WO2016193520A1 - Uso de tectómeros de oligoglicinas como transportadores multifuncionales - Google Patents

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tectomers
oligoglycine
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carbon nanotubes
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Edgar Manuel MUÑOZ DE MIGUEL
Vicente Luis CEBOLLA BURILLO
Rosa GARRIGA MATEO
Alan Brian DALTON
Izabela JUREWICZ
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Zaragoza
University of Surrey
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Zaragoza
University of Surrey
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    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to the use of oligoglycine tectomers as a biocompatible vehicle for the transport of both hydrophobic and hydrophilic substances, characterized in that this substance is incorporated and released from the tectomer by changing the pH of the medium.
  • the hydrophilic substances include carbon structures such as the functionalized forms of carbon nanotubes, graphene and graphene oxide.
  • Tectomers are unique supramolecular aggregates of oligoglycine molecules (see, for example, ChemBioChem 2003, 4, 147-154; Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291-302; J. Org. Chem. 2014, 10, 1372-1382).
  • the formation of tectomers is favored by increasing the pH towards basic regions. Although the formation of tectomers also takes place in solution, the assembly takes place two orders of magnitude faster on the surface of mica (Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology, 201 1, 2, 91-97).
  • Tectomers are a new class of biomaterials with clear interest as therapeutic agents (see, for example, ChemBioChem 2003, 4, 147-154 and Glycoconjugate Journal 2004, 21, 471-478).
  • the antiviral activity of functionalized tectomers by covalent binding of monosaccharides or oligosaccharides has been shown, by multiple specific binding to viral particles.
  • adsorption of glycosylated tectomer plates on the surface of the influenza virus blocks the adhesion of the virus to the cells.
  • tectomers are capable of forming perfectly flat layers at an atomic level and rigid, which makes them potentially useful in the design of new materials and platforms for nanodevices (see, for example, Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291- 302.).
  • liposomes and micelles have been described as biomolecular transporters.
  • a problem presented by liposomes and micelles is their low contact surface with cellular tissues and / or surfaces due to their spherical shape, which makes their application in the transport and release of drugs or materials difficult (see, for example , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2008, 105, 11613-1 1618; and Nature Nanotechnology 2007, 2, 249-255).
  • liposomes show stability problems because they tend to aggregate and fuse over time, which results in the inconvenience of producing load leaks and the need to use methods that increase their stability (see, for example, Pharmanest, 2011, 2, 301-307; and Nano Letters 2006, 6, 694-698).
  • Hydrogels often have slow response times with varying pH (see, for example, Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 321-339).
  • glycosylated tectomers could be used so that they are selectively linked, through glycosyl function and molecular recognition, with the target considered (Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291-302), as it has been carried out with other examples of glycosylated systems other than tectomers (see, for example, Advanced Drug Delivery Reviews 2000, 43, 225-244). This procedure would require prior glycosylation of the tectomers.
  • tectomers as new, highly stable, biocompatible transporters for the efficient and rapid loading and unloading of molecules and materials controlled by pH, with a flat shape that maximizes the surface of interaction with tissues or surfaces.
  • the glycosylation stage was not required in the method of use and that they could be used, in addition to transporting molecules, to transport carbon structures, such as the functionalized forms of carbon or graphene nanotubes.
  • One aspect of the present invention relates to the use of oligoglycine tectomers as vehicles for the transport of at least one substance, characterized in that this substance is incorporated and released from the tectomer by means of pH changes of the medium.
  • the present invention consists in the transport of any type of chemical entity that can be incorporated into the structure of the tectomers.
  • tectomer refers to an aggregate of oligoglycine molecules, which are capable of self-assembling forming two-dimensional structures, stable both in solution and on surfaces. These structures are stabilized by the formation of two-dimensional hydrogen bonds between the glycines that exist at the ends of the molecule (called antennas). Thus, tectomers can be classified into biantennials, triantennials and tetraantennials. Unlike polyglycine, whose structure is helical, in the tectomers the formation of hydrogen bonds occurs in two dimensions.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, for the transport of at least one hydrophobic substance or at least one hydrophilic substance.
  • substance with a hydrophobic character refers to a substance whose molecule contains aromatic rings and / or heterocycles and / or long hydrocarbon chains. These substances have a marked hydrophobic effect, which is summarized as the set of thermodynamic factors that are responsible for the grouping of the non-polar parts that the molecules contain and the tendency to be located in non-polar environments if any when exposed to an aqueous medium. Examples of these substances include, among others, coralin, beta-carotene, retinol, nitidine, fagaronine, ellipticin, acridine and derivatives, with therapeutic or technological interest.
  • hydrophilic substance refers to a substance whose molecule contains polar functional groups or with a net electrical charge, water being a good solvent for this type of substance.
  • Hydrophilic carbonated structures functionalized with polar groups or with net electric charge are included.
  • Carbon structure means materials with a high carbon content, including carbon nanotubes, graphene and graphene derivatives such as graphene oxide.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, where the hydrophilic substance is a carbon skeleton.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, where the carbon skeleton is selected from carbon nanotubes, graphene, graphene derivatives and any combination thereof, characterized by being functionalized. with hydrophilic groups, and preferably where the hydrophilic groups are carboxyl groups and the graphene derivative is graphene oxide.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, where the hydrophobic substance is selected from a drug, a fluorescent substance, a water insoluble substance or any combination thereof. .
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, where the drug and / or the fluorescent substance is coral.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, where the water insoluble substance is beta-carotene. In another embodiment, the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, characterized in that at a pH ⁇ 3, the hydrophobic substance is completely released from the tectomers. In another embodiment, the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, characterized in that at a pH ⁇ 3 or a pH ⁇ 7.4, the hydrophilic substance is completely released from the tectomers. .
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, characterized in that the tectomers are functionalized, and preferably glycosylated.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as defined above, as fluorescence based pH sensors.
  • tectomers are attractive as biocompatible transporters of molecules with considerable hydrophobic character, and also of carbon structures, such as carbon and / or graphene nanotubes functionalized with hydrophilic groups, and therefore have an interest in therapeutic applications, sensors fluorescent, as well as in a wide range of technological applications.
  • the tectomers of the invention are useful as vehicles whose loading and release are controlled by pH in examples such as: drugs, vaccines, biodetoxification, cosmetics, bioadhesives, fluorescence imaging, sensors and transport in aqueous solution of low substances soluble in water which, for example in the case of retinol and other fat-soluble vitamins, may have an interest in the field of nutrition or cosmetics.
  • they can be used as pH-sensitive transporters for loading and releasing carbon nanotubes that incorporate functional groups. Also, they can be used to immobilize carbon nanotubes on viruses, surfaces, etc., where the functionalized nanotubes themselves can act as drug transport systems (see, for example, Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9, 674-679). And, also, as sensors for the immobilization of carbon nanotubes by tectomers both by functionalization of carbon nanotubes with fluorescent markers, and by detecting the intrinsic properties of carbon nanotubes. And, since the tectomers are biofunctionalizable, both at the stage of monomeric oligoglycine and the tectomer already assembled, this offers broad perspectives on immobilization.
  • the tectomers in the invention are useful in the selective separation of functionalized forms of graphene from aqueous solutions, these materials being able to carry drugs, nucleic acids, etc. [Small 201 1, 7, 1569-1578.].
  • Functionalized forms of graphene can be released from the tectomer by changing the pH.
  • they are useful in immobilizing functionalized forms of graphene on tectomer-coated surfaces.
  • the flat shape of the tectomers favors their interaction with the functionalized forms of graphene, which also have two-dimensional structures.
  • the tectomers are biofunctionalizable, both at the stage of monomeric oligoglycine and the tectomer already assembled, this offers broad perspectives on immobilization.
  • tectomers are very stable because they can be stored in solution for long periods, particularly for at least three months, and at room temperature. In addition to use in solution, tectomers can be used covering dry solid surfaces.
  • Tectomers allow fast, efficient and reversible loading and unloading by pH control.
  • tectomers and their solubility in aqueous solution depends on the number of antennas, the number of glycine units in the antennas, the length of the hydrophobic part, the concentration employed, the temperature and the pH of the medium. Another characteristic of tectomers is that they are biodegradable.
  • the solution of charged tectomers can be lyophilized or deposited forming films, which facilitates its handling.
  • the invention relates to the use of oligoglycine tectomers as described above, as vehicles for the transport of biomolecules, and preferably for the transport of proteins, enzymes, antibodies, nucleic acids, polysaccharides, lipids, Primary metabolites, secondary metabolites and carbohydrates.
  • FIGURES Fig. 1 Structural characterization of the tectomers.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • b Electron diffraction pattern showing the crystalline structure of the tectomer.
  • c Image of atomic force microscopy (AFM) of topography, and profile, showing flat structure, with a thickness for the single plate of biantennial oligoglycine tectomer of ⁇ 6 nm.
  • AFM atomic force microscopy
  • Fig. 2. Emission fluorescence spectrum, showing increases in coralina fluorescence in the presence of increasing amounts of oligoglycine in MilliQ water (pH 6.3). b) Graph that allows the calculation of the distribution coefficient K p of the coralin in tectomeric aggregates in MilliQ water. Fig. 3. Chemical structure of the biantennial coral and oligoglycine, as well as the confocal fluorescence microscopy image, showing the incorporation of the coral fluorescent molecule into the tectomer.
  • Fig. 4. Fluorescence emission spectra of the coralin in aqueous solution in the absence (dotted line) and in the presence (continuous line) of biantennial oligoglycine. b) Spectra after subjecting both samples to photochemical damage, showing the protection of the coraline due to its incorporation in the tectomers (continuous line).
  • Fig. 5 Loading and unloading of coralin in the tectomers, monitored by vis-UV spectroscopy. It is shown how, starting from a solution of biantennial coralin / oligoglycine in MilliQ water (pH 6.3) (figure A), if the pH increases to 7.4 (figure B), the massive aggregation of the oligoglycine occurs, and The formed tectomers precipitate (TEM microscopy image of the precipitate is shown). Observe, in the vis-UV spectra, the disappearance of a certain amount of coralin from the solution when comparing the spectra A and B. Subsequently, when changing the pH to the value 3.0 (figure C), the precipitate is immediately and completely redissolved, releasing the coral (spectrum C).
  • Fig. 6. Demonstration of the solubility of ⁇ -carotene in the aqueous phase containing biantennial oligoglycine.
  • the aqueous (upper) layer is MilliQ water and the lower phase is dichloromethane.
  • the aqueous (upper) layer contains oligoglycine, and it can be seen how an appreciable amount of beta-carotene has been transferred from the organic (lower) phase to the aqueous phase containing oligoglycine (upper). The coloration that appears in the aqueous phase is due to the transferred beta-carotene, since the solution of oligoglycine in water would be colorless.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • ESEM scanning electron environmental microscopy
  • Fig. 8. a) Precipitation of graphene oxide by adding a solution of biantennial (i) or tetraantennial oligoglycine (ii) in MilliQ water (pH 6.3), due to its interaction with the tectomers. Scanning electron microscopy (SEM) images of biantennial oligoglycine tectomers b) and composite materials formed with graphene oxide c) are shown. (Observe in c) the interface in the tectomer / graphene oxide complexes). SEM micrographs of tetraantennial oligoglycine tectomers d) and of the graphene oxide e) composite materials are also shown. Fig. 9.
  • SEM scanning electron microscopy
  • FIG. 10 Cell viability studies showing the application as scaffolds of carboxylated carbon nanotubes and graphene oxide immobilized by bi- and tetra-antenary oliogoglycins tectomers for in vitro cell cultures, demonstrating their biocompatibility.
  • the three cell lines used were BXPC_3 (a), PANC_1 (b) and ASPC_1 (c).
  • Example 1 Fast, efficient and reversible loading and unloading, controlled by pH, of molecules with considerable hydrophobic character, using biantennial oligoglycins.
  • This example demonstrates the efficient loading and unloading of coralin in tectomers.
  • the molecule chosen in this study as a model drug for transport is coralin (2,3,10,11-tetramethoxy-8-methylisoquin chloride [3, 2- a] isoquinolinium, 38989-38-7 CAS).
  • Said molecule has anticancer properties (W01997029106) and also has fluorescence.
  • the process of loading the molecule by the tectomer is carried out at pH> 7.4. At this pH, 98% of the oligoglycine is precipitated, as determined by visible UV-spectroscopy measurements.
  • the coralin discharge of the tectomers can be achieved by varying the pH to acidic values, due to the immediate destruction of the tectomers, thereby releasing their content.
  • Tectomers are not stable at acidic pH due to electrostatic repulsion caused by protonation of the terminal amino groups. It has been verified by visible-UV spectroscopy that the release of coralin is complete at pH 3.0, the loading and unloading processes being completely reversible (Figure 5).
  • Tectomer / coral solutions may be deposited as films on various substrates or lyophilized (and then redissolved if required), which favors their handling.
  • the results also indicate that, when loading the tectomers with fluorescent molecules, it is possible to consider said tectomers as a pH sensor, since we can observe the formation or destruction of the tectomer plates according to the pH, using fluorescence confocal microscopy images ( Figure 3).
  • tectomers as a pH sensor, since we can observe the formation or destruction of the tectomer plates according to the pH, using fluorescence confocal microscopy images ( Figure 3).
  • normal tissue could be distinguished against tumor cells, often at acidic pH.
  • tectomers loaded with fluorescent molecules could act as sensors for the presence of viruses, given the ability of the tectomers that have been described to adhere to viruses.
  • the essential property in the transport of hydrophobic molecules by biantennial tectomers lies in the presence of a hydrocarbon chain in the central part of the oligoglycine molecule ( Figure 3).
  • the hydrophobic effect is responsible for the transport of these molecules, as shown in the case of coralin.
  • This section of the present invention thus refers to biantennial oligoglycine tectomers, the number of glycine units in the antennas and with different lengths of hydrocarbon chain in the central part of its structure being varied, with a number of groups -CH 2 > n (where n ⁇ 2).
  • Example 2 Fast, efficient and reversible, pH-controlled loading and unloading of carbon nanotubes.
  • Example 3 Fast, efficient and reversible loading and unloading of graphene, controlled by pH.
  • Example 4 Immobilization of functionalized carbon nanotubes (carboxylated) on surfaces such as glass or mica by means of bi- and tetra-antennial oligoglycine tectomers. Films (films) have been obtained by deposition and subsequent evaporation, on mica or glass, of a solution of carboxylated carbon nanotubes, as well as a solution of carboxylated carbon nanotubes / tectomers. The results show that the films of carboxylated carbon nanotubes / tectomers remain unchanged when subjected to contact with water. However, nanotube films without tectomers deteriorate and detach from the surface ( Figure 9), so the tectomers show a bioadhesive protective action.
  • Example 5 Use of tectomer films, carboxylated carbon nanotubes / tectomers and graphene oxide / bi- and tetra-antennial oligoglycine tectomers for in vitro cell culture.
  • BXPC_3 Human primary pancreatic adenocarcinoma
  • PANC_1 Human pancreatic carcinoma, epithelial cell line
  • ASPC_1 Metastasis of the pancreas (ascites).
  • biocompatibilization of carbon nanotubes and graphene oxide is interesting for the use of electronic devices, sensors, etc. based on carbon nanotubes in biological systems. They also enable the use of carbon nanotubes in cell culture studies, which are also used to simulate the structure of the extracellular matrix on a nanometric scale.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas como vehículo biocompatible para el transporte de sustancias tanto con carácter hidrofóbico como hidrofílico, caracterizado por que esta sustancia se incorpora y libera del tectómero mediante cambios de pH del medio. Entre las sustancias con carácter hidrofílicose incluyen formas funcionalizadas de nanotubos de carbono, grafeno y óxido de grafeno.

Description

USO DE TECTÓMEROS DE OLIGOGLICINAS COMO TRANSPORTADORES
MULTIFUNCIONALES
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas como vehículo biocompatible para el transporte de sustancias tanto con carácter hidrofóbico como hidrofílico, caracterizado por que esta sustancia se incorpora y libera del tectómero mediante cambios de pH del medio. Entre las sustancias con carácter hidrofílico se incluyen estructuras carbonadas como son las formas funcionalizadas de nanotubos de carbono, grafeno y óxido de grafeno.
ESTADO DE LA TÉCNICA Los tectómeros son agregados supramoleculares singulares de moléculas de oligoglicina (ver, por ejemplo, ChemBioChem 2003, 4, 147-154; Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291-302; J. Org. Chem. 2014, 10, 1372-1382). La formación de tectómeros se ve favorecida al aumentar el pH hacia regiones básicas. Aunque la formación de tectómeros también tiene lugar en disolución, el ensamblaje se produce dos órdenes de magnitud más rápido sobre superficie de mica (Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology, 201 1 , 2, 91-97).
Los tectómeros son una nueva clase de biomateriales con claro interés como agentes terapeúticos (ver, por ejemplo, ChemBioChem 2003, 4, 147-154 y Glycoconjugate Journal 2004, 21 , 471-478). Se ha mostrado la actividad antiviral de tectómeros funcionalizados mediante la unión covalente de monosacáridos u oligosacáridos, por unión específica múltiple a las partículas virales. Así, la adsorción de placas de tectómero glicosilado sobre la superficie del virus de la gripe bloquea la adhesión del virus a las células. Por otro lado, los tectómeros son capaces de formar capas perfectamente planas a nivel atómico y rígidas, lo que les hace potencialmente útiles en el diseño de nuevos materiales y plataformas para nanodispositivos (ver, por ejemplo, Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291-302.). Por otro lado, estructuras tales como micelas, liposomas, polímeros, dendrímeros, hidrogeles, nanopartículas y algunos materiales de carbono se han descrito como transportadores biomoleculares. Un problema que presentan los liposomas y micelas es su poca superficie de contacto con tejidos celulares y/o superficies debido a su forma esférica, lo que hace que su aplicación en el transporte y liberación de fármacos o materiales se vea dificultada (ver, por ejemplo, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 2008, 105, 11613-1 1618; y Nature Nanotechnology 2007, 2, 249-255).
Por otro lado, los liposomas muestran problemas de estabilidad pues con el tiempo tienden a agregarse y fusionarse, lo cual resulta en el inconveniente de producir fugas de carga y en la necesidad de emplear métodos que aumenten su estabilidad (ver, por ejemplo, Pharmanest, 2011 , 2, 301-307; y Nano Letters 2006, 6, 694-698).
Los hidrogeles presentan con frecuencia tiempos de respuesta lentos al variar el pH (ver, por ejemplo, Advanced Drug Delivery Reviews 2001 , 53, 321-339).
Además, se ha propuesto la hipótesis de que se podrían utilizar los tectómeros glicosilados para que queden unidos selectivamente, a través de la función glicosílica y por reconocimiento molecular, con la diana considerada (Nanotechnologies in Russia 2008, 3, 291-302), como se ha realizado con otros ejemplos de sistemas glicosilados distintos a los tectómeros (ver, por ejemplo, Advanced Drug Delivery Reviews 2000, 43, 225-244). Este procedimiento precisaría la previa glicosilación de los tectómeros.
Por tanto, sería deseable disponer de tectómeros como nuevos transportadores biocompatibles, altamente estables, para la eficiente y rápida carga y descarga de moléculas y materiales controlada por el pH, con forma plana que maximice la superficie de interacción con tejidos o superficies. Además, sería deseable que en el procedimiento de empleo no se precisase la etapa de glicosilación y que puedan ser utilizados, además de para transportar moléculas, para transportar estructuras carbonadas, como son las formas funcionalizadas de nanotubos de carbono o grafeno.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas como vehículos para el transporte de al menos una sustancia, caracterizado por que esta sustancia se incorpora y libera del tectómero mediante cambios de pH del medio.
Por tanto, la presente invención consiste en el transporte de cualquier tipo de entidad química que se pueda incorporar en la estructura de los tectómeros.
En la presente invención, el término "tectómero" se refiere a un agregado de moléculas de oligoglicina, que son capaces de autoensamblarse formando estructuras bidimensionales, estables tanto en disolución como sobre superficies. Estas estructuras están estabilizadas por la formación de enlaces de hidrógeno en dos dimensiones entre las glicinas que existen en los extremos de la molécula (llamados antenas). Así, se pueden clasificar los tectómeros en biantenarios, triantenarios y tetraantenarios. A diferencia de la poliglicina, cuya estructura es helicoidal, en los tectómeros la formación de los enlaces de hidrógeno sucede en dos dimensiones.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, para el transporte de al menos una sustancia con carácter hidrofóbico o de al menos una sustancia con carácter hidrofílico.
El término "sustancia con carácter hidrofóbico" se refiere a una sustancia cuya molécula contiene anillos aromáticos y/o heterociclos y/o largas cadenas hidrocarbonadas. Estas sustancias presentan marcado efecto hidrofóbico, que se resume como el conjunto de factores termodinámicos que son responsables del agrupamiento de las partes no polares que contienen las moléculas y la tendencia a localizarse en entornos no polares si los hubiere al verse expuestas a un medio acuoso. Ejemplos de estas sustancias incluyen entre otros, coralina, beta-caroteno, retinol, nitidina, fagaronina, elipticina, acridina y derivados, con interés terapeútico o tecnológico.
El término "sustancia con carácter hidrofílico" se refiere a una sustancia cuya molécula contiene grupos funcionales polares o con carga eléctrica neta, siendo el agua un buen disolvente de este tipo de sustancias. Entre las sustancias con carácter hidrofílico se incluyen las estructuras carbonadas funcionalizadas con grupos polares o con carga eléctrica neta.
Por "estructura carbonada" se entiende materiales con alto contenido en carbono, entre los que se incluyen los nanotubos de carbono, grafeno y derivados de grafeno tales como el óxido de grafeno.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, donde la sustancia con carácter hidrofílico es una estructura carbonada.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, donde la estructura carbonada se selecciona de nanotubos de carbono, grafeno, derivados de grafeno y cualquier combinación de los mismos, caracterizados por estar funcionalizados con grupos hidrofílicos, y preferiblemente donde los grupos hidrofílicos son grupos carboxilo y el derivado de grafeno es óxido de grafeno.
Las interacciones electrostáticas entre los grupos funcionales con carga negativa de las estructuras carbonadas funcionalizadas y los grupos amino terminales protonados de los tectómeros son las responsables de la formación del complejo.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, donde la sustancia con carácter hidrofóbico se selecciona de un fármaco, una sustancia fluorescente, una sustancia insoluble en agua o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, donde el fármaco y/o la sustancia fluorescente es coralina.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, donde la sustancia insoluble en agua es beta- caroteno. En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros_de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, caracterizado porque a un pH < 3, la sustancia con carácter hidrofóbico se libera por completo de los tectómeros. En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, caracterizado porque a un pH < 3 o a un pH ≥7,4, la sustancia con carácter hidrofílico se libera por completo de los tectómeros.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, caracterizado por que los tectómeros están funcionalizados, y preferiblemente glicosilados.
En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha definido anteriormente, como sensores de pH basados en la fluorescencia.
Así, se demuestra que los tectómeros son atractivos como transportadores biocompatibles de moléculas con considerable carácter hidrofóbico, y también de estructuras carbonadas, como son los nanotubos de carbono y/o grafeno funcionalizados con grupos hidrofílicos, y por ello presentan interés en aplicaciones terapeúticas, sensores fluorescentes, así como en un amplio rango de aplicaciones tecnológicas.
Por tanto, los tectómeros de la invención resultan útiles como vehículos cuya carga y liberación vienen controladas por el pH en ejemplos como: fármacos, vacunas, biodestoxificación, cosméticos, bioadhesivos, obtención de imágenes por fluorescencia, sensores y transporte en disolución acuosa de sustancias poco solubles en agua que, por ejemplo en el caso de retinol y otras vitaminas liposolubles, puede tener interés en el campo de nutrición o cosmética.
Asimismo, se pueden utilizar como transportadores sensibles al pH para la carga y liberación de nanotubos de carbono que lleven incorporados grupos funcionales. También, se pueden usar para inmovilizar nanotubos de carbono sobre virus, superficies, etc., donde los propios nanotubos funcionalizados pueden actuar como sistemas de transporte de fármacos (ver, por ejemplo, Current Opinión in Chemical Biology 2005, 9, 674-679). Y, también, como sensores de la inmovilización de nanotubos de carbono por los tectomeros tanto por funcionalización de los nanotubos de carbono con marcadores fluorescentes, como detectando las propiedades intrínsecas de los nanotubos de carbono. Y, ya que los tectomeros son biofuncionalizables, tanto en la etapa de oligoglicina monómero como ya ensamblado el tectómero, esto ofrece amplias perspectivas en cuanto a la inmovilización.
Finalmente, los tectomeros en la invención resultan útiles en la separación selectiva de formas funcionalizadas de grafeno de disoluciones acuosas, pudiendo estos materiales llevar unidos fármacos, ácidos nucleicos, etc [Small 201 1 , 7, 1569-1578.]. Las formas funcionalizadas de grafeno pueden ser liberadas del tectómero cambiando el pH. También, son útiles en la inmovilización de formas funcionalizadas de grafeno sobre superficies recubiertas de tectómero. La forma plana de los tectomeros favorece su interacción con las formas funcionalizadas de grafeno, que también poseen estructuras bidimensionales. Y, ya que los tectomeros son biofuncionalizables, tanto en la etapa de oligoglicina monómero como ya ensamblado el tectómero, esto ofrece amplias perspectivas en cuanto a la inmovilización.
Como también se ha mencionado, entre las ventajas de los tectomeros de la invención, cabe destacar su forma plana, que permite que se maximice la superficie de contacto entre el tectómero y tejidos celulares o superficies, lo cual es una ventaja respecto a la forma esférica de micelas y liposomas.
Además, los tectomeros son muy estables porque se pueden almacenar en disolución durante tiempos largos, particularmente durante al menos tres meses, y a temperatura ambiente. Además de uso en disolución, los tectomeros pueden utilizarse cubriendo superficies sólidas secas.
Los tectomeros permiten una carga y descarga rápida, eficiente y reversible mediante el control del pH.
La formación de tectomeros y su solubilidad en disolución acuosa depende del número de antenas, del número de unidades de glicina en las antenas, de la longitud de la parte hidrofóbica, de la concentración empleada, de la temperatura y del pH del medio. Otra característica de los tectómeros es que son biodegradables.
La disolución de tectómeros cargados se puede liofilizar o depositarse formando films, lo que facilita su manipulación.
Ya que los tectómeros son biofuncionalizables, tanto en la etapa de oligoglicina monómero como ya ensamblado, esto ofrece amplias perspectivas en cuanto a la inmovilización selectiva en lugares de interés. En otra realización, la invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas tal y como se ha descrito anteriormente, como vehículos para el transporte de biomoléculas, y preferiblemente para el transporte de proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, metabolitos primarios, metabolitos secundarios y carbohidratos.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Caracterización estructural de los tectómeros. a) Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) correspondiente a una disolución de oligoglicina biantenaria 1 mg-mL'1 en agua MilliQ (pH 6,3). b) Patrón de difracción de electrones mostrando la estructura cristalina del tectómero. c) Imagen de microscopía de fuerzas atómicas (AFM) de topografía, y perfil, mostrando estructura plana, con un grosor para la placa individual de tectómero de oligoglicina biantenaria de ~ 6 nm.
Fig. 2. a) Espectro de fluorescencia de emisión, mostrando los aumentos de la fluorescencia de la coralina en presencia de cantidades crecientes de oligoglicina en agua MilliQ (pH 6,3). b) Gráfica que permite el cálculo del coeficiente de reparto Kp de la coralina en los agregados tectoméricos en agua MilliQ. Fig. 3. Estructura química de la coralina y la oligoglicina biantenaria, así como la imagen de microscopía confocal de fluorescencia, mostrando la incorporación de la molécula fluorescente coralina en el tectómero.
Fig. 4. a) Espectros de emisión de fluorescencia de la coralina en disolución acuosa en ausencia (línea punteada) y en presencia (línea continua) de oligoglicina biantenaria. b) Espectros tras someter ambas muestras a daño fotoquímico, mostrando la protección de la coralina debido a su incorporación en los tectomeros (línea continua).
Fig. 5. Carga y descarga de coralina en los tectomeros, monitorizada por espectroscopia vis-UV. Se muestra cómo, partiendo de una disolución de coralina/oligoglicina biantenaria en agua MilliQ (pH 6,3) (figura A), si el pH aumenta al valor 7,4 (figura B), ocurre la agregación masiva de la oligoglicina, y los tectomeros formados precipitan (se muestra la imagen de microscopía TEM del precipitado). Observar, en los espectros vis-UV, la desaparición de cierta cantidad de coralina de la disolución al comparar los espectros A y B. Posteriormente, al cambiar el pH hasta el valor 3,0 (figura C), el precipitado es inmediata y completamente redisuelto, liberándose la coralina (espectro C).
Fig. 6. Demostración de la solubilidad de β-caroteno en fase acuosa conteniendo oligoglicina biantenaria. En la figura a) la capa acuosa (superior) es agua MilliQ y la fase inferior es diclorometano. En la figura b) la capa acuosa (superior) contiene oligoglicina, y puede observarse cómo se ha transferido una cantidad apreciable de beta-caroteno de la fase orgánica (inferior) a la fase acuosa conteniendo oligoglicina (superior). La coloración que aparece en la fase acuosa se debe al beta-caroteno transferido, puesto que la disolución de oligoglicina en agua sería incolora. Fig. 7. a) Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y b) imagen de microscopía ambiental electrónica de barrido (ESEM), correspondientes a una disolución de oligoglicina biantenaria y nanotubos de carbono funcionalizados con grupos carboxilo disueltos en agua MilliQ (pH 6,3). Ambas imágenes confirman la interacción entre los tectomeros y los nanotubos de carbono, c) Medidas de ángulo de contacto de disoluciones en agua MilliQ utilizando vidrio como soporte, que también confirman la interacción, pues el aumento del ángulo de contacto indica la neutralización parcial de las cargas negativas de los grupos carboxilo de los nanotubos de carbono. En d) la imagen de TEM muestra el efecto de cambiar el pH al valor 3,0: el tectómero ha liberado a los nanotubos de carbono (comparar con la figura a). En e) se muestra la imagen TEM en la que se aprecia que también una oligoglicina tetraantenaria se une masivamente a los nanotubos carboxilados. En la figura f) se muestran películas de materiales compuestos de nanotubos de carbono carboxilados con oligoglicina biantenaria (i) u oligoglicina tetraantenaria (ii). (Notar que se forman películas notablemente más densas con la oligoglicina tetraantenaria).
Fig. 8. a) Precipitación del óxido de grafeno al añadir una disolución de oligoglicina biantenaria (i) o tetraantenaria (ii) en agua MilliQ (pH 6,3), debido a su interacción con los tectómeros. Se muestran las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de tectómeros de oligoglicina biantenaria b) y de los materiales compuestos formados con óxido de grafeno c). (Observar en c) la interfase en los complejos formados de tectómero/óxido de grafeno). Se muestran también las micrografías SEM de tectómeros de oligoglicina tetraantenaria d) y de los materiales compuestos formados con óxido de grafeno e). Fig. 9. Imagen mostrando que las películas de nanotubos de carbono carboxilados sobre un soporte de vidrio se destruyen en contacto con agua (a), y sin embargo, se observa que, con tectómeros de oligoglicina bi-antenaria, éstos inmovilizan eficazmente y protegen la película de nanotubos de carbono frente al agua (b). Fig. 10. Estudios de viabilidad celular que muestran la aplicación como andamiaje (scaffolds) de los nanotubos de carbono carboxilados y óxido de grafeno inmovilizados mediante tectómeros de oliogoglicinas bi- y tetra-antenarias para los cultivos celulares in vitro, demostrando su biocompatibilidad. Las tres líneas celulares empleadas han sido BXPC_3 (a), PANC_1 (b) y ASPC_1 (c).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Los estudios de microscopía electrónica, difracción de electrones y de fuerzas atómicas indican que los tectomeros correspondientes a disoluciones 1 mg-mL'1 presentan estructura cristalina y bidimensional cuyo tamaño es del orden de varias mieras, y de espesor ~6 nm para una placa individual de tectómero de oligoglicina biantenaria (Figura 1).
Ejemplo 1. Carga y descarga rápida, eficiente y reversible, controlada por el pH, de moléculas con considerable carácter hidrofóbico, utilizando oligoglicinas biantenarias.
Mediante este ejemplo se demuestra la eficiente carga y descarga de coralina en tectomeros. La molécula elegida en este estudio como fármaco modelo para transportar es la coralina (cloruro de 2,3, 10,1 1-tetrametoxi-8-metilisoquino[3, 2- a]isoquinolinio, 38989-38-7 CAS). Dicha molécula tiene propiedades anticancerígenas (W01997029106) y, además, presenta fluorescencia.
Los aumentos de intensidad de fluorescencia obtenidos (Figura 2), las imágenes de microscopía de fluorescencia (Figura 3), las medidas de potencial Z y la protección que se han observado respecto al daño fotoquímico (Figura 4) confirman que la coralina se encuentra incorporada dentro de los tectomeros. Se ha calculado, por medio de medidas de intensidad de fluorescencia, un valor de coeficiente de partición de 1x104 en agua MilliQ (Figura 2).
El proceso de carga de la molécula por el tectómero se realiza a pH > 7,4. A este pH, se precipita el 98% de la oligoglicina, según se ha determinado por medidas de espectroscopia visible-UV. La descarga de coralina de los tectomeros se puede lograr variando el pH a valores ácidos, debido a la inmediata destrucción de los tectomeros, liberando de este modo su contenido. Los tectomeros no son estables a pH ácidos debido a la repulsión electrostática provocada por la protonación de los grupos amino terminales. Se ha comprobado por espectroscopia visible-UV que la liberación de coralina es completa a pH 3,0, siendo los procesos de carga y descarga completamente reversibles (Figura 5). Las disoluciones de tectómero/coralina pueden ser depositadas como películas sobre varios sustratos o liofilizadas (y después redisueltas si se requiere), lo que favorece su manipulación. Los resultados también indican que, al cargar los tectomeros con moléculas fluorescentes, es posible considerar a dichos tectomeros como un sensor de pH, pues podemos observar la formación o destrucción de las placas de tectomeros según el pH, mediante imágenes de microscopía confocal de fluorescencia (Figura 3). Así por ejemplo, se podría distinguir tejido normal frente células tumorales, frecuentemente a pH ácido.
Por otro lado, también sería posible trabajar con tectomeros funcionalizados de forma que se vieran imágenes de su colocación selectiva en lugares de interés; por ejemplo los tectomeros cargados con moléculas fluorescentes podrían actuar como sensores de la presencia de virus, dada la capacidad de los tectomeros que se ha descrito de adherirse a virus.
La propiedad esencial en el transporte de moléculas con carácter hidrofóbico por los tectomeros biantenarios radica en la presencia de una cadena hidrocarbonada en la parte central de la molécula de oligoglicina (Figura 3). El efecto hidrofóbico es el responsable del transporte de estas moléculas, como se muestra en el caso de la coralina. Este apartado de la presente invención se refiere pues a tectomeros de oligoglicinas biantenarias, pudiendo variar el número de unidades de glicina en las antenas y con diversas longitudes de cadena hidrocarbonada en la parte central de su estructura, con un número de grupos -CH2 > n (siendo n≥ 2).
Los resultados muestran también que la propiedad de transporte de moléculas con carácter hidrofóbico por los tectomeros puede ser útil para el transporte en agua de moléculas altamente hidrofóbicas e insolubles en agua: por ejemplo, se ha transferido beta-caroteno, que muestra solubilidad nula en agua, de la fase orgánica (diclorometano) a la fase acuosa empleando los tectomeros disueltos en fase acuosa como vehículos (Figura 6). Es posible mantenerlos en disolución acuosa o precipitarlos según el pH.
Ejemplo 2. Carga y descarga rápida, eficiente y reversible, controlada por el pH, de nanotubos de carbono.
Se ha demostrado que los tectomeros de oligoglicinas bi-y tetra-antenarias se unen eficientemente a nanotubos de carbono funcionalizados con grupos carboxilo en agua MilliQ (Figura 7), siendo el complejo completamente soluble. Además se ha observado que, cambiando el pH a valores < 3.0 o bien≥ 7.4, los nanotubos de carbono son liberados de los vehículos tectoméricos. Además se han fabricado películas de tectómero/nanotubos de carbono sobre una variedad de sustratos por deposición de disoluciones conteniendo tectómero/nanotubos de carbono. Estas películas se deshacen inmediatamente cambiando el pH. De forma similar se han fabricado películas de tectómero (cargado con coralina)/nanotubos de carbono. Las disoluciones empleadas pueden ser liofilizadas, lo que facilita su manipulación. Las interacciones electrostáticas entre los grupo amino terminales protonados de los tectómeros y los grupos funcionales cargados negativamente de los nanotubos de carbono son los responsables de la formación del complejo tectómeros/nanotubos de carbono. Por ello este procedimiento resulta válido para diferentes formas funcionalizadas de nanotubos de carbono.
Cambiando el pH a valores <3,0 o bien≥ 7,4 se ha observado que los nanotubos de carbono funcionalizados son liberados completamente del tectómero, ya que a estos valores de pH o bien los grupos funcionales de los nanotubos de carbono no llevan carga negativa o bien los tectómeros no llevan carga positiva.
Ejemplo 3. Carga y descarga rápida, eficiente y reversible de grafeno, controlada por el pH.
Se ha demostrado que los tectómeros de oligoglicinas bi- y tetra-antenarias se unen eficazmente a óxido de grafeno en agua MilliQ (Figura 8). El complejo precipita, lo que es un resultado muy interesante, ya que el óxido de grafeno es altamente soluble en agua MilliQ. Mediante medidas de espectroscopia vis-UV se cuantificó que la desaparición del óxido de grafeno de la disolución es completa tras producirse la precipitación, demostrando la interacción con los tectómeros.
Las interacciones electrostáticas entre los grupos amino terminal de los tectómeros y los grupos funcionales con carga negativa del óxido de grafeno son responsables de la formación del complejo. Por ello este principio se puede aplicar a otras formas funcionalizadas de grafeno. Cambiando el pH a valores <3,0 o bien≥ 7,4 se ha observado que el óxido de grafeno es liberado completamente del tectómero y puesto de nuevo en la disolución, ya que a estos valores de pH o bien los grupos funcionales del óxido de grafeno no llevan carga negativa o bien los tectómeros no llevan carga positiva.
Ejemplo 4. Inmovilización de nanotubos de carbono funcionalizados (carboxilados) sobre superficies tales como vidrio o mica mediante los tectómeros de oligoglicinas bi- y tetra-antenarias. Se han obtenido películas (films) por deposición y posterior evaporación, sobre mica o vidrio, de una disolución de nanotubos de carbono carboxilados, así como una disolución de nanotubos de carbono carboxilados/tectómeros. Los resultados muestran que las películas de nanotubos de carbono carboxilados/tectómeros permanecen inalteradas al ser sometidas al contacto con agua. Sin embargo, las películas de nanotubos sin tectómeros se deterioran y despegan de la superficie (Figura 9), por lo que los tectómeros muestran una acción protectora bioadhesiva. Las películas que incluyen tectómeros se eliminan fácilmente por lavado con tampón pH 2,2. Asimismo, se han fabricado películas de tectómeros cargados con el fluoróforo coralina y películas de nanotubos de carbono carboxilados/tectómeros cargado con el fluoróforo coralina, de interés para fabricar sensores.
Ejemplo 5. Utilización de películas de tectómeros, nanotubos de carbono carboxilados/tectómeros y óxido de grafeno/tectómeros de oligoglicinas bi- y tetra-antenarias para cultivo celular in vitro.
Se han realizado estudios de viabilidad celular que muestran la aplicación como andamiaje (scaffolds) de los nanotubos de carbono carboxilados y óxido de grafeno inmovilizados mediante tectómeros de oliogoglicinas bi- y tetra-antenarias para los cultivos celulares in vitro, demostrando su biocompatibilidad. Así, se han formado películas por secado gota a gota durante 24 horas (drop-casting) sobre placas de 96 pocilios y después se han esterilizado durante 30 minutos mediante irradiación vis-UV. El test de viabilidad utilizado ha sido: CelITiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay. Se han elegido líneas de células cancerosas, ya que es muy activa la investigación realizada sobre el comportamiento de las células cancerosas in vitro frente a tratamientos como radioterapia, quimioterapia, influencia del entorno, etc., así como la comprensión del crecimiento tumoral. Se han empleado tres líneas celulares: BXPC_3: Adenocarcinoma pancreático primario humano; PANC_1 : Carcinoma pancreático humano, línea celular tipo epitelial; ASPC_1 : Metástasis de páncreas (ascitis).
Según los resultados obtenidos (Figura 10), la presencia de nanotubos de carbono carboxilados afectó significativamente el crecimiento celular, observándose que el crecimiento celular disminuye gradualmente con el tiempo para las tres líneas celulares crecidas sobre estas películas de nanotubos, pudiéndose incluso decir que los nanotubos de carbono son tóxicos para las células en el caso de la línea celular BXPC_3. Sin embargo, se observó que la viabilidad celular es superior cuando los cultivos celulares fueron realizados sobre películas de nanotubos de carbono carboxilados/oligoglicinas bi- y tetra-antenarias, lo cual demuestra su biocompatibilidad. En el caso de los ensayos realizados con óxido de grafeno/oligoglicina biantenaria se obtienen respuestas muy similares a los casos con nanotubos de carbono/oligoglicina biantenaria. Finalmente, en los experimentos realizados en películas de oligoglicina bi- y tetra-antenarias sin nanotubos carboxilados ni óxido de grafeno, para todas las líneas celulares estudiadas, se observa que el crecimiento celular no se ve alterado si se compara con las células de los ensayos control (sólo se ralentiza el crecimiento los días 2 y 3 de la línea BXPC_3). Estos resultados demuestran por tanto la biocompatibilidad de los tectómeros de oligoglicina así como de los materiales compuestos consistentes en nanotubos carboxilados y óxido de grafeno inmovilizados en tectómeros de oligoglicina.
La biocompatibilización de nanotubos de carbono y óxido de grafeno es interesante para el empleo de dispositivos electrónicos, sensores, etc. basados en nanotubos de carbono en sistemas biológicos. Asimismo posibilitan el empleo de nanotubos de carbono en estudios de cultivos celulares, que también se utilizan para simular a escala nanométrica la estructura de la matriz extracelular

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de los tectómeros de oligoglicinas como vehículos para el transporte de al menos una sustancia, caracterizado por que esta sustancia se incorpora y libera del tectómero mediante cambios de pH del medio.
2. El uso según la reivindicación 1 , para el transporte de al menos una sustancia con carácter hidrofóbico o de al menos una sustancia con carácter hidrofílico.
3. El uso según la reivindicación 2, donde la sustancia con carácter hidrofílico es una estructura carbonada.
4. El uso según la reivindicación 3, donde la estructura carbonada se selecciona de nanotubos de carbono, grafeno, derivados de grafeno y cualquier combinación de los mismos, caracterizados por estar funcionalizados con grupos hidrofílicos.
5. El uso según la reivindicación 4, donde los grupos hidrofílicos son grupos carboxilo y el derivado de grafeno es óxido de grafeno.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde la sustancia con carácter hidrofóbico se selecciona de un fármaco, una sustancia fluorescente, una sustancia insoluble en agua o cualquier combinación de los mismos.
7. El uso según la reivindicación 6, donde el fármaco y/o la sustancia fluorescente es coralina.
8. El uso según la reivindicación 6, donde la sustancia insoluble en agua es beta- caroteno.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 6 a 8, caracterizado porque a un pH < 3, la sustancia con carácter hidrofóbico se libera por completo de los tectómeros.
10. El uso según las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque a un pH < 3 o a un pH ≥7,4, la sustancia con carácter hidrofílico se libera por completo de los tectómeros.
1 1. El uso según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que los tectomeros están funcionalizados.
12. El uso de los tectomeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , como sensores de pH basados en la fluorescencia.
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