水素またはＣ１－６アルキルであり、ｎは１～３の整数である）
であり、Ｒ１０は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ９とＲ１０は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環を形成する］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ１４は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｂはヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環である］
で示される化合物、ならびにこれらの塩および溶媒和物からなる群より選択される１種またはそれ以上のものであるが、これらに限定されない。
　式（Ｉ）で示される好ましい化合物の例としては、Ｒ１が水素またはヒドロキシ、Ｒ２が水素またはヒドロキシ、Ｒ３がＣＨ３ＮＨ２、Ａがヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環またはアダマンチル環である化合物が挙げられる。式（Ｉ）で示される好ましい化合物の具体例としては、Ａ６８９３０およびＡ７７６３６などが挙げられるが、これらに限定されない。
　式（ＩＩ）で示される好ましい化合物の例としては、Ｒ４が水素またはヒドロキシ、Ｒ５が水素またはヒドロキシ、Ｒ６が水素、Ｒ７が水素、あるいはＲ６とＲ７が一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいピロール環を形成、Ｒ８が素またはＣＨ２ＣＨＣＨ２、Ｒ９がＣＨ２－Ｓ－ＣＨ３または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 であり、Ｒ１０が水素、あるいはＲ９とＲ１０が一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環を形成する化合物が挙げられる。式（ＩＩ）で示される好ましい化合物の具体例としては、カベルゴリン、ＣＹ２０８－２４３、ペルゴリド、ジヒドレキシジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　式（ＩＩＩ）で示される好ましい化合物の例としては、Ｒ１１が水素またはハロゲン、Ｒ１２が水素またはヒドロキシ、Ｒ１３が水素またはヒドロキシ、Ｒ１４が水素、メチルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２である化合物が挙げられる。式（ＩＩＩ）で示される好ましい化合物の具体例としては、フェノルドパム、ＳＫＦ３８３９３、ＳＫＦ７７４３４、ＳＫＦ８３８２２、ＳＫＦ８３９５９、ＳＫＦ８１２９７、ＳＫＦ８２９５８などが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記化合物の塩または溶媒和物を用いてもよい。上記化合物の塩としては、塩酸塩、臭化水素塩、マレイン酸塩、メシル酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化合物の溶媒和物としては水和物などが挙げられるが、これに限定されない。
　本発明で用いられる式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の化合物において、ハロゲンは塩素、臭素およびヨウ素を含む。Ｃ１－６アルキルは炭素数１個ないし６個のアルキル基を意味する。本発明で用いられる式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の化合物は、すべての構造異性体および立体異性体を含む。
　ドパミンＤ１受容体アゴニストにて処理される中間中胚葉細胞は純化された細胞集団として提供されてもよく、他の種類の細胞を含む細胞集団として提供されてもよい。
　中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストで処理するとは、中間中胚葉細胞のドパミンＤ１受容体とドパミンＤ１アゴニストが相互作用しうる状態に置くことを意味する。典型的には、中間中胚葉細胞とドパミンＤ１アゴニストを接触させることにより、より典型的には、ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む培地にて中間中胚葉細胞を培養することにより、中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストで処理することができる。
　中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストで処理してステロイド産生細胞に分化誘導する際の培地は、ドパミンＤ１受容体アゴニストを含んでいればいずれの動物細胞培養用培地であってもよく、ＥＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、およびこれらの改変培地、ならびにこれらの混合培地などが例示されるが、これらに限定されない。接着培養を行う場合は、コーティング剤で処理された培養容器を用いることができる。コーティング剤としては、マトリゲルＴＭ、コラーゲン、ゼラチンなど、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　培地中のドパミンＤ１受容体アゴニストの量は、細胞のステロイド合成酵素遺伝子の発現および／または酵素活性、ならびに／あるいは細胞から生成されるステロイド類の量を測定することによって、適宜決定することができる。一般的には、培地中のドパミンＤ１受容体アゴニストの量は約０．１μＭ～数十μＭとすることができる。
　ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む培地にて中間中胚葉細胞を培養してステロイド産生細胞に分化誘導するための諸条件も適宜定めうる。例えばドパミンＤ１受容体アゴニストを含む培地中、３７℃、５～１０％二酸化炭素の存在下、約２日～約３０日培養してもよい。さらに、必要に応じて細胞を継代培養してもよい。
　本発明において、１種類のドパミンＤ１受容体アゴニストを用いてもよく、２種類以上のドパミンＤ１受容体アゴニストを用いてもよい。
　細胞におけるステロイド合成酵素遺伝子の発現は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）などの方法を用いて測定することができる。ステロイド合成酵素の例としては、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１７および３β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３β－ＨＳＤ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ステロイド合成酵素の活性測定方法も公知である。培地に分泌されたステロイド類は、例えばエンザイムイムノアッセイによって測定することができる。かかるエンザイムイムノアッセイ用のキットも市販されている。
　本発明におけるステロイド産生細胞は、ドパミンＤ１受容体アゴニストで処理されて分化誘導された中間中胚葉細胞であって、ドパミンＤ１受容体アゴニストで処理されずに分化誘導された場合と比較して、ステロイド類の産生能が全体として上昇している細胞である。ステロイド類の例としては、コルチゾールなどの糖質コルチコイド、アルドステロンなどの鉱質コルチコイド、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、テストステロンなどのアンドロゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のステロイド産生細胞の製造方法において、ドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨにて中間中胚葉細胞を処理することによって、細胞からのステロイド産生量をさらに増大させることができる。中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニストで処理すると同時、あるいはその前または後に、中間中胚葉細胞をＡＣＴＨで処理してもよい。通常は、ドパミンＤ１受容体アゴニストとＡＣＴＨを含有する培地にて中間中胚葉細胞を培養して、ステロイド産生細胞へ分化誘導する。
　培地に添加するＡＣＴＨの量は、例えば分化誘導された細胞が産生するステロイド類の量を測定することにより、適宜定めうるが、一般的には、約０．１μＭ～数十μＭとすることができる。
　また、本発明のステロイド産生細胞の製造方法において、ＳＦ－１を強制発現された中間中胚葉細胞を用いることにより、ステロイド産生量をさらに増大させることができる。ＳＦ－１はステロイド合成遺伝子の転写における主たるレギュレーターである。ＳＦ－１の強制発現は、発現ベクターを用いるトランスフェクションなどの公知の方法にて行うことができる。
　本発明は、もう１つの態様において、ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を製造するためのキットを提供する。本発明のキットは、ドパミンＤ１受容体アゴニストのほかに、中間中胚葉細胞、培養容器、培地などを含んでいてもよい。通常は、取扱説明書がキットに添付される。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、３β－ＨＳＤの発現量を指標とすることを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する物質のスクリーニング方法を提供する。３β－ＨＳＤは副腎皮質ホルモン合成に必須の酵素であるので、この酵素の発現量と、細胞のステロイド生成能との間に相関関係がある。この酵素の発現量は、例えばｑＲＴ－ＰＣＲなどを用いて測定することができる。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、３β－ＨＳＤの発現量を測定するための手段を含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する物質のスクリーニング用キットを提供する。該キットは、例えば３β－ＨＳＤの発現量を測定するためのｑＲＴ－ＰＣＲに必要なプライマー等を含んでいてもよい。通常は、取扱説明書がキットに添付される。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞培養物を提供する。当業者は、培養方法および培養条件を適宜選択して、ステロイド産生細胞の培養を行うことができる。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞を含む医薬組成物を提供する。当業者は、担体や賦形剤、添加剤等を適宜選択して、本発明の医薬組成物を製造することができる。本発明の医薬組成物を、副腎機能不全の治療に用いてもよい。したがって、本発明は、この態様の一具体例において、副腎機能不全の治療のための、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞を含む医薬組成物を提供する。
　本発明は、さらなる態様において、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞を副腎機能不全の患者に投与することを含む、該患者における副腎機能不全の治療方法を提供する。
本発明は、さらなる態様において、副腎機能不全の治療のための医薬の製造における、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞の使用を提供する。
　本発明は、さらなる態様において、副腎機能不全の治療のために使用される、本発明の製造方法で得られたステロイド産生細胞を提供する。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
　１．中間中胚葉細胞（ＩＭ細胞）の３β－ＨＳＤ陽性度を上昇させる小分子化合物のスクリーニング
　この実験は、ヒトｉＰＳ細胞由来のＩＭ細胞のステロイド産生細胞への分化を促進する小分子化合物をスクリーニングするためのものであった。この目的のために、ＧＦＰ遺伝子と一緒にＯＳＲ１遺伝子がノックインされたヒトｉＰＳ細胞株（３Ｄ４５）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞から、Maeら、Nat. Commun. 4, 1367 (2013)に記載された方法に従って、胚様体（ＥＢ）形成を経由してＯＳＲ１陽性（ＯＳＲ１＋）ＩＭ細胞を誘導した。先ず、ＩＭ細胞がステロイド産生細胞へと誘導されたことを示す適切なマーカーを決定するために、上記ＯＳＲ１＋細胞におけるステロイド産生酵素のｍＲＮＡ発現について調べた。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析により、ＳｔＡＲおよび３β－ＨＳＤのｍＲＮＡ発現が示されたが、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）１１Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７などの他のステロイド合成酵素のｍＲＮＡ発現はＩＭ細胞において示されなかった（図１ａ）。３β－ＨＳＤは副腎皮質ホルモンの生成に必須の酵素であるので、これを適切なマーカーであると考えた。そして３β－ＨＳＤの免疫染色を用いて、ヒトｉＰＳ細胞由来のＩＭ細胞のステロイド産生細胞への分化を促進する小分子化合物の１次スクリーニングを行った。図１ｂにその概要を示す。
　このスクリーニングのための出発材料を集めるために、Maeら、Nat. Commun. 4, 1367 (2013)に記載された方法に従って、胚様体（ＥＢ）形成を経由してＩＭ細胞を誘導した。単離されたＯＳＲ１－ＧＦＰ＋細胞を３４８ウェルプレートに播き（８０００個／ウェル）、翌日に各化合物を各ウェルに添加した。化合物添加から４日後に、細胞を３β－ＨＳＤ抗体にて染色した。担体（１％　ＤＭＳＯ）で処理した細胞よりも１０倍以上の３β－ＨＳＤ陽性度（％）を示したウェルを、１次スクリーニングでのヒットと見なした。３６４８種の化合物を調べた結果、８種の化合物がヒットした。次に、自己蛍光を有する化合物および細胞毒性を有する化合物を除外した。その結果、カベルゴリンだけが残った。カベルゴリン処理された培養物の３β－ＨＳＤ陽性細胞の割合は１．５９％で、ＤＭＳＯ処理されたコントロール（０．０７±０．０１％）よりも高かった（図１ｃ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によっても、試験した濃度（カベルゴリン１ｎＭ～２０μＭ）において用量依存的に３β－ＨＳＤ ｍＲＮＡ発現が増加したことが示された（図１ｄ）。
　２．カベルゴリンが３β－ＨＳＤ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートする機構
　カベルゴリンは、ドパミンＤ２受容体の有効かつ高親和性アゴニストとして知られている。したがって、ＯＳＲ１＋細胞においてドパミンＤ２シグナリングが３β－ＨＳＤ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートしたと考えられた。そこで、ＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＯＳＲ１＋細胞におけるドパミンＤ２受容体の発現について調べたところ、その発現レベルはヒト副腎と同等であることがわかった（図２ａ）。次に、他のドパミンＤ２受容体アゴニスト（１０μＭ　キンピロール、１μＭ　ブロモクリプチンおよび１０μＭ　プロピルノルアポモルフィン）にてＯＳＲ１＋細胞を４日間処理することにより、それらの効果について調べた。しかしながら、いずれのアゴニストもＯＳＲ１＋細胞のステロイド産生細胞への分化を促進しなかった（図２ｂ）。さらに、カベルゴリンの分化促進効果は、１０μＭのメトクロプラミド（ドパミンＤ２受容体アンタゴニスト）を毎日細胞に与えるによっては影響を受けなかった（図２ｃ）。これらの結果から、カベルゴリンによるステロイド産生細胞への分化促進は、そのドパミンＤ２受容体アゴニスト活性によるものではないと考えられた。さらに、カベルゴリンは、ドパミンＤ２受容体に対して非常に高い親和性を有するにもかかわらず、比較的高濃度で分化を改善したことも考えると、カベルゴリンの分化促進活性は、ドパミンＤ１受容体に対して低い親和性を有するアゴニストとして作用することによるものと考えられた。
　上記の考えを証明するために、ＯＳＲ１＋細胞におけるドパミンＤ１受容体発現について調べた。先ず、ＲＴ－ＰＣＲ分析を行ったところ、ドパミンＤ１受容体は未分化ヒトｉＰＳ細胞において発現されていなかったが、ＯＳＲ１＋細胞において発現されていた（図３ａ）。次に、３種類のドパミンＤ１受容体アゴニスト（１０μＭ　ペルゴリド、１０μＭ　Ａ６８９３０、１μＭ　ＳＫＦ８３８２２）でＯＳＲ１＋細胞を４日間処理し、いずれもが３β－ＨＳＤ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートすることを確認した（図３ｂ）。さらに、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行ったところ、Ｄ１受容体アンタゴニスト（１０μＭ　ＳＫＦ８３５６６）によって、カベルゴリン（２０μＭ）の促進効果がブロックされたことが示され（図３ｃ）、カベルゴリンがドパミンＤ１受容体を活性化することによって３β－ＨＳＤ ｍＲＮＡ発現を促進することが示唆された。次に、カベルゴリンがドパミンＤ１受容体活性化によって作用することを確認するために、カベルゴリンおよびＳＫＦ８３５６６にて細胞を処理した後、ドパミンＤ１受容体の第２のメッセンジャーとして知られる細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のアッセイを行った。カベルゴリンは細胞内ｃＡＭＰを有意に増加させたが、ＳＫＦ８３５６６との同時投与によって、カベルゴリンによるｃＡＭＰ増加は見られなくなった（図３ｄ）。これらの結果を総合すると、ドパミンＤ１受容体シグナリングによって細胞内ｃＡＭＰが増加して、ステロイド産生細胞への分化が促進されることがわかった。
　３．ＯＳＲ１＋細胞へのＳＦ－１トランスフェクション
　これまでの実験において、ドパミンＤ１受容体アゴニストを用いて分化誘導されたＯＳＲ１＋細胞では３β－ＨＳＤ以外のステロイド合成酵素のｍＲＮＡ発現の促進は見られなかった（データ示さず）。その理由として、これらの細胞におけるステロイド合成酵素の発現が全般的に低いので検出できなかったことが考えられた。本発明者らは、ステロイド合成遺伝子の転写における主たるレギュレーターであるＳＦ－１が、ヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞由来の中胚葉細胞をステロイド産生細胞に分化誘導することを見出している。そこで、ＳＦ－１をＯＳＲ１＋細胞にトランスフェクションし、ドパミンＤ１受容体アゴニストの効果を調べることにした。
　トランスフェクションは、サイトメガロウイルスプロモーターにより駆動されるＳＨ－Ｆ－１をコードする発現プラスミド（pCMFlag-hsNR5A1;RIKEN BRC, Saitama, Japan）２μｇを、約５ｘ１０５個のＯＳＲ１＋ＩＭ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、NucleofectorTM（Lonza, Basel, Switzerland）によるエレクトロポレーションを用いて行った。トランスフェクション効率は約６０％であった。
　ＳＦ－１をトランスフェクションしなかったＯＳＲ１＋ＩＭ細胞およびＳＦ－１をトランスフェクションしたＯＳＲ１＋ＩＭ細胞におけるステロイド合成酵素遺伝子のｍＲＮＡ発現について調べた結果を図４に示す。ＳＦ－１をトランスフェクションしなかったＯＳＲ１＋ＩＭ細胞において、カベルゴリン（２０μＭ）は３β－ＨＳＤおよびＳｔＡＲのｍＲＮＡ発現レベルを上昇させた。ＳＦ－１をトランスフェクションしなかったＯＳＲ１＋ＩＭ細胞において、ＳＫＦ８３８２２（１μＭ）は３β－ＨＳＤ、ＳｔＡＲおよびＣＹＰ１１Ｂ１のｍＲＮＡ発現レベルを上昇させた。ＳＦ－１をトランスフェクションしたＯＳＲ１＋ＩＭ細胞では、様々なステロイド合成酵素のｍＲＮＡ発現レベルが上昇していた。また、ＲＴ－ＰＣＲ分析により、これらのＩＭ細胞においてＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）受容体が出現していることも確認された（データ示さず）。
　４．ＳＦ－１をトランスフェクションしたＩＭ細胞におけるステロイド合成酵素のｍＲＮＡ発現に対するドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨの効果
　上記の実験結果に基づいて、ドパミンＤ１受容体アゴニストであるＳＫＦ８３８２２の効果について、ＡＣＴＨ刺激の存在下において調べた。ＳＦ－１をトランスフェクションしたＯＳＲ１＋ＩＭ細胞を、１μＭのＳＫＦ８３８２２、２．４μＭのＡＣＴＨ、１０μＭのＳＫＦ８３５６６の組み合わせにて２４時間処理した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＳｔＡＲ、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７および３β－ＨＳＤのｍＲＮＡ発現レベルがＳＫＦ８３８２２によりアップレギュレートされたことが示された。そして、これらの効果はＡＣＴＨ刺激によって相乗的に促進されたことが示された。さらに、ＳＫＦ８３８２２の促進効果は、ドパミンＤ１受容体アンタゴニストであるＳＫＦ８３５６６によって完全にブロックされた。ＡＣＴＨのみで処理された細胞においてもＳｔＡＲ、３β－ＨＳＤおよびＣＹＰ１１Ｂ１の発現が有意にアップレギュレートされた。これらの結果を図５に示す。
　ＳＦ－１をトランスフェクションしたＯＳＲ１＋ＩＭ細胞を、１μＭのＳＫＦ８３８２２、２．４μＭのＡＣＴＨの組み合わせとともに２日間培養を行った後培地中に分泌されたステロイドホルモンを測定した。実験は５系で行った（ｎ＝５）。有意な量のコルチゾール、アルドステロンおよびデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の産生が見られた。コルチゾールの分泌は、ＳＫＦ８３８２２およびＡＣＴＨの両用に応答して有意に増加した。ＳＫＦ８３８２２とＡＣＴＨの組み合わせにて処理された細胞は、アルドステロンおよびＤＨＥＡの産生を有意に増加させた。これらの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 ＊コントロールに対してＰ＜０．０５
＊＊コントロールに対してＰ＜０．０１
＋ＡＣＴＨに対してＰ＜０．０５
　本発明は、再生医療や疾病の研究に用いる細胞の製造の分野などにおいて非常に有用である。

Claims (12)

  1. 　中間中胚葉細胞をドパミンＤ１受容体アゴニスト、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびドパミンからなる群より選択される１またはそれ以上の物質で処理してステロイド産生細胞に分化誘導することを含む、ステロイド産生細胞の製造方法。
  2. 　該物質がドパミンＤ１受容体アゴニストを含むものである、請求項１記載の方法。
  3. 　該物質がドパミンＤ１受容体アゴニストおよびＡＣＴＨを含むものである、請求項１または２記載の方法。
  4. 　ドパミンＤ１受容体アゴニストが下式（Ｉ）～（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
    ［式中、Ｒ１およびＲ２は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ３は（ＣＨ２）ｍＮＲｘＲｙであり（ここに、ＲｘおよびＲｙは独立して水素またはＣ１～３アルキルである）、ｍは１～３の整数であり、Ａは不飽和結合を有していてもよく、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい飽和または不飽和の炭素環式の基を意味する］、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）
    ［式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ６とＲ７は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいピロール環を形成し、Ｒ８は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｒ９は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキル、ハロゲン、ＣＨ２－Ｓ－Ｒａ（ここに、ＲａはＣ１－６アルキルである）、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは独立して水素またはＣ１－６アルキルであり、ｎは１～３の整数である）
    であり、Ｒ１０は水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであるか、あるいはＲ９とＲ１０は一緒になってヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環を形成する］、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
    ［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は独立して水素、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンであり、Ｒ１４は水素、Ｃ１－６アルキルまたはＣＨ２ＣＨＣＨ２であり、Ｂはヒドロキシ、Ｃ１－６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環である］
    で示される化合物、ならびにこれらの塩および溶媒和物からなる群より選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　ドパミンＤ１アゴニストがＡ６８９３０、Ａ７７６３６、カベルゴリン、ＣＹ２０８－２４３、ペルゴリド、フェノルドパム、ＳＫＦ３８３９３、ＳＫＦ７７４３４、ＳＫＦ８３８２２、ＳＫＦ８３９５９、ＳＫＦ８１２９７、ＳＫＦ８２９５８、ならびにこれらの塩および水和物からなる群より選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　中間中胚葉細胞が多能性幹細胞を分化誘導して得られたものである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　中間中胚葉細胞がヒト由来のものである、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　中間中胚葉細胞が、ＳＦ－１遺伝子を強制発現されているものである、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　ドパミンＤ１受容体アゴニストを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を製造するためのキット。
  10. 　３β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの発現を指標とすることを含む、中間中胚葉細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する物質のスクリーニング方法。
  11. 　請求項１～８のいずれか１項記載の方法で得られたステロイド産生細胞培養物。
  12. 　請求項１～８のいずれか１項記載の方法で得られたステロイド産生細胞を含む医薬組成物。
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