WO2018083365A1 - Dispositivo y método de sensado fotónico que comprenden elementos de bioreconocimiento con cambio conformacional - Google Patents

Dispositivo y método de sensado fotónico que comprenden elementos de bioreconocimiento con cambio conformacional Download PDF

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sensing
analytes
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Jaime GARCÍA RUPÉREZ
María José BAÑULS POLO
Ángel MAQUIEIRA CATALÁ
Javier MARTÍ SENDRA
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Universidad Politecnica de Valencia
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings

Definitions

  • the present invention relates to a method and a photonic sensing device intended for the detection of specific substances of interest (analytes).
  • the method and device of the invention also allow the amplification of the signal produced by the sensing events that occur when photonic structures are used as transduction elements.
  • This method and device are based on using biorecognition elements that undergo a conformational change when a sensing event occurs, so that this conformational change is used to displace a particle of high refractive index and / or size that will be fixed to the element itself of biorecognition.
  • the conformational changes produced by the sensing events will cause a greater variation of the optical response of the photonic transduction element compared to the traditional recognition mechanisms, thus being able to detect significantly lower concentrations of analyte, as well as analytes. With reduced molecular mass.
  • sensing devices or methods that allow a large number of parameters to be measured quickly, efficiently and reliably, such as temperature, pressure, electric field strength, etc.
  • these physical quantities for which there are already tremendously mature measurement methods
  • sensing devices or methods for the detection, identification and quantification of substances such as gases, liquids, proteins, hormones, bacteria or DNA, among many others.
  • biosensors which have application in countless fields, such as pharmaceutical research, disease diagnosis, contaminant detection, or bacteriological warfare.
  • a biosensor is an analytical device that will basically consist of a biorecognition element, which is responsible for providing selectivity against the analyte of interest, and a transduction element, which is responsible for generating a measurable signal and related to the amount of analyte for detection and / or quantification.
  • biorecognition elements the most common are those based on affinity, such as: antibodies, aptamers or oligonucleotides. These biorecognition elements have a high affinity to the analytes to which they are specific, so that these interactions are used to cause a measurable and quantifiable signal change in the biosensor transduction element.
  • transduction these are sensitive to those changes that take place when the recognition events indicated above occur.
  • transduction elements such as electrochemical, piezoelectric or optical / photonic, among others.
  • Each transduction technology has its advantages and disadvantages, which can make them more suitable for some applications or others.
  • biosensor ie, the biorecognition mechanism and the type of transduction element
  • analyte concentrations eg, below nanogram / milliliter values, picomolar or femtomolar, etc.
  • work intervals are really relevant in certain applications of tremendous interest such as the early diagnosis of diseases (eg, cancer, Alzheimer's, cardiovascular) or the rapid detection of biological threats (eg , toxins, Anthrax).
  • part of the current interest is also focused on detecting analytes of reduced molecular mass (eg, of the order of a few kiloDalton or even below the kiloDalton). Similar to what happens when there is a low concentration of analyte, the fact that the analytes have a low molecular mass will result in the change they will produce on the transduction element of the biosensor will also be very small, even reaching Be undetectable by this one.
  • the usual solution for these limitations ie, the inability to detect low concentrations of analytes and / or analytes of reduced molecular mass is through the use of what are called markers.
  • the marker used to said analyte By means of an adequate treatment of the sample containing the analyte to be detected (generally this treatment is carried out in the laboratory), it is possible to link the marker used to said analyte.
  • This marker consists of a material that has certain physical properties, such as fluorescence, radioactivity, etc., so that the detection of the analyte is performed indirectly, measuring said fluorescence, radioactivity, etc.
  • the use of markers to perform the sensing poses several problems, such as, for example, the need to make a previous preparation of the sample to be analyzed (which can be complex and require a long time) or the difficulty to find a method that fixes the markers only and specifically to the analytes we want to detect.
  • photonic technology for its creation.
  • a biosensor based on photonic technology also known as “photonic sensing device”
  • the change that occurs in the optical response (ie, for frequencies in the optical spectrum range) of the photonic device will be used to detect the analyte of interest.
  • photonic transducers One of the most common implementations of photonic transducers is one in which the detection is based on the monitoring of the change that occurs in the response of the photonic structure when a variation of the refractive index occurs due to the presence of the analyte that is want to detect
  • photonic technology for the implementation of biosensing systems provides a series of advantages of great interest compared to other transduction technologies, such as the high sensitivity they provide, the small size of the structures that will allow a high level of integration, a rapid response, the ability to perform analyzes without the need for markers, the need for very low sample volumes to perform the analysis or the possibility of using mass manufacturing techniques from the field of microelectronics for low-cost manufacturing of devices integrated photonic sensing.
  • the spectral change that is used to carry out photonic sensing is based on monitoring the displacement of the spectral response of the sensing structure when sensing events occur. This is what is done for example for some typical sensing structures based on integrated photonic technology such as resonant structures based on rings or discs [1-2], or photonic crystals (or in general, periodic dielectric structures) [3-4]. In both cases, the presence of the analyte to be detected will cause a change in the dielectric distribution of the structure, which will result in a displacement of the resonances in the resonant structures, or of the prohibited photonic band and / or bands guided in the case of photonic crystals or periodic dielectric structures.
  • the photonic sensing amplification method and device proposed in the present invention allows to increase the effect that the interaction between the biorecognition element and the analyte have on the photonic sensing structure, so as to significantly reduce the achievable limit of detection (ie, detect lower concentrations of the analyte, of the order of picogram / milliliter, picomolar or even lower, depending on the type of analyte to be detected), as well as allow the detection of all types of analytes difficult to detect with the available techniques currently (for example and without limitation, biomarkers of low molecular mass, pesticides and microRNAs).
  • this amplification of the sensing events will be carried out without the need to perform any special preparation of the sample to be analyzed (eg, marking, amplification by reaction in polymerase chain, etc.), so that final systems that are simpler, easier to use, compact and economical can be obtained.
  • this method and device consists of a special implementation of the biorecognition element used, it can be used with any photonic sensing structure in which the detection mechanism is based on the change in response that occurs when a change in distribution occurs structure dielectric. This method and device could also be applicable to other sensing methodologies where detection is based on variations in the dielectric distribution, as is the case with plasmonic sensors. References cited:
  • An object of the present invention is to obtain high sensitivity photonic sensing devices (characterized by detection limits of the order of picogram / milliliter, picomolar or even lower, depending on the type of analyte to be detected) by using recognition elements in those that the process of detection of the analyte of interest will produce a conformational change that causes a greater effect on the photonic sensing structure with respect to what the traditional receiver-analyte recognition event itself would produce.
  • Another object of the present invention is to obtain high sensitivity photonic sensing devices in which low detection limits (of the order of picogram / milliliter, picomolar or even lower, depending on the type of analyte to be detected) without the need to use any complex sample preparation process such as labeling or amplification by polymerase chain reaction, thus reducing complexity, size and the cost of the final analysis elements.
  • Another object of the present invention is to obtain high sensitivity photonic sensing devices in which the recognition element is of the molecular beacon type, aptamer or equivalent, with a particle attached to them, which will be displaced to produce an amplification of the recognition event
  • Another object of the present invention is the obtaining of photonic sensing devices of high sensitivity in which the particle attached to the recognition element, which will change its position when the recognition event occurs, may be of both dielectric, metallic or biological type .
  • Another object of the present invention is the obtaining of photonic sensing devices of high sensitivity in which the recognition events, and therefore the displacement of the particles fixed to the recognition elements, occur both in the external part of the structures photonic sensing, as in its internal part in the case of working, for example, with porous structures.
  • Another object of the present invention is to obtain high sensitivity photonic sensing devices in which an effect of amplification of the spectral change occurs due to the conformational change of the biorecognition elements used, but in which the working frequency range It is not exclusively optical.
  • Another object of the present invention is the obtaining of photonic sensing devices of high sensitivity in which the conformational change of the biorecognition elements used includes their rupture, so that this will cause the release of the particle attached to the transduction element through of the biorecognition element.
  • - Sensing event analyte detection process in which, unless otherwise stated, a device and / or a method according to the invention is used.
  • Transduction element or transducer element responsible for converting sensing events into a measurable signal.
  • element responsible for converting sensing events into a measurable signal we will be considering an optical / photonic type transducer in which the sensing is based on detecting the variations produced in the response of the structure when a variation of the electrical distribution occurs.
  • Biorecognition elements, receptors or bioreceptors elements that combine with the transducer to interact specifically with the analytes to be detected, so that this interaction produces a signal measurable by the transducer.
  • biorecognition elements are considered that undergo a conformational change upon detection of the analyte.
  • FIGURES Figures 1a, 1b and 1c schematically describe the operation of a photonic sensing device, provided with a transduction element with a photon i ca.
  • Figure 1a represents the initial state of the transmission spectrum (Y) of a signal as a function of wavelength (X) through a structure that has a photonic prohibited band.
  • Figure 1 b represents the transmission spectrum (Y) of a signal as a function of the wavelength (X) through a structure that has a photonic prohibited band, once the sensing events that are to be detected have occurred .
  • Figure 1c shows the evolution of the spectral position of the spectral characteristic that is being monitored ( ⁇ ') as a function of time (X) in the case of a generic photonic sensor, considering both the sensing phase and the previous and subsequent stages to this
  • Figure 2 schematically shows the operation of a photonic sensing device according to the present invention.
  • molecular beacons are used as biorecognition elements, each of which has one of its ends fixed on the surface of the photonic transduction element and a large particle and / or high index fixed at the other end.
  • Figures 3a, 3b and 3c schematically show various photonic transduction elements that can be used in the present invention.
  • Figure 3a shows a resonant ring coupled to an access guide
  • Figure 3b shows a one-dimensional periodic dielectric structure
  • Figure 3c shows a two-dimensional periodic dielectric structure.
  • Figure 4 shows the different physical parameters that define the photonic transduction element described in Figure 3c.
  • Figure 5 is a graph depicting the normalized transmission versus the wavelength corresponding to a photonic sensing procedure using the transduction element shown in Figure 3c.
  • Figure 6 schematically describes a preferred embodiment of the present invention.
  • the biorecognition elements based on molecular beacons attached to particles of large size and / or high index are immobilized on the surface of a sensing structure based on the phenomenon of photonic prohibited band.
  • a first aspect of the invention relates to a photonic sensing device for the detection of analytes comprising a transduction element in the form of a photonic structure and biorecognition elements related to the analytes to be detected.
  • Said photonic sensing device is characterized in that the biorecognition elements undergo a conformational change when they are in the presence of the analyte to be detected and because said biorecognition elements have particles larger than the analytes to be detected, of the order of nanometers, and / or refractive index values greater than 1.3.
  • the photonic sensing device allows the detection of analytes with high sensitivity, through the use of biorecognition elements that undergo a conformational change (ie, a change in their spatial arrangement) upon detection of the desired analyte, so that This conformational change causes the displacement of particles fixed to the biorecognition elements themselves.
  • a conformational change ie, a change in their spatial arrangement
  • photonic sensing device takes advantage of the physical properties of photon sensing structures based on spectral displacement.
  • their spectral response in transmission or reflection will depend on the dielectric configuration of the materials that make up the structure used, so any variation in that dielectric composition will result in a variation of the spectral response, which it will usually translate itself into a spectral shift. Therefore, by monitoring the frequency (or wavelength) displacement experienced by the spectral response of the photonic sensing structure, we will be able to detect the presence (and quantity) of the analytes of interest.
  • the conformational change that occurs in the biorecognition elements due to the interaction with the analyte causes the particles with high refractive index (greater than 1.3) or with larger size (of the order of nanometers) -which are fixed to said elements of biorecognition - they move with respect to their original or native position (in the absence of analyte).
  • the devices according to the present invention have a higher sensitivity in the photonic sensing than the devices based on traditional recognition mechanisms, this being up to several orders of magnitude, depending on the specific configuration of the elements of biorecognition used, for example and without limitation, of two orders of magnitude.
  • the biorecognition elements are molecular beacons.
  • Molecular beacons (molecular beacons in English) are molecular probes that, in their native state (ie, in the absence of analyte), have a hairpin shape and are provided with two ends between which a specific sequence, complementary to the analyte, is arranged that you want to detect. In the presence of analyte, on the contrary, the specific sequences of the molecular beacons hybridize with complementary sequences of the analyte adopting a stretched position. This conformational change undergone by molecular beacons modifies the relative position of the particles bound to said molecular beacons, with respect to the position they maintained in the absence of the analyte. This generates a change in the dielectric distribution of the photonic structure that causes, in turn, a change in its spectral response allowing the detection of analytes with greater sensitivity.
  • the state of the art beacons are used for the detection of analytes by fluorescence analysis.
  • one of its ends is attached to a fluorescent particle, while the other is attached to a fluorescence inhibitor.
  • said molecular beacons In the native state, said molecular beacons have a hairpin shape, so that the fluorescent particles are faced with the fluorescence inhibitors and very close to them, which prevents the appearance of fluorescence.
  • the specific sequences of the molecular beacons hybridize with complementary sequences of the analyte, adopting a stretched position. This causes the fluorescent particles to move away from the fluorescence inhibitors, so that the latter can no longer prevent fluorescence from appearing.
  • Molecular beacons for use in the present invention are therefore different from those used in the prior art (they lack fluorescent particles and fluorescence inhibitors) and are used in different sensing procedures (photonic type). In these photonic procedures no fluorescence is detected, but changes in the spectral response of a photonic sensing structure caused by the modification of its dielectric distribution due, in turn, to the eventual presence of an analyte are measured.
  • the biorecognition elements are molecular beacons with specific sequences of oligonucleotides, DNA, RNA, and / or microRNA.
  • the biorecognition elements are aptamers.
  • the aptamers are biorecognition elements based on single strands of DNA or RNA oligonucleotides with a characteristic 3D structure capable of recognizing and binding specifically and with high affinity to the target analyte.
  • the conformational change of the elements of biorecognition causes its rupture, thus causing the particles bound to said biorecognition elements to be released from the transduction element to which they are initially immobilized (ie, in the absence of analyte).
  • these can be both dielectric particles with a size of the order of nanometers and an electrical conductivity less than 0.1 S nr 1 , metal particles with sizes of the order of nanometers or biological molecules with sizes of the order of nanometers and molecular mass greater than 10 KiloDalton.
  • the particles to be used must be larger than the analyte itself to be detected and / or a high index of refraction (greater than 1.3), the effect of amplification of the sensing event being greater the larger the particle size and / or its refractive index.
  • a metal particle its presence will also cause the appearance of plasmonic effects, which are considered equivalent to the photonic sensing effects considered in this invention.
  • a plasmonic effect is understood as that signal produced at the interface between metallic and dielectric materials and which can also be used to perform sensing functions.
  • a dielectric particle is one that has an electrical conductivity of less than 0.1 S nr 1 .
  • a metallic particle is that formed by a pure metallic element, an alloy of pure metallic elements and / or a metallic compound.
  • a biological molecule is that molecule that is present or has an effect on a living organism, for example and without limitation, a protein, a lipid, or an antibody.
  • photonic sensing structures considered in this invention all those in which the sensing is based on the change in photonic response that occurs when the dielectric distribution of the system is varied are considered.
  • the photonic structures that can be used in the present invention, not only are those considered in which the sensing event detected (ie, the interaction between the biorecognition elements and the analyte) occurs in the external surface of the photonic structure considered, thus occurring an interaction with the evanescent field that propagates outside the structure itself, but also those photonic structures in which sensing events occur within the structure itself, such as when porous materials are used.
  • the sensing event detected ie, the interaction between the biorecognition elements and the analyte
  • a second aspect of the present invention relates to a photonic sensing method, which comprises the use of a photonic sensing device according to the invention.
  • This invention thus describes a method and a photonic sensing device for the detection of analytes with a high sensitivity in which the displacement of the particles fixed to the biorecognition elements produced by the conformational change of the latter will allow to detect lower concentrations of analytes, as well as analytes of lower molecular mass.
  • This method and device will be valid in all those sensing configurations based on the variation that occurs in the spectral response of the photonic sensing structure when a change in its dielectric distribution takes place, regardless of the type of sensing structure used, of the range of frequencies considered and the type of particles used to fix them to the biorecognition elements.
  • FIG. 1a, 1b and 1c The basic principle of operation of a photonic sensing device based on spectral displacement is shown in Figures 1a, 1b and 1c for the particular and generic case of a photonic prohibited band structure.
  • a banned photonic band structure (or photonic band gap of English, as they are most commonly known) is a periodic dielectric structure which may have regions of the spectrum in which wave propagation is not allowed, frequency region to which known as banned photonic band.
  • the position of said photonic prohibited band is dependent on the dielectric distribution of the structure, which will change when sensing events occur.
  • Figure 1a shows the initial state in which the transmission spectrum (Y) of the sensing structure is considered, which has a photonic prohibited band (1) that covers a certain range of wavelengths (X) ; this prohibited band will be delimited by two edges where the transmission band is passed to the prohibited photonic band (2) and vice versa (3).
  • Figure 1b shows the state in which the analyte sensing events have occurred. The detection of the analyte causes a variation of the refractive index in the photonic structure, in turn causing a shift in the transmission spectrum (Y) of it with respect to that shown in Figure 1a.
  • Figure 1b it can be seen how there has been a displacement of the photonic prohibited band and therefore a change in the position of the edges at which the transmission band is passed to the prohibited photonic band and vice versa, passing from the position (2) at (4) and from (3) to (5) respectively.
  • Figure 1c shows the evolution of the spectral position of the spectral characteristic being monitored ( ⁇ ') as a function of time ( ⁇ '), which in this example could be the evolution of the position of the edge at which from the transmission band to the photonic prohibited band ((2) in figures 1 a and 1 b) or from the edge at which the photonic prohibited band is passed to the transmission band ((3) in figures 1a and 1 B).
  • the displacement experienced by the spectral response of a photonic sensing structure, shown in (7) in Figure 1c, will be determined, among other factors, by the concentration and by the molecular mass of the analyte to be detected. In this way in the devices of the prior art, those situations in which there is a very low concentration of the analyte to be detected or those in which the molecular mass of the analyte is very small, will cause extremely small spectral shifts and that will be difficult to detect by the sensing element.
  • the photonic sensing device according to the invention allows, on the contrary, to amplify the spectral shift produced by the presence of analyte, improving the sensitivity in the photonic sensing.
  • Said photonic sensing device comprises, as shown in the left part of figure 2, a photonic sensing structure (9) with biorecognition elements (10) having fixed particles (11).
  • Figure 3 schematically shows various configurations of photonic sensing structures (9) that can be used with the amplification device and method described in this invention.
  • Figure 3a shows a resonant ring coupled to an access guide
  • Figure 3b shows a one-dimensional periodic dielectric structure
  • Figure 3c shows a two-dimensional periodic dielectric structure.
  • the entrance to the photonic structure is done by (13) and the exit is done by (14).
  • the part relevant of this invention does not refer to the sensing structure itself, since as previously indicated any sensing structure based on the detection of refractive index variations would be valid, but the relevant part of this invention lies in the amplification of sensing events thanks to the use of biorecognition elements (10) that undergo a conformational change when these events occur, as well as to the fact that said biorecognition elements (10) are attached to particles (11) that still increase plus spectral displacement when a sensing event occurs.
  • Figure 5 represents the normalized transmission (Y "), expressed in dB, versus the wavelength (X"), expressed in nanometers, for the photonic sensing structure (9) of the embodiment of the invention shown in the figure 4.
  • Y normalized transmission
  • X wavelength
  • Figure 5 represents the normalized transmission (Y "), expressed in dB, versus the wavelength (X"), expressed in nanometers, for the photonic sensing structure (9) of the embodiment of the invention shown in the figure 4.
  • the presence of an edge (16) in which the photonic prohibited band is passed to the transmission band of the structure considered can be observed.
  • the biorecognition elements (10) are based on molecular beacons attached to particles (11) of large size (of the order of 6 nm in diameter) and / or high refractive index (of the order of 2.5).
  • the biorecognition elements (10) are immobilized on the surface of a photonic sensing structure (9) based on the phenomenon of prohibited photonic band.
  • the biorecognition elements (10) will undergo a conformational change upon detection of analytes (12) based on oligonucleotide chains, in this case, microRNAs.
  • the photonic sensing structure will be biofunctionalized so that the biorecognition elements (10) responsible for detecting the analytes of interest are immobilized on it.
  • the recognition elements (10) are of the molecular beacon type (or molecular beacon of English, as they are most commonly known).
  • Said elements (10) consist of a chain of artificially synthesized oligonucleotides that are characterized by having a hairpin shape in which the stem area (10a) (or English stem, as it is most commonly known) is formed by hybridization.
  • a loop zone (10b) or English loop, as it is most commonly known
  • recognition of the analyte (12) to be detected in this case, an oligonucleotide chain.
  • the hybridization process Upon recognition of the analyte (12) by the molecular beacon, the hybridization process will produce a conformational change that results in an opening of the loop (10b) and that will move both ends of the molecular beacon.
  • the biorecognition elements (10) of the molecular beacon type comprise a loop region of about 18-25 nucleotides, a stem region of 5-7 nucleotides and an additional spacer (10c) at the termination of about 10- 15 nucleotides, through which they are immobilized to the surface of the photonic structure (9).
  • a high index dielectric particle (11) will be attached to each biorecognition element (10) of the molecular beacon type to cause its displacement. This connection will be made through the termination of the molecular beacon (10) that does not have the additional spacer previously mentioned and will not be used to immobilize it to the surface.
  • These dielectric particles are considered to be composed of titanium oxide, with an index around n « 2.5 and with a diameter of around 6nm.
  • the previously described configuration of photonic sensing structure, molecular beacon (10) and dielectric nanoparticle (11) is used in order to detect oligonucleotide chains of about 22 bases; specifically, the detection of microRNA chains is considered.
  • the low molecular mass and the extremely low concentrations that are of interest to these analytes significantly makes direct detection difficult, making use of photonic sensing structures (and usually, by any other detection method).
  • the use of the configuration described previously will cause that when the microRNA is detected by the molecular beacon and it undergoes the conformational change described above (shown in the right part of Figure 6), the high index nanoparticle (11) will be displaced with respect to the photonic sensing structure.
  • the recognition event causes a displacement of the dielectric particle of about 15-20nm with respect to the surface of the photonic sensing device, which will result in this specific embodiment. of the invention, in an amplification factor of about 2 orders of magnitude on the sensing effect.
  • This level of amplification of the sensing effect will be dependent on various parameters such as the type of analyte to be detected (ie, for light analytes, the effect of amplification by the conformational change may be higher), the index of refraction and the size of the particle fixed to the biorecognition element, the position in which the particle (10) is fixed to the biorecognition element or the magnitude of the displacement of the particle (10) that is produced by the conformational change experienced, among others.

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Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo y un método de sensado fotónico para la detección de analitos (12) que comprenden una estructura fotónica (9) como elemento de transducción y elementos de bioreconocimiento (10), afines a los analitos (12) a detectar; siendo dichos elementos de bioreconocimiento (10) capaces de experimentar un cambio conformacional al estar en presencia de los analitos (12) y teniendo fijadas partículas (11) de un tamaño mayor al de los analitos (12), del orden de nanómetros y/o un índice de refracción superior a 1.3.

Description

DISPOSITIVO Y MÉTODO DE SENSADO FOTÓNICO QUE COMPRENDEN ELEMENTOS DE BIORECONOCIMIENTO CON CAMBIO CONFORMACIONAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método y un dispositivo de sensado fotónico destinado a la detección de sustancias específicas de interés (analitos).
El método y el dispositivo de la invención permiten, además, la amplificación de la señal producida por los eventos de sensado que se producen cuando se hace uso de estructuras fotónicas como elementos de transducción. Este método y dispositivo se basan en utilizar elementos de bioreconocimiento que experimenten un cambio conformacional al producirse un evento de sensado, de forma que este cambio conformacional se utilice para desplazar una partícula de alto índice de refracción y/o tamaño que estará fijada al propio elemento de bioreconocimiento. De este modo, los cambios conformacionales producidos por los eventos de sensado provocarán una mayor variación de la respuesta óptica del elemento fotónico de transducción en comparación con los mecanismos tradicionales de reconocimiento, consiguiendo así ser capaz de detectar concentraciones significativamente menores de analito, así como analitos con masa molecular reducida.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Hoy en día resulta fundamental disponer de dispositivos o métodos de sensado que permitan medir de una manera rápida, eficiente y fiable un gran número de parámetros, como por ejemplo, temperatura, presión, intensidad de campo eléctrico, etc. Además de para la medida de dichas magnitudes físicas (para las que ya existen métodos de medida tremendamente maduros), el mayor interés se centra actualmente en el desarrollo de dispositivos o métodos de sensado para la detección, identificación y cuantificación de sustancias (a las que denominamos analito), como puedan ser gases, líquidos, proteínas, hormonas, bacterias o ADN, entre muchas otras. Estos dispositivos son los denominados biosensores, los cuales tienen aplicación en infinidad de campos, como por ejemplo, la investigación farmacéutica, el diagnóstico de enfermedades, la detección de contaminantes, o la guerra bacteriológica. Un biosensor es un dispositivo analítico que estará formado básicamente por un elemento de bioreconocimiento, que se encarga de proporcionar selectividad frente al analito de interés, y de un elemento de transducción, el cual se encarga de generar una señal medible y relacionada con la cantidad de analito para su detección y/o cuantificación.
Respecto a los elementos de bioreconocimiento, los más habituales son aquellos basados en afinidad, como son por ejemplo: anticuerpos, aptámeros u oligonucelótidos. Estos elementos de bioreconocimiento tienen una elevada afinidad frente a los analitos a los que son específicos, de forma que se utilizan estas interacciones para provocar un cambio de señal medible y cuantificable en el elemento de transduccion del biosensor.
Respecto a los elementos de transduccion, estos son sensibles a aquellos cambios que tienen lugar cuando se producen los eventos de reconocimientos indicados previamente. En función del tipo de cambios detectados se distinguen diferentes tipos de elementos de transduccion, como por ejemplo, los electroquímicos, los piezoeléctricos o los ópticos/fotónicos, entre otros. Cada tecnología de transduccion tiene sus ventajas e inconvenientes, lo que las puede hacer más adecuadas para unas aplicaciones u otras.
Independientemente del tipo de biosensor (i.e., del mecanismo de bioreconocimiento y del tipo de elemento de transduccion) uno de los principales retos de estos es el ser capaz de detectar concentraciones extremadamente bajas de analito (e.g., por debajo de valores de nanogramo/mililitro, picomolar o femtomolar, etc.), ya que son esos intervalos de trabajo los realmente relevantes en determinadas aplicaciones de tremendo interés como por ejemplo el diagnóstico precoz de enfermedades (e.g., cáncer, Alzheimer, cardiovasculares) o la detección rápida de amenazas biológicas (e.g., toxinas, Ántrax). En estos casos en los que se tiene una mínima concentración del analito, el bajo número de interacciones que se producen entre los elementos de bioreconocimiento y los propios analitos que se quieren detectar apenas producirán un cambio sobre la respuesta del elemento de transduccion, de forma que serán difícilmente detectadas.
Además de rebajar las concentraciones que pueden ser detectadas mediante los biosensores desarrollados, parte del interés actual se centra también en detectar analitos de masa molecular reducida (e.g., del orden de unos pocos kiloDalton o incluso por debajo del kiloDalton). De modo similar a lo que ocurre cuando se tiene una baja concentración de analito, el hecho de que los analitos tengan una baja masa molecular se traducirá en que el cambio que producirán sobre el elemento de transduccion del biosensor será también muy pequeño, llegando incluso a ser indetectable por éste. La solución habitual para estas limitaciones (i.e., la imposibilidad de detectar bajas concentraciones de analitos y/o analitos de masa molecular reducida) es mediante el uso de lo que se denominan marcadores. Mediante un tratamiento adecuado de la muestra que contiene el analito a detectar (generalmente este tratamiento se realiza en laboratorio), se consigue enlazar el marcador utilizado a dicho analito. Este marcador consiste en un material que presenta unas determinadas propiedades físicas, como por ejemplo, fluorescencia, radioactividad, etc., de modo que la detección del analito se realiza de una forma indirecta, midiendo dicha fluorescencia, radioactividad, etc. Sin embargo, el uso de marcadores para realizar el sensado plantea diversos problemas, como pueden ser, por ejemplo, la necesidad de realizar una preparación previa de la muestra a analizar (lo cual puede ser complejo y requerir de un tiempo elevado) o la dificultad para encontrar un método que fije los marcadores únicamente y de forma específica a los analitos que deseamos detectar.
Respecto a los elementos de transduccion, una de las opciones que mayor interés despierta actualmente es la utilización de tecnología fotónica para su creación. En un biosensor basado en tecnología fotónica (también conocido como "dispositivo de sensado fotónico") se hará uso del cambio que se produce en la respuesta óptica (i.e., para frecuencias en el rango óptico del espectro) del dispositivo fotónico para detectar el analito de interés. Una de las implementaciones más habituales de transductores fotónicos es aquella en la que la detección se basa en la monitorización del cambio que se produce en la respuesta de la estructura fotónica cuando se produce una variación del índice de refracción debido a la presencia del analito que se quiere detectar.
El uso de la tecnología fotónica para la implementación de sistemas de biosensado proporciona una serie de ventajas de enorme interés frente a otras tecnologías de transduccion, como son la alta sensibilidad que proporcionan, el reducido tamaño de las estructuras que permitirá un alto nivel de integración, una respuesta rápida, la capacidad de realizar análisis sin necesidad de marcadores, la necesidad de volúmenes de muestra muy bajos para realizar el análisis o la posibilidad de usar técnicas de fabricación en masa procedentes del campo de la microelectrónica para la fabricación con bajo coste de dispositivos integrados de sensado fotónico.
De forma habitual, el cambio espectral que se utiliza para llevar a cabo el sensado fotónico se basa en monitorizar el desplazamiento de la respuesta espectral de la estructura de sensado cuando se producen los eventos de sensado. Esto es lo que se hace por ejemplo para algunas estructuras típicas de sensado basadas en tecnología fotónica integrada como son las estructuras resonantes basadas en anillos o discos [1-2], o los cristales fotónicos (o de forma general, estructuras dieléctricas periódicas) [3-4]. En ambos casos, la presencia del analito que se quiere detectar provocará un cambio de la distribución dieléctrica de la estructura, lo que se traducirá en un desplazamiento de las resonancias en las estructuras resonantes, o de la banda prohibida fotónica y/o de las bandas guiadas para el caso de los cristales fotónicos o las estructuras dieléctricas periódicas.
Existen, adicionalmente, otras estructuras fotónicas integradas que permiten realizar funciones de sensado utilizando directamente la amplitud de salida de una señal de una determinada longitud de onda, de forma que no resulta necesario monitorizar continuamente el espectro de transmisión del dispositivo. Ejemplos de este tipo de sistemas de sensado, basados en la amplitud, son los interferómetros Mach-Zehnder [5] o los acopladores direccionales [6]. A pesar de que dichos sistemas son capaces de proporcionar dispositivos de sensado más sencillos, llevan consigo el problema de que necesitan dimensiones del dispositivo muy grandes (del orden de varios milímetros o centímetros) para tener una interacción entre el campo y el analito que sea suficiente para realizar la detección, limitando así el nivel de integración que se puede conseguir en estructuras compactas.
Pese a que los resultados reportados por diversos grupos de investigación demuestran el gran potencial de la tecnología fotónica de sensado para la detección de bajas concentraciones de analito [7-12], existe todavía la necesidad de desarrollar implementaciones de biosensores fotónicos que permitan alcanzar límites de detección del orden del picogramo/mil ¡litro, picomolar o incluso inferiores (siempre dependiendo del tipo de analito a detectar), de una forma rápida y sencilla haciendo uso de estructuras fotónicas de sensado compactas.
En este contexto, el método y dispositivo de amplificación de sensado fotónico propuesto en la presente invención permite incrementar el efecto que la interacción entre el elemento de bioreconocimiento y el analito tienen sobre la estructura fotónica de sensado, de forma que permita reducir de forma significativa el límite de detección alcanzable (i.e., detectar menores concentraciones del analito, del orden de picogramo/mililitro, picomolar o incluso inferiores, dependiendo del tipo de analito a detectar), así como permitir la detección de todo tipo de analitos difícilmente detectables con las técnicas disponibles actualmente (por ejemplo y sin carácter limitativo, biomarcadores de baja masa molecular, pesticidas y microARNs). Esta amplificación de los eventos de sensado se llevará a cabo sin la necesidad de realizar ninguna preparación especial de la muestra a analizar (e.g., mareaje, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa, etc.), de forma que se podrán obtener sistemas finales más sencillos, fáciles de usar, compactos y económicos. Además, al consistir este método y dispositivo en una implementación especial del elemento de bioreconocimiento utilizado, podrá ser utilizado con cualquier estructura de sensado fotónico en la que el mecanismo de detección se base en el cambio de respuesta que ocurre al producirse un cambio en la distribución dieléctrica de la estructura. Este método y dispositivo también podría ser aplicable a otras metodologías de sensado donde la detección se base en las variaciones de la distribución dieléctrica, como es el caso de los sensores plasmónicos. Referencias citadas:
[1] De Vos, K., Bartolozzi, I., Schacht, E., Bienstman, P., Baets, R., "Silicon-on-lnsulator microring resonator for sensitive and label-free biosensing", (2007) Optics Express, 15 (12), pp. 7610-7615.
[2] McCIellan, M.S., Domier, L.L., Bailey, R.C., "Label-free virus detection using silicon photonic microring resonators", (2012) Biosensors and Bioelectronics, 31 (1), pp. 388-392.
[3] García-Rupérez, J., Toccafondo, V., Banuls, M.J., Castelló, J.G., Griol, A., Peransi- Llopis, S., Maquieira, A., "Label-free antibody detection using band edge fringes in SOI planar photonic crystal waveguides in the slow-light regime", (2010) Optics Express, 18 (23), pp. 24276-24286.
[4] Castelló, J.G., Toccafondo, V., Escorihuela, J., Bañuls, M.J., Maquieira, A., García- Rupérez, J., "Real-time observation of antigen-antibody association using a low-cost biosensing system based on photonic bandgap structures", (2012) Optics Letters, 37 (17), pp. 3684-3686.
[5] Sepúlveda, B., Snchez Del Río, J., Moreno, M., Blanco, F.J., Mayora, K., Domínguez, C, Lechuga, L.M., "Optical biosensor microsystems based on the integration of highly sensitive Mach-Zehnder interferometer devices", (2006) Journal of Optics A: Puré and Applied Optics, 8 (7), pp. S561-S566.
[6] Luff, B.J., Harris, R.D., Wilkinson, J.S., Wilson, R., Schiffrin, D.J., "Integrated-optical directional coupler biosensor", (1996) Optics Letters, 21 (8), pp. 618-620. [7] Huertas, C.S, Fariña, D., Lechuga, L.M., "Direct and Label-Free Quantification of Micro- RNA-181a at Attomolar Level in Complex Media Using a Nanophotonic Biosensor", (2016) ACS Sensors, 1 , pp. 748-756. [8] Soler, M., Estevez, M.-C, Villar-Vázquez, R., Casal, J.I., Lechuga, L.M., "Label-free nanoplasmonic sensing of tumor-associate autoantibodies for early diagnosis of colorectal cáncer", (2016) Analytica Chimica Acta, 930, pp. 31-38.
[9] Washburn, A.L., Shia, W.W., Lenkeit, K.A., Lee, S.-H., Bailey, R.C., "Multiplexed cáncer biomarker detection using chip-integrated silicon photonic sensor arrays", (2016) Analyst, 141 (18), pp. 5358-5365.
[10] Wade, J.H., Alsop, A.T., Vertin, N.R., Yang, H., Johnson, M.D., Bailey, R.C., "Rapid, Multiplexed Phosphoprotein Profiling Using Silicon Photonic Sensor Arrays", ACS Central Science (2015), 1 (7), 374-382.
[11] Chistiakova, M.V., Shi, C, Armani, A.M., "Label-free, single molecule resonant cavity detection: A double-blind experimental study", (2015) Sensors (Switzerland), 15 (3), pp. 6324- 6341.
[12] Mehrabani, S., Maker, A.J., Armani, A.M., "Hybrid integrated label-free chemical and biological sensors", (2014) Sensors (Switzerland), 14 (4), pp. 5890-5928.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Un objeto de la presente invención es obtener dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad (caracterizada por unos límites de detección del orden de picogramo/mililitro, picomolar o incluso inferiores, dependiendo del tipo de analito a detectar) mediante el uso de elementos de reconocimiento en los que el proceso de detección del analito de interés producirá un cambio conformacional que provoque un mayor efecto sobre la estructura fotónica de sensado respecto al que produciría el propio evento tradicional de reconocimiento receptor-analito.
Otro objeto de la presente invención es obtener dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que se consiguen bajos límites de detección (del orden de picogramo/mililitro, picomolar o incluso inferiores, dependiendo del tipo de analito a detectar) sin la necesidad de utilizar ningún proceso de preparación de muestra complejo como el marcado o la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa, reduciendo así la complejidad, el tamaño y el coste de los elementos de análisis finales.
Otro objeto de la presente invención es la obtención de dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que el elemento de reconocimiento es del tipo baliza molecular, aptámero o equivalente, con una partícula fijada a ellos, la cual será desplazada para producir una amplificación del evento de reconocimiento.
Otro objeto de la presente invención es la obtención de dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que la partícula unida al elemento de reconocimiento, la cual cambiará su posición al producirse el evento de reconocimiento, podrá ser tanto de tipo dieléctrico, metálico o biológico.
Otro objeto de la presente invención es la obtención de dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que los eventos de reconocimiento, y por tanto el desplazamiento de las partículas fijadas a los elementos de reconocimiento, se produzca tanto en la parte externa de las estructuras fotónicas de sensado, como en su parte interna en el caso de trabajar, por ejemplo, con estructuras porosas.
Otro objeto de la presente invención es la obtención de dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que se produce un efecto de amplificación del cambio espectral debido al cambio conformacional de los elementos de bioreconocimiento utilizados, pero en los que el rango de frecuencias de trabajo no es exclusivamente el óptico.
Otro objeto de la presente invención es la obtención de dispositivos de sensado fotónico de alta sensibilidad en los que el cambio conformacional de los elementos de bioreconocimiento utilizados incluye su ruptura, de forma que ésta provocará la liberación de la partícula unida al elemento de transducción a través del elemento de bioreconocimiento.
Otras características de la presente invención se desprenderán de la descripción detallada que sigue, junto con una realización preferida de su objeto. A efectos de la presente invención, se definen los siguientes términos: - Evento de sensado: proceso de detección de analitos en el que, salvo que se diga lo contrario, se emplea un dispositivo y/o un método según la invención.
- Elemento de transducción o transductor: elemento encargado de convertir los eventos de sensado en una señal medible. Para el caso de esta invención estaremos considerando un transductor de tipo óptico/fotónico en el que el sensado se basa en detectar las variaciones producidas en la respuesta de la estructura cuando se produce una variación de la distribución eléctrica.
- Elementos de bioreconocimiento, receptores o bioreceptores: elementos que se combinan con el transductor para que interaccionen de forma específica con los analitos a detectar, de forma que esta interacción produzca una señal medible por el transductor. En el caso de esta invención se consideran elementos de bioreconocimiento que experimentan un cambio conformacional al producirse la detección del analito.
- Analito: Sustancia objeto del sensado, presentada en estado sólido, líquido o gaseoso.
- Cambio conformacional: cambio en la disposición espacial de un elemento de bioreconocimiento, causado por la combinación de dicho elemento de bioreconocimiento con el analito.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1a, 1 b y 1c describen de forma esquemática el funcionamiento de un dispositivo de sensado fotónico, provisto de un elemento de transducción con una banda prohibida fotón i ca.
La figura 1a representa el estado inicial del espectro de transmisión (Y) de una señal en función de la longitud de onda (X) a través de una estructura que presenta una banda prohibida fotónica.
La figura 1 b representa el espectro de transmisión (Y) de una señal en función de la longitud de onda (X) a través de una estructura que presenta una banda prohibida fotónica, una vez se han producido los eventos de sensado que se quieren detectar.
La figura 1c muestra la evolución de la posición espectral de la característica espectral que se está monitorizando (Υ') en función del tiempo (X) para el caso de un sensor fotónico genérico, considerando tanto la fase de sensado como las etapas anterior y posterior a éste La figura 2 muestra de forma esquemática el funcionamiento de un dispositivo de sensado fotónico según la presente invención. En la realización mostrada, se utilizan balizas moleculares como elementos de bioreconocimiento, cada una de las cuales tiene uno de sus extremos fijado sobre la superficie del elemento fotónico de transduccion y una partícula de gran tamaño y/o alto índice fijada en el otro extremo.
Las figuras 3a, 3b y 3c muestran de forma esquemática diversos elementos fotónicos de transduccion que pueden ser utilizados en la presente invención. La figura 3a muestra un anillo resonante acoplado a una guía de acceso, la figura 3b muestra una estructura dieléctrica periódica unidimensional y la figura 3c muestra una estructura dieléctrica periódica bidimensional.
La figura 4 muestra los diferentes parámetros físicos que definen al elemento fotónico de transduccion descrito en la figura 3c.
La figura 5 es una gráfica que representa la transmisión normalizada frente a la longitud de onda correspondiente a un procedimiento de sensado fotónico utilizando el elemento de transduccion mostrado en la figura 3c. La figura 6 describe de forma esquemática una realización preferida de la presente invención. En esta realización preferida, los elementos de bioreconocimiento basados en balizas moleculares unidas a partículas de gran tamaño y/o alto índice son inmovilizados sobre la superficie de una estructura de sensado basada en el fenómeno de banda prohibida fotónica. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención se refiere a un dispositivo de sensado fotónico para la detección de analitos que comprende un elemento de transduccion en la forma de una estructura fotónica y elementos de bioreconocimiento afines a los analitos a detectar. Dicho dispositivo de sensado fotónico está caracterizado porque los elementos de bioreconocimiento sufren un cambio conformacional al estar en presencia del analito a detectar y porque dichos elementos de bioreconocimiento tienen fijadas partículas de un tamaño mayor al de los analitos a detectar, del orden de nanometros, y/o valores del índice de refracción superiores a 1.3. El dispositivo de sensado fotónico según la invención permite la detección de analitos con alta sensibilidad, mediante el uso de elementos de bioreconocimiento que experimenten un cambio conformacional (i.e., un cambio en su disposición espacial) al producirse la detección del analito deseado, de forma que este cambio conformacional provoque el desplazamiento de partículas fijadas a los propios elementos de bioreconocimiento.
El desarrollo de dicho dispositivo de sensado fotónico, aprovecha las propiedades físicas de las estructuras fotónicas de sensado basadas en desplazamiento espectral. En estas estructuras fotónicas de sensado, su respuesta espectral en transmisión o reflexión dependerá de la configuración dieléctrica de los materiales que componen la estructura empleada, por lo que, cualquier variación en esa composición dieléctrica se traducirá en una variación de la respuesta espectral, lo cual habitualmente se traducirá así mismo en un desplazamiento espectral. Por tanto, monitorizando el desplazamiento en frecuencia (o en longitud de onda) experimentado por la respuesta espectral de la estructura fotónica de sensado seremos capaces de detectar la presencia (y cantidad) de los analitos de interés. El cambio conformacional que se produce en los elementos de bioreconocimiento debido a la interacción con el analito, provoca que las partículas con alto índice de refracción (superior a 1.3) o con mayor tamaño (del orden de nanómetros) -que están fijadas a dichos elementos de bioreconocimiento- se desplacen con respecto a su posición original o nativa (en ausencia de analito). Esto modifica adicionalmente la distribución dieléctrica de la estructura fotónica, amplificando el desplazamiento espectral que se produce debido a la presencia del analito.
Gracias a este efecto de amplificación, los dispositivos según la presente invención tienen una mayor sensibilidad en el sensado fotónico que los dispositivos basados en mecanismos de reconocimiento tradicionales, siendo ésta de hasta varios órdenes de magnitud, en función de la configuración específica de los elementos de bioreconocimiento usados, por ejemplo y sin carácter limitativo, de dos órdenes de magnitud.
En una realización de la invención, los elementos de bioreconocimiento son balizas moleculares.
Las balizas moleculares (molecular beacons en inglés) son sondas moleculares que, en su estado nativo (i.e., en ausencia de analito), tienen forma de horquilla y están provistas de dos extremos entre los que cuales está dispuesta una secuencia específica, complementaria al analito que se desea detectar. En presencia de analito, por el contrario, las secuencias específicas de las balizas moleculares hibridan con secuencias complementarias del analito adoptando una posición estirada. Este cambio conformacional sufrido por las balizas moleculares modifica la posición relativa de las partículas unidas a dichas balizas moleculares, con respecto a la posición que mantenían en ausencia del analito. Esto genera un cambio en la distribución dieléctrica de la estructura fotónica que provoca, a su vez, un cambio en su respuesta espectral permitiendo la detección de los analitos con una mayor sensibilidad.
Es importante señalar que las balizas del estado de la técnica se utilizan para la detección de analitos por análisis de fluorescencia. Para ello, uno de sus extremos está unido a una partícula fluorescente, mientras que el otro está unido a un inhibidor de la fluorescencia. En el estado nativo, dichas balizas moleculares tienen forma de horquilla, de modo que las partículas fluorescentes están enfrentadas a los inhibidoras de la fluorescencia y muy próximas a éstos, lo que evita la aparición de fluorescencia. En presencia de analito, por el contrario, las secuencias específicas de las balizas moleculares hibridan con secuencias complementarias del analito, adoptando una posición estirada. Esto hace que las partículas fluorescentes se alejen de los inhibidores de fluorescencia, de forma que estos últimos ya no pueden evitar que aparezca fluorescencia. Las balizas moleculares de uso en la presente invención son, por tanto, distintas de las usadas en la técnica anterior (carecen de partículas fluorescentes y de inhibidores de la fluorescencia) y se utilizan en procedimientos de sensado diferentes (de tipo fotónico). En dichos procedimientos fotónicos no se detecta ninguna fluorescencia, sino que se miden cambios en la respuesta espectral de una estructura de sensado fotónico causada por la modificación de su distribución dieléctrica debida, a su vez, a la eventual presencia de un analito.
En otra realización de la invención los elementos de bioreconocimiento son balizas moleculares con secuencias específicas de oligonucleótidos, de ADN, ARN, y/o microARN. En otra realización de la invención, los elementos de bioreconocimiento son aptámeros. Los aptámeros son elementos de bioreconocimiento basados en cadenas sencillas de oligonucleótidos de ADN o ARN con una estructura 3D característica capaz de reconocer y unirse de manera específica y con elevada afinidad al analito diana, En otra realización de la invención el cambio conformacional de los elementos de bioreconocimiento provoca su ruptura, haciendo así que las partículas unidas a dichos elementos de bioreconocimiento sean liberadas del elemento de transducción al que están inicialmente inmovilizadas (i.e., en ausencia de analito). Respecto a las partículas fijadas a los elementos de bioreconocimiento, éstas pueden ser tanto partículas dieléctricas con un tamaño del orden de nanómetros y una conductividad eléctrica menor que 0.1 S nr1, partículas metálicas con tamaños del orden de nanómetros o moléculas biológicas con tamaños del orden de nanómetros y masa molecular superior a 10 KiloDalton. Su objetivo consiste en provocar una variación en la respuesta mayor a la que se produce por el puro evento de sensado (reconocimiento bioreceptor-analito), las partículas a utilizar deberán tener un tamaño mayor al del propio analito a detectar y/o un alto índice de refracción (superior a 1.3), siendo el efecto de amplificación del evento de sensado mayor cuanto mayor sea el tamaño de la partícula y/o su índice de refracción. Respecto al caso del uso de una partícula metálica, su presencia también provocará la aparición de efectos plasmónicos, los cuales se consideran equivalentes a los efectos de sensado fotónico considerados en esta invención. A los efectos de la presente invención, se entiende como efecto plasmónico a aquella señal producida en el interfaz entre materiales metálicos y dieléctricos y que también puede ser utilizada para realizar funciones de sensado. Además, a ios efectos de la presente invención se entiende que una partícula dieléctrica es aquella que posee una conductividad eléctrica menor que 0.1 S nr1. Asimismo, se entiende que una partícula metálica es aquella formada por un elemento metálico puro, una aleación de elementos metálicos puros y/o un compuesto metálico. Por último, se entiende que una molécula biológica es aquella molécula que está presente o tiene un efecto en un organismo vivo, por ejemplo y sin carácter limitativo, una proteína, un lípido, o un anticuerpo.
Respecto a las estructuras fotónicas de sensado consideradas en esta invención, se consideran todas aquellas en las que el sensado se basa en el cambio de respuesta fotónica que se produce al variar la distribución dieléctrica del sistema. Esto incluye estructuras típicamente usadas en el sensado fotónico como los resonadores (por ejemplo, anillos resonantes, como se muestra en la figura 3a), las estructuras de banda prohibida fotónica basadas en distribuciones periódicas unidimensionales (como se muestra en la figura 3b) o las estructuras de banda prohibida fotónica basadas en distribuciones periódicas bidimensionales (como se muestra en la figura 3c), pero también incluye otras estructuras típicas para sensado fotónico como las cavidades resonantes en estructuras de banda prohibida fotónica, las estructuras fotónicas basadas en guías de ranura, las estructuras interferométricas como las Mach-Zehnder, o los acopladores direccionales, entre muchas otras. Pero además, también será aplicable no sólo a configuraciones de estructuras fotónicas integradas creadas en substratos planares, sino también aquellas estructuras fotónicas basadas en otras configuraciones como por ejemplo estructuras multicapa, estructuras de sensado en fibra óptica, etc. que basen el sensado en la variación de respuesta óptica producida al cambiar la distribución dieléctrica de la estructura.
También en lo que se refiere a las estructuras fotónicas que se pueden utilizar en la presente invención, no sólo se consideran aquellas en las que el evento de sensado detectado (i.e., la interacción entre los elementos de bioreconocimiento y el analito) se produce en la superficie externa de la estructura fotónica considerada, ocurriendo así una interacción con el campo evanescente que se propaga por fuera de la propia estructura, sino también aquellas estructuras fotónicas en las que los eventos de sensado se producen en el interior de la propia estructura, como cuando se usan materiales porosos.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método de sensado fotónico, que comprende el uso de un dispositivo de sensado fotónico según la invención. Esta invención describe, pues, un método y un dispositivo de sensado fotónico para la detección de analitos con una alta sensibilidad en el que el desplazamiento de las partículas fijadas a los elementos de bioreconocimiento producido por el cambio conformacional de estos últimos permitirá detectar concentraciones menores de los analitos, así como analitos de menor masa molecular. Este método y dispositivo será válido en todas aquellas configuraciones de sensado basadas en la variación que se produce en la respuesta espectral de la estructura fotónica de sensado al tener lugar un cambio de la distribución dieléctrica de ésta, independientemente del tipo de estructura de sensado utilizada, del rango de frecuencias consideradas y del tipo de partículas utilizadas para fijarlas a los elementos de bioreconocimiento.
REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN
A continuación, se describen varios ejemplos concretos de la invención haciendo referencia a las figuras adjuntas. En dichas figuras, los componentes con funciones iguales o similares se han designado usando el mismo número de referencia. El principio básico de funcionamiento de un dispositivo de sensado fotónico basado en desplazamiento espectral se muestra en las figuras 1a, 1 b y 1c para el caso particular y genérico de una estructura de banda prohibida fotónica. Una estructura de banda prohibida fotónica (o photonic band gap del inglés, como se las conoce más habitualmente) es una estructura dieléctrica periódica la cual puede presentar regiones del espectro en las que no está permitida la propagación de ondas, región frecuencial a la que se conoce como banda prohibida fotónica. Tal y como se ha descrito previamente, la posición de dicha banda prohibida fotónica es dependiente de la distribución dieléctrica de la estructura, la cual cambiará al producirse los eventos de sensado. En la figura 1a se representa el estado inicial en el que se tiene el espectro de transmisión (Y) de la estructura de sensado considerada, el cual presenta una banda prohibida fotónica (1) que cubre un determinado rango de longitudes de onda (X); esta banda prohibida estará delimitada por dos bordes en los que se pasa de la banda de transmisión a la banda prohibida fotónica (2) y viceversa (3). En la figura 1 b se representa el estado en el que se han producido los eventos de sensado del analito. La detección del analito provoca una variación del índice de refracción en la estructura fotónica, provocando a su vez un desplazamiento del espectro de transmisión (Y) de ésta respecto al mostrado en la figura 1a. En la figura 1b se puede ver cómo se ha producido un desplazamiento de la banda prohibida fotónica y por tanto un cambio en la posición de los bordes en los que se pasa de la banda de transmisión a la banda prohibida fotónica y viceversa, pasando de la posición (2) a la (4) y de la (3) a la (5) respectivamente. En la figura 1c se muestra la evolución de la posición espectral de la característica espectral que se esté monitorizando (Υ') en función del tiempo (Χ'), la cual en este ejemplo podría ser la evolución de la posición del borde en el que se pasa de la banda de transmisión a la banda prohibida fotónica ((2) en figuras 1 a y 1 b) o la del borde en el que se pasa de la banda prohibida fotónica a la banda de transmisión ((3) en figuras 1a y 1 b). En esta evolución se puede ver cómo la característica espectral monitorizada permanece en una determinada longitud de onda (o frecuencia) (6), de forma que al producirse los eventos de sensado se producirá un desplazamiento de la posición de la característica espectral (7) hasta llegar a una posición de desplazamiento máximo (8) determinada por el experimento concreto que se está realizando.
El desplazamiento experimentado por la respuesta espectral de una estructura de sensado fotónico, mostrado en (7) en la figura 1c, vendrá determinado, entre otros factores, por la concentración y por la masa molecular del analito a detectar. De esta forma en los dispositivos de la técnica anterior, aquellas situaciones en las que se tenga una concentración muy baja del analito a detectar o aquellas en las que la masa molecular del analito sea muy reducida, provocarán desplazamientos espectrales extremadamente reducidos y que serán difícilmente detectables por el elemento de sensado. El dispositivo de sensado fotónico según la invención permite, por el contrario, amplificar el desplazamiento espectral producido por la presencia de analito, mejorando la sensibilidad en el sensado fotónico.
El principio de funcionamiento de un dispositivo de sensado fotónico según la presente invención se describe de forma esquemática en la figura 2.
Dicho dispositivo de sensado fotónico según la invención comprende, tal y como se muestra en la parte izquierda de la figura 2, una estructura fotónica de sensado (9) con elementos de bioreconocimiento (10) que tienen fijadas partículas (11).
Al pasar una muestra que contiene analitos (12) por dicho dispositivo de sensado fotónico, tal y como se ilustra en la parte derecha de la figura 2, la detección de estos analitos (12) por parte de los elementos de bioreconocimiento (10) producirá un cambio conformacional en el elemento de bioreconocimiento (10) que se traducirá en un cambio de la posición de las partículas (11) fijadas a estos elementos de bioreconocimiento (10) respecto a la estructura fotónica de sensado (9). De esta forma, el evento de detección producido provocará un cambio en la distribución dieléctrica de la estructura fotónica de sensado (9), que conllevará una variación en la respuesta (i.e., un desplazamiento espectral) significativamente mayor al que se produciría mediante una estrategia convencional de reconocimiento bioreceptor- analito. Por tanto, mediante el método y el dispositivo de sensado propuesto en esta invención será posible detectar concentraciones significativamente más bajas de analito y/o analitos con una masa molecular más reducida (de varios órdenes de magnitud en función de la configuración bioreceptor-partícula seleccionada) sin necesidad de llevar a cabo complejos procesos de preparación de muestra adicionales como el mareaje de los analitos o la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
La figura 3 muestra de forma esquemática diversas configuraciones de estructuras fotónicas de sensado (9) que pueden ser utilizadas con el dispositivo y método de amplificación descrito en esta invención. La figura 3a muestra un anillo resonante acoplado a una guía de acceso, la figura 3b muestra una estructura dieléctrica periódica unidimensional y la figura 3c muestra una estructura dieléctrica periódica bidimensional.
La figura 4 muestra una realización preferida de la invención en la que la estructura fotónica de sensado (9) es una estructura periódica unidimensional creada en silicio, sobre un substrato inferior de óxido de Silicio, y que está inicialmente rodeada por aire. Se parte de una guía monomodo de altura h = 220nm y anchura w= 460nm, en la que se introducen de forma periódica una serie de elementos transversales para formar la celda básica (15) que se replica de forma periódica. Los elementos transversales tienen unas dimensiones de w¡ = 140nm y we = 2μηι. La entrada a la estructura fotónica se realiza por (13) y la salida se realiza por (14). Seleccionando un periodo de a = 360nm se consigue tener un borde entre la banda prohibida fotónica y la banda de transmisión para el espectro de transmisión normalizada (Y") de los modos con polarización TE (definida dicha polarización como aquélla para la cual el campo eléctrico tiene sus componentes en el plano de la estructura planar) situado aproximadamente a una longitud de onda (X") de 1565nm, tal y como se muestra en la figura 5 con la referencia (16). Al producirse los eventos de sensado que se quieren detectar, se producirá un desplazamiento del borde entre la banda prohibida fotónica y la banda de transmisión, tal y como se describía de forma esquemática en la figura 1. En cualquier caso, insistir en que la parte relevante de esta invención no se refiere a la propia estructura de sensado, ya que tal y como se ha indicado previamente sería válida cualquier estructura de sensado basada en la detección de variaciones de índice de refracción, sino que la parte relevante de esta invención radica en la amplificación de los eventos de sensado gracias al uso de elementos de bioreconocimiento (10) que experimentan un cambio conformacional al producirse esos eventos, así como al hecho de que dichos elementos de bioreconocimiento (10) están unidos a partículas (11) que incrementan aún más el desplazamiento espectral al producirse un evento de sensado.
La figura 5 representa la transmisión normalizada (Y"), expresada en dB, frente a la longitud de onda (X"), expresada en nanómetros, para la estructura fotónica de sensado (9) de la realización de la invención mostrada en la figura 4. En la respuesta espectral mostrada se puede observar la presencia de un borde (16) en el que se pasa de la banda prohibida fotónica a la banda de transmisión de la estructura considerada.
La figura 6 describe de forma esquemática una realización preferida de la invención. En esta realización preferida, los elementos de bioreconocimiento (10) están basados en balizas moleculares unidas a partículas (11) de gran tamaño (del orden de 6 nm de diámetro) y/o alto índice de refracción (del orden de 2,5). Los elementos de bioreconocimiento (10) están inmovilizados sobre la superficie de una estructura fotónica de sensado (9) basada en el fenómeno de banda prohibida fotónica. Los elementos de bioreconocimiento (10) experimentarán un cambio conformacional al producirse la detección de analitos (12) basados en cadenas de oligonucleótidos, en este caso, microARNs.
La estructura fotónica de sensado será biofuncionalizada de forma que se inmovilicen sobre ella los elementos de bioreconocimiento (10) encargados de detectar los analitos de interés. En esta realización preferida los elementos de reconocimiento (10) son del tipo baliza molecular (o molecular beacon del inglés, como se las conoce más habitualmente). Dichos elementos (10) consisten en una cadena de oligonucleótidos sintetizados artificialmente que se caracterizan por tener una forma de horquilla en la que la zona del tallo (10a) (o stem del inglés, como se la conoce más habitualmente) se forma por la hibridación entre las 5-7 pares de bases complementarias que forman los extremos de la baliza molecular, dejando una zona de bucle (10b) (o loop del inglés, como se lo conoce más habitualmente) abierta a través de la que se producirá el reconocimiento del analito (12) que se quiere detectar, en este caso, una cadena de oligonucleótidos. Al producirse el reconocimiento del analito (12) por parte de la baliza molecular, el proceso de hibridación producirá un cambio conformacional que se traduce en una apertura del bucle (10b) y que alejará ambos extremos de la baliza molecular. En esta realización preferida los elementos de bioreconocimiento (10) de tipo baliza molecular comprenden una región de bucle de unos 18-25 nucleótidos, una región tallo de 5-7 nucleótidos y un espaciador adicional (10c) en la terminación, de unos 10-15 nucleótidos, a través de la que se inmovilizan a la superficie de la estructura fotónica (9). A cada elemento de bioreconocimiento (10) de tipo baliza molecular se le unirá una partícula dieléctrica de alto índice (11) para provocar su desplazamiento. Esta unión se realizará a través de la terminación de la baliza molecular (10) que no tiene el espaciador adicional previamente comentado y que no será utilizada para inmovilizarla a la superficie. Se considera que estas partículas dieléctricas están compuestas de óxido de titanio, con un índice alrededor de n«2.5 y con un diámetro de alrededor de 6nm.
Se utiliza la configuración previamente descrita de estructura fotónica de sensado, de baliza molecular (10) y de nanopartícula dieléctrica (11) de cara a detectar cadenas de oligonucleótidos de unas 22 bases; en concreto, se considera la detección de cadenas de microARN. La baja masa molecular y las concentraciones extremadamente bajas que son de interés para estos analitos dificulta de forma notable su detección directa haciendo uso de estructuras fotónicas de sensado (y por lo general, mediante cualquier otro método de detección). Sin embargo, el uso de la configuración descrita previamente provocará que cuando el microARN sea detectado por la baliza molecular y ésta sufra el cambio conformacional descrito anteriormente (mostrado en la parte derecha de la figura 6), la nanopartícula (11) de alto índice será desplazada respecto de la estructura fotónica de sensado. Este efecto producirá un aumento significativo del cambio de señal a detectar respecto al caso en el que se considera un mecanismo de reconocimiento tradicional. Para el caso descrito de forma esquemática en esta realización preferida, se calcula que el evento de reconocimiento provoca un desplazamiento de la partícula dieléctrica de unos 15-20nm respecto a la superficie del dispositivo de sensado fotónico, lo que se traducirá, en esta realización específica de la invención, en un factor de amplificación de alrededor de 2 órdenes de magnitud sobre el efecto de sensado.
Este nivel de amplificación del efecto de sensado será dependiente de diversos parámetros como por ejemplo el tipo de analito a detectar (i.e., para analitos livianos, el efecto de amplificación por el cambio conformacional podrá ser superior), el índice de refracción y el tamaño de la partícula fijada al elemento de bioreconocimiento, la posición en la que se fija la partícula (10) al elemento de bioreconocimiento o la magnitud del desplazamiento de la partícula (10) que se produce por el cambio conformacional experimentado, entre otros.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Dispositivo de sensado fotónico para la detección de analitos (12) que comprende un elemento de transducción en la forma de una estructura fotónica (9) y elementos de bioreconocimiento (10), afines a los analitos (12) a detectar; caracterizado porque los elementos de bioreconocimiento (10) sufren un cambio conformacional al estar en presencia de los analitos (12) a detectar y porque dichos elementos de bioreconocimiento (10) tienen fijadas partículas (11) de un tamaño mayor al de los analitos (12), del orden de nanómetros, y/o un índice de refracción mayor que 1.3.
2. - Dispositivo de sensado fotónico según la reivindicación 1 , en el que los elementos de bioreconocimiento (10) son balizas moleculares.
3. Dispositivo de sensado fotónico según la reivindicación 2, caracterizado porque los elementos de bioreconocimiento (10) son balizas moleculares con secuencias específicas de oligonucleótidos, de ADN, ARN, y/o de microARN.
4. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque los elementos de bioreconocimiento (10) son balizas moleculares provistas de una región tallo (10a) de 5-7 nucleótidos, una región de bucle (10b) de 18-25 nucleótidos y un espaciador adicional (10c), de unos 10-15 nucleótidos, inmovilizado a la superficie de la estructura fotónica (9).
5. Dispositivo de sensado fotónico según la reivindicación 1 , caracterizado porque los elementos de bioreconocimiento (10) son aptámeros.
6. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la interacción entre los elementos de bioreconocimiento (10) y los analitos (12) se produce en la parte externa de la estructura fotónica (9).
7. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la interacción entre los elementos de bioreconocimiento (10) y los analitos (12) se produce en el interior de la estructura fotónica (9).
8. Dispositivo de sensado fotónico según la reivindicación 7, caracterizado porque la parte interna de la estructura fotónica (9) está formada por un material poroso.
9. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las partículas (11) fijadas a los elementos de bioreconocimiento (10) son partículas dieléctricas con un tamaño del orden de nanometros, una conductividad eléctrica menor que 0.1 S-rrr1 y un índice de refracción superior a 1.3.
10. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque las partículas (11) fijadas a los elementos de bioreconocimiento (10) son partículas metálicas con un tamaño del orden de nanometros y formadas por un elemento metálico puro, una aleación de elementos metálicos puros y/o un compuesto metálico.
11. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque las partículas (11) fijadas a los elementos de bioreconocimiento (10) son moléculas biológicas con un tamaño del orden de nanometros y una masa molecular superior a 10 KiloDalton.
12. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la estructura fotónica (9) es un resonador, un anillo resonante, una estructura de banda prohibida fotónica con distribuciones periódicas unidimensionales, una estructura de banda prohibida fotónica con distribuciones periódicas bidimensionales, una estructura de banda prohibida fotónica con cavidad resonante, una estructura fotónica con guías de ranura, una estructura interferométrica de Mach-Zehnder y/o un acoplador direccional.
13. - Dispositivo de sensado fotónico según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el cambio conformacional de los elementos de bioreconocimiento (10) provoca la ruptura de dichos elementos de bioreconocimiento (10), de modo que las partículas (1 1) se liberan del elemento de transducción.
14. - Método de sensado fotónico, caracterizado porque comprende el uso de un dispositivo de sensado fotónico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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