WO2016198789A1 - Procédé de discrimination des bactéries escherichia coli et shigella par spectrométrie rmn - Google Patents

Procédé de discrimination des bactéries escherichia coli et shigella par spectrométrie rmn Download PDF

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WO2016198789A1
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escherichia coli
shigella
bacteria
lactose
nmr
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Isabelle CANARD
Bénédicte ELENA-HERRMANN
Caroline MIRANDE
Tony PALAMA
Gilles RAUTUREAU
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Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/4625—Processing of acquired signals, e.g. elimination of phase errors, baseline fitting, chemometric analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria

Definitions

  • the present invention relates to the field of bacteriology. More specifically, the invention relates to discrimination between bacteria of the Escherichia coli species and those of the genus Shigella.
  • Bourne et al. [2] confirmed that bacteria of the genus Enter ococcus, Streptococcus and Staphylococcus could be identified by multivariate analysis of spectral fingerprints obtained on the bacterial endometaboloma, from a hundred gram-positive bacterial suspensions.
  • Shigella bacteria are very close to bacteria of the species Escherichia coli [3]. Indeed, Shigella belongs to the family Enterobacteriaceae and includes 4 species. From a genetic point of view, the 4 species of Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii and S. sonnei) and Escherichia coli belong to the same genomic group. This similarity is a source of public health and veterinary issues. Indeed, Shigella species are generally still considered as pathogenic species whereas Escherichia coli can be pathogenic or commensal according to the strains. Their differentiation is therefore decisive for the implementation of a treatment. To date, there are biochemical or serological methods to differentiate these two bacteria that are complementary to traditional microbiology techniques. Nevertheless, these additional tests are lengthy, which significantly increases the time of results and increases the risk for the patient or the animal.
  • the field of microbiology is therefore waiting for a method to differentiate in a safe and fast way, Escherichia coli Shigella.
  • the inventors propose to implement a new Escherichia coli I Shigella differentiation method based on the analysis of the bacterial exometabolome by NMR spectrometry.
  • the invention relates to a method of differentiation by proton NMR spectrometry between a bacterium of the species Escherichia coli and a bacterium of the genus Shigella, said method comprising the steps of:
  • exometabolome all the metabolites of a biological system such as a cell, a tissue, an organ or an organism, excreted in the extracellular medium or in the culture medium.
  • the peaks analyzed in step d) are preferably those corresponding to the following metabolites: acetate, aspartate, lysine, Na-acetyllysine, propionate, serine, succinate, threonine.
  • step a) of the method according to the invention comprises the following substeps:
  • exponential phase of growth is meant the growth phase during which the bacteria multiply the fastest.
  • the operating conditions of the process according to the invention are adapted so that during the NMR analysis, the bacteria are at half their exponential growth phase.
  • the incubation temperature is preferentially 37 ° C.
  • the bacterial suspension incubation time is between 1 and 2 hours, preferably equal to one hour and a half, when the incubation temperature is 37 ° C.
  • the spectrometric method used is proton NMR spectrometry.
  • the resonance frequency used is greater than or equal to 600 megahertz (MHz).
  • a particularly advantageous frequency is 600.55 MHz.
  • An NMR spectrometer suitable for implementing the method according to the invention is, for example, the one marketed by Bruker under the reference AVANCE III, coupled to a CryoProbe TM CryoProbe TM cryoprobe (5 mm) and a high-speed sample management system. SampleJet.
  • Other diameters of NMR tubes can also be used. Thus, it is possible to use 1.7 mm or 3 mm diameter tubes, adapting the volume of sample used.
  • cryogenic probe is preferred in the process according to the invention, it is however possible to use other types of NMR probe, such as a hot probe. Such probes are well known to those skilled in the art, poured into the NMR analysis.
  • the sequence of pulses for the acquisition of the 1D NMR spectra of the proton preferentially used is a NOESY sequence (nuclear Overhauser spectroscopy) with z-gradients.
  • NOESY sequence nuclear Overhauser spectroscopy
  • other pulse sequences may also be used: for example, direct water presaturation acquisition ('zgpr'), NOESY without z-gradient, CPMG sequence (Carr Purcell Meiboom Gill) ...
  • the temperature for the acquisition of the NMR spectra is advantageously greater than 0 and may be up to 40 ° C.
  • the reference compound used in the process is 3- (trimethylsilyl) -2,2 ', 3,3'-tetradeuteropropionic acid (TMSP-d4).
  • the method according to the invention can nevertheless function without the addition of a reference compound, by using one of the metabolite signals present in the medium to calibrate the spectra (glucose doublet at 5.23 ppm, for example).
  • the signal processing can be done without apodization or with a non-exponential apodization function, a different line broadening, less than or equal to 1Hz.
  • the reduction in spectra can be done using segments whose width can be less than 0.001 ppm and up to 0.05 ppm.
  • the integration can be done considering the complete digital resolution of the spectra, without reduction of the data.
  • the excluded region for the water signal may advantageously range from 4.3 to 5.1 ppm.
  • the experiments can be performed under different pH conditions in a range of 6.0 to 8.0.
  • the pH value preferably used is 7.4.
  • the deuterated buffer used is advantageously a buffer based on KH 2 PO 4 .
  • this buffer solution can be replaced by a pure solution of D20 (in this condition, the use of a PvMN realignment method may be necessary).
  • the buffer solution contains NaN 3 , this compound may, according to a technical alternative, be absent from the deuterated buffer.
  • the concentration of the buffer solution can be varied, for a molarity of the final mixture of up to 250 mM.
  • the amount of supernatant used is between 200 and 550 ⁇ , for a total volume after dilution in a conserved buffer solution, and at the final molarity of the equivalent mixture.
  • the volume of supernatant used is equal to 540 ⁇ .
  • the NMR spectrometry data obtained are analyzed in supervised multivariate analysis.
  • a particularly suitable supervised analysis method is the OPLS-DA method (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) described by Trygg and Wold [4].
  • OPLS-DA method Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis
  • other methods of supervised analysis such as the PLS-DA method, can be used.
  • the OPLS-DA method is used to produce a robust classification model samples, which associates with a specific metabolic signature for each class of samples considered.
  • the OPLS-DA analysis exploits an X matrix of reduced NMR data (N samples x M NMR variables considered) as well as an additional Y matrix containing the sample class information (Escherichia coli Lactose +; Escherichia coli Lactose - Shigella ) on which the regression is performed.
  • the data are visualized as “score plots", in which each point represents the projection of a single sample on the first two components of the model (horizontal predictive component associated with the classification, and first orthogonal component).
  • the “loadings plots” represent the contribution of the NMR variables (corresponding to the metabolites) on the predictive component.
  • the quality of the obtained OPLS-DA model is evaluated using the parameters R 2 and Q 2, which are respectively related to the proportion of variance explained and predicted by the model, calculated by cross-validation of the data (by "7-fold cross -validation ": 6/7 of the sample of size N is used as the training sample and 1/7 of the sample is used as a test sample, other values k for cross-validation of type k-fold can be used be used to validate the model, other conventional methods of cross validation known to those skilled in the art can be used). Further validation of the models is performed by resampling the model 1000 times, under null hypothesis, by random permutations of the matrix Y.
  • Multivariate analyzes were conducted using SIMCA-P 13 software (Umetrics). Other equivalent statistical processing platforms may, however, be used.
  • Figure 1A is a graph to compare the data presented under form of "score plots", obtained from suspensions of Escherichia coli Lactose + and suspensions of Shigella.
  • Figure 1B is a graph for comparing data related to the metabolites of interest, presented as "loading plots", obtained from the same suspensions of Escherichia coli Lactose + and Shigella suspensions as for Figure 1A.
  • Figure 2A is a graph for comparing the "score plots" data obtained from suspensions of Escherichia coli Lactose - and Shigella suspensions.
  • Figure 2B is a graph for comparing data related to the metabolites of interest, presented as "loading plots", obtained from the same suspensions of Escherichia coli Lactose - and Shigella suspensions as for Figure 2A.
  • the inventors have sought to discriminate by proton NMR analysis two families of Escherichia coli, a family with Escherichia coli fermenting lactose (known as Escherichia coli Lactose +) and a family with Escherichia coli. not fermenting lactose (called "Escherichia coli Lactose -”), Shigella.
  • sample preparation steps are as follows:
  • the 48 bacterial strains prepared are analyzed in triplicate.
  • a sample of Mueller Hinton culture medium without bacterial inoculation is also analyzed in triplicate, after an incubation time identical to the incubation time of the bacterial suspensions.
  • a buffer is used to reduce the chemical shift dispersion of NMR signals that may occur due to pH or ionic strength variations between samples.
  • the optimized preparation is as follows: 60 ⁇ l of a mixture containing 1.25 M phosphate buffer KH 2 PO 4 (pH 7.4) in D 2 0 with 2 mM NaN 3 and 0.1% trimethylsilyl propionate (TMSP) ) is added to 540 of supernatant.
  • TMSP trimethylsilyl propionate
  • the temperature is then regulated at 300 Kelvin (K) throughout the NMR measurements.
  • K Kelvin
  • 128 acquisitions of the Free Induction Decays (FID) signal were collected for each experiment over a spectral width of 20 ppm.
  • a recovery time of 4 seconds, a NOESY mix time of 10 milliseconds (ms), and a receiver gain of 40.3 were used.
  • the duration of the 90 ° pulse, close to a value of 14.5 microseconds ( ⁇ ) was calibrated automatically on each sample.
  • Table 2 As can be seen in FIG. 1A, analysis by OPLS-DA model makes it possible to obtain a good separation between the Escherichia coli Lactose + strains and the Shigella strains.
  • the "loading plot" analysis allows us to highlight the metabolites present in the culture supernatants, and therefore part of the bacterial exometabolome, which allow discrimination between bacterial types. because they are much higher in one bacterial type than the other.
  • the "loading plot" analysis allows us to highlight the metabolites present in the culture supernatants, and therefore part of the bacterial exométabolome, which allow the discrimination between the bacterial types, because present in much greater quantity in one type than the other.
  • the analysis of variables (peaks identified by the proton chemical shift in ppm) corresponding to the discriminating metabolites for the Escherichia coli Lactose / Shigella differentiation is shown in Table 5 below: Chemical Displacement (ppm) Metabolites Dominant at
  • This example thus makes it possible to show that by analyzing by proton NMR spectrometry, a bacterial exometaboloma, and in particular by measuring the quantity of a reduced number of metabolites resulting from this exometabolome, it is possible to easily differentiate Escherichia coli from Shigella.
  • the method according to the invention therefore brings a real clinical interest, substantially reducing the time usually required to achieve such a differentiation and thus allow the establishment of an antibiotic treatment, when justified.

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Abstract

a présente invention concerne un procédé de différenciation par spectrométrie RMN u proton entre une bactérie Escherichia coli et une bactérie Shigella, ledit procédé omportant les étapes consistant à : - Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella; - Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré; - Obtenir au moins un spectre RMN du moins un échantillon, - Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine; - Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia coli ou Shigella.

Description

Procédé de discrimination des bactéries Escherichia coli et Shigella par
spectrométrie RMN
La présente invention concerne le domaine de la bactériologie. Plus précisément, l'invention concerne la discrimination entre les bactéries de l'espèce Escherichia coli et celles du genre Shigella.
Depuis la découverte des microbes par Pasteur, les microorganismes sont étudiés par microscopie et analyses biochimiques et quantifiés par cultures quantitatives. Ces méthodes traditionnelles sont souvent longues et fastidieuses et des alternatives analytiques ont très tôt été recherchées.
La détection rapide et l'identification précise des microorganismes et en particulier des bactéries représentent donc un enjeu majeur, tant pour le diagnostic clinique que pour le contrôle microbiologique. Le développement des technologies a permis de disposer de nouveaux outils de diagnostic. Ainsi, l'on a pu voir l'émergence de l'analyse génomique par séquençage, l'identification par spectrométrie de masse, spectrométrie infrarouge ou encore spectrométrie Raman. La spectrométrie RMN a également fait l'objet de développements dans le domaine de la microbiologie. Ainsi, Delpassand et al. [1] a décrit l'utilisation de la spectrométrie RMN du proton pour identifier différentes espèces bactériennes. En particulier, Delpassand a mis en évidence qu'il était possible d'identifier des bactéries par analyse de molécules intracellulaires, à partir d'une analyse des empreintes spectrales sur quelques suspensions bactériennes.
Plus récemment, Bourne et al. [2] a confirmé qu'il était possible d'identifier des bactéries du genre Enter ococcus, Streptococcus et Staphylococcus par analyse multivariée d'empreintes spectrales obtenues sur l'endométabolome bactérien, à partir d'une centaine de suspensions de bactéries Gram positives.
Récemment, il a été démontré que les bactéries du genre Shigella sont très proches des bactéries de l'espèce Escherichia coli [3]. En effet, Shigella appartient à la famille des Enterobacteriaceae et comprend 4 espèces. D'un point de vue génétique, les 4 espèces de Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei) et Escherichia coli appartiennent au même groupe génomique. Cette similitude est source de problématiques de santé publique et vétérinaire. En effet, les espèces de Shigella sont généralement toujours considérées comme des espèces pathogènes alors que Escherichia coli peut être pathogène ou commensale selon les souches. Leur différenciation est donc déterminante pour la mise en place d'un traitement. Il existe à ce jour des méthodes biochimiques ou sérologiques pour différencier ces deux bactéries qui sont complémentaires aux techniques de microbiologie traditionnelles. Néanmoins, ces tests complémentaires sont longs, ce qui augmente de manière significative le temps de rendu des résultats et accentue le risque pour le patient ou l'animal.
Le domaine de la microbiologie est donc dans l'attente d'une méthode permettant de différencier de manière sure et rapide, Escherichia coli de Shigella.
Les inventeurs proposent de mettre en œuvre une nouvelle méthode de différenciation Escherichia coli I Shigella basée sur l'analyse de l'exométabolome bactérien par spectrométrie RMN.
L'invention concerne de façon particulière, un procédé de différenciation par spectrométrie RMN du proton entre une bactérie de l'espèce Escherichia coli et une bactérie du genre Shigella, ledit procédé comportant les étapes consistant à :
a. Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella ;
b. Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré ;
c. Obtenir au moins un spectre RMN du au moins un échantillon,
d. Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine ; e. Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia coli ou Shigella.
Le procédé selon l'invention consiste à analyser l'exométabolome bactérien. Par exométabolome, on entend l'ensemble des métabolites d'un système biologique tel qu'une cellule, un tissu, un organe ou un organisme, excrétés dans le milieu extracellulaire ou dans le milieu de culture.
Selon un mode particulier du procédé selon l'invention, si la bactérie Escherichia coli ne métabolise pas le lactose, les pics analysés à l'étape d), sont préférentiellement ceux correspondant aux métabolites suivant : acétate, aspartate, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine.
De façon avantageuse, l'étape a) du procédé selon l'invention comporte les sous-étapes suivantes :
al) Préparer au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella à partir d'une ou plusieurs colonies de la même bactérie, de façon à obtenir un concentration bactérienne suffisante ; a2) Incuber la au moins une suspension de bactéries à une température et pendant une durée suffisantes pour obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance.
Par phase exponentielle de croissance, on entend la phase de croissance pendant laquelle les bactéries se multiplient le plus rapidement. De façon avantageuse, les conditions opératoires du procédé selon l'invention sont adaptées pour que lors de l'analyse RMN, les bactéries soient à la moitié de leur phase exponentielle de croissance
La température d'incubation est quant à elle préférentiellement de 37°C. De façon avantageuse, le temps d'incubation de suspension de bactéries est compris entre 1 et 2 heures, préférentiellement égal à une heure et demie, lorsque la température d'incubation est de 37°C. La méthode spectrométrique utilisée est la spectrométrie RMN du proton. De manière préférentielle, la fréquence de résonance utilisée est supérieure ou égale 600 mégahertz (MHz). Une fréquence particulièrement avantageuse est de 600,55 MHz. Un spectromètre RMN adapté pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention est par exemple celui commercialisé par la société Bruker sous la référence AVANCE III, couplé à une cryosonde TCI CryoProbe™ 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet. D'autres diamètres de tubes RMN peuvent également être utilisés. Ainsi, il est possible d'utiliser des tubes de diamètre 1,7 mm ou 3 mm, en adaptant le volume d'échantillon utilisé.
Si une sonde cryogénique est préférée dans le procédé selon l'invention, il est toutefois envisageable d'utiliser d'autres types de sonde RMN, telle qu'une sonde chaude. De telles sondes sont bien connues de l'homme du métier, versé dans l'analyse RMN.
La séquence d'impulsions pour l'acquisition des spectres RMN 1D du proton préférentiellement utilisée est une séquence NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy) avec gradients-z. Toutefois, d'autres séquences d'impulsions peuvent également être utilisées: par exemple, l'acquisition directe avec présaturation de l'eau ('zgpr'), NOESY sans gradient-z, séquence CPMG (Carr Purcell Meiboom Gill)...
La température pour l'acquisition des spectres RMN est avantageusement supérieure à 0 et peut aller jusqu'à 40°C.
Selon un mode préféré de réalisation, le composé de référence utilisé dans la procédé est l'acide 3-(trimethylsilyl)-2,2',3,3'-tetradeuteropropionique (TMSP-d4). Le procédé selon l'invention peut néanmoins fonctionner sans ajout de composé de référence, en utilisant l'un des signaux des métabolites présents dans le milieu pour calibrer les spectres (doublet du glucose à 5,23 ppm par exemple). Le traitement du signal peut être fait sans apodisation ou avec une fonction d'apodisation non exponentielle, un élargissement des raies différent, inférieur ou égal à 1Hz. La réduction des spectres peut se faire en utilisant des segments dont la largeur peut être inférieure à 0,001 ppm et aller jusqu'à 0,05 ppm. L'intégration peut être faite en considérant la résolution digitale complète des spectres, sans réduction des données.
La région exclue pour le signal de l'eau peut avantageusement aller de 4,3 à 5,1 ppm.
Les expériences peuvent être réalisées dans des conditions de pH différentes dans une gamme allant de 6,0 à 8,0. La valeur de pH préférentiellement utilisée est 7,4.
Selon l'invention, le tampon deutéré utilisé est avantageusement un tampon à base de KH2PO4. Toutefois, cette solution tampon peut être remplacée par une solution pure de D20 (dans cette condition, l'utilisation d'une méthode de réalignement des signaux PvMN pourra être nécessaire). De même, si selon le mode réalisation préféré, la solution tampon contient du NaN3, ce composé peut, selon une alternative technique, être absent du tampon deutéré.
La concentration de la solution tampon peut être modifiée, pour une molarité du mélange final pouvant aller jusqu'à 250 mM.
La quantité de surnageant utilisée est comprise entre 200 et 550 μί, pour un volume total après dilution en solution tampon conservé, et à molarité finale du mélange équivalente. Avantageusement, le volume de surnageant utilisé est égal à 540μί.
Les données de spectrométrie RMN obtenues sont analysées en analyse multivariée supervisée. Une méthode d'analyse supervisée particulièrement adaptée est la méthode OPLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) décrite par Trygg et Wold [4]. Toutefois, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'analyse supervisée, telles que la méthode PLS-DA.
La méthode OPLS-DA est utilisée pour produire un modèle robuste de classification des échantillons, qui s'associe à une signature métabolique spécifique pour chaque classe d'échantillons considérée. L'analyse OPLS-DA exploite un matrice X des données RMN réduites (N échantillons x M variables RMN considérées) ainsi qu'une matrice supplémentaire Y contenant l'information de classe des échantillons (Escherichia coli Lactose + ; Escherichia coli Lactose - ; Shigella) sur laquelle est effectuée la régression.
Les données sont visualisées sous forme de « score plots », dans lesquels chaque point représente la projection d'un unique échantillon sur les deux premières composantes du modèle (composante prédictive horizontale associée à la classification, et première composante orthogonale). Les « loadings plots » représentent la contribution des variables RMN (correspondant aux métabolites) sur la composante prédictive.
La qualité du modèle OPLS-DA obtenu est évaluée à l'aide des paramètres R2 et Q2 qui sont respectivement reliés à la proportion de variance expliquée et prédite par le modèle, calculée par validation croisée des données (par « 7-fold cross-validation » : 6/7 de l'échantillon de taille N est utilisé comme échantillon d'apprentissage et 1/7 de l'échantillon est utilisé comme échantillon test; d'autres valeurs k pour une validation croisée de type k-fold peuvent être utilisées pour valider le modèle ; d'autres méthodes classiques de validation croisée connues de l'homme du métier peuvent être utilisées). Une validation supplémentaire des modèles est effectuée en ré-échantillonnant le modèle 1000 fois, sous hypothèse nulle, par permutations aléatoires de la matrice Y.
Les analyses multivariées ont été conduites en utilisant le logiciel SIMCA-P 13 (Umetrics). D'autres plateformes de traitements statistiques équivalentes peuvent toutefois être utilisées.
L'invention sera mieux comprise à la lumière de l'exemple qui suit en lien avec les figures. Cet exemple a pour but d'illustrer l'invention mais n'a aucun caractère limitatif.
La figure 1A est un graphique permettant de comparer les données présentées sous forme de « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia coli Lactose + et de suspensions de Shigella.
La figure 1B est un graphique permettant de comparer les données liées aux métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des mêmes suspensions d' Escherichia coli Lactose + et de suspensions de Shigella que pour la figure 1A.
La figure 2A est un graphique permettant de comparer les données sous forme de « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia coli Lactose - et de suspensions de Shigella.
La figure 2B est un graphique permettant de comparer les données liées aux métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des mêmes suspensions d' Escherichia coli Lactose - et de suspensions de Shigella que pour la figure 2A.
Exemple :
1. Sélection des souches :
Dans cette exemple, les inventeurs ont cherché à discriminer par analyse en spectrométrie RMN du proton deux familles d' Escherichia coli, une famille à' Escherichia coli fermentant le lactose (dite « Escherichia coli Lactose + ») et une famille à' Escherichia coli ne fermentant pas le lactose (dite « Escherichia coli Lactose - »), de Shigella.
Ainsi 48 souches provenant de la souchotèque bioMérieux, (site de La Balme les Grottes, France) ont été sélectionnées :
• 16 souches d'Escherichia coli Lactose +
• 16 souches d'Escherichia coli Lactose - · 16 souches de Shigella Le tableau 1 ci-après reprend pour chaque type bactérien, le numéro et la référence bioMérieux (N° API) des souches testées :
N° de la souche Espèce N°API
1 Shigella boydii 9511152
2 Shigella boydii 9211058
3 Shigella boydii 9103021
4 Shigella boydii 8518292
5 Shigella boydii 8401004
6 Shigella flexneri 9811048
7 Shigella flexneri 9511143
8 Shigella flexneri 9211059
9 Shigella flexneri 8804032
10 Shigella sonnei 9304068
11 Shigella sonnei 9211060
12 Shigella sonnei 9103146
13 Shigella sonnei 9007037
14 Shigella sonnei 8604102
15 Shigella flexneri 8518293
16 Shigella sonnei 8807097
17 Escherichia coli Lactose + 0208040
18 Escherichia coli Lactose + 7308009
19 Escherichia coli Lactose + 8145303
20 Escherichia coli Lactose + 8147304
21 Escherichia coli Lactose + 8610007
22 Escherichia coli Lactose + 9009100
23 Escherichia coli Lactose + 9012042
24 Escherichia coli Lactose + 9030345
25 Escherichia coli Lactose + 9203096
26 Escherichia coli Lactose + 9204120
27 Escherichia coli Lactose + 9207041
28 Escherichia coli Lactose + 9306055 29 Escherichia coli Lactose + 9702027
30 Escherichia coli Lactose + 1301204
31 Escherichia coli Lactose + 1301205
32 Escherichia coli Lactose + 1301206
33 Escherichia coli Lactose - 1006021
34 Escherichia coli Lactose - 1109131
35 Escherichia coli Lactose - 9304017
36 Escherichia coli Lactose - 1307049
37 Escherichia coli Lactose - 0007027
38 Escherichia coli Lactose - 8211054
39 Escherichia coli Lactose - 8306016
40 Escherichia coli Lactose - 8312075
41 Escherichia coli Lactose - 8402177
42 Escherichia coli Lactose - 8406013
43 Escherichia coli Lactose - 8408062
44 Escherichia coli Lactose - 8410015
45 Escherichia coli Lactose - 8410016
46 Escherichia coli Lactose - 8410045
47 Escherichia coli Lactose - 8410048
48 Escherichia coli Lactose - 8410062
Tableau 1
2. Culture des bactéries et préparation de l'échantillon :
La préparation des échantillons est faite de manière à étudier l'exométabolome bactérien et donc le profil métabolique des bactéries décrites ci-dessus. Ainsi, les étapes de préparation des échantillons sont les suivantes :
• Préculture des bactéries sur gélose Columbia (Ref bioMérieux 43041) supplémentée à 5% en sang de mouton. Cette étape est réalisée à deux reprises par repiquage de colonies ; Ensemencement d'un milieu Mueller-Hilton liquide (Muller Hinton II Broth Cation Adjusted, Réf. Becton Dickinson 212322) à partir d'une ou plusieurs colonies obtenues à partir des précultures sur gélose Columbia, de manière à obtenir une concentration bactérienne finale des suspensions correspondant à une turbidité de 2 unités McFarland ;
Incubation des suspensions à 37°C pendant lh30 ;
Centrifugation des suspensions bactériennes pendant 10 min à 4000g ;
• Collecte des surnageants dans des tubes Eppendorf et stockage à -80°C.
Les 48 souches bactériennes préparées sont analysées en triplicata. Par ailleurs, un échantillon de milieu de culture Mueller Hinton sans inoculation bactérienne est également analysé en triplicata, après un temps d'incubation identique au temps d'incubation des suspensions bactériennes.
Ce qui fait un total de 147 surnageants à analyser en spectrométrie RMN.
3. Analyse RMN :
a. Préparation des échantillons pour la RMN :
Un tampon est utilisé pour réduire la dispersion de déplacement chimique des signaux RMN qui peuvent se produire du fait des variations de pH ou de force ionique entre les échantillons.
La préparation optimisée est la suivante : 60μΙ^ d'un mélange contenant 1,25M de tampon phosphate KH2P04 (pH 7,4) dans le D20 avec 2mM de NaN3 et 0,1% de trimethylsilyl propionate (TMSP) est ajouté à 540 de surnageant.
Le mélange est agité vigoureusement et 550 du mélange est transféré dans un tube RMN 5mm. Chaque tube est placé dans un rack 96 tubes. L'ensemble des étapes de pipetage, de mélange et de transfert sont réalisées à l'aide d'une plateforme automatisée de gestion de liquide Freedom EVO 75, commercialisée par TECAN. Les racks sont stockés à +4°C jusqu'aux mesures en RMN. b. Mesures RMN :
Toutes les mesures sont réalisées sur un spectromètre Bruker AVANCE III fonctionnant à une fréquence de résonance protonique de 600,55 MHz, couplé à une cryosonde TCI CryoProbe™ 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet, qui permet de maintenir la température des échantillons à +4°C jusqu'à mesure RMN proprement dite.
La température est alors régulée à 300 Kelvins (K) tout au long des mesures RMN. Une séquence d'impulsions standard de RMN 1D 1H du proton, la séquence NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy) avec gradients-z, a été appliquée sur chaque échantillon afin de recueillir le profil métabolique correspondant. 128 acquisitions du signal de précession libre (FID : Free Induction Decays) ont été collectées pour chaque expérience sur une largeur spectrale de 20 ppm. Un délai de récupération de 4 secondes (s), un temps de mélange NOESY de 10 millisecondes (ms), ainsi qu'un gain du récepteur de 40,3 ont été utilisés. La durée de l'impulsion 90°, proche d'une valeur de 14,5 microsecondes (μβ) a été calibrée automatiquement sur chaque échantillon. Une série d'expériences de RMN bidimensionnelle (1H-13C HSQC, 'Η-'Η TOCSY et 1H J-Résolue) a été enregistrée pour un sous-ensemble d'échantillons afin de permettre l'annotation des signaux des différents métabolites. c. Analyse des données de spectres RMN 1H
Une fonction d'apodisation exponentielle, correspondant à un élargissement des raies de 0,3 Hz a été utilisée pour le traitement des signaux de précession libre, avant transformation de Fourier. Une correction de phase manuelle a été appliquée sur les spectres RMN 1H obtenus, qui ont été référencés par rapport au signal du TMSP calibré à δ = - 0,016 ppm à pH 7,4, sous Topspin 3,1 (Bruker GmbH, Rheinstetten, Allemagne).
Les spectres ont été réduits pour intégration en segments de largeur constante (0,01 ppm) sur la gamme de déplacement chimique [0,30 ; lOppm]. La région [4,50 ; 5,01 pm] correspondant au signal résiduel de l'eau a été exclue de l'analyse. Cette réduction des données a été réalisée sous le logiciel AMIX (Bruker), sans normalisation. Les données sont ensuite exportées dans SIMCA-P 13 (Umetrics, Umea,
Suède), pour analyse statistique. L'analyse par OPLS-DA est effectuée avec une répartition selon la méthode Pareto.
4. Analyse des résultats : discrimination Escherichia coli I Shigella
16 souches différentes ont été analysées par type bactérien {Escherichia coli Lactose +, Escherichia coli Lactose -, Shigella). Les variations entre les souches d'un même type pouvant être importantes, une analyse multivariée supervisée par OPLS-DA a été mise en œuvre afin de ne se focaliser que sur les différences primaires. - Discrimination Escherichia coli Lactose + / Shigella :
Comme explicité supra, la qualité du modèle OPLS-DA choisi pour l'analyse des données de RMN est évaluée et validée à l'aide des paramètres R2, Q2, mais également la valeur p du test CV-ANOVA. Les valeurs correspondantes ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle OPLS-SA choisi, sont regroupés dans le tableau 2 ci-dessous :
Figure imgf000014_0001
Tableau 2 Comme on peut le voir sur la figure 1 A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia coli Lactose + et les souches de Shigella. Lorsqu'on se reporte à la figure 1B, l'analyse « loading plot » nous permet de mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de l'exométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type bactérien par rapport à l'autre.
L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia coli Lactose + / Shigella est reprise dans le tableau 3 ci-dessous :
Figure imgf000015_0001
Tableau 3
Cette analyse montre que 11 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia coli Lactose + / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'alanine, l'aspartate, Péthanol, le lactose, la lysine, la Να-acétyllysine, le propionate, le succinate, la thréonine et la valine. - Discrimination Escherichia coli Lactose - / Shigella :
Comme explicité supra, les valeurs des paramètres R2, Q2, mais également la valeur p du test CV-ANOVA, ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle OPLS-SA choisi pour la discrimination Escherichia coli Lactose - / Shigella , sont regroupés dans le tableau 4 ci-dessous :
Figure imgf000016_0001
Tableau 4 Comme on peut le voir sur la figure 2A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia coli Lactose - et les souches de Shigella.
Lorsqu'on se reporte à la figure 2B, l'analyse « loading plot » nous permet de mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de Pexométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type par rapport à l'autre. L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia coli Lactose - / Shigella est reprise dans le tableau 5 ci-dessous : Déplacement chimique (ppm) Métabolites Dominant chez
1 ,9 Acétate Escherichia coli
2.66; 2.67; 2.69; 2.78; 2.81 ; 3.88; 3.89; 3.90 Aspartate Shigella sp.
1.41 ; 1.42; 1.49; 1.50; 1.51 ; 1.52; 1.86; 1.87; 1.88; 1.89; 1.91 ; Lysine Shigella sp. 1.92; 3.03; 3.73; 3.74; 3.75
1.44; 1.45; 1.68; 1.69; 1.70; 2.99; 3.00; 3.02 Na-Acetyllysine Escherichia coli
1.04; 1.05; 2.15; 2.16; 2.17; 2.18 Propionate Escherichia coli
3.82; 3.83; 3.84; 3.91 ; 3.92; 3.94; 3.95; 3.96; 3.97; 3.99 Serine Shigella sp.
2.38; 2.39 Succinate Escherichia coli
1.30; 1.31 ; 1.32; 3.57; 3.58; 4.23; 4.24; 4.25 Threonine Shigella sp.
Tableau 5 Cette analyse montre que 8 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia coli Lactose - / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'aspartate, la lysine, la Να-acétyllysine, le propionate, la sérine, le succinate et la thréonine.
Cet exemple permet donc de montrer qu'en analysant par spectrométrie RMN du proton, Γ exométabolome bactérien, et en particulier en mesurant la quantité d'un nombre réduit de métabolites issus de cet exométabolome, il est possible de différencier aisément Escherichia coli de Shigella
Le procédé selon l'invention apporte donc un réel intérêt clinique, en diminuant sensiblement le temps nécessaire habituellement pour réaliser une telle différenciation et ainsi permettre la mise en place d'un traitement antibiotique, lorsqu'il se justifie.
Références bibliographiques
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[4] Johan Tryg and Svante Wold, Journal of Chemometrics, Volume 16, Issue 3, pages 119-128, March 2002

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de différenciation par spectrométrie RMN du proton entre une bactérie Escherichia coli et une bactérie Shigella, ledit procédé comportant les étapes consistant à :
a) Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella ;
b) Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré ;
c) Obtenir au moins un spectre RMN du au moins un échantillon, d) Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Να-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine ;
e) Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia coli ou Shigella.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel, si la bactérie Escherichia coli ne métabolise pas le lactose, les pics analysés à l'étape d), sont ceux correspondant aux métabolites suivant : acétate, aspartate, lysine, Να-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine.
Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape a), comporte les sous-étapes suivante :
al) Préparer au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia coli ou Shigella à partir d'une ou plusieurs colonies de la même bactérie, de façon à obtenir un concentration bactérienne suffisante ; a2) Incuber la au moins une suspension de bactéries à une température et pendant une durée suffisantes pour obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le temps d'incubation de la au moins une suspension de bactéries est compris entre 1 et 2 heures, préférentiellement une heure et demie. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la température d'incubation est de 37°C.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la fréquence de résonnance utilisée est supérieure ou égale à 600 MHz.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la fréquence de résonnance utilisée est égale à 600,55 MHz
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