WO2017017294A1 - Compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel) y su interacción con ácidos nucleicos - Google Patents

Compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel) y su interacción con ácidos nucleicos Download PDF

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dirrutenium
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open
ligands
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Santiago HERRERO DOMÍNGUEZ
Reyes JIMENEZ APARICIO
María Encarnación MARTÍNEZ SALAS
Gloria María LOZANO CUBO
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Universidad Complutense de Madrid
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Universidad Complutense de Madrid
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention falls within the chemical sector, since it deals with chemical compounds and their mixtures with different solvents; It also fits into the biotechnology and pharmaceutical sectors for its applications.
  • RNA is involved in numerous biological processes, among others, protein synthesis, genetic regulation, maintenance of genomic stability. etc.
  • RNA activity is directly related to its three-dimensional structure. Therefore, determining its structure is essential to understand its function (Draper, Biopolymers 2013, 99, 1105-1113).
  • the structure of the RNA is classified into different levels: primary structure consisting of the nudeotidic sequence, secondary structure composed of propellers, hairpins, loops and intersections between propellers, and tertiary structure determined by the established interactions between the previous elements. The tertiary structure determines the active conformation of the RNA.
  • RNA molecules can be determined by chemical approaches using DMS (dimethylsulfate), NMIA (N-methylisatoic anhydride). 1M7 (1-metU-7- nKroisatoic anhydride), NAI (2-methylnicotnic acid knidazolda), etc.
  • Intersections in the RNA are defined as the connection point between propellers, or between propellers and loops. Intersections are involved in the autocatalytic properties of some ribozymes, recognition of RNA switch binding domain ⁇ riboswitches), internal translation initiation (IRES elements), protein interaction, etc. Although appropriate techniques are available to identify forks and loops, the determination of intersections is very poor (Laing et al. JMB 2009, 393, 67-82) so new tools are needed to determine the residues located in these positions within of the structure of nucleic acids. Detailed description of the invention
  • One aspect of the present invention relates to open-paddlewheef open-paddle wheel dirrutenium compounds and their application to the structural analysis of RNA molecules that explain, manipulate or cancel their function.
  • the dirrutenium compounds with open vane wheel structure (i) of the present invention consist of two ruthenium atoms joined by metal-metal bond and supported by three bridge ligands (LL) that form, together with the metal centers, a ring , generally, of five links (Barral et al., Chem. Eur. J. 2007, 13, 10088-10095); in the compounds of formula (i) the other two equatorial positions (*) and the two axial positions (**) are free or occupied by monodentate and / or bidentate chelate ligands; with the exception of (when
  • the three bridge ligands (LL) are selected from the group consisting of: formamidinate, guanidinate, triazenide, aminopyridinate, amidate, carboxylate, hydroxypyridinate, acetamidinate and / or benzamidinate.
  • Monodentate and / or bidentate chelate ligands are selected from the group consisting of: halides, pseudohalides, sulfate, water, ethanol, DMSO, ammonia, alkoxides, alkyls.
  • monodentate ligands are understood as those ligands that have a single anchor point at the coordination center.
  • Bidentate chelated ligands are those ligands that are coordinated to a single central atom by two donor groups.
  • bridge ligands are understood as those ligands that simultaneously bind to two central atoms, that is, the bridge ligands bind to the two central atoms to produce dinuclear coordination entities.
  • Another aspect of the invention relates to a method for synthesizing dinutenium compounds with an open vane wheel structure comprising the following steps:
  • step can be included:
  • the bridge ligands (L-L) of the dirrutenium compounds with open-paddlewheel structure are selected from the group consisting of. formamidinate, guanidinate, triazenide, aminopyridinate, amidate, carboxylate, hydroxypyridinate, acetamidinate and / or benzamidinate.
  • the solutions of the compounds with open vane wheel structure without occupying the axial positions are generally not very stable, which makes their use difficult.
  • the compounds are stabilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) or in ethanol, which are coordinated to the axial positions, which implies an improvement in the stability of the compounds in solution and facilitates their use. This improves the stability and handling of the compounds without reducing their reactivity.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ethanol which are coordinated to the axial positions
  • the dirrutenium compound with open vane wheel structure is soluble in aqueous medium, a solution of the compound in water can be prepared directly, but this is not usual.
  • the present invention includes solutions in DMSO or in ethanol. To do this, the dirrutenium compound is dissolved in the minimum amount of DMSO or ethanol and then diluted with water until the most appropriate concentration is achieved for the procedure to be followed.
  • Another aspect of the invention therefore, relates to a process for preparing the solutions, comprising:
  • Y neutral ligand such as water, DMSO or ethanol
  • n 1, 2): Weighs between 1 and 5 mg of dirrutenium compound or of a dirrutenium compound and dissolved in a solvent that stabilize the compound, such as DMSO or ethanol to form solutions with a concentration between 1.5 and 2.5 mM.
  • the invention also relates to a method for determining the intersections between helices and / or the transition between helices and loops in RNA molecules including:
  • RNA with an open vane wheel structure as a template in reverse transcription (RT) reactions with labeled primers
  • the dirrutenium compound with open vane wheel structure of steps b) and c) is preferably used in aqueous medium.
  • the dirrutenium compound with open vane wheel structure is not stable in water, it is preferably stabilized in DMSO or with ethanol to act as ligands and stabilize the compound.
  • the treatment of folded RNA is preferably carried out under controlled conditions of pH, concentration of monovalent and divalent ions, temperature and time.
  • RNA Once the RNA has been retracted in its native conformation, when treated with a mixture of the dirrutenium compound with an open pallet wheel structure in an aqueous medium, a covalent bond is established between the species of dirrutenium and the nucleotides of the RNA located at the end or immediately adjacent to a propeller, or at the intersection between propellers (figure 2).
  • the dirrutenium compound with open vane wheel structure of steps b) and c) is the compound of formula (i) where the two Ru atoms, joined by metal-metal bond, are supported by three bridge ligands (LL) that form, next to the metallic centers, a ring; the other two equatorial positions (*) and the two axial positions (**) are free or occupied by monodentate and / or bidentate chelate ligands.
  • LL bridge ligands
  • RNA folded in the same way and diluted in the same aqueous medium (hereinafter referred to as RNA-control) is used, containing DMSO or ethanol in the same concentration at which that solvent has been used to dissolve the Dirrutenium compound in those cases where the addition of a solvent has been necessary.
  • RT reverse transcriptase enzyme
  • incubation of the RNA with the dirrutenium complex with open pallet wheel structure causes the specific stop of the reverse transcriptase enzyme (RT) in the nucleotide prior to the dirrutenium reactive position.
  • RT reverse transcriptase enzyme
  • primers labeled with a fluorophore are used, or with 32 P at its 5 'end.
  • RNA sequencing reactions are performed with the same primer used for the RT but labeled with another fluorophore.
  • the products of the sequencing are separated by capillary electrophoresis together with the products of the RT.
  • Another option is to detect them in acrylamide-urea denaturing gels in the event that the primers have been labeled with 32 P.
  • the intensity of the RT stop products in the treated RNA is quantified and normalized with respect to the RNA-control. The resulting reactivity is plotted against the nucleotide position ( Figure 3).
  • nucleotides reactive to dirrutenium in the secondary structure of the RNA are ascribed by comparison with reactivity data obtained with compounds known in the state of the art (for example, NMIA) that determine the position of loops and mismatched regions, as well as non-reactive nucleotides that form hydrogen bonds in paired regions.
  • NMIA compounds known in the state of the art
  • the identification of the specific stops of the RT that is, of the products obtained in the RT with an open-ended wheel with a vane wheel structure, allows the identification of RNA nucleotides located at the end or immediately adjacent to a helix, or in the intersection between helices that is where, specifically, the compounds of the invention interact with RNA.
  • RNA reactivity to dirrutenium compounds with open vane wheel structure ( Figure 2, right) have been compared with experimental structure determination data with agents that they attack nucleotides located in loops and, in general, mismatched regions (figure 2, left).
  • results of mutational analysis and sequence covariation data indicate the nucleotides that form helices.
  • the combination of all the indicated data has allowed us to conclude that the attack sites of the dirrutenium compound with open vane wheel structure are located at the intersections of propellers and / or in the transition between helices and loops of the RNA.
  • Propellers are basic elements of the secondary structure of RNA that support the three-dimensional shape of the native molecule and, therefore, determine the founding of the RNA.
  • To date there are no methodologies capable of specifically identifying nucleotides located at the intersections of helices and / or in the transition between helices and loops in nucleic acids. Therefore, the structural arrangement of these nucleotides is modeled from negative data, which has led to limitations in their study.
  • the presented invention constitutes a new tool in the study of the structure of nucleic acids, so it is of great immediate and short-term scientific interest in the field of molecular and structural biology.
  • Another aspect of the invention relates to combinations of dirrutenium complexes with open vane wheel structure with nucleic acids and, more specifically with RNA molecules.
  • RNA with dirrutenium compounds with open vane wheel structure can also be used to improve the crystallization capacity of RNA molecules for study by X-ray diffraction.
  • the existence of heavy atoms produces increase in the intensity of the reflections, which facilitates obtaining crystallographic data.
  • this type of dirrutenium-RNA compound interactions can be used to deform the RNA structure by disabling it.
  • the invention also relates to a kit for the analysis of RNA molecules that includes: one or more dirrutenium compounds with open vane wheel structure, a buffer suitable for RNA treatment and instructions for use.
  • the compound or compounds of Dirrutenium with open vane wheel structure included in the kit have the formula (i) where the two atoms of Ru, joined by metal-metal bond, are supported by three bridge ligands (LL) that form, next to the metal centers, a ring; the other two equatorial positions (*) and the two axial positions (**) are free or occupied by monodentate and / or bidentate chelate ligands.
  • the bridge ligands of the dirrutenium compounds are selected from the group consisting of: formamidinate, guanidinate, triazenide, aminopyridinate, amidate, carboxylate, hydroxypyridinate, acetamidinate and / or benzamidinate.
  • the dirrutenium compound (s) included in the kit may be stabilized with DMSO or with ethanol. Additionally, the kit may contain a solvent, preferably DMSO or ethanol.
  • Figure 3 Normalized RNA reactivity as a function of nucleotide position. The intensity of the reactivity is quantified with the gray scale shown.
  • RNA already used in Lozano and others was used.
  • the RNA (2 pmol) was incubated with a 10 ⁇ solution of the dirrutenium compound
  • RNA synthesized in vitro was refolded by denaturation at 95 ° C for 2 min in 5mM TRIS, pH 8, 0.5 mM EDTA and rapid cooling on ice for 2 min, followed by incubation in folding buffer (100 mM HEPES -KOH, pH 8.0, 0.5 mM MgCl 2 , 100 mM NaCI) for 20 min at 37 ° C in a final volume of 18 pL (Lozano et al. FEBS J, 2014, 281, 3685-3700).
  • folding buffer 100 mM HEPES -KOH, pH 8.0, 0.5 mM MgCl 2 , 100 mM NaCI
  • RNA was incubated with 10% DMSO final concentration (control RNA) or with a 10 ⁇ solution of dirrutenium in DMSO / water, prepared according to Example 2, for 15 minutes at 37 ° C. Finally, the treated RNA and the control RNA were precipitated with 2.5 volumes of ethanol and resuspended in 10 ⁇ L of 5 mM TRIS, pH 8, 0.5 mM EDTA.
  • control RNA 10% DMSO final concentration
  • a 10 ⁇ solution of dirrutenium in DMSO / water prepared according to Example 2
  • RNA and the control RNA (2 pmol) were incubated, separately, with a sequence primer complementary to the RNA (2 pmol) and labeled in 5 'with a fluorophore (described in Lozano et al. FEBS J, 2014, 281, 3685-3700) at 65 ° C for 5 min, then another 5 min at 35 ° C and finally cooled 2 min with ice.
  • the reaction primer extension was performed in a final volume of 16 ⁇ iL, in the presence of a buffer reverse transcriptase (50 mM TRIS-HCl, pH 8.3, 3 mM MgCl 2, 75 mM KCI, 8 mM DTT) and 1 ⁇ of each dNTP.
  • the electrophoregrams resulting from capillary electrophoresis were analyzed using the QuSHAPE program (Karabiber et al., RNA 2013, 19, 63-67).
  • the reactivity values obtained for the corresponding nudeotide of the RNA-control were subtracted from the values obtained for each nudeotide of the RNA treated with the dirrutenium compound with open vane wheel structure.
  • the reactivity of at least 3 independent experiments was used to calculate the mean (standard deviation).
  • Quantitative reactivity values were normalized to a scale of 0 to 2, in which 0 represents non-reactive nucleotides and the average intensity of the reactive nucteotides is set to 1, as shown in Figure 3.
  • the sequencing ladder is separated next to the treated RNA or the control RNA, since each reaction carries a different fluorophore.
  • the fluorescent peaks of the ladder obtained with DDC mark the position of the guanines in the RNA. Therefore, they serve to align the peaks of the RT reaction with the nucleotide position corresponding to the treated RNA.
  • the sequencing ladder is prepared with the four chain terminators (DDC, DDG, DDA and DDT ), and are loaded into the sequencing gel in parallel to the RT of the treated RNA and the control RNA. Therefore, all RNA nucleotides can be identified.
  • the mobility of RT stops in the treated RNA, and in the control RNA coincides in the denaturing gel with the nucleotide located in its same position.

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Abstract

La invención se refiere a compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddiewheel), su estabilización, su método de elaboración y métodos para utilizarlos en el análisis de la estructura secundaria y terciaria del ARN, particularmente en la determinación de las intersecciones entre hélices o en la transición entre hélices y bucles. La invención también se refiere a un kit que contiene compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddiewheel) y los medios adecuados para utilizarlos en el análisis de la estructura de! ARN.

Description

Titulo
Compuestos de dimítanlo con estructura de rueda de paletas abierta (open- (open-peddlew yhe seu/) interacción con ácidos nucleicos. Sector de la técnica
La presente invención se encuadra en el sector químico, puesto que se trata de compuestos químicos y sus mezclas con distintos disolventes; asimismo, se encuadra en los sectores biotecnológico y farmacéutico por sus aplicaciones.
Estado de la técnica
Los ácidos nucleicos son deposHarios de la información genética. En particular el ARN esté implicado en numerosos procesos biológicos, entre otros, la síntesis de proteínas, la regulación genética, el mantenimiento de la estabilidad genómica. etc. La actividad del ARN esté dilectamente relacionada con su estructura tridimerisionai. Por lo tanto, la determinación de su estructura es fundamental para comprender su función (Draper, Biopolymers 2013, 99, 1105-1113). La estructura del ARN se clasifica en distintos niveles: estructura primaria constituida por la secuencia nudeotfdica, estructura secundaria compuesta por hélices, horquillas, bucles e intersecciones entre hélices, y estructura terciaria determinada por las irtteracciones establecidas entre los elementos anteriores. La estructura terciaria determina la conformación activa del ARN. Existen varias aproximaciones biofísicas para determinar la estructura del ARN como la cristalografía, la resonancia magnética nuclear (RMN) o la microscopía crioelectrónica (cryo-EM). Estas metodologías suelen presentar limitaciones debido a la dificultad para obtener cristales de ARN, o complejos estables para cryo-EM, o debido al gran tamaño de las moléculas a estudiar por RMN. La CGftfbrmacidn local de cada nucledtido de una molécula de ARN puede determinarse mediante abordajes químicos empleando DMS (dimetilsulfato), NMIA (anhídrido N-metilisatoico). 1M7 (anhídrido 1-metU-7- nKroisatoico), NAI (knidazolda del ácido 2-metilnicotjnico), etc. (Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281, 3685-3700; Fernéndez-Miragall y otros. RNA 2006, 12, 223-234; Weeks y Mauger. Acc. Chem. Res. 2011, 44. 1280-1291; Spitale y otros; NaL Chem. Biol. 2013, 9, 18-20). Estos compuestos reconocen específicamente nucleótidos desemparejados, localizados en bucles o regiones de cadena sencilla.
Las intersecciones en el ARN se definen como el punto de conexión entre hélices, o bien entre hélices y bucles. Las intersecciones están implicadas en las propiedades autocataliticas de algunas ribozimas, el reconocimiento de dominio de unión de interruptores de ARN {riboswitches), la iniciación interna de la traducción (elementos IRES), la interacción con proteínas, etc. Aunque se dispone de técnicas apropiadas para identificar horquillas y bucles, la determinación de las intersecciones es muy pobre (Laing y otros. JMB 2009, 393, 67-82) por lo que son necesarias nuevas herramientas que determinen los residuos localizados en dichas posiciones dentro de la estructura de los ácidos nucleicos. Descripción detallada de la invención
Compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open- paddlewheel) y su interacción con ácidos nucleicos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta {open-paddlewheef) y su aplicación al análisis estructural de moléculas de ARN que permita explicar, manipular o anular su función.
Los compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (i) de la presente invención constan de dos átomos de rutenio unidos por enlace metal-metal y soportados por tres ligandos puente (L-L) que forman, junto a los centros metálicos, un anillo, generalmente, de cinco eslabones (Barral y otros, Chem. Eur. J. 2007, 13, 10088-10095); en los compuestos de fórmula (i) las otras dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por ligandos monodentados y/o bidentados quelato; con la salvedad de (cuando
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0003
Los tres ligandos puente (L-L) se seleccionan del grupo formado por: formamidinato, guanidinato, tríazenuro, aminopiridinato, amidato, carboxilato, hidroxipirídinato, acetamidinato y/o benzamidinato. Los ligandos monodentados y/o bidentados quelatos se seleccionan del grupo formado por: haluros, pseudohaluros, sulfato, agua, etanol, DMSO, amoniaco, alcóxidos, alquilos.
Figure imgf000005_0001
En la presente invención se entiende por ligandos monodentados aquellos ligandos que poseen un único punto de anclaje al centro de coordinación. Por ligandos bidentados quelato se entiende aquellos ligandos que se coordinan a un único átomo central mediante dos grupos dadores. Asimismo, en esta memoria descriptiva, se entiende por ligandos puente aquellos ligandos que se enlazan simultáneamente a dos átomos centrales, es decir, los ligandos puente se unen a los dos átomos centrales para producir entidades de coordinación dinucleares.
Asimismo, en la presente invención, por capacidad coordinativa se entiende la tendencia que posee una especie para actuar como ligando con respecto a la posibilidad de ejercer de contraión o mantenerse libre. Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para sintetizar compuestos de dinutenio con estructura de rueda de paletas abierta que comprende los siguientes pasos:
a) Síntesis de compuestos de fórmula
Figure imgf000005_0003
Br, I) a partir de mediante sustitución parcial de
Figure imgf000005_0005
los grupos carboxilato, bien por calentamiento a reflujo o por síntesis solvotermal asistida por microondas.
b) Síntesis de compuestos de fórmula
Figure imgf000005_0004
mediante la adición de ácido hidrácido a una suspensión de
Figure imgf000005_0006
Figure imgf000005_0002
Opcionalmente, puede incluirse el siguiente paso:
c) Síntesis de otros compuestos de fórmula
Figure imgf000006_0001
tiocianato y/o cianato) mediante intercambio de los ligandos haluro en
] por ligandos pseudohaluro.
Figure imgf000006_0005
En este método, los ligandos puente (L-L) de los compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel) se seleccionan del grupo formado por. formamidinato, guanidinato, triazenuro, aminopirídinato, amidato, carboxilato, hidroxipirídinato, acetamidinato y/o benzamidinato.
Las disoluciones de los compuestos con estructura de rueda de paletas abierta sin ocupar las posiciones axiales generalmente no son muy estables, lo que dificulta su uso. En la presente invención, para solucionar este problema, se estabilizan los compuestos en dimetilsutfóxido (DMSO) o en etanol, que se coordinan a las posiciones axiales, lo que supone una mejora en la estabilidad de los compuestos en disolución y facilita su uso. De esta forma se mejora la estabilidad y manejo de los compuestos sin reducir su reactividad.
Si el compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta es soluble en medio acuoso, se puede preparar directamente una disolución del compuesto en agua, pero esto no es lo habitual. En ei caso de que el compuesto no sea suficientemente soluble en agua, la presente invención incluye disoluciones en DMSO o en etanol. Para ello, se disuelve el compuesto de dirrutenio en la mínima cantidad de DMSO o etanol y luego se diluye con agua hasta conseguir la concentración más adecuada para el procedimiento que se vaya a seguir. Otro aspecto de la invención, por lo tanto, se refiere a un procedimiento para preparar las disoluciones, que comprende:
a) Preparación de una disolución de
Figure imgf000006_0002
pseudohalogenuro u otro anión con capacidad coordinativa; Y = ligando neutro como agua, DMSO o etanol; n = 1 , 2): Se pesan entre 1 y 5 mg de compuesto de dirrutenio
Figure imgf000006_0004
o de un compuesto de dirrutenio y se disuelven en un disolvente que
Figure imgf000006_0003
estabilice el compuesto, como DMSO o etanol para formar disoluciones con una concentración entre 1.5 y 2.5 mM.
b) La disolución de [Ru2(L-L)3X2Yn] en DMSO o etanol se diluye en agua hasta conseguir concentraciones del orden de mil veces inferiores.
La invención también se refiere a un método para la determinación de las intersecciones entre hélices y/o de la transición entre hélices y bucles en moléculas de ARN que incluye:
a) inducir el plegado en conformación nativa de ARN procedente de una muestra aislada o sintetizado in vitro,
b) tratar el ARN plegado con una disolución de compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta,
c) utilizar el ARN tratado con dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta como molde en reacciones de transcripción reversa (RT) con cebadores marcados,
d) identificar las paradas especificas de la RT del paso c).
El compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta de los pasos b) y c) se utiliza preferentemente en medio acuoso. En aquellos casos en los que el compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta no sea estable en agua, se estabiliza preferentemente en DMSO o bien con etanol para que actúen como ligandos y estabilizar el compuesto. Por otro lado, el tratamiento del ARN plegado se realiza preferentemente bajo condiciones controladas de pH, concentración de iones monovalentes y divalentes, temperatura y tiempo. Una vez replegado el ARN en su conformación nativa, al tratarse con una mezcla del compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta en medio acuoso, se establece una unión covalente entre la especie de dirrutenio y los nucleótidos del ARN localizados en el extremo o inmediatamente contiguos a una hélice, o bien en la intersección entre hélices (figura 2).
Preferentemente el compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abiertas de los pasos b) y c) es el compuesto de fórmula (i) donde los dos átomos de Ru, unidos por enlace metal-metal, están soportados por tres ligandos puente (L-L) que forman, junto a los centros metálicos, un anillo; las otras dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por ligandos monodentados y/o bidentados quelato. Como control de la reacción se utiliza ARN plegado de la misma forma y diluido en el mismo medio acuoso (de aquí en adelante denominado ARN- control), conteniendo DMSO o etanol en la misma concentración a la que ese disolvente se haya empleado para disolver el compuesto de dirrutenio en aquellos casos en que haya sido necesaria la adición de un disolvente.
En cuanto a las reacciones de RT, la incubación del ARN con el complejo de dirrutenio con estructura rueda de paletas abierta provoca la parada específica de la enzima transcríptasa reversa (RT) en el nucleótido anterior a la posición reactiva a dirrutenio. Para la RT se utilizan cebadores marcados con un fluoróforo, o bien con 32P en su extremo 5'.
Para identificar las paradas especificas de la RT, además del ARN-control, se realizan reacciones de secuenciadón del ARN con el mismo cebador utilizado para la RT pero marcado con otro fluoróforo. A continuación, se separan los productos de la secuenciación por electroforesis capilar junto con los productos de la RT. Otra opción es detectarlos en geles desnaturalizantes acrilamida-urea en el caso de que se hayan marcado los cebadores con 32P. La intensidad de los productos de parada de la RT en el ARN tratado es cuantificada y normalizada con respecto al ARN-control. La reactividad resultante se representa frente a la posición nucleotídica (figura 3). Finalmente, se adscriben los nucleótidos reactivos a dirrutenio en la estructura secundaria del ARN por comparación con datos de reactividad obtenidos con compuestos conocidos en el estado de la técnica (por ejemplo, NMIA) que determinan la posición de bucles y regiones desapareadas, asi como los nucleótidos no reactivos que forman enlaces de hidrógeno en regiones apareadas. La identificación de las paradas especificas de la RT, es decir, de los productos obtenidos en la RT con dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta, permite identificar nucleótidos del ARN localizados en el extremo o inmediatamente contiguos a una hélice, o bien en la intersección entre hélices que es donde, específicamente, interaccionan los compuestos de la invención con el ARN. Los resultados de reactividad del ARN a los compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (Figura 2, derecha) se han comparado con datos experimentales de determinación de estructura con agentes que atacan nucleótidos localizados en bucles y, en general, regiones desapareadas (figura 2, izquierda). A su vez, resultados de análisis mutacional y datos de covariación de secuencia indican los nucleótidos que forman hélices. La combinación de todos los datos indicados nos han permitido concluir que los sitios de ataque del compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta se localizan en las intersecciones de hélicesy/o en la transición entre hélices y bucles del ARN.
Las hélices son elementos básicos de la estructura secundaria del ARN que sostienen la forma tridimensional de la molécula nativa y, por ello, determinan la fundón del ARN. A día de hoy no se dispone de metodologías capaces de identificar específicamente nucleótidos localizados en las intersecciones de hélices y/o en la transición entre hélices y bucles en ácidos nucleicos. Por ello, la disposición estructural de estos nucleótidos se modela a partir de datos negativos, lo que ha supuesto limitaciones en su estudio. La invención presentada constituye una nueva herramienta en el estudio de la estructura de los ácidos nucleicos, por lo que es de gran interés científico inmediato y tecnológico a corto plazo, en el ámbito de la biología molecular y estructural. Otro aspecto de la invención se refiere a las combinaciones de los complejos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta con ácidos nucleicos y, más concretamente con moléculas de ARN.
La existencia de interacciones especificas del ARN con compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta también puede utilizarse para mejorar la capacidad de cristalización de las moléculas de ARN para su estudio por difracción de rayos X. Además, la existencia de átomos pesados produce un aumento en la intensidad de las reflexiones, lo que facilita la obtención de datos cristalográficos.
Por último, este tipo de interacciones compuesto de dirrutenio-ARN puede utilizarse para deformar la estructura del ARN inhabilitándolo.
La invención también se refiere a un kit para el análisis de moléculas de ARN que incluye: uno o varios compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta, un tampón adecuado para el tratamiento del ARN y las instrucciones de uso. Preferentemente, el compuesto o los compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta incluidos en el kit tienen la fórmula (i) donde los dos átomos de Ru, unidos por enlace metal-metal, están soportados por tres ligandos puente (L-L) que forman, junto a los centros metálicos, un anillo; las otras dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por ligandos monodentados y/o bidentados quelato.
Además, los ligandos puente de los compuestos de dirrutenio se seleccionan del grupo formado por: formamidinato, guanidinato, tríazenuro, aminopiridinato, amidato, carboxilato, hidroxipiridinato, acetamidinato y/o benzamidinato. Por otro lado, el/los compuestos de dirrutenio que se incluyen en el kit pueden estar estabilizados con DMSO o con etanol. Adicionalmente, el kit puede contener un disolvente, preferentemente, DMSO o etanol. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación ORTEP de la estructura cristalina del compuesto
Figure imgf000010_0003
en la que se indican los átomos de rutenio (Ru), nitrógeno (N), cloro (Cl), oxigeno (O) y azufre (S). Los átomos de carbono no están etiquetados y los átomos de hidrógeno han sido omitidos por claridad.
Figura 2. Modelo de la estructura secundaría del ARN en el que se muestra los valores de reactividad con NMIA (izquierda; tomado de Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281, 3685-3700) y con el compuesto
(derecha) según la escala de grises.
Figure imgf000010_0002
Figura 3. Reactividad normalizada del ARN en función de la posición del nucleótido. La intensidad de la reactividad se cuantifica con la escala de grises que se muestra.
Modo de realización de la invención
Ejemplo 1. Preparación de los complejos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta.
1.1. Síntesis solvotermal activada por microondas de compuestos de fórmula
Figure imgf000010_0001
Se introdujeron 0,5 mmol de
Figure imgf000011_0005
[ ( ) ], , de Ν,Ν'- difenitformamidina, 0,5 ml_ de trietilamina y 3,5 mmol de LiCI en un recipiente de teflón de 85 ml_ con 8 mL de THF (tetrahidrofurano). El recipiente se cerró herméticamente y se introdujo en un horno microondas con control de temperatura y de presión. Se mantuvo la mezcla a 128 °C durante 60 min y a continuación se evaporaron los componentes volátiles de la mezcla. El residuo obtenido se trató con tolueno y la disolución se llevó a sequedad. El sólido se lavó con éter de petróleo. Rendimiento: 40-60%.
1.2. Síntesis solvotermal activada por microondas de compuestos de fórmula
Figure imgf000011_0001
[ ( )( ) ] ( )
Se introdujeron 0,5 mmol de
Figure imgf000011_0002
[ ( ) ], , mmol de Ν,Ν'- difeniltriazeno, 0,5 mL de trietilamina y 3,5 mmol de LiCI en un recipiente de teflón de 85 mL con 8 mL de THF (tetrahidrofurano). El recipiente se cerró herméticamente y se introdujo en un horno microondas con control de temperatura y de presión. Se mantuvo la mezcla a 128 °C durante 60 min y a continuación se evaporaron los componentes volátiles de la mezcla. El residuo obtenido se trató con éter etílico y la disolución se llevó a sequedad. El sólido se lavó con éter de petróleo. Rendimiento: 40-60%.
1.3-1.7. Preparación de compuestos con estructura de rueda de paletas abierta de fórmula
Figure imgf000011_0006
dianisilformamidinato, N.N'-difeniltríazenuro, trifenilguanidinato, 2,4,6- trimetilaminopiridinato, 6-cloro-2-oxopirklinato).
Se suspendieron 0,5 mmol de compuesto
Figure imgf000011_0003
[R 5 10 mL de un disolvente polar como metanol o agua y se añadieron 6- 10 gotas de ácido clorhídrico al 35%. La mezcla se dejó agitando durante una hora a temperatura ambiente. El sólido se filtró y se lavó con éter etílico. Rendimiento: 35-65%.
Ejemplo 2. Preparación de las disoluciones
2.1.1. Preparación de una disolución de
Figure imgf000011_0004
en DMSO.
Se pesaron 2.5 mg de [Ru2(PhNCHNPh)3Cl2], obtenido según el ejemplo 1.1., para formar 1.5 mL de disolución 1.94 mM en DMSO. 2.1.2. Preparación de una disolución de
Figure imgf000012_0001
en DMSO/agua.
La disolución preparada según el procedimiento descrito en 2.1.1. se diluyó con agua hasta conseguir una concentración 10 μΜ de
Figure imgf000012_0008
2.2.1. Preparación de una disolución de
Figure imgf000012_0002
en DMSO )
Se pesaro
Figure imgf000012_0003
n 2.5 mg de obtenido según el ejemplo 1.2., para formar 1.5 mL de disolución 1.94 mM en DMSO.
2.2.2. Preparación de una disolución de
Figure imgf000012_0007
en DMSO/agua.
La disolución preparada según el procedimiento descrito en 2.2.1. se diluyó con agua hasta conseguir una concentración 10 μΜ de
Figure imgf000012_0004
La especie cristalizada a partir de las disoluciones de DMSO o de las disoluciones DMSO/agua obtenida según los ejemplos 2.1.1. y 2.1.2., respectivamente, es la misma:
Figure imgf000012_0005
Ejemplo 3. Tratamiento del ARN con compuestos de dirrutenio con estnjctura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheelj.
Se empleó el ARN ya utilizado en Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281 , 3685- 3700. El ARN (2 pmol) se incubó con una disolución 10 μΜ del compuesto de dirrutenio
Figure imgf000012_0006
Antes del tratamiento, el ARN sintetizado in vitro se replegó mediante desnaturalización a 95 °C durante 2 min en 5mM TRIS, pH 8, 0.5 mM EDTA y enfriamiento rápido en hielo durante 2 min, seguido de incubación en tampón de plegado (100 mM HEPES-KOH, pH 8.0, 0.5 mM MgCI2, 100 mM NaCI) durante 20 min a 37 °C en un volumen final de 18 pL (Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281 , 3685-3700). Seguidamente, el ARN se incubó con DMSO al 10% de concentración final (ARN-control) o con una disolución 10 μΜ de dirrutenio en DMSO/agua, preparado según el ejemplo 2, durante 15 minutos a 37 °C. Finalmente, el ARN tratado y el ARN-control se precipitaron con 2.5 volúmenes de etanol y se resuspendieron en 10 \iL de 5 mM TRIS, pH 8, 0.5 mM EDTA. Ejemplo 4. Reacción de extensión de cebador
El ARN tratado y el ARN-control (2 pmol) se incubaron, por separado, con un cebador de secuencia complementaría al ARN (2 pmol) y marcado en 5' con un fluoróforo (descrito en Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281 , 3685-3700) a 65 °C durante 5 min, después otros 5 min a 35 °C y, finalmente, se enfriaron 2 min con hielo. La reacción de extensión de cebador se realizó en un volumen final de 16 \iL, en presencia de un tampón de transcriptasa reversa (50 mM TRIS-HCI, pH 8.3, 3 mM MgCI2, 75 mM KCI, 8 mM DDT) y 1 μΜ de cada dNTP. La mezcla se calentó a 52 °C durante 1 min antes de añadir 100 U de Superscript III RT (Invitrogen) e incubar a 52 °C durante 30 min. En paralelo, se realizó una reacción de secuenciación con el mismo ARN bajo estudio (1 pmol), 0.1 mM ddCTP (terminador de cadena) y 0.5 mM cada dNTP. El cebador marcado con el fluoróforo NED (Applied Biosystems) se usó tanto para la muestra de ARN tratada como para el ARN-control, mientras que la reacción de secuenciación se realizó con el cebador marcado con fluoróforo FAM. Los productos resultantes de la RT junto con la reacción de secuenciación se resolvieron por electroforesis capilar. Ejemplo 5. Análisis de los datos de la reacción de extensión de cebador
Los electroforegramas resultantes de la electroforesis capilar se analizaron mediante el programa QuSHAPE (Karabiber y otros, RNA 2013, 19, 63-67). Los valores de reactividad obtenidos para el nudeótido correspondiente del ARN-control se sustrajeron de los valores obtenidos para cada nudeótido del ARN tratado con el compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta. La reactividad de al menos 3 experimentos independientes se utilizó para calcular la media (tdesviación estándar). Los valores de reactividad cuantitativos se normalizaron a una escala de 0 a 2, en la que 0 representa nucleótidos no reactivos y la intensidad media de los nucteótidos reactivos se ajusta a 1 , tal y como se muestra en la figura 3.
En la electroforesis por secuenciación capilar, se separa la escalera de secuenciación junto al ARN tratado o el ARN-control, dado que cada reacdón lleva un fluoróforo diferente. Los picos de fluorescenda de la escalera obtenida con DDC (ver más arriba) marcan la posición de las guaninas en el ARN. Por ello, sirven para alinear los picos de la reacción de la RT con la posición nucleotidica correspondiente al ARN tratado. En el caso de cebadores marcados con 32P (como los descritos en Lozano y otros. FEBS J, 2014, 281 , 3685-3700), la escalera de secuenciaclón se prepara con los cuatro terminadores de cadena (DDC, DDG, DDA y DDT), y se cargan en el gel de secuenciación en paralelo a la RT del ARN tratado y el ARN-control. Por lo tanto, se pueden identificar todos los nucleótidos del ARN. La movilidad de las paradas de la RT en el ARN tratado, y en el ARN- control, es coincidente en el gel desnaturalizante con el nucleótido localizado en su misma posición.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuestos de dirrutenlo oon estructura de rueda de paletas abiertaen-peddlewhee/) de formula:
Figure imgf000015_0001
donde los dos ¿tomos de Ru, unidos por enlace metal-metal, están soportados por tres Hgandos puente (L-L) que forman, junto a los centros metáleos, un añilo; donde las dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por Hgandos monodentados y/o bidentados quelato; con la salvedad de [
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000015_0002
2. Compuestos de dinutonio oon estructura de rueda de paletas abiertaen-peddlewhee/) según la reivindicación 1 en los que tos ligandos puente (L-L) se seleccionan del grupo formado por rormamkJinato, guanidktato, triazenuro, aminopiridinato, amidato, carboxilato, hidroxipirídinato, acetamidinato y/o benzamidinato.
3. Compuestos de dimiten» oon estructura de rueda de patotas abiertaen-peddlewhee/) según cualquiera da las reivindicaciones 1-2 en tos que al menos una de las posiciones axiales (**) está ocupada por dimetilsulfoxido (DMSO) y/o etanoJ.
4. Disolución de un completo de drrutenk) con estructura de rueda de paletos abierta(open-peddlewhee/) según se define en la reivirxlicadón 3, en medio acuoso.
5. Método para elaborar compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel) que comprende los siguientes pasos: a) sintetizar compuestos de fórmula
Figure imgf000016_0004
] a partir de mediante sustitución parcial de los grupos
Figure imgf000016_0001
carboxilato,
b) sintetizar compuestos de fórmula
Figure imgf000016_0005
mediante la adición de ácido hidrácído (ΗΧ') a una suspensión de
Figure imgf000016_0006
Figure imgf000016_0003
y, opcionalmente,
c) sintetizar otros compuestos de fórmula
Figure imgf000016_0002
mediante intercambio de ligandos haluro X* por ligandos pseudohaluro X" seleccionados del grupo formado por azida, tiocianato y/o cianato.
6. Método para elaborar compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel), según la reivindicación 5, en los que los ligandos puente (L-L) se seleccionan del grupo formado por: formamidinato, guanidinato, triazenuro, aminopirídinato, amidato, carboxilato, hidroxiptridinato, acetamidinato y/o benzamidinato.
7. Método para elaborar compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel), según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que el paso a) se realiza por síntesis solvotermal asistida por microondas.
8. Método para la determinación de las intersecciones entre hélices y/o de la transición entre hélices y bucles en moléculas de ARN que incluye:
a) inducir el plegado en conformación nativa de ARN procedente de una muestra aislada o sintetizado in vibro,
b) tratar el ARN plegado con una disolución de compuesto de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta (open-paddlewheel),
c) utilizar el ARN tratado con dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta como molde en reacciones de transcripción reversa (RT) con cebadores marcados,
d) identificar las paradas específicas de la RT del paso c).
9. Método según la reivindicación 8 en el que el compuesto de dirrutenio de los pasos b) y c) tiene la fórmula (i) donde los dos átomos de Ru, unidos por enlace metal-metal, están soportados por tres ligandos puente (L-L) que forman, junto a los centros metálicos, un anillo; donde las dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por ligandos monodentados y/o bidentados quelato.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9 en el que ligandos puente de los compuestos de dirrutenio de los pasos b) y c) se seleccionan del grupo formado por: formamidinato, guanidinato, triazenuro, aminopiridinato, amidato, carboxilato, hidroxipirídinato, acetamidinato y/o benzamidinato.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 en el que el compuesto de dirrutenio de los pasos b) y c) está estabilizado con DMSO o con etanol.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en el que el compuesto de dirrutenio de los pasos b) y c) se utiliza en medio acuoso.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-12 en el que se incluye un ARN-control plegado y diluido en el mismo medio que el ARN del paso a).
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-13 en el que los cebadores utilizados en la RT están marcados con en su extremo 5'.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 que incluye, en el paso d), las siguientes fases:
1) realizar reacciones de secuenciación del ARN procedente de la muestra aislada o sintetizado in vitro,
2) separar los productos de la secuenciación de la fase 1) junto con los productos de la RT del paso c),
3) detectar los productos de la secuenciación y los productos de la RT,
4) cuantrñcar la intensidad de los productos de parada de la RT con respecto al ARN-control.
16. Uso de complejos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta o de sus disoluciones en el estudio y análisis del ARN.
17. Combinaciones de ARN con compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta.
18. Kit para determinar las intersecciones entre hélices y/o la transición entre hélices y bucles en moléculas de ARN que incluye uno o varios compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta y un tampón adecuado para el tratamiento del ARN.
19. Kit según la reivindicación 18 en el que el/los compuestos de dirrutenio con estructura de rueda de paletas abierta tiene la fórmula (i) donde los dos átomos de Ru, unidos por enlace metal-metal, están soportados por tres ligandos puente (L-L) que forman, junto a ios centros metálicos, un anillo; donde las dos posiciones ecuatoriales (*) y las dos posiciones axiales (**) están libres u ocupadas por ligandos monodentados y/o bidentados quelato.
20. Kit según la reivindicación 19 en el que los ligandos puente de los compuestos de dirrutenio se seleccionan del grupo formado por: formamidinato, guanidinato, triazenuro, aminopiridinato, amidato, carboxilato, hidroxipiridinato, acetamidinato y/o benzamidinato.
21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 19-20 en el que el/los compuestos de dirrutenio están estabilizados con DMSO o con etanol.
22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 19-21 que incluye disolvente seleccionado del grupo formado por DMSO y etanol.
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