WO2016163839A1

WO2016163839A1 - 콜레스테롤 축적에 의한 질환 진단용 마커 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: WO2016163839A1
Application number: PCT/KR2016/003775
Authority: WO
Inventors: 김용림; 최지영; 류혜명
Original assignee: Kyungpook National University Hospital; Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Current assignee: Kyungpook National University Hospital; Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2016-10-13
Anticipated expiration: 2017-10-10
Also published as: KR20160121450A; JP2018513986A; KR102017876B1; KR20180125137A

Abstract

본 발명은 콜레스테롤 축적과 관련된 질환의 진단용 마커 조성물 및 이를 검출하여 관련 질환의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 하이포잔틴은 직접적으로 또는 간접적으로 세포 내 콜레스테롤의 축적을 증가시키며 산화적 스트레스를 유발한다는 점에서 콜레스테롤 축적과 관련된 질환, 보다 바람직하게는 관상동맥질환의 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 마커를 통해 콜레스테롤 축적과 관련된 질환의 발견 및 예후 예측에 중요한 정보를 제공할 수 있으며, 관련 질환 치료 약물의 스크리닝에 활용될 수 있다.

Description

【명세세

【발명의 명칭】

콜레스테롤 축적에 의한 질환 진단용 마커 조성물 및 이의 이용 【기술분야】

본 발명은 콜레스테를 축적에 의한 질환 진단용 마커로서 하이포잔틴

(hypoxanthine)의 이용과 이를 이용하여 질병의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방 법에 관한 발명으로， 더욱 상세하게는 생체 시료로부터 하이포잔틴의 양을 측정하 여 콜레스테를 축적에 의한 질환을 진단 및 예측하는 방법에 관한 것이다.

【배경기술】

본 출원은 2015년 4월 10일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0051122 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 동맥경화는 오랜 기간에 걸쳐 혈관의 벽에 지방이 축적되고 또한 혈관 벽이 두꺼워지는 질환이다. 주로 고지질혈증 특히， 고콜레스테를혈증이 주요 위험인자이 며 또한 고혈압 및 당뇨병 등도 위험인자로 알려져 있다. 최근 서구화된 식사 및 인구의 고령화에 따라 동맥경화의 발병 및 이와 관련된 뇌심혈관계 질환이 크게 증 가하고 있다. 동맥경화의 진행과정을 보면， 산화지질， 높은 혈압과 빠른 혈류 등에 의해 혈관 내면을 구성하고 있는 혈관내피세포에 손상이 먼저 일어나고， 점차 혈관 벽에 지방이 축적되며 대식세포 및 T 세포 등의 침윤과 염증반웅이 진행되고 혈관 평활근세포의 증식으로 인해 혈관 벽이 두꺼워진다. 그 결과 혈관이 좁아지게 되어 혈액의 흐름이 원활하지 못하게 된다. 심장의 관상동맥이 좁아진 경우 무리한 운동 등에 의해 심장으로 혈액 공급이 부족하여 통증을 느끼게 되는 협심증의 증상을 보 이게 된다. 한편 두꺼워진 혈관혁 (이 부분을 동맥경화 플라크라 함)내 대식세포에 의해 생성되는 단백질분해효소의 활성이 왕성한 경우 플라크를 덮고 있는 조직의 일부가 터지게 된다. 이때 플라크 안에 있던 지방 및 주변 단백질 등이 혈관 내로 나와 혈전을 형성하며 흔히 심장의 관상동맥 또는 뇌의 혈관 둥을 막아버려 심근경 색 또는 뇌졸중을 야기하게 된다. 기존의 동맥경화 진단은 초음파 및 혈관조영술을 이용하여 혈관 벽이 좁아진 것이나 석회화 등의 관찰을 통해 이루어진다. 그러나 기존의 진단은 동맥경화가 상 당히 진행되어 육안으로 구별이 가능할 만큼 혈관이 좁아졌을 때 가능하다. 또한 혈관이 좁아진 소견만을 갖고는 병변이 안정한 플라크 (stable plaque)인지 아니면 조만간 터질 가능성이 큰 불안정한 플라크 (vulnerable plaque 또는 rupturable plaque)인지를 판단하는데 전혀 도움이 되지 않는다. 따라서 이러한 종래의 동맥경 화 플라크 진단의 단점을 보완하여 혈관이 저명하게 좁아지기 이전의 동맥경화를 조기에 발견하고 진단하는데 도움이 되는 새로운 진단용 마커 및 이에 사용될 수 있는 진단용 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에， 본 발명의 발명자들은 퓨린 대사과정의 마지막 생성물인 하이포잔틴 (hypoxanthine)이 세포 내 콜레스테를의 축적 및 산화적 스트레스를 증가시킨다는 것을 발견하고, 이 결과에 기초하여 하이포잔틴이 콜레스테롤 축적에 의한 질환， 특히 관상동맥질환의 진단에 매우 유용한 마커로 사용될 수 있음에 착안하여 본 발 명을 완성하였다. 따라서， 본 발명의 목적은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 하이포잔틴의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정결과를 정상대조군 시료의 하이포잔 틴의 양과 비교하는 단계를 포함하는 콜레스테롤 축적 관련 질환 진단 또는 예후에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테롤 축 적 관련 질환의 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 임의의 물질을 인간을 제외한 동물에 투여한 후 혈청 하이포잔틴의 농도를 측정하는 것을 포함하는， 콜레스테를 축적 관련 질환 치료제 의 스크리닝 방법올 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테를 축 적 관련 질환의 진단용 마커를 제조하기 위한 용도 # 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여 (_a) 생물학적 시료에 존재하는 하이포잔틴의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정결과를 정상대조군 시료의 하 이포잔틴의 양과 비교하는 단계를 포함하는콜레스테를 축적 관련 질환 진단 또는 예후에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테를 축적 관련 질환의 진단용 마커 조성물을 제 공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 임의의 물질을 인간을 제외한 동물 에 투여한 후 혈청 하이포잔틴의 농도를 측정하는 것을 포함하는， 콜레스테를 축적 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이하본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 하이포잔틴 (hypoxanthine)의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정결과를 정상대조군 시료의 하이포잔 틴 (hypoxanthine)의 양과 비교하는 단계를 포함하는 콜레스테를 축적 관련 질환 진 단 또는 예후에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 하이포잔틴 (hypoxanthine)은 하기 화학식 ( 1) 로 표현되는 화합물로서, 요산 합성의 중간 산물이고 아데닐산에서 생성되며 잔틴의 전구 물질이다. 하이포잔틴, 잔틴 및 요산은 퓨린의 대사경로의 마지막 산물에 해당한다. 비정상적인 퓨린 대사 과정 및 퓨린 과생성은 레쉬니한 증후군 (Lesch-Nyhan syndrome)과 관련이 있으며， 이 증早군은 HGPRT( ur ine salvage enzyme— guanine phosphor ibosyl transferase)의 결핍에 의해 발생된다.

[화학식 1]

한편， 하이포잔틴은 잔틴 산화효소 (xanthine oxidase)의 기질로서 작용하며 , 이 과정에서 ROS react ive ox i gen species)의 생성을 증가시키게 된다. R0S는 혈관 의 기능상실 및 /또는 동맥경화증의 발병과 밀접하게 관련이 되어 있으며, 음주 또 는 흡연은 HGPRT의 활성을 낮추게 되고 결과적으로 혈중 하이포잔틴의 농도를 증가 시켜 관상동맥질환의 발병 가능성을 높이게 되는 것이다. 이에， 본 발명의 발명자들은 하이포잔틴과 고지혈증， 심혈관계질환 등 콜레 스테를의 축적 및 /또는 산화적 스트레스와 관련되어 있는 질환들과의 상관성을 밝 히기 위해 연구를 진행하였고， 하이포잔틴이 일련의 기전을 통해 세포 내 콜레스테 를의 축적을 증가시키고 산화적 스트레스를 유발하여 심혈관계 질환의 발병 가능성 을 높인다는 사실에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 일실시예에 따르면， ApoE 가 결핍 (knock-out ) 되어 있는 마우스에 하이포잔틴을 8주간 투여한 결과， 동물의 체중에는 영향을 미치지 않으면서 혈중 콜레스테를 수치를 현저하게 증가시켰으며, 하이포잔틴을 투여받은 동물에서 동맥 경화성 플라그의 형성이 대조군과 비교해 현저하게 증가한다는 것을 확인하였다 (실 시예 1) . 또한， 본 발명의 다른 실시예에 따르면， 하이포잔틴을 24시간 처리한 HepG2 세포에서 대조군 세포와 비교해 R0S의 생성량 및 콜레스테를의 축적량이 현 저하게 증가되어 있었다 (실시예 2-1) . 상기한 결과를 토대로， 혈중 하이포잔틴의 농도가 높으면 고지혈증， 동맥경 화증 등과 같이 콜레스테를의 축적에 의한 질환이 유발될 수 있다는 것올 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명의 발명자들은 하이포잔틴에 의해 콜레스테롤 축적이 유발되는 기전을 밝히기 위해 일련의 실험을 진행하였다. 즉， 본 발명의 다른 일실시예에 따 르면， 하이포잔틴의 처리에 의해 HepG2 세포에서 콜레스테를의 세포 방출 (ef f lux) 를 유도하는 트랜스포터인 ApoE 및 ABCA ATP-binging casette, sub-fami ly A, member 1)의 mRNA 발현 및 단백질 양이 대조군과 비교해 현저하게 감소되어 있었 다. 반면에， 콜레스테롤의 생성과 관련되어 있는 HMG-CoA 환원효소 (HMGCR)와 LDLRdow densi ty l ipoprotein receptor) 단백질 양은 하이포잔틴의 처리에 의해 아무런 변화가 나타나지 않았다 (실시예 2-2) . 또한, 본 발명의 다른 일실시예에서 본 발명의 발명자들은 하이포잔틴이 대 사되는 과정에서 유발되는 산화적 스트레스가 콜레스테를의 축적과 연관성이 있는 지 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 활성산소의 일종인 과산화수소 (¾0₂) 를 HepG2에 24시간 처리한 결과 세포 내 콜레스테를 수치가 대조군과 비교해 현저 하게 증가되어 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 3-1) . 또한， 과산화수소의 처리로 인해 HepG2 세포에서 대조군과 비교해 ApoE 및 ABCA1의 mRNA 발현량 및 단백질 양 이 현저하게 감소하고， LDLR의 단백질 양이 증가되는 것을 확인하였다 (실시예 3- 2) . 또한， 본 발명의 다른 일실시예에서 하이포잔틴 및 과산화수소를 처리한 HepG2 세포에 NAC(N-acetylcystein)을 처리한 결과 세포 내 콜레스테롤 수치가 감 소하였고， 활성산소의 일종인 과산화수소의 양이 감소하는 것으로 나타났다. 또한， 하이포잔틴과 과산화수소로 인해 감소된 ApoE 및 ABCA1 발현량이 증가하는 것을 확 인하였다 (실시예 4) .

또한， 본 발명의 다른 일실시예에서 하이포잔틴을 처리한 HepG2 세포에 알로 퓨리놀 (al lopurinol )을 처리한 결과， 세포 내에서 하이포잔틴으로 인하여 증가한 R0S의 생성량과 콜레스테롤의 축적이 감소하는 것으로 나타났으며, 하이포잔틴으로 인하여 감소한 ABCA1 및 LXR- α의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다 (실시예 5) . 또한， 본 발명의 다른 일실시예에서 ApoE가 결핍된 HepG2 세포에 하이포잔틴 을 처리한 결과， 세포 내 콜레스테를의 양이 증가하였고， ApoE 및 ABCA1의 발현량 이 감소하는 것으로 나타났으며 세포에 ApoE를 형질전환시켜 하이포잔틴을 처리한 결과 상승 작용에 의해 콜레스테를 양이 증가하는 반면, ApoE 및 ABCA1의 mRNA와 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인하였다 (실시예 6) . 즉, 하이포잔틴은 직접적으로 세포에 작용하여 콜레스테를의 배출과 관계된

ApoE 및 ABCA1의 발현을 감소시켜 세포내에 콜레스테롤 축적을 유발한다는 것을 알 수 있었고， 하이포잔틴에 의해 유발되는 산화적 스트레스는 ApoE 및 ABCA1의 발현 을 감소시킬 뿐 아니라, 콜레스테를의 생성과 밀접한 연관이 있는 LDLR의 발현을 증가시켜 세포 내 콜레스테를의 축적을 더욱 증가시키고 세포에 산화적 스트레스를 유발하껴 심혈관계에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 수 있었다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 임상환자 혈액 샘플로부터 혈중 콜레스 테를 농도와 하이포잔틴 농도와의 상관성을 분석한 결과. 정상대조군과 비교해 고 콜레스테를군에서 혈중 하이포잔틴의 농도가 통계적으로 유의성 있게 높게ᅳ 나타나 는 것을 확인하여， 하이포잔틴이 콜레스테를 축적에 의한 질환에 대한 바이오 마커 로서 유용하게 사용될 수 있음을 다시 한번 확인하였다 (실시예 7) . . 상기한 바에 따라, 하이포잔틴은 콜레스테를 축적에 의해 유발되는 질환의 진단용 바이오마커 또는 심혈관계질환의 산화적 스트레스를 예측하는 바이오마커로 서 유용하게 사용될 수 있으며， 본 발명에 따른 콜레스테를 축적 관련 질환 진단용 마커 조성물을 이용하여 해당 질환으로 의심되는 환자군의 생체 시료로부터 하이포 잔틴의 양을 측정하는 것은 질환의 효과적인 예측 및 진단을 위한 정보로써 제공할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로， 콜레스테롤 축적 관련 질환 의심환자의 생물학적 시료로부 터 하이포잔틴의 양을 검출하고 이를 정상 대조군의 수치와 비교함으로써 콜레스테 를 축적 관련.질환을 진단 또는 예후를 예측해볼 수 있다. 즉 생물학적 시료 내 하 이포잔틴의 양이 정상 대조군의 것보다 의심환자에서 더 높다면， 그 환자를 콜레스 테롤 축적 관련 질환이 발병 가능한 환자라고 예측해 볼 수 있으며， 시간 경과에 따라 동일한 환자의 생물학적 시료로부터 하이포잔틴의 검출량을 비교함으로써 질 병의 예후를 예측해볼 수 있는 것이다. 상기 (a) 단계에서 하이포잔틴의 양은 미셀 액체크로마토그래피 (micel lar l iquid chromatography) , 미셀 전기운동 모세관법 (micel lar electrokinet ic capi l lary) , 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) , 액체크로마토그래피 -질량 분석 (LC/MS) , 기체크로마토그래피-질량분석 (GC/MS) 및 상업적으로 이용 가능한 검출용 키트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 가지 방법으로 측정될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 상기 콜레스테를 축적 관련 질환은 고지혈증， 지방간 , 관상 동맥질환 및 심혈관질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 관상동맥질환은 심근경색, 협심증， 죽상동맥경화증， 금 성 관상동맥 증후군 또는 뇌혈관 발작인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 관상동맥심질환이라고도 부르는 관상동맥 질환은 심장으로 산소가 풍부한 혈 액을 공급하는 심장 관상동맥 내부에 혈전이 축적되는 질환을 말한다. 혈전은 지 방, 콜레스테를, 칼슴 및 기타 혈액에서 발견되는 물질들로 이루어져 있으며， 혈전 이 동맥에 축적되는 질환을 동맥경화증으로 정의한다. 혈전은 동맥을 협착시켜 심 장으로 흐르는 혈류량을 줄이며 동맥 내에서 혈액 응고가 발생할 가능성을 더 높이 게 된다. 혈액 응고로 인해 혈류가 일부 차단되거나 완전히 차단될 수 있고， 이렇 게 동맥이 막히면 혈액이 심장에 도달하지 못하여 협심증 (가슴통증)이나 심장마비 가 발생할 수 있다. 관상동맥질환을 유발하는 인자들은 다양하나 그 중 가장 위험한 인자로는 높 은 혈중콜레스테를 수치를 들 수 있으며， 하이포잔틴의 혈중 수치가 높을 경우 고 지혈증， 관성동맥질환 등이 발생될 가능성이 증가된다는 절에서， 하이포잔틴의 혈 중 농도를 평가하여 관상동맥질환 등 콜레스테를의 축적과 관련된 질환의 발병 가 능성， 예후 등을 예측해 볼 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액, 혈청， 혈장， 타액 및 뇨로 이루어 진 군 중에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며， 바람직하게는 혈청 또 는 뇨일 수 있다. 본 발명은 또한 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테롤 축적 관련 질환의 진단용 마커 조성물을 제공한다 본 발명은 또한 임의의 물질을 인간을 제외한 동물에 투여한 후 혈청 하이포 잔틴의 농도를 측정하는 것을 포함하는， 콜레스테를 축적 관련 질환 치료제의 스크 리닝 방법을 제공한다. 구체적으로， 콜레스테롤 축적 관련 질환에 효과를 나타낼 것으로 기대가 되 는 임의의 물질을 인간을 제외한 동물에 투여한 후， 동물로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 상기 마커 조성물의 양을 측정하여 임의의 물질을 처리하지 않은 대조 군과 비교해 하이포잔틴의 양이 감소한 물질을 콜레스테를 축적 관련 질환의 치료 제로 선별할 수 있다. 본 발명은 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테를 축적 관련 질환 의 진단용 마커를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 본 발명에서 '진단' 은 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 본 발명에 따른 진단용 마커 는 콜레스테를 축적으로 인한 고지혈증, 지방간， 관상동맥질환 및 심혈관질환 등을 특이적으로 진단할 수 있다.

【유리한 효과】

상기에서 살펴본 바와 같이， 하이포잔틴은 직접적으로 또는 간접적으로 세포 내 콜레스테를의 축적을 증가시키며 산화적 스트레스를 유발한다는 점에서 콜레스 테를 축적과 관련된 질환， 보다 바람직하게는 관상동맥질환의 진단용 마커로서 유 용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 마커를 통해 콜레스테를 축적과 관련된 질환의 발견 및 예후 예측에 중요한 정보를 제공할 수 있으며, 관련 질환 치료 약물의 스크리닝쎄 활용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 C57BL/6 마우스 (WT)와 ApoE 결손 (knock-out ) 마우스에 하이포잔틴 (hypoxanthine)을 투여한 후 촬영한 대동맥굴 사진 (A)과 마우스에서 동맥경화증 발 병 영역을 측정한 결과 (B)를 나타낸 것이다. 데이터는 mean士 SEM으로 나타내었다 ( - ： 하이포잔틴 미처리군, + ： 하이포잔틴 처리군， *** < 0.001 versus WT, #P < 0.05 versus ApoE KO. Hx : hypoxanthine) 도 2는 HepG2 세포에서 하이포잔틴이 R0S 생성과 콜레스테를 축정을 유도하 는 것올 나타낸 것으로, HepG2 세포에 하이포잔틴 (1， 2.5 mM)을 처리한 후 R0S 생 성량을 형광 현미경으로 관찰한 결과 (A), Amp lex red 분석법으로 과산화수소의 양 을 측정한 결과 (B), HepG2 세포에 다른 농도의 하이포잔틴을 처리한 후 세포 용해 물에서 콜레스테를과 콜레스테릴 에스테르 레벨을 측정한 결과 (C) 및 RT-PCR로 APOE, ABCA1, HMGCR, and LDLR의 mRNA레벨을 측정한 결과 (D), 웨스턴 블롯으로 APOE, ABCA1, HMGCR, LDLR의 단백질량을 측정한 결과 (E) 및 단백질 농도를 그래프 로 나타낸 것 (F)이다. 데이터는 mean士 SEM으로 나타내었다 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus control (Ctrl). AU: arbitrary units) . 도 3은 HepG2 세포에서 과산화수소가 콜레스테를 축적 및 지방 형성에 관련 된 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것으로， HepG2 세포에 과산화수소를 농도별로 처리했을 때 세포독성을 발광현미경 (배율: 40 X)올 통해 관찰한 결과 (A), 세포독성 을 MTT assay를 이용해 측정한 결과 (B), Amp lex red assay로 과산화수소 레벨을 측 정한 결과 (C), 세포 용해물에서 세포 내 총 콜레스테를과 콜레스테릴 에스테르의 양을 측정한 결과 (D),RT-PCR로 APOE, ABCAl^' HMGCR, LDLR의 mRNA 레벨을 측정한 결 과 (E), 웨스턴 블롯으로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR의 단백질량을 측정한 결과 (F) 단백질 농도를 그래프로 나타낸 것 (G)이다. 데이터는 mean士 SEM으로 나타내었다 < 0.05, **P <0.01 versus control , ***Ρ < 0.001 versus control (Ctrl). AU: arbitrary units) . 도 4는 하이포잔틴 또는 과산화수소가 처리된 HepG2 세포에서 NAC가 콜레스 테를 레벨 및 지방 형성에 관련된 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것으로， Amplex res assay로 과산화수소 레벨을 측정하였고 세포 용해물에서 콜레스테를과 콜레스 테릴 에스테르의 양를 분석한 결과 (A), 5 mM NAC를 2시간 동안 처리한 뒤 24시간 동안 ImM 하이포잔틴올 처리한 세포에서 RT-PCR로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR의 mRNA 레벨을 측정한 결과 (B), 웨스턴 블롯으로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR의 단백질 량을 측정한 결과 (C), 5mM NAC를 2시간 동안 처리한 뒤 24시간 동안 500 μΜ 과산 화수소를 처리한 세포에서 RT-PCR로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR의 mRNA 레벨을 측정 한 결과 (D), 웨스턴 블롯으로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR의 단백질량을 측정한 것과 그래프로 나타낸 결과 (E)를 나타낸 것이다. 데이터는 mean土 SEM으로 나타내었다 (* < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001 versus control (Ctrl). #P < 0.05, 置 < 0.01, 漏 P < 0.001 versus Ηχ: hypoxanthine, AU: arbitrary units) . 도 5는 하이포잔틴이 처리된 HepG2 세포에서 알로퓨리놀 (al lupurinol)이 콜 레스테를 레벨 및 지방 형성에 관련된 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것으로， 세 포에 1 mM 하이포잔틴과 100 μΜ알로퓨리놀을 처리한 뒤 Amplex red assay로 과산 화수소를 측정한 결과 (A), 세포 용해물에서 콜레스테롤과 콜레스테릴 에스테르의 양을 측정한 결과 (B), RT-PCR 법으로 ABCAl mRNA(C)와 LXR-a(D)의 발현량을 측정 한 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 mean士 SEM으로 나타내었다 (* < 0.05, **P < 0.01, *** ^ <0.001 versus control (Ctrl). 林 P < 0.05, MP < 0.01，醒 P < 0.001 versus Ηχ: hypoxanthine. A: al lopur inol； AU': arbitrary units) . 도 6은 ApoE 결핍 HepG2 세포에서 하이포잔틴이 콜레스테롤 레벨과 지방형성 과 관련된 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것으로, HepG2 세포에 AP0E- siRNA(siAPOE) 또는 non-target-siRNA(siN)를 형질전환 한 후 하이포잔틴을 처리하 여 세포 용해물에서 콜레스테를과 콜레스테릴 에스테르의 양을 측정한 결과 (A), RT-PCR로 ARE, ABCAl, HMGCR, LDLR mRNA^\ 발현량을 측정한 결과 (B), 웨스턴 블롯 으로 APOE, ABCAl, HMGCR, LDLR 단백질 양을 측정한 결과 (C) 및 단백질량을 그래프 로 나타낸 것 (D)이다. 데이터는 mean土 SEM으로 나타내었다 (*^ < 0.05, **P < 0.01， ***P < 0.001 versus control (Ctrl). #P < 0.05，腦 P < 0.001 versus Hx: hypoxanthine) 도 7은 임상환자 혈액 샘플로부터 혈중 콜레스테를 수치를 측정한 결과 (A)와 임상환자 혈액 샘플로부터 혈중 하이포잔틴 수치를 측정한 결과 (B)를 나타낸 것이 다 (control ： 정상대조군， Hypercholesterol ： 고콜레스테를군).

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법> 1. 동물 관리 , 식이 및 하이포잔틴 투여

7주령 수컷 ApoE 결손 (knock-out) 마우스 및 C57BL/6 마^'우스에 고콜레스테를 식이를 12주간 투여한 하였으며, 고콜레스테를 식이는 16%의 지방， 1.25¾>의 콜레스 테롤 및 0.5%의 sodium cholic acid가 포함되어 있었다. 14마리의 wild type 마우 스를 하이포잔틴을 투여하지 않은 그룹 (WT, n=6)과 하이포잔틴을 투여한 그룹 ( T- Hx, n=8)으로 분류하였고, 14마리 ApoeE 결손 마우스를 하이포잔틴을 투여하지 않 은 그룹 (ApoE K0, n=6)과 하이포잔틴을 투여한 그룹 (ApoE K0-Hx, n=8)으로 분류하 였다. 4주간 고콜레스테를 식이를 마친 후 하이포잔틴을 200 mg/kg/day로 8주간 복 강투여 했으며， 12주간의 in vivo 실험이 종료된 후, 마우스를 희생시켜 대동맥을 추출하였고， 조직학적으로 분석하였으며， 혈청 화학치 검사를 위해 혈액을 수득하 였다.

2. 혈청화학검사

모든 투여가 종료된 후 각각의 마우스의 심장에서 혈액 샘플을 수득하였다. 혈액 샘플은 마우스의 심장에서 획득하여 응고를 방지하기 위해 EDTA가 없는 병에 준비하였다. 혈청에서 총 콜레스테를 지질과 트리글리세라이드 레벨을 분석하였다.

3. 대동맥의 동맥경화성 플라크 확인

차가운 PBS로 관류한 뒤 차가운 포르말린 완층액으로 관류 한 후， 대동맥을 흉강 및 심장에서 추출하였다. 대동맥을 길게 펼친 다음 왁스 보드에 평면으로 장 착하였고， 0.5% Sudan IV 용액으로 염색하였다. en face 물질을 디지털로 촬영한 뒤 Image J(NIH, USA)를 사용하여 정량하였고， 플라크 범위의 비율 (%)을 측정하였 다.

4. 세포 배양 및 하이포잔틴 처리

인간 간암세포주인 HepG2 세포를 ATCC에서 구매하여 37^°C, 5% C02에서 10% FBS (Gibco-BRL) , 100 /g/mL penicillin and 10

streptomycin (Gibco-BRL) 이 첨가된 Dulbecco' s modified Eagle' s medium (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에서 세포를 배양하였다. HepG2 세포는 12-well 또는 6-well 플레이트에 분주하여 배양하였고 매 3~4일마다 배지를 교체하였다. 1 mM과 2.5 mM의 하이포잔틴, 0, 100, 250, 500, 및 1000 μΜ의 Η202, 5 mM의 N— acetylcysteine(NAC, Sigma-Aldrich) , 및 100 μΜ의 알로퓨리놀 (al lopurinol， Sigma-Aldr ich)을 함유하거나 함유하지 않은 10% DMEM에서 HepG2 세포를 24시간동 안 37^°C에서 배양하였다.

5. 총 콜레스테를 및 콜레스테릴 에스테르의 측정

HepG2 세포는 37^°C에서 24시간 동안 하이포잔틴 (1 또는 2 mM의 농도) 또는 과산화수소의 첨가 또는 미첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 얼음 내 살린 ( ice-cold sal ine)으로 세척하였다. 세포 내 구성물인 콜레스테를과 콜레스테릴 에 스테르를 클로로포름:이소프로판올: NP-40의 비율이 7: 11 :0.1인 용액으로 추출한 뒤 에 제조사의 지침에 따라 콜레스테를 분석 버퍼 (ab65359; Abeam, UK)를 사용하여 측정하였다. 모든 샘플은 37^°C에서 60분 동안 콜레스테를 분석 반웅 버퍼로 배양하 였고， 590nm에서 측정하였다.

6. 세포 내 R0S 측정

세포 내 R0S의 양을 측정하기 위해 2' ，7' -dichlorof luorescin di acetate (DCFH-DA)를 이용하였다. HepG2 세포를 96-wel l 플레이트에 1 x 10 세포 /wel l 로 분주하였다. DCFH-DA는 세포 내에서 dichlorof luorescin(DCFH)을 에스테라아제 (esterase)로 가수분해된다. 이 비형광 분자는 세포 내 산화제의 활성에 의해 형광 dichlorof luorescein(DCF)로 산화되었다. NAC 처리 군에는 5 mM NAC가 함유된 배지 를 첨가하였고 2시간 동안 먼저 배양한 뒤 PBS로 두 번 세척한 후， 50 μ Μ의 DCFH- DA 용액을 넣고 세포를 30분간 배양하였다. 이 후 세포를 PBS로 세척한 후 각 농도 의 하이포잔틴 또는 과산화수소를 세포에 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 이 후 482 nm의 excitat ion 및 520 nm의 emission의 조건으로 형광현미경을 이용하여 세 포 내 R0S 레벨을 측정하였다.

7. 과산화수소의 측정

96 웰 플레이트에 HepG2 세포를 배양한 뒤， 제조사의 지침에 따라 Amplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit (Molecular Probes , Invitrogen, USA)를 사용하여 과산화수소의 레벨을 측정하였다. 형광은 545 nm excitat ion 및 590 nm emission 조건에서 마이크로플레이트 리더기 (FLUOstar , BMG Labtechnologies , USA)를 사용하 여 측정하였다.

8. 세포 생존능 측정 96 웰 플레이트에서 1.0X10 eel ls/wel l의 농도로 분주하여 DMEM에서 배양한 HepG2 세포에 과산화수소 (0， 100, 250, 500 및 1000 μ Μ)를 2시간 또는 24시간 동 안 처리하였다. 배지를 교체한 후， HepG2 세포를 24시간 동안 배양하였고， 500 (ig /ml의 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2yl ) -2, 5-diphenyl tetrazol ium bromide)를 4시 간 동안 처리하였다. 200 id DMSOCAmresco, USA)를 첨가하여 포르마잔 (formazan)을 용해한 뒤, 마이크로플레이트 리더기 (Bio-Rad, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도 를 측정하였다.

9. 형질전환

인간 ApoE siR A, 비표적 siRNA 및 음성 대조군을 Dharmacon(USA)에서 구입

TM

하였고， 20 nM올 사용하였고， Opt i -MEM ( Invi trogen) 형질전환 배지와

TM

Lipofectamine ( invitrogen)을 사용하였다. HepG2 세포를 형질전환 하루 전에 접종 하였고， 다음날 40 내지 50%가 되도록 배양하였다. 형질감염 복합체를 형성하기 위 하여 ApoE에 대한 RNAi 이중가닥을 리포펙타민과 흔합하여 배양된 세포에 첨가하였 다, 4시간 동안 배양한 후， 배지를 DMEM으로 교체하고 24시간 동안 배양하였다.

10. 웨스턴 블롯 (Western blott ing)

웨스턴 블롯은 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 진행하였으며, 각 단백질에 대한 1차 항체는 각각 ApoE (1 :2000， Abeam, UK) , ABCA1 (1 :2000， Abeam) , HMGCR (1 :5000， Abeam) , LDLR (1 :2000， Abeam) , 및 β -act in (1: 10 ,000， Sigma-Aldrich, St . Louis M0, USA)을 이용하였다. 2차 항체로는 horseradi sh- per oxidase一 conjugated polyclonal goat ant i -rabbit immunoglobul in 또는 goat ant i -mouse immunoglobul in (Dako, Glostrup, Denmark)을 이용하였다 . 양성 면역 밴드는 β -act in과 비교하였고， 농도계로 정량화하였다.

11. RNA추출 및 RT-PCR분석

HepG2 세포를 하이포잔틴이 첨가 (1 또는 2 mM의 농도) 또는 미첨가된 10¾> DMEM에서 24시간—동안 배양하였다. 세포를 배양한 후 PBS로 워싱하고 총 RNA를 TRI reagent (Molecular Research Center Inc . , USA)를 이용하여 추출하였다. 1 zg 의 총 RNA를 cDNA 합성 키트 (Takara Shuzo Co. , Japan)를 이용해 전사한 후， 제조 사의 지침에 따라 PRISM 7000 Sequence Detect ion System으로 SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosistems, USA)를 사용하여 RT-PCR(real— time PCR)을 실시하 였다. 모든 샘플은 유전자 발현의 상대적인 정량에 대한 Ct 법을 사용하여 정량하 였고, β-actin으로 표준화하였으며， 유전자 증폭에 사용된 프라이머 세트의 염기 서열은 하기 표 1에 개시하였다.

【표 11

RT-PCR에 이용된 프라이머 세트의 염기서열

12. 통계적 분석

데이터는 Mean 士 SEM으로 표시하였다. 모든 실험은 최소 3번의 독립적인 실 험으로 실시하였고， 모든 데이터는 Shapin>-Wilks 표준화 검사를 사용하여 정상 시 험하였다. 그룹 간의 차이의 중요성을 Dunett' s post -hoc 검사 보는 Bonferroni post-hoc 검사에 따라 일원 변량분석 (AN0VA)으로 분석하였다. 비 일반적으로 분산 된 데이터는 KruskalWallis 검사로 분석하였으며， 0.05 이하 P 값은 통계적으로 유 의한 것으로 간주하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 5(GraphPad, CA)로 실시하 였다.

<실시예 1>

하이포잔틴 투여에 따른 혈중 지질 함량의 변화 및 동맥경화성 플라그 형성 하이포잔틴 동맥경화증 등 콜레스테를 축적 관련 질환의 상관성을 판단하기 위해， 하이포잔틴의 투여가 지질 프로파일을 변화시키는지 여부 및 플라그 형성을 유발하는지 여부를 평가하였다.

7주령 수컷 ApoE 결핍 마우스와 wi ld type 마우스에 12주 동안 고 지방， 고 콜레스테를 식이를 제공하였고, 고지방 식이 섭취한지 4주 후부터 8주 동안 하이포 잔틴을 투여하였다.

고콜레스테를 식이 섭취기간 및 하이포잔틴 투여기간을 포함하는 총 12주가 경과한 후， 하이포잔틴은 동물의 체중에는 아무런 영향을 나타내지 않았다. 흥미롭 게도 ApoE 결손 마우스에서 하이포잔틴 투여에 의해 혈중 총 콜레스테를 수치가 현 저하게 증가하였다 (표 2 참조) .

그 결과 도 1에서 나타난 바와 같이, ApoE 결손 마우스에서 하이포잔틴 투 여에 의해 동맥경화성 플라그의 형성이 현저히 증가하였다. 반면에， wi ld type 마 우스에서 하이포잔틴 투여에 의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, en face 대동맥 의 분석은 하이포잔틴 투여하지 않은 ApoE 결손 마우스와 비교하여 하이포잔틴 투 여한 ApoE 결손 마우스에서 현저하게 동맥경화성 플라크가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

【표 2】

하 투여에 파 ，혈 ¾^■지질변화

WT WT-Hx oE KO ApoE KD-Hx

(n=8) (n=6) Cn=8)

28.3 ± 1.2 2e o±o,e 27.1±0. 28.8±0.8 1스 fl[를

1578 ±173"*

Cmg dl)

«¾]글리녜라이드

3 t l 36 ±2 83t l2 150±81

** P <0.0Q1 versus IT mica, P < 0.GG1 vea-sus Apoe KO mice.

<실시예 2>

하이포잔틴이 HeDG2 세포주에서 ROS의 생성량 및 콜레스테를에 미치는 영향 <실시예 2-1> HepG2 세포에서 하이포잔틴이 ROS 생성 및 콜레스테를 축적에 미치는 영향 in vi tro 상에서 하이포잔틴이 HepG2 세포에서 콜레스테를의 상향조절과 관 련된 기작을 조사하기 위하여， 다음과 같이 실험을 실시하였다.

상기 기재된 실험방법에 따라 HepG2 세포에 24시간 동안 하이포잔틴을 처리 하였고， 세포를 수득하여 세포 용해물에서 R0S 생성량， 총 콜레스테를 및 콜레스테 릴 에스테르의 레벨을 측정하였다. R0S의 생성량을 형광 현미경으로 관찰하였고， Amp lex red assay법으로 측정하였다. 또한 세포 용해물 내의 콜레스테를 및 콜레스 테릴 에스테르의 단백질 양을 측정하였다.

그 결과 도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이， 1 mM과 2.5 mM의 하이포잔틴에 2 시간 동안 처리한 후， R0S를 나타내는 DCF 녹색 형광의 빈도수가 증가하였으며 과 산화수소의 양이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 도 2C에 나타난„바와 같이， 세포 에 1 mM과 2.5 mM의 하이포잔틴에 24시간 동안 처리한 경우가 대조군에 비하여 총 콜레스테롤 양과 콜레스테릴 에스테르의 양이 상당이 증가하는 ：것으로 나타났다. 이를 통해, 하이포잔틴이 R0S의 생성을 유발하여 세포에 산화적 스트레스를 유발할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 2-2>

하이포잔틴이 지방형성과 관련된 유전자 및 단쌕질 발현에 미치는 영향 세포 내에서 하이포잔틴에 의해 유도된 콜레스테롤 축적되는 기전을 밝히기 위해， 지방 생성과 관련된 유전자의 발현량을 RT-PCR법을 통해 확인하였고, 단백질 수준에서도 동일하게 나타나는 지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

상기 기재된 실험방법에 따라 HepG2 세포를 하이포잔틴이 첨가된 DMEM 배지 에서 배양하였다. 배양한 세포에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였고， 당업계에서 통상적으로 사용되는 조건에 따라 RT-PCR을 실시하였다. 또한 배양한 세포를 수득 하여 상기 실험방법에 따라 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과를 도 2D 내지 2F에 나타내었다.

ApoE와 ABCA1은 모두 세포 내 콜레스테를을 세포 외로 배출 (ef f lux)시키는 역할을 담당하는 세포막 단백질로 상기 단백질의 발현이 감소하면 세포 내 콜레스 테를의 배출이 감소되어 콜레스테롤 축적이 증가하게 된다. 도 2D 및 2F에 나타난 바와 같이， 하이포잔틴을 HepG2 세포에 24시간 처리한 결과 ApoE와 ABCA1 유전자의 발현이 감소하는 것으로 나타난 반면， 세포 내 콜레스테를의 합성과 관련된 HMGCR 및 LDLR의 mRNA는 하이포잔틴의 처리에 의해 아무런 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한 도 2E에 나타난 바와 같이, ApoE와 ABCA1 단백질의 발현량이 감소하는 것으로 나타난 반면， 세포 내 콜레스테를의 합성과 관련된 HMGCR 및 LDLR단백질은 하이포 잔틴의 처리에 의해 증가하는 경향을 나타냈으나 통계적으로 유의성은 나타나지 않 았다.

이를 통해， 하이포잔틴의 처리로 세포막에 존재하는 콜레스테롤 배출 수송체 인 ApoE 및 ABCA1의 mRNA의 발현 및 단백질 발현이 감소하고， 세포 내 콜레스테를 합성과 관련된 HMGCR 및 LDLR의 mRNA의 발현 및 단백질 발현은 아무런 영향이 없기 때문에， 세포 내에서 생성된 콜레스테를이 세포 외로 배출되지 못해 콜레스테를의 축적이 유발된다는 것을 알수 있었다.

<실시예 3>

과산화수소가 HeDG2 세포주에서 R0S의 생성량 및 콜레스테를에 미치는 영향 〈실시예 3-1>

HepG2 세포에서 과산화수소가 콜레스테를 축적에 미치는 영향

하이포잔틴의 대사 과정에서 활성산소가 생성이 된다는 사실은 공지가 되어 있으며， 이러한 활성산소가 콜레스테를 축적과 관련된 질환과 어떠한 연관성이 있 는지 여부를 판단하고자 다음과 같은 실험을 진행하였다.

HepG2 세포에 100， 500 및 1000 μ Μ의 과산화수소를 2시간 동안 및 24시간 동안 처리하여， 상기 기재된 실험방법에 따라 ΜΤΤ 법과 광학 현미경으로 세포 생존 율을 확인하였고, R0S 레벨과 총 콜레스테를 레벨을 분석하였다.

그 결과 도 3Α 및 3Β에 나타난 바와 같이， 세포에 500 μ Μ과 1000 μ Μ의 과 산화수소를 처리한 경우 세포 형태가 변형되었고， 세포 생존 능력이 상당히 감소하 는 것으로 나타났다. 또한 도 3C에 나타난 바와 같이 과산화수소를 HepG2 세포에 2 시간동안 처리한 결과 과산화수소의 농도가 대조군에 비하여 증가하는 것으로 나타 났고, 도 3D에 나타난 바와 같이, 과산화수소를 HepG2 세포에 24시간동안 처리한 결과 콜레스테를 레벨과 콜레스테릴 에스테르의 레벨이 대조군에 비해 증가하는 것 으로 나타났다. 다만， 과산화수소 1000 μ Μ에서는 세포의 생존률이 낮기 때문에 콜 레스테를 레벨이 낮게 측정된 것으로 판단된다.

<실시예 3-2>

과산화수소가 지방형성과 관련된 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향 상기 실시예 3-1에서 나타낸 바와 같이， 과산화수소 처리에 따라 세포 내 콜 레스테를이 축적되는 기전을 밝히기 위해, 지방 생성과 관련된 유전자의 발현량을 RT-PCR법을 통해 확인하였고, 단백질 수준에서도 동일하게 나타나는 지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과 도 3E 내지 3G에서 나타난 바와 같이， 과산화수소를 처리한 경우에 ApoE 및 ABCA1 유전자와 단백질의 발현량이 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 반 면에 500 μ Μ과산화수소를 처리한 경우에 LDLR 유전자와 단백질 발현량이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 과산화수소에 농도 의존적으로 HMGCR 유전자 발현량은 감소 한 반면, 단백질 발현량은 대조군과 비교하여 유의성이 나타나지 않았다. 한편， 과 산화수소 1000 μ Μ에서는 세포의 생존률이 낮아 β -act in의 밴드가 감소하는 것으 로 판단된다.

이를 통해, 500 μ Μ의 과산화수소를 사용하여 HepG2 세포에서 과산화수소로 유도된 산화적 효과를 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

NAC가 HepG2 세포주에서 R0S의 생성량 및 콜레스테롤에 미치는 영향 <실시예 4-1>

HepG2 세포에서 NAC가 콜레스테를 축적에 미치는 영향

in vi tro 상에서 하이포잔틴 및 과산화수소에 의해 유도된 콜레스테롤의 축 적에 항산화제가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 실시하였다.

HepG2 세포에 하이포잔틴 ( 1 mM) 또는 과산화수소 (500 μ Μ)를 처리하기 전에 5mM의 NAC(N— acetylcystein)를 2시간 동안 처리하였다. 상기 기재된 실험방법에 따 라， 세포를 수득하여 과산화수소 생성량 및 총 콜레스테를의 레벨을 측정하였다. 그 결과 도 4A에 나타난 바와 같이， 5 mM NAC를 처리한 경우에 과산화수소 양이 감소하는 것으로 나타났고, 대조군과 유사한 양인 것으로 나타났다. 또한 HepG2 세포에 하이포잔틴과 과산화수소를 처리하였을 때 총 콜레스테롤 레벨이 증 가한 반면에 NAC가 콜레스테를의 축적을 개선시키는 것으로 나타났다.

이를 통해， R0S를 제거하는 NAC는 R0S로 유도된 콜레스테롤 축적을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4-2> NAC가 지방형성과 관련된 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향 세포 내에서 하이포잔틴에 의해 유도된 콜레스테를 증가가 R0S를 통해 매개 된 것인지 확인하기 위하여, 지방 생성과 관련된 유전자의 발현량에 항생제가 미치 는 효과를 RT-PCR법을 통해 확인하였고， 단백질 수준에서도 동일하게 나타나는 지 를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

상기 기재된 실험방법에 따라 HepG2 세포를 하이포잔틴이 첨가된 DMEM 배지 에서 배양하였다. 배양한 세포에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였고， RT-PCR을 실시하였다. 또한 배양한 세포를 수득하여 상기 실험방법에 따라 웨스턴 블롯을 실 시하였다.

그 결과 도 4B 내지 4E에 나타난 바와 같이， NAC를 처리한 경우에 하이포잔 틴과 과산화수소로 인해 감소된 ApoE 및 ABCA1 발현량이 증가하는 것으로 나타났 다. 반면에 HMGCR 및 LDLR의 mRNA 발현과 단백질 발현은 하이포잔틴과 NAC 처리에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다 (도 4B 및 4C) .

또한， 과산화수소를 처리하였을 때 HMGCR 전사량이 상당히 감소하였으나， NAC를 처리하였을 때， HMGCR 발현을 억제하는 과산화수소의 효과를 억제하였다. 丽 GCR 단백질 레벨은 대조군 세포와 비교하여 차이가 나타나지 않았다. 과산화수소 를 처리하였을 때 LDLR mRNA 및 단백질 레벨이 증가하였으나， NAC 처리에 의해 LDLR 발현을 증가시키는 과산화수소의 효과를 억제하는 것으로 나타났다 (도 4D 및 4E) .

<실시예 5>

앞로퓨리놀이 HeDG2 세포주에서 R0S의 생성량 및 콜레스테를에 미치는 영향 in vi tro 상에서 하이포잔틴에 의해 유도된 콜레스테를의 축적에 특정한 크 산틴 산화효소가 미치는 효과를 조사하기 위해， 알로퓨리놀 (al lopur inol )을 사용하 여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

상기 기재된 실험방법에 따라 HepG2 세포에 2시간 및 24시간 동안 1 mM의 하 이포잔틴과 100 μ Μ의 알로퓨리놀을 처리한 다음, R0S의 생성량과 콜레스테롤 양을 측정하였다. 또한 HepG2 세포를 수득하여 ABCA1과 LXR- a ( l iver X receptor alpha) 유전자 발현량을 RT-PCR법으로 측정하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이， 알로퓨리놀을 처리였을 때， 하이포잔틴으 로 인하여 증가한 R0S의 생성량과 콜레스테를의 축적이 감소하는 것으로 나타났다( 도 5A, 5B) . 또한 알로퓨리놀을 처리한 그룹에서 하이포잔틴으로 인하여 감소한 ABCA1의 발현량이 증가하는 것으로 나타났으며， 하이포잔틴으로 인하여 감소한 LXR- α mRNA의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다.

<실시예 6>

ApoE결핍 상태에서 하이포잔틴이 콜레스테를 축적 및 지방형성과 관련된 유 퓌자에 미치는 영향

ApoE가 결핍된 세포에서 하이포잔틴이 콜레스테를 축적에 미치는 영향을 확 인하기 위하여， 다음과 같이 실험을 실시하였다.

상기 기재된 실험방법에 따라， HepG2 세포를 인간 ApoE-siRNA( siAPOE , 20nM) 또는 비표적 siRNA(siN, 20nM)로 형질전환시켰다. HepG2 세포에 24시간 동안 siAPOE 또는 siN으로 형질전환 시킨 후， 1 mM 하이포잔틴을 처리한 세포와 처리하 지 않은 세포를 24시간 동안 배양했다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이， ApoE의 결핍은 콜레스테를을 증가시키 며 ApoE 및 ABCA1의 전사 레벨을 감소시킨다. 세포에 siAPOE를 형질전환시켜 하이 포잔틴을 처리한 군에서는 상승 작용에 의해 콜레스테롤 양이 증가하는 것으로 나 타났다 (도 6A) . 또한 siAPOE와 하이포잔틴은 상승작용하여 ApoE와 ABCA1 mRNA 발현 량과 단백질 발현량을 감소시키는 것으로 나타난 반면， HMGCR 및 LDLR mRNA 발현량 및 단백질 발현량은 siAPOE와 하이포잔틴에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 6B, 6C, 6D) .

<실시예 7>

고콜레스테롤 환자의 생체시료 내 하이포잔틴 검출

본 발명에서 사용한 임상시료는 다양한 질환으로 경북대학교 병원올 내원한 환자로부터 동의를 받아 -80^°C에서 보관중인 혈청 시료를 사용하였다.

임상시료에서 혈중 콜레스테를 농도와 하이포잔틴의 상관성을 확인하기 위하 여 총콜레스테를 200 mg/dL 이하의 환자 10명 (대조군)과 총콜레스테를 300-600 mg/dL 인 환자 9명 (고콜레스테를군)을 대상으로 혈중 하이포잔틴의 농도를 평가하 였다. 하이포잔틴의 농도는 Amp lex Red Hypoxanthine assay ki t (Molecular Probe) 을 사용하여 환자 혈청을 대상으로 평가하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이 총콜레스테를은 대조군에서 (control ) 평균 150 土 4. 1 mg/dL이었으며， 고콜레스테를군 (Hypercholesterol )에서는 376 土 31.5 mg/dL 으로 측정되었다. 혈중 하이포잔틴의 농도는 대조군에서 16 士 2.3 μ Μ, 고콜레스 테를군에서는 25 士 2.7 μ Μ로 나타나 통계학적으로 유의성 있는 결과를 나타냈다. 즉, 혈증 콜레스테를 수치와 하이포잔틴의 수치가 상관성을 나타낸다는 것을 임상 시료로부터 다시 한 번 확인하여, 하이포잔틴이 콜레스테를 축적으로 인한 질환에 대한 바이오 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

【산업상 이용가능성】

하이포잔틴은 직접적으로 또는 간접적으로 세포 내 콜레스테를의 축적을 증 가시키며 산화적 스트레스를 유발한다는 점에서 콜레스테롤 축적과 관련된 질환， 보다 바람직하게는 관상동맥질환의 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 또 한， 본 발명의 진단용 마커를 통해 콜레스테를 축적과 관련된 질환의 발견 및 예후 예측에 중요한 정보를 제공할 수 있으며， 관련 질환 치료 약물의 스크리닝에 활용 될 수 있다는 점에서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

(a) 생물학적 시료에 존재하는 하이포잔틴 (hypoxanthine)의 양을 측정하는 단계 ; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 측정결과를 정상대조군 시료의 하이포잔틴 양과 비교 하는 단계를 포함하는 콜레스테롤 축적 관련 질환 진단 또는 예후에 유용한 정보를 제공하는 방법 .

【청구항 2】

제 1항에 있어서 , 상기 콜레스테를 축적 관련 질환은 고지혈증， 지방간, 관상 동맥질환 및 심혈관질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 3】

제 2항에 있어서， 상기 관상동맥질환은 심근경색， 협심증， 죽상동맥경화증， 급성 관상동맥 증후군 또는 뇌혈관 발작인 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 4】

제 1항에 있어서， 상기 하이포잔틴의 양은 미셀 액체크로마토그래피 (mi cel lar l iquid chromatography) , 미셀 전기운동 모세관법 (micel lar electrokinet ic capi l lary) , 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)， 액체크로마토그래피 -질량 분석 (LC/MS) 및 기체크로마토그래피-질량분석 (GC/MS)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 가지 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 5]

제 1항에 있어서， 상기 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액, 혈청., 혈장， 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을특징으로 하는 방법 .

【청구항 6】

하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테롤 축적 관련 질환의 진단용 마커 조성물.

【청구항 7】

임의의 물질을 쇤간을 제외한 동물에 투여한 후 혈청 하이포잔틴의 농도를 측정하는 것을 포함하는， 콜레스테를 축적 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법.

【청구항 8]

하이포잔틴 (hypoxanthine)을 포함하는 콜레스테롤 축적 관련 질환의 진단용 마커를 제조하기 위한 용도.