WO2017170335A1 - 細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法 Download PDF

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郷史 田中
亮 末永
貴彦 戸谷
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/04—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel, a cell culture vessel support jig, and a cell culture method for efficiently culturing various cells.
  • well plates and flasks are often used as culture vessels for subculture.
  • a well plate in order to obtain an appropriate cell density, add cells to the individual wells together with the culture medium, start culturing, allow the cells to grow sufficiently in the well, and then transfer to the flask. Incubate with additional culture medium according to the growth, and when it grows to a certain volume, transfer to a flask with a larger volume and add more culture medium. It is known (see, for example, paragraph [0027] of Patent Document 1).
  • Patent Document 2 proposes a flask-type culture vessel in which a plurality of recesses are formed on one surface of a polyhedral shape such as a rectangular parallelepiped as a flask-type culture vessel.
  • an agglomerate formed by coalescence of single cells is formed in a recess that is a plurality of first culture portions provided in the first culture surface, and this is formed on the second culture surface in the container. It moves to the 2nd culture part with a larger area than a culture part, and is trying to become a bigger aggregate.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture container, a cell culture container support jig, and a cell culture method.
  • the cell culture container according to the present invention includes a container main body made of a gas permeable plastic film and an injection port, and the container main body has a peripheral portion sealed and a container top surface side having a bulging shape.
  • a plurality of recesses to be cell culture parts are provided on the bottom surface of the container body.
  • the cell culture container support jig is a jig for supporting the cell culture container, and is configured to support the bottom side of the container body in a non-contact manner with the recess.
  • the cell culture method according to the present invention is a cell culture method using the above-described cell culture container, wherein the bottom surface side of the container body is supported in a non-contact manner on the concave portion, and the cell is formed on the bottom portion of the concave portion.
  • cells can be efficiently cultured in the same container while reducing the risk of contamination while maintaining an appropriate cell density during culture.
  • a cell culture container 1 shown in FIG. 1 includes a container main body 2 made of a gas permeable plastic film and an injection port 3 made of a tubular member through which a culture medium, cells, and the like can circulate.
  • the container body 2 has a bulging shape in which the peripheral portion is sealed and the top surface 2a side bulges like a plateau, and the edge of the flat top surface 2a is inclined so as to be connected to the peripheral portion. Is formed.
  • the bottom surface 2b of the container body 2 is provided with a plurality of recesses 4 serving as cell culture parts.
  • the concave portion 4 provided on the bottom surface 2b of the container body 2 has an opening diameter (diameter) D of 0 in order to suppress the movement of cells in the container body 2 so that cells in culture remain in the single concave portion 4. It is preferably 3 to 10 mm, more preferably 0.3 to 5 mm, still more preferably 0.5 to 4 mm, particularly preferably 0.5 to 2 mm, and the depth d is 0.1 mm or more. Is preferred.
  • the opening diameter of the recess 4 may be the same for all the recesses 4. For example, the bottom surface 2 b is divided into a plurality of regions, and the opening diameter of the recess 4 is made different for each region.
  • the recessed part 4 to be provided may include two or more kinds of recessed parts having different opening diameters.
  • the top surface 2a side of the container body 2 is bulged in a plateau shape, and the edge of the top surface 2a is inclined so as to be connected to the peripheral portion.
  • the amount of the medium containing the cells decreases on the peripheral side and settles in the medium.
  • the number of cells is also reduced.
  • the opening diameters of all the recesses 4 are the same, the number of cells that settle into the recesses 4 on the peripheral side is reduced, so the same number of cells settle in all the recesses 4.
  • the shape of the recess 4 is a spherical crown so that cells can easily gather at the bottom of the recess 4, but the shape of the recess 4 is not limited to this.
  • the ratio d / D of the depth d to the opening diameter D of the recess 4 is preferably set to 0.05 to 1.
  • the occupied area of the concave portion 4 occupying the bottom surface 2b is preferably as large as possible within a range in which the moldability is not impaired in order to avoid cells from staying in the portion other than the concave portion 4 of the bottom surface 2b. Specifically, it is preferably 30 to 90% with respect to the area of the bottom surface 2b.
  • the recesses 4 are preferably arranged in a zigzag pattern as shown in the figure so that the area occupied by the recesses 4 in the bottom surface 2b is as large as possible. However, the recesses 4 may be arranged in a lattice pattern as necessary.
  • the size of the container body 2 is not particularly limited, but is preferably, for example, 50 to 500 mm in length and 50 to 500 mm in width.
  • Such a cell culture container 1 can be manufactured as follows, for example. First, a top surface side plastic film that becomes the top surface 2 a side of the container body 2 and a bottom surface side plastic film that becomes the bottom surface 2 b side of the container body 2 are prepared. And the top surface side plastic film is shape
  • the top side plastic film and the bottom side plastic film molded as described above are overlapped, and the peripheral part is heat-sealed with a tubular member forming the injection port 3 at a predetermined position. And then trim the periphery if necessary. Thereby, the cell culture container 1 as shown in FIG. 1 can be manufactured.
  • the gas permeability of the plastic film forming the container body 2 is determined according to the gas permeability test method of JIS K 7126.
  • the oxygen permeability measured at a test temperature of 37 ° C. is 5000 mL / (m 2 ⁇ day ⁇ atm. ) Or more.
  • it is preferable that a part or all of the plastic film has transparency so that the progress of cell culture and the state of cells can be confirmed.
  • the material used for the plastic film forming the container body 2 is not particularly limited as long as it has a desired gas permeability.
  • examples thereof include thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyester, silicone elastomer, polystyrene elastomer, and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP). These may be used as a single layer, or may be used by laminating the same or different materials, but has a layer that functions as a sealant layer in consideration of heat fusion when sealing the periphery. Is preferred.
  • the plastic film used for forming the container body 2 so as to have an appropriate shape retaining property capable of maintaining the bulging shape on the top surface 2a side and the shape of the concave portion 4 while having flexibility.
  • the thickness is preferably 30 to 200 ⁇ m.
  • the injection port 3 is composed of a tubular member through which a culture medium, cells, and the like can circulate, as described above, but the tubular member forming the injection port 3 is, for example, polyethylene, polypropylene, It can be molded into a predetermined shape by injection molding, extrusion molding, or the like using a thermoplastic resin such as vinyl chloride, polystyrene-based elastomer, or FEP.
  • a thermoplastic resin such as vinyl chloride, polystyrene-based elastomer, or FEP.
  • a port blocking prevention piece can be provided.
  • a port blockage prevention piece is provided, it is preferably provided so as to be positioned on the top surface 2a side of the container body 2 so as not to hinder the sedimentation of cells into the recess 4 provided on the bottom surface 2b.
  • the cells to be cultured together with the culture medium are placed in the vessel body 2 while maintaining a closed system via a liquid feeding tube connected to the injection port 3. inject. Then, the cells injected into the container body 2 settle in the medium and are collected at the bottom of each recess 4.
  • the bottom surface is deformed so that the periphery is lifted as the container is filled with the content liquid.
  • the top surface 2a side of the container body 2 has a bulging shape, and by designing the bulging shape on the top surface 2a side in consideration of the injection amount, It is possible to suppress the deformation of the bottom surface 2b when the cells to be cultured are injected together with the medium. Accordingly, the cells can be uniformly accommodated in the respective recesses 4 without the recesses 4 provided on the bottom surface 2b being inclined.
  • a cell low adhesion treatment is applied to the bottom surface 2b including the recesses 4 so that the cells settled in the medium are likely to collect at the bottoms of the recesses 4 so that the cells do not adhere easily.
  • the low cell adhesion treatment include, for example, a treatment for imparting hydrophilicity to the surface of the plastic film by a surface treatment such as a plasma treatment, a phospholipid polymer, a surfactant, a protein such as albumin, and the like. Treatment for inhibiting the adsorption of cell adhesion protein.
  • the bottom surface 2b side also has a bulging shape that bulges in a plateau like the top surface 2a side. By doing in this way, it is formed so that the edge of bottom face 2b may incline and continue to a peripheral part, and it can avoid that a cell retains in the peripheral part side of bottom face 2b. Furthermore, it is preferable that the bottom surface 2b side of the container body 2 also has a bulging shape in order to suppress deformation of the bottom surface 2b when the cells to be cultured are injected together with the culture medium.
  • the cells injected into the container body 2 settle in the medium and gather at the bottom of each recess 4, and the cell density is increased in a state where the cell density is increased. It can induce culture and differentiation well. And since the container main body 2 consists of a plastic film which has gas permeability, it can supply sufficient quantity of oxygen to the cell in culture
  • the concave portion 4 is formed on the bottom surface side plastic film as described above, the plastic film is stretched so that the thickness of the concave portion 4 is other than the concave portion 4 of the bottom surface 2b. It is preferable to make the thickness thinner than the thickness of the portion, whereby the gas permeability of the recess 4 can be increased, and sufficient oxygen can be supplied to the cells collected in the recess 4.
  • cells when performing cell culture using the cell culture container 1, cells can be cultured under predetermined conditions in a culture vessel such as a CO 2 incubator.
  • the cell culture vessel 1 is preferably installed on a frame in the incubator via a jig 10 that can support the bottom surface 2 b side of the concave portion 4 in a non-contact manner.
  • the concave portion 4 is surely prevented from being crushed and deformed, and the cells in culture collected in the concave portion 4 are prevented from flowing out around the concave portion 4.
  • the gas permeability from the bottom surface 2b can be maximized.
  • a perforation or a recess having a diameter that allows the recess 4 to be inserted in a non-contact manner corresponds to the arrangement of the recess 4
  • the top surface 2a is used as the culture surface with the top of the cell culture container 1 reversed. By using it, the culture area can be expanded. This makes it possible to continue cell culture while maintaining an appropriate cell density in the same container.
  • the cells to be cultured are anchorage-dependent cells
  • an enzyme solution for peeling the cells from the bottom surface of the recesses 4 is added as necessary. In this case, the enzyme solution can be injected into the container body 2 while maintaining a closed system via the liquid feed tube connected to the injection port 3. .
  • cell culture usually requires a period of several days to several weeks, and during that period, it is necessary to add a medium or change a medium as necessary. These operations can be easily performed while maintaining the closed system by adding the medium or replacing the medium through the liquid feeding tube connected to the. Furthermore, after completion of the culture, the cells in the cell culture vessel 1 can be recovered while maintaining the closed system via the liquid feeding tube connected to the injection port 3.
  • the cell density at the time of culture is appropriately maintained while maintaining a closed system without subculture, and the cells are efficiently used. It is possible to multiply it. Moreover, a complicated transfer operation is not required, and cells can be efficiently cultured in the same container while reducing the risk of contamination.
  • the container body 2 is formed using a plastic film, it is lightweight even if the capacity is increased and is not bulky. Therefore, the container body 2 is suitable for large-scale cell culture. A sufficient amount of medium can be injected. In addition, the size of the container body 2 can be adjusted using a clamp or the like, and can be flexibly handled according to the number of cells and the amount of medium. On the other hand, in the flask type culture container as in Patent Document 2, it is necessary to replace the container with a different size.
  • the container main body 2 has a rectangular shape and includes the injecting port 3 on one side of the short side, but is not limited thereto.
  • the shape of the container body 2 may be a square shape, an oval shape, a circular shape, or the like, and can be various shapes as necessary.
  • the position and the number of the injection ports 3 can be changed as appropriate.
  • the present invention can be used as a technique for efficiently culturing various cells.

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Abstract

ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体２と注入出用ポート３とを備え、容器本体２は、周辺部がシールされ、その天面２ａ側が膨出形状を有するとともに、底面２ｂに、細胞培養部となる凹部４が複数設けられた細胞培養容器１に、注入出ポート３から、培地とともに培養対象の細胞を容器本体２に注入して細胞培養を行う。これにより、培養時の細胞密度を適性に維持しながら、コンタミネーションのリスクの低減しつつ、同一の容器内で効率良く細胞を培養する。

Description

細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法
　本発明は、種々の細胞を効率良く培養するための細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養・分化誘導することが求められている。
　このような細胞培養にあっては、培地中の細胞密度を適正な範囲に維持することが必要である。すなわち、細胞の増殖に伴い培地中の細胞密度が高くなっていくと、増殖に必要な培地成分の枯渇や、細胞自身の代謝産物の蓄積などにより細胞の成長が阻害され、細胞の増殖効率が低下してしまう。また、培地中の細胞密度が低すぎても、細胞を効率良く増殖・分化誘導させることができない。このため、細胞をある程度の規模で培養する場合には、通常、培地中の細胞密度が適性に維持されるように、継代を繰り返しながら培養を行っている。
　従来、継代培養に際しては、ウェルプレートやフラスコなどが培養容器として用いられることが多い。例えば、ウェルプレートを用いて、適度の細胞密度となるように、培地とともに細胞を個々のウェルに加えて培養を開始し、ウェル内で細胞を十分に増殖させてからフラスコに移し替え、細胞の増殖に合わせて培地を追加して培養するとともに、一定量に増殖した時点で、より容量の大きいフラスコに移し替えて、さらに培地を追加することにより、継代を繰り返して細胞を大量に培養することが知られている（例えば、特許文献１［００２７］段落など参照）。
　なお、特許文献２には、フラスコタイプの培養容器として、直方体などの多面体形状に形成された容器の一面に、複数の凹部が凹設されたフラスコタイプの培養容器が提案されている。特許文献２では、第１培養面に複数凹設された第１培養部となる凹部でシングルセルの合一による凝集塊を形成し、これを容器内の第２培養面に形成された第１培養部よりも面積が広い第２培養部に移して、より大きな凝集塊となるようにしている。
特開２０１１－２４１１５９号公報 特開２００６－５５０６９号公報
　しかしながら、このようにして継代培養を行うにあたっては、ウェルプレートの個々のウェルに細胞を加える際や、ウェルプレートからフラスコに細胞を移し替える際に、ピペッティング操作を何回も繰り返す必要がある。また、継代のたびに新たなフラスコなどの培養容器に細胞を移さなければならず、煩雑な作業が強いられるばかりか、細菌やウイルスなどのコンタミネーションのリスクも高くなってしまうという問題がある。
　また、特許文献２のようなフラスコタイプの培養容器では、開口部を閉塞する蓋を外して、開口部を開放したときにしかガス交換が行われない。このため、培養中の細胞に十分な量の酸素を供給できないだけでなく、ガス交換に際してもコンタミネーションのリスクが避けられないという問題もある。さらに、実験室レベルを超えて、ある程度の規模で細胞を大量に培養するには、容量が限られているフラスコタイプの培養容器は不向きである。
　本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、培養時の細胞密度を適性に維持しながら、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、同一の容器内で効率良く細胞を培養・分化誘導するための細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法の提供を目的とする。
　本発明に係る細胞培養容器は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体と、注入出用ポートとを備え、前記容器本体は、周辺部がシールされ、容器天面側が膨出形状を有するとともに、前記容器本体の底面に細胞培養部となる凹部を複数設けた構成としてある。
　また、本発明に係る細胞培養容器の支持治具は、上記の細胞培養容器を支持する治具であって、前記容器本体の前記底面側を前記凹部に非接触で支持可能な構成としてある。
　また、本発明に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、前記容器本体の前記底面側を前記凹部に非接触で支持して、前記凹部の底部に細胞を集めて培養する方法としてある。
　本発明によれば、培養時の細胞密度を適性に維持しながら、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、同一の容器内で効率良く細胞を培養することができる。
本発明の実施形態に係る細胞培養容器の概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図、（ｃ）は底面図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養容器の変形例の概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図、（ｃ）は底面図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養容器の使用例を示す説明図である。
　以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
　図１に示す細胞培養容器１は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体２と、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなる注入出用ポート３とを備えている。
　容器本体２は、周辺部がシールされ、その天面２ａ側が台地状に膨出した膨出形状を有しており、平坦面とされた天面２ａの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成されている。これとともに、容器本体２の底面２ｂには、細胞培養部となる凹部４が複数設けられている。
　容器本体２の底面２ｂに設ける凹部４は、容器本体２内における細胞の移動を抑止して、培養中の細胞が一つの凹部４に留まるようにするために、開口径（直径）Ｄが０．３～１０ｍｍであるのが好ましく、より好ましくは０．３～５ｍｍ、さらに好ましくは０．５～４ｍｍ、特に好ましくは０．５～２ｍｍであり、深さｄが０．１ｍｍ以上であるのが好ましい。凹部４の開口径は、全ての凹部４で同一としてもよく、例えば、底面２ｂを複数の領域に分割して、それぞれの領域ごとに凹部４の開口径を異ならせるなどして、底面２ｂに設ける凹部４が、開口径が異なる二種以上の凹部を含んでいてもよい。
　例えば、本実施形態では、容器本体２の天面２ａ側を台地状に膨出させて、天面２ａの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成している。このようにすると周辺部側の高さが低くなるので、培地とともに培養対象の細胞を容器本体２に注入した際に、細胞を含む培地の量が周辺部側で少なくなり、培地中を沈降する細胞数も少なくなる。そうすると、全ての凹部４の開口径を同一にすると、周辺部側の凹部４に沈降して入る細胞数が少なくなってしまうため、全ての凹部４に同じ程度の数の細胞が沈降して入ってくるように、周辺部側では凹部４の開口径を大きくするのが好ましい。
　また、図１に示す細胞培養容器１では、凹部４の底部に細胞が集まり易くなるように、凹部４の形状を球冠状としているが、凹部４の形状は、これに限定されない。凹部４の底部に細胞が集まり易くするには、凹部４の開口径Ｄに対する深さｄの比ｄ／Ｄを０．０５～１とするのが好ましい。
　また、底面２ｂに占める凹部４の占有面積は、底面２ｂの凹部４以外の部分に細胞が滞留してしまうのを避けるために、成形性が損なわれない範囲でできるだけ大きくするのが好ましく、具体的には、底面２ｂの面積に対して３０～９０％であるのが好ましい。凹部４の配列は、図示するような千鳥状として、底面２ｂに占める凹部４の占有面積ができるだけ大きくなるようにするのが好ましいが、必要に応じて格子状に配列してもよい。
　また、容器本体２の大きさは特に限定されないが、例えば、縦５０～５００ｍｍ、横５０～５００ｍｍとするのが好ましい。
　このような細胞培養容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
　まず、容器本体２の天面２ａ側となる天面側プラスチックフィルムと、容器本体２の底面２ｂ側となる底面側プラスチックフィルムとを用意する。そして、天面側プラスチックフィルムを、その周辺部を残して台地状に膨出するように成形する。一方、底面側プラスチックフィルムには、複数の凹部４を所定の配列で成形する。これらは、一般的な真空成形や圧空成形などによって形成することが可能であり、金型などを適宜調整することで、膨出形状や凹部４の形状が所望の形状となるように成形することができる。
　次に、上記のように成形された天面側プラスチックフィルムと底面側プラスチックフィルムとを重ね合せるとともに、所定の位置に注入出用ポート３を形成する管状の部材を挟んで周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１に示すような細胞培養容器１を製造することができる。
　容器本体２を形成するプラスチックフィルムのガス透過性は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２６のガス透過度試験方法に準拠して、試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上であるのが好ましい。
　また、当該プラスチックフィルムは、細胞培養の進行状況や細胞の状態などを確認できるように、一部又は全部が透明性を有しているのが好ましい。
　容器本体２を形成するプラスチックフィルムに用いる材料としては、所望のガス透過性を有していれば特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂が挙げられる。これらは単層で用いても、同種又は異種の材料を積層して用いてもよいが、周辺部をシールする際の熱融着性を考慮すると、シーラント層として機能する層を有しているのが好ましい。
　また、可撓性を有しながらも、天面２ａ側の膨出形状や凹部４の形状が保たれる適度の形状保持性を有するように、容器本体２を形成するのに用いるプラスチックフィルムの厚みは、３０～２００μｍであるのが好ましい。
　また、注入出用ポート３は、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなるのは前述した通りであるが、注入出用ポート３を形成する管状の部材は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、所定の形状に成形することができる。
　また、注入出用ポート３には、容器本体２の天面２ａ側と底面２ｂ側との貼り付きによってポートが閉塞してしまうのを避けるために、その基端から容器本体２内に突出するポート閉塞防止片を設けることができる。このようなポート閉塞防止片を設ける場合には、底面２ｂに設けた凹部４への細胞の沈降の妨げにならないように、容器本体２の天面２ａ側に位置するように設けるのが好ましい。
　このような細胞培養容器１を用いて細胞培養を行うには、注入出用ポート３に接続された液送チューブを介して閉鎖系を維持しつつ、培地とともに培養対象の細胞を容器本体２に注入する。そして、容器本体２に注入された細胞は、培地中を沈降して各凹部４の底部に集められる。
　ここで、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしただけの平パウチ状の容器では、容器内が内容液で満たされていくにつれて周辺部が持ち上がるように底面が変形する。これに対して、本実施形態にあっては、容器本体２の天面２ａ側が膨出形状を有しており、注入量を考慮して天面２ａ側の膨出形状を設計することで、培地とともに培養対象の細胞を注入する際の底面２ｂの変形を抑制することができる。これによって、底面２ｂに設けられた凹部４が傾いたりすることなく、それぞれの凹部４に均一に細胞を収容することが可能となる。
　培地中を沈降する細胞が、各凹部４の底部に集まり易くなるように、凹部４を含む底面２ｂには、細胞低接着処理を施して細胞が接着し難くするのが好ましい。細胞低接着処理としては、例えば、プラズマ処理などの表面処理によってプラスチックフィルムの表面に親水性を付与する処理、リン脂質ポリマー、界面活性剤、アルブミンのようなタンパク質などをコーティングしてプラスチックフィルムの表面に細胞接着性タンパクが吸着するのを阻害する処理などが挙げられる。
　また、底面２ｂの凹部４以外の部分、特に、底面２ｂの周辺部側に、細胞が滞留してしまうのを避けて、凹部４の底部に細胞がより集まり易くするために、容器本体２は、図２に示すように、その底面２ｂ側も天面２ａ側と同様に台地状に膨出した膨出形状を有しているのが好ましい。このようにすることで、底面２ｂの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成され、底面２ｂの周辺部側に細胞が滞留してしまうのを避けることができる。さらに、容器本体２の底面２ｂ側も膨出形状を有するようにすることは、培地とともに培養対象の細胞を注入する際の底面２ｂの変形を抑制する上でも好ましい。
　なお、このような態様とする場合、前述したようにして細胞培養容器１を製造する際に、底面側プラスチックフィルムを、その周辺部を残して膨出するように成形するとともに、膨出させた部位に凹部４を成形するようにすればよい。
　このように、本実施形態の細胞培養容器１によれば、容器本体２に注入された細胞は、培地中を沈降して各凹部４の底部に集まり、細胞密度が高められた状態で、効率良く培養・分化誘導することができる。そして、容器本体２は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなるため、培養中の細胞に十分な量の酸素を供給できる。特に、本実施形態にあっては、前述したようにして底面側プラスチックフィルムに凹部４を成形する際に、当該プラスチックフィルムが延伸されて、凹部４の肉厚が、底面２ｂの凹部４以外の部分の肉厚に比べて薄肉となるようにするのが好ましく、これにより凹部４のガス透過性を高めて、凹部４に集められた細胞により十分な酸素を供給することができる。
　また、細胞培養容器１を用いて細胞培養を行うにあたっては、ＣＯ２インキュベータなどの培養器内で、所定の条件下で細胞を培養することができる。このとき、細胞培養容器１は、図３に示すように、その底面２ｂ側を凹部４に非接触で支持可能な治具１０を介して、培養器内の架台に設置するのが好ましい。このようにすることで、凹部４が潰れたりして変形するのを確実に防止して、凹部４に集められた培養中の細胞が、凹部４の周囲に流出してしまわないようにすることができるだけでなく、底面２ｂからのガス透過性を最大限に高めることができる。
　細胞培養容器１の底面２ｂ側を凹部４に非接触で支持可能な治具１０としては、例えば、当該凹部４が非接触で挿通可能な径の穿孔又は凹部を、当該凹部４の配列に対応させて複数設けた平板状の治具や、当該凹部４の間に当該凹部４と非接触となるように網目状に線材を組んだ金網状の治具などが挙げられる。
　そして、凹部４の底部に集められた細胞が一定以上に増殖して、その細胞密度が培養に適した範囲を超えたときには、細胞培養容器１の天地を逆にして天面２ａを培養面として利用することで、培養面積を拡大することができる。これにより、同一の容器内で適正な細胞密度を維持しながら、細胞培養を継続することが可能となる。
　なお、培養対象の細胞が足場依存性の細胞である場合には、細胞培養容器１の天地を逆にする際に、必要に応じて、細胞を凹部４の底面から剥離するための酵素溶液を容器本体２に注入するが、この場合であっても、注入出用ポート３に接続された液送チューブを介して閉鎖系を維持しつつ、かかる酵素溶液を容器本体２に注入することができる。
　また、細胞の培養には、通常、数日～数週間の期間を要し、その期間中に、必要に応じて、培地の追加や、培地交換を行わなければならないが、注入出用ポート３に接続された液送チューブを介して培地の追加や、培地交換をすることで、閉鎖系を維持したまま、これらの作業を容易に行うことができる。さらに、培養終了後は、注入出用ポート３に接続された液送チューブを介して閉鎖系を維持したまま、細胞培養容器１内の細胞を回収することもできる。
　以上のように、本実施形態の細胞培養容器１を用いて細胞培養を行うことで、継代を行うことなく閉鎖系を維持したまま培養時の細胞密度を適正に維持して、細胞を効率的に増殖させることが可能になる。また、煩雑な移し替え作業が不要であり、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、同一の容器内で効率良く細胞を培養することができる。
　さらに、プラスチックフィルムを用いて容器本体２を形成しているため、その容量を大きくしても軽量であり、嵩張ることもないので、大量の細胞培養に適しており、容器本体２には、予め十分な量の培地を注入しておくこともできる。しかも、クランプなどを用いて容器本体２のサイズを調整することも可能であり、細胞数、培地量に応じてフレキシブルに対応することができる。これに対して、特許文献２のようなフラスコタイプの培養容器では、サイズの異なる容器に取り換えて対応しなければならない。
　以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、前述した実施形態では、容器本体２は長方形状とされており、その短辺側の一辺に注入出用ポート３を備えているが、これに限定されない。容器本体２の形状は、正方形状、楕円形状、円形状などとする場合もあり、必要に応じて種々の形状とすることができる。注入出用ポート３を備える位置やその数も適宜変更可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先権の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　本発明は、種々の細胞を効率良く培養する技術として利用できる。
　１　　　　　細胞培養容器
　２　　　　　容器本体
　２ａ　　　　　天面
　２ｂ　　　　　底面
　３　　　　　注入出用ポート
　４　　　　　凹部
　１０　　　　　治具

Claims (10)

  1. 　ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体と、注入出用ポートとを備え、
    　前記容器本体は、周辺部がシールされ、容器天面側が膨出形状を有するとともに、
    　前記容器本体の底面に細胞培養部となる凹部を複数設けたことを特徴とする細胞培養容器。
  2. 　前記凹部は、開口径が０．３～１０ｍｍであり、深さが０．１mm以上である請求項1に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記底面に占める前記凹部の占有面積が、前記底面の面積に対して３０～９０％である請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記凹部が、開口径が異なる二種以上の凹部を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記プラスチックフィルムの酸素透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上である請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記凹部の肉厚が、前記底面の前記凹部以外の部分の肉厚に比べて薄肉にされた請求項1～５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記凹部を含む前記底面に、細胞低接着処理を施した請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記注入出用ポートの基端から前記容器本体内に突出するポート閉塞防止片を、前記天面側に位置するように設けた請求項1～７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器を支持する治具であって、
    　前記容器本体の底面側を前記凹部に非接触で支持可能なことを特徴とする細胞培養容器の支持治具。
  10. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    　前記容器本体の底面側を前記凹部に非接触で支持して、前記凹部の底部に細胞を集めて培養することを特徴とする細胞培養方法。
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