WO2018115723A1 - Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques - Google Patents

Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques Download PDF

Info

Publication number
WO2018115723A1
WO2018115723A1 PCT/FR2017/053707 FR2017053707W WO2018115723A1 WO 2018115723 A1 WO2018115723 A1 WO 2018115723A1 FR 2017053707 W FR2017053707 W FR 2017053707W WO 2018115723 A1 WO2018115723 A1 WO 2018115723A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
opening
well
microscope slide
support
Prior art date
Application number
PCT/FR2017/053707
Other languages
English (en)
Inventor
Gaelle Recher
Kévin Alessandri
Laetitia ANDRIQUE
Pierre Nassoy
Maxime FEYEUX
Andréas BIKFALVI
Original Assignee
Universite de Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale - Inserm
Institut D'optique Graduate School
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Bordeaux, Centre National De La Recherche Scientifique, Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale - Inserm, Institut D'optique Graduate School filed Critical Universite de Bordeaux
Publication of WO2018115723A1 publication Critical patent/WO2018115723A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of devices and methods for culturing and observing biological samples.
  • biological sample is understood to mean 3D biological cells such as spheroids, organoids or cell aggregates (3D cells), embryos or even capsules containing biological cells.
  • optical microscope sample holder adapted to visualize, for example, the spatial and temporal evolution of living biological organisms or to image fixed samples, as exemplary PFA type markers and marked by any type of microscope.
  • marker such as antibodies against proteins.
  • Optical microscopy is commonly used in biology or biomedicine for the visualization of biological processes in biological organisms or cells.
  • Different fields of biology including developmental biology, stem cells, tissue engineering or biophysics are interested in the study and analysis of processes at the cellular level.
  • these analyzes require the acquisition of images of high spatial and temporal resolution, in a repetitive manner, in large quantities and with a sufficient yield to allow a reliable statistical analysis.
  • Current optical microscopes offer different imaging techniques and configurations such as confocal, multi-photon or rotating disk microscopy that provide excellent spatial and temporal resolution for the study of a particular sample.
  • these microscopy devices do not allow to mount and automatically process a large number of biological samples with a high yield.
  • culture chambers for example of the petri dish type, which make it possible to grow living biological samples in a liquid culture medium.
  • biological samples have a wide variety of shape, size and development conditions.
  • the zebrafish larvae have an elongated shape and are very tolerant with respect to the culture conditions.
  • Other embryos have a spherical shape but are more demanding in terms of culture conditions.
  • Another category of three-dimensional biological samples includes multicellular aggregates, spheroids, organoids, embryos and capsules containing biological cells.
  • the present invention proposes a chamber for culturing and imaging biological samples by optical microscopy, said culture and imaging chamber comprising a support and a cover.
  • the support comprising at least one inner housing, at least one microscope slide disposed facing an opening formed in the support or in the cover facing said inner housing, a seal disposed between the support and the cover in contact with said at least one microscope slide, the seal delimiting at least one other opening arranged facing to the microscope slide, a hydrogel layer disposed within said other seal opening, the hydrogel layer comprising an array of open wells formed at predetermined three-dimensional positions in a bound orthonormal coordinate system to the support, each well being adapted to receive a biological sample, the support, the cover and the seal being configured to be secured to form a culture and liquid-tight imaging chamber.
  • This culture and imaging chamber is compatible with imaging on many microscopes, is inexpensive to manufacture, easy to assemble, to transport, while ensuring liquid tightness and gas permeability of the medium in culture. It allows to individually position biological samples with micrometric precision without applying mechanical stress on these biological samples.
  • the culture and imaging chamber comprises the mechanical holding means adapted to maintain the seal between the support and the cover.
  • the wells are of millimeter or sub-millimeter dimensions or even up to micrometric dimensions;
  • the support and / or the seal comprises a plurality of compartments sealed relative to each other, at least one sealed compartment comprising said hydrogel layer and said well network;
  • the support comprises a first opening
  • the lid comprises a second opening
  • said at least one microscope slide comprising a first microscope slide disposed opposite the first opening and a second microscope slide disposed opposite the second opening, the gasket sealing being in contact with the first microscope slide and the second microscope slide
  • the lid is opaque or the cover has a second opening
  • said at least one microscope slide comprises a second microscope slide disposed opposite the second opening and a reflective or dichroic optical component disposed in the inner housing of the support
  • the support is opaque or the support comprises a first opening, said at least one microscope slide comprising a first microscope slide facing the first opening and in which the cover is opaque or comprises a reflective or dichroic optical component;
  • the network of open wells is arranged in a grid having a predefined pitch in one or two transverse directions in the orthonormal coordinate system;
  • the well network comprises at least one open well having a parallelepiped shape, a cylindrical shape, a frustoconical shape, a flared shape or a closed form at a well opening;
  • the well network comprises at least one well having a wall inclined with respect to a horizontal surface of the hydrogel layer of an angle greater than 0 degrees and less than 135 degrees, or 1 10 degrees or preferably less than 100; degrees, said horizontal surface of the hydrogel layer being the one where the openings of the wells are;
  • the well network comprises at least one well having a flat or concave bottom formed in the hydrogel layer and / or at least one well having a bottom formed by a microscope slide surface;
  • the hydrogel layer comprises a plurality of registration marks, each registration mark being disposed near a well and being configured to identify this well;
  • a bowl is formed in the hydrogel layer and is adapted to receive an immersion liquid
  • the support, the cover and the seal are formed by molding or by three-dimensional printing from polymeric, preferably biocompatible materials;
  • the rigid support has several openings and is adapted to receive a microscope slide facing each support opening;
  • the support comprises a partition separating the inner housing into sealed compartments, each compartment comprising a seal and a microscope slide;
  • the seal has a rectangular or square section
  • the support comprises at least one lateral fin adapted to receive a microscope slide fixation clamp on an optical microscope sample holder and to hold the support on the optical microscope sample holder;
  • the microscope slide is made of glass, of polymer material and / or comprises a thin-film coating adapted to increase the adhesion of a biological sample;
  • the invention also proposes a method for manufacturing a culture chamber and imaging biological samples by microscopy comprising the following steps:
  • a gelled hydrogel layer comprising the imprint of the plurality of protrusions of the buffer and forming an array of wells of dimensions equal to the dimensions of the protrusions of the buffer ;
  • FIG. 1 represents an exploded view of the components of a culture and imaging chamber according to one embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows an exploded view of the elements of a mold to form a seal
  • FIG. 3 shows top views and in section along the line A-A and along the line B-B of an example of a seal
  • FIG. 4 represents a perspective view of an example of a buffer provided with a network of projections for forming a network of wells by impression in a hydrogel layer;
  • FIG. 5 represents views from above and, respectively, in section along the line A-A and the line B-B, of an example of a stamp for imprint marking a network of wells in a hydrogel layer;
  • FIG. 6 shows detail views of an example of projection for forming a well of flared shape
  • FIG. 7 shows detail views of another example of projection to form a well rectangular parallelepiped shape
  • FIG. 8 illustrates the steps of construction of a culture and imaging chamber according to one embodiment of the invention
  • FIG. 9 represents examples of support and seals forming watertight compartments according to another embodiment of the invention.
  • FIG. 10A shows a view of a detail of an exemplary stamp
  • FIG. 10B a view of a detail of a hydrogel layer in which is formed by imprinting the pad of FIG. 10A well network with local locator marks associated with each well;
  • FIG. 11 illustrates, for microscopy, an example of a well
  • FIG. 12 schematically illustrates an exemplary method for transferring biological objects from a culture dish to the wells of a culture and imaging chamber
  • FIG. 13 illustrates the positioning of a culture and imaging chamber on an optical microscope sample holder
  • FIG. 14 represents a reconstructed image from 70 images of optical microscopy according to a rectangular grid of steps, each well comprising a biological capsule;
  • FIG. 16 represents an example of a well for an experiment on a biological capsule and the trajectories of several cellular nuclei within this capsule;
  • FIG. 17 represents another example of a well network for an experiment on zebrafish larvae.
  • the present disclosure provides a culture and imaging chamber that can be fully manufactured and assembled by the user from common components such as microscope slides, inexpensive materials, such as a hydrogel (eg agarose). , methylcellulose, phytagel) and an elastomer (eg silicone) and parts manufactured by stereolithography in 3D using a 3D printer having a resolution of at least 50 ⁇ in each direction and using a resin.
  • a hydrogel eg agarose
  • an elastomer eg silicone
  • the resin used is a biocompatible resin.
  • FIG. 1 there is shown the components of a culture chamber and imaging according to one embodiment of the invention.
  • the various components are here removed and placed next to each other in a reference (XYZ).
  • the culture and imaging chamber comprises a support 1, a first microscope slide 2, a hydrogel layer 6, a seal 4, a cover 5 and a second microscope slide 12.
  • a vertical direction is a direction parallel to the axis OZ, the longitudinal plane is perpendicular to the vertical direction.
  • the support 1 has a length of 76 mm and a width of 26 mm which correspond to the dimensions of a conventional microscope slide.
  • the support 1 comprises a flat bottom parallel to the longitudinal plane having an opening January 1 and lower flanges 51 defining the opening 1 January.
  • the support also comprises walls 41 extending in the vertical direction on four sides transversely to the bottom over a height of a few millimeters and upper edges 71.
  • the bottom of the support is adapted to receive a lamella microscope 2 having a length of 50 mm and a width of 24 mm.
  • the opening 1 1 is here rectangular of length and width respectively smaller than the length and the width of the microscope slide 2.
  • the edges 51 of the bottom and the walls 41 of the support 1 thus form an inner housing 61 adapted to receive and hold the microscope slide 2 facing the opening 1 1.
  • the opening 1 1 of the support 1 thus provides optical access to the inner housing 61.
  • the support 1 here comprises two outer fins 21 arranged in the extension of the length of the support to allow manipulation or fixing the culture chamber and imaging on a microscope sample holder.
  • the lid 5 is generally rectangular in shape and has a flat top face and edges 45.
  • the edges 45 extend transversely in the vertical direction to the top face 35 of the lid on four sides to form a skirt.
  • the edges 45 of the cover 5 are adapted to fit on the upper flanges 71 of the support 1.
  • the upper face 35 of the cover here comprises an opening 15 of rectangular shape, having a length of about 44 mm and a width of about 18 mm respectively, which are less than the length and respectively the width of a microscope slide. standard.
  • a slot 25 is formed in one of the edges of the cover to allow the insertion of the second microscope slide 12.
  • the cover comprises guide rails for guiding and holding the lamella 12 in the cover 5.
  • the lamella 12 completely covers the opening 15 of the lid.
  • the lid and the support are held together, reversibly and tightly, through the seal 4. More specifically, the cover engages the edges of the seal 4 which protrude outside the inner housing 61.
  • the opening 15 of the cover 5 provides optical access to the inner housing 61.
  • the opening 15 of the cover 5 is aligned with the opening 1 1 of the support 1.
  • the cover 5 and the support 1 are preferably manufactured by stereolithography in 3D, for example by means of an Envision City Micro-Plus Hi-Re type printer having a resolution of at least 50 ⁇ and preferably 25 ⁇ in each direction in each direction.
  • a biocompatible resin such as HTM140 resin from Envision City is used.
  • the resin has a low viscosity before photo-polymerization and high rigidity after polymerization.
  • the support 1 and the lid 5 can be sterilized by autoclave a large number of times.
  • the lid is removable for example to change the contents of the culture chamber and imaging or change the culture liquid.
  • the seal 4 is preferably a silicone seal, for example polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the seal here has the general shape of a frame 14 of rectangular section surrounding a rectangular opening 34.
  • the seal 4 is preferably formed by molding.
  • the seal 4 has a thickness dimensioned so that it bears in a continuous and closed line on the first microscope slide 2 and in another continuous and closed line on the second microscope slide 12, when the cover 5 is attached to the support 1.
  • the lower part of the frame 14 of the seal forms a flange 94.
  • the flange is dimensioned so that when the seal 4 is placed in abutment on the first microscope slide in the inner housing 61, the upper part of the frame 14 exceeds the walls 41 of the support.
  • the edges 45 of the cover engage on the upper part of the frame 14 to maintain the cover fixed on the support sealingly.
  • the seal 4 for example PDMS, can also be sterilized by autoclave a large number of times.
  • the various elements of the device, apart from the hydrogel layer, are autoclavable individually and / or assembled.
  • the hydrogel layer 6 comprises a network of open wells formed by stamping or imprint marking.
  • the hydrogel layer 6 is preferably an agarose gel.
  • Agarose has several advantages as a carrier for forming wells, including being easy to model, transparent in the visible range, and neutral for most living biological samples.
  • the hydrogel layer consists of a phytogel, a methylcellulose gel, an alginate gel or a fluorinated polymer.
  • the hydrogel layer 6 is intended to be positioned on the first microscope slide 2 and inside the seal 4.
  • the seal 4 is a gas-tight seal vis-à-vis a dipping liquid.
  • the volume delimited by the two slats microscope 2, 12 and the gasket 4 is a volume which is leakproof vis-à-vis a liquid immersion, but which allows gas exchange.
  • the hydrogel layer is disposed within this volume.
  • the first microscope slide 2 makes it possible, for example, to visualize the hydrogel layer 6 by means of an inverted microscope.
  • the second microscope slide 12 makes it possible, for example, to visualize the hydrogel layer 6 by means of a right microscope. There is thus a culture chamber and imaging that is liquid tight and gas permeable.
  • the culture chamber and imaging is easily removable.
  • the support 1, the cover 5 and the seal 4 can be sterilized for reuse.
  • the microscope slides 2, 12 are inexpensive.
  • the hydrogel layer is easy to manufacture and also inexpensive.
  • the hydrogel layer is part of the consumable elements.
  • FIG 2 illustrates an example of a molding device for forming a seal.
  • the molding device comprises an outer frame 74, an inner frame 64 and a cross 84 for positioning the inner frame 64 relative to the outer frame 74.
  • the mounted molding device is shown.
  • a liquid PDMS resin eg Sylgard 184, Corning mixed with 10% curing agent
  • the seal 4 is removed from the molding device.
  • Figure 3 shows top views and in section along the lines BB and CC of a seal 4 thus obtained.
  • the seal 4 has a large rectangular aperture 34 about 18 mm wide and 45 mm long.
  • the seal 4 has a total thickness of about 7 mm.
  • the gasket 4 advantageously comprises a flat lower surface 44 and a flat upper surface 54.
  • the seal 4 is placed on the first microscope slide 2 in the housing 61 of the support 1, so that the lower surface 44 forms a continuous and closed contact line with the upper surface of the first lamella 2 of microscope.
  • the second microscope slide 12 being inserted into the cover 5, the cover 5 is placed on the support 1 so as to close the culture and imaging chamber.
  • the upper surface 54 of the seal 4 forms another continuous and closed line of contact with the lower surface of the second microscope slide 12.
  • No adhesive is used between the different components of the culture chamber and the imaging. This results in a culture chamber and waterproof imaging without glue which avoids any risk of contamination of biological samples inside the culture chamber and imaging.
  • a buffer 13 is made comprising a plurality of raised projections.
  • the pad is then used to stamp a well array in a hydrogel layer.
  • the buffer 13 is preferably manufactured by stereo-lithography in 3D using a 3D printer having a resolution of at least 50 ⁇ and preferably 25 ⁇ in each direction.
  • a 3D printer having a resolution of at least 50 ⁇ and preferably 25 ⁇ in each direction.
  • the Envision City Micro-Plus Hi-Re type printer and a biocompatible resin such as Envision City's HTM140 resin are used.
  • Figures 4-5 illustrate an example of buffer 13 having a plurality of relief projections 23 arranged here in a regular two-dimensional network.
  • the buffer has 7 lines and 11 columns, ie 77 projections, or 9 lines and 17 columns, ie 153 projections.
  • the shape, the dimensions and the relative positions of the projections 23 determine the opposite shape, the dimensions and the positions of the wells that one seeks to manufacture.
  • the protrusions of the pad have all the same shape and dimensions and are arranged in a regular one or two dimensional mesh.
  • the height of the projections is chosen to be preferably greater than or equal to 5 times the size of the biological samples considered.
  • the buffer 13 comprises feet 33 which serve to determine the distance from the wells to the microscope slide.
  • the feet 33 of the pad 13 have a height greater than or equal to the height of the projections 23.
  • the pad 13 has a total length and a width slightly smaller respectively than the length and width of the opening 34 of the seal 4.
  • FIG. 6 represents an example of projection 23 for forming a well adapted to receive a biological object of spherical shape and with a diameter of between 100 ⁇ and 300 ⁇ approximately.
  • the projection 23 has a height of about 1.2 mm.
  • the projection here has a rectangular base of 1 mm by 0.5 mm and a top 53 in the form of disk of 0.3 mm in diameter.
  • the corresponding well shape is a flared shape that allows accurate positioning in 3D and maintains a spherical biological object without applying mechanical stress.
  • the pad 13 also has a mark 43 in relief or recessed adjacent to the projection 23. This mark 43 is intended to generate a specific registration mark in the vicinity of each well to allow identification and easy identification. of each well on the microscopy images.
  • Figure 7 shows another example of projection 23 to form a well adapted to receive an elongated biological object, for example a zebrafish larva.
  • the projection 23 is here rectangular parallelepiped shape.
  • the projection 23 has a height of about 1 mm and a rectangular apex 53 of about 1.5 mm by 0.7 mm.
  • the corresponding parallelepipedic well shape prevents the rotational movement of a larva on itself while reducing the mechanical stress applied to the larva.
  • Figure 8 illustrates an example of a process for manufacturing and assembling a culture and imaging chamber.
  • a first microscope slide 2 is placed in the housing of a support 1 laid flat on a table.
  • a seal 4 is disposed on the microscope slide 2 and held in the inner housing 61 by a dimensional adjustment of the support 1 so as to form a continuous and closed sealing line between the microscope slide 2 and the lower surface. 44 of the seal 4.
  • a hydrogel in liquid form is poured into the opening 34 of the seal 4 so as to form a layer of liquid hydrogel covering the surface of the microscope slide 2 inside the seal. 4.
  • about 2 mL of heated agarose is used at a temperature adapted to be liquid.
  • the surface of the pad 13 comprising the array of projections 23 is applied to the liquid hydrogel layer while avoiding bubble formation.
  • the feet 33 of the pad are advantageously in contact with the surface of the microscope slide 2.
  • the assembly is cooled, for example at a temperature of 4 ° C. for a few minutes until the hydrogel layer is gelled.
  • the buffer is removed after gel of the agarose layer.
  • the gelled agarose layer thus has the imprint of the projections 23 of the buffer 13 which form a network of wells in the agarose layer.
  • the positions and dimensions of each well are thus precisely determined in three dimensions.
  • Each well forms a cavity having a well aperture formed on the surface of the gelled agarose layer, each well opening having a millimeter or sub-millimeter transverse dimension and each well having a millimeter depth.
  • the wells are in fact arranged on the same grid as the protrusions of the buffer.
  • the wells have the same dimensions as the corresponding projections of the buffer.
  • the bottom of each well is located at the same and only distance from the microscope slide which facilitates the automatic acquisition of microscopy images on each well without requiring a development step between each image.
  • FIG. 8D is poured a liquid medium suitable for the culture and imaging of biological objects considered.
  • This liquid medium is, for example, a saline solution of PBS type, phosphate buffer saline, and derivatives or an aqueous culture medium adapted to 3D cell cultures, supplemented or not with pharmacological molecules or molecules intended to provide fluorescent exogenous labeling or chromogenic or otherwise, or any other molecules of biological interest to be applied by balneation.
  • the lid 5 provided with the second microscope slide is positioned on the support 1.
  • the second microscope slide 12 comes into contact with the upper surface 54 of the seal 4.
  • the culture and imaging chamber is then liquid-tight while remaining gas-permeable.
  • the opening 1 1 of the support 1 is aligned on the opening 34 of the seal and on the opening 15 of the cover 5.
  • the culture and imaging chamber can be placed in an incubator to allow the liquid medium to diffuse into the agarose layer and / or to balance the gas exchange.
  • the culture and imaging chamber is disposed on a microscope sample holder as shown in Fig. 8F.
  • the objective and / or the condenser 100 of the microscope is here placed above the culture and imaging chamber.
  • the total height of the culture and imaging chamber is less than 8 mm and compatible with most optical microscopes. According to the modalities of reflection imaging or transmission, the lamella 2 and / or lamella 12 allow the collection of a signal by reflection and / or transmission.
  • the total time for assembling a culture and imaging chamber is less than 10 minutes. Biological samples can be loaded quickly and efficiently.
  • FIG 9 illustrates a variant of seal 24 here comprising two openings 134.
  • Each opening 134 of the seal 24 here forms a compartment.
  • Such a seal may be arranged in a support as shown in Figure 1 to form two compartments sealed relative to each other.
  • This seal 24 makes it possible, for example, to form an identical well network in each compartment of the joint 24.
  • the two openings 134 are intended to be arranged facing an opening of the support 1 or the cover 5.
  • the support 1 comprises two compartments separated by a partition 31.
  • a seal 94 adapted to the dimensions of each compartment makes it possible to have two well networks formed in two layers of agarose, the two compartments being sealed with respect to one another while being formed in the same support 1.
  • Each seal 94 has an opening 234 disposed facing an opening 11 of a compartment of the support 1.
  • Dissolved molecules can be markers or drugs, which are administered to biological samples by balancing.
  • FIG. 10A illustrates a detail view of a portion of buffer 13 for forming a well network by impression in a hydrogel layer.
  • the protrusions 23 and the marks 43 and a foot 33 are observed.
  • the agarose layer comprises the imprint of the pad of FIG. 10A.
  • the well network 26 is observed, and the registration marks 46 adjacent to each well.
  • each registration mark 46 consists of a letter indicating a line and a number indicating a column of the network.
  • the footprint forms a bowl 36 that allows to inject, collect and / or change the liquid medium of the culture chamber and imaging.
  • FIG. 11 shows a microscopic view of a well 26 formed by the impression of a projection 23 as shown in FIG. 6.
  • the bottom 56 of the well 26 is flat and circular in shape of equal diameter. at about 300 micrometers.
  • the walls of the well are flared towards the opening of the well.
  • One of the walls is advantageously inclined at an angle of about 67 degrees to the horizontal surface of the agarose layer to allow the injection of a biological capsule via a pipette.
  • the ends of the projections are placed at a predetermined distance (for example by the height of the feet of the pad) from the surface of the microscope slide so that the well bottoms consist of a thin layer of agarose and are all located at the same predetermined distance from the microscope slide surface.
  • FIG. 12 illustrates a method for transferring spherical biological samples 27 approximately 200 ⁇ m diameter in a well network.
  • the biological samples 27 are placed in a liquid medium 17 in a Petri dish 9.
  • the biological samples 27 are aspirated one by one in a Pasteur pipette in the direction of the arrow.
  • the end of the pipette is preferably chosen so that the inside diameter of the pipette is slightly greater than that of the biological samples 27.
  • the aspiration is preferably configured so that the biological samples 27 are aligned and spaced regularly in the pipette 8. For example, thus draws up to 12 biological samples 27 in a pipette.
  • FIG. 12 illustrates a method for transferring spherical biological samples 27 approximately 200 ⁇ m diameter in a well network.
  • the end of the pipette is placed in a well 26 of the agarose layer in order to deposit a biological sample 27 in this well 26.
  • the procedure is repeated for individually depositing a biological sample 27 in each well of the agarose layer 6.
  • the biological samples 27 are thus individually arranged in the wells at predetermined positions in 3D. In general, this step is performed by hand, under visual control by observation with the stereomicroscope. Positioning accuracy depends on the size of the wells, the size of the biological samples, and the manual accuracy of an experimenter or the mechanical accuracy of a micromanipulator. The positioning accuracy is in a range from a few hundred micrometers to about ten micrometers.
  • the manipulation of biological samples 27 during aspiration and expulsion can be monitored in real time by means of a stereomicroscope. Tilting a well wall at an angle of about 67 degrees to the vertical allows a biological sample to be injected via the pipette without obscuring the image field in a right microscope. On the other hand, the inclination of the opposing wall at an angle of about 80 degrees to the horizontal surface of the hydrogel layer reduces optical aberrations in a right microscope.
  • the bowl 36 formed in the agarose layer 6 makes it possible to renew the liquid medium without the risk of touching one of the biological samples 27.
  • the culture and imaging chamber can then be sealed by the cover and the microscope slide 12.
  • the seal 4 is gas permeable but is liquid-tight and prevents evaporation. culture liquid.
  • the sterility of the biological samples is preserved in the chamber and the chamber can be subject to round trips between the incubator where the biological samples are cultivated under appropriate and sometimes sterile conditions and the microscope. Samples can be imaged during several days in a row, in continuity, or not, with or without a return to the incubator. It is also possible to open the lid in a sterile environment or not to replace the culture medium by taking advantage of the cups 36 formed in the corners of the agarose layer 6.
  • the shape and depth of the wells allow easy handling of a large number of biological samples that are individualized and easily identifiable by the registration marks. Back and forth of the culture and imaging chamber between a preparation bench, an incubator and / or a microscope are thus facilitated. In addition, the risk of mixing the individualized biological samples and identified in the well network is extremely small.
  • the lid has no opening.
  • the support comprises an aperture and a microscope slide as described in the embodiment in connection with FIG. This embodiment protects the biological samples from ambient light.
  • the culture and imaging chamber can be observed on an inverted light microscope.
  • the second microscope slide is replaced by an optical device or an optical system comprising for example a reflecting plate, such as a mirror, or a partially reflecting plate, a dichroic plate, a polarizer, a half-wave plate , a quarter-wave plate and / or a lens.
  • the support has no opening, but nevertheless comprises a microscope slide 2 or an optical device or an optical system comprising for example a reflecting plate, such as a mirror, or a partially reflecting plate, a dichroic plate, a polarizer, a half wave plate, a quarter wave plate and / or a lens.
  • a reflecting plate such as a mirror, or a partially reflecting plate
  • a dichroic plate such as a mirror
  • a polarizer such as a partially reflecting plate
  • a half wave plate such as a mirror
  • a polarizer such as a half wave plate
  • a quarter wave plate such as a quarter wave plate
  • the hydrogel layer and the seal 4 are in direct contact with the reflective lamella or plate so as to ensure the sealing of the chamber.
  • the lid 5 has an opening 15 and a microscope slide 12 as described in the embodiment in connection with FIG. 1. This embodiment may allow performing experiments requiring the presence of components in the path of light either on the excitation (before the sample) or detection (after the sample) portion
  • Figure 13 illustrates the use of a culture and imaging chamber according to the present disclosure on a sample holder of a microscope.
  • the motorized stage is programmed to allow the automatic acquisition of low or medium resolution image fields by means of a microscopy apparatus according to the step of the well network.
  • the plate moves in general in the coordinates of the spatial reference of the microscope, classically along the X and Y axes in a horizontal plane.
  • the displacement along the vertical Z axis, corresponding to the depth of the sample is effected either by moving the plate and / or, most often, the turret of objectives.
  • the objective and / or the condenser 100 of the microscope is here placed above the culture and imaging chamber. It is no longer necessary to focus on each biological sample.
  • FIG. 14 illustrates an example of 70 image fields corresponding to 70 wells of a culture and imaging chamber. Identification marks adjacent to the wells are identified despite the presence of bubbles formed on the surface of the agarose layer.
  • images are acquired by means of an epi-fluorescence and wide-field microscope for taking pictures as a function of time.
  • the microscope comprises an enclosure in a controlled temperature and gas atmosphere surrounding the sample holder and the culture and imaging chamber.
  • Intermediate images can be acquired automatically for example every 30 min.
  • a confocal laser scanning microscope is used to acquire slices at different Z-elevations in biological cells, with a Z-pitch of a few microns, for example. We can then reconstruct the 3D image of the 50 biological capsules and follow the evolution of the cells with a very high spatial and temporal resolution.
  • FIGs. 16A and 16B show composite images comprising fluorescence channels superimposed on a light field microscopy image. These images make it possible to follow the trace of the displacement of the cell nuclei within a capsule as a function of time, represented in FIG. 16C.
  • Figure 16D illustrates the directional analysis of cell motions in Figure 16C, which can be used to determine the interaction between different populations of biological cells. It is observed that the biological capsule does not move inside a well and does not deteriorate. This chamber of culture and analysis allows to analyze a large number of biological samples with a high yield, while providing images of microscopy of high spatial resolution, in 2D or in 3D and on a long duration of experiment going up to several dozen hours or even several days.
  • wells having other shapes and / or dimensions adapted to other samples are used.
  • a well of rectangular parallelepiped-shaped wells, as described with reference to FIG. 7, is used to provide transgenic zebrafish larvae having a cell nucleus marker, for example of the NLS :: TagRFP type.
  • a wide-field microscope is used to acquire images of larvae fixed at 30 hpf (Fig. 17A-17C).
  • a confocal microscope is used to acquire images of the same larvae further incubated in a Bodipy lipid marker 505/515 (Fig. 17D-17E).
  • An image processing system makes it possible to reconstruct the image of the larvae in 3D.
  • 77 larvae are placed in a culture and imaging chamber with 7 rows and 11 columns.
  • a 4X microscope objective enables a complete scan of the chamber (Fig. 17A).
  • a 10X microscope objective is used to scan a reduced area (5 rows by 5 columns, represented by a box in Fig. 17A) with better spatial resolution (Fig. 17B).
  • the image of Figure 17C distinguishes the individual nuclei from the labeled cells. It is also observed that the marking mark of each Well is legible, which allows to trace the development history of each individual larva and push the analyzes of a particular individual if necessary.
  • the culture and imaging chamber of the present disclosure is compatible with many optical microscopes.
  • this culture and imaging chamber is compatible with any type of microscopy comprising a microscope stand, a platen provided with a sample holder intended to receive a microscope slide and whose objective and / or the condenser of the microscope.
  • microscope have a frontal distance compatible with the spatial space of the culture chamber and imaging.
  • a light sheet microscope can also be used for rapid scanning of a light sheet by real or digital scanning, which greatly increases the scanning speed.
  • a right microscope for excitation and collection or a microscope having an optical axis inclined at 45 degrees can be used.
  • the culture chamber and imaging is also compatible with a confocal microscope, or rotating disc or super resolution.

Abstract

L'invention concerne une chambre de culture et d'imagerie (10) comprenant un support (1) rigide et un couvercle (5), au moins une lamelle de microscope (2, 12) disposée face à une ouverture (11, 15) formée dans le support (1) ou dans le couvercle (5), un joint d'étanchéité(4, 14, 24) comprenant au moins une autre ouverture (34) disposée face à la lamelle de microscope (2, 12) et une couche d'hydrogel (6) disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture (34) du joint d'étanchéité (4, 14, 24), la couche d'hydrogel (6) comprenant un réseau de puits, le réseau de puits comprenant une pluralité de puits (26) ouverts de dimensions millimétriques ou sub-millimétriques disposés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support (1), chaque puits (26) étant adapté pour recevoir un échantillon biologique.

Description

CHAMBRE DE CULTURE ET D'IMAGERIE D'ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES
DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale le domaine des dispositifs et méthodes pour la culture et l'observation d'échantillons biologiques.
Dans le présent document, on entend par échantillon biologique des cellules biologiques à 3D telles que des sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires (cellules à 3D), des embryons ou encore des capsules contenant des cellules biologiques.
Elle concerne plus particulièrement un porte-échantillon pour microscope optique adapté pour visualiser par exemple l'évolution spatiale et temporelle d'organismes biologiques vivants ou pour imager des échantillons fixés, à titre d'exemple fixateurs de types PFA et marqués par des tout type de marqueur, tels que des anticorps contre des protéines.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La microscopie optique est couramment utilisée en biologie ou en biomédecine pour la visualisation de processus biologiques dans des organismes ou cellules biologiques. Différents champs de la biologie parmi lesquels la biologie du développement, les cellules souches, l'ingénierie des tissus ou la biophysique s'intéressent à l'étude et l'analyse des processus au niveau cellulaire. Toutefois, ces analyses nécessitent l'acquisition d'images de haute résolution spatiale et temporelle, de manière répétitive, en grande quantité et avec un rendement suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Les microscopes optiques actuels proposent différentes techniques et configurations d'imagerie telles que la microscopie confocale, multi-photonique ou à disque rotatif qui offrent une excellente résolution spatiale et temporelle pour l'étude d'un échantillon particulier. Cependant, ces appareils de microscopie ne permettent pas de monter et traiter automatiquement un grand nombre d'échantillons biologiques avec un rendement élevé.
II existe des chambres de culture, par exemple de type boîte de Pétri, qui permettent de faire croître des échantillons biologiques vivants dans un milieu de culture liquide.
Des dispositifs particuliers pour immobiliser des échantillons biologiques vivants ont été développés dans certains laboratoires. Comme résumé dans un article de revue, J. Clarke (« Live imaging of development in fish embryos », Semin cell Dev Biol, 20(8), 942-6, 2009) il a été démontré la visualisation de larves de poisson zèbre inclus dans un gel d'agarose. Bien que cette approche soit facile à mettre en œuvre, elle ne convient pas pour le suivi à long terme du développement de ces larves du fait des contraintes mécaniques générées par la croissance des larves dans le gel d'agarose. De plus, ce procédé n'est pas automatisé, si bien qu'il est difficile d'obtenir un grand nombre d'échantillons pour obtenir des statistiques fiables.
On connaît aussi une chambre de culture comprenant un réseau de puits cylindriques formés par gravure dans un substrat de verre épais. Toutefois, une telle chambre de culture n'est pas compatible avec une visualisation par microscope optique en configuration droite.
Or, les échantillons biologiques présentent une grande variété de forme, de dimension et de conditions de développement. A titre d'exemple, les larves de poisson zèbre ont une forme allongée et sont très tolérantes vis-à-vis des conditions de culture. D'autres embryons ont une forme sphérique mais sont plus exigeants en termes de conditions de culture. Une autre catégorie d'échantillons biologiques en trois dimensions regroupe les agrégats multicellulaires, sphéroïdes, organoïdes, les embryons et les capsules contenant des cellules biologiques.
Dans des expériences de biologie ou de biomédecine par exemple, il est souhaitable de tester des médicaments sur des modèles in vivo avec un rendement élevé. Il est alors nécessaire d'effectuer des acquisitions d'image automatisées sur de nombreuses cibles avec une haute résolution spatiale et temporelle.
II n'existe pas de dispositif pratique permettant de positionner précisément un grand nombre d'échantillons biologiques vivants sur un porte-échantillon de microscope optique tout en réduisant les interactions mécaniques ou biochimiques sur ces échantillons biologiques vivants.
OBJET DE L'INVENTION
Afin de remédier à l'inconvénient précité de l'état de la technique, la présente invention propose une chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques par microscopie optique, ladite chambre de culture et d'imagerie comprenant un support et un couvercle, le support comprenant au moins un logement intérieur, au moins une lamelle de microscope disposée face à une ouverture formée dans le support ou dans le couvercle face audit logement intérieur, un joint d'étanchéité disposé entre le support et le couvercle en contact avec ladite au moins une lamelle de microscope, le joint d'étanchéité délimitant au moins une autre ouverture disposée face à la lamelle de microscope, une couche d'hydrogel disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture du joint d'étanchéité, la couche d'hydrogel comprenant un réseau de puits ouverts formés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support, chaque puits étant adapté pour recevoir un échantillon biologique, le support, le couvercle et le joint étant configurés de manière à être rendus solidaires pour former une chambre de culture et d'imagerie étanche vis-à-vis d'un liquide.
Cette chambre de culture et d'imagerie est compatible avec l'imagerie sur de nombreux microscopes, est peu coûteuse à fabriquer, facile à assembler, à transporter, tout en assurant l'étanchéité au liquide et la perméabilité au gaz du milieu en culture. Elle permet de positionner individuellement des échantillons biologiques avec une précision micrométrique sans appliquer de contrainte mécanique sur ces échantillons biologiques.
De façon avantageuse, la chambre de culture et d'imagerie comporte les moyens mécaniques de maintien adaptés pour maintenir le joint d'étanchéité entre le support et le couvercle.
D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses de la chambre de culture et d'imagerie conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- les puits sont de dimensions millimétriques ou sub-millimétriques ou même allant jusqu'à des dimensions micrométriques ;
- le support et/ou le joint d'étanchéité comporte une pluralité de compartiments étanches les uns par rapport aux autres, au moins un compartiment étanche comprenant ladite couche d'hydrogel et ledit réseau de puits;
- le support comporte une première ouverture, le couvercle comporte une deuxième ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comprenant une première lamelle de microscope disposée face à la première ouverture et une deuxième lamelle de microscope disposée face à la deuxième ouverture, le joint d'étanchéité étant en contact avec la première lamelle de microscope et la deuxième lamelle de microscope ; - le couvercle est opaque ou le couvercle comporte une deuxième ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comporte une deuxième lamelle de microscope disposée face à la deuxième ouverture et un composant optique réfléchissant ou dichroïque disposé dans le logement intérieur du support ;
- le support est opaque ou le support comporte une première ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comprenant une première lamelle de microscope face à la première ouverture et dans laquelle le couvercle est opaque ou comporte un composant optique réfléchissant ou dichroïque ;
- le réseau de puits ouverts est disposé suivant une grille ayant un pas prédéfini suivant une direction ou deux directions transverses dans le repère orthonormé ;
- le réseau de puits comporte au moins un puits ouvert ayant une forme parallélépipédique, une forme cylindrique, une forme tronconique, une forme évasée ou une forme refermée au niveau d'une ouverture de puits ;
- le réseau de puits comporte au moins un puits ayant une paroi inclinée par rapport à une surface horizontale de la couche d'hydrogel d'un angle supérieur à 0 degrés et inférieur à 135 degrés, ou 1 10 degrés ou de préférence inférieur à 100 degrés, ladite surface horizontale de la couche d'hydrogel étant celle où se trouvent les ouvertures des puits ;
- le réseau de puits comporte au moins un puits ayant un fond plat ou concave formé dans la couche d'hydrogel et/ou au moins un puits ayant un fond formé par une surface de lamelle de microscope ;
- la couche d'hydrogel comporte une pluralité de marques de repérage, chaque marque de repérage étant disposée à proximité d'un puits et étant configurée pour identifier ce puits ;
- une cuvette est formée dans la couche d'hydrogel et est adaptée pour recevoir un liquide d'immersion ;
- le support, le couvercle et le joint d'étanchéité sont formés par moulage ou par impression en trois dimensions à partir de matériaux polymères, de préférence biocompatibles ;
- le support rigide comporte plusieurs ouvertures et est adapté pour recevoir une lamelle de microscope face à chaque ouverture de support ;
- le support comporte une cloison séparant le logement intérieur en compartiments étanches, chaque compartiment comprenant un joint d'étanchéité et une lamelle de microscope ;
- le joint d'étanchéité a une section rectangulaire ou carrée ;
- le support comporte au moins une ailette latérale adaptée pour recevoir une pince de fixation de lame de microscope sur un porte-échantillon de microscope optique et pour maintenir le support sur le porte-échantillon de microscope optique ;
- la lamelle de microscope est en verre, en matériau polymère et/ou comporte un revêtement en couche mince adapté pour augmenter l'adhérence d'un échantillon biologique ;
L'invention propose également un procédé de fabrication d'une chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques par microscopie comprenant les étapes suivantes :
- fabriquer par stéréo-lithographie à partir d'une résine un tampon comprenant une pluralité de saillies ayant une base de dimension transverse millimétrique ou submillimétrique et une hauteur de dimension millimétrique ou submillimétrique ;
- disposer une première lamelle de microscope dans un logement intérieur d'un support rigide,
- disposer un joint d'étanchéité dans le logement intérieur du support rigide, le joint d'étanchéité ayant une ouverture et le joint d'étanchéité ayant une surface inférieure en contact avec la lamelle de microscope,
- verser une couche d'hydrogel liquide dans l'ouverture du joint d'étanchéité de manière à recouvrir la surface de la lamelle de microscope ;
- former une empreinte du tampon dans la couche d'hydrogel liquide, de manière à obtenir une couche d'hydrogel gélifiée comprenant l'empreinte de la pluralité de saillies du tampon et formant un réseau de puits de dimensions égales aux dimensions des saillies du tampon ;
- prélever au moins un échantillon biologique et disposer l'échantillon biologique dans un puits du réseau de puits; et
- fixer un couvercle sur le support pour fermer de manière étanche la chambre de culture et d'imagerie ainsi formée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE D'UN EXEMPLE DE RÉALISATION La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.
Sur les dessins annexés :
- la figure 1 représente une vue éclatée des composants d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 2 représente une vue éclatée des éléments d'un moule pour former un joint d'étanchéité ;
- la figure 3 représente des vues de dessus et en coupe selon la ligne A- A et selon la ligne B-B d'un exemple de joint d'étanchéité ;
- la figure 4 représente une vue en perspective d'un exemple de tampon muni d'un réseau de saillies pour former un réseau de puits par empreinte dans une couche d'hydrogel ;
- la figure 5 représente des vues de dessus et, respectivement, en coupe selon la ligne A-A et la ligne B-B, d'un exemple de tampon pour marquer par empreinte un réseau de puits dans une couche d'hydrogel ;
- la figure 6 représente des vues de détail d'un exemple de saillie pour former un puits de forme évasée ;
- la figure 7 représente des vues de détail d'un autre exemple de saillie pour former un puits de forme parallélépipédique rectangle ;
- la figure 8 illustre les étapes de construction d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 9 représente des exemples de support et de joints d'étanchéité formant des compartiments étanches selon un autre mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 10A représente une vue d'un détail d'un exemple de tampon et la fig. 10B une vue d'un détail d'une couche d'hydrogel dans laquelle est formé par empreinte du tampon de la fig. 10A un réseau de puits avec marques de repérage locales associées à chaque puits ;
- la figure 1 1 illustre en vue de microscopie un exemple de puits ;
- la figure 12 illustre schématiquement un exemple de procédé de transfert d'objets biologiques d'une boite de culture vers les puits d'une chambre de culture et d'imagerie ;
- la figure 13 illustre le positionnement d'une chambre de culture et d'imagerie sur un porte-échantillon de microscope optique ;
- la figure 14 représente une image reconstituée à partir de 70 images de microscopie optique suivant une grille de pas rectangulaire, chaque puits comprenant une capsule biologique ;
- les figures 15A-15B représentent des images composées de 50 images d'un réseau de puits comprenant des capsules biologiques prises respectivement à un instant t= 0 et à un autre instant t= 15h ;
- la figure 16 représente un exemple de puits pour une expérience sur une capsule biologique et les trajectoires de plusieurs noyaux cellulaires au sein de cette capsule ;
- la figure 17 représente un autre exemple de réseau de puits pour une expérience sur des larves de poisson zèbre.
Dispositif et procédé
La présente divulgation propose une chambre de culture et d'imagerie pouvant être entièrement fabriquée et assemblée par l'utilisateur à partir de composants courants tels que des lamelles de microscope, des matériaux peu coûteux, tels qu'un hydrogel (par exemple d'agarose, méthylcellulose, phytagel) et un élastomère (par exemple de silicone) et des pièces fabriquées par stéréo- lithographie en 3D au moyen d'une imprimante 3D ayant une résolution d'au moins 50 μιτι dans chaque direction et utilisant une résine. De préférence, la résine utilisée est une résine biocompatible.
Sur la figure 1 , on a représenté les composants d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention. Les différents composants sont ici démontés et placés les uns à côté des autres dans un repère (XYZ). La chambre de culture et d'imagerie comporte un support 1 , une première lamelle de microscope 2, une couche d'hydrogel 6, un joint d'étanchéité 4, un couvercle 5 et une deuxième lamelle de microscope 12.
Pour la suite de la description, une direction verticale est une direction parallèle à l'axe OZ, le plan longitudinal est perpendiculaire à la direction verticale.
Le support 1 a une longueur de 76 mm et une largeur de 26 mm qui correspondent aux dimensions d'une lame classique de microscope. Dans cet exemple, le support 1 comporte un fond plat parallèle au plan longitudinal ayant une ouverture 1 1 et des rebords inférieurs 51 délimitant l'ouverture 1 1 . Le support comporte aussi des parois 41 s'étendant selon la direction verticale sur quatre côtés transversalement au fond sur une hauteur de quelques millimètres et des rebords supérieurs 71 . Le fond du support est adapté pour recevoir une lamelle de microscope 2 ayant une longueur de 50 mm et une largeur de 24 mm. L'ouverture 1 1 est ici rectangulaire de longueur et de largeur inférieures respectivement à la longueur et la largeur de la lamelle de microscope 2. Les rebords 51 du fond et les parois 41 du support 1 forment ainsi un logement intérieur 61 adapté pour recevoir et maintenir la lamelle de microscope 2 face à l'ouverture 1 1 . L'ouverture 1 1 du support 1 fournit ainsi un accès optique sur le logement intérieur 61 . De façon avantageuse, le support 1 comporte ici deux ailettes 21 extérieures disposées dans le prolongement de la longueur du support pour permettre de manipuler ou fixer la chambre de culture et d'imagerie sur un porte-échantillon de microscope.
Le couvercle 5 est de forme générale rectangulaire et comporte une face supérieure 35 plane et des bords 45. Les bords 45 s'étendent transversalement selon la direction verticale à la face supérieure 35 du couvercle sur quatre côtés pour former une jupe. Les bords 45 du couvercle 5 sont adaptés pour s'ajuster sur les rebords supérieurs 71 du support 1 . La face supérieure 35 du couvercle comporte ici une ouverture 15 de forme rectangulaire, ayant une longueur d'environ 44 mm et respectivement une largeur d'environ 18 mm, qui sont inférieures à la longueur et respectivement à la largeur d'une lamelle de microscope standard. Une fente 25 est ménagée dans un des bords du couvercle pour permettre l'insertion de la deuxième lamelle de microscope 12. De façon avantageuse, le couvercle comporte des rails de guidage pour guider et maintenir la lamelle 12 dans le couvercle 5. Ainsi, la lamelle 12 recouvre entièrement l'ouverture 15 du couvercle. Le couvercle et le support sont maintenus ensemble, de manière réversible et étanche, par l'intermédiaire du joint d'étanchéité 4. Plus précisément, le couvercle s'emboite sur les rebords du joint d'étanchéité 4 qui dépassent à l'extérieur du logement intérieur 61 . L'ouverture 15 du couvercle 5 fournit un accès optique sur le logement intérieur 61 . De façon avantageuse, lorsque le couvercle 5 est positionné sur le support 1 , l'ouverture 15 du couvercle 5 est alignée sur l'ouverture 1 1 du support 1 .
Le couvercle 5 et le support 1 sont de préférence fabriqués par stéréo- lithographie en 3D, par exemple au moyen d'une imprimante de type Micro-Plus Hi-Re d'Envision City ayant une résolution d'au moins 50 μιτι et de préférence de 25 μιτι dans chaque direction dans chaque direction. On utilise une résine biocompatible telle que la résine HTM140 d'Envision City. La résine présente une faible viscosité avant photo-polymérisation et une grande rigidité après photo- polymérisation. Après durcissement, le support 1 et le couvercle 5 peuvent être stérilisés en autoclave un grand nombre de fois. Ainsi, on dispose d'un support 1 et d'un couvercle 5 rigides. Toutefois, il est facile de fixer le couvercle sur le support. Le couvercle est amovible par exemple pour changer le contenu de la chambre de culture et d'imagerie ou changer le liquide de culture.
Le joint d'étanchéité 4 est de préférence un joint en silicone, par exemple en polydiméthylsiloxane (PDMS). Le joint d'étanchéité a ici la forme générale d'un cadre 14 de section rectangulaire entourant une ouverture 34 rectangulaire. Le joint 4 est de préférence formé par moulage. Le joint 4 a une épaisseur dimensionnée de manière à ce qu'il soit en appui suivant une ligne continue et fermée sur la première lamelle de microscope 2 et suivant une autre ligne continue et fermée sur la deuxième lamelle de microscope 12, lorsque le couvercle 5 est fixé au support 1 . La partie inférieure du cadre 14 du joint d'étanchéité forme une collerette 94. La collerette est dimensionnée de sorte que lorsque le joint 4 est disposé en appui sur la première lamelle de microscope dans le logement intérieur 61 , la partie supérieure du cadre 14 dépasse les parois 41 du support. Lorsque le couvercle 5 est positionné sur le support 1 , les bords 45 du couvercle s'emboitent sur la partie supérieure du cadre 14 pour maintenir le couvercle fixé sur le support de manière étanche. Le joint d'étanchéité 4, par exemple en PDMS, peut aussi être stérilisé en autoclave un grand nombre de fois. De manière générale, les différents éléments du dispositif, mis à part la couche d'hydrogel, sont autoclavables individuellement et/ou assemblés.
La fabrication de la couche d'hydrogel 6 sera décrite plus en détail par la suite. La couche d'hydrogel 6 comporte un réseau de puits ouverts formés par estampage ou par marquage d'une empreinte. La couche d'hydrogel 6 est de préférence constituée d'un gel d'agarose. L'agarose présente plusieurs avantages en tant que support pour former les puits, notamment d'être facile à modeler, d'être transparent dans le domaine visible et d'être neutre pour la plupart des échantillons biologiques vivants. Dans des variantes, la couche d'hydrogel est constituée d'un phytogel, d'un gel de méthylcellulose, d'un gel d'alginate ou d'un polymère fluoré. La couche d'hydrogel 6 est destinée à être positionnée sur la première lamelle de microscope 2 et à l'intérieur du joint d'étanchéité 4.
Le joint d'étanchéité 4 est un joint étanche vis-à-vis d'un liquide d'immersion et perméable au gaz. Ainsi, le volume délimité par les deux lamelles de microscope 2, 12 et le joint d'étanchéité 4 est un volume qui est étanche vis-à- vis d'un liquide d'immersion, mais qui permet les échanges gazeux. La couche d'hydrogel est disposée à l'intérieur de ce volume. Il existe différentes modalités d'imagerie en microscopie qui peuvent nécessiter un seul ou deux accès optiques. Ainsi, en microscopie de fluorescence, l'excitation et l'émission se font au moyen du même objectif de microscope, un seul accès optique est alors suffisant. Par contre, pour l'imagerie en champ clair (ou bright field microscopy) ou pour la microscopie en transmission (par exemple l'imagerie en champ sombre, en polarisation, par génération de seconde harmonique ou SHG, ou plus généralement tout mode de génération de contraste pour l'imagerie nécessitant une détection en transmission), les deux accès optiques sont nécessaires. La première lamelle de microscope 2 permet par exemple de visualiser la couche d'hydrogel 6 au moyen d'un microscope inversé. La deuxième lamelle de microscope 12 permet par exemple de visualiser la couche d'hydrogel 6 au moyen d'un microscope droit. On dispose ainsi d'une chambre de culture et d'imagerie qui est étanche au liquide et perméable au gaz.
La chambre de culture et d'imagerie est facilement démontable. Le support 1 , le couvercle 5 et le joint d'étanchéité 4 peuvent être stérilisés pour une réutilisation. Les lamelles de microscope 2, 12 sont peu onéreuses. La couche d'hydrogel est facile à fabriquer et également peu onéreuse. La couche d'hydrogel fait partie des éléments consommables.
La figure 2 illustre un exemple de dispositif de moulage pour former un joint d'étanchéité. Sur la figure 2A, on a représenté en vue éclatée les différents éléments du moule et le joint obtenu. Le dispositif de moulage comporte un cadre extérieur 74, un cadre intérieur 64 et un croisillon 84 pour positionner le cadre intérieur 64 par rapport au cadre extérieur 74. Sur la figure 2B, on a représenté le dispositif de moulage monté. Pour former le joint, on coule une résine de PDMS liquide (par exemple Sylgard 184, Corning mélangée avec 10% d'un agent de durcissement) dans l'interstice entre le cadre intérieur 64 et le cadre extérieur 74 du moule. Après environ 3h de durcissement, on retire le joint d'étanchéité 4 du dispositif de moulage.
La figure 3 représente des vues de dessus et en coupe selon les lignes B-B et C-C d'un joint d'étanchéité 4 ainsi obtenu. Le joint d'étanchéité 4 comporte une large ouverture 34 rectangulaire d'environ 18 mm de large et 45 mm de long. Le joint d'étanchéité 4 a une épaisseur totale d'environ 7 mm. Le joint 4 comporte avantageusement une surface inférieure 44 plane et une surface supérieure 54 plane. Le joint d'étanchéité 4 est placé sur la première lamelle de microscope 2 dans le logement 61 du support 1 , de manière à ce que la surface inférieure 44 forme une ligne de contact continue et fermée avec la surface supérieure de la première lamelle 2 de microscope. La deuxième lamelle de microscope 12 étant insérée dans le couvercle 5, le couvercle 5 est posé sur le support 1 de manière à fermer la chambre de culture et d'imagerie. Ainsi, la surface supérieure 54 du joint d'étanchéité 4 forme une autre ligne de contact continue et fermée avec la surface inférieure de la deuxième lamelle de microscope 12. Aucune colle n'est utilisée entre les différents composants de la chambre de culture et d'imagerie. On obtient ainsi une chambre de culture et d'imagerie étanche sans colle ce qui permet d'éviter tout risque de contamination des échantillons biologiques à l'intérieur de la chambre de culture et d'imagerie.
Nous allons maintenant décrire la fabrication du réseau de puits ouverts destinés à recevoir des échantillons biologiques.
On fabrique tout d'abord un tampon 13 comprenant une pluralité de saillies en relief. Le tampon est ensuite utilisé pour former par estampage un réseau de puits dans une couche d'hydrogel. Le tampon 13 est de préférence fabriqué par stéréo-lithographie en 3D au moyen d'une imprimante 3D ayant une résolution d'au moins 50 μιτι et de préférence de 25 μιτι dans chaque direction. On utilise par exemple l'imprimante de type Micro-Plus Hi-Re d'Envision City et une résine biocompatible telle que la résine HTM140 d'Envision City.
Les figures 4-5 illustrent un exemple de tampon 13 comportant une pluralité de saillies 23 en relief disposées ici suivant un réseau régulier à deux dimensions. Par exemple le tampon comporte 7 lignes et 1 1 colonnes, soit 77 saillies, ou encore 9 lignes et 17 colonnes, soit 153 saillies. La forme, les dimensions et les positions relatives des saillies 23 déterminent la forme inverse, les dimensions et les positions des puits que l'on cherche à fabriquer. De préférence, les saillies du tampon ont toutes la même forme et les mêmes dimensions et sont disposées suivant un maillage régulier à une ou deux dimensions. La hauteur des saillies est choisie pour être de préférence supérieure ou égale à 5 fois la dimension des échantillons biologiques considérés. De façon avantageuse, le tampon 13 comporte des pieds 33 qui servent à déterminer la distance des puits par rapport à la lamelle de microscope. De préférence, les pieds 33 du tampon 13 ont une hauteur supérieure ou égale à la hauteur des saillies 23. Le tampon 13 a une longueur totale et une largeur légèrement inférieures respectivement à la longueur et la largeur de l'ouverture 34 du joint 4.
La figure 6 représente un exemple de saillie 23 pour former un puits adapté pour recevoir un objet biologique de forme sphérique et de diamètre compris entre 100 μιτι et 300 μιτι environ. La saillie 23 a une hauteur d'environ 1 ,2 mm. La saillie a ici une base rectangulaire de 1 mm par 0,5 mm et un sommet 53 en forme de disque de 0,3 mm de diamètre. La forme de puits correspondante est une forme évasée qui permet de positionner précisément en 3D et de maintenir un objet biologique sphérique sans appliquer de contrainte mécanique. De façon particulièrement avantageuse, le tampon 13 comporte aussi une marque 43 en relief ou en creux adjacente à la saillie 23. Cette marque 43 est destinée à générer une marque de repérage spécifique au voisinage de chaque puits afin de permettre une identification et un repérage aisé de chaque puits sur les images de microscopie.
La figure 7 représente un autre exemple de saillie 23 pour former un puits adapté pour recevoir un objet biologique de forme allongée, par exemple une larve de poisson zèbre. La saillie 23 est ici de forme parallélépipédique rectangle. La saillie 23 a une hauteur d'environ 1 mm et un sommet 53 rectangulaire d'environ 1 ,5 mm par 0,7 mm. La forme de puits parallélépipédique correspondante empêche les mouvements de rotation d'une larve sur elle-même tout en réduisant les contraintes mécaniques appliquées sur la larve.
La figure 8 illustre un exemple de procédé de fabrication et d'assemblage d'une chambre de culture et d'imagerie. Sur la figure 8A, on a disposé une première lamelle de microscope 2 dans le logement d'un support 1 posé à plat sur une table. Un joint d'étanchéité 4 est disposé sur la lamelle de microscope 2 et maintenu dans le logement intérieur 61 par un ajustement dimensionnel du support 1 de manière à former une ligne d'étanchéité continue et fermée entre la lamelle de microscope 2 et la surface inférieure 44 du joint 4. Un hydrogel sous forme liquide est versé dans l'ouverture 34 du joint d'étanchéité 4 de manière à former une couche d'hydrogel liquide recouvrant la surface de la lamelle de microscope 2 à l'intérieur du joint d'étanchéité 4. A titre d'exemple, on utilise environ 2 mL d'agarose chauffé à une température adaptée pour qu'il soit liquide. Sur la figure 8B, avant durcissement de l'hydrogel, la surface du tampon 13 comprenant le réseau de saillies 23 est appliqué à la couche d'hydrogel liquide tout en évitant la formation de bulles. Les pieds 33 du tampon sont avantageusement en contact avec la surface de la lamelle de microscope 2. L'ensemble est refroidi, par exemple à une température de 4°C pendant quelques minutes jusqu'à ce que la couche d'hydrogel soit gélifiée.
A l'étape de la figure 8C, on retire le tampon après gel de la couche d'agarose. La couche d'agarose gélifiée comporte ainsi l'empreinte des saillies 23 du tampon 13 qui forment un réseau de puits dans la couche d'agarose. Les positions et dimensions de chaque puits sont ainsi déterminées précisément en trois dimensions. Chaque puits forme une cavité ayant une ouverture de puits formée sur la surface de la couche d'agarose gélifiée, chaque ouverture de puits étant de dimension transverse millimétrique ou sub-millimétrique et chaque puits ayant une profondeur millimétrique. Par construction, les puits sont en effet disposés sur la même grille que les saillies du tampon. Les puits ont les mêmes dimensions que les saillies correspondantes du tampon.
De façon particulièrement avantageuse, le fond de chaque puits est situé à une même et unique distance de la lamelle de microscope ce qui facilite l'acquisition automatique d'images de microscopie sur chaque puits sans nécessiter une étape de mise au point entre chaque image.
Sur la figure 8D on verse un milieu liquide approprié à la culture et à l'imagerie des objets biologiques considérés. Ce milieu liquide est par exemple une solution aqueuse saline de type PBS, phosphate buffer saline, et dérivés ou un milieu de cultures aqueux adapté aux cultures de cellules 3D, supplémentés ou non en molécules pharmacologiques ou en molécules visant à apporter un marquage exogène fluorescent ou chromogénique ou autre, ou en tout autre molécules d'intérêt biologique devant être appliqué par balnéation. A l'étape de la figure 8E, on positionne le couvercle 5 muni de la deuxième lame de microscope sur le support 1 . La deuxième lame de microscope 12 vient en contact avec la surface supérieure 54 du joint d'étanchéité 4. La chambre de culture et d'imagerie est alors étanche vis-à-vis des liquides tout en restant perméable aux gaz. L'ouverture 1 1 du support 1 est alignée sur l'ouverture 34 du joint d'étanchéité et sur l'ouverture 15 du couvercle 5. Selon les besoins de l'expérience, la chambre de culture et d'imagerie peut être placée dans un incubateur pour permettre au milieu liquide de diffuser dans la couche d'agarose et/ou pour équilibrer les échanges gazeux.
Après avoir disposé les échantillons biologiques dans les puits de la couche d'hydrogel, la chambre de culture et d'imagerie est disposée sur un porte- échantillon de microscope comme illustré sur la figure 8F. L'objectif et/ou le condenseur 100 du microscope est ici placé au-dessus de la chambre de culture et d'imagerie.
La hauteur totale de la chambre de culture et d'imagerie est inférieure à 8 mm et compatible avec la plupart des microscopes optiques. Selon les modalités de l'imagerie par réflexion ou par transmission, la lamelle 2 et/ou la lamelle 12 permettent la collection d'un signal par réflexion et/ou par transmission.
La durée totale pour l'assemblage d'une chambre de culture et d'imagerie est inférieure à 10 minutes. Le chargement des échantillons biologiques peut être réalisé de manière rapide et très efficace.
La figure 9 illustre une variante de joint d'étanchéité 24 comprenant ici deux ouvertures 134. Chaque ouverture 134 du joint d'étanchéité 24 forme ici un compartiment. Un tel joint peut être disposé dans un support tel qu'illustré sur la figure 1 pour former deux compartiments étanches l'un par rapport à l'autre. Ce joint 24 permet par exemple de former un réseau de puits identique dans chaque compartiment du joint 24. Les deux ouvertures 134 sont destinées à être disposées face à une ouverture du support 1 ou du couvercle 5.
Selon une autre variante illustrée sur la figure 9, le support 1 comporte deux compartiments séparés par une cloison 31 . Un joint d'étanchéité 94 adapté aux dimensions de chaque compartiment permet de disposer de deux réseaux de puits formés dans deux couches d'agarose, les deux compartiments étant étanches l'un par rapport à l'autre tout en étant formés dans le même support 1 . Chaque joint d'étanchéité 94 comporte une ouverture 234 disposée face à une ouverture 1 1 1 d'un compartiment du support 1 .
Ces variantes sont utiles par exemple pour comparer aisément des molécules dissoutes dans des milieux de culture distincts tout en assurant que les deux compartiments sont soumis aux mêmes conditions externes. Les molécules dissoutes peuvent être des marqueurs ou des drogues, qui sont administrées aux échantillons biologiques par balnéation.
La figure 10A illustre une vue de détail d'une portion de tampon 13 pour former un réseau de puits par empreinte dans une couche d'hydrogel. On observe les saillies 23 et les marques 43 ainsi qu'un pied 33. Sur la figure 10B, la couche d'agarose comporte l'empreinte du tampon de la fig. 10A. On observe le réseau de puits 26, et les marques de repérage 46 adjacentes à chaque puits. Dans cet exemple, chaque marque de repérage 46 est constituée d'une lettre indiquant une ligne et d'un chiffre indiquant une colonne du réseau. L'empreinte du pied forme une cuvette 36 qui permet d'injecter, de recueillir et/ou de changer le milieu liquide de la chambre de culture et d'imagerie.
Sur la figure 1 1 , on observe une vue en microscopie d'un puits 26 formé par l'empreinte d'une saillie 23 telle que représentée sur la figure 6. Le fond 56 du puits 26 est plat et de forme circulaire de diamètre égal à environ 300 micromètres. Les parois du puits sont évasées vers l'ouverture du puits. Une des parois est avantageusement inclinée d'un angle d'environ 67 degrés par rapport à la surface horizontale de la couche d'agarose pour permettre l'injection d'une capsule biologique via une pipette.
Le transfert de la forme des saillies dans l'agarose est effectué de manière très précise et fidèle au modèle. En particulier, on observe sur la figure 1 1 des marches correspondant à la fabrication couche par couche en 3D des saillies du tampon. Ces marches permettent par exemple de mesurer la profondeur d'un plan image suivant l'axe optique dans une image de microscopie confocale.
De façon avantageuse, les extrémités des saillies sont placées à une distance prédéterminée (par exemple par la hauteur des pieds du tampon) de la surface de la lamelle de microscope si bien que les fonds de puits sont constitués d'une couche mince d'agarose et sont tous situés à une même distance prédéterminée de la surface de lamelle de microscope.
La figure 12 illustre un procédé de transfert d'échantillons biologiques 27 sphériques d'environ 200 μιτι de diamètre dans un réseau de puits. Sur la figure 12A, les échantillons biologiques 27 sont disposés dans un milieu liquide 17 dans une boite de Pétri 9. Sur la fig. 12A, on aspire les échantillons biologiques 27 un par un dans une pipette 8 Pasteur dans le sens de la flèche. L'extrémité de la pipette est de préférence choisie de manière à ce que le diamètre intérieur de la pipette soit légèrement supérieur à celui des échantillons biologiques 27. L'aspiration est de préférence configurée pour que les échantillons biologiques 27 soient alignés et espacés régulièrement dans la pipette 8. A titre d'exemple, on aspire ainsi jusqu'à 12 échantillons biologiques 27 dans une pipette. Sur la figure 12B-12C, on place l'extrémité de la pipette dans un puits 26 de la couche d'agarose afin de déposer un échantillon biologique 27 dans ce puits 26. On répète l'opération pour déposer individuellement un échantillon biologique 27 dans chaque puits de la couche d'agarose 6. Les échantillons biologiques 27 sont ainsi disposés individuellement dans les puits à des positions prédéterminées en 3D. De manière générale, cette étape est réalisée à la main, sous contrôle visuel par observation au stéréomicroscope. La précision de positionnement dépend de la taille des puits, de la taille des échantillons biologiques, et de la précision manuelle d'un expérimentateur ou de la précision mécanique d'un micromanipulateur. La précision de positionnement est comprise dans une gamme allant de quelques centaines de micromètres à environ une dizaine de micromètres.
La manipulation des échantillons biologiques 27 lors de l'aspiration et lors de l'expulsion peut être contrôlée en temps réel au moyen d'un stéréo- microscope. L'inclinaison d'une paroi du puits d'un angle d'environ 67 degrés par rapport à la verticale permet d'injecter un échantillon biologique 27 via la pipette sans masquer le champ image dans un microscope droit. D'autre part, l'inclinaison de la paroi opposée d'un angle d'environ 80 degrés par rapport à la surface horizontale de la couche d'hydrogel permet de réduire les aberrations optiques dans un microscope droit.
De cette manière, plusieurs dizaines d'échantillons biologiques peuvent être disposées chacune dans un puits d'une même chambre de culture et d'imagerie en quelques minutes.
De façon particulièrement avantageuse, la cuvette 36 formée dans la couche d'agarose 6 permet de renouveler le milieu liquide sans risquer de toucher un des échantillons biologiques 27.
La chambre de culture et d'imagerie peut ensuite être fermée de manière étanche par le couvercle et la lamelle de microscope 12. Le joint d'étanchéité 4 est perméable aux gaz mais est étanche vis-à-vis des liquides et empêche l'évaporation du liquide de culture. Ainsi la stérilité des échantillons biologiques est préservée dans la chambre et la chambre peut être sujet à des allers-retours entre l'incubateur où les échantillons biologiques sont cultivés en conditions appropriées et parfois stériles et le microscope. Les échantillons peuvent être imagés pendant plusieurs jours de suite, en continuité, ou non, avec ou non-retour à l'incubateur. Il est également possible d'ouvrir le couvercle sous environnement stérile ou non pour remplacer le milieu de culture en tirant avantage des cuvettes 36 formées dans les angles de la couche d'agarose 6.
La forme et la profondeur des puits permettent une manipulation aisée d'un grand nombre d'échantillons biologiques qui sont individualisés et aisément repérables par les marques de repérage. Des allers-retours de la chambre de culture et d'imagerie entre un banc de préparation, un incubateur et/ou un microscope sont ainsi facilités. De plus, le risque de mélange des échantillons biologiques individualisées et repérées dans le réseau de puits est extrêmement réduit.
Dans une variante, le couvercle ne comporte pas d'ouverture. Le support comporte une ouverture et une lamelle de microscope comme décrit dans le mode de réalisation en lien avec la figure 1 . Ce mode de réalisation permet de protéger les échantillons biologiques vis-à-vis de la lumière ambiante. La chambre de culture et d'imagerie peut être observée sur un microscope optique inversé.
Dans une autre variante, la deuxième lamelle de microscope est remplacée un dispositif optique ou un système optique comprenant par exemple une lame réfléchissante, tel qu'un miroir, ou une lame partiellement réfléchissante, une lame dichroïque, un polariseur, une lame demi-onde, une lame quart d'onde et/ou une lentille. Cette variante peut permettre de réaliser des expériences nécessitant d'amener ou de détecter de la lumière de manière sélective dans la chambre de culture et d'imagerie tout en observant les échantillons au moyen d'un microscope inversé.
Dans autre une variante, le support ne comporte pas d'ouverture, mais comporte néanmoins une lamelle de microscope 2 ou un dispositif optique ou un système optique comprenant par exemple une lame réfléchissante, tel qu'un miroir, ou une lame partiellement réfléchissante, une lame dichroïque, un polariseur, une lame demi-onde, une lame quart d'onde et/ou une lentille. Dans ce cas, la couche d'hydrogel et le joint 4 sont directement en contact avec la lamelle ou lame réfléchissante de manière à assurer l'étanchéité de la chambre. Le couvercle 5 comporte une ouverture 15 et une lamelle de microscope 12 comme décrit dans le mode de réalisation en lien avec la figure 1 . Ce mode de réalisation peut permettre réaliser des expériences nécessitant la présence de composants optiques sur le trajet de la lumière que ce soit sur la portion d'excitation (avant l'échantillon) ou de détection (après l'échantillon) dans la chambre de culture et d'imagerie tout en observant les échantillons au moyen d'un microscope droit.
La figure 13 illustre l'utilisation d'une chambre de culture et d'imagerie selon la présente divulgation sur une platine porte-échantillon d'un appareil de microscopie. La platine motorisée est programmée pour permettre l'acquisition automatique de champ images de basse ou moyenne résolution au moyen d'un appareil de microscopie en fonction du pas du réseau de puits. La platine se déplace en général dans les coordonnées du référentiel spatial du microscope, classiquement suivant les axes X et Y dans un plan horizontal. Le déplacement suivant l'axe Z vertical, correspondant à la profondeur de l'échantillon, s'effectue soit en déplaçant la platine et/ou, le plus souvent, la tourelle d'objectifs. L'objectif et/ou le condenseur 100 du microscope est ici placé au-dessus de la chambre de culture et d'imagerie. Il n'est ensuite plus nécessaire de faire la mise au point sur chaque échantillon biologique. L'acquisition d'un grand nombre d'images de microscopie sur de nombreux échantillons biologiques est ainsi grandement accélérée. Le rendement et le nombre d'échantillons peuvent ainsi être fortement accrus. Sur l'insert de la figure 13, on observe que l'ouverture 1 1 du support est alignée avec l'ouverture 34 du joint et avec l'ouverture 15 du couvercle. Ces trois ouvertures 1 1 , 34 et 15 peuvent ainsi être alignées sur l'axe optique d'un microscope droit ou inversé pour permettre des mesures en transmission.
La figure 14 illustre un exemple de 70 champs images correspondant à 70 puits d'une chambre de culture et d'imagerie. On identifie les marques de repérage adjacentes aux puits malgré la présence de bulles formées en surface de la couche d'agarose.
Sur la figure 15, on acquiert des images au moyen d'un microscope à épi-fluorescence et à champ large pour effectuer des prises de vue en fonction du temps. De façon avantageuse, le microscope comporte une enceinte sous atmosphère contrôlée en température et en gaz entourant le porte-échantillon et la chambre de culture et d'imagerie. La figure 15A représente l'acquisition d'image de 50 capsules biologiques dans des puits au début de l'expérience (t=0) et la figure 15B représente l'image des mêmes puits à la fin de l'expérience (t=15h). Des images intermédiaires peuvent être acquises automatiquement par exemple toutes les 30 min. Dans un autre exemple, on utilise un microscope confocal à balayage laser pour acquérir des tranches à différentes altitudes en Z dans les cellules biologiques, avec un pas en Z de quelques microns par exemple. On peut ensuite reconstruire l'image en 3D des 50 capsules biologiques et suivre l'évolution des cellules avec une très haute résolution spatiale et temporelle.
Les figures 16A et 16B représentent des images composites comprenant des canaux de fluorescence superposés sur une image de microscopie en champ clair. Ces images permettent de suivre la trace du déplacement des noyaux cellulaires à l'intérieur d'une capsule en fonction du temps, représenté en figure 16C. La figure 16D illustre l'analyse directionnelle des mouvements des cellules de la figure 16C, qui peut permettre de déterminer l'interaction entre différentes populations de cellules biologiques. On observe que la capsule biologique ne bouge pas à l'intérieur d'un puits et ne se détériore pas. Cette chambre de culture et d'analyse permet d'analyser un grand nombre d'échantillons biologiques avec un rendement élevé, tout en fournissant des images de microscopie de haute résolution spatiale, en 2D ou en 3D et sur une longue durée d'expérience allant jusqu'à plusieurs dizaines d'heures ou même plusieurs jours.
Dans un autre exemple d'application, on utilise des puits ayant d'autres forme et/ou dimensions adaptées à d'autres échantillons. A titre d'exemple, on utilise un réseau de puits de forme parallélépipédique rectangle, comme décrits en lien avec la figure 7, pour disposer des larves de poisson zèbre transgéniques ayant un marqueur de noyau cellulaire, par exemple de type NLS::TagRFP. On utilise d'une part un microscope à champ large pour acquérir les images des larves fixées à 30 hpf (Fig. 17A-17C). D'autre part, on utilise un microscope confocal pour acquérir des images les mêmes larves incubées en plus dans un marqueur lipidique Bodipy 505/515 (Fig. 17D-17E). Un système de traitement d'image permet de reconstruire l'image des larves en 3D. Compte tenu de la taille des larves, on dispose 77 larves dans une chambre de culture et d'imagerie à 7 lignes et 1 1 colonnes. Un objectif de microscope 4X permet d'effectuer un balayage complet de la chambre (Fig. 17A). Un objectif de microscope 10X est utilisé pour balayer une zone réduite (5 lignes par 5 colonnes, représenté par un cadre sur la fig. 17A) avec une meilleure résolution spatiale (Fig. 17B). De façon remarquable, l'image de la figure 17C permet de distinguer les noyaux individuels des cellules marquées. On observe aussi que la marque de repérage de chaque puits est lisible, ce qui permet de retracer l'historique de développement de chaque larve individuellement et de pousser les analyses d'un individu particulier si nécessaire.
De manière plus générale, l'homme du métier adaptera aisément la forme et les dimensions des puits en fonction de l'échantillon biologique à étudier in vivo, en particulier à toutes sortes d'embryons et d'organoïdes.
La chambre de culture et d'imagerie de la présente divulgation est compatible avec de nombreux microscopes optiques.
Plus précisément, cette chambre de culture et d'imagerie est compatible avec tout type de microscopie comprenant un statif de microscope, une platine munie d'un porte échantillon destiné à recevoir une lame de microscopie et dont l'objectif et/ou le condenseur du microscope ont une distance frontale compatible avec l'encombrement spatial de la chambre de culture et d'imagerie.
En particulier, elle est compatible avec l'utilisation d'un microscope multi- photon, basé sur l'utilisation d'un faisceau d'excitation infrarouge qui permet une plus grande pénétration de la lumière dans un échantillon épais et une réduction de la phototoxicité du fait d'une excitation défocalisée (out-of-focus excitation). Un microscope à feuille de lumière peut aussi être utilisé pour le balayage rapide d'une feuille de lumière par balayage réel ou numérique, ce qui permet d'augmenter fortement la vitesse de balayage. Dans ce cas, on peut utiliser un microscope droit pour l'excitation et la collection ou un microscope ayant un axe optique incliné à 45 degrés.
La chambre de culture et d'imagerie est aussi compatible avec un microscope confocal, ou à disques tournants ou de super résolution.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Chambre de culture et d'imagerie (10) d'échantillons biologiques par microscopie optique, ladite chambre de culture et d'imagerie (10) comprenant :
- un support (1 ) et un couvercle (5), le support (1 ) comprenant au moins un logement intérieur (61 ) ;
- au moins une lamelle de microscope (2, 12) disposée face à une ouverture (1 1 , 15) formée dans le support (1 ) ou dans le couvercle (5) face audit logement intérieur ;
- un joint d'étanchéité (4, 24, 94) disposé entre le support (1 ) et le couvercle (5) en contact avec ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12), le joint d'étanchéité (4) délimitant au moins une autre ouverture (34) disposée face à la lamelle de microscope (2, 12);
- une couche d'hydrogel (6) disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture (34) du joint d'étanchéité (4, 24, 94), la couche d'hydrogel (6) comprenant un réseau de puits (26) ouverts formés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support (1 ), chaque puits (26) étant adapté pour recevoir un échantillon biologique ;
- le support, le couvercle et le joint étant configurés de manière à être rendus solidaires pour former une chambre de culture et d'imagerie (10) étanche vis-à-vis d'un liquide.
2. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 dans laquelle le support (1 ) et/ou le joint d'étanchéité (4, 94, 24) comporte une pluralité de compartiments étanches les uns par rapport aux autres, au moins un compartiment étanche comprenant ladite couche d'hydrogel (6) et ledit réseau de puits (26).
3. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le support (1 ) comporte une première ouverture (1 1 ), le couvercle (5) comporte une deuxième ouverture (15), ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12) comprenant une première lamelle de microscope (2) disposée face à la première ouverture (1 1 ) et une deuxième lamelle de microscope (12) disposée face à la deuxième ouverture (15), le joint d'étanchéité (4) étant en contact avec la première lamelle de microscope (2) et la deuxième lamelle de microscope (12).
4. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le couvercle (5) comporte une deuxième ouverture (15), ladite au moins une lamelle de microscope comporte une deuxième lamelle de microscope (12) disposée face à la deuxième ouverture (15) et un composant optique réfléchissant ou dichroïque disposé dans le logement intérieur du support.
5. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le support (1 ) comporte une première ouverture (1 1 ), ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12) comprenant une première lamelle de microscope (2) face à la première ouverture (1 1 ) et dans laquelle le couvercle (5) est opaque ou comporte un composant optique réfléchissant ou dichroïque.
6. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 5 dans laquelle au moins un puits (26) ouvert a une forme parallélépipédique, une forme cylindrique, une forme tronconique, une forme évasée ou une forme refermée au niveau d'une ouverture de puits.
7. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 6 dans laquelle le réseau de puits comporte au moins un puits ayant une paroi inclinée par rapport à une surface horizontale de la couche d'hydrogel d'un angle supérieur à 0 et inférieur ou égal à 135 degrés.
8. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 7 dans laquelle le réseau de puits comporte au moins un puits ayant un fond plat ou concave formé dans la couche d'hydrogel et/ou au moins un puits ayant un fond formé par une surface de lamelle de microscope (2).
9. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 8 dans laquelle la couche d'hydrogel comporte une pluralité de marques de repérage (46), chaque marque de repérage (46) étant disposée à proximité d'un puits (26) et étant configurée pour identifier ce puits (26).
PCT/FR2017/053707 2016-12-22 2017-12-19 Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques WO2018115723A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1663241A FR3061203A1 (fr) 2016-12-22 2016-12-22 Chambre de culture et d'imagerie d'echantillons biologiques
FR1663241 2016-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018115723A1 true WO2018115723A1 (fr) 2018-06-28

Family

ID=58547612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2017/053707 WO2018115723A1 (fr) 2016-12-22 2017-12-19 Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3061203A1 (fr)
WO (1) WO2018115723A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110548549A (zh) * 2019-08-22 2019-12-10 北京戴纳实验科技有限公司 实验室隔离操作箱
IT202000003043A1 (it) * 2020-02-14 2021-08-14 Bioevo S R L Dispositivo e metodo per il trasporto, la conservazione, la preparazione e l’analisi di campioni biologici.
WO2023235884A1 (fr) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions et méthodes
WO2024059079A1 (fr) * 2022-09-13 2024-03-21 Quantum-Si Incorporated Ensemble puce de capteur et ses procédés de fabrication

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3098525B1 (fr) * 2019-07-12 2022-05-27 Centre Nat Rech Scient Plaque multi-puits et son procédé de préparation
WO2022026846A1 (fr) * 2020-07-30 2022-02-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Insert pour la préparation de chambres de culture cellulaire

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4435508A (en) * 1981-11-20 1984-03-06 Gabridge Michael G Tissue culture vessel
DE10118905A1 (de) * 2001-04-18 2002-10-24 Evotec Ag Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Verteilen von Partikeln
US20090305397A1 (en) * 2005-03-16 2009-12-10 John Robert Dodgson Cellular entity maturation and transportation systems
US8569046B2 (en) * 2009-02-20 2013-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Microarray with microchannels
EP2799535A1 (fr) * 2013-04-29 2014-11-05 FOM Institute for Atomic and Molecular Physics Membrane microstructurée destinée à être utilisée dans une cellule d'écoulement

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4435508A (en) * 1981-11-20 1984-03-06 Gabridge Michael G Tissue culture vessel
DE10118905A1 (de) * 2001-04-18 2002-10-24 Evotec Ag Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Verteilen von Partikeln
US20090305397A1 (en) * 2005-03-16 2009-12-10 John Robert Dodgson Cellular entity maturation and transportation systems
US8569046B2 (en) * 2009-02-20 2013-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Microarray with microchannels
EP2799535A1 (fr) * 2013-04-29 2014-11-05 FOM Institute for Atomic and Molecular Physics Membrane microstructurée destinée à être utilisée dans une cellule d'écoulement

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. CLARKE: "Live imaging of development in fish embryos", SEMIN CELL DEV BIOL, vol. 20, no. 8, 2009, pages 942 - 6, XP026756955, DOI: doi:10.1016/j.semcdb.2009.08.003

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110548549A (zh) * 2019-08-22 2019-12-10 北京戴纳实验科技有限公司 实验室隔离操作箱
CN110548549B (zh) * 2019-08-22 2021-11-02 北京戴纳实验科技有限公司 实验室隔离操作箱
IT202000003043A1 (it) * 2020-02-14 2021-08-14 Bioevo S R L Dispositivo e metodo per il trasporto, la conservazione, la preparazione e l’analisi di campioni biologici.
WO2023235884A1 (fr) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions et méthodes
WO2024059079A1 (fr) * 2022-09-13 2024-03-21 Quantum-Si Incorporated Ensemble puce de capteur et ses procédés de fabrication

Also Published As

Publication number Publication date
FR3061203A1 (fr) 2018-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018115723A1 (fr) Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques
US10620419B2 (en) Arrangement for light sheet microscopy
Cadart et al. Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells
JP6492073B2 (ja) 光シート顕微鏡検査用の装置
EP2781591B1 (fr) Plateau, système et procédé de surveillance et de mise en culture d'une culture cellulaire
US9904248B2 (en) Digital holographic microscope with fluid systems
US9804378B2 (en) Arrangement for light sheet microscopy
CN102067046A (zh) 透明生物物体的分析
JP4731847B2 (ja) ペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法
JP6851582B2 (ja) 細胞培養用顕微鏡スライドの改良およびそれに関連する改良
Heiligenstein et al. The CryoCapsule: simplifying correlative light to electron microscopy
US10385305B2 (en) Device for measuring activity of cultured cells, microchamber and method of measuring activity of cultured cells
JP6832954B2 (ja) 培養機器
KR102127765B1 (ko) 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
Wollrab et al. Ordering single cells and single embryos in 3D confinement: a new device for high content screening
US20220401951A1 (en) Rapid cell culture test device including island structures
GB2546408A (en) Temperature regulating container
KR102145842B1 (ko) 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치
US20180267286A1 (en) Observation Device with Optical Compensation
Hochstetter Presegmentation Procedure Generates Smooth-Sided Microfluidic Devices: Unlocking Multiangle Imaging for Everyone?
JP2016182091A (ja) 細胞培養器及び細胞培養方法
JP6839599B2 (ja) 観察装置
Grenci et al. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids
Bélanger et al. Low-cost production and sealing procedure of mechanical parts of a versatile 3D-printed perfusion chamber for digital holographic microscopy of primary neurons in culture
Aredia et al. An innovative cell microincubator for drug discovery based on 3D silicon structures

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17828977

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17828977

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1