WO2017082254A1 - 抗リン酸化Ｂａｃｈ２抗体及び抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法 - Google Patents

抗リン酸化Ｂａｃｈ２抗体及び抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法 Download PDF

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佐藤　好宏
亨 玉原
勇樹 佐藤
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for an anti-tumor immune activator and an anti-phosphorylated Bach2 antibody that can be used therefor.
  • BB2 is a transcriptional repressor expressed in immune cells such as B cells and T cells. It has been reported that Bach2 is involved in the control of differentiation from B cells to plasma cells and the control of differentiation of regulatory T cells (Non-Patent Documents 1 to 4). 4). Furthermore, it has been reported that polymorphisms in the Bach2 gene correlate with allergic diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases and the like (Non-Patent Documents 5 to 11). In addition, the present inventors have produced a mouse in which the function of the Bach2 gene is inhibited, and have reported that this mouse is useful as a model animal for inflammatory bowel disease and hyper IgM syndrome (Patent Document 1). . However, it is not known that antitumor immunity can be activated by inhibiting the function of Bach2 and its relationship with phosphorylation.
  • An object of the present invention is to provide a novel screening method for an antitumor immune activator and to provide a reagent that can be used for that purpose.
  • the present inventors have found that cytotoxic CD8 + T cells are induced in the tumor site by inhibiting the function of Bach2, and the transcriptional repressing activity of Bach2 Is found to be regulated by phosphorylation / dephosphorylation of Bach2, and by doing so, screening for drugs that inhibit Bach2 function using Bach2 phosphorylation as an index, a tumor immune activator can be obtained As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following.
  • sequence of H chain CDR The sequence of amino acid numbers 18 to 26 of SEQ ID NO: 18 or a sequence in which one to several amino acid residues thereof are substituted; the sequence of amino acid numbers 44 to 50 or a sequence in which one to several amino acid residues thereof are substituted; And the sequence of amino acid numbers 89 to 95 or a sequence in which one to several amino acid residues thereof are substituted, or the sequence of amino acid numbers 18 to 26 in SEQ ID NO: 22 or one to several amino acid residues thereof are substituted.
  • [5] As an H chain sequence The amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a sequence in which one to several amino acid residues thereof are substituted, deleted, added or inserted, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or one to several amino acid residues thereof are substituted or missing.
  • sequence of the light chain CDR The sequence of SEQ ID NO: 20 or 24, the sequence of amino acid numbers 32 to 42, or a sequence in which one to several amino acid residues thereof are substituted, the sequence of amino acid numbers 60 to 63, or one to several amino acid residues thereof are substituted
  • the monoclonal antibody is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, humanized monoclonal antibody or human monoclonal antibody, and F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody), disulfide bond Fv,
  • the antibody according to [9] which is a single chain antibody (scFv) and a polymer thereof.
  • a screening method for an antitumor immune activator comprising a step of selecting a compound that inhibits the function of Bach2.
  • a tumor immune activator can be efficiently screened. Furthermore, an anti-phosphorylated Bach2 antibody that can be used not only for screening for tumor immune activators but also for immunological research and diagnostic purposes including functional analysis of Bach2 is provided.
  • the vertical axis shows the number per 10,000 analyzed cells.
  • the Bach2 protein that can be used in the present invention is preferably a mammal-derived Bach2 protein.
  • the human Bach2 protein includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the mouse Bach2 protein includes SEQ ID NO: 26.
  • proteins having an amino acid sequence are used.
  • one or several (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or 26 are used.
  • Examples of the gene encoding Bach2 protein include a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a complementary sequence to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • stringent conditions it corresponds to 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which is a normal washing condition for Southern hybridization. The conditions for washing at a salt concentration are included.
  • Antitumor immunity activators increase the expression of target genes such as Granzyme B and interferon ⁇ , which are transcriptionally regulated by Bach2, by suppressing the function of Bach2 as a transcriptional repressor, such as CD8 + T cells It is preferable that cytotoxic T cells are induced in tumor tissue to kill the tumor.
  • the “tumor (cancer)” to be administered with the antitumor immunity activator of the present invention is not particularly limited as long as it is a malignant tumor to be treated.
  • pancreatic cancer, colon cancer, liver cancer, Gastrointestinal tumors such as stomach cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, skin tumors such as malignant melanoma, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, kidney cancer, etc.
  • Screening method examples include screening based on the expression level of Bach2, screening based on the expression level of the target gene of Bach2, screening based on phosphorylation of Bach2.
  • One aspect of the screening method for an antitumor immunity activator in the present invention relates to screening for compounds that suppress the expression of the Bach2 gene.
  • Bach2 mRNA levels in cells that express the Bach2 gene may be measured, or expression of the reporter gene may be carried out using cells that have the reporter gene functionally linked downstream of the Bach2 gene enhancer or promoter region. You may measure.
  • the cell type is preferably a mammal-derived cell, more preferably a cultured T cell.
  • the enhancer and promoter region of the Bach2 gene can be obtained by referring to known genomic information. For example, the Bach2 gene can be extracted by comparing the Bach2 cDNA sequence with the Bach2 genomic sequence on the database.
  • a region of 100 bp to 10 kbp existing upstream from the start point is exemplified.
  • “functionally linked” means that the transcription factor binds to the enhancer or promoter region of the Bach2 gene so that expression of the reporter gene is induced, and the enhancer or promoter region of the Bach2 gene and the reporter gene Is connected.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected.
  • a CAT gene a lacZ gene, a luciferase gene, a ⁇ -glucuronidase gene (GUS) and a GFP gene that are commonly used by those skilled in the art. Etc.
  • a test compound is brought into contact with the cell, and the amount of Bach2 mRNA or the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract is measured.
  • the expression level of mRNA can be measured by Northern hybridization method, RT-PCR method, hybridization method using microarray, and the like.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, by detecting the acetylation of chloramphenicol, when the reporter gene is a lacZ gene, the coloration of the dye compound is caused by the catalytic action of the gene expression product.
  • the expression level of the reporter gene can be measured.
  • a compound that decreases the expression level of Bach2 mRNA or the reporter gene is selected as compared with the case where no test compound is administered.
  • a compound that decreases the expression level of Bach2 mRNA or reporter gene can be used as a drug for suppressing Bach2 function and improving antitumor immunity.
  • a compound (pharmaceutical candidate substance) used for a screening For example, a low molecular synthetic compound may be sufficient and the compound contained in a natural product may be sufficient. Further, it may be a peptide or a nucleic acid. Although individual test substances may be used for screening, a compound library containing these substances may be used.
  • Another embodiment of the screening method for an antitumor immunity activator in the present invention relates to screening for compounds that regulate transcription by Bach2. That is, the expression level of a target gene that is subject to transcriptional control by Bach2 is used as an index. Specifically, first, a cell having Bach2 and DNA to which a reporter gene is functionally linked downstream of a Bach2 target gene or a transcription control region existing upstream of the Bach2 target gene is provided. Next, the test compound is brought into contact with the cells. A cell that inherently expresses Bach2 or a target gene may be used, or a cell into which a Bach2 gene or a reporter gene has been introduced may be used.
  • the cell type is preferably a mammal-derived cell, more preferably a cultured T cell.
  • the mRNA level of the Bach2 target gene and the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract are measured. The measurement can be performed in the same manner as described above.
  • Bach2 target genes include Granzyme B (Gzmb) (J Biol Chem. 1998 Dec 25; 273 (52): 35326-31.), Interferon ⁇ and Fas L.
  • a compound that increases the expression level of mRNA of the Bach2 target gene or the reporter gene is selected as compared with the case where the test compound is not administered. Since Bach2 normally suppresses target gene expression as a transcriptional repressor, compounds that increase the expression level of Bach2 mRNA or reporter gene are drugs that inhibit Bach2 function and improve antitumor immunity. Available as
  • another embodiment of the screening method of the present invention is based on such phosphorylation of Bach2. That is, when a compound is added to a cell expressing Bach2 or an extract thereof, the phosphorylation level of Bach2 is measured, and when the phosphorylation level of Bach2 is increased compared to when no compound is added or when a control compound is added, The compound can be selected as a compound (candidate compound) having antitumor immune activity. Since Bach2 was estimated to undergo phosphorylation of mTORC1 in cells, it is preferable that mTORC1 coexist in the screening system. Furthermore, since Bach2 may be phosphorylated by mTORC2, mTORC2 may coexist. mTORC1 and mTORC2 may be endogenous or exogenous.
  • the phosphorylation site of Bach2 is preferably serine at position 535 (serine corresponding to serine at position 536 in SEQ ID NO: 2).
  • the serine corresponding to serine at position 536 of SEQ ID NO: 2 refers to a serine residue that is located at the position of serine at position 536 of SEQ ID NO: 2 when the subject sequence is aligned with SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 26 this corresponds to serine at position 535.
  • a method for specifically detecting phosphorylated Bach2 a method of detecting the difference in mobility in electrophoresis as an index or a method using an anti-phosphorylated serine antibody may be used.
  • a method using an antibody that specifically recognizes is preferable.
  • An antibody specifically recognizing phosphorylated Bach2 is a peptide of about 10 to 20 amino acids containing a phosphorylated site of Bach2, and the peptide is phosphorylated at the site, which is used as an antigen.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies obtained by immunizing mammals such as mice, mouse monoclonal antibodies, chimeric monoclonal antibodies and humanized monoclonal antibodies produced using genetic recombination techniques, and human antibody-producing transgenic animals And the like, and the like.
  • the polyclonal antibody can be produced by an existing general production method. For example, it can be obtained from serum obtained from the immunized animal by immunizing a non-human mammal with the antigen as described above.
  • Monoclonal antibodies can be obtained using methods well known to those skilled in the art (eg, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor. Laboratory (1988)).
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody is prepared by administering an antigen as described above to a non-human mammal such as a mouse and antibody-producing cells contained in the spleen obtained from the immunized mammal and myeloma cells. It is prepared by cell fusion.
  • Hybridoma clones that produce monoclonal antibodies can be screened by culturing the hybridomas in, for example, a microtiter plate, and measuring the reactivity of the culture supernatant of the wells with the immunoantigen by an immunochemical method such as ELISA. it can. Then, the clone can be obtained by further cloning from the well containing the hybridoma producing the target antibody by the limiting dilution method. Production of monoclonal antibodies from hybridomas can be accomplished by culturing the hybridomas in vitro or growing in vivo in the ascites of mammals such as mice, rats, etc., and isolating the resulting culture supernatant or the ascites of mammals. This can be done.
  • Isolation and purification of the monoclonal antibody may be performed by a known method, for example, easily achieved by means such as ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, anion exchanger, affinity chromatography and the like. be able to.
  • the monoclonal antibody may be obtained by a gene recombination technique. Although mouse monoclonal antibodies are also included, chimeric monoclonal antibodies, humanized monoclonal antibodies and human monoclonal antibodies may be used. Furthermore, antibody fragments such as F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody), disulfide bond Fv, single chain antibody (scFv), and polymers thereof may be used.
  • a 10-20 amino acid peptide containing serine at position 535 can be used as an antigen.
  • a peptide of EDGSGG (pS) PCSLPL (SEQ ID NO: 25) is exemplified.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes amino acid numbers 18 to 26 (HCDR1) of SEQ ID NO: 18 or 22 and amino acid numbers 44 to 50 (HCDR2) of SEQ ID NO: 18 or 22 in the CDR of the heavy chain (heavy chain) variable region.
  • amino acid numbers 89 to 95 (HCDR3) of SEQ ID NO: 18 or 22, and amino acid numbers 32 to 42 (LCDR1) of SEQ ID NO: 20 or 24 are added to the CDR of the L chain (light chain) variable region, SEQ ID NO: Examples include those containing the amino acid sequence of amino acid numbers 60 to 63 (LCDR2) of 20 or 24 and amino acid numbers 99 to 107 (LCDR3) of SEQ ID NO: 20 or 24.
  • one or several amino acids may be substituted in one or more of these CDRs.
  • one to several is, for example, one or two.
  • Obtaining an antibody whose specificity has been improved to the same level or higher by modifying the CDR sequence can be performed by a known technique such as phage display.
  • the region other than CDR is not particularly limited as long as it maintains the structure as an antibody and can exert its function, and is derived from a mouse-derived sequence, a human-derived sequence, a sequence derived from another mammal, a chimeric sequence thereof, an artificial sequence Any of the sequences may be used.
  • the amino acid sequences of the H and L chain constant regions are Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 and Cell vol.22, Examples are described in p197, 1980.
  • mouse antibodies having these CDRs include antibodies having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or 22 in the H chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 24 in the L chain.
  • amino acid sequences as long as the function of specifically recognizing phosphorylated Bach2 is maintained, substitution of 1 to several amino acids (1 to 20, 1 to 10, or 1 to 5), There may be deletions, additions or insertions. Such substitutions, deletions and additions may be introduced into the CDR, but are preferably introduced into regions other than the CDR.
  • the anti-phosphorylated Bach2 antibody of the present invention can be used as a research reagent or a clinical test reagent in addition to screening for an antitumor immune activator. For example, it can be used as a test for immune diseases.
  • B16-F10 cells 0.5 ⁇ 10 6 cells
  • a mouse melanoma cell line were subcutaneously transplanted into wild-type mice (C57BL / 6, 8-10 weeks old) or Bach2 knockout mice (see Table 2005/110433).
  • the tumor tissue was taken out, a tissue section was prepared, and immunostaining was performed using an anti-PNL2 (protein expressing melanoma specific) antibody.
  • the wild type mice showed a wide range of tumors
  • the Bach2 knockout mice showed reduced tumors.
  • FIG. 2 shows changes over time in tumor volume in wild type mice and Bach2 knockout mice.
  • the tumor volume was calculated by a simple formula (major axis ⁇ minor axis 2 ) / 2 by measuring the major axis and minor axis of the tumor formed from the body surface.
  • FIGS. In order to analyze the phenomenon of FIGS. Specifically, on day 13 after tumor administration, tumor tissue was removed from wild-type mice and Bach2 knockout mice, a sample obtained by homogenizing the tumor using CD45 antibody was purified, and FACS (cell sorter was used using an antibody against the marker molecule of each immune cell. ) was analyzed. As a result, as shown in FIG. 3, CD8 + T cells were specifically induced in the tumor tissue of Bach2 knockout mice, suggesting that antitumor effects were exhibited.
  • Gzmb (Granzyme B) Forward: GACCCAAAGACCAAACGTGC (SEQ ID NO: 3) Reverse: TGAAAGCACGTGGAGGTGAA (SEQ ID NO: 4)
  • Prf1 perforin 1 (pore forming protein)
  • Forward CCCACTCCAAGGTAGCCAAT (SEQ ID NO: 5)
  • Reverse GAGCTGTTAAAGTTGCGGGG (SEQ ID NO: 6)
  • GITR corticoid-induced TNFR family related gene
  • PD-1 Programmed death-1 Forward: GCCCTAGCTGTCTTCTGCTC (SEQ ID NO: 11) Reverse: CACACTAGGGACAGGTGCTG (SEQ ID NO: 12)
  • CTLA4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
  • Forward CTTGTCGCAGTTAGCTTGGG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse GACCCCTGTTGTAAGAGGACTT (SEQ ID NO: 14)
  • GZMB and IFNG are target genes for Bach2 and are involved in cytotoxicity.
  • CD8 + T cell cytotoxicity in Bach2 knockout mice was examined whether CD8 + T cells induced in tumor tissues of wild type mice and Bach2 knockout mice were cytotoxic. Specifically, first, 30000 CD8 + T cells were sorted from a tumor mass of B16F10 transplanted into wild-type mice and Bach2 knockout mice. Next, as target cells, 3000 B16F10 cells labeled with a high concentration of CTV (CTV-high) (Life technologies) and CD8 + T cells were co-cultured for 5 hours. Further, 3000 B16F10 cells labeled with CTV-high without adding T cells were cultured as a control for 5 hours.
  • CTV-high CTV-high
  • Anti-phosphorylated Bach2 antibody was prepared as follows. A peptide containing serine at position 535 and phosphorylated on the serine (SEQ ID NO: 25) is synthesized, and a mouse is immunized to produce a hybridoma from which a clone that specifically recognizes phosphorylated Bach2 is selected. Two clones were limited-diluted and selected as a hybridoma strain producing a phosphorylated Bach2-specific antibody (clone 7, clone 17).
  • the antibody was purified from the hybridoma strain, and its specificity for phosphorylated Bach2 was evaluated by the following procedure.
  • Transfect PlatE cells (293 cell-derived retrovirus packaging cell lines) with pcDNA-Bach2 or pcDNA-Bach2S535A (substitute the serine for alanine) Prepare whole cell extract after 24 hours. Partial treatment with phosphatase (CIAP) at 37 ° C for 1 hour
  • Electrophoresis of 5 ⁇ g equivalent extract ⁇ Western blotting Membrane was blocked with 0.5% BSA in T-TBS, then each antibody (0.1 microgram / ml) and reaction secondary antibody was anti-mouse HRP-conjugated antibody HRP detection uses Pierce Pico ECL kit
  • both clones 7 and 17 bound to wild-type Bach2, and the signal of the binding band was reduced by CIAP treatment.
  • almost no signal was observed in Bach2, which was not subjected to phosphorylation in which position 535 was mutated. From these results, it was considered that clones 7 and 17 specifically recognize Bach2 phosphorylated at position 535.
  • DNA encoding the antibody was isolated from clones 7 and 17, and the sequence of the DNA encoding the antibody was analyzed by a conventional method.
  • the H chain amino acid sequence of clone 7 was SEQ ID NO: 18, and the CDR sequences were amino acid numbers 18 to 26, 44 to 50, and 89 to 95.
  • the amino acid sequence of the L chain of clone 7 was SEQ ID NO: 20, and the CDR sequences were amino acid numbers 32-42, 60-63 and 99-107.
  • the amino acid sequence of the H chain of clone 17 was SEQ ID NO: 22, and the CDR sequences were amino acid numbers 18 to 26, 44 to 50, and 89 to 95.
  • the amino acid sequence of the L chain of clone 17 was SEQ ID NO: 24, and the CDR sequences were amino acid numbers 32-42, 60-63, and 99-107.
  • B1-8 hi mouse-derived B cells are added to a culture solution containing a reagent that stimulates antigen immunity (hereinafter referred to as a stimulant), and rapamycin, an mTORC1 inhibitor, dissolved in DMSO is added to the culture solution containing the stimulant.
  • a stimulant a reagent that stimulates antigen immunity
  • rapamycin an mTORC1 inhibitor
  • DMSO a reagent that stimulates antigen immunity
  • p70S6 kinase which is known to be phosphorylated by mTORC1
  • the p-p70S6 kinase band was observed in both the environment where the stimulant and rapamycin coexisted and the environment where the stimulant and AZD were coexistent. Disappeared.
  • mTORC1 is activated by AKT, but mTORC2 is indirectly involved in mTORC1 activation by activating AKT. Since the phosphorylated Bach2 band disappeared by AZD, it became clear that STOR phosphorylation of Bach2 involves not only mTORC1 but also mTORC2.

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Abstract

Bach2もしくはその標的遺伝子の発現レベルまたはBach2のリン酸化を指標とし、Bach2の機能を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、抗腫瘍免疫活性化剤を得る。Bach2のリン酸化は好ましくは抗リン酸化Bach2抗体を用いて測定される。

Description

抗リン酸化Ｂａｃｈ２抗体及び抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法
本発明は抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法およびそれに使用できる抗リン酸化Bach2抗体に関する。
Bach2はB細胞やT細胞などの免疫細胞で発現する転写抑制因子で、B細胞から形質細胞への分化制御や制御性T細胞の分化制御への関与が報告されている（非特許文献１～４）。さらに、Bach2遺伝子における多型がアレルギー疾患や炎症性疾患や自己免疫疾患などに相関することが報告されている（非特許文献５～１１）。
また、本発明者らは、Bach2遺伝子の機能が阻害されたマウスを作製し、このマウスが炎症性腸疾患およびハイパーIgM症候群のモデル動物として有用であることを報告している（特許文献１）。しかしながら、Bach2の機能阻害によって抗腫瘍免疫を活性化できることやリン酸化との関係は知られていない。
再表2005/110433
Immunity 39, 136-147 Nature 498,506-510 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 10735-10740 Nat Commun 4, 2830 PLoS Genet. 2011 Aug;7(8):e1002216 Nat Genet. 2010 Dec;42(12):1118-25 Nat Genet. 2010 Apr;42(4):295-302 PLoS Genet. 2014 Feb 27;10(2):e1004123 Arthritis Rheum. 2013 Dec;65(12):3058-62 Lancet. 2011 Sep 10;378(9795):1006-14 Nat Genet. 2012 May 6;44(6):676-80
本発明は、新規な抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法を提供することおよびその目的で使用できる試薬を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、Bach2の機能を阻害することにより細胞障害性のCD8＋T細胞が腫瘍部位に誘導されること、およびBach2の転写抑制活性はBach2のリン酸化・脱リン酸化によって制御されていることを見出し、それにより、Bach2のリン酸化等を指標としてBach2の機能を阻害する薬剤をスクリーニングすることにより腫瘍免疫活性化剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
[１]　配列番号２の５３６位に相当するセリン残基がリン酸化されたリン酸化Bach2を特異的に認識する抗体。
[２]　配列番号２５の７位に相当するセリン残基がリン酸化されたペプチドに結合する、[１]に記載の抗体。
[３]　H鎖CDRの配列として、
配列番号１８または２２の、
アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、[１]または[２]に記載の抗体。
[４]　H鎖CDRの配列として、
配列番号１８の
アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、または
配列番号２２の
アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、[３]に記載の抗体。
[５]　H鎖の配列として、
配列番号１８のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２２のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列を含む、[３]に記載の抗体。
[６]　L鎖CDRの配列として、
配列番号２０または２４の
アミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、[１]～[５]のいずれかに記載の抗体。
[７]　L鎖CDRの配列として、
配列番号２０の
アミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
または
配列番号２４のアミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、[６]に記載の抗体。
[８]　L鎖の配列として、配列番号２０のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２４のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、
を含む、[６]に記載の抗体。
[９]　ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である[１]～[８]のいずれかに記載の抗体。
[１０]　モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体およびその、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体である、[９]に記載の抗体。
[１１]　Bach2の機能を阻害する化合物を選択する工程を含む、抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法。
[１２]　Bach2を発現する細胞に被検化合物を添加する工程、Bach2のリン酸化レベルを測定する工程、およびBach2のリン酸化レベルを増加させる化合物を選択する工程を含む、[１１]に記載のスクリーニング方法。
[１３]　リン酸化レベルの測定が配列番号２の５３６位に相当するセリン残基のリン酸化レベルを測定することによる、[１２]に記載のスクリーニング方法。
[１４]　抗リン酸化Bach2抗体を用いてBach2のリン酸化レベルが測定される、[１２]または[１３]に記載のスクリーニング方法。
[１５]　抗リン酸化Bach2抗体が[１]～[１０]のいずれかに記載の抗体である、[１４]に記載のスクリーニング方法。
本発明によれば、腫瘍免疫活性化剤を効率よくスクリーニングできる。さらには、腫瘍免疫活性化剤のスクリーニングのみならず、Bach2の機能解析をはじめとした免疫研究や診断目的でも使用可能な抗リン酸化Bach2抗体も提供される。
腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍部位の免疫染色結果を示す顕微鏡写真。 腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍容積の経時変化を示すグラフ。 腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織における、各種免疫細胞をFACSによって解析した結果を示す図。縦軸は解析した細胞10000個あたりの個数を示す。 腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞における各種遺伝子の発現レベルをRT-PCRで解析した結果を示す図。 腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞のメラノーマ細胞に対する殺傷効果を示す図。 野生型Bach2、リン酸化部位置換Bach2を発現する細胞に対する抗Bach2抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す写真。 野生型Bach2またはリン酸化部位置換Bach2を導入した細胞における標的遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した結果を示す図。mockの発現を１として発現量の比を表している。 抗リン酸化Bach2抗体を用いた野生型Bach2またはリン酸化部位置換Bach2に対するウエスタンブロットの結果を示す図（写真）。 抗リン酸化Bach2抗体を用いたウエスタンブロットによる、基質のリン酸化に対する各薬剤の影響の解析結果を示す図（写真）。
＜Bach2＞
本発明において使用可能なBach2タンパク質としては、哺乳類由来のBach2タンパク質が好ましく、例えば、ヒトのBach2タンパク質としては配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられ、マウスのBach2タンパク質としては配列番号２６のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ただし、転写抑制因子としての機能を維持する限り、配列番号２または２６のアミノ酸配列において、１または数個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号２または２６の全長配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
Bach2タンパク質をコードする遺伝子としては配列番号１の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。ただし、転写抑制因子としての機能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄する条件が挙げられる。
＜抗腫瘍免疫活性化剤＞
抗腫瘍免疫活性化剤は、Bach2の転写抑制因子としての機能を抑制することにより、Bach2によって転写制御されているGranzyme Bやインターフェロンγ等の標的遺伝子の発現を増加させ、CD8＋T細胞等の細胞障害性T細胞を腫瘍組織に誘導して腫瘍を殺傷するものであることが好ましい。
本発明の抗腫瘍免疫活性化剤の投与対象となる「腫瘍（がん）」としては、治療すべき悪性腫瘍であれば特に制限されないが、例えば膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、胃がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん等の消化器系腫瘍、例えば悪性黒色腫等の皮膚腫瘍、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、腎がん等を挙げることができる。
＜スクリーニング方法＞
スクリーニング方法としては、Bach2の発現量に基づくスクリーニング、Bach2の標的遺伝子の発現量に基づくスクリーニング、Bach2のリン酸化に基づくスクリーニング、などが例示される。
＜Bach2の発現量に基づくスクリーニング＞
本発明における抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法の態様の一つは、Bach2遺伝子の発現を抑制する化合物のスクリーニングに関するものである。Bach2遺伝子を発現する細胞におけるBach2のｍRNA量を測定してもよいし、Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞を使用してレポーター遺伝子の発現を測定してもよい。細胞の種類は哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、培養T細胞がより好ましい。Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域は公知のゲノム情報を参考にして得ることができ、例えば、データベース上で、Bach2 cDNA配列とBach2ゲノム配列を照らしあわせることで抽出することができるが、Bach2遺伝子の転写開始点より上流に存在する１００ｂｐ～１０ｋｂｐの領域が例示される。なお、「機能的に結合した」とは、Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。
レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。
細胞に被検化合物を接触させ、該細胞または該細胞抽出液におけるBach2のｍRNA量またはレポーター遺伝子の発現レベルを測定する。mRNAの発現レベルはノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション法などにより測定を行うことができる。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、クロラムフェニコールのアセチル化を検出することにより、レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
被検化合物を投与していない場合と比較して、Bach2のｍRNAまたは該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する。Bach2のｍRNAまたはレポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物は、Bach2の機能を抑制して抗腫瘍免疫を向上させるための薬剤として利用できる。
なお、スクリーニングに供される化合物（医薬候補物質）としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドや核酸であってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。
＜Bach2の標的遺伝子の発現量に基づくスクリーニング＞
本発明における抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法の他の態様は、Bach2による転写を制御する化合物のスクリーニングに関するものである。すなわち、Bach2によって転写制御を受ける標的遺伝子の発現量を指標とする。具体的には、まず、Bach2と、Bach2標的遺伝子またはBach2標的遺伝子の上流に存在する転写制御領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞を提供する。次いで、該細胞に被検化合物を接触させる。なお、Bach2や標的遺伝子を本来的に発現する細胞を使用してもよいし、Bach2遺伝子やレポーター遺伝子を導入した細胞を使用してもよい。細胞の種類は哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、培養T細胞がより好ましい。次いで、該細胞または該細胞抽出液におけるBach2標的遺伝子のｍRNA量やレポーター遺伝子の発現レベルを測定する。測定は上記と同様にして行うことができる。
なお、Bach2標的遺伝子としては、Granzyme B（Gzmb）（J Biol Chem. 1998 Dec 25;273(52):35326-31.）やインターフェロンγやFas Lなどが挙げられる。
被検化合物を投与していない場合と比較して、Bach2標的遺伝子のｍRNAまたは該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。通常、Bach2は転写抑制因子として標的遺伝子の発現を抑制しているため、Bach2のｍRNAまたはレポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物は、Bach2の機能を阻害して抗腫瘍免疫を向上させるための薬剤として利用できる。
＜Bach2のリン酸化に基づくスクリーニング＞
本発明者らの検討により、Bach2の活性はリン酸化によって制御されていることが分かった。すなわち、Bach2はリン酸化を受けて不活性化され、それにより、細胞障害性に関与するような標的遺伝子の発現抑制が解除され、その結果、CD8＋T細胞が活性化して抗腫瘍免疫効果が発揮されると考えられる。よって、Bach2のリン酸化を促進する化合物を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、抗腫瘍免疫活性を有する化合物が得られる。
したがって、本発明のスクリーニング方法の他の態様は、このようなBach2のリン酸化を指標にしたものである。すなわち、Bach2を発現する細胞またはその抽出物に化合物を添加し、Bach2のリン酸化レベルを測定し、Bach2のリン酸化レベルが化合物非添加時または対照化合物添加時と比較して増加した時に、その化合物を抗腫瘍免疫活性を有する化合物（候補化合物）として選択することができる。Bach2は細胞内でmTORC1のリン酸化を受けることが推定されたので、スクリーニング系にmTORC1を共存させることが好ましい。さらにBach2はmTORC2によるリン酸化を受ける可能性もあるので、mTORC2を共存させてもよい。mTORC1およびmTORC2は内因性のものでもよいし、外因性のものでもよい。
Bach2のリン酸化部位としては、好ましくは、５３５位のセリン（配列番号２の５３６位のセリンに相当するセリン）が挙げられる。なお、配列番号２の５３６位のセリンに相当するセリンとは、対象配列を配列番号２とアラインメントしたときに配列番号２の５３６位のセリンの位置に配置されるセリン残基をいう。例えば、５３６位よりもN末端側でアミノ酸残基の欠損や付加が起こった時はそれに応じてN末端から数えた位置は変化するが、そのような場合も当然に含む。マウスの配列（配列番号２６）においては、５３５位のセリンに該当する。
リン酸化されたBach2を特異的に検出するための方法としては、電気泳動における移動度の差を指標に検出する方法や、抗リン酸化セリン抗体を用いる方法でもよいが、リン酸化されたBach2を特異的に認識する抗体を用いる方法が好ましい。
＜抗リン酸化Bach2抗体＞
リン酸化されたBach2を特異的に認識する抗体としては、Bach2のリン酸化部位を含む約１０～２０アミノ酸のペプチドであって、当該部位がリン酸化されたペプチドを用意し、それを抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されるマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、上記のような抗原を非ヒト哺乳動物に免疫することで該免疫感作動物から得た血清などから取得することができる。
モノクローナル抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:　A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製は、上記のような抗原をマウスなどの非ヒト哺乳動物に投与し、免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓に含まれる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞を細胞融合させることにより調製される。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、ウェルの培養上清の免疫抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡ等の免疫化学的方法によって測定することにより行うことができる。そして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを含むウェルから更に、限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット等の哺乳動物の腹水中等でのインビボで増殖させ、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、既知の方法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体、アフィニティークロマトグラフィー等の手段により容易に達成することができる。
モノクローナル抗体は遺伝子組み換え技術で得られるものでもよい。マウスモノクローナル抗体も含まれるが、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体でもよい。さらに、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体等の抗体フラグメントでもよい。
例えば、５３５位のセリンがリン酸化されたリン酸化Bach2を認識する抗リン酸化Bach2抗体を得るためには、５３５位のセリンを含む１０～２０アミノ酸のペプチドを抗原に使用することができる。そのようなペプチドとしては、EDGSGG(pS)PCSLPL（配列番号２５）のペプチドが例示される。
本発明のモノクローナル抗体として具体的には、H鎖（重鎖）可変領域のCDRに配列番号１８または２２のアミノ酸番号１８～２６（HCDR1）、配列番号１８または２２のアミノ酸番号４４～５０（HCDR2）および配列番号１８または２２のアミノ酸番号８９～９５（HCDR3）のアミノ酸配列を含み、L鎖（軽鎖）可変領域のCDRに配列番号２０または２４のアミノ酸番号３２～４２（LCDR1）、配列番号２０または２４のアミノ酸番号６０～６３（LCDR2）および配列番号２０または２４のアミノ酸番号９９～１０７（LCDR3）のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
なお、リン酸化Bach2を特異的に認識する限り、これらのCDRの１つ以上において、１～数個のアミノ酸が置換されてもよい。ここで、１～数個とは、例えば、１個または２個である。CDRの配列を改変して特異性が改変前と同等以上に向上した抗体を得ることは、公知のファージディスプレイなどの技術によって行うことができる。
CDR以外の領域は抗体としての構造を維持し、機能を発揮できる配列であれば特に制限されず、マウス由来の配列、ヒト由来の配列、他の哺乳動物由来の配列、それらのキメラ配列、人工配列のいずれであってもよい。定常領域を含む場合においては、H鎖およびL鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980 に記載のものが例示される。
これらのCDRを有するマウス抗体としては、H鎖に配列番号１８または２２のアミノ酸配列を、L鎖に配列番号２０または２４のアミノ酸配列を有する抗体が例示される。なお、これらのアミノ酸配列においては、リン酸化Bach2を特異的に認識する機能が維持される限り、１～数個のアミノ酸（１～２０個、１～１０個または１～５個）の置換、欠失、付加または挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。
本発明の抗リン酸化Bach2抗体は、抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング以外に、研究用試薬や臨床検査用試薬としても使用しうる。例えば、免疫疾患の検査薬としても使用しうる。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。
＜Bach2ノックアウトによる抗腫瘍効果とその細胞メカニズムの解析＞
野生型マウス（C57BL/6、8-10週齢）またはBach2ノックアウトマウス（再表2005/110433）に、マウスメラノーマ細胞株である B16-F10 細胞（0.5×106個）を皮下に移植し、腫瘍投与後10日目に腫瘍組織を取り出し、組織切片を作成し、抗PNL2（メラノーマ特異的に発現しているタンパク質）抗体を用いて、免疫染色を行った。その結果、図１に示すように、野生型マウスでは腫瘍が広範囲に見られたのに対し、Bach2ノックアウトマウスでは腫瘍は縮小していた。
図２では、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍容積の経時変化を示した。腫瘍容積は体表から形成された腫瘍の長径と短径を測定し、簡易式（長径×短径2）/2で算出した。
これらの結果から、Bach2の機能を阻害することにより、抗腫瘍免疫効果が達成されうることが示唆された。
次に、図１，２の現象を解析するために、腫瘍部位における免疫細胞の解析を行った。すなわち、腫瘍投与後１３日に野生型マウスおよびBach2ノックアウトマウスから腫瘍組織を取り出し、CD45抗体を用いて腫瘍をホモジナイズしたサンプルを精製し、各免疫細胞のマーカー分子に対する抗体を用いてFACS（細胞ソーター）で解析を行った。その結果、図３に示すように、Bach2ノックアウトマウスの腫瘍組織ではCD8＋T細胞が特異的に誘導され、これにより抗腫瘍効果が発揮されていることが示唆された。
＜Bach2ノックアウトマウスにおける標的遺伝子の転写レベルの解析＞
また、上記腫瘍投与13日後の野生型およびBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞において、各種遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した。
解析した遺伝子と使用したプライマーは下記の通り。
Gzmb（Granzyme B）
Forward : GACCCAAAGACCAAACGTGC（配列番号３）
Reverse : TGAAAGCACGTGGAGGTGAA（配列番号４）
Prf1（perforin 1 (pore forming protein)）
Forward : CCCACTCCAAGGTAGCCAAT（配列番号５）
Reverse : GAGCTGTTAAAGTTGCGGGG（配列番号６）
Ifng（Interferon gamma）
Forward : AGCGTCATTGAATCACACCTG（配列番号７）
Reverse : GAATGCTTGGCGCTGGAC（配列番号８）
GITR (glucocorticoid-induced TNFR family related gene)
Forward : ATCTGCAAGCACTACCCCTG（配列番号９）
Reverse : ACAGGCAACACACCGGAAG（配列番号１０）
PD-1 (Programmed death-1)
Forward : GCCCTAGCTGTCTTCTGCTC（配列番号１１）
Reverse : CACACTAGGGACAGGTGCTG（配列番号１２）
CTLA4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）
Forward : CTTGTCGCAGTTAGCTTGGG（配列番号１３）
Reverse : GACCCCTGTTGTAAGAGGACTT（配列番号１４）
4-1BB
Forward : CCGTGCAGAACTCCTGTGAT（配列番号１５）
Reverse : TTACAGTTCGGCTGTCCACC（配列番号１６）
その結果、図４に示すように、Bach2ノックアウトマウスにおいて特にGZMBとIFNGの発現が上昇していることが分かった。これらはBach2に標的遺伝子であり、細胞障害性に関与する。
＜Bach2ノックアウトマウスにおけるCD8＋T細胞の細胞障害性の評価＞
次に、野生型マウスおよびBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞が細胞障害性を示すかについて調べた。
具体的には、まず、30000個のCD8＋T細胞を、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスに移植したB16F10の腫瘍塊からソーティングした。次いで、Target用細胞として、高濃度のCTV（CTV-high）（Life technologies 社）で標識したB16F10細胞3000個とCD8＋T細胞を5時間共培養した。また、T細胞を加えないCTV-highで標識したB16F10細胞3000個をcontrolとして5時間培養した。
同時にReference用細胞として、低濃度の（CTV-low）（Life technologies 社）で標識したB16F10細胞を3000個を5時間培養した。（こちらにはT細胞なし）Target 細胞とReference細胞を混合し、 CTV-highとCTV-highのB16B10細胞の割合を測定し、Specific lysis= (Reference-Target)/Reference　の式でCD8陽性T細胞の細胞障害性を評価した。その結果、図５に示すように、 Bach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞はメラノーマ細胞に対して細胞障害性を有することが確かめられた。
＜Bach2のリン酸化部位の解析＞
次に、Bach2のリン酸化部位を調べるため、野生型Bach2またはリン酸化部位と思われるセリン残基およびスレオニン残基をアラニンに置換した変異型Bach2をFLAGタグを付した融合タンパク質として（HEK293細胞）で発現させ、細胞抽出物を電気泳動にかけたのち、抗Bach2抗体で検出した。
その結果、図６に示すように、５３５位のセリン（配列番号２の５３６位のセリンに相当）を置換したBach2では、野生型で見られるリン酸化によるバンドシフトが消失した。この結果から、Bach2のリン酸化部位として５３５位が含まれることが分かった。
＜Bach2のリン酸化の転写抑制活性への影響＞
次に、Bach2のリン酸化と転写抑制活性の関係を調べるため、野生型Bach2またはS535A Bach2（配列番号２の５３６位のセリンをアラニンに置換）による標的遺伝子の転写への影響を調べた。具体的には、野生型マウスの脾臓から単離したCD8＋T細胞を抗CD3/CD28抗体で24時間刺激した後に、野生型Bach2、S535A変異Bach2またはmockをインフェクションして24時間後に細胞を回収して、RT-PCRを行った。
その結果、図７に示すように、５３５位が置換されたリン酸化されない変異型Bach2が導入された細胞では、細胞障害性に関わる遺伝子の発現が増加することがわかった。
＜抗リン酸化Bach2抗体の作製と評価＞
抗リン酸化Bach2抗体を以下の通り作製した。５３５位のセリンを含み、当該セリンがリン酸化されたペプチド（配列番号２５）を合成し、マウスに免疫してハイブリドーマを作製し、その中から、リン酸化Bach2を特異的に認識するクローンを選択し、その中の２クローンを限界希釈し、リン酸化Bach2特異的抗体産生ハイブリドーマ株として選択した（クローン７、クローン１７）。
該ハイブリドーマ株より抗体を精製し、以下の手順でリン酸化Bach2に対する特異性を評価した。
PlatE細胞（293細胞由来レトロウイルスパッケージング細胞株）にpcDNA-Bach2あるいはpcDNA-Bach2S535A (当該セリンをアラニンに置換）をトランスフェクション
24時間後に全細胞抽出液を調製
一部はフォスファターゼ（CIAP）で37℃1時間処理
5μｇ相当抽出液を電気泳動→ウエスタンブロッティングへ
膜は0.5% BSA in T-TBSでブロック処理した後で各抗体（0.1マイクログラム/ml）と反応
二次抗体はanti-mouse HRP結合抗体
HRP検出はPierce Pico ECLキットを使用
その結果、図８に示すように、クローン７および１７はいずれも野生型Bach2に結合し、その結合バンドのシグナルはCIAP処理によって減少した。一方、５３５位が変異したリン酸化を受けないBach2ではシグナルがほとんど見られなかった。これらのことから、クローン７および１７は５３５位がリン酸化されたBach2を特異的に認識していると考えられた。
クローン７および１７より抗体をコードするDNAを単離し、通常の方法で、抗体をコードするDNAの配列を解析した。
その結果、クローン７のH鎖のアミノ酸配列は配列番号１８であり、CDRの配列は、アミノ酸番号１８～２６、４４～５０および８９～９５であった。
クローン７のL鎖のアミノ酸配列は配列番号２０であり、CDRの配列は、アミノ酸番号３２～４２、６０～６３および９９～１０７であった。
クローン１７のH鎖のアミノ酸配列は配列番号２２であり、CDRの配列は、アミノ酸番号１８～２６、４４～５０および８９～９５であった。
クローン１７のL鎖のアミノ酸配列は配列番号２４であり、CDRの配列は、アミノ酸番号３２～４２、６０～６３および９９～１０７であった。
＜抗リン酸化Bach2抗体の評価＞
次に、抗リン酸化Bach2抗体（クローン１７由来）を用い、B1-8hiマウス（Shih et al (2002) Nature Immunology 3, 570-575）由来のB細胞中に含まれるリン酸化Bach2タンパク質の検出を行った。
B1-8hiマウス由来のB細胞を、抗原免疫を刺激する試薬（以下、刺激薬）を含む培養液、前記刺激薬を含む培養液にmTORC1の阻害剤であるラパマイシンをDMSOに溶解して添加した培養液、ならびに前記刺激薬を含む培養液にmTORC1及びmTORC2の両方を阻害するAZDをDMSOに溶解して添加した培養液、にて1時間培養し、細胞を回収し、ウエスタンブロッティングを行った。なお、抗リン酸化Bach2抗体（クローン１７由来）以外の各一次抗体については、以下のものを使用した。
Bach2抗体：Oyake et al (1996) Mol Cell Biol 16 6083-6095
p-FoxO1抗体：Cell Signaling社　カタログ番号　＃9461
FoxO1抗体：Cell Signaling社　カタログ番号　＃2880
p-p70S6 kinase抗体：Cell Signaling社　カタログ番号　＃9205
p70S6 kinase抗体：Cell Signaling社　カタログ番号　＃9202
αTubulin抗体：Santa Cruz社　カタログ番号　sc-5286
その結果、図９に示すように、抗リン酸化Bach2抗体（クローン１７由来）を用いたウエスタンブロッティングでは、刺激薬なし（－）ではバンドが見られなかったが、刺激薬あり（DMSO）では2本のバンドが見られた。また刺激薬とラパマイシンが共存する状況ではリン酸化Bach2に相当するバンドの消失は見られず、刺激薬とAZDが共存する状況では該バンドが消失した。mTORC2でリン酸化されることが知られているFoxO1について調べると、予想通り刺激薬とラパマイシンが共存する場合はp-FoxO1のバンドは消失せず、刺激薬とAZDが共存する場合はバンドが消失した。一方、mTORC1でリン酸化されることが知られているp70S6 kinaseについて調べると、刺激薬とラパマイシンが共存する環境下および刺激薬とAZDが共存する環境下のいずれの場合もp-p70S6 kinaseのバンドが消失した。mTORC1はAKTにより活性化されるがmTORC2はAKTを活性化することで間接的にmTORC1活性化に関与する。AZDによりリン酸化Bach2バンドが消失することから、Bach2のS535のリン酸化は、mTORC1だけでなくmTORC2も関与することが明らかとなった。

Claims (15)

  1. 配列番号２の５３６位に相当するセリン残基がリン酸化されたリン酸化Bach2を特異的に認識する抗体。
  2. 配列番号２５の７位に相当するセリン残基がリン酸化されたペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. H鎖CDRの配列として、
    配列番号１８または２２の、
    アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
    アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、請求項１または２に記載の抗体。
  4. H鎖CDRの配列として、
    配列番号１８の
    アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
    アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、または
    配列番号２２の
    アミノ酸番号１８～２６の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４～５０の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
    アミノ酸番号８９～９５の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、請求項３に記載の抗体。
  5. H鎖の配列として、
    配列番号１８のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
    配列番号２２のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列を含む、請求項３に記載の抗体。
  6. L鎖CDRの配列として、
    配列番号２０または２４のアミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
    アミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. L鎖CDRの配列として、
    配列番号２０のアミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、およびアミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
    または
    配列番号２４の
    アミノ酸番号３２～４２の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０～６３の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
    アミノ酸番号９９～１０７の配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換された配列、
    を含む、請求項６に記載の抗体。
  8. L鎖の配列として、
    配列番号２０のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
    配列番号２４のアミノ酸配列もしくはその１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、
    を含む、請求項６に記載の抗体。
  9. ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体およびその、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体である、請求項９に記載の抗体。
  11. Bach2の機能を阻害する化合物を選択する工程を含む、抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法。
  12. Bach2を発現する細胞に被検化合物を添加する工程、Bach2のリン酸化レベルを測定する工程、およびBach2のリン酸化レベルを増加させる化合物を選択する工程を含む、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
  13. リン酸化レベルの測定が配列番号２の５３６位に相当するセリン残基のリン酸化レベルを測定することによる、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
  14. 抗リン酸化Bach2抗体を用いてBach2のリン酸化レベルが測定される、請求項１２または１３に記載のスクリーニング方法。
  15. 抗リン酸化Bach2抗体が請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
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