WO2017006046A1 - Fixation de molécules organiques sur une matrice de silice poreuse. - Google Patents

Fixation de molécules organiques sur une matrice de silice poreuse. Download PDF

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WO
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solution
biologically active
amine
silica
phytase
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Inventor
Edith LE CADRE
Christophe TROUILLEFOU
Claude PLASSARD
Emmanuel BELAMIE
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Institut National D'etudes Superieures Agronomiques De Montpellier
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Agro Innovation International SAS
Original Assignee
Institut National D'etudes Superieures Agronomiques De Montpellier
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Agro Innovation International SAS
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)

Definitions

  • the invention relates to a process for binding biologically active organic molecules in a silica matrix using the combination of phospholipids and an amine, in particular an amino acid or dicyandiamide.
  • the attachment of an enzyme on a mineral support can be done by covalent bonding to the surface of the solid (also called coupling immobilization). It can also be carried out by adsorption of the molecule inside the pores of the support (for example by impregnating the support with a stirred enzyme solution), by encapsulation in semi-permeable membranes or by trapping the protein. in a porous matrix manufactured by a sol-gel process.
  • the advantage of enzyme binding by a sol-gel process in mineral or organo-mineral matrices is the low loss of enzymes by leaching; however, the enzymes enclosed in such a matrix are generally not very accessible and problems of diffusion of the molecules of the substrate towards the outside related to the structure of the material, the opening of its porous network and the diameter of its pores.
  • Porous or mesoporous silica matrices are generally prepared by condensation of silica around organic surfactant compounds. active ingredients, which are then totally or partially removed to generate the pore volume.
  • MTS Mesoporous Tensioactive Structurants, or Miel-Templated Silica
  • organic surfactant phases used may be organized, depending on the case, in lamellar, hexagonal or cubic structure.
  • the silicate ions polymerize and form a three-dimensional network around aggregates of organic molecules.
  • the available porosity after removal of the structurant may be higher or lower and its shape results directly from the structure of the organic phases that have been prepared.
  • MCM-41 hexagonal
  • MCM-48 cubic 3-D structure of Matter No. 48 of the name of the company that made them for the first time in 1992
  • KIT-6 cubic 3-D structure of symmetry
  • a preparation process uses the combination of phospholipids and a fatty amine comprising a C 8 -C 2 aliphatic chain.
  • Fatty amines are generally used to catalyze the hydrolysis and polycondensation reaction of silica precursors. The hydrolysis / condensation reaction can thus be carried out in more basic reaction conditions. It is taught in this document that fatty amines, when used alone to prepare the structured organic phase, make it possible to obtain hexagonal mesoporous silicas but that the activity of the immobilized enzymes is insufficient. Associated with phospholipids, they make it possible to obtain a better apparent activity of the immobilized enzyme
  • Laveille et al. have proposed the synthesis of materials encapsulating an enzyme (glucose oxidase) based on the condensation of amorphous silica from an alkoxide precursor, around an ordered phase of phospholipids ⁇ Laveille, et al, 2010).
  • the source of phospholipids (PL) used in this document is egg lecithin consisting of at least 50% phosphatidylcholine (PC), and in particular phosphatidylethanolamine (PE).
  • the concentration of lecithin and the nature of the solvent medium are determining parameters for the structure of the final material.
  • the solvent used for the dilution of lecithin and in which the sol-gel reactions are carried out, is a mixture of aqueous sodium acetate buffer (AcNa) and ethanol (EtOH) in variable proportions.
  • SMS sponge mosoporous silica
  • NPS nanoporous silica capsules
  • isotropic 3-D porous network a sponge-like structure with an isotropic 3-D porous network.
  • dodecylamine an aliphatic chain amine deemed toxic. It would therefore be interesting to be able to manufacture 3-D structure materials without the use of a toxic molecule.
  • a sponge structure has numerous tortuosities which can cause problems for the diffusion of substrates and enzymatic reaction products.
  • the matrices obtained have a 3-D structure better defined than that of SMS or NPS, cubic bi-continuous, as demonstrated by X-ray diffractograms. Finally, the formation process of these products does not require the use of dodecylamine or other toxic molecule.
  • the product of the invention also has the advantage of being biodegradable and based on natural molecules that respect the environment, non-contaminating for the ecosystem and humans. Indeed, once the enzyme is added to the plant, the silica matrix dissolves gradually in the soil in contact with water.
  • the amine of small size used in the context of the invention is a natural amine or has been authorized for use in agriculture, thus having the advantage over synthetic amines not to exhibit any toxicity character for the man or his ecosystem.
  • mesoporous silicas to encapsulate enzymes that can be used in agriculture and directly in the soil, in particular as fertilizers.
  • Burns et al. (2013) mention the interest of protecting the enzymatic activity of soils for the purpose of bioremediation or protection of enzymes with soil organic matter.
  • Trouillefou et al (2015) describes a phytase immobilized in a mesoporous silica that can be used for the phosphorus nutrition of plants.
  • the resulting material is called KIT-6.
  • the process for incorporating the enzymatic activity into the porous structure first comprises the synthesis of the silicic material, its calcination at high temperature to eliminate the texturing agent (copolymer) and finally the impregnation of the material obtained. using a solution of the enzyme.
  • Such a method therefore does not allow to retain the phospholipidic organic component of the silicic matrix because of the calcination step.
  • the encapsulation process is not always satisfactory and the reagents and the synthesis steps of KIT-6 induce a fairly high production cost which could be very significant for production on an industrial scale.
  • the enzyme is not always sufficiently fixed inside the matrix.
  • the present invention therefore relates to a process for binding a biologically active organic molecule within a silica matrix, said method comprising the following steps:
  • aqueous solution (A) containing an amine selected from amino acids, oligopeptides, amines comprising a nitrile group, urea and mixtures thereof preparing an alcoholic solution (B) of at least one alcohol in Ci-C 6 and at least one phospholipid, and preparing an aqueous solution (C) of the biologically active molecule,
  • step (3) incorporating the solution (C) in the mixture obtained at the end of step (2), (4) adding to the mixture obtained at the end of step (3), at least one tetraalkoxysilane, and then allowing to stand for a time sufficient to obtain porous solid particles based on silica containing the biologically active molecule.
  • the invention also relates to the products that can be obtained by such a method.
  • the present invention relates to a biologically active organic molecule fixed within a silica matrix that can be obtained by the method according to the invention.
  • This molecule fixed within the silica matrix therefore advantageously has the form of a porous solid particle based on silica, in particular a mesoporous silica particle, within which the active molecule is incorporated as described hereinabove. after in the paragraph on step (4).
  • the subject of the invention is also the use of the products according to the invention in various fields, in particular agriculture, in particular for the nutrition of plants.
  • Such products when based on phosphatases, may for example be spread on crops in order to transform in situ the sources of non-assimilable organic phosphorus by the plant into orthophosphate ions.
  • enzymes capable of mineralizing soil organic matter can be encapsulated and used as a supported biocatalyst when spread on crops and thus allow a recycling of nutrients nitrogen, potassic or micronutrients.
  • amylases, ureas, cellulases enter the decomposition of organic matter and allow the release of forms of nitrogen assimilable by plants.
  • the silica matrix obtained according to the process of the invention is a mesoporous silica.
  • This aqueous solution comprises (advantageously consists of) water and an amine selected from amino acids, oligopeptides, amines comprising a nitrile group, urea and mixtures thereof.
  • the amine is therefore chosen from amino acids, oligopeptides, amines comprising a nitrile group, urea and mixtures thereof, more advantageously from amino acids and amines comprising a nitrile group.
  • amino acids natural amino acids and in particular apolar amino acids, such as for example valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, glycine, alanine and proline, in particular the L isomers of these amino acids, are preferred since it is about natural amino acids.
  • alanine in particular DL-alanine, which is less expensive, is preferred.
  • oligopeptides mention may be made of dipeptides such as glycyl glycine.
  • the amines comprising a nitrile group are primary amines, secondary amines or tertiary amines, in particular the amine is a guanidine and / or cyanamide derivative such as 2-cyanoguanidine (dicyanodiamide).
  • Dicyanodiamide is commonly used in agriculture as an inhibitor of the activity of nitrifying bacteria. It is an amino molecule that does not contain an aliphatic chain.
  • the amine of the aqueous solution (A) according to the invention is chosen from alanine and 2-cyanoguanidine.
  • the aqueous solution (A) is free of oligosaccharides such as mono- or di-saccharides, for example beta-D-lactose or glucose, glycerol, sorbitol, or else polyhydroxylated synthetic polymers such as polyvinyl alcohol or polymers of unsaturated carboxylic acids.
  • oligosaccharides such as mono- or di-saccharides, for example beta-D-lactose or glucose, glycerol, sorbitol, or else polyhydroxylated synthetic polymers such as polyvinyl alcohol or polymers of unsaturated carboxylic acids.
  • the pH of the aqueous solution (A) is advantageously between
  • aqueous solution A is buffered, for example with the aid of a sodium acetate buffer.
  • Alcoholic solution f B) is buffered, for example with the aid of a sodium acetate buffer.
  • This solution comprises (advantageously consists of) at least one C 1 -C 6 alcohol and at least one phospholipid.
  • C 1 -C 6 alcohol means any linear or branched C 1 -C 6 alkyl group substituted by one or more -OH groups, advantageously by a single -OH group.
  • phospholipids within the meaning of the present invention includes phosphate diglycerides preferably comprising a cationic nitrogen group bound to the phosphate group.
  • examples of such phospholipids include phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine. These phospholipids are generally used in the form of mixtures obtained from various natural sources such as lecithins, for example lecithin extracted from egg yolk or lecithin extracted from soya.
  • a lecithin containing at least 50% of 1-alpha-phosphatidylcholine is used as phospholipid. It is also possible to use a lecithin containing at least 95% by weight of phosphatidylcholine.
  • the concentration of phospholipid in the alcoholic solution (B) is preferably between 20 and 100 mg / ml, preferably between 30 and 80 mg / ml, in particular between 34 and 77 mg / ml.
  • Alcohol Ci-C 6 may be, for example methanol or ethanol, in particular ethanol, particularly ethanol at least 96% and advantageously 99% ethanol.
  • the alcoholic solution (B) may further comprise an amine selected from amino acids, oligopeptides, amines comprising a nitrile group, urea and mixtures thereof.
  • the mass ratio between the phospholipid and the amine in the solution (B), when the solution (B) comprises an amine is between 10/1 and 60/1, preferably of the order of 47/1. .
  • the total concentration of phospholipids in the final mixture (A + B + C) should be sufficient to observe the formation of the three-dimensional phase.
  • the ratio between the phospholipids and the amine also has an influence on the size of the micelles and, consequently, the pore size of the mesoporous silica.
  • the Applicant has obtained satisfactory porosities when the mass ratio between the phospholipid and the amine in the final mixture (A + B + C) is between 1/1 and 20/1, preferably between 2/1 and 10 / 1.
  • the mass ratio between the C 1 -C 6 alcohol and the water is between 57/48 and 55/45 in the final mixture (A + B + C).
  • an aqueous solution (C) is prepared: the biologically active molecule is dissolved in a suitable quantity of water.
  • the aqueous solution (C) is devoid of carbohydrate, in particular oligosaccharide such as mono- or di-saccharides, for example beta-D-lactose or glucose, glycerol, sorbitol, or polyhydroxylated synthetic polymers such as polyvinyl alcohol or polymers of unsaturated carboxylic acids.
  • oligosaccharide such as mono- or di-saccharides, for example beta-D-lactose or glucose, glycerol, sorbitol, or polyhydroxylated synthetic polymers such as polyvinyl alcohol or polymers of unsaturated carboxylic acids.
  • composition of the reaction solution of the process steps of the present invention can be defined more particularly with respect to the total amount of silica precursor used.
  • tetraalkoxysilane per mole of tetraalkoxysilane, preferably is used 14-112 moles of H 2 0, 10 "7-10" 3 mol of at least one biologically active molecule, 0.05 to 0, 20 moles of at least one phospholipid, 0.04 to 0.16 moles of at least one amine and 8.5 to 34 moles of at least one C 1 -C 8 alcohol.
  • the pH of the aqueous solution (A) and the pH of the aqueous solution (C) are preferably identical and chosen so as to stabilize the biologically active molecule if necessary, in particular between 4.5 and 7, more particularly between and 7, still more particularly between 5.5 and 6.5. It can in particular be chosen between 5 and 6 and advantageously be 5.5 or be chosen between 6 and 7 and advantageously be 6.
  • the term "lyotropic mesophase” is understood to mean the liquid-crystal phase whose formation is related to the concentration of the mesogenic molecules.
  • the characterization of these phases is conventionally carried out by optical microscopy in polarized light and X-ray diffraction at small angles.
  • the solution (B) is added to the solution (A) with stirring.
  • the meaning of this addition is very important. Indeed, if we added solution (A) in solution (B), we would not get the formation of this mesophase.
  • the solution (B) is added dropwise to the solution (A).
  • stirring is carried out using a bar magnet at a rotational speed of between 300 and 1000 rpm for a period of between 5 and 15 minutes.
  • the mixture (A + B) is advantageously stirred, in particular at 900 rpm, for 10 minutes, that is to say until the formation of the lyotropic mesophase.
  • Step (3) Addition of the solution (C) in the mixture (A + B)
  • Solution (C) is added to the solution (A + B) with stirring, advantageously with a magnetized bar, in particular at a rate of rotation between 700 and 900 revolutions per minute, for a period of between 10 and 20 minutes.
  • the meaning of this addition is very important. Indeed, if one added the solution (A + B) in the solution (C), one would not obtain the desired product.
  • the solution (C) is added dropwise to the solution (A + B).
  • the solution obtained is the mixture (A + B + C), whose X-ray diffraction analysis gives a diagram presenting a three-dimensional mesophase (FIG. 2), that is to say a network of pores oriented in three directions. from space.
  • the characterization of these phases is conventionally carried out by optical microscopy in polarized light and X-ray diffraction at small angles.
  • the solution (A + B + C) is advantageously maintained with vigorous stirring (for example 900 rpm) for another 10 minutes.
  • the tetraalkoxysilane, precursor of the silicic matrix may be chosen from tetraalkoxysilanes of formula Si (O-Rl) 4 , tetraalkoxysilanes of formula Si (R2) n (O-R2) 4 and mixtures thereof, each R 1 and R 2 independently represents a linear or branched C 1 -C 4 , preferably C 1 -C 2 , alkyl radical and n being 1, 2 or 3.
  • Tetraethoxysilane (TEOS) is the particularly preferred silica precursor.
  • the addition of the silica precursor is preferably carried out with stirring to ensure good homogenization of the various ingredients. Stirring is generally maintained for a few minutes, preferably for 5 to 120 minutes, especially for 90 to 120 minutes.
  • TEOS a darkening of the coloring of the mixture is observed as well as of its texture which thickens at the same time. Over time, the precipitation of fine silica particles in suspension is observed.
  • Precursor quantities of silica, in particular TEOS in Particularly of "reagent" quality, between 0.4 and 0.8 ml are preferred for carrying out the syntheses.
  • reaction solution is then allowed to stand for several hours, preferably for 2 to 48 hours, particularly for 4 to 30 hours, more preferably for 20 to 30 hours, during which the polycondensation reaction of the tetraalkoxysilanes takes place.
  • this maturation is carried out at a temperature of between 20 and 35 ° C., in particular of approximately 33 ° C.
  • the temperature should not be too high to avoid degradation of the active molecule.
  • the fine silica particles observed sediment and the turbidity of the mixture decreases.
  • two phases are present in the mixture: one solid and the other composed of a yellowish aqueous mixture.
  • These particles can be separated from the reaction medium by simple filtration, for example on sintered glass, or by centrifugation. They are then preferably washed with a solvent or mixture of solvents to preserve the activity of the biological molecules. It is particularly preferred to wash the particles with a buffer solution, in particular sodium acetate, at a pH of between 4 and 7, in particular between 5 and 7, more particularly between 5.5 and 6.5. It may in particular be chosen between 5 and 6 and advantageously be 5.5 or be chosen between 6 and 7 and advantageously be 6.5.
  • a buffer solution in particular sodium acetate
  • vacuum drying is preferred for a period of between 24 and 48 hours.
  • the silica particles according to the invention generally have an average size in volume, advantageously a volume average diameter (D50) of between 10 and 25 ⁇ m, in particular between 10 and 20 ⁇ m. ⁇ , measured by laser granulometry with the Malvern Instruments Mastersizer 2000 in an acetate buffer as shown in Figure 3 and a spherical shape, as shown in Figure 4.
  • D50 volume average diameter
  • Their pore volume obtained after calcination at a temperature between 450 ° C. and 650 ° C. for 6-10 hours in air is determined from nitrogen adsorption isotherms at 77 K, and is generally between 0.09 and 0.11 ml / g, preferably it is 0.10 ml / g (as for example shown in Figure 5).
  • the average pore size determined by the Derjaguin-Broekhoff-de Boer method (DBdB) from nitrogen desorption isotherms at 77 K, is between 3.5 and 4.5 nm.
  • the specific surface area of the silica particles measured by the Brunauer method, Emmett and Teller (BET) from the nitrogen adsorption-desorption isotherms at 77 K, is generally between 30 and 50 m 2 / g, preferably it is 40 m 2 / g.
  • TMC TMC
  • the structuring agent serving as an organic template phospholipid, in particular lecithin with 50% of the phosphatidylcholine, Sigma-Aldrich
  • a co-structurant amine, in particular acid amine or dicyandiamide DCD 99.5%
  • absolute ethanol in particular 99%, for dissolving phospholipids and forming bilayers, water, a salt (sodium acetate) and a precursor of silica (TEOS , Fluka).
  • the method of the present invention can be used to immobilize in any porous solid matrix any biologically active molecule, that is, any molecule capable of reacting with living organisms and therefore playing a specific role in the metabolism.
  • This type of molecule may be of natural or synthetic origin, such as a hormone, an enzyme or the active substance of a medicament or a plant protection product.
  • it is an enzyme for example amylases, ureas, cellulases and phosphatases such as phytases.
  • this molecule is soluble in water.
  • the biologically active molecule is preferably a protein whose mean diameter is between 4 and 25 nm, in particular between 5 and 25 nm, preferably between 5 and 14 nm, according to the measurement method disclosed in Oakley AJ et al. (2010) for Aspergillus niger phytase phyA or according to the Protein Data Bank http://wvvw.rcsb.org.
  • proteins examples include phosphatases, and in particular a phytase.
  • Natural enzymes, phytases play an essential role in the phosphorus cycle by hydrolyzing phytates or phytic acids contained in plants.
  • PAH acid phosphatase histidine
  • BPP beta-helix phytase
  • PAP purple acid phosphatase
  • CP cysteine phosphatase
  • phytases show a broad substrate specificity. They have the ability to hydrolyze many phosphorylated compounds, such as ADP, ATP, phenyl phosphate, fructose 1,6-bisphosphate, glucose-6-phosphate, glycerophosphate and 3-phosphoglycerate. Only a few phytases are specific for phytic acid, especially BPP.
  • the phytases are chosen from acid phosphatases capable of effecting the hydrolysis of five of the six phytate phosphate groups, in particular the 6-phytase called myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase (EC classification number 3.1.3.26). 4-phytase (EC 3.1.3.26) and 5-phytase (EC 3.1.3.72) can also be used.
  • the phytase used is a recombinant phytase (EC 3.1.3.26) from a concentrated extract of the enzyme whose concentration is 80 mg / ml.
  • the phytase extract was obtained by overexpression of the phyA gene of Aspergillus niger by the yeast Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004).
  • the phytases are chosen from beta-helix phytases (BPP).
  • the phytases are a mixture of phytases, in particular a mixture between the recombinant phytase (EC 3.1.3.8) derived from Bacillus subtilis eX. the recombinant 6-phytase (EC 3.1.3.26) obtained by overexpression of the phyA gene of Aspergillus niger by the yeast Pichia pastoris.
  • any biologically active molecule whose mean volume diameter, measured for example by laser particle size, in particular with a Malvern particle size analyzer, is between 4 and 25 nm, in particular between 5 and 25 nm, preferably between 5 and 14 nm, and in particular soluble in water.
  • the enzymes immobilized inside a matrix obtained according to this process have excellent specific activities, good resistance to reaction conditions, are easy to recover by simple filtration or by centrifugation, can thus be reused a large number of times and are inexpensive to produce.
  • the biocatalysts obtained are also highly resistant to the desorption or leaching of the enzymes ( ⁇ 200 ⁇ g phytase desorbable for 300 mg of phytases actually immobilized).
  • the product of the invention also has the advantage of being biodegradable and based on natural molecules that respect the environment, non-contaminating for the ecosystem and humans.
  • Silica can dissolve gradually in the soil in contact with soil water.
  • the present invention thus also relates to a biologically active organic molecule fixed within a silica matrix that can be obtained by the process according to the present invention.
  • the biologically active organic molecule which will be attached to the silica matrix is as described above.
  • the biologically active organic molecule fixed within a silica matrix according to the invention therefore has the form of a silica particles obtained by the process according to the invention and can therefore have the characteristics indicated above at the end of step (4).
  • the biologically active organic molecule fixed within a silica matrix has a cubic 3-D bi-continuous structure, as demonstrated by the X-ray diffractograms (FIG. 7) and is therefore better defined than that of the sponge structures.
  • SMS or NPS of the prior art presence of additional diffraction peaks (comparison between the diffractogram of Figure 7 according to the invention and Figure 5 of Galarneau et al 2007, Figure 9 of Galarneau et al. Figure 6 of LAVEILLE et al., 2010).
  • the silica matrix on which the organic molecule is attached is non-toxic, in particular through the use of a non-toxic structuring agent, more particularly with respect to the environment and more generally to the cultivation of plants. and soil organisms.
  • the silica matrix retains its phospholipidic organic component, which is not the case for example with products obtained using the method described in Trouillefou et al (2015) because of the step of calcination of the silicic material.
  • the percentage of immobilization of the organic molecule in the silica matrix is higher than that of the Trouillefou et al (2015) material.
  • the subject of the present invention is also a composition, in particular a phytopharmaceutical composition or a fertilizer composition, comprising the molecule fixed within a silica matrix according to the invention and an excipient, in particular a phytopharmaceutically acceptable excipient.
  • This composition may in particular consist of a fertilizer such as a nutrient solution, and may advantageously be in liquid or solid form.
  • the present invention further relates to the use of the product (molecule fixed within a silica matrix) obtained by the method described above or the composition comprising it as a crop fertilizer.
  • FIG. 1 represents the diagram of the steps of the method of the invention.
  • FIG. 2 represents the X-ray diffraction pattern of the solution A + B + C used for the manufacture of example la according to the invention illustrating the preexistence of a lyotropic mesophase formed from the phospholipid bilayers.
  • FIG. 3 represents the particle size distribution of particles (TMC) obtained by the method of example 1a according to the invention freshly synthesized (continuous line) and TMC of example 1a after 3 month in 0.5M AcNa buffer solution (dashed line) by laser granulometry.
  • Figure 4 shows a scanning electron micrograph of the vacuum dried TMC obtained in Example 1a.
  • FIG. 5 represents the nitrogen desorption adsorption isotherms of the
  • FIG. 6 shows the transmission electron micrographs of the TMCs synthesized with the amino (a) alanine and (b) DCD molecules (Examples 1a and 1b respectively).
  • Figure 7 shows (a) the TMC-alanine XRD diagram of Example 1a, (b) the X-ray diagram of the TMC-DCD of Example 1b and (c) the resolution model of the pn3m phase from FIG. indexation of peaks.
  • Figure 8 shows the comparison of the two supported biocatalysts KIT-6 10X and TMC according to Example 1b for (a) the amounts of Pi desorbed from the anion exchange resins and (b) the amounts of Pi present in the soil solution according to Example 3.
  • FIG. 9 represents the total amount of phosphorus accumulated in the root parts and aerial parts of M. truncatula plants after 30 days of culture under sterile conditions with phytate as the sole source of P according to Example 4.
  • Figure 10 represents the rate of incorporation in% of Aspergillus niger phytase in TMCs synthesized either from alanine (TMC-Alanine): or DCD (TMC-DCD): lb according to Example 1.
  • FIG. 11 represents the activity of the associated enzymes in the TMC material obtained according to Example 6.
  • This example illustrates the method of the invention applied to a recombinant phytase.
  • Two functional materials were prepared: one with alanine and the other with dicyandiamide (DCD).
  • Recombinant phytase was used from a concentrated extract of the enzyme whose specific activity was 5400 IU / ml and the concentration was 80 mg / ml.
  • the phytase extract was obtained by overexpression of the phyA gene of Aspergillus niger by the yeast Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004).
  • Solution (A) contains 26 mg of dissolved alanine with rapid stirring in 7 ml of 0.5 M sodium acetate buffer solution at pH 5.5.
  • Solution (B) contains 300 mg of lecithin (with 50% Sigma-Aldrich 1-alpha-phosphatidylcholine) diluted in 9 ml of 99% absolute ethanol in which 6.5 mg of alanine is dissolved.
  • Solution (A) contains 117.7 mg of dissolved DCD with rapid stirring in 7 ml of 0.5 M sodium acetate buffer solution at pH 5.5.
  • Solution (B) contains 300 mg of lecithin (with 50% Sigma-Aldrich 1-alpha-phosphatidylcholine) diluted in 9 ml of 99% absolute ethanol.
  • Solution (C) for both materials contains 1.35 ml of the enzyme extract, so each of the materials received 108 mg of phytase.
  • the images made from transmission electron microscopy have allowed us to observe an organization of pores following well-defined planes (FIG. 6).
  • the powder obtained is characterized by X-ray diffraction at small angles and has a characteristic diagram profile of a cubic structure Ia-3d. Structural determination of the mesophase of the dried material was made from peak indexing of the X-ray diagram and suggests a pn3m phase ( Figure 7).
  • the encapsulation rate in% of Aspergillus niger phytase in TMCs synthesized either from alanine (TMC-Alanine: ex la) or from DCD (TMC-DCD: ex lb) is presented in FIG. rate is almost 100% for example lb). This rate is measured after separation by centrifugation. At the end of the centrifugation, the materials are separated from a supernatant that contains all the unencapsulated enzymes. An analysis of the total protein content using the Thermo Scientific Pierce Micro BCA Protein Assay Kit is performed on the supernatant and the incorporated amount is deduced knowing the total amount initially delivered.
  • This functional material can be directly used to carry out enzymatic catalysis reactions which give a specific activity of 10,000 IU / g of material (IU: micromoles of transformed substrate per minute).
  • Example la has a certain porosity characterized by nitrogen sorption at 77K (Tristar 3000, Micromeretics).
  • the three nitrogen sorption isotherms shown in Figure 5 are characteristic of a material with mesoporosity.
  • the first (solid rounds) obtained with the material of the example simply dried in air is of type IV with a type II hysteresis loop which indicates interconnected cage type pores.
  • the pore volume is rather low, of the order of 0.15 ml / g, which is consistent with the presence of phospholipids whose cubic mesophase served as a support for the condensation of the silica network.
  • DBdB graphical determination using an abacus
  • BJH model data processing
  • Example la a phytase immobilized according to the method of Example la (TMC).
  • the catalytic test chosen to compare their activity is the hydrolysis of the phytase.
  • the enzymatic tests are carried out as follows:
  • the measurement of the enzymatic activity of free or immobilized enzymes consists in measuring the phosphate (Pi) released from the specific substrate of phytase, phytate. Pi concentrations are measured by the green method of Malachite Ohno, T., et al., 1991).
  • the determination of enzyme activity requires the use of a pair of 1.5 ml centrifuge tubes. In one the reaction is carried out for 5 minutes (t5) and the other serves as a control or zero point (t0) in which the reaction does not take place.
  • the procedure for carrying out the enzymatic reaction consists in preparing tubes t0 and t5 with 100 ⁇ l of immobilized phytase extract and 300 ⁇ l of 0.5 M sodium acetate buffer solution pH 5.5. Then, 500 ⁇ of 1 N trichloroacetic acid is added to the t0 tube to prevent the enzymatic reaction from occurring.
  • the tubes and the substrate which is the solution of 5 mM sodium phytate pH 5.5 prepared in 0.5 M sodium acetate buffer pH 5.5, are heat-treated at 37 ° C. 100 ⁇ l of solution of the substrate, sodium phytate, at 5 mM pH 5.5 are then added to the tubes t0 and t5. After 5 minutes, 500 ⁇ l of trichloroacetic acid are added to the t5 tube to stop the enzymatic reaction. Finally, the tubes are immediately centrifuged and placed in a refrigerator at 4 ° C. while waiting to carry out the determination of the inorganic phosphorus produced during the reaction by the Malachite green method.
  • the specific activity of the supported biocatalysts is expressed in pmol / min / mesoporous mg noted U / mg.
  • Table 1 makes it possible to compare the characteristics of the TMC of example la according to the invention and of an impregnated KIT-6 containing the same amount of immobilized phytase by impregnation, denoted KIT-6 10X as described in the article (Trouillefou et al 2014).
  • KIT-6 10X The quantities of phytase immobilized in the two mesoporous materials (expressed in pg of protein / mg of material), the specific activity of the supported biocatalyst (in U / mg) as well as the relative specific activity (%) of the phytases are presented. immobilized.
  • anion exchange resins (BDH 55164, VWR) are contacted for 24 hours with this artificial soil.
  • the Pi adsorbed by the exchange resins is desorbed with successive baths (Q Qian, P., et al. 2002.) with a solution of 0.02 M KCl.
  • the quantities of Pi desorbed and present in the soil solution are then assayed with Malachite green ( Figure 8).
  • Seedlings grow in sealed Petri dishes (12x12 cm) to maintain the sterility of the culture medium.
  • the seedlings are arranged at the 4 corners of the box and a hole on the top of each box, clogged with a sterile adhesive, allows to water the plants over the experience.
  • All boxes are filled with 99 g of sterilized sand, 16.5 ml of buffer MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) at pH 5.5 and three nutrient solutions described in Table 2.
  • 1 ml of an extract of TMC is added (material of example la according to the invention) 1 mg / ml and 5 ml of a solution of 15 mM sodium phytate.
  • Table 2 composition of nutrient solutions used for the cultivation of M. truncatula.
  • the plants are harvested for individual mineralization. Their aerial (AP) and root (PR) parts, however, are separated to perform the absorbed phosphorus analysis. Their mineralization is carried out in sealed tubes in the presence of 10 ml of HCl (6 N) at 110 ° C. for 16 hours. Ali M. A. et al., 2009). The determination of Pi in the mineralizer is carried out in Malachite green.
  • the functional material TMC according to the invention made it possible to observe a significant accumulation of P in the cultivated plants (FIG. 9).
  • the amount of phosphorus accumulated by the plants in the presence of TMC is 2.5 that of the control, and the differences are significant for the aerial and root parts.
  • EXAMPLE 5 Fixation of a Bacillus subtilis recombinant phvtase within the silica matrix by the method of the invention
  • This example illustrates the method of the invention applied to a recombinant phytase from Bacillus subtilis.
  • the functional material was prepared with dicyandiamide (DCD).
  • a recombinant phytase produced by the yeast Pichia pastoris was used from a concentrated extract of the enzyme whose specific activity was equal to 5.5 IU / ml and the concentration equal to 0.114 mg / ml.
  • the P. pastoris yeast overexpressing the PhyC gene of Bacillus subtilis alkaline phytase was obtained as described by Guerrero-Olazaran et al. (2010).
  • the phytase extract was then prepared according to the protocol described by Boze, H., et al. (2004).
  • Solution (A) contains 117.7 mg of dissolved DCD with rapid stirring in 7 ml of 0.5M sodium acetate buffer solution pH 6.5.
  • Solution (B) contains 300 mg of lecithin (with 50% Sigma-Aldrich 1-alpha-phosphatidylcholine) diluted in 9 ml of 99% absolute ethanol.
  • Solution (C) contains 0.75 ml of the enzyme extract, so the material received 85.5 ⁇ g of Bacillus subtilis phytase.
  • Solution (B) was added slowly to solution (A) with stirring.
  • the A + B mixture was stirred vigorously (500 rpm) for 10 minutes, and then the solution (C) was added to the A + B mixture.
  • This example illustrates the method of the invention applied to the simultaneous encapsulation of two recombinant phytases, one of which is an acid phytase (Ac, resulting from the overexpression of the phyA gene of Aspergillus nigei) and the other is alkaline (Aie , resulting from the overexpression of the PhyC gene of Bacillus subtilis).
  • Ac acid phytase
  • Alkaline Alkaline
  • the two phytase extracts Ac and Ae were obtained by overexpression of the phyA gene of Aspergillus niger or the PhyC gene of Bacillus subtilis, by the yeast Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004).
  • Solution (A) contains 117.7 mg of dissolved DCD with rapid stirring in 7 ml of 0.5 M sodium acetate buffer solution at pH 5.5.
  • Solution (B) contains 300 mg of lecithin (with 50% Sigma-Aldrich 1-alpha-phosphatidylcholine) diluted in 9 ml of 99% absolute ethanol.
  • Solution (C) contains a mixture of 0.75 ml of the enzyme extract Ac and 0.75 ml of the enzyme extract Ae, thus the material received 60 mg of Ac acid phytases and 85.5 ⁇ g of phytases Alkaline Aie simultaneously.
  • Solution A + B + C was stirred vigorously (900 rpm) for an additional 10 minutes before the addition of 0.4 ml of tetraethyl orthosilicate (TEOS, Fluka). After adding TEOS, the preparation was allowed to stir for 90 minutes. Then the solution was aged at 33 ° C for 24 hours.
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • the activity of the associated enzymes present in the material obtained is presented in FIG. 11 and is measured according to the following protocol:
  • Phosphorus is measured using the method of Ohno T et al.

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Abstract

L'invention concerne un procédé fixation de molécules biologiquement actives, notamment des enzymes, au sein d'une matrice de silice, en présence de phospholipides et d'une aminé de petite taille. Application dans le domaine de la nutrition des plantes.

Description

FIXATION DE MOLECULES ORGANIQUES SUR UNE MATRICE DE SILICE
POREUSE
L'invention concerne un procédé de fixation de molécules organiques biologiquement actives au sein d'une matrice de silice en utilisant l'association de phospholipides et d'une aminé, en particulier d'un acide aminé ou de la dicyanodiamide.
La plupart des molécules biologiquement actives sont très sensibles aux conditions environnementales, telles que le pH, la température, la force ionique ou la présence d'inhibiteurs. Il est donc nécessaire de les immobiliser dans des supports solides organo-minéraux afin de préserver leur structure et leur activité, lorsqu'elles sont destinées à être exposées à un milieu naturel soumis à des fortes variations notamment d'ordre environnemental.
Plusieurs moyens ont déjà été mis en œuvre pour immobiliser des enzymes sur des substrats.
La fixation d'une enzyme sur un support minéral peut se faire par liaison covalente à la surface du solide (encore appelée immobilisation par couplage). Elle peut également être effectuée par adsorption de la molécule à l'intérieur des pores du support (par exemple par imprégnation du support avec une solution d'enzyme sous agitation), par encapsulation dans des membranes semi- perméables ou encore par piégeage de la protéine dans une matrice poreuse fabriquée par un procédé sol-gel.
L'avantage de la fixation des enzymes par un procédé sol-gel dans des matrices minérales ou organo-minérales réside dans la faible perte d'enzymes par lixiviation ; cependant les enzymes enfermées dans une telle matrice sont généralement peu accessibles et l'on peut rencontrer des problèmes de diffusion des molécules du substrat vers l'extérieur liés à la structure du matériau, à l'ouverture de son réseau poreux et au diamètre de ses pores.
Les matrices de silice poreuses ou mésoporeuses sont généralement préparées par condensation de silice autour de composés organiques tensio- actifs, qui sont ensuite éliminés totalement ou partiellement pour générer le volume poreux.
Certains matériaux dits MTS (Mésoporeux aux Tensioactifs Structurants, ou Miœlle-Templated Silica) sont obtenus par auto-assemblage de micelles de molécules de tensioactif en solution dans l'eau, autour desquelles se condense la silice.
Les phases organiques tensio-actives mises en œuvre peuvent s'organiser, selon les cas, en structure lamellaire, hexagonale ou cubique.
Au cours de la synthèse de la silice, les ions silicates polymérisent et forment un réseau tridimensionnel autour des agrégats de molécules organiques. La porosité disponible après élimination du structurant peut être plus ou moins élevée et sa forme résulte directement de la structure des phases organiques qui ont été préparées.
Parmi les structures de silice mésoporeuse les plus étudiées, on connaît les structures dites « MCM-41 » (hexagonale), « MCM-48 » (cubique) (Mobil Composition of Matter No. 41 et Mobil Composition of Matter No. 48 du nom de la société qui les a fabriquées pour la première fois en 1992), et la structure cubique 3-D de symétrie Ia3d dite « KIT-6 ».
On sait que la taille et la forme des pores obtenus dépendent étroitement de la nature du tensio-actif et de sa quantité dans le milieu réactionnel. Cependant, en l'état actuel des connaissances, il est très difficile de prévoir le rôle que peut jouer l'agent tensio-actif comme agent structurant et quelle structure il peut générer, car des mécanismes très complexes d'interactions interviennent entre les micelles de tensioactifs et les espèces inorganiques qui pilotent l'auto-assemblage coopératif.
Plusieurs systèmes d'encapsulation ont été décrits dans l'art antérieur. Par exemple, dans la demande FR 2 879 186, un procédé de préparation utilise l'association de phospholipides et d'une aminé grasse comportant une chaîne aliphatique en C8-C2i . Les aminés grasses sont généralement utilisées pour catalyser la réaction d'hydrolyse et de polycondensation des précurseurs de silice. La réaction d'hydrolyse/condensation peut ainsi se faire dans des conditions réactionnelles plus basiques. Il est enseigné dans ce document, que les aminés grasses, lorsqu'elles sont utilisées seules pour préparer la phase organique structurée, permettent l'obtention de silices mésoporeuses hexagonales mais que l'activité des enzymes immobilisées est insuffisante. Associées à des phospholipides, elles permettent d'obtenir une meilleure activité apparente de l'enzyme immobilisée
Laveille et al. ont proposé la synthèse de matériaux encapsulant une enzyme (glucose oxydase) basée sur la condensation de silice amorphe à partir d'un précurseur alcoxyde, autour d'une phase ordonnée de phospholipides {Laveille, et al, 2010). La source de phospholipides (PL) utilisée dans ce document est de la lécithine d'œuf constituée d'au moins 50% de phosphatidylcholine (PC), et notamment de phosphatidylethanolamine (PE). La concentration en lécithine et la nature du milieu solvant sont des paramètres déterminants pour la structure du matériau final. Le solvant utilisé pour la dilution de la lécithine et dans lequel sont réalisées les réactions sol-gel, est un mélange de tampon aqueux d'acétate de sodium (AcNa) et d'éthanol (EtOH) en proportions variables.
Ces matériaux, nommés SMS pour "sponge mosoporous silica" (Galarneau et al. 2007 et 2010) ou NPS pour "nanoporous silica capsules" (forme particulaire de la phase SMS) {Laveille et al. 2010 ) ont une structure de type éponge avec un réseau poreux 3-D isotrope. Il est à noter que la formation de la mésostructure de type éponge est attribuée à la présence de la dodécylamine, une aminé à chaîne aliphatique réputée toxique. Il serait donc intéressant de pouvoir fabriquer des matériaux de structure 3-D sans utilisation de molécule toxique. Par ailleurs, une structure en éponge présente de nombreuse tortuosités ce qui peut causer des problèmes pour la diffusion des substrats et produits de réaction enzymatique. Il serait ainsi intéressant d'obtenir une structure 3-D plus régulière afin de permettre une meilleure diffusion. II a été mis au point dans le cadre de la présente invention une nouvelle méthode de fixation d'enzymes au sein d'une matrice de silice selon un procédé sol-gel de polycondensation de tétraalcoxysilanes en milieu aqueux en utilisant l'association d'une aminé de petite taille en présence de phospholipides. Les enzymes immobilisées d'une matrice obtenue selon ce procédé présentent d'excellentes activités, une bonne résistance aux conditions réactionnelles, sont faciles à récupérer par simple filtration ou par centrifugation et peuvent ainsi être réutilisées un grand nombre de fois. Les biocatalyseurs obtenus résistent en outre très bien à la désorption ou lixiviation des enzymes. De plus les matrices obtenues présentent une structure 3-D mieux définie que celle des SMS ou NPS, bi-continue cubique, comme démontré par les diffractogrammes des rayons X. Enfin, le procédé de formation de ces produits ne nécessite pas l'utilisation de dodécylamine ou autre molécule toxique.
Pour des applications agricoles, le produit de l'invention présente en outre l'avantage d'être biodégradable et basé sur des molécules naturelles respectueuses de l'environnement, non contaminantes pour l'écosystème et l'Homme. En effet, une fois l'enzyme apportée à la plante, la matrice de silice se dissout progressivement dans le sol au contact de l'eau. Au surplus, l'aminé de petite taille utilisée dans le cadre de l'invention est une aminé naturelle ou ayant reçu une autorisation pour une utilisation en agriculture, présentant donc l'avantage par rapport aux aminés de synthèse de ne présenter aucun caractère de toxicité pour l'homme ou son écosystème.
Or dans l'art antérieur il n'a jamais été exemplifié d'utilisation des silices mésoporeuses pour encapsuler des enzymes utilisables en agricultures et directement dans les sols, en particulier comme engrais.
En effet, Hossain, K.-Z. et al. (2008) décrit l'adsorption d'uréase sur une silice mésoporeuse de type PE-MCM-41 et leur utilisation potentielle pour réduire l'hydrolyse de l'urée et donc contrôler la libération d'azote dans les sols. Toutefois ces uréases encapsulées n'ont jamais été testées pour vérifier leur activité, que ce soit en conditions contrôlées ou en en plein champ. En outre l'encapsulation se fait après la formation de la silice mésoporeuse par imbibition dans la porosité libérée par le gabarit organique calciné.
Gogos, A. et al. (2012) décrit l'utilisation de silice mésoporeuse, mais uniquement pour permettre la délivrance d'insecticide.
Burns et al. (2013) évoquent l'intérêt de protéger l'activité enzymatique des sols à des fins de bioremédiation ou de protection des enzymes avec la matière organique des sols.
L'article de Trouillefou et al (2015), décrit une phytase immobilisée dans une silice mésoporeuse utilisable pour la nutrition phosphorée des plantes.
Le matériau obtenu est dénommé KIT-6. Toutefois, le procédé d'incorporation de l'activité enzymatique au sein de la structure poreuse comprend d'abord la synthèse du matériau silicique, sa calcination à haute température pour éliminer l'agent texturant (copolymère) puis finalement l'imprégnation du matériau obtenu à l'aide d'une solution de l'enzyme.
Un tel procédé ne permet donc pas de conserver la composante organique phospholipidique de la matrice silicique à cause de l'étape de calcination. En outre le procédé d'encapsulation n'est pas toujours satisfaisant et les réactifs et les étapes de synthèse du KIT-6 induisent un coût de production assez élevé qui pourrait être très conséquent pour une production à l'échelle industrielle.
L'enzyme n'est en outre pas toujours fixée de façon suffisante à l'intérieur de la matrice.
La présente invention a par conséquent pour objet un procédé de fixation d'une molécule organique biologiquement active au sein d'une matrice de silice, ledit procédé comprenant les étapes suivantes consistant à :
(1) préparer une solution aqueuse (A) contenant une aminé choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, préparer une solution alcoolique (B) d'au moins un alcool en Ci-C6 et d'au moins un phospholipide, et préparer une solution aqueuse (C) de la molécule biologiquement active,
(2) incorporer la solution (B) dans la solution (A) sous agitation pour obtenir la formation une mésophase lyotrope,
(3) incorporer la solution (C) dans le mélange obtenu à l'issue de l'étape (2), (4) ajouter au mélange obtenu à l'issue de l'étape (3), au moins un tétra-alcoxysilane, puis laisser reposer pendant une durée suffisante pour obtenir des particules solides poreuses à base de silice renfermant la molécule biologiquement active.
L'invention a également pour objet les produits susceptibles d'être obtenus par un tel procédé. Ainsi la présente invention concerne une molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Cette molécule fixée au sein de la matrice de silice a donc avantageusement la forme d'une particule solide poreuse à base de silice, en particulier d'une particule de silice mésoporeuse, au sein de laquelle se trouve incorporée la molécule active comme décrit ci-après dans le paragraphe sur l'étape (4).
L'invention a également pour objet l'utilisation des produits selon l'invention dans différents domaines, notamment l'agriculture, en particulier pour la nutrition des végétaux.
De tels produits, lorsqu'ils sont à base de phosphatases, pourront par exemple être épandus sur les cultures afin de transformer in situ les sources de phosphore organique non assimilable par la plante, en ions orthophosphates.
D'autres enzymes capable de minéraliser la matière organique des sols peuvent être encapsulées et utilisées comme biocatalyseur supporté lorsqu'épandues sur les cultures et permettre ainsi un recyclage des éléments nutritifs azotés, potassiques voire des oligo-éléments. Par exemple, les amylases, les uréases, les cellulases entrent dans la décomposition de matières organiques et permettent la libération de formes d'azotes assimilables par les végétaux.
La matrice de silice obtenue selon le procédé de l'invention est une silice mésoporeuse. On entend par « silice mésoporeuse » au sens de la présente invention, une silice ayant des pores d'une taille moyenne comprise entre 2 et 50 nm (norme IUPAC). Etape f 1) : préparation des solutions (A), f B) et (O
Solution aqueuse (A)
Cette solution aqueuse comprend (avantageusement est constituée par) de l'eau et une aminé choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges.
L'amine est donc choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, plus avantageusement parmi les acides aminés et les aminés comprenant un groupe nitrile. Parmi les acides aminés, on préfère les acides aminés naturels et en particulier les acides aminés apolaires, tels que par exemple valine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, glycine, alanine et proline, en particulier les isomères L de ces acides aminés car il s'agit d'acides aminés naturels.
Dans un mode de mise en œuvre de l'invention, on préfère l'alanine, en particulier la DL-alanine qui est moins coûteuse.
Parmi les oligopeptides, on pourra citer les dipeptides comme par exemple la glycyl-glycine.
Les aminés comprenant un groupe nitrile sont des aminés primaires, des aminés secondaires ou des aminés tertiaires, en particulier l'amine est un dérivé de guanidine et/ou de cyanamide tel que la 2-cyanoguanidine (dicyanodiamide).
La dicyanodiamide est couramment utilisé en agriculture comme inhibiteur de l'activité des bactéries nitrifiantes. C'est une molécule aminée ne contenant pas de chaîne aliphatique.
Ainsi avantageusement l'amine de la solution aqueuse (A) selon l'invention est choisie parmi l'alanine et la 2-cyanoguanidine.
Selon un mode de mise en œuvre, la solution aqueuse (A) est dépourvue d'oligosaccharide tels que des mono- ou di-saccharides, par exemple le bêta-D-lactose ou le glucose ;de glycérol, de sorbitol, ou encore de polymères synthétiques polyhydroxylés tels que le poly(alcool vinylique) ou de polymères d'acides carboxyliques insaturés.
Le pH de la solution aqueuse (A) est avantageusement compris entre
4,5 et 7, en particulier entre 5 et 7, plus particulièrement entre 5,5 et 6,5. Il peut en particulier être choisi entre 5 et 6 et avantageusement être de 5,5 ou être choisi entre 6 et 7 et avantageusement être de 6,5. En particulier la solution aqueuse A est tamponnée, par exemple à l'aide d'un tampon acétate de sodium. Solution alcoolique f B)
Cette solution comprend (avantageusement est constituée par) au moins un alcool en Ci-C6 et au moins un phospholipide.
Au sens de la présente invention on entend par « alcool en Ci-C6 », tout groupe alkyle en Ci-C6 linéaire ou ramifié substitué par un ou plusieurs groupes -OH, avantageusement par un seul groupe -OH.
Le terme « phospholipides » au sens de la présente invention englobe les diglycérides phosphatés comportant de préférence un groupe azoté cationique lié au groupe phosphate. On peut citer à titre d'exemple de tels phospholipides, la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine. Ces phospholipides sont généralement utilisés sous forme de mélanges obtenus à partir de diverses sources naturelles telles que les lécithines, par exemple la lécithine extraite du jaune d'œuf ou la lécithine extraite du soja.
Selon un mode de réalisation, on utilise, à titre de phospholipide, une lécithine contenant au moins 50% de l-alpha-phosphatidylcholine. On peut également utiliser une lécithine contenant au moins 95% en poids de phosphatidylcholine.
La concentration du phospholipide dans la solution alcoolique (B) est de préférence comprise entre 20 et 100 mg/ml, de préférence comprise entre 30 et 80 mg/ml, en particulier comprise entre 34 et 77 mg/ml.
L'alcool en Ci-C6 pourra être par exemple du méthanol ou de l'ethanol, en particulier de l'ethanol, plus particulièrement de l'éthanol à au moins 96% et avantageusement de l'éthanol à 99%.
La solution alcoolique (B) peut en outre comprendre une aminé choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges. Avantageusement, le rapport massique entre le phospholipide et l'aminé dans la solution (B), lorsque la solution (B) comprend une aminé, est compris entre 10/1 et 60/1, de préférence de l'ordre de 47/1.
La concentration totale de phospholipides dans le mélange final (A+B+C) doit être suffisante pour observer la formation de la phase tridimensionnelle.
Le ratio entre les phospholipides et l'aminé a par ailleurs une influence sur la taille des micelles et, par conséquent, la taille des pores de la silice mésoporeuse. La Demanderesse a obtenu des porosités satisfaisantes lorsque le rapport massique entre le phospholipide et l'aminé dans le mélange final (A + B + C) est compris entre 1/1 et 20/1, de préférence compris entre 2/1 et 10/1.
Par ailleurs, il peut être intéressant que le ratio massique entre l'alcool en Ci-Cs et l'eau soit compris entre 57/48 et 55/45 dans le mélange final (A+B+C).
Solution (C)
Dans l'étape (1) du procédé selon l'invention, on prépare une solution aqueuse (C) : la molécule biologiquement active est dissoute dans une quantité appropriée d'eau.
Selon un mode de mise en œuvre, la solution aqueuse (C) est dépourvue d'hydrate de carbone, en particulier d'oligosaccharide tels que des mono- ou di-saccharides, par exemple le bêta-D-lactose ou le glucose, de glycérol, de sorbitol, ou encore de polymères synthétiques polyhydroxylés tels que le poly(alcool vinylique) ou de polymères d'acides carboxyliques insaturés.
Les quantités respectives des différents composants entrant dans la composition de la solution réactionnelle des étapes du procédé de la présente invention peuvent être définies plus particulièrement par rapport à la quantité totale de précurseur de silice utilisée.
Ainsi, pour une mole de tétra-alcoxysilane, on utilise de préférence de 14 à 112 moles de H20, de 10"7 à 10"3 moles d'au moins une molécule biologiquement active, de 0,05 à 0, 20 moles d'au moins un phospholipide, de 0,04 à 0,16 moles d'au moins une aminé et de 8,5 à 34 moles d'au moins un alcool en Ci-Cs.
Le pH de la solution aqueuse (A) et le pH de la solution aqueuse (C) sont de préférence identiques et choisis de manière à stabiliser la molécule biologiquement active si besoin, en particulier compris entre 4,5 et 7, plus particulièrement entre 5 et 7, encore plus particulièrement entre 5,5 et 6,5. Il peut en particulier être choisi entre 5 et 6 et avantageusement être de 5,5 ou être choisi entre 6 et 7 et avantageusement être de 6,. Etape (2) : formation de la mésophase Ivotrope
Au sens de la présente invention, on entend par « mésophase lyotrope » la phase cristal-liquide dont la formation est liée à la concentration des molécules mésogènes. La caractérisation de ces phases est classiquement réalisée par microscopie optique en lumière polarisée et diffraction des rayons X aux petits angles.
Pour obtenir cette mésophase, la solution (B) est ajoutée dans la solution (A) sous agitation. Le sens de cet ajout est très important. En effet, si on ajoutait la solution (A) dans la solution (B), on n'obtiendrait pas la formation de cette mésophase.
Avantageusement, la solution (B) est ajoutée goutte à goutte dans la solution (A).
En particulier l'agitation est effectuée à l'aide d'un barreau aimanté à une vitesse de rotation comprise entre 300 et 1000 tours par minute pour une durée comprise entre 5 et 15 minutes.
Le mélange (A+B) est avantageusement maintenu sous agitation, en particulier à 900 tours par minute, pendant 10 minutes, c'est-à-dire jusqu'à la formation de la mésophase lyotrope.
Etape (3) : Ajout de la solution (C) dans le mélange (A+B)
La solution (C) est ajoutée dans la solution (A+B) sous agitation, avantageusement avec un barreau aimanté, en particulier à une vitesse de rotation comprise entre 700 et 900 tours par minute, pour une durée comprise entre 10 et 20 minutes. Le sens de cet ajout est très important. En effet, si on ajoutait la solution (A+B) dans la solution (C), on n'obtiendrait pas le produit désiré.
Avantageusement, la solution (C) est ajoutée goutte à goutte dans la solution (A+B).
La solution obtenue est le mélange (A+B+C), dont l'analyse par diffraction des rayons X donne un diagramme présentant une mésophase tridimensionnelle (Figure 2) c'est-à-dire un réseau de pores orientés dans les trois directions de l'espace. La caractérisation de ces phases est classiquement réalisée par microscopie optique en lumière polarisée et diffraction des rayons X aux petits angles.
La solution (A+B+C) est avantageusement maintenue sous vive agitation (par exemple 900 tours par minute) pendant 10 minutes supplémentaires.
Etape (4) : silice
Le tétra-alcoxysilane, précurseur de la matrice silicique, peut être choisi parmi les tétra-alcoxysilanes de formule Si(0-Rl)4, les tétra-alcoxysilanes de formule Si(R2)n(0-R2)4 et leurs mélanges, chaque RI et R2 représentant indépendamment un radical alkyle linéaire ou ramifié en Ci-C4, de préférence en Ci-C2, et n valant 1, 2 ou 3. Le tétra-éthoxysilane (TEOS) est le précurseur de silice particulièrement préféré.
L'addition du précurseur de silice se fait de préférence sous agitation pour assurer une bonne homogénéisation des différents ingrédients. L'agitation est généralement maintenue pendant quelques minutes, de préférence pendant 5 à 120 minutes, en particulier pendant 90 à 120 minutes. Au cours de l'ajout du précurseur de silice, en particulier du TEOS, on observe un virage de la coloration du mélange qui s'assombrit ainsi que de sa texture qui s'épaissit en même temps. On observe au cours du temps la précipitation de fines particules de silice en suspension. Les quantités précurseur de silice, en particulier du TEOS (en particulier de qualité « réactif »), comprises entre 0,4 et 0,8 ml_ sont préférées pour effectuer les synthèses.
On laisse ensuite la solution réactionnelle reposer pendant plusieurs heures, de préférence pendant 2 à 48 heures, en particulier pendant 4 à 30 heures, plus avantageusement pendant 20 à 30 heures, au cours desquelles se déroule la réaction de polycondensation des tétra-alcoxysilanes. Avantageusement cette maturation se fait à une température comprise entre 20 et 35°C, en particulier d'environ 33°C. La température ne doit pas être trop élevée pour éviter la dégradation de la molécule active. Les fines particules de silice observées sédimentent et la turbidité du mélange diminue. A la fin de la maturation, deux phases sont présentent dans le mélange: l'une solide et l'autre composée d'un mélange aqueux jaunâtre.
Ces particules peuvent être séparées du milieu réactionnel par simple filtration, par exemple sur du verre fritté, ou par centrifugation. Elles sont ensuite de préférence lavées avec un solvant ou mélange de solvants permettant de préserver l'activité des molécules biologiques. On préfère en particulier le lavage des particules avec une solution tampon en particulier acétate de sodium à un pH compris entre 4 et 7, en particulier entre 5 et 7, plus particulièrement entre 5,5 et 6,5. Il peut en particulier être choisi entre 5 et 6 et avantageusement être de 5,5 ou être choisi entre 6 et 7 et avantageusement être de 6,5.
Elles sont ensuite de préférence séchées sous vide ou lyophilisées pour faciliter l'utilisation ultérieure et protéger les molécules biologiques. On préfère en particulier le séchage sous vide pour une durée comprise entre 24 et 48 heures.
Les particules de silice selon l'invention, ainsi obtenues par le procédé selon l'invention, ont généralement une taille moyenne en volume, avantageusement un diamètre moyen en volume (D50), comprise entre 10 et 25 μιτι, en particulier entre 10 et 20 μιτι, mesuré par granulométrie laser avec le Mastersizer 2000 de Malvern Instruments dans un tampon acétate comme illustré à la figure 3 et une forme sphérique, comme illustré à la figure 4. Leur volume poreux obtenu après calcination à une température comprise entre 450°C et 650°C pendant 6-10 heures sous air est déterminé à partir des isothermes d'adsorption d'azote à 77 K, et est généralement compris entre 0,09 et 0,11 ml/g, de préférence il est de 0,10 ml/g (comme par exemple illustré à la figure 5).
La taille moyenne des pores, déterminée par la méthode Derjaguin- Broekhoff-de Boer (DBdB) à partir des isothermes de désorption d'azote à 77 K, est comprise entre 3,5 et 4,5 nm.
La surface spécifique des particules de silice, mesurée par la méthode Brunauer, Emmett and Teller (BET) à partir des isothermes d'adsorption- désorption d'azote à 77 K, est généralement comprise entre 30 et 50 m2/g, de préférence il est de 40 m2/g.
En particulier, afin de ne pas risquer de polluer les sols avec des composés chimiques, le choix du phospholipide et de l'aminé (aussi dénommés agent texturants) a porté sur des réactifs non toxiques, et le biocatalyseur enzymatique supporté obtenu a été baptisé du nom de TMC signifiant « Tridimentional Mesoporous Capsule ». L'ensemble des composants entrant dans la synthèse du TMC sont : l'agent structurant servant de gabarit organique (phospholipide, en particulier lécithine avec 50% de l-a-phosphatidylcholine, Sigma-AIdrich), un co-structurant (aminé, en particulier acide aminé ou dicyanodiamide DCD 99,5%), de l'éthanol absolu, en particulier à 99%, pour dissoudre les phospholipides et former les bicouches, de l'eau, un sel (acétate de sodium) et un précurseur de silice (TEOS, Fluka).
Ratios molaires de la synthèse du TMC avec le DCD (1) ou l'acide aminé (2) :
(1) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,62 DCD/0,2
Lécithine
(2) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,15 Acide aminé/0,2
Lécithine Molécule organique bioloaiauement active
Le procédé de la présente invention peut servir à immobiliser dans une matrice solide poreuse n'importe quelle molécule biologiquement active, c'est-à- dire n'importe quelle molécule capable de réagir avec les organismes vivants et donc jouant un rôle spécifique dans le métabolisme. Ce type de molécule peut être d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une hormone, une enzyme ou la substance active d'un médicament ou d'un produit phytopharmaceutique. En particulier il s'agit d'une enzyme par exemple les amylases, les uréases, les cellulases et les phosphatases telles que les phytases. Avantageusement cette molécule est soluble dans l'eau.
La molécule biologiquement active est de préférence une protéine dont le diamètre moyen est compris entre 4 et 25 nm, en particulier entre 5 et 25nm,de préférence compris entre 5 et 14 nm, selon la méthode de mesure divulguée dans Oakley AJ et al. (2010) pour Aspergillus niger phytase phyA ou selon la Protein Data Bank http://wvvw.rcsb.org.
On peut citer à titre d'exemples de telles protéines les phosphatases, et en particulier une phytase.
Enzymes naturelles, les phytases jouent un rôle essentiel dans le cycle du phosphore en hydrolysant les phytates ou les acides phytiques contenus dans les végétaux.
On distingue quatre catégories distinctes de phytases: phosphatases acides histidine (HAP), beta-hélice phytases (BPP), des phosphatases acides pourpres (PAP) et la cystéine phosphatase (CP).
La plupart des phytases montrent une large spécificité de substrat. Elles ont la capacité d'hydrolyser de nombreux composés phosphorylés, comme l'ADP, l'ATP, le phényle phosphate, le fructose 1,6-biphosphate, le glucose-6-phosphate, le glycérophosphate et la 3-phosphoglycérate. Seuls quelques phytases sont spécifiques de l'acide phytique, notamment les BPP.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les phytases sont choisies parmi les phosphatases acides capables d'effectuer l'hydrolyse de cinq des six groupements phosphates du phytate, notamment la 6-phytase appelée myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase (numéro de classification EC 3.1.3.26). On peut également utiliser la 4-phytase (EC 3.1.3.26), et la 5-phytase (EC 3.1.3.72).
En particulier, la phytase utilisée est une phytase recombinante (EC 3.1.3.26) à partir d'un extrait concentré de l'enzyme dont la concentration est de 80 mg/ml. L'extrait phytasique a été obtenu par surexpression du gène phyA de Aspergillus niger par la levure Pichia pastoris {Boze, H., et al., 2004).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, les phytases sont choisies parmi les beta-hélice phytases (BPP).
II peut ainsi avantageusement s'agir d'une phytase recombinante (EC
3.1.3.8) issue de Bacillus subtilis dont la concentration est égale à 0,114 mg/ml. La levure P. pastoris surexprimant le gène PhyC de la phytase alcaline de Bacillus subtilis a été obtenue comme décrit par Guerrero-Olazaran et al. (2010). Puis l'extrait phytasique peut être préparé selon le protocole décrit par Boze, H., et al. (2004).
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, les phytases sont un mélange de phytases, en particulier un mélange entre la phytase recombinante (EC 3.1.3.8) issue de Bacillus subtilis eX. la 6-phytase recombinante (EC 3.1.3.26) obtenue par surexpression du gène phyA de Aspergillus niger ar la levure Pichia pastoris.
On pourra utiliser dans le cadre de la présente invention, toute molécule biologiquement active dont le diamètre moyen en volume, mesurée par exemple par granulométrie laser en particulier avec un granulomètre Malvern, est compris entre 4 et 25nm, en particulier entre 5 et 25 nm, de préférence compris entre 5 et 14 nm, et en particulier soluble dans l'eau.
Les enzymes immobilisées à l'intérieur d'une matrice obtenue selon ce procédé présentent d'excellentes activités spécifiques, une bonne résistance aux conditions réactionnelles, sont faciles à récupérer par simple filtration ou par centrifugation, peuvent ainsi être réutilisées un grand nombre de fois et sont peu coûteuses à produire. Les biocatalyseurs obtenus résistent en outre très bien à la désorption ou lixiviation des enzymes (< 200 pg phytase désorbables pour 300 mg de phytases effectivement immobilisées).
Pour des applications agricoles, le produit de l'invention présente en outre l'avantage d'être biodégradable et basé sur des molécules naturelles respectueuses de l'environnement, non contaminantes pour l'écosystème et l'Homme. La silice peut se dissoudre progressivement dans le sol au contact de l'eau du sol.
La présente invention concerne donc également une molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon la présente invention.
En particulier la molécule organique biologiquement active qui va être fixée sur la matrice silice est telle que décrite ci-dessus.
La molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice selon l'invention a donc la forme d'une particules de silice obtenue par le procédé selon l'invention et peut donc avoir les caractéristiques indiquées ci- dessus à la fin de l'étape (4).
En particulier, la molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice présente une structure 3-D bi-continue cubique, comme démontré par les diffractogrammes des rayons X (figure 7) et est donc mieux définie que celle des structures éponges SMS ou NPS de l'art antérieur : présence de pics de diffraction additionnels (comparaison entre le diffractogramme de la figure 7 selon l'invention et la figure 5 de Galarneau et al de 2007, la figure 9 de Galarneau et al. de 2010 et la figure 6 de LAVEILLE et al. de 2010). En outre la matrice silice sur laquelle est fixée la molécule organique est non toxique, en particulier grâce à l'utilisation d'un agent structurant non toxique, plus particulièrement vis-à-vis de l'environnement et plus généralement de la culture des plantes et des organismes du sol.
Enfin la matrice silice conserve sa composante organique phospholipidique, ce qui n'est pas le cas par exemple des produits obtenus à l'aide du procédé décrit dans Trouillefou et al (2015) à cause de l'étape de calcination du matériau silicique. De plus, le pourcentage d'immobilisation de la molécule organique dans la matrice silice est plus élevé que celui du matériau de Trouillefou et al (2015). La présente invention a également pour objet une composition, en particulier phytopharmaceutique ou une composition d'engrais, comprenant la molécule fixée au sein d'une matrice silice selon l'invention et un excipient, en particulier phytopharmaceutiquement acceptable.
Au sens de la présente invention, on en entend par « phytopharmaceutiquement acceptable », qui est acceptable pour l'utilisation sur les plantes ou le sol, c'est-à-dire non polluant pour l'environnement et non toxique pour les hommes (utilisateurs).
Cette composition peut en particulier consister en un engrais telle qu'une solution nutritive, et peut être avantageusement sous forme liquide ou solide.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation du produit (molécule fixée au sein d'une matrice silice) obtenu par le procédé décrit précédemment ou de la composition le comprenant comme engrais de cultures végétales.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description des figures et des exemples qui suivent qui sont donnés à titre informatif non limitatif.
La figure 1 représente le schéma des étapes du procédé de l'invention. La figure 2 représente le diagramme de diffraction des rayons X de la solution A+B+C utilisée pour la fabrication de l'exemple la selon l'invention illustrant la préexistence d'une mésophase lyotrope formée à partir des bicouches de phospholipides.
La figure 3 représente la distribution granulométrique en volume des particules (TMC) obtenues par le procédé de l'exemple la selon l'invention fraîchement synthétisés (ligne continue) et des TMC de l'exemple la après 3 mois dans une solution tampon AcNa 0,5 M (ligne pointillée) par granulométrie laser.
La figure 4 représente un cliché de microscopie électronique à balayage du TMC séché sous vide obtenu dans l'exemple la.
La figure 5 représente les isothermes d'adsorption désorption d'azote du
TMC séché sous vide obtenu selon l'exemple la
La figure 6 représente les clichés de microscopie électronique à transmission des TMC synthétisés avec les molécules aminées (a) alanine et (b) DCD (exemples la et lb respectivement).
La figure 7 représente (a) le diagramme de DRX du TMC-alanine de exemple la, (b) le diagramme de DRX du TMC-DCD de exemple lb et (c) le modèle de résolution de la phase pn3m à partir de l'indexation des pics.
La figure 8 représente la comparaison des deux biocatalyseurs supportés KIT-6 10X et TMC selon l'exemple lb pour (a) les quantités de Pi désorbées des résines échangeuses d'anions et (b) les quantités de Pi présentes dans la solution de sol selon l'exemple 3.
La figure 9 représente la quantité totale de phosphore accumulé dans les parties racinaires et les parties aériennes de plants de M. truncatula après 30 jours de culture en conditions stériles avec du phytate comme seule source de P selon l'exemple 4.
La figure 10 représente le taux d'incorporation en % de la phytase de Aspergillus niger dans les TMC synthétisé soit à partir d'alanine (TMC - Alanine) : la ou de DCD (TMC-DCD) : lb selon l'exemple 1.
La figure 11 représente l'activité des enzymes associées dans le matériau TMC obtenu selon l'exemple 6.
Exemple 1: Fixation d'une phytase au sein de la matrice de silice par le procédé de l'invention
Cet exemple illustre la méthode de l'invention appliquée à une phytase recombinante. Deux matériaux fonctionnels ont été préparés: l'un avec de l'alanine et l'autre avec du dicyanodiamide (DCD). On a utilisé une phytase recombinante à partir d'un extrait concentré de l'enzyme dont l'activité spécifique était égale à 5400 Ul/ml et la concentration égale à 80 mg/ml. L'extrait phytasique a été obtenu par surexpression du gène phyA de Aspergillus niger par la levure Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004).
Trois solutions (A), (B) et (C) ont été préparées à température ambiante avant d'être mélangées selon le protocole suivant:
Matériau 1 (exemple la")
La solution (A) contient 26 mg d'alanine dissous sous agitation rapide dans 7 ml de solution tampon acétate de sodium 0,5 M à pH 5,5.
La solution (B) contient 300 mg de lécithine (avec 50% de l-alpha- phosphatidylcholine Sigma-AIdrich) diluée dans 9 ml d'éthanol absolu 99% dans lequel on dissout 6,5 mg d'alanine.
Matériau 2 (exemple lb)
La solution (A) contient 117,7 mg de DCD dissous sous agitation rapide dans 7 ml de solution tampon acétate de sodium 0,5 M à pH 5,5.
La solution (B) contient 300 mg de lécithine (avec 50% de l-alpha- phosphatidylcholine Sigma-AIdrich) diluée dans 9 ml d'éthanol absolu 99%.
La solution (C) pour les deux matériaux (exemples la et lb) contient 1,35 ml de l'extrait enzymatique, donc chacun des matériaux a reçu 108 mg de phytase.
Ratios molaires de la synthèse du TMC avec le DCD (2) ou aniline (1) :
(1) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,15 aniline/0,2 Lécithine
(2) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,62 DCD/0,2 Lécithine Les étapes de la synthèse se sont déroulées de façon identique pour les deux matériaux. La solution (B) a été ajoutée lentement à la solution (A) sous agitation. Le mélange A+B a été maintenu sous vive agitation (500 tours par minutes) pendant 10 minutes, puis la solution (C) a été ajoutée au mélange A+B. La solution A+ B + C a été maintenue sous vive agitation (900 tours par minutes) pendant 10 minutes supplémentaires avant l'addition de 0,4 ml d'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS, Fluka). Après l'ajout de TEOS, on a laissé la préparation sous agitation pendant 90 minutes. Ensuite la solution a été mise à maturation à 33°C pendant 24 heures.
Le lendemain, la préparation a été centrifugée afin de récupérer le précipité. Deux lavages successifs ont été effectués avec la solution tampon utilisée précédemment. L'échantillon a ensuite été séché sous vide pendant 48h.
Les clichés réalisés à partir de la microscopie électronique à transmission ont permis d'observer une organisation des pores suivant des plans bien définis (figure 6).
La poudre obtenue est caractérisée par diffraction des rayons X aux petits angles et présente un profil de diagramme caractéristique d'une structure cubique Ia-3d. La détermination structurale de la mésophase du matériau séché a été effectuée à partir de l'indexation des pics du diagramme de rayons X et suggère une phase pn3m (Figure 7).
Le taux d'encapsulation en % de la phytase de Aspergillus niger dans les TMC synthétisés soit à partir d'alanine (TMC - Alanine : ex la) ou de DCD (TMC- DCD : ex lb) est présenté dans la figure 10. Ce taux est de quasiment de 100% pour l'exemple lb). Ce taux est mesuré après séparation par centrifugation. A la fin de la centrifugation, les matériaux sont séparés d'un surnageant qui contient toutes les enzymes non encapsulées. Une analyse de la teneur en protéines totales à l'aide du kit de dosage protéique Thermo Scientific Pierce Micro BCA est effectuée sur le surnageant et la quantité incorporée est déduite connaissant la quantité totale initiale apportée.
Ce matériau fonctionnel peut être directement utilisé pour effectuer des réactions de catalyse enzymatique qui donnent une activité spécifique de 10000 Ul/g de matériau (UI : micromoles de substrat transformé par minute).
Le matériau synthétisé dans l'exemple la présente une certaine porosité caractérisée par sorption d'azote à 77K (Tristar 3000, Micromeretics). Les trois isothermes de sorption d'azote présentés dans la figure 5 sont caractéristiques d'un matériau présentant une mésoporosité.
Le premier (ronds pleins) obtenu avec le matériau de l'exemple la simplement séché à l'air est de type IV avec une boucle d'hystérèse de type II qui indique des pores de type cage interconnectés. Dans ce cas, le volume poreux est assez faible, de l'ordre de 0,15 ml/g, ce qui est cohérent avec la présence des phospholipides dont la mésophase cubique a servi de support pour la condensation du réseau de silice. Malgré cela, après séchage, une certaine porosité est libérée, dont le diamètre moyen est de l'ordre de 4 à 5 nm selon le mode de calcul, respectivement DBdB (détermination graphique à l'aide d'un abaque) ou BJH (modèle de traitement des données).
Après séchage en conditions C02 supercritique du matériau de l'exemple la (ronds vides), l'isotherme garde la même allure générale mais on observe une augmentation considérable du volume poreux (~0,75 ml/g) et du diamètre des pores : 5,1 (DBdB) à 6,5 nm (BJH). Il est à noter que la méthode de séchage en conditions C02 supercritique est connue pour préserver les structures tridimensionnelles des matériaux car l'élimination du solvant se produit sans interface (donc pas de stress capillaire), contrairement au séchage simple (interface liquide/gaz) ou même à la lyophilisation (interface solide/gaz). Par ailleurs, certaines étapes d'échange de solvant, en particulier avec l'éthanol peuvent conduire à un "lessivage" au moins partiel des phospholipides, ce qui libère de la porosité en laissant essentiellement le réseau de silice. Mais dans ce cas, le matériau caractérisé n'est plus représentatif du matériau actif car il n'y plus ni les phospholipides, ni probablement l'enzyme. Mais cela permet d'avoir une idée de l'organisation du réseau silicique.
Enfin, le même matériau de l'exemple la calciné (carrés vides) pour éliminer la partie organique présente une porosité plus faible que les deux autres échantillons, sans doute parce que le réseau silice est assez fragile et que la calcination à haute température induit son effondrement en grande partie. Ainsi, de la porosité est libérée par la calcination de la partie organique (phospholipides + enzyme), mais l'effondrement partiel du réseau silicique conduit à un volume poreux relativement faible, de l'ordre de 0,1 ml/g et des diamètres de pores de l'ordre de 5,5 nm. Mais là aussi, comme pour le séchage supercritique, les caractéristiques poreuses sont celles du réseau de silice seulement et ne reflètent donc pas complètement les propriétés du matériau fonctionnel. Exemple 2 : Comparaison de l'activité enzvmatiaue de la phvtase fixée au sein de la matrice de silice selon le procédé de l'invention et un procédé de l'art antérieur
On a comparé les activités
- d'une phytase immobilisée selon le procédé de l'exemple la (TMC), et
- d'une phytase immobilisée par imprégnation dans du KIT-6 selon le procédé décrit dans l'article de Trouillefou, et al., 2015.
L'essai catalytique choisi pour comparer leur activité est l'hydrolyse du phytase. En particulier, les essais enzymatiques sont réalisés de la manière suivante:
La mesure de l'activité enzymatique des enzymes libres ou immobilisées consiste à doser le phosphate (Pi) libéré à partir du substrat spécifique de la phytase, le phytate. Les concentrations en Pi sont mesurées par la méthode au vert de Malachite Ohno, T., et al., 1991).
La détermination de l'activité enzymatique nécessite d'utiliser une paire de tubes à centrifuger de 1,5 ml. Dans l'un la réaction s'effectue pendant 5 minutes (t5) et l'autre sert de témoin ou point zéro (tO) dans lequel la réaction n'a pas lieu. Le mode opératoire pour réaliser la réaction enzymatique consiste à préparer les tubes tO et t5 avec 100 μΙ d'extrait de phytase immobilisée et 300 μΙ de solution tampon d'acétate de sodium 0,5 M pH 5,5. Puis, on ajoute 500 μΙ d'acide trichloroacétique 1 N dans le tube tO pour empêcher la réaction enzymatique de se produire. Ensuite, on thermalise à 37°C les tubes ainsi que le substrat qu'est la solution de phytate de sodium 5 mM pH 5,5 préparée dans le tampon acétate de sodium 0,5 M pH 5,5. On ajoute alors 100 μΙ de solution du substrat, le phytate de sodium, à 5 mM pH 5,5 dans les tubes tO et t5. Après 5 minutes, 500 μΙ d'acide trichloroacétique sont ajoutés dans le tube t5 pour stopper la réaction enzymatique. Enfin, les tubes sont aussitôt centrifugés et placés au réfrigérateur à 4°C en attendant d'effectuer le dosage du phosphore inorganique produit au cours de la réaction par la méthode au vert de Malachite. L'activité enzymatique de chaque réaction est obtenue en divisant par 5 minutes la différence entre la concentration en Pi du t5 et du tO. Elle est exprimée en unité enzymatique (U), soit 1 μιτιοΙ de produit (Pi) formé par min = 1 Unité Enzymatique (U). L'activité spécifique des biocatalyseurs supportés est exprimée en pmol/min/mg mésoporeux noté U/mg.
Le Tableau 1 permet de comparer les caractéristiques du TMC de l'exemple la selon l'invention et d'un KIT-6 imprégné contenant la même quantité de phytase immobilisée par imprégnation, noté KIT-6 10X comme décrit dans l'article (Trouillefou et al. 2014). Sont présentées, les quantités de phytase immobilisées dans les deux matériaux mésoporeux (exprimées en pg de protéine/mg de matériau), l'activité spécifique du biocatalyseur supporté (en U/mg) ainsi que l'activité spécifique relative (%) des phytases immobilisées.
Tableau 1 : taux d'encapsulation, activités, stabilité et production des TMC et des KIT-6 10X
Figure imgf000024_0001
Ces résultats montrent que le procédé de fixation d'enzyme selon l'invention permet d'obtenir des biocatalyseurs présentant une meilleure activité spécifique que la même enzyme fixée selon le procédé de l'art antérieur mettant en œuvre une imprégnation de la phytase dans une silice mésoporeuse à structure tridimensionnelle ia3d nommée KIT-6. Exemple 3 : Comparaison à l'aide de résine échanaeuses d'anions de la disponibilité en Pi issu de l'hvdroivse du phvtate par la phvtase fixée par imprégnation dans KIT- 6 10X et par encapsulation dans TMC obtenu dans l'exemple lb
Une solution de sol contenant du phvtate de sodium 0,49 mM dans un sol artificiel constitué de 99 g de sable fin (Sigma-AIdrich, 50-70 mesh, réf. 14808-60-7), 30 mg de goethite de synthèse {Cornell, R. M., et al., 2006.), de 617 mg de kaolinite (Clay Minerai Society, KGa2) et un volume total d'eau ajouté dans le sol de 33 ml à pH 5,5 sont mis à incuber pendant 3 jours avec une quantité d'enzyme équivalente à 0,50 mg de phytase, ladite phytase se trouvant soit sous une forme non immobilisée, soit sous une forme immobilisée selon le procédé de l'exemple lb (TMC), soit sous une forme immobilisée par imprégnation dans du KIT-6 selon le procédé décrit dans l'article de Trouillefou, et al., 2014.
Puis, des résines échangeuses d'anions (BDH 55164, VWR) sont mises en contact pendant 24 heures avec ce sol artificiel. Le Pi adsorbé par les résines échangeuses est désorbé à l'aide de bains successifs {Q Qian, P., et al. 2002.) avec une solution de KCI 0,02 M. Les quantités de Pi désorbées et présentes dans la solution de sol sont ensuite dosées au vert de Malachite (Figure 8).
Les résultats de la Figure 8a indiquent clairement que les quantités de Pi résine sont supérieures pour le TMC de l'exemple lb selon l'invention par rapport à KIT- 6 10X après 24 heures d'exposition. De plus, la Figure 8b montre que les quantités de Pi disponibles dans la solution de sol sont identiques. Exemple 4 : Activité du matériau dans un sol sableux pour la nutrition de la plante modèle Medicaao truncatulata
Les plantules croissent dans des boîtes de Pétri (12x12 cm) scellées pour conserver la stérilité du milieu de culture. Les plantules sont disposées aux 4 coins de la boîte et un trou sur le dessus de chaque boîte, bouché avec un adhésif stérile, permet d'effectuer l'arrosage des plantes au fil de l'expérience. Toutes les boîtes sont remplies avec 99 g de sable stérilisé, 16,5 ml de tampon MES (acide 2-(N-morpholino)ethanesulfonique) à pH 5,5 et trois solutions nutritives décrites dans le Tableau 2. En plus de ce mélange de base dans les boîtes de Pétri, sont ajoutés 1 ml d'un extrait de TMC (matériau de l'exemple la selon l'invention) 1 mg/ml et 5 ml d'une solution de phytate de sodium 15 mM. Tableau 2 : composition des solutions nutritives utilisées pour la culture de M. truncatula.
Figure imgf000026_0001
Après 30 jours de culture, les plants sont récoltés pour être minéralisés individuellement. Leurs parties aériennes (PA) et racinaires (PR) sont toutefois séparées pour effectuer l'analyse de phosphore absorbé. Leur minéralisation est réalisée dans des tubes scellés en présence de 10 ml de HCI (6 N) à 110°C pendant 16 h Ali M. A. et al., 2009). Le dosage du Pi dans le minéralisât est effectué au vert de Malachite.
Le matériau fonctionnel TMC selon l'invention a permis d'observer une accumulation significative de P dans les plantes cultivées (Figure 9). La quantité de phosphore accumulé par les plantes en présence de TMC représente 2,5 celle du témoin, et les différences sont significatives pour les parties aériennes et racinaires. Exemple 5: Fixation d'une phvtase recombinante de Bacillus subtilis au sein de la matrice de silice par le procédé de l'invention
Cet exemple illustre la méthode de l'invention appliquée à une phytase recombinante issue de Bacillus subtilis. Le matériau fonctionnel a été préparé avec du dicyanodiamide (DCD).
On a utilisé une phytase recombinante produite par la levure Pichia pastoris à partir d'un extrait concentré de l'enzyme dont l'activité spécifique était égale à 5,5 Ul/ml et la concentration égale à 0,114 mg/ml. La levure P. pastoris surexprimant le gène PhyC de la phytase alcaline de Bacillus subtilis a été obtenue comme décrit par Guerrero-Olazaran et al. (2010). Puis l'extrait phytasique a été préparé selon le protocole décrit par Boze, H., et al. (2004).
Trois solutions (A), (B) et (C) ont été préparées à température ambiante avant d'être mélangées selon le protocole suivant:
La solution (A) contient 117,7 mg de DCD dissous sous agitation rapide dans 7 ml de solution tampon acétate de sodium 0,5 M à pH 6,5.
La solution (B) contient 300 mg de lécithine (avec 50% de l-alpha- phosphatidylcholine Sigma-AIdrich) diluée dans 9 ml d'éthanol absolu 99%.
La solution (C) contient 0,75 ml de l'extrait enzymatique, donc le matériau a reçu 85,5 pg de phytase de Bacillus subtilis.
Ratios molaires de la synthèse du TMC avec le DCD :
1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,62 DCD/0,2 Lécithine
La solution (B) a été ajoutée lentement à la solution (A) sous agitation. Le mélange A+B a été maintenu sous vive agitation (500 tours par minutes) pendant 10 minutes, puis la solution (C) a été ajoutée au mélange A+B.
La solution A+ B + C a été maintenue sous vive agitation (900 tours par minutes) pendant 10 minutes supplémentaires avant l'addition de 0,4 ml d'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS, Fluka). Après l'ajout de TEOS, on a laissé la préparation sous agitation pendant 90 minutes. Ensuite la solution a été mise à maturation à 33°C pendant 24 heures. Le lendemain, la préparation a été centrifugée afin de récupérer le précipité. Deux lavages successifs ont été effectués avec la solution tampon utilisée précédemment. L'échantillon a ensuite été séché sous vide pendant 48h. Exemple 6: Fixation d'une phytase recombinante issue de Bacillus subtilis et Aspergillus niger au sein de la matrice de silice par le procédé de l'invention en présence de DCD
Cet exemple illustre la méthode de l'invention appliquée à l'encapsulation simultanée de deux phytases recombinantes, dont l'une est une phytase acide (Ac, issue de la surexpression du gène phyA de Aspergillus nigei) et l'autre est alcaline (Aie, issu de la surexpression du gène PhyC de Bacillus subtilis).
Les deux extraits phytasiques Ac et Aie ont été obtenus par surexpression du gène phyA de Aspergillus niger ou du gène PhyC de Bacillus subtilis, par la levure Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004).
On a utilisé un extrait concentré Ac dont l'activité spécifique était égale à 5400 Ul/ml et la concentration protéique égale à 80 mg/ml et un extrait concentré Al dont l'activité spécifique était égale à 5,5 Ul/ml et la concentration protéique égale à 0,114 mg/ml.
Trois solutions (A), (B) et (C) ont été préparées à température ambiante avant d'être mélangées selon le protocole suivant:
La solution (A) contient 117,7 mg de DCD dissous sous agitation rapide dans 7 ml de solution tampon acétate de sodium 0,5 M à pH 5,5.
La solution (B) contient 300 mg de lécithine (avec 50% de l-alpha- phosphatidyleholine Sigma-AIdrich) diluée dans 9 ml d'éthanol absolu 99%.
La solution (C) contient un mélange de 0,75 ml de l'extrait enzymatique Ac et de 0,75 ml de l'extrait enzymatique Aie, donc le matériau a reçu 60 mg de phytases acides Ac et 85,5 pg de phytases alcalines Aie simultanément.
Ratios molaires de la synthèse du TMC avec le DCD :
1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,62 DCD/0,2 Lécithine La solution (B) a été ajoutée lentement à la solution (A) sous agitation. Le mélange A+B a été maintenu sous vive agitation (500 tours par minutes) pendant 10 minutes, puis la solution (C) a été ajoutée au mélange A+B.
La solution A + B + C a été maintenue sous vive agitation (900 tours par minutes) pendant 10 minutes supplémentaires avant l'addition de 0,4 ml d'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS, Fluka). Après l'ajout de TEOS, on a laissé la préparation sous agitation pendant 90 minutes. Ensuite la solution a été mise à maturation à 33°C pendant 24 heures.
Le lendemain, la préparation a été centrifugée afin de récupérer le précipité. Deux lavages successifs ont été effectués avec la solution tampon utilisée précédemment. L'échantillon a ensuite été séché sous vide pendant 48h.
L'activité des enzymes associées présentes dans le matériau obtenu est présentée dans la figure 11 et est mesurée à l'ide du protocole suivant :
Dans un tube à centrifuger de 1,5 ml :
Tampon MES pH7 0,5M = 100 μΙ
CaCI2 2mM = 25μΙ
PhytateNa lOmM = 25 μΙ
Extrait du produit selon l'invention avec BS lmg/ml = 50 μΙ
Acide Tri chlore acétique (TCA) IN = 200μΙ
5 minutes de réaction à 37°C
Le phosphore est mesure à l'aide de la méthode de Ohno T et al.
(1991).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fixation d'une molécule organique biologiquement active au sein d'une matrice de silice, ledit procédé comprenant les étapes suivantes consistant à :
(1) préparer une solution aqueuse (A) contenant une aminé choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, préparer une solution alcoolique (B) d'au moins un alcool en Ci-C6 et d'au moins un phospholipide, et préparer une solution aqueuse (C) de la molécule biologiquement active,
(2) incorporer la solution (B) dans la solution (A) sous agitation pour obtenir la formation une mésophase lyotrope,
(3) incorporer la solution (C) dans le mélange (A+B) obtenu à l'issue de l'étape (2),
(4) ajouter au mélange obtenu à l'issue de l'étape (3), au moins un tétra-alcoxysilane, puis laisser reposer pendant une durée suffisante pour obtenir des particules solides poreuses à base de silice renfermant la molécule biologiquement active.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aminé est choisie parmi les acides aminés apolaires en particulier parmi la valine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la glycine, l'alanine, et la proline, en particulier il s'agit de l'alanine.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aminé est choisie parmi les oligopeptides, en particulier choisie parmi les dipeptides tel que la glycyl-glycine.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aminé est la 2-cyanoguanidine.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la solution alcoolique (B) contient une aminé choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les aminés comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution alcoolique (B) et la solution aqueuse (A) contiennent la même aminé.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution alcoolique (B) est ajoutée goutte à goutte dans la solution aqueuse (A).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise, à titre de phospholipide, une lécithine contenant au moins 95% en poids de phosphatidylcholine.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse (A) et le pH de la solution aqueuse (C) sont identiques et choisis de manière à stabiliser la molécule biologiquement active si besoin, en particulier compris entre 4,5 et 6.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le ratio massique entre l'alcool en Ci-C6 et l'eau est compris entre 57/48 et 55/45 dans le mélange final (A+B+C).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que le rapport massique entre le phospholipide et l'aminé dans la solution (B), est compris entre 10/1 et 60/1, de préférence de l'ordre de 47/1.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le tétra-alcoxysilane est choisi parmi les tétra-alcoxysilanes de formule Si(0-Rl)4, les tétra-alcoxysilanes de formule Si(R2)n(0-R2)4 et leurs mélanges, chaque RI et R2 représentant indépendamment un radical alkyle linéaire ou ramifié en Ci-C4, de préférence en Ci-C2, et n valant 1, 2 ou 3.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la molécule biologiquement active est une protéine dont le diamètre moyen est compris entre 5 et 25 nm, de préférence compris entre 7 et 14 nm.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la molécule biologiquement active est une enzyme, de préférence une phosphatase, notamment une phytase.
15. Molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Composition, en particulier d'engrais, comprenant la molécule fixée au sein d'une matrice de silice selon la revendication 15 et un excipient.
17. Utilisation d'une phosphatase fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou d'une composition la comprenant pour la nutrition phosphatée des végétaux.
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