WO2017104966A1 - 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

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saponin
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saponins
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김보슬
김형수
노규진
배신자
이서현
박종진
김철민
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경성대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to the use of ginseng saponins, such as wild ginseng, goat ginseng, culture root, ginseng, hwagi ginseng, jeonchisam, or red ginseng, specifically, the active saponins containing Compound K by extracting, heat-treating and enzymatic conversion of the ginseng saponins Ginseng saponins that produce Rd, F2, and Rg3 and contain 90% or more of these compounds K, Rd, F2, and Rg3 as main components, extending cell life, promoting cell differentiation, increasing red blood cell count, and reducing triglycerides (Hereinafter referred to as 'CKS').
  • ginseng saponins such as wild ginseng, goat ginseng, culture root, ginseng, hwagi ginseng, jeonchisam, or red ginseng
  • the active saponins containing Compound K by extracting, heat-treating and enzymatic conversion of the ginseng saponin
  • Saponins and non-saponins in ginseng have excellent pharmacological activity, excellent efficacy in eliminating harmful free radicals, anticancer, lowering blood pressure, It has an excellent effect on lipid lowering, liver toxicity, etc.
  • Ginseng saponin which is well known as a major pharmacological component of ginseng, is divided into PPD (Protopanaxadiol) family and PPT (Protopanaxatriol) family.
  • PPD-based saponins have a structure in which various substituents are bonded to PPD, which is a basic structure, and ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, F2, Rg3, and Compound K are representative saponins.
  • PPT-based saponins are the basic structure of PPT, and ginsenosides Re, Rf, Rg1, and Rh1 are typical.
  • Ginseng saponins also contain three or more sugars ginsenosides Rb1, Rb2, and Rd. It is known that ginsenosides Rg3, Rh1, Rh2, F2, CY and CK produced by hydrolysis of some sugars than Re, and Re exhibit much better effects in terms of absorption into the living body and biological activity. Ginseng saponin, which has a lot of sugar, is known to be absorbed into our body in the small intestine very little.
  • ginseng products containing saponin components are composed of three saponins which are highly soluble in water.
  • the inactive state of the components is highly soluble in water, but is poorly absorbed in the intestine. It is known that there is little effect.
  • the ingredients are activated and changed into active ingredients, they are not soluble in water, but instead have high absorption in the human body, thereby exerting the effect.
  • the term 'active' used in active saponins, active goat ginseng, active ingredients, etc. refers to the characteristics of saponins or ginsenosides of ginseng processed by the present invention.
  • the total content of saponin is higher than normal wild ginseng, mountain goat ginseng or ginseng, and is absorbed by the human body to exert its effect.
  • ginsenosides Rg3, Rh1, Rh2, F2, CY, and CK which are formed by hydrolysis of some sugars other than ginsenosides Rb1, Rb2, Rd, and Re, in which three or more sugars are bonded It means a saponin which shows a much better effect in terms of absorption into the living body or physiological activity with any one or two or more ginsenoids selected.
  • the active ingredient is a form in which the sugar attached to the tri-saponin is separated and exhibited its effect after being absorbed by the human body.
  • This process is mainly a process that is degraded by heat or by enzymes. Some are absorbed after being activated by microorganisms in the intestine.
  • the production of the active ingredient Compound K (Compound K) is known to be difficult to make quite difficult.
  • the inventors of the present invention have tried to find a use for anti-aging by producing a CKS.
  • Aging is a state in which it is difficult for a living body to perform a normal function due to a decrease in homeostasis of a living body and an induction of suicide of cells due to excessive accumulation of wastes as well as functional degradation of cells and organs that are components of a living body. It can also be defined as a process of increasing susceptibility to disease and death. However, these causes are so diverse and complex that it is difficult to tell them as one.
  • the present invention was intended to identify internal factors among various causes of aging through blood analysis. With age, hepatic function, kidney function, memory loss and, in particular, excessive increase in total and triglycerides cause blood vessel problems and cause many diseases. Therefore, the results were analyzed through blood analysis.
  • the 12-month-old Sprague Dawley Rat (SD rat) was purchased and raised for 19 months, and CKS was intraperitoneally administered for 37 days from the age of 20 months and compared with the unadministered control group.
  • Compound K is difficult to manufacture and experiment due to its extremely difficult manufacturing and expensive disadvantages.
  • the inventors of the present invention have developed technology for producing a large amount of compound K by enzymatic conversion for a long time, and by administering CKS containing the prepared compound K to an aged Sprague Dawley Rat (hereinafter referred to as SD rat) Blood analysis was performed. As a result of blood analysis, a decrease in triglycerides was apparent, and there was an increase in red blood cells.
  • the differentiation effect on stem cells was examined, and the effect on cell life extension through cell culture was examined.
  • the differentiation of stem cells means that many cells can be produced in a short time, and in particular, reducing the differentiation time means that the number of cells can be increased in a short time.
  • the present invention has been invented to solve the conventional problems as described above has the following object.
  • An object of the present invention is to remove the sugar attached to ginseng saponin to prepare an active ingredient, and to provide a composition useful for increasing the number of red blood cells and reducing triglycerides by including the ginseng saponin as an active ingredient.
  • the present invention comprises a ginseng saponin as an active ingredient to reduce the differentiation time of stem cells, and to provide a composition useful for prolonging cell life through the inhibition of ⁇ -galactase in cells.
  • the present invention provides a composition comprising ginseng saponin as an active ingredient, which overcomes the problem of residual organic solvents by using heat alcohol and enzymatic treatment while preparing alcoholic saponin in parallel with heat treatment and enzymatic treatment. It aims to do it.
  • the present invention for achieving the above object is implemented by the following solving means.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising useful ginseng saponin as an active ingredient and useful for increasing the number of red blood cells and reducing triglycerides, and also useful for differentiating stem cells and extending the life of cells. Exposing to steam under pressure of 1.1 kg / cm 2 while removing excess moisture at 121 ° C.
  • step S1 Injecting air through the ginseng that passed the step S1 continuously to cool to 90 °C or less (step S2); Repeating step S1 and step S2 two more times (step S3); After step S3, the ginseng is cooled to room temperature in a thermostat and the ginseng is shredded to a particle size of 1 mm or less (step S4); Extracting saponin by adding 80% alcohol to the ginseng having undergone the S4 step, and concentrating the extracted saponin (step S5); After step S5, dissolving the concentrated saponin in ethanol and adding sterile water to prepare a suspension (step S6); After the step S6, adding the suspension dropwise to the pectinase enzyme solution to react (step S7); And precipitated by centrifuging the solution passed through the step S7, and dissolving the resulting precipitate in alcohol alcohol and suspended again in sterile physiological saline to filter and then concentrated the filtrate.
  • step S1 Injecting air through the ginseng that passed the
  • the present invention is characterized in that the ginseng saponin is more than 90% of the protopanaxadiol-based saponins, the protopanaxadiol-based saponins active protopanaxadiol is Compound K, Rd, F2, Rg3 increase in the number of red blood cells and reduced triglycerides It is a pharmaceutical composition useful for stem cell differentiation and cell life extension.
  • the present invention has the following effects by the above configuration.
  • the present invention removes the sugars attached to ginseng saponin as an active ingredient, and includes the ginseng saponin as an active ingredient to provide a pharmaceutical composition useful for increasing the number of red blood cells and reducing triglycerides.
  • Including ginseng saponin overcoming the problems as an active ingredient has an effect of providing a pharmaceutical composition useful for increasing the number of red blood cells and decrease of triglycerides, stem cell differentiation and cell life extension.
  • 1 is a side view of the automatic temperature and humidity control device.
  • 2 is a saponin structure of the saponin and the PPD series of the PPT series.
  • FIG 3 is a diagram showing the process of glucose is separated from the saponins of ginseng by the enzyme reaction
  • ginseng saponin Rb1 is a diagram showing the process of producing a compound k is an active saponin by falling glucose by the enzyme reaction.
  • Figure 4 is a diagram illustrating the process of glucose off by the enzymatic reaction of the 'heat treated saponin suspension'.
  • FIG. 5 shows the results of HPLC analysis of active saponins of CKS (representing the results of compound k 52%, Rd 34.4%, F2 2.69%, and Rg3 2% in the total saponin content).
  • Figure 6 is a CKS solution analysis results by the particle size analyzer (average particles are analyzed to 1 ⁇ m or less).
  • Figure 7 shows the results of blood and blood cells analyzed after blood was collected by CKS once daily for 20 days to 37 days in the abdominal cavity of four SD rats per group (triglyceride (TG) is statistically significant) The results showed that the CKS group decreased to 55% compared to the control group with an average of 450 mg / dl, and the total hematocrit (Hct) increased from 45% to 57.8%.
  • X 10 6 eseo gae / ⁇ l to 9.12 X10 6 gae / ⁇ l show an increase of about 30%).
  • FIG. 8 shows the results of observing the doubling time of MSCs in human experiments using stem cells derived from human teeth (as a result, the lowest population stem cell doubling at a concentration of 10 ng / ml). time).
  • Figure 10 shows the content of intracellular ß-galactosidase is a result of evaluation using human tooth-derived stem cells.
  • the ginseng is heat treated using an automatic temperature and humidity control device, and the ginseng refers to any one or two or more of the root of wild ginseng, goat ginseng, culture root, ginseng ginseng, hwagi ginseng, jeonchisam, or ginseng.
  • the automatic thermo-humidity control device will be described with reference to FIG. 1, where the steam in the air in the high-temperature, high-pressure steam chamber is sent to the automatic thermo-humidity control room through a valve, where the active ginseng is manufactured and dried by continuous operation.
  • the steam injection valve opens, the air valve opens automatically.
  • the air valve When the steam is filled in the automatic temperature / humidity control room, when the air is removed, the air valve automatically closes. When the temperature and pressure reaches the activation point, the steam injection valve closes. Maintained for a minute. After 10 minutes, the air valve opens automatically and the pressure drops. When the temperature reaches 90 °C, the air valve closes again, the steam injection valve opens, the steam is filled in the thermo-humidity control room, and when the air is removed, the air valve automatically closes when the temperature is reached and the steam reaches the activation point. The injection valve is closed and held for 10 minutes. The operation is repeated one more time to heat and activate ginseng three times in total.
  • the present invention prepared the active ingredient by heat treatment, specifically heat treatment at 121 °C, 1.1 kg / cm2 for 10 minutes, was repeated three times (manufactured Heated Saponin, hereinafter 'HS'), it was crushed by a grinder Suspended in 80% weak ethanol (or 80% alcohol alcohol) to extract the saponin component. This is because PPD is more easily extracted in 80% ethanol solution than PPT. The extracted saponin was evaporated and concentrated, which was then suspended in water and used as a raw material for producing PPD-active type.
  • the present invention was prepared by injecting a certain amount of the reaction raw material to the enzyme using a tube peristaltic pump to prepare a PPD-based active ingredient containing a compound k.
  • the prepared active ingredient was collected by centrifugation and then resuspended in ethanol to concentrate the filtrate after filtration.
  • Ginseng containing goats were loaded on a porous shelf at 121 ° C for 10 minutes using an automatic thermo-humidity control device filled with steam to remove moisture by removing moisture from underneath at 1.1 kg / cm2 pressure. Heat treatment was performed by exposure to steam. The heat-treated ginseng was cooled to 90 ° C. or lower while injecting air by opening a vent valve, and the same operation was repeated twice more.
  • the active ginseng prepared in Example 1 was finely crushed into particles of 1 mm or less and dried, and 80% ethanol was added thereto, followed by heating to sufficiently extract the active saponin. Specifically, crushed 60 g of the prepared active ginseng, extracted with 300 ml of 80% alcohol alcohol, filtered through a 500 ⁇ m particle filter paper to remove solids and alcohol alcohol solution (hereinafter referred to as' heat treated saponin alcohol solution 'or' HS alcohol). Solution ') was collected.
  • the 'heat treated saponin alcohol solution' was concentrated using a rotary evaporator (hereinafter, referred to as 'heat treated saponin concentrate' or 'HS concentrate').
  • the 'heat treated saponin concentrate' was dissolved in a small amount of alcohol (ethanol) and sterile distilled water was added to prepare a suspension (hereinafter referred to as 'heat treated saponin suspension', concentration 0.23 w / v%).
  • the 'heat-treated saponin suspension' was maintained at 50 ° C or higher.
  • an aqueous solution containing Pectinase (trade name Rapidase, DSM food, Netherlands) (2.4% Pectinase solution) was maintained at a temperature of 50 ° C. using a temperature automatic device (hereinafter referred to as enzyme solution).
  • enzyme solution a temperature automatic device
  • the 'thermally treated saponin suspension' was continuously injected drop by drop.
  • the injection rate of the 'heat treated saponin suspension' was 50 ml / min. More specifically, as shown in FIG.
  • a 'thermally treated saponin suspension' is injected into the enzyme solution by a predetermined amount using a tube peristaltic pump (Peristaltic pump) (50 ml / min), and the collected components are collected by centrifugation and then in ethanol. After suspension and filtration again, the filtrate was concentrated to finally obtain a concentrate. 1 to 1.4 grams of the final concentrate was prepared from 60 grams of wild ginseng with 30% moisture content, of which the compound k (CK) was 52%, the highest was Rd 34.4%, F2 was 2.7% and Rg3. Was contained 2% (see Figs. 5 and 6).
  • the final concentrate is CK, Rd, F2, Rg3 and the like active ingredients of PPD series occupy more than 91% and compound k (CK) is the highest content of 52%, hereinafter referred to as CKS.
  • the prepared CKS was weighed, dissolved by the addition of 10-fold alcoholic alcohol, and then suspended in sterile saline solution containing 0.01% polysorbate 80.
  • the suspension thus prepared was analyzed using a particle size analyzer (Malvern nano ZS-902). The average particle size was 785.5 nm and the size was less than 1 ⁇ m.
  • the control group was administered sterile saline solution intraperitoneally 1ml once a day, and the experimental group was administered CKS once a day at a concentration of 1.25mg / kg in the CKS group.
  • the treated CKS suspension was used.
  • red blood cells increased by 30% and hematocrit (Hct) increased from 45% to 57.8%.
  • hemoglobin (Hb) platelets (platelet), total cholesterol (T-cho), high density cholesterol (HDL), low density cholesterol (LDL) was not changed (see Figure 7).
  • Stem cells were extracted from human wisdom teeth. While culturing stem cells, CKS was added at each concentration to count the number of cells, and generation time (or doubling time) was calculated based on this.
  • the control group (Con) averaged 46 hours, the most reduced to a mean 30 hours at a concentration of 10 ng / nl (see Figure 8).
  • the inhibitory ability against cancer cells was observed, and the generation time after culturing using human-derived lung cancer cell A549 was examined.
  • the average generation time of the control group (Con) was 20 hours, compared with an average of 25 hours using 10 / ml CKS. It was found to increase with time. All other concentrations also tended to increase, but the highest generation time was found at 10 ng / ml (see FIG. 9).
  • Stem cells were extracted from human wisdom teeth. Stem cells were cultured and ß-galactosidase content analysis was performed by adding 10ng / nl CKS. Inhibiting the expression of ß-galactosidase in a cell means extending the life of the cell. Content analysis of ß-galactosidase using mesenchymal stem cells, stem cells derived from human teeth, was analyzed by ELISA, an enzyme-immunoassay. In cells (Dental MSCs), the ß-galactosidase content was reduced in all three patients, 16% less in the first sample (Den1) and 10% less in the second sample (Den2). The third sample (den3) was reduced by 12%. The average ß-galactosidase content was reduced by 12.7%, which is related to prolongation of cell lifespan.
  • the present invention removes the sugars attached to ginseng saponin as an active ingredient, and includes the ginseng saponin as an active ingredient to provide a pharmaceutical composition useful for increasing the number of red blood cells and reducing triglycerides. Including the ginseng saponin overcoming the problem as an active ingredient, there is an industrial applicability to provide a pharmaceutical composition useful for increasing the number of red blood cells and reducing triglycerides, stem cell differentiation and cell life extension.

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Abstract

본 발명은 산삼, 산양삼, 배양근, 수인삼, 화기삼, 전칠삼, 또는 홍삼 등의 인삼류 사포닌의 용도로서, 세포의 수명연장, 세포의 분화 촉진, 적혈구 수 증가, 및 중성지방 감소에 대한 것이다. 구체적으로는 상기 인삼류 사포닌을 추출하고 열처리하고 효소전환시켜 Compound K를 포함하는 활성형 사포닌 Rd, F2, Rg3를 제조하고, 이들 Compound K, Rd, F2, Rg3를 주성분으로 90% 이상 함유하여, 세포의 수명연장, 세포의 분화 촉진, 적혈구 수 증가, 및 중성지방 감소 효과를 가지는 인삼류 사포닌의 용도에 관한 것이다.

Description

인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물
본 발명은 산삼, 산양삼, 배양근, 수인삼, 화기삼, 전칠삼, 또는 홍삼 등의 인삼류 사포닌의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 상기 인삼류 사포닌을 추출하고 열처리하고 효소전환시켜 Compound K를 포함하는 활성형 사포닌 Rd, F2, Rg3를 제조하고, 이들 Compound K, Rd, F2, Rg3를 주성분으로 90% 이상 함유하여, 세포의 수명연장, 세포의 분화 촉진, 적혈구 수 증가, 및 중성지방 감소 효과를 가지는 인삼류 사포닌(이하 'CKS' 라 칭함)에 관한 것이다.
인삼류에 들어있는 사포닌 및 비사포닌계 물질(Panacen, 다당류, 아미노산 유도체, 폴리아세틸렌 유도체, 페놀화합물)은 뛰어난 약리활성을 가지며, 유해 활성산소(free radical) 소거에 탁월한 효능을 가지며 항암, 혈압강하, 지질강하, 간독성 등에 뛰어난 효능을 지닌다. 인삼류의 주요 약리성분으로 잘 알려진 인삼사포닌은 PPD(Protopanaxadiol)계열 및 PPT(Protopanaxatriol)계열로 나누어진다. PPD계열 사포닌은 기본 구조인 PPD에 다양한 치환기가 결합된 구조를 가지고 있으며 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, F2, Rg3, Compound K 등이 대표적인 사포닌이다. PPT 계열 사포닌은 PPT가 기본 구조이며 진세노사이드 Re, Rf, Rg1, Rh1 등이 대표적이다.
일반적으로 자연계에 존재하는 많은 배당체 화합물들은 그 자체보다는 당이 분해되어 비당체가 되었을때 생리활성이 증가되는 경향을 나타내는데 인삼사포닌의 경우도 당이 3개 이상 결합된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rd, 및 Re보다 일부의 당이 가수분해되어 생성된 진세노사이드 Rg3, Rh1, Rh2, F2, CY 및 CK 등이 생체 내로의 흡수나 생리활성 등의 면에서 훨씬 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 당이 많이 결합되어 있는 인삼사포닌은 소장 내에서 우리 몸으로 흡수되는 양이 매우 적은 것으로 알려져 있는데 사람의 배설물에서 추출된 장내 미생물의 진세노사이드 Rb1의 가수분해능력을 실험한 결과, 장내 미생물의 21%는 분해능력이 없는 것으로 나타났으며, 분해능력이 있는 70%정도의 장내 미생물은 인삼사포닌을 분해하는 능력에 큰 차이가 있다는 것이 확인되었다.
일반적으로 사포닌 성분을 포함한 인삼류 제품들은 물에 대한 용해성이 높은 성분들로 이루어진 삼(蔘) 사포닌들로 이루어져 있는데, 비활성형 상태의 상기 성분들은 물에 대한 용해성이 높은 반면, 장내에서 흡수가 잘 되지 않아 효과는 거의 없는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 성분들이 활성화되어 활성형 성분으로 변화하면 물에 잘 녹지 않는 대신 인체 내 흡수도가 높아져 그 효과를 잘 발휘하게 된다.
본 발명에서 활성형 사포닌, 활성형 산양삼, 활성형 성분 등에서 사용되는 '활성형'이라는 용어는 본 발명의 의하여 가공된 인삼류의 사포닌 또는 진세노사이드의 특성을 말하는 것으로서, 사포닌의 핵에 붙은 당류가 떨어진 결과, 일반 산삼, 산양산삼 또는 인삼에 비하여 사포닌의 총 함량이 높고 인체에 흡수된 후 그 효과를 발휘하게 된다. 즉, 당이 3개 이상 결합된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rd, 및 Re가 아닌, 일부의 당이 가수분해되어 생성된 진세노사이드 Rg3, Rh1, Rh2, F2, CY 및 CK으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 진세노이드로 생체 내로의 흡수나 생리활성 등의 면에서 훨씬 우수한 효과를 나타내는 사포닌을 의미한다.
이처럼, 활성형 성분이란 삼(蔘)사포닌에 붙어 있는 당이 떨어져 나간 형태의 성분으로서, 인체에 흡수된 후 그 효과를 발휘하게 되는데, 이 과정은 주로 열에 의하여 분해되거나 효소에 의하여 분해되는 과정이며, 일부는 장내의 미생물에 의하여 활성화된 후 흡수되기도 한다. 특히 활성형 성분인 컴파운드 케이(Compound K)의 제조는 상당히 까다로워 만들기가 어려운 것으로 알려져 있다.
본 발명자 등은 CKS를 제조하여 연구를 진행하여 항노화에 대한 용도를 발견하고자 하였다. 노화는 생체의 구성성분인 세포와 장기의 기능적 저하와 더불어 노폐물의 과도한 축적으로 생체의 항상성 저하와 더불어 세포의 자살유도 등으로 생체가 정상적 기능을 수행하기가 어려운 상태이다. 또한 질병과 사망에 대한 감수성이 증가하여 쇠약해지는 과정으로 정의할 수 있다. 그러나 이런 원인은 다양하고 복잡하여 그 원인을 하나로 말하기란 어렵다.
본 발명은 여러 가지 노화 원인 중 내부적인 요인을 혈액분석을 통하여 확인하고자 하였다. 나이가 들어감에 따라 간기능 저하, 신장기능 저하, 기억력 감퇴와 특히, 총 지방이나 중성지방의 과도한 증가가 혈관에 문제를 야기하며 많은 질병의 원인이 되고 있다. 따라서 혈액분석을 통해서 그 결과를 관찰하고자 하였다.
이에 12개월 된 스프라그 도우리 백서(Sprague Dawley Rat, 이하 SD 랫)를 구입하여 19개월이 되도록 사육하고 20개월이 되는 날부터 37일간 CKS를 복강투여하여 미투여 대조군과 비교하여 보았다. Compound K는 제조가 상당히 까다롭고 그로 인하여 고가인 단점으로 인하여 구입하여 실험하기가 쉽지 않다. 본 발명자 등은 오랜 기간 동안 효소 전환에 의하여 compound K를 다량 제조하고자 기술개발을 하여 왔고 제조된 compound K를 함유하는 CKS를 노화된 스프라그 도우리 백서(Sprague Dawley Rat, 이하 SD 랫)에 투여하여 혈액분석을 실시하였다. 혈액분석의 결과로 중성지방의 감소가 뚜렷하게 나타났으며, 적혈구의 증가가 있었다. 활동성이 많이 떨어진 대조군에 비하여 약물 투여군은 활동성이 활발하였으며 이미 본 발명자 등이 특허출원한 운동성 증가에 대한 결과(대한민국 특허출원번호: 10-2014-0023244)와 더불어 추가적인 이유를 규명하고자 하였고 혈액분석을 통해 추가로 CKS의 영향을 확인할 수 있었다. 미국식품의약국(FDA)이 골수섬유증 치료제인 룩소리티닙(ruxolitinib)을 진성적혈구증가증(polycythemia vera) 환자에게도 처방될 수 있도록 적응증을 승인했는데, 이와 유사하게 CKS를 적혈구의 증가 효과의 용도 또한 환자에게도 처방될 수 있다.
노화 백서를 확보하는 것은 상당한 시간이 소요되는 관계로 오랜 시간 동안 사육해야하는 하는 어려움이 있고, 생체 기능이 언제 저하될지 모르는 상황이라서 적절한 실험 설계가 상당히 어렵다. 이에 본 발명자 등은 백서를 19개월까지 매일 관찰하였으며 CKS를 실험에 이용하여 지방분석과 혈구 분석을 통한 결과를 도출하고자 하였으며 노화 백서를 대상으로 한 실험으로 항노화에 대한 좋은 결과를 도출하고자 하였다.
추가로, 줄기세포에 대한 분화 작용을 알아보았으며, 세포배양을 통한 세포의 수명연장에 대한 작용을 알아보았다. 줄기세포의 분화작용이 있다는 것은 그 만큼 많은 세포를 짧은 시간에 만들 수 있다는 의미이며, 특히나 분화 시간을 줄인다는 것은 빠른 시간내에 세포의 수를 증가시킬 수 있다는 의미이다.
학자들은 세포수명연장작용을 가지는 물질을 연구하여 왔고 β-galactase를를 억제하는 안전한 물질을 찾고자 노력하여 왔다. 그러나 이런 물질을 찾기는 쉽지 않고 또한 안전성과 안정성이 확보된 물질을 이용하는 것은 아주 어렵다. 특히 경제적인 측면에서는 가격을 고려하여야 하는데 본 발명자 등이 오랜기간동안 연구하여온 CKS는 안정성, 안전성, 가격 등에서 최적의 물질이 될 것으로 보여진다. 세포 배양의 측면에서 배양세포의 β-galactase를 억제한다는 것은 세포의 수명연장을 일으킨다는 의미이며, 과학자들은 세포 수명 연장작용을 가지는 물질을 연구하여 왔고, 본 발명자 등이 β-galactase를 억제효능을 가지는 CKS를 이용하여 결과를 도출하고자 하였다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해소하고자 발명된 것으로 다음과 같은 목적을 가진다.
본 발명은 인삼류 사포닌을 붙어있는 당을 떼어내어 활성형 성분으로 제조하고, 상기 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소에 유용한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 줄기세포의 분화시간을 줄이고, 세포내의 β-galactase를 억제를 통한 세포수명 연장에 유용한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 인삼류 사포닌을 활성형 성분으로 제조하기 위해 열처리와 효소처리를 병행하는 한편 주정 알콜을 사용하여 제조함으로써 유해성 유기용매의 잔류성에 대한 문제점을 극복한 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 다음과 같은 해결 수단에 의하여 구현된다.
본 발명은 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소에 유용하고, 또한 줄기세포의 분화작용과 세포의 수명연장작용 유용한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 인삼류 사포닌은 인삼류를 다공성 선반이 있는 자동온습도조절장치를 이용하여 121℃에서 10분간 과량의 수분을 제거하면서 1.1 kg/㎠ 압력하에서 증기에 노출시키는 단계(S1단계); 상기 S1단계를 거친 인삼류를 연속으로 공기를 주입하여 90℃이하로 식히는 단계(S2 단계); 상기 S1단계와 상기 S2단계를 2회 더 반복하는 단계(S3 단계); 상기 S3단계 후, 상기 인삼류를 자동온도조절장치 내에서 실온까지 식히고 상기 인삼류를 입자크기 1mm 이하로 파쇄하는 단계(S4 단계); 상기 S4 단계를 거친 인삼류에 80% 주정 알콜을 첨가하여 사포닌을 추출하고, 상기 추출된 사포닌을 농축하는 단계(S5 단계); 상기 S5 단계 후, 농축된 사포닌을 에탄올에 용해하고 멸균수를 첨가하여 현탁액을 제조하는 단계(S6 단계); 상기 S6 단계 후, 상기 현탁액을 한 방울씩 펙티네이즈(pectinase) 효소 용액에 첨가하여 반응을 시키는 단계(S7 단계); 및 상기 S7 단계의 반응을 거친 용액을 원심 분리하여 침전시키고, 생성된 침전물을 주정 알콜에 녹인 후 멸균 생리식염수에 다시 현탁하여 여과한 후에 여액을 농축한 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼류 사포닌이 protopanaxadiol계 사포닌이 90%이상인 것을 특징으로 하고, 상기 protopanaxadiol계 사포닌이 활성형 protopanaxadiol은 Compound K, Rd, F2, Rg3인 것을 특징으로 하는 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소, 줄기세포 분화작용과 세포의 수명연장작용에 유용한 약학 조성물이다.
본 발명은 앞서 본 구성에 의하여 다음과 같은 효과를 가진다.
본 발명은 인삼류 사포닌을 붙어있는 당을 떼어내어 활성형 성분으로 제조하고, 상기 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소에 유용한 약학 조성물을 제공하는 한편, 유해성 유기용매의 잔류성에 대한 문제점을 극복한 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소, 줄기세포 분화작용과 세포의 수명연장작용에 유용한 약학 조성물을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 자동온습도 조절장치의 측면도이다.
도 2는 PPT계열의 사포닌과 PPD 계열의 사포닌 구조이다.
도 3은 인삼류의 사포닌에서 효소반응으로 글루코스가 떨어져 나가는 과정을 나타낸 그림(인삼사포닌 Rb1에서 효소반응으로 글루코스가 떨어져서 활성형 사포닌인 컴파운드 케이가 제조되는 과정을 나타낸 그림)이다.
도 4는 '열처리 사포닌 현탁액'을 효소반응으로 글루코스가 떨어져 나가는 공정을 도식화한 그림이다.
도 5는 CKS의 활성형 사포닌의 HPLC에 의한 분석결과(총 사포닌 함량중에서 compound k 52%, Rd 34.4%, F2 2.69%, Rg3 2%의 결과를 나타남)이다.
도 6은 입도분석기에 의한 CKS용액 분석결과이다(평균입자가 1㎛이하로 분석됨).
도 7은 그룹당 4마리의 SD랫의 복강에 20개월부터 37일간 1일 1회 CKS를 투여하여 혈액을 채취한 후 분석한 혈액 및 혈구의 결과이다( 중성지방(TG)는 통계적으로 유의성이 있는 결과를 보여줌. 평균 450 mg/dl를 보인 대조군에 비하여 CKS투여 실험군은 250 mg/dl로 55%수준으로 감소하였음. 또한 총 Hematocrit(Hct)는 45%에서 57.8%로 높아졌으며 적혈구(RBC)의 수치는 7 X 106 개/㎕에서 9.12 X106 개/㎕로 약 30%의 증가를 보임).
도 8은 사람 치아 유래 줄기세포를 이용한 실험에서, 중간엽줄기세포(MSCs)의 배가시간(Doubling time)을 관찰한 결과이다(결과로 10 ng/ml의 농도에서 가장 적은 PDT (Population stem cell doubling time)시간을 나타내었다).
도 9는 사람 치아 유래 줄기세포를 이용한 실험에서, 인간유래 백혈구 암세포에 대한 PDT를 측정한 결과이다(10 ng/ml의 농도에서 가장 긴 시간을 나타내어 백혈암 세포의 성장속도를 느리게 만들었다).
도 10은 세포내 ß-galactosidase의 함량을 본 것인데 인간 치아유래 줄기세포를 이용하여 평가한 결과이다.
출원인은 이하에서 앞서 본 과제의 해결수단을 상세하게 설명한다. 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 공지기술에 대한 상세한 내용은 생략한다.
본 발명에서는 자동온습도조절장치를 이용한 인삼류를 열처리하고 있으며, 상기 인삼류는 산삼, 산양삼, 배양근, 수인삼, 화기삼, 전칠삼, 또는 인삼의 뿌리 중의 어느 하나 또는 둘 이상을 말한다. 먼저 자동온습도 조절장치의 구조를 도 1을 통하여 살펴보면, 고온고압의 증기 전실에서 대기중인 증기가 밸브를 통하여 자동온습도조절실로 증기를 보내고 여기에서 연속작업에 의하여 활성형 인삼을 제조하고 건조하게 된다. 스팀주입자동밸브가 열리면 공기밸브가 자동으로 열리고 자동온습도조절실에서 스팀이 채워지고 공기가 제거되면 자동인식으로 공기밸브가 자동으로 닫히고 온도와 압력이 활성화지점까지 도달하면 스팀주입자동밸브가 닫히고 10분간 유지된다. 10분 후 공기밸브가 자동으로 열리고 압력이 내려간다. 온도가 90℃가 되면, 다시 공기밸브가 닫히고 스팀주입밸브가 열리며 자동온습도조절실에서 스팀이 채워지고 공기가 제거되면 자동인식으로 공기밸브가 자동으로 닫히고 온도와 압력이 활성화지점까지 도달하면 스팀주입자동밸브가 닫히고 10분간 유지된다. 상기 조작을 1회 더 반복하여 총 3회에 걸쳐 인삼류를 열처리하여 활성화한다.
본 발명은 열처리에 의하여 활성형 성분을 제조하였으며, 구체적으로는 121℃, 1.1 kg/㎠에서 10분간 열처리하였고, 총 3회 반복하였으며(Heated Saponin 제조, 이하 'HS' 제조), 이것을 분쇄기로 파쇄하여 80% 약전에탄올 (또는 80% 주정알콜)에 현탁하여 사포닌 성분을 추출하였다. 이것은 PPT에 비하여 PPD가 80%의 에탄올용액에 추출이 잘 되기 때문이다. 이렇게 추출된 사포닌 성분을 증발 농축하였으며, 이것을 다시 물에 현탁하여 PPD 활성형 제조 원료로 이용하였다. 현탁원료를 튜브 연동식 펌프(Peristaltic pump)를 이용하여 일정량씩 효소 용액에 주입하여 사포닌의 당측쇄를 분해하여 활성형 성분을 제조하였다(Compound K포함한 PPD계열 사포닌 제조, 이하 'CKS' 제조). 일정량씩 반응 원료를 효소에 넣지 않을 경우에는 수율이 낮고 뭉치는 현상으로 인하여 반응이 잘 일어나지 않는다. 따라서 본 발명은 튜브 연동식 펌프를 이용하여 효소에 반응 원료를 일정량씩 주입하여 컴파운드 케이를 포함하는 PPD 계열의 활성형 성분을 제조하였다. 제조된 활성형 성분을 원심분리하여 수거한 후 주정에탄올에 재현탁하여 여과 후에 여액을 농축하였다.
이하, 본 발명을 실시예 및 도면에 따라 구체적으로 설명한다.
<실시예 1>
산양삼을 포함하는 인삼류를 공기가 제거되어 증기로 채워진 자동온습도조절장치를 이용하여 121℃에서 10분간 다공성 선반에 적재하여 수분이 밑으로 떨어지도록 하여 과량의 수분을 제거하면서, 1.1 kg/㎠ 압력하에서 증기에 노출시켜 열처리하였다. 상기 열처리된 상기 인삼류를 통기밸브를 열어 공기를 주입하면서 90℃ 이하로 식히고, 다시 동일한 조작을 2회 더 반복하여 실시하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 제조된 활성형 인삼류를 1 mm이하의 입자로 잘게 파쇄하고 건조하고, 여기에 80% 주정 알콜을 첨가하여 열을 가해 충분히 추출하여 활성형 사포닌을 추출하였다. 구체적으로는, 제조된 활성형 인삼류 60그램을 파쇄하여 80% 주정알콜 300ml을 넣어 추출하고 약 500 ㎛ 입자여과지에 여과하여 고형물을 제거하여 주정알콜용액(이하 '열처리 사포닌 주정용액' 또는 'HS주정용액'이라 함)를 수거하였다.
상기 '열처리 사포닌 주정용액'은 회전 농축기(Rotary evaporator)를 이용하여 농축하였다(이하, '열처리 사포닌 농축물' 또는 'HS 농축물'이라 함). 상기 '열처리 사포닌 농축물'을 소량의 주정 알콜(에탄올)에 녹이고 멸균 증류수를 가해 현탁액을 제조하였다(이하, '열처리 사포닌 현탁액'라 함, 농도 0.23 w/v%). 오염에 의해 유해균이 발생하는 것을 방지하기 위하여 상기 '열처리 사포닌 현탁액'을 50℃이상으로 유지하였다.
상기 '열처리 사포닌 현탁액'과 별도로, Pectinase(상품명 Rapidase, DSM food, 네덜란드)가 포함된 수용액(2.4% Pectinase 용액)을 온도 자동장치를 이용하여 온도 50℃로 유지하였고(이하 효소 용액'이라 함), 상기 효소용액에 상기 '열처리 사포닌 현탁액'를 한 방울씩 연속하여 주입하였다. 상기 '열처리 사포닌 현탁액'의 주입속도는 50ml/min으로 하였다. 더욱 자세히 설명하면 도 4와 같이 '열처리 사포닌 현탁액'을 튜브 연동식 펌퍼(Peristaltic pump)를 이용하여 일정량씩 효소 용액에 주입하여(50ml/min) 제조된 성분을 원심분리하여 수거한 후 주정에탄올에 다시 현탁하여 여과한 후에 여액을 농축하여 최종적으로 농축물을 확보하였다. 수분함량 30%인 60그램의 산양삼으로부터 1 ~ 1.4 그램의 최종 농축물이 제조되었으며, 그 중에서 compound k(CK)가 52%로 함량이 가장 높았고, Rd가 34.4%였고, F2가 2.7%, Rg3가 2% 함유되어 있었다(도 5 및 도 6 참조).
사포닌 compound K F2 Rd Rg3
함량 52% 2.69% 34.4 2%
상기 최종 농축물은 CK, Rd, F2, Rg3 등 PPD 계열의 활성형 성분이 91% 이상을 차지하고 compound k(CK)가 52%로 함량이 가장 높으므로 이하, CKS라고 칭한다.
<실시예 3>
CKS현탁제 제조 및 분석
제조된 CKS를 무게를 칭량하고, 10배 무게의 주정알콜을 첨가하여 녹인 후 0.01% polysorbate 80을 포함하는 멸균 생리식염수에 섞어 현탁화하였다. 이렇게 제조된 현탁액을 particle size analyzer(Malvern nano ZS- 902)를 이용하여 분석하였다. 분석결과로 입자의 평균크기는 785.5 nm였으며 1 ㎛이하의 크기를 보였다.
<실시예 4>
동물투여실험
동물실에서 19개월까지 생육시킨 웅성 SD Rat를 실험에 이용하였고 20개월부터 총 37일간 투여하였다. 총 10마리를 5마리씩 두 개의 그룹으로 나누어 대조군은 멸균 생리식염수를 복강으로 1ml씩 1일 1회 투여하였으며, 실험군은 CKS 투여군으로 1.25mg/kg의 농도로 CKS를 1일 1회 복강투여하였으며 무균처리된 CKS현탁용액을 이용하였다. 실험 도중 자연암이 발생한 실험군의 한 마리는 실험에서 탈락시켰다. 38일째에 혈액을 채취하고 분석에 이용하였다. 혈액분석을 위해서 전문 혈액 분석기관인 ㈜녹십자 랩셀에 의뢰하여 자료를 확보하였다.
분석결과, 적혈구(RBC)는 30%의 증가를 보였고, 헤마토크리트(Hct)는 45%에서 57.8%로 증가하였다. 그 외 헬모글로빈(Hb), 혈소판(Platelet), 총 콜레스테롤(T-cho), 고밀도 콜레스테롤(HDL), 저밀도 콜레스테롤(LDL)은 변화가 없었다(도 7 참조).
<실시예 5>
사람의 사랑니를 뽑아 줄기세포를 추출하였다. 줄기세포를 세포배양하면서 각 농도별로 CKS를 첨가하여 세포의 수를 Counting하였고 이를 바탕으로 세대세간(또는 배가시간)을 계산하였다. 대조군(Con)이 평균 46시간인데 10 ng/nl의 농도에서 평균 30시간으로 가장 많아 줄었다(도 8 참조). 또한, 암세포에 대한 억제능을 관찰하였는데 인간유래 폐암세포인 A549를 이용하여 배양한 후 세대시간을 알아보았는데 대조군(Con)의 평균 세대시간이 20시간인데 비하여 10/ml의 CKS를 사용한 경우에 평균 25시간으로 증가되는 것을 알 수 있었다. 다른 농도에서도 모두 증가하는 경향을 보였으나 10 ng/ml에서 가장 높은 세대시간을 보였다(도 9 참조).
<실시예 6>
사람의 사랑니를 뽑아 줄기세포를 추출하였다. 줄기세포를 세포배양하면서 10ng/nl의 CKS를 첨가하여 ß-galactosidase 함량 분석을 실시하였다. 세포에서 ß-galactosidase의 발현을 억제할 수 있다는 것은 세포의 수명을 연장한다는 의미가 있다. 사람의 치아 유래 줄기세포인 중간엽줄기세포를 이용하여 ß-galactosidase 에 대한 함량 분석을 효소면역 측정법인 ELISA 로 분석한 결과로 CKS처리를 한 경우에 3명의 사람으로부터 각각 분리된 사랑니 유래 중간엽줄기세포에서(Dental MSCs)에서 ß-galactosidase의 함량이 3명 모두에서 감소하였고 첫 번째 검체(Den1)에서는 대조군(con)에 비하여 16%가 줄었고, 두 번째 검체(Den2)는 10%가 줄었으며, 세 번째 검체(den3)는 12%가 줄었다. 평균 12.7%의 ß-galactosidase의 함량이 줄었고 이는 세포의 수명 연장과 관계가 있다는 결과이다.
본 발명은 인삼류 사포닌을 붙어있는 당을 떼어내어 활성형 성분으로 제조하고, 상기 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소에 유용한 약학 조성물을 제공하는 한편, 유해성 유기용매의 잔류성에 대한 문제점을 극복한 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하여 적혈구 수 증가 및 중성지방 감소, 줄기세포 분화작용과 세포의 수명연장작용에 유용한 약학 조성물을 제공하는 산업상의 이용가능성이 있다.

Claims (7)

  1. 세포의 수명연장 및 세포의 분화 촉진에 유용한, 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포의 수명 연장은 베타 갈락토시다제의 억제에 의한 것을 특징으로 하는 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포의 분화 촉진은 줄기세포 분화 촉진인 것을 특징으로 하는 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  4. 중성지방 감소 및 적혈구 수 증가에 유용한, 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 인삼류 사포닌은 protopanaxadiol계 사포닌이 90%이상인 것을 특징으로 하는 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 protopanaxadiol계 사포닌은 활성형 protopanaxadiol은 Compound K, Rd, F2, Rg3인 것을 특징으로 하는 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 인삼류 사포닌은
    인삼류를 다공성 선반이 있는 자동온습도조절장치를 이용하여 121℃에서 10분간 과량의 수분을 제거하면서 1.1 kg/㎠ 압력 하에서 증기에 노출시키는 단계(S1단계);
    상기 S1단계를 거친 인삼류를 연속으로 공기를 주입하여 90℃이하로 식히는 단계(S2 단계);
    상기 S1단계와 상기 S2단계를 2회 더 반복하는 단계(S3 단계);
    상기 S3단계 후, 상기 인삼류를 자동온도조절장치 내에서 실온까지 식히고 상기 인삼류를 입자크기 1mm 이하로 파쇄하는 단계(S4 단계);
    상기 S4 단계를 거친 인삼류에 80% 주정 알콜을 첨가하여 사포닌을 추출하고, 상기 추출된 사포닌을 농축하는 단계(S5 단계);
    상기 S5 단계 후, 농축된 사포닌을 에탄올에 용해하고 멸균수를 첨가하여 현탁액을 제조하는 단계(S6 단계);
    상기 S6 단계 후, 상기 현탁액을 한 방울씩 펙티네이즈(pectinase) 효소 용액에 첨가하여 반응을 시키는 단계(S7 단계); 및
    상기 S7 단계의 반응을 거친 용액을 원심 분리하여 침전시키고, 생성된 침전물을 주정 알콜에 녹인 후 멸균 생리식염수에 다시 현탁하여 여과한 후에 여액을 농축한 것임을 특징으로 하는 인삼류 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물.
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