WO2017043087A1 - 糞便試料から物質を抽出する方法 - Google Patents

糞便試料から物質を抽出する方法 Download PDF

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organic solvent
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stool sample
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真嗣 福田
千晴 石井
勝 冨田
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Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting a substance from a stool sample, particularly suitable for performing analysis such as metabolome analysis using mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy, metagenome analysis using a next-generation sequencer,
  • the present invention relates to a method for extracting a substance from a stool sample.
  • the intestinal flora plays an important role in maintaining human homeostasis by degrading indigestible polysaccharides, producing essential nutrients such as vitamins, building the immune system, and controlling the growth of pathogenic bacteria. is there.
  • various intestinal diseases such as colorectal cancer (Non-Patent Documents 1 and 2), metabolic diseases such as type 2 diabetes (Non-Patent Document 3), obesity It is suggested that it leads to the onset (nonpatent literature 4) etc.
  • the intestinal microflora is a presence that can have both positive and negative effects on the human body.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • the relationship between the gut microbiota and our health has been pointed out, but there are still many unclear points about the mechanism that the gut microbiota affects the human body.
  • the physiological function of the intestinal flora has been clarified by obtaining the composition and genetic information of the intestinal flora by metagenomic analysis and metatranscriptome analysis of the intestinal flora.
  • Non-patent Document 7 It has also been reported that chain fatty acids activate systemic energy metabolism and prevent obesity (Non-patent Document 7). On the other hand, it has also been reported that secondary bile acids produced by intestinal bacteria by decomposing primary bile acids promote the onset of liver cancer (Non-patent Document 8). Thus, metabolites produced from the intestinal flora have both positive and negative functions. Metabolomic analysis of intestinal metabolites is based on "elucidation of interaction mechanism between host and intestinal flora", “search for new functional substances of metabolites produced from intestinal flora”, “intestinal metabolite profile It is considered useful for evaluation of the intestinal environment.
  • Non-Patent Document 9 mouse stool is dissolved in a phosphate buffered saline (PBS) solution, and the supernatant is analyzed by capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS: Capillary Electrophoresis). It describes a method of measuring metabolites by measuring with -Time of Flight Mass Spectrometry. However, there are few reports on intestinal metabolites, and it is difficult to say that a method for measuring intestinal metabolites has been established.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Patent Document 10 a method of extracting a metabolite using a mixed solvent of water / methanol
  • Patent Document 11 a method of extracting a metabolite by liquid-liquid distribution using a mixed solvent of chloroform / methanol
  • Patent Document 1 describes a method for extracting a metabolite from cells in the presence of methanol, chloroform, and water.
  • Non-patent Document 12 when extracting a metabolite from cells having cell walls such as bacteria and plants, a method of physically crushing the cells with zirconia beads or the like and extracting with a solvent such as methanol is used (Non-patent Document 12). ).
  • An object of the present invention is to provide a more practical method for extracting a substance from a stool sample. More specifically, the problem of the present invention is that a metabolome analysis using mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy, a metagenome analysis using a next-generation sequencer, etc. It is to provide a method for extracting a substance.
  • E Solvent containing a hydrophobic organic solvent:
  • F Solvent containing a hydrophilic organic solvent and a hydrophobic organic solvent:
  • G Solvent consisting of water:
  • the present inventors have found that various substances can be extracted by using an aqueous solvent in combination with a hydrophilic organic solvent and / or a hydrophobic organic solvent. Furthermore, the present inventors have found that when stool samples are suspended in a solvent, metabolites such as amino acids can be more efficiently extracted by crushing and suspending treatment using beads. In addition, the present inventors separate the substance extracted from the stool sample by capillary electrophoresis or chromatography, and use it for mass spectrometry and / or nuclear magnetic resonance spectroscopy, thereby providing the one or more kinds of substances. And the concentration of the one or more substances is measured and cluster analysis is performed on the measured data. The substance profile is classified into clusters (groups) for each characteristic substance. I found what I could do. The present inventors have found these things further and have completed the present invention.
  • the present inventors compared the case where water was used as an aqueous solvent with the case where a PBS solution was used, and found that more types of metabolites could be detected using water. .
  • the present inventors have also found that when a PBS solution is used and a sample is concentrated and subjected to mass spectrometry, current flows excessively due to the influence of salt concentration, and accurate measurement cannot be performed. The present inventors have found these things further and have completed the present invention.
  • the present invention (1) A method for extracting one or more substances from a stool sample, Step A of suspending the stool sample in any of the following solvents (a) to (g) to obtain a suspension:
  • E Solvent containing a hydrophobic organic solvent:
  • G Solvent consisting of water: Step B of separating the liquid layer containing the solvent from the suspension: and Step C for obtaining one or more substances after removing proteins from the liquid layer:
  • the method of extracting the substance of (4) The method for extracting a substance according to (2) or (3) above, wherein the bead diameter in step A-1 is in the range of 0.02 to 0.5 mm, (5) Before the step A or the step A-1, the method further includes a step X of crushing the dried stool sample with beads to obtain a dried stool piece, and the dried stool piece is used as the stool of the step A or the step A-1.
  • the present invention also provides: (12) A method of identifying one or more substances in a stool sample and measuring the concentration, composition or ratio of the one or more substances,
  • the one or more substances extracted by the method according to any one of (1) to (11) above are separated by chromatography or capillary electrophoresis, and subjected to mass spectrometry and / or nuclear magnetic resonance spectroscopy.
  • Step P for identifying the one or more substances by measuring and measuring the concentration, composition or ratio of the one or more substances A method characterized by including: (13) A method of classifying a plurality of objects into two or more clusters, For each stool sample obtained from a plurality of subjects, two or more substances are identified by performing the method described in (12) above, and the concentration, composition or ratio of the two or more substances is determined.
  • Process Q to measure and Cluster analysis is performed on the concentration, composition, or ratio data of the two or more substances obtained in the step Q, and the plurality of objects are classified into two or more clusters according to the similarity of the substance profile S:
  • one or more substances can be efficiently extracted from a stool sample.
  • more types of substances can be extracted from a stool sample. Therefore, according to the present invention, a method for extracting a substance in a stool sample suitable for performing analysis such as metabolome analysis using mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy, metagenome analysis using a next-generation sequencer, etc. Can be provided.
  • FIG. 6 is a diagram showing profiles of (cationic) metabolites detected in extracted samples 1 to 5; Hierarchical clustering of samples and metabolites was performed using Pearson's correlation coefficient.
  • the character string before the hyphen represents the type of the extracted sample (extracted samples 1 to 5), and the number after the hyphen represents the difference in stool used.
  • the heat map represents the Z-score of each metabolite, with black representing high concentration, light gray representing low concentration, and white representing below detection limit.
  • FIG. 6 is a diagram showing the result of comparing the number of metabolites detected in extracted samples 1 to 5.
  • PAM Partitioning
  • [1] to [3] in the figure respectively indicate Butyrate (butyric acid), Cholate (cholic acid) and Thiamine (vitamin B1), and the ellipses centered on [1] to [3] are the butyric acid group, A cholic acid group and a vitamin B1 group are shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of analyzing changes in metabolite profiles with respect to storage at ⁇ 80 ° C. when stool samples are stored at room temperature for 1 to 2 days.
  • “I” in the figure indicates a metabolite in which an increase in concentration was observed when the stool sample was stored at room temperature for 1 to 2 days, and “II” represents when the stool sample was stored at room temperature for 1 day.
  • III indicates decreased concentration when stool samples were stored at room temperature for 1-2 days Indicates a metabolite.
  • Metabolites are extracted by the methanol / chloroform method from stool samples stored at -80 ° C immediately after collection or stored at room temperature, 4 ° C or -20 ° C for 1-2 days, and the detected metabolites are used. It is a figure which shows the result of having performed the principal component analysis. Fecal samples were placed in various organic solvents (100% methanol [100% MeOH], 50% methanol [50% MeOH], or methanol / chloroform [MeOH / CHCl 3 ]) at room temperature or in the absence of an organic solvent. It is a figure which shows the result of having performed the principal component analysis using the detected metabolite preserve
  • the shape of the plot indicates the type of organic solvent used for storage, and the color indicates the storage temperature.
  • a stool sample is stored in 100% methanol [100% MeOH] or methanol / chloroform [MeOH / CHCl 3 ]) or in the absence of an organic solvent at room temperature, 4 ° C. or ⁇ 80 ° C. for 2 days. It is a figure which shows the result of having performed the principal component analysis using the metabolite detected at the time.
  • the shape of the plot indicates the type of organic solvent used for storage, and the color indicates the storage temperature.
  • the “method for extracting one or more substances from a stool sample” of the present invention refers to one or more substances from a stool sample.
  • B Solvent containing aqueous solvent and hydrophobic organic solvent:
  • C A solvent containing an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent:
  • D Solvent containing a hydrophilic organic solvent:
  • E Solvent containing a hydrophobic organic solvent:
  • F Solvent containing a hydrophilic organic solvent and a hydrophobic organic solvent:
  • G Solvent consisting of water: Step B of separating the liquid layer containing the solvent from the suspension: and Step C for obtaining one or more substances after removing proteins from the liquid layer: As long as it contains, there is no particular limitation.
  • the biological species from which the “fecal sample” in the present invention is derived is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, mice, rats, cows, sheep, horses, monkeys, among which humans are preferable. It is done.
  • the “substance” in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance contained in a stool sample, and includes a hydrophilic substance, a lipophilic substance, an amphiphilic substance, and more specifically, acidic, neutral or basic. Hydrophilic substances, acidic, neutral or basic lipophilic substances, acidic, neutral or basic amphiphilic substances.
  • Preferred “substances” in the present invention include intestinal metabolites; nucleic acids such as DNA and RNA; bile acids such as cholic acid and deoxycholic acid; short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid and butyric acid; lactic acid and succinic acid.
  • Organic acids such as acids; amino acids; carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides and trisaccharides; uremic toxins such as indoxyl sulfate; lipids such as fatty acids and neutral fats;
  • intestinal metabolite in this specification refers to a substance produced by synthesis and / or decomposition based on a substance taken from the outside by an organism (host) and / or intestinal bacteria from which a stool sample is derived. It means a substance that exists or has existed in the intestine (preferably in the large intestine) of the host.
  • Specific examples of intestinal metabolites include short-chain fatty acids having 2 to 6 carbon atoms; amino acids; vitamins; polyamines; nucleic acids; bile acids; carbohydrates; Preferred are the substances listed in Table 5. According to the extraction method of the present invention, intestinal metabolites can be more comprehensively extracted from a stool sample.
  • Step A in the extraction method of the present invention is not particularly limited as long as it is a step of obtaining a suspension by suspending the stool sample in any of the solvents (a) to (g).
  • aqueous solvent examples include water such as purified water; buffered aqueous solution; aqueous solution containing a pH adjuster; and the like. From the viewpoint of extracting more types of intestinal metabolites, water is preferable. . In addition, when the extract extracted using a buffered aqueous solution containing salt is subjected to mass spectrometry, excessive current may flow during measurement, which may hinder the measurement. As water, water is preferable to a buffered aqueous solution.
  • the pH of the buffered aqueous solution or the aqueous solution containing the pH adjusting agent can be appropriately set according to the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • the pH can be in the range of 6-8.
  • the buffer aqueous solution include a phosphate buffer aqueous solution, a tris-hydrochloride buffer aqueous solution, and a Good buffer aqueous solution.
  • these aqueous solvents commercially available ones may be used, or those prepared using reagents may be used.
  • hydrophilic organic solvent means an organic solvent having a solubility in water of more than 20 g / 100 g (20 ° C.).
  • the “hydrophilic organic solvent” is not particularly limited as long as it is a hydrophilic organic solvent, and is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetone, 1 type or 2 or more types selected from the group which consists of tetrahydrofuran and diethylene glycol can be mentioned, Among these, 1 type or 2 selected from the group which consists of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, and acetone is mentioned.
  • hydrophilic solvents Commercially available ones may be used, or ones prepared using reagents may be used.
  • the “hydrophobic organic solvent” means an organic solvent having a solubility in water of 20 g / 100 g (20 ° C.) or less.
  • the “hydrophobic organic solvent” is not particularly limited as long as it is a hydrophobic organic solvent, and is selected from the group consisting of chloroform, hexane, ether, diethyl ether, benzene, phenol, and isoamyl alcohol, or 2 or more types can be mentioned, among which 1 type or 2 or more types selected from the group consisting of chloroform, hexane, and diethyl ether can be mentioned preferably, among which chloroform and hexane can be mentioned more preferably.
  • these hydrophobic solvents commercially available solvents may be used, or those prepared using reagents may be used.
  • the following solvents (a1) to (f1) can be preferably mentioned, and the following solvents (a2) to (f2) can be more preferably mentioned.
  • A1 A solvent containing an aqueous solvent and a hydrophilic organic solvent and not containing a hydrophobic organic solvent:
  • B1 A solvent containing an aqueous solvent and a hydrophobic organic solvent and not containing a hydrophilic organic solvent:
  • C1 A solvent containing an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent:
  • D1 A solvent containing a hydrophilic organic solvent and not containing an aqueous solvent or a hydrophobic organic solvent:
  • E1 A solvent containing a hydrophobic organic solvent and not containing an aqueous solvent or a hydrophilic organic solvent:
  • F1 A solvent containing a hydrophilic organic solvent and a hydrophobic organic solvent and not containing an aqueous solvent:
  • A2 A solvent comprising an aqueous solvent and a hydrophilic organic solvent:
  • B2 A solvent comprising an aqueous solvent and a hydrophobic organic solvent:
  • C2 A solvent comprising an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent:
  • D2 A solvent comprising a hydrophilic organic solvent:
  • E2 A solvent comprising a hydrophobic organic solvent:
  • F2 A solvent comprising a hydrophilic organic solvent and a hydrophobic organic solvent:
  • the content of the aqueous solvent or the hydrophilic organic solvent in the solvents (a), (a1) and (a2) is not particularly limited, depending on the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • a solvent having an aqueous solvent content in the range of 10 to 90% by weight and a hydrophilic organic solvent content in the range of 90 to 10% by weight can be mentioned.
  • a solvent having an aqueous solvent content in the range of 10 to 50% by weight and a hydrophilic organic solvent content in the range of 90 to 50% by weight can be preferably exemplified.
  • the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophilic organic solvent in the solvents (a), (a1) and (a2) is not particularly limited, and the properties of one or more substances that are the purpose of extraction are not limited. However, it can be set within a range of 1: 9 to 9: 1, and preferably within a range of 1: 9 to 5: 1.
  • Preferable embodiments of the solvents (a), (a1) and (a2) include methanol aqueous solutions having a methanol concentration in the range of 10 to 90% by weight.
  • An aqueous methanol solution within the range of wt% can be preferably mentioned, and an aqueous methanol solution having a methanol concentration of 50 wt% can be more preferred.
  • the content of the aqueous solvent or the hydrophobic organic solvent in the solvents (b), (b1) and (b2) is not particularly limited, depending on the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • a solvent having an aqueous solvent content in the range of 10 to 90% by weight and a hydrophobic organic solvent content in the range of 90 to 10% by weight may be mentioned.
  • preferred is a solvent having an aqueous solvent content in the range of 10 to 50% by weight and a hydrophobic organic solvent content in the range of 90 to 50% by weight.
  • the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophobic organic solvent in the solvents (b), (b1) and (b2) is not particularly limited, and the properties of one or more substances that are the purpose of extraction are not limited. However, it can be set within a range of 1: 9 to 9: 1, and preferably within a range of 1: 9 to 5: 1.
  • the content of the aqueous solvent, the hydrophilic organic solvent, and the hydrophobic organic solvent in the solvents (c), (c1), and (c2) is not particularly limited, and may be one or more kinds of substances that are intended for extraction.
  • the content can be appropriately set according to the properties and the like, for example, the content of the aqueous solvent is in the range of 5 to 85% by weight, the content of the hydrophilic organic solvent is in the range of 5 to 85% by weight, and And a solvent having a hydrophobic organic solvent content in the range of 5 to 85% by weight.
  • the aqueous solvent content is in the range of 5 to 60% by weight, and the hydrophilic organic solvent content is in the range of 5 to 85% by weight.
  • a solvent having a hydrophobic organic solvent content of 10 to 70% by weight and a hydrophobic organic solvent content of 10 to 70% by weight can be preferably used.
  • the aqueous solvent content is 5 to 30% by weight.
  • the content of hydrophilic organic solvent is 30 to 0 is the weight% range, and can be the content of the hydrophobic organic solvent is exemplified more preferably the solvent is in the range of 30 to 50 wt%.
  • the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophilic organic solvent in the solvents (c), (c1) and (c2), the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophobic organic solvent, and the hydrophilic organic solvent to the hydrophobic solvent are examples of the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophobic organic solvent.
  • the weight ratio with the organic solvent is not particularly limited, and can be set as appropriate according to the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophilic organic solvent can be, for example, in the range of 1: 9 to 9: 1, and preferably in the range of 1: 9 to 4: 6.
  • the weight ratio of the solvent to the hydrophobic organic solvent can be, for example, in the range of 1: 9 to 9: 1, and can preferably be in the range of 1: 9 to 4: 6.
  • the weight ratio of the organic solvent to the hydrophobic organic solvent can be, for example, in the range of 1: 9 to 9: 1, and particularly in the range of 3: 7 to 7: 3.
  • the water content is in the range of 5 to 85% by weight and the methanol content is in the range of 5 to 85% by weight.
  • a solvent having a chloroform content in the range of 5 to 85% by weight including a water content in the range of 5 to 60% by weight and a methanol content of 10 to 70% by weight. %, And a solvent having a chloroform content in the range of 10 to 70% by weight is preferable.
  • the water content is in the range of 5 to 30% by weight
  • a solvent having a content of 30 to 50% by weight and a chloroform content of 30 to 50% by weight can be mentioned more preferably.
  • the content of the hydrophilic organic solvent in the solvents (d) and (d1) is not particularly limited and can be appropriately set according to the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • a solvent having a hydrophilic solvent content in the range of 80 to 100% by weight can be mentioned, and among them, a solvent having a hydrophilic organic solvent content in the range of 95 to 100% by weight is preferable. Can do.
  • the content of the hydrophobic organic solvent in the solvents (e) and (e1) is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • a solvent having a hydrophobic solvent content in the range of 80 to 100% by weight can be mentioned, and among them, a solvent having a hydrophobic organic solvent content in the range of 95 to 100% by weight is preferably mentioned. Can do.
  • the content of the hydrophilic organic solvent and the hydrophobic organic solvent in the solvents (f), (f1), and (f2) is not particularly limited, depending on the properties of one or more substances that are the purpose of extraction.
  • a solvent having a hydrophilic solvent content in the range of 10 to 90% by weight and a hydrophobic organic solvent content in the range of 90 to 10% by weight may be used.
  • preferred is a solvent having a hydrophilic solvent content in the range of 30 to 70% by weight and a hydrophobic organic solvent content in the range of 70 to 30% by weight.
  • the weight ratio of the hydrophilic solvent to the hydrophobic organic solvent in the solvents (f), (f1) and (f2) is not particularly limited. Although it can be appropriately set according to the properties, for example, it can be in the range of 1: 9 to 9: 1, and among them, it can be in the range of 3: 7 to 7: 3.
  • the stool sample When the stool sample is suspended in any of the solvents (a) to (g), the stool sample may be added and suspended in the solvent, or the solvent may be added to the stool sample. It may be added and suspended.
  • the method for suspending the stool sample in the solvent is not particularly limited, and examples thereof include a method of suspending the stool sample in the solvent by shaking and / or stirring the solvent and the stool sample. Among them, the solvent and the stool sample are agitated with an ultrasonic or pressure homogenizer to suspend the stool sample in the solvent, the solvent and the stool sample (preferably A method of suspending the stool sample in the solvent by shaking and / or stirring the container containing them with a vortex mixer is preferred.
  • Step A-1 Step A-1: Obtaining a suspension by crushing and suspending a stool sample with beads in any of the solvents (a) to (g) above
  • the physiological functions of the intestinal flora have recently been obtained by obtaining the composition and genetic information of the intestinal flora by metagenomic analysis and metatranscriptome analysis of the intestinal flora. Is becoming clear.
  • the metabolite profile including the metabolite accumulated in the intestinal bacteria can be obtained by crushing with beads, a more accurate metabolomic analysis can be performed. It is considered that the physiological function of the intestinal flora can be elucidated in more detail by integrating the results of this highly accurate metabolome analysis and the above-described genetic information.
  • the method for obtaining a suspension by crushing and suspending the stool sample with beads in the solvent in the step A-1 is not particularly limited, and the solvent, the stool sample and the beads coexist. Then, the above-mentioned solvent, the stool sample and the beads are shaken and / or stirred to crush and suspend the stool sample with beads to obtain a suspension. Among them, the solvent, The stool sample and the beads (preferably a container containing them) are shaken and / or agitated with a cell crushing device such as a vortex mixer or Shake master NEO (manufactured by Biomedical Science Co., Ltd.). A method of obtaining a suspension by crushing and suspending treatment with is preferred.
  • the material of the beads in the step A-1 is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed (preferably, microorganisms in the stool sample can be crushed), but zirconia (zirconium dioxide), zirconium, quartz, silica, stainless steel, Examples thereof include magnesium oxide, titanium oxide, manganese oxide, magnesium, titanium, and manganese.
  • the shape of the beads in the above step A-1 is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed (preferably, microorganisms in the stool sample can be crushed). it can.
  • the size of the beads in step A-1 is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed (preferably, microorganisms in the stool sample can be crushed).
  • the length of the longest part of the bead is 0.
  • a suitable range is 0.02 to 0.5 mm, preferably 0.05 to 0.3 mm.
  • the diameter of the beads is preferably in the range of 0.02 to 0.5 mm, preferably in the range of 0.05 to 0.3 mm.
  • the amount of beads added in the above step A-1 is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed (preferably, the microorganism in the stool sample can be crushed), and is preferably within the range of 1 mg to 1 g per 1 mL of solvent, for example. May be in the range of 10 to 800 mg, more preferably in the range of 40 to 600 mg.
  • the beads in the step A-1 the beads exemplified in the step X described later may be used in combination with the beads exemplified in the step A-1.
  • the extraction method of the present invention may not further include the following step X, but the step A or the point that the amount of each stool sample used for extraction can be made as uniform as possible by obtaining a dried stool piece. It is preferable to further include the following step X before step A-1. Step X: Step X of obtaining a dried stool piece by crushing a dried stool sample with beads
  • step X the dried stool pieces obtained in step X are used as the stool sample in step A or step A-1.
  • the material of the beads in the above step X is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed, and specific examples include the materials listed as the materials of the beads in A-1.
  • the material of the beads in the above step X may be the same as or different from the material of the beads in the above A-1.
  • the shape of the beads in the above-mentioned step X is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed, but a substantially spherical shape can be mentioned, and a spherical shape can be preferably mentioned.
  • the shape of the beads in the step X may be the same as or different from the shape of the beads in the above A-1.
  • the size of the beads in the above step X is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed.
  • the length of the longest part of the beads is in the range of 0.6 to 15 mm, preferably 1.5 to 9 mm.
  • the range is preferably mentioned.
  • the diameter of the beads is preferably in the range of 0.6 to 15 mm, preferably in the range of 1.5 to 9 mm.
  • the amount of beads added in the above step X is not particularly limited as long as the stool sample can be crushed.
  • it is within the range of 1 mg to 1 g, preferably within the range of 50 to 500 mg per 10 mg (converted to dry weight) of the stool sample. be able to.
  • step A and step A-1 in the extraction method of the present invention varies depending on the characteristics of the substance targeted for extraction, but a suitable mode can be selected according to the characteristics.
  • a suitable mode can be selected according to the characteristics.
  • the solvent is not limited to an aqueous solvent. It is preferable to use a hydrophilic organic solvent in combination.
  • the solvent is a hydrophilic organic solvent. It is preferable not to use them together, and it is preferable to use only an aqueous solvent.
  • Process Y The extraction method of the present invention may not further include the following step Y. However, after the stool sample is collected, the stool sample is not frozen until the substance is extracted from the stool sample. In the case of storage, it is preferable to further include the following step Y before step A or step A-1 from the viewpoint of suppressing the change in the metabolite profile in the stool sample during storage.
  • Process Y The collected stool sample is stored in the following solvent (h) or (i): Process Y: (H) a solvent containing an aqueous solvent and a hydrophilic organic solvent of 75% by weight or more: (I) a solvent comprising an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent and a hydrophobic organic solvent:
  • step Y the stool sample stored in step Y is used as the stool sample in step A or step A-1.
  • aqueous solvent examples include “aqueous solvent” and “hydrophilicity in the solvent of the above step A, respectively.
  • examples mentioned in “Organic solvent” and “Hydrophobic organic solvent” and preferred examples can be given.
  • the “aqueous solvent”, “hydrophilic organic solvent” and “hydrophobic organic solvent” used as the solvent in the above step Y are the “aqueous solvent” and “hydrophilic organic solvent” used as the solvent in the above step A or step A-1.
  • “Hydrophobic organic solvent” may be the same as or different from each other.
  • the following solvents (h1) and (i1) can be preferably mentioned, and the following solvents (h2) and (i2) can be more preferably mentioned.
  • H1 A solvent that contains an aqueous solvent and 75% by weight or more of a hydrophilic organic solvent and does not contain a hydrophobic organic solvent:
  • I1 A solvent containing an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent:
  • H2 A solvent comprising an aqueous solvent and a hydrophilic organic solvent of 75% by weight or more:
  • I2 A solvent comprising an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent:
  • the solvent (h) is a solvent containing an aqueous solvent and a hydrophilic organic solvent, and the content of the hydrophilic organic solvent in the solvent is 75% by weight or more.
  • the content of the hydrophilic organic solvent in the solvents (h), (h1) and (h2) is not particularly limited as long as it is 75% by weight or more, but is preferably 80% by weight or more, more preferably 85% by weight. More preferably, 90% by weight or more, more preferably 95% by weight or more, and still more preferably 98% by weight or more.
  • the content of the aqueous solvent in the solvents (h), (h1) and (h2) is not particularly limited as long as it is less than 25% by weight, and is appropriately set according to the content of the hydrophilic organic solvent. Examples thereof include less than 20% by weight, less than 15% by weight, less than 10% by weight, less than 5% by weight, and less than 2% by weight.
  • the weight ratio of the hydrophilic organic solvent to the aqueous solvent in the solvents (h), (h1) and (h2) is not particularly limited as long as it is higher than 3 times, but is higher than 3 times and 100 times or lower. Can be mentioned.
  • the methanol concentration is 75% by weight or more (preferably 80% by weight or more, more preferably 85% by weight or more, further preferably 90% by weight). % Or more, more preferably 95% by weight or more, and still more preferably 98% by weight or more) and less than 100% by weight methanol aqueous solution or 100% by weight methanol solution. Among them, 100% by weight methanol solution is more preferable. Can be mentioned.
  • the content of the aqueous solvent, the hydrophilic organic solvent and the hydrophobic organic solvent in the solvents (i), (i1) and (i2) is not particularly limited and can be set as appropriate.
  • the content is in the range of 1 to 40% by weight, the content of the hydrophilic organic solvent is in the range of 10 to 95% by weight, and the content of the hydrophobic organic solvent is in the range of 5 to 60% by weight.
  • the content of the aqueous solvent is in the range of 1 to 25% by weight
  • the content of the hydrophilic organic solvent is in the range of 20 to 90% by weight
  • the hydrophobic organic solvent A solvent having a content in the range of 10 to 50% by weight can be preferably mentioned.
  • the content of the aqueous solvent is in the range of 1 to 15% by weight and the content of the hydrophilic organic solvent is 40 to 80% by weight. And the inclusion of a hydrophobic organic solvent. There may be mentioned more preferably the solvent is in the range of 15 to 45 wt%. Further, the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophilic organic solvent in the solvents (i), (i1) and (i2), the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophobic organic solvent, and the hydrophilic organic solvent to the hydrophobic solvent. The weight ratio with the organic solvent is not particularly limited and can be set as appropriate.
  • the weight ratio of the aqueous solvent to the hydrophilic organic solvent can be, for example, in the range of 1:30 to 1: 3, and preferably in the range of 1:20 to 1: 5.
  • the weight ratio of the solvent to the hydrophobic organic solvent can be, for example, in the range of 1:15 to 1: 1.5, and preferably in the range of 1:10 to 1: 2.5.
  • the weight ratio of the hydrophilic organic solvent to the hydrophobic organic solvent can be, for example, in the range of 6: 1 to 2: 3, and particularly in the range of 4: 1 to 1: 1. it can.
  • the water content is in the range of 1 to 40% by weight, and the methanol content is in the range of 10 to 95% by weight.
  • a solvent having a chloroform content in the range of 5 to 60% by weight Among them, the water content is in the range of 1 to 25% by weight and the methanol content is in the range of 20 to A solvent having a content of 90% by weight and a chloroform content of 10 to 50% by weight can be preferably mentioned.
  • the content of water is 1 to 15% by weight
  • More preferred examples include a solvent having a methanol content in the range of 40 to 80% by weight and a chloroform content in the range of 15 to 45% by weight.
  • the stool sample is included in the solvent (h) or (i).
  • the method is not particularly limited, and for example, the solvent (h) or (i) may be added to the stool sample, or the stool sample may be added to the solvent (h) or (i). Good.
  • fluctuation changes More preferably, it is 30 degrees C or less. More preferably, it is 25 ° C. or less, more preferably 20 ° C. or less, further preferably 15 ° C. or less, more preferably 10 ° C. or less, further preferably 5 ° C. or less, more preferably 0 ° C. or less, and further preferably ⁇ 5 ° C. or less. More preferably, it is ⁇ 15 ° C. or lower, more preferably ⁇ 20 ° C.
  • the significance of the present invention is that the metabolite profile in the stool sample immediately after collection is suppressed from changing.
  • examples of the temperature during storage include 0 ° C. or higher, 3 ° C. or higher, 4 ° C. or higher, 6 ° C. or higher, and 10 ° C. or higher.
  • the temperature range at the time of storage in the step (Y) is more specifically within a range of ⁇ 90 to 40 ° C., within a range of ⁇ 90 to 30 ° C., within a range of ⁇ 80 to 30 ° C., and ⁇ 80 to 25 Examples thereof include a range of °C, a range of -60 to 20 °C, and the like.
  • the preferred storage temperature range is more specifically within the range of 0 to 40 ° C., within the range of 0 to 30 ° C., within the range of 0 to 25 ° C., Within the range of 0 to 20 ° C, within the range of 0 to 15 ° C, within the range of 0 to 10 ° C, within the range of 0 to 5 ° C, within the range of 3 to 25 ° C, within the range of 3 to 20 ° C, 3 to Within 15 ° C, within 3-10 ° C, within 3-5 ° C, within 4-25 ° C, within 4-20 ° C, within 4-15 ° C, within 4-10 ° C In the range of 4 to 5 ° C, in the range of 6 to 25 ° C, in the range of 6 to 20 ° C, in the range of 6 to 15 ° C, in the range of 6 to 10 ° C, and the like.
  • the period of storage in the above step (Y) is not particularly limited and can be appropriately set according to the temperature at the time of storage. For example, when the storage temperature is less than 0 ° C., 1 minute to 1 month In the range of 20 minutes to 3 weeks, in the range of 1 hour to 2 weeks, etc. When the storage temperature is 0 ° C. or higher, the range of 1 minute to 7 days, 20 minutes to 3 For example, within the range of 1 day to 2 days.
  • the stool sample stored in Step Y can be used as the stool sample in Step A or Step A-1.
  • the method for using the stool sample after storage in Step Y as the stool sample in Step A or Step A-1 is not particularly limited, and the solvent used for storage in Step Y (hereinafter simply referred to as “storage solvent”) is also displayed. )) May or may not be removed after storage in step Y.
  • a storage solvent Is preferably not removed.
  • the storage solvent is used as it is as the extraction solvent.
  • Step A and step A-1 may be performed.
  • the storage solvent contains one or more solvents selected from the group consisting of an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, and a hydrophobic organic solvent.
  • the storage solvent is preferably changed to the extraction solvent.
  • the storage solvent of (h) above may be used as the extraction solvent of (a) as it is, or by adding an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, etc.
  • the changed solvent may be used as the extraction solvent of (a) above, or the solvent whose composition has been changed from the storage solvent by adding a hydrophobic organic solvent or the like to the storage solvent, etc. It may be used as an extraction solvent.
  • the storage solvent (i) may be used as it is as the extraction solvent (c), or may be composed of the storage solvent by adding an aqueous solvent, a hydrophilic organic solvent, a hydrophobic organic solvent, or the like. You may use the solvent which changed etc. as the extraction solvent of said (c).
  • Step B in the extraction method of the present invention is not particularly limited as long as it is a step of separating the liquid layer containing the solvent from the suspension obtained in Step A or Step A-1.
  • a method for separating the liquid layer from the suspension is not particularly limited, but a method of separating the supernatant by centrifuging the suspension can be mentioned as a preferred example. Centrifugation of the suspension can be performed using a commercially available centrifuge.
  • Step C in the extraction method of the present invention is not particularly limited as long as it is a step of obtaining one or more substances after removing the protein from the liquid layer fractionated in Step B above.
  • the method for removing the protein from the liquid layer collected in the step B is not particularly limited, and a method for removing the protein in the liquid layer using a filter such as an ultrafiltration filter or a reverse osmosis filter is preferable. be able to. Commercially available ultrafiltration filters and reverse osmosis filters can be used.
  • the liquid obtained by removing the protein in the liquid layer contains one or more substances extracted from the stool sample. From the viewpoint of the storage stability of the extracted substance, it is preferable to dry the liquid. Such a dried substance can be used by adding and dissolving a solvent such as water again when subjected to mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy. In addition, when adding the solvent, it is preferable to add an internal standard substance for mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy.
  • chromatography in Step P include liquid chromatography and gas chromatography, with liquid chromatography being preferred. Separation of substances by chromatography or capillary electrophoresis (CE: Capillary Electrophoresis) can be performed by a conventional method using a commercially available chromatograph (chromatography apparatus) or a capillary electrophoresis apparatus.
  • chromatography apparatus chromatography apparatus
  • capillary electrophoresis apparatus chromatography apparatus
  • the mass spectrometry described above is a method in which a substance is converted into gaseous ions using an ion source (ionization), and the substance ionized by moving in a vacuum and using electromagnetic force or by a time-of-flight difference is analyzed in the analysis unit. It is a measuring method using a mass spectrometer that can be separated and detected according to the above.
  • an EI method, a CI method, an FD method, an FAB method, a MALDI method, an ESI method, or the like can be selected as appropriate, and an ionized substance is separated in an analysis unit.
  • a separation method such as a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time of flight (TOF) type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, or the like can be appropriately selected.
  • tandem mass spectrometry (MS / MS) or triple quadrupole mass spectrometry combining two or more mass spectrometry methods can be used.
  • a conventionally known mass spectrometry using a commercially available mass spectrometer can be used.
  • a detection part and a data processing method can also be selected suitably.
  • Suitable mass spectrometry methods in the above step P include capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), liquid chromatography- Examples include mass spectrometry (LC-MS: “Lipid” Chromatography-Mass “Spectrometry”, among which CE-TOFMS is preferred.
  • CE-TOFMS is excellent in measuring ionic low-molecular compounds, has high resolution, and can simultaneously measure a wider variety of metabolites.
  • CE-TOFMS can measure, for example, about 90% of major metabolites in E. coli (Ohashi, Y., et al.
  • CE-TOFMS is not necessarily suitable for the measurement of neutral substances and fat-soluble substances, but it also contains short-chain fatty acids, amino acids, some vitamins, polyamines, etc., which are main substances as intestinal metabolites. Since it can be measured, it is suitable for profiling of intestinal metabolites.
  • GC-MS is excellent for measuring volatile substances such as short-chain fatty acids, there are some substances such as some amino acids that cannot be measured.
  • LC-MS can measure various metabolites, it is necessary to select an optimum column and measurement method for each substance to be measured, and the completeness in one measurement is inferior to CE-TOFMS.
  • the substance can be used as an internal standard.
  • the internal standard substance include methionine sulfone, D-camphor 10-sulfonic acid [CSA], 2-morpholinoethane sulfonic acid [MES], 3-aminopyrrolidine, and trimesate.
  • the internal standard substance is preferably labeled with a stable isotope or fluorescence so that it can be distinguished from the substance in the stool sample.
  • the internal standard substance may be added to the stool sample before extracting one or more substances, or may be added to the sample after extracting one or more substances from the stool sample. Good.
  • the above-mentioned nuclear magnetic resonance spectroscopy is a method in which one or more kinds of substances are placed in a strong magnetic field, and a pulsed radio wave is irradiated to molecules having the same nuclear spin orientation to cause nuclear magnetic resonance. Thereafter, the molecular structure is analyzed by detecting a signal generated when the molecule returns to the original stable state.
  • the method of nuclear magnetic resonance spectroscopy is not particularly limited, and may be Fourier transform NMR, continuous wave NMR, one-dimensional NMR, or two-dimensional NMR. There may be. Nuclear magnetic resonance analysis can be performed by a conventional method using a commercially available nuclear magnetic resonance apparatus.
  • ⁇ Method of classifying multiple objects into two or more clusters As the “method for classifying a plurality of objects into two or more clusters” of the present invention (hereinafter also referred to as “classification method of the present invention”), For each stool sample obtained from a plurality of subjects, two or more kinds of substances are identified by performing the above-described identification / measurement method of the present invention, and the concentration, composition or ratio of the two or more kinds of substances Measuring step Q: and Cluster analysis is performed on the concentration, composition, or ratio data of the two or more substances obtained in the step Q, and the plurality of objects are classified into two or more clusters according to the similarity of the substance profile S: As long as it contains, there is no particular limitation.
  • the “subject” in the classification method of the present invention means an organism that is a collection source of a stool sample. Although it does not restrict
  • the “cluster” classified in the classification method of the present invention is the presence or absence of any one or two or more (preferably one) substance among the one or two or more kinds in the stool sample, and the concentration is high or low.
  • step Q in the classification method of the present invention two or more substances are identified by performing the above-described identification and measurement method of the present invention for each stool sample obtained from a plurality of subjects, and There is no particular limitation as long as it is a step of measuring the concentration, composition or ratio of two or more substances.
  • step S in the classification method of the present invention, a cluster analysis is performed on the data of the concentration, composition, or ratio of the two or more substances obtained in step Q, and the plurality of objects are determined according to the similarity of the substance profiles.
  • the method of cluster analysis in step S is not particularly limited as long as a plurality of objects can be classified into two or more clusters, and may be hierarchical clustering or division optimization clustering.
  • Preferable examples of the optimization clustering include PAM clustering (partitioning around medoid clustering). These cluster analyzes can be performed by commercially available software.
  • “Similarity of substance profile” in the above step S is the kind of two or more kinds of substances identified in the above step Q, and the concentration, composition or ratio of two or more kinds of substances measured in the above step Q. Degree of similarity between one object and another object. Such similarity can be evaluated by commercially available cluster analysis software or the like.
  • the number of clusters to be classified is not particularly limited, for example, the number of clusters derived based on Calinski-Harabaszbas (CH) index can be preferably cited. However, when an error occurs when dividing into the number of clusters derived based on CH index, it can be preferably cited that the number of clusters is one more than the number of clusters derived.
  • CH index Calinski-Harabaszbas
  • the classification method of the present invention may not further include the step R between the step Q and the step S, but may further include the step R.
  • the step R is not particularly limited as long as it is a step of standardizing data on the concentration, composition or ratio of the two or more substances obtained in the step Q. Standardization of such data can be performed using commercially available software or the like.
  • a PBS solution was added to the precipitate after removing the supernatant a at a rate of 100 ⁇ L per 10 mg of stool sample, and the mixture was stirred with a vortex mixer, and then the supernatant (supernatant b) was recovered.
  • the supernatant a and the supernatant b were each subjected to protein removal using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa, and the filtrate diluted twice with MilliQ water was used for measurement.
  • Extracted sample 1 was obtained by adding the concentrations obtained from supernatant a and supernatant b after the measurement.
  • step [5] 100 ⁇ L of PBS solution is added to 10 mg of stool sample to the precipitate after removing supernatant b, and the mixture is stirred with a vortex mixer, and then 10,800 ⁇ g at 10 Centrifuged for minutes. Thereafter, the washing step for removing the supernatant was repeated twice to remove extracellular metabolites and internal standard substances. Add 100 ⁇ L of 50% methanol solution / MilliQ water containing 3 types of internal standard substances, 3 mm zirconia beads (TOMY) 3 pieces, and about 0.1 g of 0.1 mm zirconia beads (TOMY) to the precipitate.
  • TOMY 3 mm zirconia beads
  • the cells were disrupted by stirring at 1,500 rpm for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 17,800 ⁇ g for 5 minutes to recover the supernatant (“extracted sample 2”).
  • the extracted sample 2 was subjected to protein removal using an ultrafiltration filter having a molecular weight cut off of 5 kDa, and the filtrate was dried at 40 ° C. for 3 hours with a vacuum dryer (manufactured by LABCONCO), and then re-dissolved in 50 ⁇ L of MilliQ water. The dissolved one was used for measurement.
  • the extracted sample 5 was subjected to protein removal using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa, and the filtrate was dried at 40 ° C. for 3 hours with a vacuum dryer (manufactured by LABCONCO), and then redissolved in 50 ⁇ L of MilliQ water. What was done was used for the measurement.
  • CE-TOFMS 1-1-2 Metabolite Measurement and Analysis by CE-TOFMS Extracted samples were measured in the positive ion mode of CE-TOFMS (Agilent Technologies). The measurement by CE-TOFMS is described in the literature (Hirayama, A., et al. "Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry.” Cancer research; 69 (11) 2009, pp. 4918-4925.). The data measured by CE-TOFMS is the analysis software Master Hands (Sugimoto, M., et al.
  • Cluster I 45 types of metabolites (Table 2) were classified.
  • Such metabolite group of cluster I was detected at the highest concentration in extract sample 4 (with bead crushing treatment).
  • This cluster I contained 15 amino acids and 3 dipeptides.
  • the metabolite of cluster I tended to be detected at a higher concentration in extraction sample 4 (with bead crushing treatment) than in extracted sample 3 (without bead crushing treatment) (FIG. 3).
  • these metabolites are also present outside the cells, but a certain amount is also present in the cells, and it is thought that the amount detected was increased by crushing the cells with beads.
  • these metabolites of cluster I tend to be detected at a higher concentration in extracted sample 4 (extracted with PBS) than extracted sample 5 (extracted with methanol), and are therefore less likely to elute into methanol. Was shown (FIG. 3).
  • Such a cluster II metabolite group was detected at a high concentration particularly in the extracted sample 5. Since these metabolites tend to be extracted at the highest concentration under the condition that the beads are crushed and methanol is added, they are considered to be metabolites that are abundant in bacterial cells and easily dissolved in methanol.
  • This cluster contained nucleic acid components such as guanine, cytidine, and adenosine, and vitamins such as thiamine and pyridoxal.
  • Cluster 52 contains 52 types of metabolites (Table 4).
  • Such a cluster III metabolite group had a small detection amount in the extraction sample 2 and was detected to the same extent in the extraction samples 1 and 3 to 5. Moreover, since there was little difference in the detection amount in the extraction sample 3 (without bead crushing treatment) and the extraction sample 4 (with bead crushing treatment), it was shown that these metabolites are present in the cells in a small amount. In addition, comparing extracted sample 4 (extracted with PBS) and extracted sample 5 (extracted with methanol), there is no significant difference in the detected concentration. It was shown that there is.
  • Cluster 21 was classified into 21 types of metabolites (Table 5).
  • extraction sample 2 detects metabolites contained in bacterial cells that are present in feces but are not lysed. However, the concentration of metabolite detected in extraction sample 2 is generally low. Therefore, it is considered that the amount of metabolites contained in such cells is very small compared to the whole.
  • the results of hierarchical clustering showed that the extracted sample 1 and the extracted sample 3 are similar.
  • the difference between the extraction methods of the extraction sample 1 and the extraction sample 3 is that the extraction sample 3 was stirred while the extraction sample 1 was not stirred, and the conditions such as the extraction solvent were the same.
  • the beads of the extraction sample 3 were not used, it was considered that the cells were not crushed.
  • the results of this study show that fecal metabolites are mainly present outside the cells, and as a result, extraction sample 1 and extraction sample 3 are considered to have similar extraction conditions.
  • Extraction sample 4 was the method by which similar metabolite profiles were obtained following extraction sample 1 and extraction sample 3.
  • the extracted sample 3 and the extracted sample 4 had similar metabolite profiles except for amino acids belonging to cluster I, although there was a difference in the presence or absence of bead crushing.
  • Extraction sample 5 was classified into a different cluster from extraction sample 1, extraction sample 3, and extraction sample 4.
  • Extraction sample 1, strip extraction sample 3 and extraction sample 4 do not contain methanol in the solvent, but extraction sample 5 contains methanol in the solvent, so that the difference in solvent may affect the metabolite profile from which the difference is obtained. Indicated.
  • Extraction sample 3 and extraction sample 4 differ in the presence or absence of crushing by beads, and extraction sample 4 and extraction sample 5 differ in the presence or absence of methanol addition, but the difference between extraction sample 3 and extraction sample 4 is greater than that of extraction sample 4 and extraction sample 4. This indicates that the difference between the extracted samples 5 is larger, and it was shown that the presence or absence of methanol had a greater effect than the presence or absence of bead crushing.
  • the cation metabolite profile in feces obtained by CE-TOFMS is affected by the presence or absence of disruption of cells by the solvent and beads used for extraction.
  • Comparison of the metabolite profiles of the supernatant fraction, the precipitate fraction, and the whole fecal suspension revealed that various metabolites were contained in the supernatant fraction.
  • the amino acid concentration was particularly susceptible to the extraction conditions, and the cells were crushed and tended to be detected at the highest concentration in the extracted sample 4 to which no methanol was added.
  • the most types of metabolites were detected in the extracted sample 5 in which methanol was added and the cells were crushed using beads.
  • Metabolite extraction 2 Based on the conditions under which the extracted sample 5 was obtained, further examination of metabolite extraction conditions was performed. That is, similarly to the conditions under which the extracted sample 5 was obtained, when metabolites were extracted using methanol as a solvent (hereinafter referred to as “methanol method”), and when metabolites were extracted using methanol and chloroform as solvents ( Hereinafter, the difference in detectable metabolites was analyzed by CE-TOFMS.
  • the extracted sample Me was subjected to protein removal using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa, and the filtrate was dried at 40 ° C. for 3 hours with a vacuum dryer (manufactured by LABCONCO), and then two kinds of internal standard substances (200 ⁇ M). 100 ⁇ L of MilliQ water containing 3-aminopyrrolidine and 200 ⁇ M trimesate) was added, and the mixture was thoroughly stirred and redissolved and used for the measurement.
  • 2-1-2 Methanol / Chloroform Method Three types of internal standard substances (20 ⁇ M methionine sulfone, 20 ⁇ M D-camphor) were added to 10 mg of the stool sample stirred in step [2] of the “2-1-1 methanol method”. 500 ⁇ L of 100% methanol containing 10-sulfonic acid [CSA] and 20 ⁇ M 2-morpholinoethanesulfonic acid [MES]) and 0.1 g of 0.1 mm zirconia beads (TOMY) were added, and 500 ⁇ L of chloroform was further added. And after adding 200 microliters MilliQ water, the cell crushing process was performed by stirring for 10 minutes at 1,500 rpm using Shake master NEO (made by a biomedical science company).
  • Shake master NEO made by a biomedical science company.
  • extracted sample MeCr was subjected to protein removal using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa.
  • the filtrate was dried at 40 ° C. for 3 hours with a vacuum dryer (manufactured by LABCONCO), and then two kinds of internal standard substances (200 ⁇ M). 100 ⁇ L of MilliQ water containing 3-aminopyrrolidine and 200 ⁇ M trimesate) was added, and the mixture was thoroughly stirred and redissolved and used for the measurement.
  • the profile of the metabolite extracted by the methanol method was very similar to the profile of the metabolite extracted by the methanol / chloroform method.
  • the concentration of metabolites detected by the methanol method was generally higher than that of the methanol / chloroform method. That is, the metabolites in which a difference of 1.5 times or more was recognized between the two methods were the 29 types of substances shown in Table 8. Among them, the metabolites with higher concentrations detected by the methanol / chloroform method were detected. While there were 4 types of substances, there were 25 types of metabolites with higher concentrations detected by extraction with the methanol method (Table 8).
  • the values in the second and third columns from the left in Table 8 are the concentrations of the respective metabolites detected in “Me (extracted sample Me)” and “MeCr (extracted sample MeCr)” (relative values to the internal standard substance). ).
  • the numerical values in the first column from the right in the table indicate the concentration of each metabolite detected in “MeCr (extracted sample MeCr)” with respect to the concentration of each metabolite detected in “Me (extracted sample Me)”.
  • the concentration ratio (MeCr / Me) is shown.
  • the composition of the human intestinal microflora is considered to be divided into two or three enterotypes according to the characteristics of eating habits. Therefore, stool samples were collected 9 times for each subject from 18 healthy subjects, and all the metabolites detected in accordance with the method described in the section “2-1-1 Methanol Method” were used. According to the method described in Arumugam, M., et al. “Enterotypes of the human gut microbiome.” Nature; 473 (7346), 2011, pp.174-180.), Enterotypes by PAM clustering were classified. As a result of performing PAM clustering by setting the number of clusters suitable for classification to 3, it was possible to classify into Butyrate (butyric acid), Cholate (cholic acid), and Thiamine (vitamin B1) groups (FIG. 5).
  • extracted sample PBS solution was collected.
  • the extracted sample PBS solution was subjected to protein removal using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa, and the filtrate was dried at 40 ° C. for 3 hours with a vacuum dryer (manufactured by LABCONCO). 20 ⁇ L of MilliQ water containing 200 ⁇ M 3-aminopyrrolidine and 200 ⁇ M trimesate) was added, and the mixture was well stirred and redissolved.
  • concentration ratio of this solution is 15 times, and the PBS concentration of this solution is 15 ⁇ PBS. . MilliQ water was added to this solution, and the concentration ratio of this solution from the initial suspension of the stool sample was 10 times ( ⁇ 10), 5 times ( ⁇ 5), 1 time ( ⁇ 1), 0.2 Diluted to double ( ⁇ 0.2). These diluted solutions were analyzed by CE-TOFMS.
  • FIG. 6 shows the number of types of metabolites detected in each dilution.
  • a sample with a concentration ratio of 5 times or more PBS ⁇ 5, ⁇ 10, ⁇ 15
  • PBS ⁇ 5, ⁇ 10, ⁇ 15 a sample with a concentration ratio of 5 times or more
  • FIG. 7 indicates a metabolite in which an increase in concentration was observed when the stool sample was stored at room temperature for 1 to 2 days
  • “II” represents a stool sample stored at room temperature for 1 day
  • “III” indicates that the concentration decreased when stool samples are stored at room temperature for 1-2 days. Indicates the recognized metabolite.
  • the concentration of 10 kinds of metabolites such as Butanoate (Butyrate) and Propionate increased more than twice
  • concentration of 10 kinds of metabolites such as Cholate has a concentration of 1/2. It decreased to less than double (Fig. 7).
  • the rate of increase / decrease in the concentration of the metabolite was higher when the storage period was 2 days than when stored at ⁇ 80 ° C.
  • stool samples were prepared from various organic solvents (100% methanol [100% MeOH], 50% methanol [50% MeOH], or methanol / chloroform [MeOH / CHCl 3 ]).
  • Method C a method of extracting a metabolite with a methanol / chloroform solution (“Method C” in Table 9) after storing a stool sample in the absence of an organic solvent was performed. Also, in each extraction method, immediately after adding a stool sample into various organic solvents (Methods 1 to 4), or immediately after storing the stool sample in the absence of an organic solvent (Method C), a sample was controlled. Used for. A detailed method is shown below.
  • one or more substances can be efficiently extracted from a stool sample.
  • more types of substances can be extracted from a stool sample. Therefore, according to the present invention, a method for extracting a substance in a stool sample suitable for performing analysis such as metabolome analysis using mass spectrometry or nuclear magnetic resonance spectroscopy, metagenome analysis using a next-generation sequencer, etc. Can be provided.

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Abstract

本発明は、糞便試料から物質を抽出する、より実用的な方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することを目的とする。糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、以下の工程Ａ～Ｃを含むことを特徴とする。 工程Ａ：以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程：　（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：　（ｇ）水からなる溶媒： 工程Ｂ：前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程：及び、 工程Ｃ：前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程：

Description

糞便試料から物質を抽出する方法
　本発明は、糞便試料から物質を抽出する方法に関し、特に、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法等に関する。
　ヒトの腸管内には数百種類以上にも及ぶ腸内細菌が棲息しており、ヒト一人の腸内に棲息している腸内細菌の合計重量は約１．５ｋｇにもなる。腸内におけるこの腸内細菌の群衆は腸内細菌叢と呼ばれている。腸内細菌叢は、難消化性多糖の分解、必須栄養素であるビタミン等の産生、免疫システムの構築、病原性菌の増殖抑制などの役割を担い、人間の恒常性の維持に重要な存在である。しかし一方で、腸内細菌叢のバランスが崩れると、大腸がんなどをはじめとする様々な腸疾患（非特許文献１、２）、２型糖尿病などの代謝疾患（非特許文献３）、肥満の発症（非特許文献４）などにつながることが示唆されている。このように、腸内細菌叢は、人体に好影響も悪影響も及ぼし得る存在である。
　近年では、健康なヒトの便懸濁液を偽膜性大腸炎患者に移植するという便移殖療法により、抗生物質を用いて治療するよりも高い治療効果が得られたことが報告されていることから、腸内細菌叢や腸内環境の改善による、疾患治療の可能性も提示されている（非特許文献５）。このように腸内細菌叢とわれわれの健康との関連性が指摘されているが、腸内細菌叢が人体に影響を与えるメカニズムについては未だ不明瞭な点が多い。近年、腸内細菌叢のメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析により、腸内細菌叢の構成や遺伝子情報を得ることで、腸内細菌叢の生理学的機能が明らかになりつつある。しかし、腸内細菌叢の生理的機能の詳細を議論するためには、それら遺伝子機能だけでなく、宿主と腸内細菌とのやり取りの結果として生じる腸内の代謝物質情報も加味して議論する必要があると考えられることから、腸内代謝物質のメタボローム研究が近年注目されている。腸内代謝物質は宿主と腸内細菌の両者による代謝の結果として産生され、さらに、腸内細菌と宿主とが共通に利用するが、種々の先行研究から腸内細菌特有の代謝物質が宿主の生体応答に影響を与えることも徐々に明らかになってきた。例えば、腸内細菌叢から産生される酪酸は、宿主の制御性Ｔ細胞の分化を誘導し、腸管の炎症が軽減することが報告されており（非特許文献６）、また、酢酸を含む短鎖脂肪酸は全身のエネルギー代謝を活性化し肥満を防止することも報告されている（非特許文献７）。一方で、腸内細菌が一次胆汁酸を分解して産生する二次胆汁酸は、肝臓がんの発症を促進することも報告されている（非特許文献８）。このように、腸内細菌叢から産生される代謝物質には正負両面の機能がある。腸内代謝物質のメタボローム解析は、「宿主－腸内細菌叢間相互作用メカニズムの解明」、「腸内細菌叢から産生される代謝物質の新規機能物質の探索」、「腸内代謝物質プロファイルによる腸内環境の評価」などに有用だと考えられる。
　非特許文献９には、マウスの糞便をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline：PBS）溶液に溶解し、その上清をキャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析法（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ：Capillary Electrophoresis-Time of Flight Mass Spectrometry）で測定することで代謝物質を計測する方法が記載されている。しかしながら、腸内代謝物質の研究報告は少なく、腸内代謝物質の測定手法は確立しているとはいいがたい。
　また、糞便試料ではなく、動物細胞や血液などの試料から代謝物質を抽出する一般的な方法として、代謝酵素を失活させるためにメタノールやクロロホルムを用いる方法が知られており、例えば、メタノール、あるいは、水／メタノールの混合溶媒を用いて代謝物質を抽出する方法（非特許文献１０）や、クロロホルム／メタノールの混合溶媒を使用した液液分配により代謝物質を抽出する方法（非特許文献１１）などがよく用いられている。また、特許文献１には、メタノール、クロロホルム、水の共存下で、細胞から代謝物質を抽出する方法が記載されている。さらに、細菌や植物などの細胞壁をもつ細胞から代謝物質を抽出する場合は、ジルコニアビーズなどにより細胞を物理的に破砕し、メタノールなどの溶媒で抽出する方法が用いられている（非特許文献１２）。
特開２００８－００５７７８号公報
Arthur, J.C., et al. "Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. " Science;338(6103), 2012, pp.120-123. Garrett, W.S., et al." Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system." Cell;131(1),2007, pp.33-45. Vijay-Kumar, M., et al. "Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll-like receptor 5." Science;328(5975), 2010, pp.228-231 Turnbaugh, P.J., et al. "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest." Nature;444(7122), 2006, pp.1027-1031. van Nood, E., et al. "Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile." The New England journal of medicine;368(5), 2013, pp.407-415. Furusawa, Y., et al. "Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells." Nature;504(7480),2013, pp.446-450. Kimura, I., et al. "The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43." Nature communications 2013;4:1829. Yoshimoto, S., et al. "Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome." Nature;499(7456), 2013,pp.97-101. Matsumoto, M., et al. "Impact of intestinal microbiota on intestinal luminal metabolome." Scientific reports 2012;2:233. Dietmair, S., et al. "Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: development of a metabolite extraction protocol." Analytical biochemistry;404(2),2010, pp.155-164. Kuwabara, H., et al. "Altered metabolites in the plasma of autism spectrum disorder: a capillary electrophoresis time-of-flight mass spectroscopy study." PloS one 2013;8(9):e73814. Wang, X., et al. "Evaluation and optimization of sample preparation methods for metabolic profiling analysis of Escherichia coli." Electrophoresis 2015.
　本発明の課題は、糞便試料から物質を抽出する、より実用的な方法を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法において、
（Ａ）以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
　　（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｇ）水からなる溶媒：
（Ｂ）前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
（Ｃ）前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含むと、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　また、本発明者らは、水性溶媒と、親水性有機溶媒及び／又は疎水性有機溶媒とを併用すると、より多種の物質を抽出できることを見いだした。さらに、本発明者らは糞便試料を溶媒中で懸濁する際に、ビーズを用いて破砕・懸濁処理すると、アミノ酸等の代謝物質がより効率良く抽出できることを見いだした。また、本発明者らは、糞便試料から抽出した物質をキャピラリー電気泳動やクロマトグラフィーで分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度を測定し、その測定データについてクラスター解析を行ったところ、物質プロファイルのうち、特徴的な物質ごとに、クラスター（グループ）に分類できることを見いだした。本発明者らは、これらのことなどをさらに見いだし、本発明を完成するに至った。
　また、本発明者らは、水性溶媒として水を用いた場合と、ＰＢＳ溶液を用いた場合を比較したところ、水を用いた方がより多数種の代謝物質を検出することができることを見いだした。また、ＰＢＳ溶液を用いた場合に、サンプルを濃縮して質量分析すると、塩濃度の影響で電流が過剰に流れてしまい、正確な測定ができなくなることも本発明者らは見いだした。本発明者らは、これらのことなどをさらに見いだし、本発明を完成するに至った。
　また、本発明者らは、糞便試料を採取した後、その糞便試料から物質の抽出を行うまでの間、冷凍せずにその糞便試料を保存する場合に、その糞便試料を以下の（ｈ）、（ｉ）のいずれかの溶媒中で保存すると、保存中のその糞便試料における代謝物質プロファイルの変動が抑制されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　　（ｈ）水性溶媒及び高濃度（例えば７５重量％以上）の親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　すなわち、本発明は、
（１）糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
　　（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｇ）水からなる溶媒：
　前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
　前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含むことを特徴とする、物質を抽出する方法や、
（２）工程Ａが、（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ－１であることを特徴とする上記（１）に記載の物質を抽出する方法や、
（３）溶媒が水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が１０～５０重量％の範囲内であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の物質を抽出する方法や、
（４）工程Ａ－１におけるビーズの直径が、０．０２～０．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の物質を抽出する方法や、
（５）工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いることを特徴とする上記（１）～（４）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（６）工程Ｘにおけるビーズの直径が、０．６～１５ｍｍの範囲内であることを特徴とする上記（５）に記載の物質を抽出する方法や、
（７）溶媒が、さらに疎水性有機溶媒を含むことを特徴とする上記（３）～（６）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（８）工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙをさらに含み、該工程Ｙで保存後の糞便試料を工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いることを特徴とする上記（１）～（４）及び（７）のいずれかに記載の物質を抽出する方法：
　　（ｈ）水性溶媒及び７５重量％以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：や、
（９）水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする上記（１）～（８）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（１０）親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする上記（１）～（９）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（１１）疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする上記（１）～（１０）のいずれかに記載の物質を抽出する方法に関する。
　また、本発明は、
（１２）糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
　上記（１）～（１１）のいずれかに記載の方法で抽出した前記１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：
　を含むことを特徴とする、方法や、
（１３）複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法であって、
　複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記（１２）に記載の方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
　前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
　を含むことを特徴とする、方法や、
（１４）工程Ｑと工程Ｓの間に、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Ｒをさらに含み、
　前記工程Ｒで標準化したデータを、工程Ｓにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする上記（１３）に記載の方法に関する。
　本発明によれば、糞便試料から１種又は２種以上の物質（好ましくは腸内の代謝物質）を効率的に抽出することができる。また、本発明によれば、糞便試料からより多数の種類の物質を抽出することができる。したがって、本発明によれば、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することができる。
代謝物質抽出法のフローチャートを示す図である。 抽出サンプル１～５において検出された（陽イオン性）代謝物質のプロファイルを示す図である。サンプル及び代謝物質の階層的クラスタリングはピアソンの相関係数を用いて行った。ヒートマップの上部に記載された文字列のうち、ハイフンの前の文字列は抽出サンプルの種類（抽出サンプル１～５）を表し、ハイフンの後ろの数字は用いた糞便の違いを表す。ヒートマップは各代謝物質のＺスコアを表し、黒は高濃度を、薄い灰色は低濃度を、白は検出限界以下を表す。 抽出サンプル３～５において検出されたアミノ酸１９種（グルタミン［Ｇｌｎ］、アラニン［Ａｌａ］、アスパラギン［Ａｓｎ］、グリシン［Ｇｌｙ］、イソロイシン［Ｉｌｅ］、ロイシン［Ｌｅｕ］、リシン［Ｌｙｓ］、メチオニン［Ｍｅｔ］、フェニルアラニン［Ｐｈｅ］、セリン［Ｓｅｒ］、チロシン［Ｔｙｒ］、トリプトファン［Ｔｒｐ］、トレオニン［Ｔｈｒ］、バリン［Ｖａｌ］、アスパラギン酸［Ａｓｐ］、グルタミン酸［Ｇｌｕ］、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、プロリン［Ｐｒｏ］、及びアルギニン［Ａｒｇ］）の濃度を比較した結果を示す図である。３組の棒グラフは、左から順に、抽出サンプル３、４、及び５（条件３、４、及び５）において検出された各アミノ酸濃度（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示す。 抽出サンプル１～５において検出された代謝物質数を比較した結果を示す図である。縦軸は各抽出条件で検出された代謝物質の種類数（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示し、横軸は各抽出条件を示す。 抽出サンプルＭｅ及び抽出サンプルＭｅＣｒにおいて検出された代謝物質を用いて、ＰＡＭ（Partitioning Around Medoids）クラスタリングを行った結果を示す図である。図中の［１］～［３］は、それぞれButyrate（酪酸）、Cholate（コール酸）及びThiamine（ビタミンＢ１）を示し、［１］～［３］を中心とした楕円は、それぞれ酪酸グループ、コール酸グループ及びビタミンＢ１グループを示す。 ＰＢＳ溶液又は水で抽出したサンプルにおいて、サンプルの濃縮率をそれぞれ変化させた場合に検出された代謝物質数を比較した結果を示す図である。縦軸は各抽出条件で検出された代謝物質の種類数（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示し、横軸は抽出条件及び濃縮率を示す。 糞便試料を室温で１～２日間保存したときに、－８０℃保存に対する代謝物質プロファイルの変動を解析した結果を示す図である。図中の「I」は、糞便試料を室温で１～２日間保存したときに、濃度増加が認められた代謝物質を示し、「II」は、糞便試料を室温で１日間保存したときに、濃度増加し、かつ室温で２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示し、「III」は、糞便試料を室温で１～２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示す。 採便直後に－８０℃で保存、もしくは室温または４℃で１～２日間保存した糞便試料から、メタノール・クロロホルム法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。 採便直後に－８０℃で保存、もしくは室温または４℃で１～２日間保存した糞便試料から、５０％メタノール法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。 採便直後に－８０℃で保存、もしくは室温または４℃または－２０℃で１～２日間保存した糞便試料から、メタノール・クロロホルム法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。 糞便試料を、各種有機溶媒（１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、５０％メタノール［５０％ＭｅＯＨ］、又は、メタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中もしくは有機溶媒非存在下で、室温、４℃もしくは－８０℃で２日間保存し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。プロットの形は保存に用いた有機溶媒の種類、色は保存温度を示している。 図１１のうち、糞便試料を、１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、またはメタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中もしくは有機溶媒非存在下で、室温、４℃もしくは－８０℃で２日間保存した際に検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。プロットの形は保存に用いた有機溶媒の種類、色は保存温度を示している。
＜糞便試料から物質を抽出する方法＞
　本発明の「糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法」（以下、「本発明の抽出方法」とも表示する。）としては、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
　　（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｇ）水からなる溶媒：
　前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
　前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含んでいる限り、特に制限されない。
（糞便試料）
　本発明における「糞便試料」の由来となる生物種としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
（物質）
　本発明における「物質」としては、糞便試料中に含まれる物質である限り特に制限されないが、親水性物質、親油性物質、両親媒性物質が挙げられ、より詳しくは、酸性、中性又は塩基性の親水性物質、酸性、中性又は塩基性の親油性物質、酸性、中性又は塩基性の両親媒性物質が挙げられる。また、本発明における好ましい「物質」としては、腸内代謝物質；ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸；コール酸やデオキシコール酸などの胆汁酸；酢酸やプロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸；乳酸やコハク酸などの有機酸；アミノ酸；単糖や二糖、三糖などの糖質；インドキシル硫酸などの尿毒素；脂肪酸や中性脂肪などの脂質；等が挙げられる。
　本明細書における「腸内代謝物質」とは、糞便試料の由来となる生物（宿主）及び／又は腸内細菌が外界から取り入れた物質をもとにして合成及び／又は分解して生成する物質であって、宿主の腸内（好ましくは大腸内）に存在している又は存在していた物質を意味する。腸内代謝物質として具体的には、炭素数２～６の短鎖脂肪酸；アミノ酸；ビタミン類；ポリアミン；核酸；胆汁酸；糖質；尿毒素；等が挙げられ、中でも、後述の表２～表５に記載された物質が好ましく挙げられる。本発明の抽出方法によれば、糞便試料から腸内代謝物質をより網羅的に抽出することができる。
（工程Ａ）
　本発明の抽出方法における工程Ａとしては、上記（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程である限り特に制限されない。
（溶媒）
　これらの溶媒における「水性溶媒」としては、精製水等の水；緩衝水溶液；ｐＨ調整剤を含む水溶液；等が挙げられるが、より多種類の腸内代謝物質を抽出する観点から、水が好ましい。また、塩を含む緩衝水溶液を用いて抽出した抽出液を濃縮して質量分析法に供した場合、測定の際に過剰な電流が流れて測定が妨げられる可能性があるため、上記の水性溶媒としては、緩衝水溶液よりも、水が好ましい。緩衝水溶液や、ｐＨ調整剤を含む水溶液のｐＨとしては、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、ｐＨ４～１０の範囲内や、ｐＨ６～８の範囲内とすることができる。上記の緩衝水溶液としては、例えば、リン酸塩緩衝水溶液、トリス－塩酸塩緩衝水溶液、グッド緩衝水溶液等を挙げることができる。これらの水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
　本明細書において、「親水性有機溶媒」とは、水への溶解度が２０ｇ／１００ｇ（２０℃）超の有機溶媒を意味する。上記の「親水性有機溶媒」としては、親水性の有機溶媒である限り特に制限されず、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、及びアセトンからなる群から選択される１種又は２種以上を好ましく挙げることができ、中でも、メタノール及びエタノールをより好ましく挙げることができ、中でも、メタノールをさらに好ましく挙げることができる。これらの親水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
　本明細書において、「疎水性有機溶媒」とは、水への溶解度が２０ｇ／１００ｇ（２０℃）以下の有機溶媒を意味する。上記の「疎水性有機溶媒」としては、疎水性の有機溶媒である限り特に制限されず、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、クロロホルム、ヘキサン、及びジエチルエーテルからなる群から選択される１種又は２種以上を好ましく挙げることができ、中でも、クロロホルム及びヘキサンをより好ましく挙げることができる。これらの疎水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
　上記（ａ）～（ｆ）の溶媒としては、以下の（ａ１）～（ｆ１）の溶媒を好ましく挙げることができ、以下の（ａ２）～（ｆ２）の溶媒をより好ましく挙げることができる。
（ａ１）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｂ１）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、親水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｃ１）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ１）親水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｅ１）疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｆ１）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒を含まない溶媒：
（ａ２）水性溶媒及び親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｂ２）水性溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｃ２）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｄ２）親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｅ２）疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｆ２）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
　上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１０～９０重量％の範囲内であり、かつ、親水性有機溶媒の含量が９０～１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１０～５０重量％の範囲内であり、かつ、親水性有機溶媒の含量が９０～５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９～５：１の範囲内を好ましく挙げることができる。
　上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における好適な態様としては、メタノール濃度が１０～９０重量％の範囲内のメタノール水溶液を挙げることができ、中でも、メタノール濃度が１０～５０重量％の範囲内のメタノール水溶液を好ましく挙げることができ、中でも、メタノール濃度が５０重量％のメタノール水溶液をより好ましく挙げることができる。
　上記の（ｂ）、（ｂ１）及び（ｂ２）の溶媒における水性溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１０～９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０～１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１０～５０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０～５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ｂ）、（ｂ１）及び（ｂ２）の溶媒における水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９～５：１の範囲内を好ましく挙げることができる。
　上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が５～８５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が５～８５重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が５～８５重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が５～６０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が１０～７０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１０～７０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が５～３０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が３０～５０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が３０～５０重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。また、上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比や、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比や、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができる。水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９～４：６の範囲内を好ましく挙げることができ、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９～４：６の範囲内を好ましく挙げることができ、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、３：７～７：３の範囲内を挙げることができる。
　上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における好適な態様としては、水の含量が５～８５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が５～８５重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が５～８５重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水の含量が５～６０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が１０～７０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１０～７０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水の含量が５～３０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が３０～５０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が３０～５０重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。
　上記の（ｄ）及び（ｄ１）の溶媒における親水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、親水性溶媒の含量が８０～１００重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、親水性有機溶媒の含量が９５～１００重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。
　上記の（ｅ）及び（ｅ１）の溶媒における疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、疎水性溶媒の含量が８０～１００重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、疎水性有機溶媒の含量が９５～１００重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。
　上記の（ｆ）、（ｆ１）及び（ｆ２）の溶媒における親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、親水性溶媒の含量が１０～９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０～１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、親水性溶媒の含量が３０～７０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が７０～３０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ｆ）、（ｆ１）及び（ｆ２）の溶媒における親水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば１：９～９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、３：７～７：３の範囲内を挙げることができる。
（溶媒中に糞便試料を懸濁する方法）
　上記（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に糞便試料を懸濁する際には、上記溶媒中に上記糞便試料を添加して懸濁してもよいし、上記溶媒を上記糞便試料に添加して懸濁してもよい。上記溶媒中に上記糞便試料を懸濁する方法としては特に制限されず、上記溶媒及び上記糞便試料を振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が挙げられ、中でも、上記溶媒及び上記糞便試料を、超音波式、圧力式等のホモジナイザーで攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法や、上記溶媒及び上記糞便試料（好ましくはこれらを含む容器）をボルテックスミキサーで振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が好ましく挙げられる。
（工程Ａ－１）
　糞便試料からより多種の物質を抽出する観点や、糞便試料中の腸内細菌内からより多種の物質をより高濃度で抽出する観点から、上記工程Ａの中でも、以下の工程Ａ－１が好ましく挙げられる。
工程Ａ－１：上記（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ－１：
　上記の背景技術にも記載したように、近年、腸内細菌叢のメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析により、腸内細菌叢の構成や遺伝子情報を得ることで、腸内細菌叢の生理学的機能が明らかになりつつある。
　一方、ビーズでの破砕処理を行うことによって、腸内細菌内に蓄積している代謝物質を含めた代謝物質プロファイルを取得できれば、より精度の高いメタボローム解析を行うことができる。この高精度のメタボローム解析の結果と、前述の遺伝子情報を統合すれば、腸内細菌叢の生理的機能をより詳細に解明することができると考えられる。
　上記工程Ａ－１における溶媒中で、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法としては特に制限されず、上記溶媒と上記糞便試料とビーズとを共存させた状態で、上記溶媒、上記糞便試料及び上記ビーズを振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法が挙げられ、中でも、上記溶媒、上記糞便試料及び上記ビーズ（好ましくはこれらを含む容器）をボルテックスミキサーや、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）等の細胞破砕装置で振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法が好ましく挙げられる。
　上記工程Ａ－１におけるビーズの材質としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されないが、ジルコニア（二酸化ジルコニウム）、ジルコニウム、石英、シリカ、ステンレス、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化マンガン、マグネシウム、チタン、マンガンなどが挙げられる。
　上記工程Ａ－１におけるビーズの形状としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されないが、略球状を挙げることができ、球状を好ましく挙げることができる。
　上記工程Ａ－１におけるビーズの大きさとしては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されず、例えば、ビーズの最長部分の長さとしては、０．０２～０．５ｍｍの範囲内、好ましくは０．０５～０．３ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。ビーズが球状の場合、ビーズの直径としては、０．０２～０．５ｍｍの範囲内、好ましくは０．０５～０．３ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。
　上記工程Ａ－１で用いるビーズは、市販されているものを用いることができる。
　上記工程Ａ－１におけるビーズの添加量としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されず、例えば、溶媒１ｍＬ当たり１ｍｇ～１ｇの範囲内、好ましくは１０～８００ｍｇの範囲内、より好ましくは４０～６００ｍｇの範囲内を挙げることができる。
　上記工程Ａ－１におけるビーズとして、上記工程Ａ－１に関して例示したビーズと共に、後述の工程Ｘに関して例示するビーズを併用してもよい。
（工程Ｘ）
　本発明の抽出方法は、以下の工程Ｘをさらに有していなくてもよいが、乾燥糞便小片を得ることによって、抽出に用いる各糞便試料の量をできるだけ揃えることができる点で、工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、以下の工程Ｘをさらに有していることが好ましい。
工程Ｘ：乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘ：
　本発明の抽出方法が、工程Ｘをさらに有している場合は、工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として、上記工程Ｘで得られた乾燥糞便小片を用いる。
　上記工程Ｘにおけるビーズの材質としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、具体的には、上記Ａ－１におけるビーズの材質として列挙されている材質を挙げることができる。上記工程Ｘにおけるビーズの材質は、上記Ａ－１におけるビーズの材質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　上記工程Ｘにおけるビーズの形状としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されないが、略球状を挙げることができ、球状を好ましく挙げることができる。上記工程Ｘにおけるビーズの形状は、上記Ａ－１におけるビーズの形状と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　上記工程Ｘにおけるビーズの大きさとしては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、例えば、ビーズの最長部分の長さとしては、０．６～１５ｍｍの範囲内、好ましくは１．５～９ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。ビーズが球状の場合、ビーズの直径としては、０．６～１５ｍｍの範囲内、好ましくは１．５～９ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。
　上記工程Ｘで用いるビーズは、市販されているものを用いることができる。
　上記工程Ｘにおけるビーズの添加量としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、例えば、糞便試料１０ｍｇ（乾燥重量換算）当たり１ｍｇ～１ｇの範囲内、好ましくは５０～５００ｍｇの範囲内を挙げることができる。
　本発明の抽出方法における上記工程Ａや工程Ａ－１の好適な態様は、抽出の目的とする物質の特性によって異なるが、その特性に応じて好適な態様を選択することができる。例えば、後述の実施例におけるクラスターIIの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ－１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行う方が好ましく、また、溶媒としては水性溶媒だけでなく親水性有機溶媒を併用する方が好ましい。一方、後述の実施例におけるクラスターＩの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ－１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行う方が好ましく、また、溶媒としては親水性有機溶媒を併用しない方が好ましく、水性溶媒のみを用いることが好ましい。また、後述の実施例におけるクラスターIIIの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ－１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行うか否かによる差異はそれほど生じず、また、溶媒として水性溶媒のみを用いるか、親水性有機溶媒を併用するかによる差異もそれほど生じない。
（工程Ｙ）
　本発明の抽出方法は、以下の工程Ｙをさらに有していなくてもよいが、糞便試料を採取した後、その糞便試料から物質の抽出を行うまでの間、冷凍せずにその糞便試料を保存する場合には、保存中のその糞便試料における代謝物質プロファイルの変動を抑制する観点から、工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、以下の工程Ｙをさらに有していることが好ましい。
工程Ｙ：採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙ：
　　（ｈ）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
　　（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
　本発明の抽出方法が、工程Ｙをさらに有している場合は、工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として、上記工程Ｙで保存後の糞便試料を用いる。
　上記工程Ｙの溶媒における「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」の例や、好適な例としては、それぞれ、上記工程Ａの溶媒における「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」で挙げた例や、好適な例を挙げることができる。上記工程Ｙの溶媒で用いる「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」は、上記工程Ａ又は工程Ａ－１の溶媒に用いる「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」とそれぞれ同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　上記（ｈ）、（ｉ）の溶媒としては、以下の（ｈ１）、（ｉ１）の溶媒を好ましく挙げることができ、以下の（ｈ２）、（ｉ２）の溶媒をより好ましく挙げることができる。
（ｈ１）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｉ１）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｈ２）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｉ２）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
　上記（ｈ）の溶媒は、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒であって、溶媒中の親水性有機溶媒の含量が７５重量％以上である溶媒である。上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における親水性有機溶媒の含量としては、７５重量％以上である限り特に制限されないが、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上が挙げられる。また、上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における水性溶媒の含量としては、２５重量％未満である限り特に制限されず、親水性有機溶媒の含量に合わせて適宜設定することができ、例えば２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満などが挙げられる。また、上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における、水性溶媒に対する親水性有機溶媒の重量比としては、３倍より高ければ特に制限されないが、３倍より高く１００倍以下が挙げられる。
　上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における好適な態様としては、メタノール濃度が７５重量％以上（好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上）で１００重量％未満のメタノール水溶液や、１００重量％メタノール溶液を挙げることができ、中でも、１００重量％メタノール溶液をより好ましく挙げることができる。
　上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１～４０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が１０～９５重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が５～６０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１～２５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が２０～９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１０～５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１～１５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が４０～８０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１５～４５重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。また、上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比や、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比や、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、適宜設定することができる。水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比として、例えば１：３０～１：３の範囲内を挙げることができ、中でも、１：２０～１：５の範囲内を好ましく挙げることができ、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：１５～１：１．５の範囲内を挙げることができ、中でも、１：１０～１：２．５の範囲内を好ましく挙げることができ、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば６：１～２：３の範囲内を挙げることができ、中でも、４：１～１：１の範囲内を挙げることができる。
　上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における好適な態様としては、例えば、水の含量が１～４０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が１０～９５重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が５～６０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水の含量が１～２５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が２０～９０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１０～５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水の含量が１～１５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が４０～８０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１５～４５重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。
　上記工程Ｙにおいて、採取した糞便試料を上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する方法としては、かかる糞便試料が、上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中に含まれるようにする方法である限り特に制限されず、例えば、糞便試料に上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒を添加してもよいし、上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒に糞便試料を添加してもよい。
　上記工程（Ｙ）において保存する際の温度としては、特に制限されないが、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制する観点から、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下、さらに好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１５℃以下、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは５℃以下、より好ましくは０℃以下、さらに好ましくは－５℃以下、より好ましくは－１５℃以下、さらに好ましくは－２０℃以下、より好ましくは－４０℃以下、さらに好ましくは－６０℃以下、より好ましくは－８０℃以下が挙げられる。一方、冷凍設備などが使用できず、糞便試料を冷凍状態で保存することができない場合であっても、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制するという本発明の意義がより多く享受する観点から、保存する際の温度として、例えば０℃以上、３℃以上、４℃以上、６℃以上、１０℃以上が挙げられる。
　上記工程（Ｙ）において保存する際の温度範囲としてより具体的には、－９０～４０℃の範囲内、－９０～３０℃の範囲内、－８０～３０℃の範囲内、－８０～２５℃の範囲内、－６０～２０℃の範囲内などが挙げられる。また、本発明の意義がより多く享受する観点で好適な保存温度の範囲としてより具体的には、０～４０℃の範囲内、０～３０℃の範囲内、０～２５℃の範囲内、０～２０℃の範囲内、０～１５℃の範囲内、０～１０℃の範囲内、０～５℃の範囲内、３～２５℃の範囲内、３～２０℃の範囲内、３～１５℃の範囲内、３～１０℃の範囲内、３～５℃の範囲内、４～２５℃の範囲内、４～２０℃の範囲内、４～１５℃の範囲内、４～１０℃の範囲内、４～５℃の範囲内、６～２５℃の範囲内、６～２０℃の範囲内、６～１５℃の範囲内、６～１０℃の範囲内などが挙げられる。
　上記工程（Ｙ）において保存する期間としては、特に制限されず、保存する際の温度等に応じて適宜設定することができ、例えば保存温度が０℃未満の場合は、１分間～１ヶ月間の範囲内、２０分間～３週間の範囲内、１時間～２週間の範囲内などが挙げられ、保存温度が０℃以上である場合は、１分間～７日間の範囲内、２０分間～３日間の範囲内、１時間～２日間の範囲内などが挙げられる。
　工程Ｙで保存後の糞便試料は、工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いることができる。工程Ｙで保存後の糞便試料を、工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いる方法としては、特に制限されず、工程Ｙで保存に用いた溶媒（以下、単に「保存溶媒」とも表示する。）の一部又は全部を、工程Ｙの保存後に除去してもよいし、除去しなくてもよいが、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制する観点から、保存溶媒を除去しないことが好ましい。
　工程Ｙの保存後に保存溶媒を除去しない場合であって、かつ、かかる保存溶媒が上記（ａ）～（ｇ）のいずれかの抽出溶媒である場合は、前記保存溶媒をそのまま抽出溶媒として、上記工程Ａや工程Ａ－１を行ってもよい。また、上記Ｙの保存後に保存溶媒を除去しない場合、その保存溶媒に、水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の溶媒を含有させることによって、保存溶媒を抽出溶媒に変化させることが好ましい。例えば、上記（ｈ）の保存溶媒は、そのまま上記（ａ）の抽出溶媒として用いてもよいし、水性溶媒、親水性有機溶媒等を保存溶媒に添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ａ）の抽出溶媒として用いてもよいし、疎水性有機溶媒等を保存溶媒に添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよい。また、上記（ｉ）の保存溶媒は、そのまま上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよいし、水性溶媒、親水性有機溶媒、疎水性有機溶媒等を添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよい。
（工程Ｂ）
　本発明の抽出方法における工程Ｂとしては、上記工程Ａ又は工程Ａ－１で得た懸濁液から、上記溶媒を含む液層を分取する工程である限り特に制限されない。
（液層を分取する方法）
　上記懸濁液から、上記液層を分取する方法としては、特に制限されないが、例えば、上記懸濁液を遠心してその上清を分取する方法を好ましく挙げることができる。懸濁液の遠心は、市販の遠心分離装置を用いて行うことができる。
（工程Ｃ）
　本発明の抽出方法における工程Ｃとしては、上記工程Ｂで分取した液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程である限り特に制限されない。
（液層からタンパク質を除去する方法）
　上記工程Ｂで分取した液層からタンパク質を除去する方法としては、特に制限されず、限外濾過フィルターや、逆浸透フィルター等のフィルターを用いて上記液層のタンパク質を除去する方法を好ましく挙げることができる。限外濾過フィルターや、逆浸透フィルターは、市販のものを用いることができる。
　上記液層のタンパク質を除去して得られた液体に、糞便試料から抽出した１種又は２種以上の物質が含まれている。抽出した物質の保存性の観点から、上記液体を乾燥することが好ましい。かかる乾燥した物質は、質量分析法や核磁気共鳴分光法に供する際に、再度水等の溶媒を添加及び溶解して用いることができる。また、該溶媒を添加する際、質量分析法や核磁気共鳴分光法用の内部標準物質も添加することが好ましい。
＜糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法＞
　本発明の「糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法」（以下、「本発明の同定・測定方法」とも表示する。）としては、本発明の抽出方法で抽出した１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、上記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、上記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：を含んでいる限り、特に制限されない。上記工程Ｐにおける「クロマトグラフィー」としては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーが挙げられ、液体クロマトグラフィーが好ましく挙げられる。クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動（ＣＥ：Capillary Electrophoresis）による物質の分離は、市販のクロマトグラフ（クロマトグラフィー用の装置）や、キャピラリー電気泳動装置を用いて、常法により行うことができる。
　上記の質量分析法とは、イオン源を用いて物質を気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化した物質を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析装置を用いた測定方法である。
　イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化した物質を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。上記工程Ｐにおける質量分析法としては、市販の質量分析装置を用いた従来公知の質量分析法を利用することができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。
　上記工程Ｐにおける好適な質量分析法としては、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析法（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）、ガスクロマトグラフ－質量分析法（ＧＣ－ＭＳ: Gas Chromatography-Mass Spectrometry）や液体クロマトグラフ－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ: Lipid Chromatography-Mass Spectrometry）が挙げられ、中でもＣＥ－ＴＯＦＭＳが好ましく挙げられる。ＣＥ－ＴＯＦＭＳは、イオン性の低分子化合物の測定に優れ、分離能が高く、より多種の代謝物質を同時に測定することができる。ＣＥ－ＴＯＦＭＳは、例えば大腸菌における主要な代謝物質の約９０％を測定することが可能である（Ohashi, Y., et al. "Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS." Molecular bioSystems;4(2), 2008, pp.135-147）。また、ＣＥ－ＴＯＦＭＳは、中性物質や脂溶性物質の測定には必ずしも向いていないが、腸内代謝物質として主要な物質である短鎖脂肪酸、アミノ酸、一部のビタミン類、ポリアミンなどを同時に測定することが可能であるため、腸内代謝物質のプロファイリングに適している。なお、ＧＣ－ＭＳは、短鎖脂肪酸などの揮発性物質の測定には優れるものの、一部のアミノ酸など、測定できない物質もある。ＬＣ－ＭＳは、多様な代謝物質の測定が可能であるが、測定対象となる物質ごとに最適なカラムや測定メソッドを選択する必要があり、一度の測定における網羅性ではＣＥ－ＴＯＦＭＳに劣る。
　質量分析法を用いて、上記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する場合、物質の種類と濃度が既知の物質を内部標準として用いることができる。内部標準物質としては、メチオニンスルホン、Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］、２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］、３－アミノピロリジン、トリメセートなどを挙げることができる。上記の内部標準物質は、糞便試料中の物質と区別できるように、安定同位体や蛍光等で標識されていることが好ましい。内部標準物質は、１種又は２種以上の物質を抽出する前の糞便試料に添加してもよいし、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出した後のサンプルに添加してもよい。
　上記の核磁気共鳴分光法とは、上記１種又は２種以上の物質を強い磁場の中に置き、核スピンの向きを揃えた分子にパルス状のラジオ波を照射し、核磁気共鳴させた後、分子が元の安定状態に戻る際に発生する信号を検知して分子構造などを解析する方法である。
　核磁気共鳴分光法の方法としては特に制限されず、フーリエ変換ＮＭＲであってもよいし、連続波法ＮＭＲであってもよい、また、一次元ＮＭＲであってもよいし、二次元ＮＭＲであってもよい。核磁気共鳴分析法は、市販の核磁気共鳴装置を用いて、常法により行うことができる。
＜複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法＞
　本発明の「複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法」（以下、「本発明の分類方法」とも表示する。）としては、
　複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
　前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
を含んでいる限り、特に制限されない。
（対象）
　本発明の分類方法における「対象」とは、糞便試料の採取源である生物を意味する。かかる生物の種類としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
（クラスター）
　本発明の分類方法において分類する「クラスター」とは、糞便試料中の１種又は２種以上のうち、いずれか１種又は２種以上（好ましくは１種）の物質の有無や、濃度の高低などから選択される１種又は２種以上（好ましくは１種）の特性が共通する「対象の集団」を意味する。
（工程Ｑ）
　本発明の分類方法における工程Ｑとしては、複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程である限り特に制限されない。
（工程Ｓ）
　本発明の分類方法における工程Ｓとしては、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程である限り特に制限されない。上記工程Ｓにおけるクラスター解析の手法としては、複数の対象を２以上のクラスターに分類できる限り特に制限されず、階層的クラスタリングであってもよいし、分割最適化クラスタリングであってもよく、該分割最適化クラスタリングとしては、ＰＡＭクラスタリング（partitioning around medoid clustering）を好ましく挙げることができる。これらのクラスター解析は、市販のソフトウェアにより行うことができる。
　上記工程Ｓにおける「物質プロファイルの類似度」とは、上記工程Ｑで同定された２種以上の物質の種類や、該工程Ｑで測定された２種以上の物質の濃度、組成又は割合が、ある対象と別の対象において類似している度合を意味する。かかる類似度は、市販のクラスター解析ソフトウェアなどによって評価することができる。
　分類するクラスターの数としては特に制限されないが、例えばCalinski-Harabasz (CH) indexに基づいて導かれたクラスター数を好ましく挙げることができる。ただし、CH indexに基づいて導かれたクラスター数に分けたときにエラーが発生した場合は、導かれたクラスター数よりも１つ多いクラスター数に分類することを好ましく挙げることができる。
（工程Ｒ）
　本発明の分類方法は、上記の工程Ｑと工程Ｓの間に工程Ｒをさらに含んでいなくてもよいが、工程Ｒをさらに含んでいてもよい。該工程Ｒとしては、上記工程Ｑで得られた上記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程である限り特に制限されない。かかるデータの標準化は、市販のソフトウェアなどを用いて行うことができる。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．代謝物質の抽出１
　糞便試料中の腸内細菌の代謝物質を、キャピラリー電気泳動（capillary electrophoresis：ＣＥ）－飛行時間型質量分析計（Time-of-Flight mass spectrometer;ＴＯＦＭＳ）(ＣＥ－ＴＯＦＭＳ)を用いて検出するために、まず、代謝物質の抽出の条件検討を行った。
１－１　方法
１－１－１　代謝物質の抽出法
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、採取後直ちに－８０℃で保存した。
〔２〕内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する０．１×ＰＢＳ溶液（以下、単に「ＰＢＳ溶液」という）を、１０ｍｇの糞便試料あたり１００μＬの割合で加え、ハンディーホモジナイザー（SIGMA社製）で糞便試料全体が均一になるまで撹拌し、糞便懸濁液を調製した。
〔３〕糞便懸濁液を１００μＬずつ４本のスクリューキャップチューブ（バイオメディカルサイエンス社製）に分注し、以下の〔４〕～〔９〕に示す抽出条件（図１及び表１）により抽出サンプル１、及び２～５をそれぞれ得た。
〔４〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬを、１７，８００×ｇで１０分間遠心し、上清（上清ａ）を回収した。上清ａを除いた後の沈殿物に、ＰＢＳ溶液を、１０ｍｇの糞便試料あたり１００μＬの割合で加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、上清（上清ｂ）を回収した。上清ａと上清ｂを、それぞれ分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で２倍に希釈したものを測定に用いた。測定後、上清ａと上清ｂから得られた濃度を足しあわせたものを抽出サンプル１とした。
〔５〕上記工程〔４〕において、上清ｂを除いた後の沈殿物に、１０ｍｇの糞便試料に対して１００μＬのＰＢＳ溶液を加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、１７，８００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清を取り除く洗浄工程を２度繰り返し、細胞外代謝物質と内部標準物質を除いた。沈殿物に、１００μＬの５０％メタノール溶液／上記内部標準物質３種含有MilliQ水、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び約０．１ｇの０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル２」）を回収した。抽出サンプル２を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔６〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌した。この際、ビーズの添加は行っていない。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル３」）を回収した。抽出サンプル３を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で２倍に希釈し測定に用いた。
〔７〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇを加え、Shakemaster NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル４」）を回収した。抽出サンプル４を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔８〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、１００％ メタノール溶液を１００μＬ（最終濃度では５０％のメタノール）、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル５」）を回収した。抽出サンプル５を分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１－１－２　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
　抽出サンプルはＣＥ－ＴＯＦＭＳ（Agilent Technologies社製）の陽イオンモードで測定を行った。ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる測定は、文献（Hirayama, A., et al. "Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry." Cancer research;69(11)2009, pp.4918-4925.）に記載の方法にしたがって行った。ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより測定したデータは、解析ソフトウェアMaster Hands（Sugimoto, M., et al. "Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles." Metabolomics : Official journal of the Metabolomic Society;6(1), 2010, pp.78-95.）を用いて、代謝物質の同定と濃度を算出した。抽出条件ごとの代謝物濃度を比較するため、各条件の代謝物濃度からＺスコアを算出し（すなわち、各条件の代謝物濃度を標準化し）、MeV TM4 version 4.8（Saeed, A.I., et al. "TM4 microarray software suite." Methods in enzymology 2006;411:134-193.）を用いてヒートマップを作製し、代謝物質についてk-meansを用いたクラスタリングを行った。また、同定された代謝物質の種類とその濃度について、各抽出サンプル間で階層的クラスタリングを行った。
１－２　結果及び考察
　各抽出条件での代謝物質濃度を比較するため、各代謝物質の濃度をＺスコアに変換し、得られた代謝物質の種類とその濃度を可視化し、代謝物質についてk-meansクラスタリングを行い、抽出条件ごとの特徴を反映したクラスターＩ～ＩＶに分類した（図２）。
　クラスターＩには、４５種類の代謝物質（表２）が分類された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　かかるクラスターＩの代謝物質群は、抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）において最も高濃度で検出された。このクラスターＩには１５種のアミノ酸や３種のジペプチドが含まれていた。また、このクラスターＩの代謝物質は、抽出サンプル３（ビーズ破砕処理無し）と比較して、抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）で高濃度に検出される傾向にあった（図３）。そのため、これらの代謝物質は菌体外にも存在するが、菌体内にも一定量存在しており、ビーズによる菌体破砕を行うことで検出量が増加したと考えられる。さらに、これらのクラスターＩの代謝物質は、抽出サンプル５（メタノールで抽出）と比較して、抽出サンプル４（ＰＢＳで抽出）において高濃度で検出される傾向にあるため、メタノールに溶出しにくいことが示された（図３）。
　クラスターIIには、２３種類の代謝物質（表３）が分類された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　かかるクラスターIIの代謝物質群は、特に、抽出サンプル５において高濃度に検出された。これらの代謝物質はビーズ破砕を行い、メタノールを添加した条件で最も高濃度で抽出される傾向にあるため、菌体内の存在量が多く、メタノールに溶解しやすい代謝物質であると考えられる。このクラスターにはguanine、cytidine、adenosineなどの核酸の構成要素や、thiamine、pyridoxalなどのビタミンが含まれていた。
　クラスターIIIには、５２種類の代謝物質（表４）が分類された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　かかるクラスターIIIの代謝物質群は、抽出サンプル２において検出量が少なく、抽出サンプル１及び３～５では同程度に検出された。また、抽出サンプル３（ビーズ破砕処理無し）と抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）において検出量の違いが少ないことからも、これらの代謝物質は菌体内の存在量が少ないことが示された。また、抽出サンプル４（ＰＢＳで抽出）と、抽出サンプル５（メタノールで抽出）とを比較しても、検出濃度に大きな差がないことから、ＰＢＳでもメタノールでも同程度に抽出可能な代謝物質であることが示された。
　クラスターＩＶには、２１種類の代謝物質（表５）が分類された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　かかるクラスターＩＶの代謝物質群は、いくつかの抽出条件で検出されなかったものである。したがって、これらの代謝物質に注目する際は抽出条件を慎重に検討する必要があると考えられる。
　以上の結果を踏まえ、各抽出条件の特徴をサンプル間の階層的クラスタリングから比較すると、抽出サンプル２ではほぼ全ての代謝物質濃度が他の抽出方法と比較して低いことが示された。これは、糞便中代謝物質の多くが菌体外に存在していることを示している。腸管内では常に腸内細菌の増殖や溶菌（死滅）が起こるため、腸管内や糞便中には溶菌した腸内細菌由来の代謝物質も多量に存在していると考えられる。抽出サンプル２では、糞便中に存在はするが溶菌していない細菌細胞に含有されている代謝物質を検出しているが、抽出サンプル２で検出される代謝物質濃度が全体的に低濃度であったことから、このような細胞に含まれる代謝物質は全体から比べると微量であると考えられる。他の抽出条件については、階層的クラスタリングの結果から抽出サンプル１と抽出サンプル３が類似していることが示された。抽出サンプル１と抽出サンプル３の抽出手法の違いは、抽出サンプル３では撹拌を行ったのに対し、抽出サンプル１は撹拌を行わなかった点のみであり、抽出溶媒などの条件は同一である。また、抽出サンプル３の撹拌ではビーズを用いていないため、菌体の破砕は起こらなかったと考えられる。本研究の結果から、糞便中代謝物質は主に菌体外に存在することが示されているため、結果として抽出サンプル１と抽出サンプル３は類似した抽出条件になっていたと考えられる。抽出サンプル１と抽出サンプル３に次いで、類似した代謝物質プロファイルが得られた手法は抽出サンプル４であった。抽出サンプル３と抽出サンプル４ではビーズ破砕の有無に差があるにも関わらず、クラスターIに属するアミノ酸などを除いて代謝物質プロファイルは類似していた。抽出サンプル５は抽出サンプル１、抽出サンプル３、および抽出サンプル４とは異なるクラスターに分類された。抽出サンプル１、条抽出サンプル３、抽出サンプル４は溶媒にメタノールを含まないが、抽出サンプル５は溶媒にメタノールが含まれているため、溶媒の違いが得られる代謝物質プロファイルに影響を及ぼすことが示された。また、抽出サンプル３と抽出サンプル４はビーズによる破砕の有無が異なり、抽出サンプル４と抽出サンプル５はメタノール添加の有無が異なるが、抽出サンプル３と抽出サンプル４の差よりも、抽出サンプル４と抽出サンプル５の差の方が大きいことを示しており、メタノール添加の有無はビーズ破砕の有無よりも大きな影響をおよぼすことが示された。
　次に、個別の代謝物質に注目し、溶媒の違いや菌体の破砕の有無によって有意に濃度が異なる代謝物質を調べた。溶媒の違いによる影響の分析には抽出サンプル４と抽出サンプル５の比較を、菌体破砕の有無による影響の分析には抽出サンプル３と抽出サンプル４の比較を行った。なお、比較した結果、偽陽性率（False Discovery Rate：ＦＤＲ）が０．０５以下の有意差があるものを選択した。
　溶媒の違いの比較（抽出サンプル４と抽出サンプル５の比較）から、検出された１４１物質のうち２９物質の代謝物質の濃度に、溶媒の違いによる有意差が認められた（表６）。そのうち１４物質はアミノ酸で、いずれも抽出サンプル４において有意に高濃度で検出された。アミノ酸は水溶液中では双性イオンとなり、有機溶媒よりも水に溶解しやすい性質があるため、このような結果が得られたと考えられる。また、メタノールを添加した抽出サンプル５において有意に高濃度であった物質にはadenineや2'-deoxyguanosineなど核酸の構成要素が含まれていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ビーズによる菌体破砕の有無の比較（抽出サンプル３と抽出サンプル４の比較）では４種のアミノ酸を含む７物質の代謝物質の濃度に有意差が認められた（表７）。これらすべての代謝物質が菌体破砕を行った抽出サンプル４において高濃度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　抽出サンプル１～５において検出できた代謝物質の数を解析したところ、抽出サンプル５において検出された代謝物質の数は平均１３１種であり、最も多かった（図４）。これは抽出サンプル１と抽出サンプル２のように菌体と上清を分離していないことに加え、有機溶媒を用いることでＰＢＳ溶液には溶解しにくい代謝物質も抽出できたことに起因すると考えられる。また、抽出サンプル２では検出された代謝物質が平均８３種と最も少なかった。本研究によって菌体内の代謝物質の存在量は菌体外に比べて少ないことが示されているが、この結果は菌体内のみから代謝物質を得ても検出限界に満たない物質が３０～４０％程度存在していることを示している。
　これらの結果より、ＣＥ－ＴＯＦＭＳによって得られる糞便中の陽イオン代謝物質プロファイルは、抽出に用いる溶媒やビーズによる菌体破砕の有無による影響を受けることが示された。上清画分、沈殿画分、および糞便懸濁液全体の代謝物質プロファイルの比較から、多様な代謝物質が上清画分に含有されていることが明らかとなった。抽出サンプル１～５の比較では特にアミノ酸の濃度が抽出条件の影響を受けやすく、菌体破砕を行い、メタノールを添加しない抽出サンプル４において最も高濃度で検出される傾向にあった。また、検出可能な代謝物質の数の比較では、メタノールを添加し、ビーズを用いて菌体破砕を行った抽出サンプル５において最も多くの種類の代謝物質が検出された。
２．代謝物質の抽出２
　抽出サンプル５が得られた条件を基に、代謝物質抽出の条件検討をさらに行った。すなわち、抽出サンプル５が得られた条件と同様に、メタノールを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合（以下、「メタノール法」という）と、メタノール及びクロロホルムを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合（以下、「メタノール・クロロホルム法」という）とで、検出できる代謝物質の差異をＣＥ－ＴＯＦＭＳにより分析した。
２－１　方法
２－１－１　メタノール法
〔１〕健常人（男女計７５名）から糞便試料をそれぞれ採取し、凍結乾燥処理した。
〔２〕凍結乾燥処理後の糞便試料に、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）４個を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて糞便試料全体が均一になるまで撹拌した。
〔３〕撹拌処理後の糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する５０％メタノールを４００μＬ、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＭｅ」）を回収した。抽出サンプルＭｅを分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３－アミノピロリジン及び２００μＭトリメセート）を含有するMilliQ水を１００μＬ加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。
２－１－２　メタノール・クロロホルム法
　上記「２－１－１　メタノール法」の工程〔２〕で撹拌処理した糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１００％メタノールを５００μＬ、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を０．１ｇ加え、さらに、５００μＬのクロロホルム及び２００μＬのMilliQ水を加えた後、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＭｅＣｒ」）を回収した。抽出サンプルＭｅＣｒを分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３－アミノピロリジン及び２００μＭトリメセート）を含有するMilliQ水を１００μＬ加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。
２－１－３　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析は、上記「１－１－２　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。
２－２　結果
　メタノール法で抽出された代謝物質のプロファイルと、メタノール・クロロホルム法で抽出された代謝物質のプロファイルとはよく類似していた。一方、かかる２種類の抽出方法で抽出された代謝物質の濃度について比較したところ、全体的にメタノール・クロロホルム法よりもメタノール法で抽出した方が検出される代謝物質の濃度は高かった。すなわち、両方法で１．５倍以上の差異が認められた代謝物質は、表８に示す２９種類の物質であったが、そのうちメタノール・クロロホルム法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は４種類あったのに対して、メタノール法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は２５種類もあった（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８中の左から２及び３番目の列の数値は、それぞれ「Ｍｅ（抽出サンプルＭｅ）」及び「ＭｅＣｒ（抽出サンプルＭｅＣｒ）」において検出された各代謝物質の濃度（内部標準物質に対する相対値）を示す。また、表中の右から１番目の列の数値は、「Ｍｅ（抽出サンプルＭｅ）」において検出された各代謝物質の濃度に対する、「ＭｅＣｒ（抽出サンプルＭｅＣｒ）」において検出された各代謝物質の濃度の比（ＭｅＣｒ／Ｍｅ）を示す。
　ヒト腸内細菌叢の構成は、食生活の特徴によって２～３つのエンテロタイプに分けられると考えられている。そこで、健常な被験者１８名から各被験者あたり９回ずつ糞便試料の採取を行い、上記「２－１－１　メタノール法」の項目に記載の方法にしたがって検出された代謝物質全てを用い、文献（Arumugam, M., et al. "Enterotypes of the human gut microbiome." Nature;473(7346), 2011, pp.174-180.）に記載の方法にしたがって、ＰＡＭクラスタリングによるエンテロタイプを分類した。分類に適したクラスター数を３に設定しＰＡＭクラスタリングを行った結果、Butyrate（酪酸）、Cholate（コール酸）、及びThiamine（ビタミンＢ１）グループに分類することができた（図５）。
３．代謝物質の抽出３
３－１－１　ＰＢＳ溶液での抽出
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、凍結乾燥処理した。
〔２〕凍結乾燥処理後の糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１×ＰＢＳ溶液を５００μＬ、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）４個、及び、約０．１ｇの０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで５分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＰＢＳ溶液」）を回収した。抽出サンプルＰＢＳ溶液を分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３－アミノピロリジン及び２００μＭ トリメセート）を含有するMilliQ水を２０μＬ加えてよく攪拌して再溶解した。この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率（以下、「この溶液の濃縮率」とも表示する。）は１５倍であり、この溶液のＰＢＳ濃度は１５×ＰＢＳとなっている。この溶液にMilliQ水を加え、この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率がそれぞれ１０倍（×１０）、５倍（×５）、１倍（×１）、０．２倍（×０．２）となるように希釈した。これらの希釈溶液を、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより分析した。
３－１－２　水での抽出
　上記「３－１－１　ＰＢＳ溶液での抽出」の工程〔２〕における「上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１×ＰＢＳ溶液」に代えて、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有するMilliQ水を用いて同様の抽出処理を行い、得られた各希釈溶液を、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより分析した。
３－１－３　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
　上記３－１－１や３－１－２で得られた各希釈溶液の代謝物質の、ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる測定及び解析は、上記「１－１－２　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。
３－２　結果
　各希釈液において検出された代謝物質の種類数を図６に示す。ＰＢＳ溶液で抽出した場合は、５倍以上の濃縮率のサンプル（ＰＢＳの×５、×１０、×１５）では、塩濃度の影響で電流が過剰に流れてしまい、正確に測定することができなかった。ＰＢＳ溶液で抽出した、×０．２や×１の希釈溶液（サンプル）と、水で抽出した、×０．２や×１の希釈溶液（サンプル）との間で、検出された代謝物質の種類数を比較したところ、水で抽出したサンプルは、ＰＢＳで抽出したサンプルよりも、割合として１１～１７％程度多い代謝物質が検出された（図６）。
　なお、水で抽出した場合、５倍以上の濃縮率でも電流値には問題はなかったが、特にアニオンモードで測定する際は、ピークの形状がややブロードになる傾向があった。したがって、水で抽出した場合で、アニオンモードで測定する場合は、１倍以下の濃縮率で測定を行うことが望ましいことが分かった。
４．糞便試料の保存方法の検討１
　糞便試料を採取してから、代謝物質を検出するまでの糞便試料の保存状態が、代謝物質の検出にどのような影響を及ぼすかについて検討した。具体的には、健常人から糞便試料を採取し、室温（２０～２５℃）で１～２日間保存した後、実施例２に記載の方法にしたがって、５０％メタノールを溶媒として代謝物質を抽出し、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより代謝物質を測定した。測定は実施例１に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行った。なお、コントロールとして、健常人から糞便試料を採取した後、直ちに超低温フリーザー（－８０℃）で保存したものを用いた。
　その結果、糞便試料を採取後、室温で１～２日間保存すると、－８０℃で保存した場合と比べ、少なくとも４７種類の代謝物質について、濃度の増減が認められた（図７）。例えば、図７において、「I」は、糞便試料を室温で１～２日間保存したときに、濃度増加が認められた代謝物質を示し、「II」は、糞便試料を室温で１日間保存したときに、濃度増加し、かつ室温で２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示し、「III」は、糞便試料を室温で１～２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示す。また、例えば、Butanoate（Butyrate）、Propionate等の１０種類の代謝物質は、その濃度が２倍以上増加していたのに対して、Cholate等の１０種類の代謝物質は、その濃度が１／２倍以下に減少していた（図７）。また、保存期間が、１日間の場合よりも、２日間の場合の方が、－８０℃で保存した場合と比較した代謝物質濃度の増減の割合が高かった。
　さらに、採取後の糞便試料を冷蔵（４℃）又は冷凍（－２０℃）で保存した場合や、代謝物質の抽出を「メタノール・クロロホルム法」により行った場合についても合わせて検討した。その結果、糞便試料を４℃で保存した場合や、代謝物質の抽出を「メタノール・クロロホルム法」により行った場合も同様に、－８０℃で保存した場合と比べ、代謝物質濃度の増減が認められるとともに、保存期間が、１日間の場合よりも、２日間の場合の方が代謝物質濃度の増減の割合が高かった（図８、図９）。一方、糞便試料を－２０℃で保存した場合は、－８０℃で保存した場合と類似の代謝物質プロファイルを示した（図１０）。
　これらの結果は、糞便試料を冷凍（少なくとも－２０℃以下）保存すると、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを良好に維持できるものの、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、代謝物質プロファイルが変動するため、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを維持することは難しいことを示している。特に、糞便試料を冷蔵や常温で保存した場合、4-beta-Acetylaminoethyl imidazole、Riboflavin、Octanoate、beta-Ala、Quinate、Malate、Choline等の代謝物質の濃度は、ある被験者から得た糞便試料では増加するのに対して別の被験者から得た糞便試料では減少するなど、個々の被検者間で増減の仕方が異なることが示された。この結果から、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、糞便試料に含まれる細菌叢や代謝物質の違いによって、同じように保存した場合であっても、代謝物質プロファイルの変化の仕方が異なる可能性が考えられる。そのため、糞便試料の冷蔵や常温での保存による代謝物質プロファイルの変動に基づいて、保存後の糞便試料における代謝物質プロファイルから採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを推測することは困難であることから、糞便試料の保存による代謝物質プロファイルの変動を、最小限に留める必要があると考えられる。
５．糞便試料の保存方法の検討２
　冷凍設備のない場所で糞便試料を採取して、該糞便試料を遠方の分析施設まで移送する場合など、糞便試料を採取した後、直ちに冷凍保存することが困難な場合も考えられる。そこで、冷凍以外の保存方法を検討するために、糞便試料を、各種有機溶媒（１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、５０％メタノール［５０％ＭｅＯＨ］、又は、メタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中に保存した場合に、代謝物質プロファイルがどのように変動するかについて解析した。具体的には、糞便試料を１００％メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法１」）、糞便試料を５０％メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法２」）、糞便試料を５０％メタノール液中で保存後、メタノール及びＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール；２５：２４：１）液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法３」）、並びに糞便試料をメタノール・クロロホルム液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法４」）を検討した。なお、コントロールとして、糞便試料を有機溶媒非存在下で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法Ｃ」）を行った。また、各々の抽出方法において、糞便試料を各種有機溶媒中に加えた直後（方法１～４）、もしくは糞便試料を有機溶媒非存在下（方法Ｃ）で直ちに－８０℃で保存した試料をコントロールに用いた。詳細な方法を以下に示す。
５－１　方法
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、重量を測定し、保存用溶媒（表９の「保存用溶媒」）を添加した。
〔２〕室温（２０～２５℃）、４℃、又は－８０℃で２日間保存した。
〔３〕代謝物質の抽出条件（表９の「抽出溶媒の組成」）となるように、添加用溶媒（表９の「添加用溶媒」）を保存用溶媒に添加した。またその際に、内部標準物質３種（１０００μＭ メチオニンスルホン、１０００μＭ Ｄ－カンファー１０－スルホン酸［ＣＳＡ］及び１０００μＭ ２－モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有するMilliQ水を１０μＬ添加した。
〔４〕３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。
〔５〕１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を回収した後、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、１００μＬの内部標準物質２種（２００μＭ ３－アミノピロリジン及び２００μＭ トリメセート）を含有するMilliQ水に再溶解し、実施例１に記載の方法にしたがって、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより代謝物質を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
５－２　結果
　糞便試料を、有機溶媒非存在下（すなわち保存溶媒なし）（表９の「方法Ｃ」）で４℃又は室温で保存した場合、或いは５０％メタノール液中（表９の「方法２」や「方法３」）で４℃又は室温で保存した場合は、それぞれ－８０℃で保存した場合と比べ、代謝物質濃度の増減がより多く認められた（図１１）。一方、糞便試料を、１００％メタノール液中（表９の「方法１」）で４℃又は室温で保存した場合や、メタノール・クロロホルム液中（表９の「方法４」）で４℃又は室温で保存した場合は、それぞれ－８０℃で保存した場合と類似の代謝物質プロファイルを示し、保存による代謝物質濃度の増減が抑制された（図１１、図１２）。
　これらの結果は、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、代謝物質プロファイルは変動するが、糞便試料を１００％メタノール液、メタノール・クロロホルム液等の有機溶媒中で保存すると、かかる代謝物質プロファイルの変動の程度が抑制され、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを良好に維持できることを示している。
　本発明によれば、糞便試料から１種又は２種以上の物質（好ましくは腸内の代謝物質）を効率的に抽出することができる。また、本発明によれば、糞便試料からより多数の種類の物質を抽出することができる。したがって、本発明によれば、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することができる。

Claims (14)

  1. 　糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
    　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
    　（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｇ）水からなる溶媒：
    　前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
    　前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
    を含むことを特徴とする、物質を抽出する方法。
  2. 　工程Ａが、（ａ）～（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ－１であることを特徴とする請求項１に記載の物質を抽出する方法。
  3. 　溶媒が水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が１０～５０重量％の範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の物質を抽出する方法。
  4. 　工程Ａ－１におけるビーズの直径が、０．０２～０．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項２又は３に記載の物質を抽出する方法。
  5. 　工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
  6. 　工程Ｘにおけるビーズの直径が、０．６～１５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項５に記載の物質を抽出する方法。
  7. 　溶媒が、さらに疎水性有機溶媒を含むことを特徴とする請求項３～６のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
  8. 　工程Ａ又は工程Ａ－１より前に、採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙをさらに含み、該工程Ｙで保存後の糞便試料を工程Ａ又は工程Ａ－１の糞便試料として用いることを特徴とする請求項１～４及び７のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
    　（ｈ）水性溶媒及び７５重量％以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
    　（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
  9. 　水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
  10. 　親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
  11. 　疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
  12. 　糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
    　請求項１～１１のいずれかに記載の方法で抽出した前記１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：
    　を含むことを特徴とする、方法。
  13. 　複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法であって、
    　複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、請求項１２に記載の方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
    　前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
    　を含むことを特徴とする、方法。
  14. 　工程Ｑと工程Ｓの間に、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Ｒをさらに含み、
    　前記工程Ｒで標準化したデータを、工程Ｓにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
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