WO2018115723A1 - Chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques - Google Patents

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WO2018115723A1
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Gaelle Recher
Kévin Alessandri
Laetitia ANDRIQUE
Pierre Nassoy
Maxime FEYEUX
Andréas BIKFALVI
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Universite de Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale - Inserm
Institut D'optique Graduate School
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Abstract

L'invention concerne une chambre de culture et d'imagerie (10) comprenant un support (1) rigide et un couvercle (5), au moins une lamelle de microscope (2, 12) disposée face à une ouverture (11, 15) formée dans le support (1) ou dans le couvercle (5), un joint d'étanchéité(4, 14, 24) comprenant au moins une autre ouverture (34) disposée face à la lamelle de microscope (2, 12) et une couche d'hydrogel (6) disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture (34) du joint d'étanchéité (4, 14, 24), la couche d'hydrogel (6) comprenant un réseau de puits, le réseau de puits comprenant une pluralité de puits (26) ouverts de dimensions millimétriques ou sub-millimétriques disposés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support (1), chaque puits (26) étant adapté pour recevoir un échantillon biologique.

Description

CHAMBRE DE CULTURE ET D'IMAGERIE D'ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES

DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale le domaine des dispositifs et méthodes pour la culture et l'observation d'échantillons biologiques.

Dans le présent document, on entend par échantillon biologique des cellules biologiques à 3D telles que des sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires (cellules à 3D), des embryons ou encore des capsules contenant des cellules biologiques.

Elle concerne plus particulièrement un porte-échantillon pour microscope optique adapté pour visualiser par exemple l'évolution spatiale et temporelle d'organismes biologiques vivants ou pour imager des échantillons fixés, à titre d'exemple fixateurs de types PFA et marqués par des tout type de marqueur, tels que des anticorps contre des protéines.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

La microscopie optique est couramment utilisée en biologie ou en biomédecine pour la visualisation de processus biologiques dans des organismes ou cellules biologiques. Différents champs de la biologie parmi lesquels la biologie du développement, les cellules souches, l'ingénierie des tissus ou la biophysique s'intéressent à l'étude et l'analyse des processus au niveau cellulaire. Toutefois, ces analyses nécessitent l'acquisition d'images de haute résolution spatiale et temporelle, de manière répétitive, en grande quantité et avec un rendement suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Les microscopes optiques actuels proposent différentes techniques et configurations d'imagerie telles que la microscopie confocale, multi-photonique ou à disque rotatif qui offrent une excellente résolution spatiale et temporelle pour l'étude d'un échantillon particulier. Cependant, ces appareils de microscopie ne permettent pas de monter et traiter automatiquement un grand nombre d'échantillons biologiques avec un rendement élevé.

II existe des chambres de culture, par exemple de type boîte de Pétri, qui permettent de faire croître des échantillons biologiques vivants dans un milieu de culture liquide.

Des dispositifs particuliers pour immobiliser des échantillons biologiques vivants ont été développés dans certains laboratoires. Comme résumé dans un article de revue, J. Clarke (« Live imaging of development in fish embryos », Semin cell Dev Biol, 20(8), 942-6, 2009) il a été démontré la visualisation de larves de poisson zèbre inclus dans un gel d'agarose. Bien que cette approche soit facile à mettre en œuvre, elle ne convient pas pour le suivi à long terme du développement de ces larves du fait des contraintes mécaniques générées par la croissance des larves dans le gel d'agarose. De plus, ce procédé n'est pas automatisé, si bien qu'il est difficile d'obtenir un grand nombre d'échantillons pour obtenir des statistiques fiables.

On connaît aussi une chambre de culture comprenant un réseau de puits cylindriques formés par gravure dans un substrat de verre épais. Toutefois, une telle chambre de culture n'est pas compatible avec une visualisation par microscope optique en configuration droite.

Or, les échantillons biologiques présentent une grande variété de forme, de dimension et de conditions de développement. A titre d'exemple, les larves de poisson zèbre ont une forme allongée et sont très tolérantes vis-à-vis des conditions de culture. D'autres embryons ont une forme sphérique mais sont plus exigeants en termes de conditions de culture. Une autre catégorie d'échantillons biologiques en trois dimensions regroupe les agrégats multicellulaires, sphéroïdes, organoïdes, les embryons et les capsules contenant des cellules biologiques.

Dans des expériences de biologie ou de biomédecine par exemple, il est souhaitable de tester des médicaments sur des modèles in vivo avec un rendement élevé. Il est alors nécessaire d'effectuer des acquisitions d'image automatisées sur de nombreuses cibles avec une haute résolution spatiale et temporelle.

II n'existe pas de dispositif pratique permettant de positionner précisément un grand nombre d'échantillons biologiques vivants sur un porte-échantillon de microscope optique tout en réduisant les interactions mécaniques ou biochimiques sur ces échantillons biologiques vivants.

OBJET DE L'INVENTION

Afin de remédier à l'inconvénient précité de l'état de la technique, la présente invention propose une chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques par microscopie optique, ladite chambre de culture et d'imagerie comprenant un support et un couvercle, le support comprenant au moins un logement intérieur, au moins une lamelle de microscope disposée face à une ouverture formée dans le support ou dans le couvercle face audit logement intérieur, un joint d'étanchéité disposé entre le support et le couvercle en contact avec ladite au moins une lamelle de microscope, le joint d'étanchéité délimitant au moins une autre ouverture disposée face à la lamelle de microscope, une couche d'hydrogel disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture du joint d'étanchéité, la couche d'hydrogel comprenant un réseau de puits ouverts formés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support, chaque puits étant adapté pour recevoir un échantillon biologique, le support, le couvercle et le joint étant configurés de manière à être rendus solidaires pour former une chambre de culture et d'imagerie étanche vis-à-vis d'un liquide.

Cette chambre de culture et d'imagerie est compatible avec l'imagerie sur de nombreux microscopes, est peu coûteuse à fabriquer, facile à assembler, à transporter, tout en assurant l'étanchéité au liquide et la perméabilité au gaz du milieu en culture. Elle permet de positionner individuellement des échantillons biologiques avec une précision micrométrique sans appliquer de contrainte mécanique sur ces échantillons biologiques.

De façon avantageuse, la chambre de culture et d'imagerie comporte les moyens mécaniques de maintien adaptés pour maintenir le joint d'étanchéité entre le support et le couvercle.

D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses de la chambre de culture et d'imagerie conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :

- les puits sont de dimensions millimétriques ou sub-millimétriques ou même allant jusqu'à des dimensions micrométriques ;

- le support et/ou le joint d'étanchéité comporte une pluralité de compartiments étanches les uns par rapport aux autres, au moins un compartiment étanche comprenant ladite couche d'hydrogel et ledit réseau de puits;

- le support comporte une première ouverture, le couvercle comporte une deuxième ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comprenant une première lamelle de microscope disposée face à la première ouverture et une deuxième lamelle de microscope disposée face à la deuxième ouverture, le joint d'étanchéité étant en contact avec la première lamelle de microscope et la deuxième lamelle de microscope ; - le couvercle est opaque ou le couvercle comporte une deuxième ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comporte une deuxième lamelle de microscope disposée face à la deuxième ouverture et un composant optique réfléchissant ou dichroïque disposé dans le logement intérieur du support ;

- le support est opaque ou le support comporte une première ouverture, ladite au moins une lamelle de microscope comprenant une première lamelle de microscope face à la première ouverture et dans laquelle le couvercle est opaque ou comporte un composant optique réfléchissant ou dichroïque ;

- le réseau de puits ouverts est disposé suivant une grille ayant un pas prédéfini suivant une direction ou deux directions transverses dans le repère orthonormé ;

- le réseau de puits comporte au moins un puits ouvert ayant une forme parallélépipédique, une forme cylindrique, une forme tronconique, une forme évasée ou une forme refermée au niveau d'une ouverture de puits ;

- le réseau de puits comporte au moins un puits ayant une paroi inclinée par rapport à une surface horizontale de la couche d'hydrogel d'un angle supérieur à 0 degrés et inférieur à 135 degrés, ou 1 10 degrés ou de préférence inférieur à 100 degrés, ladite surface horizontale de la couche d'hydrogel étant celle où se trouvent les ouvertures des puits ;

- le réseau de puits comporte au moins un puits ayant un fond plat ou concave formé dans la couche d'hydrogel et/ou au moins un puits ayant un fond formé par une surface de lamelle de microscope ;

- la couche d'hydrogel comporte une pluralité de marques de repérage, chaque marque de repérage étant disposée à proximité d'un puits et étant configurée pour identifier ce puits ;

- une cuvette est formée dans la couche d'hydrogel et est adaptée pour recevoir un liquide d'immersion ;

- le support, le couvercle et le joint d'étanchéité sont formés par moulage ou par impression en trois dimensions à partir de matériaux polymères, de préférence biocompatibles ;

- le support rigide comporte plusieurs ouvertures et est adapté pour recevoir une lamelle de microscope face à chaque ouverture de support ;

- le support comporte une cloison séparant le logement intérieur en compartiments étanches, chaque compartiment comprenant un joint d'étanchéité et une lamelle de microscope ;

- le joint d'étanchéité a une section rectangulaire ou carrée ;

- le support comporte au moins une ailette latérale adaptée pour recevoir une pince de fixation de lame de microscope sur un porte-échantillon de microscope optique et pour maintenir le support sur le porte-échantillon de microscope optique ;

- la lamelle de microscope est en verre, en matériau polymère et/ou comporte un revêtement en couche mince adapté pour augmenter l'adhérence d'un échantillon biologique ;

L'invention propose également un procédé de fabrication d'une chambre de culture et d'imagerie d'échantillons biologiques par microscopie comprenant les étapes suivantes :

- fabriquer par stéréo-lithographie à partir d'une résine un tampon comprenant une pluralité de saillies ayant une base de dimension transverse millimétrique ou submillimétrique et une hauteur de dimension millimétrique ou submillimétrique ;

- disposer une première lamelle de microscope dans un logement intérieur d'un support rigide,

- disposer un joint d'étanchéité dans le logement intérieur du support rigide, le joint d'étanchéité ayant une ouverture et le joint d'étanchéité ayant une surface inférieure en contact avec la lamelle de microscope,

- verser une couche d'hydrogel liquide dans l'ouverture du joint d'étanchéité de manière à recouvrir la surface de la lamelle de microscope ;

- former une empreinte du tampon dans la couche d'hydrogel liquide, de manière à obtenir une couche d'hydrogel gélifiée comprenant l'empreinte de la pluralité de saillies du tampon et formant un réseau de puits de dimensions égales aux dimensions des saillies du tampon ;

- prélever au moins un échantillon biologique et disposer l'échantillon biologique dans un puits du réseau de puits; et

- fixer un couvercle sur le support pour fermer de manière étanche la chambre de culture et d'imagerie ainsi formée.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE D'UN EXEMPLE DE RÉALISATION La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.

Sur les dessins annexés :

- la figure 1 représente une vue éclatée des composants d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 2 représente une vue éclatée des éléments d'un moule pour former un joint d'étanchéité ;

- la figure 3 représente des vues de dessus et en coupe selon la ligne A- A et selon la ligne B-B d'un exemple de joint d'étanchéité ;

- la figure 4 représente une vue en perspective d'un exemple de tampon muni d'un réseau de saillies pour former un réseau de puits par empreinte dans une couche d'hydrogel ;

- la figure 5 représente des vues de dessus et, respectivement, en coupe selon la ligne A-A et la ligne B-B, d'un exemple de tampon pour marquer par empreinte un réseau de puits dans une couche d'hydrogel ;

- la figure 6 représente des vues de détail d'un exemple de saillie pour former un puits de forme évasée ;

- la figure 7 représente des vues de détail d'un autre exemple de saillie pour former un puits de forme parallélépipédique rectangle ;

- la figure 8 illustre les étapes de construction d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 9 représente des exemples de support et de joints d'étanchéité formant des compartiments étanches selon un autre mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 10A représente une vue d'un détail d'un exemple de tampon et la fig. 10B une vue d'un détail d'une couche d'hydrogel dans laquelle est formé par empreinte du tampon de la fig. 10A un réseau de puits avec marques de repérage locales associées à chaque puits ;

- la figure 1 1 illustre en vue de microscopie un exemple de puits ;

- la figure 12 illustre schématiquement un exemple de procédé de transfert d'objets biologiques d'une boite de culture vers les puits d'une chambre de culture et d'imagerie ;

- la figure 13 illustre le positionnement d'une chambre de culture et d'imagerie sur un porte-échantillon de microscope optique ;

- la figure 14 représente une image reconstituée à partir de 70 images de microscopie optique suivant une grille de pas rectangulaire, chaque puits comprenant une capsule biologique ;

- les figures 15A-15B représentent des images composées de 50 images d'un réseau de puits comprenant des capsules biologiques prises respectivement à un instant t= 0 et à un autre instant t= 15h ;

- la figure 16 représente un exemple de puits pour une expérience sur une capsule biologique et les trajectoires de plusieurs noyaux cellulaires au sein de cette capsule ;

- la figure 17 représente un autre exemple de réseau de puits pour une expérience sur des larves de poisson zèbre.

Dispositif et procédé

La présente divulgation propose une chambre de culture et d'imagerie pouvant être entièrement fabriquée et assemblée par l'utilisateur à partir de composants courants tels que des lamelles de microscope, des matériaux peu coûteux, tels qu'un hydrogel (par exemple d'agarose, méthylcellulose, phytagel) et un élastomère (par exemple de silicone) et des pièces fabriquées par stéréo- lithographie en 3D au moyen d'une imprimante 3D ayant une résolution d'au moins 50 μιτι dans chaque direction et utilisant une résine. De préférence, la résine utilisée est une résine biocompatible.

Sur la figure 1 , on a représenté les composants d'une chambre de culture et d'imagerie selon un mode de réalisation de l'invention. Les différents composants sont ici démontés et placés les uns à côté des autres dans un repère (XYZ). La chambre de culture et d'imagerie comporte un support 1 , une première lamelle de microscope 2, une couche d'hydrogel 6, un joint d'étanchéité 4, un couvercle 5 et une deuxième lamelle de microscope 12.

Pour la suite de la description, une direction verticale est une direction parallèle à l'axe OZ, le plan longitudinal est perpendiculaire à la direction verticale.

Le support 1 a une longueur de 76 mm et une largeur de 26 mm qui correspondent aux dimensions d'une lame classique de microscope. Dans cet exemple, le support 1 comporte un fond plat parallèle au plan longitudinal ayant une ouverture 1 1 et des rebords inférieurs 51 délimitant l'ouverture 1 1 . Le support comporte aussi des parois 41 s'étendant selon la direction verticale sur quatre côtés transversalement au fond sur une hauteur de quelques millimètres et des rebords supérieurs 71 . Le fond du support est adapté pour recevoir une lamelle de microscope 2 ayant une longueur de 50 mm et une largeur de 24 mm. L'ouverture 1 1 est ici rectangulaire de longueur et de largeur inférieures respectivement à la longueur et la largeur de la lamelle de microscope 2. Les rebords 51 du fond et les parois 41 du support 1 forment ainsi un logement intérieur 61 adapté pour recevoir et maintenir la lamelle de microscope 2 face à l'ouverture 1 1 . L'ouverture 1 1 du support 1 fournit ainsi un accès optique sur le logement intérieur 61 . De façon avantageuse, le support 1 comporte ici deux ailettes 21 extérieures disposées dans le prolongement de la longueur du support pour permettre de manipuler ou fixer la chambre de culture et d'imagerie sur un porte-échantillon de microscope.

Le couvercle 5 est de forme générale rectangulaire et comporte une face supérieure 35 plane et des bords 45. Les bords 45 s'étendent transversalement selon la direction verticale à la face supérieure 35 du couvercle sur quatre côtés pour former une jupe. Les bords 45 du couvercle 5 sont adaptés pour s'ajuster sur les rebords supérieurs 71 du support 1 . La face supérieure 35 du couvercle comporte ici une ouverture 15 de forme rectangulaire, ayant une longueur d'environ 44 mm et respectivement une largeur d'environ 18 mm, qui sont inférieures à la longueur et respectivement à la largeur d'une lamelle de microscope standard. Une fente 25 est ménagée dans un des bords du couvercle pour permettre l'insertion de la deuxième lamelle de microscope 12. De façon avantageuse, le couvercle comporte des rails de guidage pour guider et maintenir la lamelle 12 dans le couvercle 5. Ainsi, la lamelle 12 recouvre entièrement l'ouverture 15 du couvercle. Le couvercle et le support sont maintenus ensemble, de manière réversible et étanche, par l'intermédiaire du joint d'étanchéité 4. Plus précisément, le couvercle s'emboite sur les rebords du joint d'étanchéité 4 qui dépassent à l'extérieur du logement intérieur 61 . L'ouverture 15 du couvercle 5 fournit un accès optique sur le logement intérieur 61 . De façon avantageuse, lorsque le couvercle 5 est positionné sur le support 1 , l'ouverture 15 du couvercle 5 est alignée sur l'ouverture 1 1 du support 1 .

Le couvercle 5 et le support 1 sont de préférence fabriqués par stéréo- lithographie en 3D, par exemple au moyen d'une imprimante de type Micro-Plus Hi-Re d'Envision City ayant une résolution d'au moins 50 μιτι et de préférence de 25 μιτι dans chaque direction dans chaque direction. On utilise une résine biocompatible telle que la résine HTM140 d'Envision City. La résine présente une faible viscosité avant photo-polymérisation et une grande rigidité après photo- polymérisation. Après durcissement, le support 1 et le couvercle 5 peuvent être stérilisés en autoclave un grand nombre de fois. Ainsi, on dispose d'un support 1 et d'un couvercle 5 rigides. Toutefois, il est facile de fixer le couvercle sur le support. Le couvercle est amovible par exemple pour changer le contenu de la chambre de culture et d'imagerie ou changer le liquide de culture.

Le joint d'étanchéité 4 est de préférence un joint en silicone, par exemple en polydiméthylsiloxane (PDMS). Le joint d'étanchéité a ici la forme générale d'un cadre 14 de section rectangulaire entourant une ouverture 34 rectangulaire. Le joint 4 est de préférence formé par moulage. Le joint 4 a une épaisseur dimensionnée de manière à ce qu'il soit en appui suivant une ligne continue et fermée sur la première lamelle de microscope 2 et suivant une autre ligne continue et fermée sur la deuxième lamelle de microscope 12, lorsque le couvercle 5 est fixé au support 1 . La partie inférieure du cadre 14 du joint d'étanchéité forme une collerette 94. La collerette est dimensionnée de sorte que lorsque le joint 4 est disposé en appui sur la première lamelle de microscope dans le logement intérieur 61 , la partie supérieure du cadre 14 dépasse les parois 41 du support. Lorsque le couvercle 5 est positionné sur le support 1 , les bords 45 du couvercle s'emboitent sur la partie supérieure du cadre 14 pour maintenir le couvercle fixé sur le support de manière étanche. Le joint d'étanchéité 4, par exemple en PDMS, peut aussi être stérilisé en autoclave un grand nombre de fois. De manière générale, les différents éléments du dispositif, mis à part la couche d'hydrogel, sont autoclavables individuellement et/ou assemblés.

La fabrication de la couche d'hydrogel 6 sera décrite plus en détail par la suite. La couche d'hydrogel 6 comporte un réseau de puits ouverts formés par estampage ou par marquage d'une empreinte. La couche d'hydrogel 6 est de préférence constituée d'un gel d'agarose. L'agarose présente plusieurs avantages en tant que support pour former les puits, notamment d'être facile à modeler, d'être transparent dans le domaine visible et d'être neutre pour la plupart des échantillons biologiques vivants. Dans des variantes, la couche d'hydrogel est constituée d'un phytogel, d'un gel de méthylcellulose, d'un gel d'alginate ou d'un polymère fluoré. La couche d'hydrogel 6 est destinée à être positionnée sur la première lamelle de microscope 2 et à l'intérieur du joint d'étanchéité 4.

Le joint d'étanchéité 4 est un joint étanche vis-à-vis d'un liquide d'immersion et perméable au gaz. Ainsi, le volume délimité par les deux lamelles de microscope 2, 12 et le joint d'étanchéité 4 est un volume qui est étanche vis-à- vis d'un liquide d'immersion, mais qui permet les échanges gazeux. La couche d'hydrogel est disposée à l'intérieur de ce volume. Il existe différentes modalités d'imagerie en microscopie qui peuvent nécessiter un seul ou deux accès optiques. Ainsi, en microscopie de fluorescence, l'excitation et l'émission se font au moyen du même objectif de microscope, un seul accès optique est alors suffisant. Par contre, pour l'imagerie en champ clair (ou bright field microscopy) ou pour la microscopie en transmission (par exemple l'imagerie en champ sombre, en polarisation, par génération de seconde harmonique ou SHG, ou plus généralement tout mode de génération de contraste pour l'imagerie nécessitant une détection en transmission), les deux accès optiques sont nécessaires. La première lamelle de microscope 2 permet par exemple de visualiser la couche d'hydrogel 6 au moyen d'un microscope inversé. La deuxième lamelle de microscope 12 permet par exemple de visualiser la couche d'hydrogel 6 au moyen d'un microscope droit. On dispose ainsi d'une chambre de culture et d'imagerie qui est étanche au liquide et perméable au gaz.

La chambre de culture et d'imagerie est facilement démontable. Le support 1 , le couvercle 5 et le joint d'étanchéité 4 peuvent être stérilisés pour une réutilisation. Les lamelles de microscope 2, 12 sont peu onéreuses. La couche d'hydrogel est facile à fabriquer et également peu onéreuse. La couche d'hydrogel fait partie des éléments consommables.

La figure 2 illustre un exemple de dispositif de moulage pour former un joint d'étanchéité. Sur la figure 2A, on a représenté en vue éclatée les différents éléments du moule et le joint obtenu. Le dispositif de moulage comporte un cadre extérieur 74, un cadre intérieur 64 et un croisillon 84 pour positionner le cadre intérieur 64 par rapport au cadre extérieur 74. Sur la figure 2B, on a représenté le dispositif de moulage monté. Pour former le joint, on coule une résine de PDMS liquide (par exemple Sylgard 184, Corning mélangée avec 10% d'un agent de durcissement) dans l'interstice entre le cadre intérieur 64 et le cadre extérieur 74 du moule. Après environ 3h de durcissement, on retire le joint d'étanchéité 4 du dispositif de moulage.

La figure 3 représente des vues de dessus et en coupe selon les lignes B-B et C-C d'un joint d'étanchéité 4 ainsi obtenu. Le joint d'étanchéité 4 comporte une large ouverture 34 rectangulaire d'environ 18 mm de large et 45 mm de long. Le joint d'étanchéité 4 a une épaisseur totale d'environ 7 mm. Le joint 4 comporte avantageusement une surface inférieure 44 plane et une surface supérieure 54 plane. Le joint d'étanchéité 4 est placé sur la première lamelle de microscope 2 dans le logement 61 du support 1 , de manière à ce que la surface inférieure 44 forme une ligne de contact continue et fermée avec la surface supérieure de la première lamelle 2 de microscope. La deuxième lamelle de microscope 12 étant insérée dans le couvercle 5, le couvercle 5 est posé sur le support 1 de manière à fermer la chambre de culture et d'imagerie. Ainsi, la surface supérieure 54 du joint d'étanchéité 4 forme une autre ligne de contact continue et fermée avec la surface inférieure de la deuxième lamelle de microscope 12. Aucune colle n'est utilisée entre les différents composants de la chambre de culture et d'imagerie. On obtient ainsi une chambre de culture et d'imagerie étanche sans colle ce qui permet d'éviter tout risque de contamination des échantillons biologiques à l'intérieur de la chambre de culture et d'imagerie.

Nous allons maintenant décrire la fabrication du réseau de puits ouverts destinés à recevoir des échantillons biologiques.

On fabrique tout d'abord un tampon 13 comprenant une pluralité de saillies en relief. Le tampon est ensuite utilisé pour former par estampage un réseau de puits dans une couche d'hydrogel. Le tampon 13 est de préférence fabriqué par stéréo-lithographie en 3D au moyen d'une imprimante 3D ayant une résolution d'au moins 50 μιτι et de préférence de 25 μιτι dans chaque direction. On utilise par exemple l'imprimante de type Micro-Plus Hi-Re d'Envision City et une résine biocompatible telle que la résine HTM140 d'Envision City.

Les figures 4-5 illustrent un exemple de tampon 13 comportant une pluralité de saillies 23 en relief disposées ici suivant un réseau régulier à deux dimensions. Par exemple le tampon comporte 7 lignes et 1 1 colonnes, soit 77 saillies, ou encore 9 lignes et 17 colonnes, soit 153 saillies. La forme, les dimensions et les positions relatives des saillies 23 déterminent la forme inverse, les dimensions et les positions des puits que l'on cherche à fabriquer. De préférence, les saillies du tampon ont toutes la même forme et les mêmes dimensions et sont disposées suivant un maillage régulier à une ou deux dimensions. La hauteur des saillies est choisie pour être de préférence supérieure ou égale à 5 fois la dimension des échantillons biologiques considérés. De façon avantageuse, le tampon 13 comporte des pieds 33 qui servent à déterminer la distance des puits par rapport à la lamelle de microscope. De préférence, les pieds 33 du tampon 13 ont une hauteur supérieure ou égale à la hauteur des saillies 23. Le tampon 13 a une longueur totale et une largeur légèrement inférieures respectivement à la longueur et la largeur de l'ouverture 34 du joint 4.

La figure 6 représente un exemple de saillie 23 pour former un puits adapté pour recevoir un objet biologique de forme sphérique et de diamètre compris entre 100 μιτι et 300 μιτι environ. La saillie 23 a une hauteur d'environ 1 ,2 mm. La saillie a ici une base rectangulaire de 1 mm par 0,5 mm et un sommet 53 en forme de disque de 0,3 mm de diamètre. La forme de puits correspondante est une forme évasée qui permet de positionner précisément en 3D et de maintenir un objet biologique sphérique sans appliquer de contrainte mécanique. De façon particulièrement avantageuse, le tampon 13 comporte aussi une marque 43 en relief ou en creux adjacente à la saillie 23. Cette marque 43 est destinée à générer une marque de repérage spécifique au voisinage de chaque puits afin de permettre une identification et un repérage aisé de chaque puits sur les images de microscopie.

La figure 7 représente un autre exemple de saillie 23 pour former un puits adapté pour recevoir un objet biologique de forme allongée, par exemple une larve de poisson zèbre. La saillie 23 est ici de forme parallélépipédique rectangle. La saillie 23 a une hauteur d'environ 1 mm et un sommet 53 rectangulaire d'environ 1 ,5 mm par 0,7 mm. La forme de puits parallélépipédique correspondante empêche les mouvements de rotation d'une larve sur elle-même tout en réduisant les contraintes mécaniques appliquées sur la larve.

La figure 8 illustre un exemple de procédé de fabrication et d'assemblage d'une chambre de culture et d'imagerie. Sur la figure 8A, on a disposé une première lamelle de microscope 2 dans le logement d'un support 1 posé à plat sur une table. Un joint d'étanchéité 4 est disposé sur la lamelle de microscope 2 et maintenu dans le logement intérieur 61 par un ajustement dimensionnel du support 1 de manière à former une ligne d'étanchéité continue et fermée entre la lamelle de microscope 2 et la surface inférieure 44 du joint 4. Un hydrogel sous forme liquide est versé dans l'ouverture 34 du joint d'étanchéité 4 de manière à former une couche d'hydrogel liquide recouvrant la surface de la lamelle de microscope 2 à l'intérieur du joint d'étanchéité 4. A titre d'exemple, on utilise environ 2 mL d'agarose chauffé à une température adaptée pour qu'il soit liquide. Sur la figure 8B, avant durcissement de l'hydrogel, la surface du tampon 13 comprenant le réseau de saillies 23 est appliqué à la couche d'hydrogel liquide tout en évitant la formation de bulles. Les pieds 33 du tampon sont avantageusement en contact avec la surface de la lamelle de microscope 2. L'ensemble est refroidi, par exemple à une température de 4°C pendant quelques minutes jusqu'à ce que la couche d'hydrogel soit gélifiée.

A l'étape de la figure 8C, on retire le tampon après gel de la couche d'agarose. La couche d'agarose gélifiée comporte ainsi l'empreinte des saillies 23 du tampon 13 qui forment un réseau de puits dans la couche d'agarose. Les positions et dimensions de chaque puits sont ainsi déterminées précisément en trois dimensions. Chaque puits forme une cavité ayant une ouverture de puits formée sur la surface de la couche d'agarose gélifiée, chaque ouverture de puits étant de dimension transverse millimétrique ou sub-millimétrique et chaque puits ayant une profondeur millimétrique. Par construction, les puits sont en effet disposés sur la même grille que les saillies du tampon. Les puits ont les mêmes dimensions que les saillies correspondantes du tampon.

De façon particulièrement avantageuse, le fond de chaque puits est situé à une même et unique distance de la lamelle de microscope ce qui facilite l'acquisition automatique d'images de microscopie sur chaque puits sans nécessiter une étape de mise au point entre chaque image.

Sur la figure 8D on verse un milieu liquide approprié à la culture et à l'imagerie des objets biologiques considérés. Ce milieu liquide est par exemple une solution aqueuse saline de type PBS, phosphate buffer saline, et dérivés ou un milieu de cultures aqueux adapté aux cultures de cellules 3D, supplémentés ou non en molécules pharmacologiques ou en molécules visant à apporter un marquage exogène fluorescent ou chromogénique ou autre, ou en tout autre molécules d'intérêt biologique devant être appliqué par balnéation. A l'étape de la figure 8E, on positionne le couvercle 5 muni de la deuxième lame de microscope sur le support 1 . La deuxième lame de microscope 12 vient en contact avec la surface supérieure 54 du joint d'étanchéité 4. La chambre de culture et d'imagerie est alors étanche vis-à-vis des liquides tout en restant perméable aux gaz. L'ouverture 1 1 du support 1 est alignée sur l'ouverture 34 du joint d'étanchéité et sur l'ouverture 15 du couvercle 5. Selon les besoins de l'expérience, la chambre de culture et d'imagerie peut être placée dans un incubateur pour permettre au milieu liquide de diffuser dans la couche d'agarose et/ou pour équilibrer les échanges gazeux.

Après avoir disposé les échantillons biologiques dans les puits de la couche d'hydrogel, la chambre de culture et d'imagerie est disposée sur un porte- échantillon de microscope comme illustré sur la figure 8F. L'objectif et/ou le condenseur 100 du microscope est ici placé au-dessus de la chambre de culture et d'imagerie.

La hauteur totale de la chambre de culture et d'imagerie est inférieure à 8 mm et compatible avec la plupart des microscopes optiques. Selon les modalités de l'imagerie par réflexion ou par transmission, la lamelle 2 et/ou la lamelle 12 permettent la collection d'un signal par réflexion et/ou par transmission.

La durée totale pour l'assemblage d'une chambre de culture et d'imagerie est inférieure à 10 minutes. Le chargement des échantillons biologiques peut être réalisé de manière rapide et très efficace.

La figure 9 illustre une variante de joint d'étanchéité 24 comprenant ici deux ouvertures 134. Chaque ouverture 134 du joint d'étanchéité 24 forme ici un compartiment. Un tel joint peut être disposé dans un support tel qu'illustré sur la figure 1 pour former deux compartiments étanches l'un par rapport à l'autre. Ce joint 24 permet par exemple de former un réseau de puits identique dans chaque compartiment du joint 24. Les deux ouvertures 134 sont destinées à être disposées face à une ouverture du support 1 ou du couvercle 5.

Selon une autre variante illustrée sur la figure 9, le support 1 comporte deux compartiments séparés par une cloison 31 . Un joint d'étanchéité 94 adapté aux dimensions de chaque compartiment permet de disposer de deux réseaux de puits formés dans deux couches d'agarose, les deux compartiments étant étanches l'un par rapport à l'autre tout en étant formés dans le même support 1 . Chaque joint d'étanchéité 94 comporte une ouverture 234 disposée face à une ouverture 1 1 1 d'un compartiment du support 1 .

Ces variantes sont utiles par exemple pour comparer aisément des molécules dissoutes dans des milieux de culture distincts tout en assurant que les deux compartiments sont soumis aux mêmes conditions externes. Les molécules dissoutes peuvent être des marqueurs ou des drogues, qui sont administrées aux échantillons biologiques par balnéation.

La figure 10A illustre une vue de détail d'une portion de tampon 13 pour former un réseau de puits par empreinte dans une couche d'hydrogel. On observe les saillies 23 et les marques 43 ainsi qu'un pied 33. Sur la figure 10B, la couche d'agarose comporte l'empreinte du tampon de la fig. 10A. On observe le réseau de puits 26, et les marques de repérage 46 adjacentes à chaque puits. Dans cet exemple, chaque marque de repérage 46 est constituée d'une lettre indiquant une ligne et d'un chiffre indiquant une colonne du réseau. L'empreinte du pied forme une cuvette 36 qui permet d'injecter, de recueillir et/ou de changer le milieu liquide de la chambre de culture et d'imagerie.

Sur la figure 1 1 , on observe une vue en microscopie d'un puits 26 formé par l'empreinte d'une saillie 23 telle que représentée sur la figure 6. Le fond 56 du puits 26 est plat et de forme circulaire de diamètre égal à environ 300 micromètres. Les parois du puits sont évasées vers l'ouverture du puits. Une des parois est avantageusement inclinée d'un angle d'environ 67 degrés par rapport à la surface horizontale de la couche d'agarose pour permettre l'injection d'une capsule biologique via une pipette.

Le transfert de la forme des saillies dans l'agarose est effectué de manière très précise et fidèle au modèle. En particulier, on observe sur la figure 1 1 des marches correspondant à la fabrication couche par couche en 3D des saillies du tampon. Ces marches permettent par exemple de mesurer la profondeur d'un plan image suivant l'axe optique dans une image de microscopie confocale.

De façon avantageuse, les extrémités des saillies sont placées à une distance prédéterminée (par exemple par la hauteur des pieds du tampon) de la surface de la lamelle de microscope si bien que les fonds de puits sont constitués d'une couche mince d'agarose et sont tous situés à une même distance prédéterminée de la surface de lamelle de microscope.

La figure 12 illustre un procédé de transfert d'échantillons biologiques 27 sphériques d'environ 200 μιτι de diamètre dans un réseau de puits. Sur la figure 12A, les échantillons biologiques 27 sont disposés dans un milieu liquide 17 dans une boite de Pétri 9. Sur la fig. 12A, on aspire les échantillons biologiques 27 un par un dans une pipette 8 Pasteur dans le sens de la flèche. L'extrémité de la pipette est de préférence choisie de manière à ce que le diamètre intérieur de la pipette soit légèrement supérieur à celui des échantillons biologiques 27. L'aspiration est de préférence configurée pour que les échantillons biologiques 27 soient alignés et espacés régulièrement dans la pipette 8. A titre d'exemple, on aspire ainsi jusqu'à 12 échantillons biologiques 27 dans une pipette. Sur la figure 12B-12C, on place l'extrémité de la pipette dans un puits 26 de la couche d'agarose afin de déposer un échantillon biologique 27 dans ce puits 26. On répète l'opération pour déposer individuellement un échantillon biologique 27 dans chaque puits de la couche d'agarose 6. Les échantillons biologiques 27 sont ainsi disposés individuellement dans les puits à des positions prédéterminées en 3D. De manière générale, cette étape est réalisée à la main, sous contrôle visuel par observation au stéréomicroscope. La précision de positionnement dépend de la taille des puits, de la taille des échantillons biologiques, et de la précision manuelle d'un expérimentateur ou de la précision mécanique d'un micromanipulateur. La précision de positionnement est comprise dans une gamme allant de quelques centaines de micromètres à environ une dizaine de micromètres.

La manipulation des échantillons biologiques 27 lors de l'aspiration et lors de l'expulsion peut être contrôlée en temps réel au moyen d'un stéréo- microscope. L'inclinaison d'une paroi du puits d'un angle d'environ 67 degrés par rapport à la verticale permet d'injecter un échantillon biologique 27 via la pipette sans masquer le champ image dans un microscope droit. D'autre part, l'inclinaison de la paroi opposée d'un angle d'environ 80 degrés par rapport à la surface horizontale de la couche d'hydrogel permet de réduire les aberrations optiques dans un microscope droit.

De cette manière, plusieurs dizaines d'échantillons biologiques peuvent être disposées chacune dans un puits d'une même chambre de culture et d'imagerie en quelques minutes.

De façon particulièrement avantageuse, la cuvette 36 formée dans la couche d'agarose 6 permet de renouveler le milieu liquide sans risquer de toucher un des échantillons biologiques 27.

La chambre de culture et d'imagerie peut ensuite être fermée de manière étanche par le couvercle et la lamelle de microscope 12. Le joint d'étanchéité 4 est perméable aux gaz mais est étanche vis-à-vis des liquides et empêche l'évaporation du liquide de culture. Ainsi la stérilité des échantillons biologiques est préservée dans la chambre et la chambre peut être sujet à des allers-retours entre l'incubateur où les échantillons biologiques sont cultivés en conditions appropriées et parfois stériles et le microscope. Les échantillons peuvent être imagés pendant plusieurs jours de suite, en continuité, ou non, avec ou non-retour à l'incubateur. Il est également possible d'ouvrir le couvercle sous environnement stérile ou non pour remplacer le milieu de culture en tirant avantage des cuvettes 36 formées dans les angles de la couche d'agarose 6.

La forme et la profondeur des puits permettent une manipulation aisée d'un grand nombre d'échantillons biologiques qui sont individualisés et aisément repérables par les marques de repérage. Des allers-retours de la chambre de culture et d'imagerie entre un banc de préparation, un incubateur et/ou un microscope sont ainsi facilités. De plus, le risque de mélange des échantillons biologiques individualisées et repérées dans le réseau de puits est extrêmement réduit.

Dans une variante, le couvercle ne comporte pas d'ouverture. Le support comporte une ouverture et une lamelle de microscope comme décrit dans le mode de réalisation en lien avec la figure 1 . Ce mode de réalisation permet de protéger les échantillons biologiques vis-à-vis de la lumière ambiante. La chambre de culture et d'imagerie peut être observée sur un microscope optique inversé.

Dans une autre variante, la deuxième lamelle de microscope est remplacée un dispositif optique ou un système optique comprenant par exemple une lame réfléchissante, tel qu'un miroir, ou une lame partiellement réfléchissante, une lame dichroïque, un polariseur, une lame demi-onde, une lame quart d'onde et/ou une lentille. Cette variante peut permettre de réaliser des expériences nécessitant d'amener ou de détecter de la lumière de manière sélective dans la chambre de culture et d'imagerie tout en observant les échantillons au moyen d'un microscope inversé.

Dans autre une variante, le support ne comporte pas d'ouverture, mais comporte néanmoins une lamelle de microscope 2 ou un dispositif optique ou un système optique comprenant par exemple une lame réfléchissante, tel qu'un miroir, ou une lame partiellement réfléchissante, une lame dichroïque, un polariseur, une lame demi-onde, une lame quart d'onde et/ou une lentille. Dans ce cas, la couche d'hydrogel et le joint 4 sont directement en contact avec la lamelle ou lame réfléchissante de manière à assurer l'étanchéité de la chambre. Le couvercle 5 comporte une ouverture 15 et une lamelle de microscope 12 comme décrit dans le mode de réalisation en lien avec la figure 1 . Ce mode de réalisation peut permettre réaliser des expériences nécessitant la présence de composants optiques sur le trajet de la lumière que ce soit sur la portion d'excitation (avant l'échantillon) ou de détection (après l'échantillon) dans la chambre de culture et d'imagerie tout en observant les échantillons au moyen d'un microscope droit.

La figure 13 illustre l'utilisation d'une chambre de culture et d'imagerie selon la présente divulgation sur une platine porte-échantillon d'un appareil de microscopie. La platine motorisée est programmée pour permettre l'acquisition automatique de champ images de basse ou moyenne résolution au moyen d'un appareil de microscopie en fonction du pas du réseau de puits. La platine se déplace en général dans les coordonnées du référentiel spatial du microscope, classiquement suivant les axes X et Y dans un plan horizontal. Le déplacement suivant l'axe Z vertical, correspondant à la profondeur de l'échantillon, s'effectue soit en déplaçant la platine et/ou, le plus souvent, la tourelle d'objectifs. L'objectif et/ou le condenseur 100 du microscope est ici placé au-dessus de la chambre de culture et d'imagerie. Il n'est ensuite plus nécessaire de faire la mise au point sur chaque échantillon biologique. L'acquisition d'un grand nombre d'images de microscopie sur de nombreux échantillons biologiques est ainsi grandement accélérée. Le rendement et le nombre d'échantillons peuvent ainsi être fortement accrus. Sur l'insert de la figure 13, on observe que l'ouverture 1 1 du support est alignée avec l'ouverture 34 du joint et avec l'ouverture 15 du couvercle. Ces trois ouvertures 1 1 , 34 et 15 peuvent ainsi être alignées sur l'axe optique d'un microscope droit ou inversé pour permettre des mesures en transmission.

La figure 14 illustre un exemple de 70 champs images correspondant à 70 puits d'une chambre de culture et d'imagerie. On identifie les marques de repérage adjacentes aux puits malgré la présence de bulles formées en surface de la couche d'agarose.

Sur la figure 15, on acquiert des images au moyen d'un microscope à épi-fluorescence et à champ large pour effectuer des prises de vue en fonction du temps. De façon avantageuse, le microscope comporte une enceinte sous atmosphère contrôlée en température et en gaz entourant le porte-échantillon et la chambre de culture et d'imagerie. La figure 15A représente l'acquisition d'image de 50 capsules biologiques dans des puits au début de l'expérience (t=0) et la figure 15B représente l'image des mêmes puits à la fin de l'expérience (t=15h). Des images intermédiaires peuvent être acquises automatiquement par exemple toutes les 30 min. Dans un autre exemple, on utilise un microscope confocal à balayage laser pour acquérir des tranches à différentes altitudes en Z dans les cellules biologiques, avec un pas en Z de quelques microns par exemple. On peut ensuite reconstruire l'image en 3D des 50 capsules biologiques et suivre l'évolution des cellules avec une très haute résolution spatiale et temporelle.

Les figures 16A et 16B représentent des images composites comprenant des canaux de fluorescence superposés sur une image de microscopie en champ clair. Ces images permettent de suivre la trace du déplacement des noyaux cellulaires à l'intérieur d'une capsule en fonction du temps, représenté en figure 16C. La figure 16D illustre l'analyse directionnelle des mouvements des cellules de la figure 16C, qui peut permettre de déterminer l'interaction entre différentes populations de cellules biologiques. On observe que la capsule biologique ne bouge pas à l'intérieur d'un puits et ne se détériore pas. Cette chambre de culture et d'analyse permet d'analyser un grand nombre d'échantillons biologiques avec un rendement élevé, tout en fournissant des images de microscopie de haute résolution spatiale, en 2D ou en 3D et sur une longue durée d'expérience allant jusqu'à plusieurs dizaines d'heures ou même plusieurs jours.

Dans un autre exemple d'application, on utilise des puits ayant d'autres forme et/ou dimensions adaptées à d'autres échantillons. A titre d'exemple, on utilise un réseau de puits de forme parallélépipédique rectangle, comme décrits en lien avec la figure 7, pour disposer des larves de poisson zèbre transgéniques ayant un marqueur de noyau cellulaire, par exemple de type NLS::TagRFP. On utilise d'une part un microscope à champ large pour acquérir les images des larves fixées à 30 hpf (Fig. 17A-17C). D'autre part, on utilise un microscope confocal pour acquérir des images les mêmes larves incubées en plus dans un marqueur lipidique Bodipy 505/515 (Fig. 17D-17E). Un système de traitement d'image permet de reconstruire l'image des larves en 3D. Compte tenu de la taille des larves, on dispose 77 larves dans une chambre de culture et d'imagerie à 7 lignes et 1 1 colonnes. Un objectif de microscope 4X permet d'effectuer un balayage complet de la chambre (Fig. 17A). Un objectif de microscope 10X est utilisé pour balayer une zone réduite (5 lignes par 5 colonnes, représenté par un cadre sur la fig. 17A) avec une meilleure résolution spatiale (Fig. 17B). De façon remarquable, l'image de la figure 17C permet de distinguer les noyaux individuels des cellules marquées. On observe aussi que la marque de repérage de chaque puits est lisible, ce qui permet de retracer l'historique de développement de chaque larve individuellement et de pousser les analyses d'un individu particulier si nécessaire.

De manière plus générale, l'homme du métier adaptera aisément la forme et les dimensions des puits en fonction de l'échantillon biologique à étudier in vivo, en particulier à toutes sortes d'embryons et d'organoïdes.

La chambre de culture et d'imagerie de la présente divulgation est compatible avec de nombreux microscopes optiques.

Plus précisément, cette chambre de culture et d'imagerie est compatible avec tout type de microscopie comprenant un statif de microscope, une platine munie d'un porte échantillon destiné à recevoir une lame de microscopie et dont l'objectif et/ou le condenseur du microscope ont une distance frontale compatible avec l'encombrement spatial de la chambre de culture et d'imagerie.

En particulier, elle est compatible avec l'utilisation d'un microscope multi- photon, basé sur l'utilisation d'un faisceau d'excitation infrarouge qui permet une plus grande pénétration de la lumière dans un échantillon épais et une réduction de la phototoxicité du fait d'une excitation défocalisée (out-of-focus excitation). Un microscope à feuille de lumière peut aussi être utilisé pour le balayage rapide d'une feuille de lumière par balayage réel ou numérique, ce qui permet d'augmenter fortement la vitesse de balayage. Dans ce cas, on peut utiliser un microscope droit pour l'excitation et la collection ou un microscope ayant un axe optique incliné à 45 degrés.

La chambre de culture et d'imagerie est aussi compatible avec un microscope confocal, ou à disques tournants ou de super résolution.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Chambre de culture et d'imagerie (10) d'échantillons biologiques par microscopie optique, ladite chambre de culture et d'imagerie (10) comprenant :
- un support (1 ) et un couvercle (5), le support (1 ) comprenant au moins un logement intérieur (61 ) ;
- au moins une lamelle de microscope (2, 12) disposée face à une ouverture (1 1 , 15) formée dans le support (1 ) ou dans le couvercle (5) face audit logement intérieur ;
- un joint d'étanchéité (4, 24, 94) disposé entre le support (1 ) et le couvercle (5) en contact avec ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12), le joint d'étanchéité (4) délimitant au moins une autre ouverture (34) disposée face à la lamelle de microscope (2, 12);
- une couche d'hydrogel (6) disposée à l'intérieur de ladite autre ouverture (34) du joint d'étanchéité (4, 24, 94), la couche d'hydrogel (6) comprenant un réseau de puits (26) ouverts formés à des positions prédéterminées en trois dimensions dans un repère orthonormé lié au support (1 ), chaque puits (26) étant adapté pour recevoir un échantillon biologique ;
- le support, le couvercle et le joint étant configurés de manière à être rendus solidaires pour former une chambre de culture et d'imagerie (10) étanche vis-à-vis d'un liquide.
2. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 dans laquelle le support (1 ) et/ou le joint d'étanchéité (4, 94, 24) comporte une pluralité de compartiments étanches les uns par rapport aux autres, au moins un compartiment étanche comprenant ladite couche d'hydrogel (6) et ledit réseau de puits (26).
3. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le support (1 ) comporte une première ouverture (1 1 ), le couvercle (5) comporte une deuxième ouverture (15), ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12) comprenant une première lamelle de microscope (2) disposée face à la première ouverture (1 1 ) et une deuxième lamelle de microscope (12) disposée face à la deuxième ouverture (15), le joint d'étanchéité (4) étant en contact avec la première lamelle de microscope (2) et la deuxième lamelle de microscope (12).
4. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le couvercle (5) comporte une deuxième ouverture (15), ladite au moins une lamelle de microscope comporte une deuxième lamelle de microscope (12) disposée face à la deuxième ouverture (15) et un composant optique réfléchissant ou dichroïque disposé dans le logement intérieur du support.
5. Chambre de culture et d'imagerie selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le support (1 ) comporte une première ouverture (1 1 ), ladite au moins une lamelle de microscope (2, 12) comprenant une première lamelle de microscope (2) face à la première ouverture (1 1 ) et dans laquelle le couvercle (5) est opaque ou comporte un composant optique réfléchissant ou dichroïque.
6. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 5 dans laquelle au moins un puits (26) ouvert a une forme parallélépipédique, une forme cylindrique, une forme tronconique, une forme évasée ou une forme refermée au niveau d'une ouverture de puits.
7. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 6 dans laquelle le réseau de puits comporte au moins un puits ayant une paroi inclinée par rapport à une surface horizontale de la couche d'hydrogel d'un angle supérieur à 0 et inférieur ou égal à 135 degrés.
8. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 7 dans laquelle le réseau de puits comporte au moins un puits ayant un fond plat ou concave formé dans la couche d'hydrogel et/ou au moins un puits ayant un fond formé par une surface de lamelle de microscope (2).
9. Chambre de culture et d'imagerie selon l'une des revendications 1 à 8 dans laquelle la couche d'hydrogel comporte une pluralité de marques de repérage (46), chaque marque de repérage (46) étant disposée à proximité d'un puits (26) et étant configurée pour identifier ce puits (26).
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