WO2016159111A1 - 胎児の遺伝子状態を判定する方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for determining the genetic status of a fetus.
- amniotic fluid test As a prenatal diagnosis, an amniotic fluid test has conventionally been performed to examine fetal cell chromosomes in amniotic fluid by amniocentesis.
- this method has been pointed out as a major problem that there is a possibility of miscarriage.
- Patent Document 1 discloses a fetus during pregnancy using genotype data measured from a mixed sample of fetal mother-derived DNA and fetal-derived DNA, and, if necessary, genotype data from the mother and father. A method for determining the ploidy status of a chromosome in is described.
- fetal cell eg, fetal nucleated red blood cell
- Various methods have been studied.
- the number of fetal cells obtained when such a known technique is used to reliably select rare fetal cells may be limited to at most several or one.
- Patent Document 1 discloses that a plurality of loci of interest are amplified by multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) using a plurality of primer sets, mutations and chromosomes. Methods for detecting genetic diseases such as abnormalities are described.
- Patent Document 2 discloses a method for amplifying a specific sequence of genomic DNA derived from a fetus using a highly multiple targeted polymerase chain reaction, and determining the allele frequency at each target locus with a sequencer. ing.
- Multiplex PCR is known as a reaction for simultaneously amplifying two or more amplification target regions in one reaction system. It is known that multiplex PCR is a useful technique for efficiently amplifying a region to be amplified from a small amount of DNA extracted from a small amount of blood and typing a large number of SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). It has been.
- Patent Document 3 discloses a primer design method for multiplex PCR that can efficiently amplify a plurality of amplification sites (targets).
- an object of the present invention is to provide a method for determining a fetal gene state, which can perform amplification by polymerase chain reaction (PCR) in a target region uniformly and accurately.
- PCR polymerase chain reaction
- the inventors of the present invention have evaluated the primer dimer formation property, and the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the primer base sequence.
- a pair-wise local alignment is performed, a local alignment score is obtained, a first-stage selection is performed based on the obtained local alignment score, and a preset sequence including the 3 ′ end of the nucleotide sequence of the candidate primer
- pairwise global alignment was performed to obtain a global alignment score
- the second stage was selected based on the obtained global alignment score, and was selected in both the first stage and the second stage.
- Adopting a primer allows the target gene region to be It can be ⁇ and efficiently amplified, become known that the resulting primer set to be subjected to polymerase chain reaction, and completed the present invention.
- the present invention includes the following (1) to (6).
- a method for determining the genetic status of a fetus A target region selection step of selecting a target region for determining the gene state from a region on the human genome; A single cell isolation step for isolating single cells from a maternal blood sample; A genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the single cell; Amplification step by polymerase chain reaction in which the target region is amplified by polymerase chain reaction using a primer set designed to amplify the target region by polymerase chain reaction using genomic DNA extracted from the single cell as a template When, A DNA sequencing step for decoding the DNA base sequence of the amplification product by the polymerase chain reaction of the target region; With
- the target region selection step is performed before or after both the single cell isolation step and the genomic DNA extraction step, or in parallel with both the single cell isolation step and the genomic DNA extraction step.
- a primer set designed to amplify the target region by polymerase chain reaction is: A target region selection step of selecting a target region for designing a primer set to be subjected to polymerase chain reaction from the target region; A primer candidate base sequence creating step for creating at least one base sequence of candidate primers for amplifying the target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the target region on the genome, respectively ,
- For the primer candidate base sequence under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the primer candidate base sequence, local alignment is performed pairwise, and a local alignment score is obtained, and Based on the local alignment score obtained in the local alignment step, a first step selection step of performing a first step selection of the nucleotide sequence of the primer candidate, A global alignment step of performing global alignment in a pairwise manner for a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the base sequence of the candidate primer, and obtaining a global alignment score; Based on the global alignment score obtained in the global alignment
- a method for determining the genetic state of a fetus which is designed by a method for designing a primer set for polymerase chain reaction, which is performed in parallel with both steps.
- a first primer adopting step Selecting a second target region for designing a primer set for polymerase chain reaction from the target region, a second target region selection step; Creating at least one base sequence of candidate primers for amplifying the second target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the second target region on the genome, Second primer candidate base sequence creation step; Regarding the base sequence of the candidate primer for amplifying the second target region and the base sequence of the primer already employed, the partial sequences to be compared are 3 of the base sequence of the primer candidate and the base sequence of the primer already employed.
- a second local alignment step of performing a pairwise local alignment to obtain a local alignment score under the condition of including an end;
- a second first-stage selection step for performing first-stage selection of the base sequences of candidate primers for amplifying the second target region based on the local alignment score obtained in the second local alignment step.
- a second global alignment process for determining a global alignment score
- a second second-stage selection step for performing a second-stage selection of candidate nucleotide sequences for amplifying the second target region based on the global alignment score obtained in the second global alignment step.
- a second primer adoption step With
- both the first local alignment process and the first first stage selection process are performed before or after both the first global alignment process and the first second stage selection process. Or in parallel with both the first global alignment step and the first second stage selection step, and Both the second local alignment step and the second first stage selection step are performed before or after both the second global alignment step and the second second stage selection step, or the above Performed in parallel with both the second global alignment process and the second second stage selection process, When there are three or more target regions, each step from the second target region selection step to the second primer adoption step is performed for amplifying the target region for all target regions.
- the method for determining a fetal gene state according to (1) above which is designed by a method for designing a primer set for polymerase chain reaction, which is repeated until the base sequence of the primer is adopted.
- the present invention it is possible to provide a method for determining the genetic state of a fetus that can perform amplification by polymerase chain reaction in a target region uniformly and accurately.
- gene sequencing in a target region can be reliably and efficiently performed in a short process.
- FIG. 1 is a block diagram showing a method for designing primers and primer sets in the present invention.
- the present invention generally relates to a technique for detaching cells fixed on a substrate, extracting genomic DNA, performing DNA amplification in an amplification target region, and determining the gene state of fetal nucleated red blood cells. More specifically, in the present invention, when amplifying DNA in a region to be amplified by polymerase chain reaction, DNA amplification is performed using a primer designed so that the complementarity between the primers is reduced, so that the work process is performed.
- the present invention relates to a technique for shortening and solving the problem that the amount of PCR amplification product varies among a plurality of cells.
- Conventional non-invasive prenatal diagnosis is a method of analyzing fetal cell-free DNA present in maternal blood in a mixture with the cell-free DNA of the mother.
- This method is useful as a method for detecting numerical abnormalities of fetal chromosomes, but because it analyzes in a state where mother's cell-free DNA and fetal cell-free DNA coexist, it determines the genetic status other than numerical abnormalities. It has the disadvantage of being difficult to do.
- the present invention is a technique for analyzing a single cell derived from a fetus, and the detection region can include a genetic polymorphism site and / or a somatic mutation site that are already known. Because there is, it is possible to determine a genetic state that is not limited to a numerical abnormality.
- sequence analysis of amplification products in order to efficiently analyze amplification products, it is necessary to perform amplification with high precision by reducing non-specific products such as primer dimers mixed in the sequence library.
- the design method of primers and primer sets used in the polymerase chain reaction has been improved, and various gene regions can be amplified uniformly and accurately even from very small DNA in a single cell, so that fetal gene abnormalities can be reliably detected. Made it possible to detect the presence or absence.
- the method for determining the genetic status of a fetus comprises a target region selecting step for selecting a target region for determining the gene status from a region on the human genome, and a simple method for isolating a single cell from a maternal blood sample.
- the primer set that is performed in parallel with both steps and designed to amplify the target region by PCR is a primer and primer set design method described in “ ⁇ Primer and primer set design method” described below. Designed to determine the genetic status of the fetus.
- a target region for determining the gene state is selected from a region on the human genome.
- the “region on the human genome” refers to a region on genomic DNA in which a site related to a gene polymorphism, a single gene disease, a multifactor disease, and / or cancer or the like is present.
- the length of the region is not particularly limited, and may be one base or more.
- the region on the human genome where the target region is selected may exist in either the gene region or the non-gene region.
- the gene region is a gene encoding a protein, a coding region where a ribosomal RNA (Ribonucleic acid) gene and a transfer RNA gene are present, an intron that divides the gene, a transcriptional regulatory region, and a 5′-leader sequence.
- Non-gene regions also include non-repetitive sequences such as pseudogenes, spacers, response elements and origins of replication, and repetitive sequences such as tandem repeats and distributed repeats.
- Genetic polymorphisms include, for example, SNP (Single Nucleotide Polymorphism), SNV (Single Nucleotide Variant), STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism), mutation, and insertion And / or deletion (indel) and the like.
- Single gene diseases are diseases that develop due to abnormalities in a single gene. Abnormalities include deletion or duplication of the gene itself, and / or base substitution, insertion and / or deletion within the gene.
- a single gene that causes a single gene disease is called a “responsible gene”.
- a multifactor disease is a disease in which multiple genes are involved in the onset, and may involve a specific combination of SNPs. These genes are called “susceptibility genes” in the sense that they are susceptible to disease. Cancer is a disease caused by gene mutation. Like other diseases, there are hereditary (familial) cancers, which are called genetic tumors (familial tumors).
- the number of regions on the human genome is not particularly limited. This is because the region on the human genome is a candidate list for selecting a target region, and even if a huge number is listed, not all of them must be analyzed.
- the target region is a region selected as a target for determining the gene state from the region on the human genome.
- the purpose of selection is not limited to detecting genetic polymorphisms, diseases, or cancers related to each region, but may be detection of aneuploidy of chromosomes, etc. . Further, the purpose of selection is not limited to one, and it may have two or more purposes.
- the number of regions on the human genome to be selected as the target region varies depending on the target gene state and is not particularly limited as long as it is 1 or more, but is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 That's it.
- Single cell isolation process In the single cell isolation step, single cells are isolated from the maternal blood sample.
- the maternal blood sample is not particularly limited as long as it is a blood sample collected from a maternal body (pregnant woman), but maternal peripheral blood is preferable.
- Maternal peripheral blood includes maternal eosinophils, neutrophils, basophils, mononuclear cells and lymphocytes such as lymphocytes and mature erythrocytes without nuclei, as well as maternal nucleated red blood cells and Fetal nucleated red blood cells are included. Fetal nucleated red blood cells are said to be present in maternal blood from about 6 weeks after pregnancy. Therefore, in the present invention, it is preferable to examine peripheral blood of pregnant women about 6 weeks after pregnancy.
- the single cell is not particularly limited as long as it is derived from a fetus, but fetal nucleated red blood cells are preferred.
- Fetal nucleated red blood cells are red blood cell precursors that pass through the placenta and are present in the mother's blood. When the mother is pregnant, fetal red blood cells can be nucleated. Since the erythrocytes have chromosomes, fetal chromosomes and fetal genes can be obtained by means of low invasiveness.
- the fetal nucleated red blood cells are said to be present in a ratio of about 1 in 10 6 cells in maternal blood, and the probability of existence in peripheral blood of pregnant women is very small.
- basophils are about 1.070 to 1.080 g / mL
- lymphocytes are about 1.060 to 1.080 g / mL
- mononuclear cells are about 1.060 to 1 About .070 g / mL.
- Percoll Percoll, manufactured by GE Healthcare Bioscience
- Ficoll pack Ficoll-Paque, manufactured by GE Healthcare Biosciences
- a medium such as (Histopaque, manufactured by Sigma Aldrich) can be used.
- percoll and histopack As for Percoll, a product having a density of 1.130 g / cm 3 (specific gravity 1.130) is commercially available, and a medium having a target density (specific gravity) can be prepared by dilution. In addition, a medium having a density of 1.077 g / cm 3 (specific gravity 1.077) and a medium having a density of 1.119 g / cm 3 (specific gravity 1.119) are commercially available. A medium having a target density (specific gravity) can be prepared. By using percoll and histopack, it is possible to prepare the first medium and the second medium.
- Percoll and histopack it is possible to prepare the first medium and the second medium.
- the density of the medium to be stacked is set in order to separate fetal nucleated red blood cells having a density of about 1.065 to 1.095 g / mL from other blood cell components in the mother body. Since the central density of fetal nucleated red blood cells is about 1.080 g / mL, two different density media (first medium and second medium) sandwiching the central density are prepared and adjacent to each other. When layered, it is possible to collect a fraction having a desired fetal nucleated red blood cell at its interface.
- the density of the first medium is set to 1.080 g / mL or more and 1.100 g / mL or less
- the density of the second medium is set to 1.060 g / mL or more and 1.080 g / mL or less.
- the density of the first medium is set to 1.080 g / mL or more and 1.090 g / mL or less
- the density of the second medium is set to 1.065 g / mL or more and 1.080 g / mL or less.
- the density of the first medium is set to 1.085 g / mL and the density of the second medium is set to 1.075 g / mL, respectively.
- Mononuclear cells are preferably separated from the desired fraction to be collected.
- the first medium and the second medium may be the same type of medium or different types of media, but are preferably the same type of medium.
- nucleated red blood cell candidates In order to obtain nucleated red blood cell candidates from the mother's blood, it is possible to prepare a substrate (blood cell specimen) on which blood is applied and dried to smear blood cells.
- a transparent medium is preferably used, and a slide glass is more preferably used.
- fetal nucleated red blood cell candidates can be selected using the ratio of the area of the nuclear region to the cytoplasmic area, the circularity of the nucleus and / or the area of the nuclear region, etc. It is. In particular, it is preferable to select, as a fetal nucleated red blood cell candidate, a cell that satisfies the condition of the ratio of the area of the nuclear region to the area of the cytoplasm or the circularity of the nucleus.
- N is the area of the nucleus region of the cell that performs image analysis
- C is the area of the cytoplasm of the cell that performs image analysis.
- N is the cytoplasm area of the cell to be image-analyzed
- L is the length of the major axis of the cell nucleus to be image-analyzed, that is, circumscribing the complex-shaped cell nucleus. It is the length of the major axis of the ellipse.
- a system for selecting fetal nucleated red blood cell candidates using cell morphology information is equipped with an optical microscope, a digital camera, a slide glass stage, an optical transport system, an image processing PC, a control PC, and a display.
- the optical transport system includes an objective lens and a CCD camera.
- the image processing PC includes a processing system that performs data analysis and data storage.
- the control PC includes a control system that controls the position control of the slide glass stage and the entire process.
- hemoglobin The protein present in red blood cells in the blood of all vertebrates, including humans, is hemoglobin.
- Nucleated erythrocytes are different from leukocytes, which are one type of nucleated cells in blood, in the presence or absence of hemoglobin.
- Hemoglobin is oxygenated hemoglobin that displays a bright red color when combined with oxygen, and reduced hemoglobin that exhibits a dark red color when not combined with oxygen. ing. Since hemoglobin has absorption at 380 nm to 650 nm, it is possible to detect hemoglobin with information of at least one monochromatic light resulting from the difference in absorbance in this wavelength region.
- Monochromatic light is preferably used for confirming the presence of hemoglobin, and monochromatic light having a wavelength of 400 nm to 500 nm or a monochromatic light having a wavelength range of 525 nm to 580 nm, which has a large absorption of hemoglobin, can be selected. Since the absorption coefficient in these wavelength regions shows a high value due to the presence of hemoglobin, the ratio with the absorption coefficient of the cytoplasm of leukocytes is 1 or more.
- a cell having a nearly circular cell nucleus and having hemoglobin can be identified as a candidate for a nucleated red blood cell.
- fetal nucleated red blood cells and adult nucleated red blood cells have spectroscopic effects caused by different oxygen binding capacities because fetal hemoglobin is hemoglobin F (HbF) and adult hemoglobin is hemoglobin A (HbA). It is possible to select fetal nucleated red blood cells using the difference in characteristics.
- microspectrophotometer When measuring the absorption coefficient of cytoplasm, a microspectrophotometer can be used.
- the microspectrophotometer is a photometer that uses the same optical principle as a normal spectrophotometer and uses an optical system of a microscope, and a commercially available apparatus can be used.
- cells can be obtained by peeling a single cell from a transparent substrate with a micromanipulator.
- the origin of isolated nucleated erythrocytes by DNA analysis such as polymorphism analysis by SNP and / or STR (Short Tandem Repeat: short tandem repeat) and confirmation of the presence of Y chromosome, etc. Can be determined.
- the DNA analysis can be performed simultaneously with the determination of the gene state, as described in “(Identification of fetal nucleated red blood cells)” in the DNA sequencing step described later.
- genomic DNA extraction process In the genomic DNA extraction step, genomic DNA is extracted from the single cell isolated in the above “ ⁇ Single cell isolation step>”.
- the target region is PCR-amplified using a primer set designed to PCR-amplify the target region using the genomic DNA extracted in the “ ⁇ Genomic DNA extraction step>” as a template.
- the “primer set designed to amplify the target region by PCR” will be described in detail in “ ⁇ Primer and primer set design method” described later.
- the polymerase chain reaction uses DNA polymerase to repeatedly replicate template DNA.
- a short DNA primer that hybridizes with the template DNA is added at the beginning and end of the DNA base sequence to be amplified, and replication is initiated by polymerase. Each time replication is repeated, the two strands of the template double-stranded DNA are dissociated and replicated separately.
- multiplex PCR it is possible to use a heat-resistant DNA polymerase and reaction buffer used in general PCR, but the reaction conditions for each primer pair need to be studied because the temperatures at which each primer pair anneals to the template DNA are different. There is a case. Therefore, it is preferable to use a heat-resistant DNA polymerase and reaction buffer optimized for multiplex PCR, and in the present invention, it is more preferable to perform the reaction using a multiplex PCR assay kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
- the number of target regions is determined from the DNA sequence region specific to the chromosome from the target region at the location required according to the test. Select and create candidate candidate nucleotide sequences for amplifying each target region, and select those with low complementarity between the primer nucleotide sequences. However, the amplification of the target area is greatly improved.
- sample pretreatment is performed after extraction of nucleic acid from a sample, (1) DNA fragmentation, (2) DNA size selection, (3) DNA end smoothing treatment, ( 4) The process of adding adapter sequences to the DNA ends, (5) DNA purification, and (6) DNA amplification is required.
- the amount of amplified DNA is measured by, for example, an ultra-trace spectrophotometer nanodrop (manufactured by Thermo Fisher Scientific) that measures the absorbance at a wavelength of 260 nm, an Agilent 2100 bioanalyzer using a laser fluorescence detection method ( Agilent), or a Quantus fluorometer (Promega) that quantifies double-stranded DNA by a fluorescence method.
- an ultra-trace spectrophotometer nanodrop manufactured by Thermo Fisher Scientific
- Agilent laser fluorescence detection method
- Quantus fluorometer Promega
- nucleic acid purification methods include a method using phenol / chloroform / ethanol, a method of selectively adsorbing on a silica carrier such as a silica membrane filter in the presence of a chaotropic salt, and the presence of PEG (Polyethylene glycol).
- a method using a phenomenon in which a nucleic acid selectively binds to a magnetic bead modified with a carboxyl group is known.
- a multiplex PCR amplification product can be selected by a purification method using magnetic beads.
- Magnetic bead purification process By purifying the PCR amplification product using magnetic beads, which are paramagnetic microbeads, it is possible to more efficiently analyze only the target region.
- nucleic acids are reversibly bound to the particle surface of the magnetic beads, the magnetic beads are adsorbed with a magnet, and the amplified DNA fragment and liquid are separated, thereby efficiently producing enzymes, dNTPs, Contaminants such as PCR primers, primer dimers, and salts can be removed.
- the method using magnetic beads has less sample loss and higher contaminant removal efficiency. As a result, it is possible to efficiently analyze only the target region in the DNA sequencing step.
- Magnetic beads are commercially available, and for example, AMPure XP kit (manufactured by Beckman Coulter), NucleoMag (manufactured by Takara Bio Inc.), EpiNext DNA Purification HT System (manufactured by Epigentec) or the like can be used. Especially, it is preferable to refine
- next-generation sequencer for sequence analysis of PCR amplification products, it is desirable to use a next-generation sequencer, in particular, MiSeq (manufactured by Illumina).
- each multiplex PCR product has a sample identification sequence (index sequence) composed of 6 to 8 bases and an oligonucleotide on the MiSeq flow cell.
- index sequence index sequence
- P5 and P7 sequences for hybridization to the sequences. By adding these sequences, a maximum of 96 types of multiplex PCR products can be measured at one time.
- an adapter ligation method or a PCR method can be used as a method for adding the index sequence, the P5 sequence and the P7 sequence to both ends of the multiplex PCR product.
- a method for quantifying a PCR product an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Agilent) or a Quantus fluorometer (Promega) can be used, but a method of measuring a multiplex PCR product by a quantitative PCR method is more preferable.
- quantification is preferably performed using a KAPA library quantification kit (manufactured by Nippon Genetics).
- BWA Backrows-Wheeler Aligner: Li, H., 1 other, “Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform”, Bioinformatics, 2009, 25, 14, 1754-1760; Li, H., 1 other, “Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform”, Bioinformatics, 2010, No. 26, No. 5, p. 589-595) is preferably used to map to a known human genome sequence.
- SAMtools Li, Heng, et al., “The Sequence Alignment / Map format and SAMtools ", Bioinformatics, 2009, 25, 16, pp. 2078-2079; SAM is derived from” Sequence Alignment / Map "), and / or BEDtools (Quinlan, AR, 1 other) , "BEDTools: a flexible suite of utilities for Comparison genomic features ", Bioinformatics, 2010, Vol. 26, No. 6, p. 841-842) is preferably used to analyze gene mutation and quantification of the number of chromosomes.
- the sequencer determines the amplification amount (number of sequence reads) of an amplification product having a sequence of 140 bp or more and 180 bp or less of a cell identified as a mother-derived nucleated red blood cell. .
- the amount of amplification of the amplification product derived from the fetus (number of sequence reads) and the amount of amplification of the amplification product derived from the mother (number of sequence reads) are approximately 1: 1. is expected. If the fetus has a disease that is trisomy derived from an amplified chromosome, the ratio is expected to be 1: 1.5 (or 2: 3).
- the amount of PCR amplified product derived from a fetus (number of sequence reads) relative to the amount of PCR amplified product derived from a mother when a normal fetus is pregnant (number of sequence reads) collected from a plurality of pregnant mothers in advance. Find multiple ratios and find their distribution. Further, a plurality of ratios of the amount of amplification products derived from the fetus (number of sequence reads) to the amount of amplification products derived from the mother when the trisomy fetus becomes pregnant (number of sequence reads) are obtained, and the distribution thereof is determined. A cut-off value can also be set in a region where the two distributions do not overlap.
- the pre-determined cut-off value is compared with the result of determining the ratio of amplification products. If the ratio is less than or equal to the cut-off value, the fetus is normal, and if the ratio is greater than or equal to the cut-off value, trisomy It is also possible to interpret the test result as follows.
- the method of the present invention may be performed again by returning to the single cell isolation step of isolating single cells from the maternal blood sample.
- STR can also be used as a kind of genetic polymorphism for paternity discrimination.
- SNPs in which one base in the genome base sequence is mutated and observed at a frequency of 1% or more can be used.
- fetal cells and maternal cells can also be discriminated based on the presence or absence of cells having different STR or SNPs in nucleated red blood cells using a next-generation sequencer.
- auxiliary information for determination of the gene state for example, a mother-derived white blood cell is obtained and STR or SNPs are similarly analyzed. Can be done.
- the fetus is confirmed to be a boy by ultrasonography before collecting nucleated red blood cells, the presence of the Y chromosome in the collected nucleated red blood cells is detected, so that the nucleated red blood cells are removed from the fetus. It can be determined whether or not it originates.
- a FISH (Fluorescent in situ hybridization) method using a fluorescent probe specific to the Y chromosome is known.
- CEP X / Y DNA probe kit manufactured by Abbott
- nucleated erythrocyte derived from a boy's fetus by preparing a primer having a base sequence specific to the Y chromosome and using PCR to confirm the presence or absence of amplification.
- a primer and a primer set designing method which is one of the characteristic points of the present invention, generally speaking, selects a plurality of specific target regions, searches nearby base sequences, and extracts each of the extracted primer sets.
- the primer group which includes the target region as an amplification target and does not become complementary to each other is obtained by confirming the complementarity with and selecting a base sequence with low complementarity.
- Primer groups can be checked for complementarity by using local alignment so that the complementarity of the entire sequence is low, and by using global alignment for the end of the primer sequence. The feature is in creating. This will be described in detail below.
- the first aspect of the primer and primer set design method in the present invention comprises the following steps.
- A a target region selection step of selecting a target region for designing a primer set to be subjected to the polymerase chain reaction from the target region for determining the gene state selected in the target region selection step;
- B Primer candidate base sequences for creating at least one candidate base sequence for amplifying the target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the target region on the genome.
- a local alignment step of obtaining a local alignment score by performing local alignment pairwise on the condition that a partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence of the primer candidate with respect to the base sequence of the primer candidate
- Target region selection step This is shown as "(first) target region selection step" in the block diagram of FIG.
- the target region selection step is a step of selecting a target region for designing a primer set to be subjected to the polymerase chain reaction from a target region for determining a fetal gene state selected from a region on the human genome in the target region selection step. is there.
- the target region is a region selected as a target for designing a primer set to be subjected to the polymerase chain reaction from the target region.
- PCR polymerase chain reaction
- PCR is a reaction for synthesizing DNA from a template DNA using a DNA polymerase.
- primers oligonucleotides
- a combination of primers used simultaneously in one PCR reaction system may be referred to as a primer set.
- PCR can be easily extended from a simple system that amplifies a single region using a pair of primer sets to a complex system (multiplex PCR) that amplifies multiple regions simultaneously using multiple pairs of primer sets can do.
- PCR is that only a desired region can be selectively amplified from a very long DNA molecule such as the human genome (3 billion base pairs). In addition, it is possible to obtain a sufficient amount of an amplification product in a desired region using a very small amount of genomic DNA as a template.
- the time required for amplification is generally as short as about 2 hours.
- the advantage of PCR is that the process is simple and can be amplified by a fully automatic desktop device.
- (B) Primer candidate base sequence creation step This is shown as "(first) primer candidate base sequence creation step" in the block diagram of FIG.
- the primer candidate base sequence creating step is a step of creating at least one base sequence of candidate primers for amplifying the target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the target region on the genome. It is.
- the vicinity region of the target region is a generic term for a region outside the 5 ′ end of the target region and a region outside the 3 ′ end of the target region.
- the inside of the target area is not included in the neighboring area.
- the length of the neighboring region is not particularly limited, but is preferably not more than a length that can be extended by PCR, and more preferably not more than the upper limit of the length of the DNA fragment desired to be amplified. In particular, it is preferable that the length is easy for concentration selection and / or sequence reading. You may change suitably according to the kind etc. of the enzyme (DNA polymerase) used in PCR.
- the specific length of the neighboring region is preferably about 20 to 500 bases, more preferably about 20 to 300 bases, still more preferably about 20 to 200 bases, and still more preferably about 50 to 200 bases.
- the length of the primer refers to the total molar percentage of guanine (G) and cytosine (C) in all nucleobases), Tm value (two This is the temperature at which 50% of the stranded DNA dissociates to become single-stranded DNA.Tm is derived from melting temperature), and the same points to be noted in general primer design methods such as sequence bias .
- the length (number of nucleotides) of the primer is not particularly limited, but is preferably 15 mer to 45 mer, more preferably 20 mer to 45 mer, and further preferably 20 mer to 30 mer. When the length of the primer is within this range, it is easy to design a primer excellent in specificity and amplification efficiency.
- the GC content is not particularly limited, but is preferably 40 mol% to 60 mol%, more preferably 45 mol% to 55 mol%. When the GC content is within this range, problems of specificity and a decrease in amplification efficiency due to higher order structures are unlikely to occur.
- the Tm value is not particularly limited, but is preferably in the range of 50 ° C. to 65 ° C., more preferably in the range of 55 ° C. to 65 ° C.
- Tm value should be calculated using software such as OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights) or Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/) Can do. Moreover, it can also obtain
- Tm value (° C.) 2 (nA + nT) +4 (nC + nG)
- the method for calculating the Tm value is not limited to these, and the Tm value can be calculated by various conventionally known methods.
- the primer candidate base sequence has no base bias as a whole. For example, it may be desirable to avoid partially GC rich sequences and partially AT rich sequences. It is also desirable to avoid T and / or C continuity (polypyrimidine) and A and / or G continuation (polypurine).
- the 3 'terminal base sequence avoids a GC-rich sequence or an AT-rich sequence.
- the 3 'terminal base is preferably G or C, but is not limited thereto.
- a specificity check step for evaluating the specificity of the primer candidate base sequence based on the sequence complementarity of each primer candidate base sequence prepared in the above (b) primer candidate base sequence preparation step to the respective genomic DNA May be implemented.
- the specificity check is performed by performing local alignment between the base sequence of the genomic DNA and the base sequence of the candidate primer. If the local alignment score is less than a preset value, the base sequence of the candidate primer is complementary to the genomic DNA. It can be evaluated that the specificity is low and the specificity is high.
- it is desirable that the local alignment is also performed on a complementary strand of genomic DNA. This is because the primer is single-stranded DNA, whereas the genomic DNA is double-stranded.
- a complementary base sequence may be used instead of the primer candidate base sequence. Complementarity can be considered homology to complementary strands.
- a homology search may be performed on the genomic DNA base sequence database using the candidate primer base sequences as query sequences.
- a homology search tool for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: Blast) (Altschul, S. A., four others, “Basic Local Alignment Search Tool”, Journal of Molecular Biology, 1990, October, 215, pp. 403-410) and FASTA (Pearson, W. R., 1 other, “Improved tools for biological sequence comparison”, Bulletin of the National Academy of Sciences, National Academy of Sciences, 1988, 4 Month, Vol. 85, p.2444-2448).
- BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Blast
- FASTA Pearson, W. R., 1 other, “Improved tools for biological sequence comparison”, Bulletin of the National Academy of Sciences, National Academy of Sciences, 1988, 4 Month, Vol. 85, p.2444-2448.
- the scoring system and the local alignment score threshold are not particularly limited, and can be appropriately set depending on the length of the base sequence of the candidate primer and / or PCR conditions.
- the default value of the homology search tool may be used.
- the base sequence of the candidate primer is complementary to the base sequence at an unexpected position on the genomic DNA and has low specificity, when PCR is performed using the primer of the base sequence, Exclude artifacts because they may amplify artifacts.
- (C) Local alignment step This is shown as "(first) local alignment step” in the block diagram of FIG.
- the local alignment step the partial sequences to be compared for all the pairs consisting of two base sequences extracted from the base sequence of the candidate primer for amplifying the target region created in the above (b) primer candidate base sequence creation step
- the combination of base sequence pairs for performing local alignment may be a combination selected by allowing duplication or a combination selected without allowing duplication, but a primer dimer between primers of the same base sequence. If the formability has not yet been evaluated, a combination selected to allow duplication is preferred.
- the (f) primer candidate selected in the second stage selection process You may perform a process and the (d) 1st step selection process mentioned later.
- the local alignment is an alignment performed on a partial sequence, and a portion having high complementarity can be locally examined.
- the local alignment is usually performed under the condition that “the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence” unlike the local alignment performed on the base sequence.
- the partial sequences to be compared include the 3 ′ ends of both base sequences.
- the condition that “the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence”, that is, “the partial sequence to be compared starts from the 3 ′ end of one sequence and 3 ′ of the other sequence”.
- the local alignment under the condition of “considering only the alignment that ends at the end”, a mode in which the partial sequences to be compared include the 3 ′ ends of both base sequences is preferable.
- the local alignment may insert a gap.
- Gap means base insertion and / or deletion (indel).
- a case where bases are complementary between base sequence pairs is regarded as a match (match), and a case where they are not complementary is regarded as a mismatch (mismatch).
- the alignment is performed so that a score is given to each of the match, mismatch, and indel, and the total score is maximized. What is necessary is just to set a score suitably.
- a scoring system may be set as shown in Table 1 below. In Table 1, “-” represents a gap (insertion and / or deletion (indel)).
- dot matrix shown in Table 3 from the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2. Specifically, the base sequence of SEQ ID NO: 1 is arranged from left to right in the 5 ′ to 3 ′ direction, the base sequence of SEQ ID NO: 2 is arranged from the bottom to the top, in the direction of 5 ′ to 3 ′, and bases Is entered in a grid that is complementary to obtain a dot matrix shown in Table 3.
- the alignment can be obtained not only by the dot matrix method exemplified here but also by dynamic programming, word method, or other various methods.
- (D) First Stage Selection Step This is shown as “(first) first stage selection step” in the block diagram of FIG.
- the first stage selection step based on the local alignment score obtained in the above (c) local alignment step, the first stage selection of the base sequence of the primer candidate created in the above (b) primer candidate base sequence creation step is performed. It is a process.
- a threshold value (first threshold value) of the local alignment score is set in advance. If the local alignment score is less than the first threshold, it is determined that these two base sequence pairs have low dimer formation, and the subsequent steps are performed. On the other hand, if the local alignment score is equal to or higher than the first threshold value, it is determined that the pair of these two base sequences has high dimer formation, and the subsequent steps are not performed for the pair.
- the first threshold is not particularly limited and can be set as appropriate.
- the first threshold value may be set according to PCR conditions such as the amount of genomic DNA used as a template for the polymerase chain reaction.
- the local alignment score is “ ⁇ 0”, which is less than the first threshold value “3”. Therefore, it is determined that the base sequence pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 have low dimer formation. Can do.
- this process is performed with respect to all the pairs which calculated the score in said (c) local alignment process.
- (E) Global alignment step This is shown as "(first) global alignment step” in the block diagram of FIG.
- the primer candidate base sequences for all the pairs consisting of two base sequences extracted from the candidate primer base sequences for amplifying the target region created in the above (b) primer candidate base sequence creating step This is a step of obtaining a global alignment score by performing global alignment in a pair-wise manner with respect to a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end.
- the combination of base sequence pairs for performing global alignment may be a combination selected by allowing duplication or a combination selected without allowing duplication, but primer dimers between primers of the same base sequence If the formability has not yet been evaluated, a combination selected to allow duplication is preferred.
- the global alignment is an alignment performed on the “entire sequence”, and the complementarity of the entire sequence can be examined.
- the “entire sequence” is the entire base sequence having a preset sequence length including the 3 ′ end of the base sequence of the candidate primer.
- a gap may be inserted in the global alignment.
- Gap means base insertion and / or deletion (indel).
- a case where the bases are complementary between the base sequence pairs is regarded as a match (match), and a case where the bases are not complementary is regarded as a mismatch (mismatch).
- the alignment is performed so that a score is given to each of the match, mismatch, and indel, and the total score is maximized. What is necessary is just to set a score suitably.
- a scoring system may be set as shown in Table 1 above. In Table 1, “-” represents a gap (insertion and / or deletion (indel)).
- the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 shown in Table 5 below correspond to 3 bases at the 3 ′ end (capital part. “Base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end”). ) For global alignment.
- the scoring system is as shown in Table 1.
- alignment can be obtained by a dot matrix method, a dynamic programming method, a word method, or other various methods.
- (F) Second Stage Selection Step This is shown as “(first) second stage selection step” in the block diagram of FIG.
- the second stage selection step based on the global alignment score obtained in the (e) global alignment step, the second stage selection of the primer candidate base sequences created in the (b) primer candidate base sequence creation step is performed. It is a process.
- a global alignment score threshold (second threshold) is set in advance. If the global alignment score is less than the second threshold value, it is determined that the pair of these two base sequences has low dimer formation, and the subsequent steps are performed. On the other hand, if the global alignment score is equal to or higher than the second threshold value, it is determined that the pair of these two base sequences has high dimer formation property, and the subsequent steps are not performed for the pair.
- the second threshold value is not particularly limited and can be set as appropriate. For example, the second threshold value may be set according to PCR conditions such as the amount of genomic DNA used as a template for the polymerase chain reaction.
- the base sequence of the preset base number including the 3 ′ end of the base sequence of each primer is pair-wise globally aligned.
- the global alignment score obtained in this manner can be made less than the second threshold value.
- the global alignment score is “ ⁇ 3”, which is less than the second threshold value “3”. Can do.
- this process is performed with respect to all the pairs for which scores were calculated in the above (e) global alignment process.
- Both the (c) local alignment process and the (d) first stage selection process are performed before or after the (e) global alignment process and (f) the second stage selection process, or (E) You may implement in parallel with both processes of a global alignment process and said (f) 2nd step selection process.
- the combination of (e) the global alignment process and (f) the second stage selection process is performed first, and (f) the second stage selection process is passed.
- a pair of base sequences of candidate primers determined to have low primer dimer formation in the above (d) first stage selection step and (f) second stage selection step may be applied to genomic DNA or chromosomal DNA.
- An amplification sequence length check step may be performed in which the distance between the ends of the primer candidate base sequences is calculated and a determination is made as to whether or not the distance is within a preset range. If the distance between the end portions of the base sequence is within a preset range, it can be determined that there is a high possibility that the primer candidate base sequence pair can appropriately amplify the target region.
- the distance between the ends of the primer candidate base sequences is not particularly limited, and can be set as appropriate depending on the PCR conditions such as the type of the enzyme (DNA polymerase). For example, within the range of 100 to 200 bases (pair), within the range of 120 to 180 bases (pair), within the range of 140 to 180 bases (pair), within the range of 140 to 160 bases (pair), 160 to 180 bases It can be set in various ranges such as within the (pair) range.
- the primer adoption step comprises the steps of (d) the first step selection step and (f) the second step selection step, the candidate primer sequence selected for amplification of the target region. It is a process to adopt as. That is, in this step, for each primer candidate base sequence, the local alignment score obtained by performing pair-wise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence is the first. And a global alignment score obtained by performing global alignment on a pairwise basis for a base sequence having a preset number of bases including the 3 ′ end of each primer candidate base sequence is less than the second threshold value.
- the base sequence of a certain candidate primer is adopted as the base sequence of the primer for amplifying the target region.
- the local alignment score is “ ⁇ 0”, which is less than the first threshold “3”.
- the global alignment score is “ ⁇ 3”, which is less than the second threshold value “3”. Therefore, the base sequence of the candidate primer shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence of the candidate primer shown in SEQ ID NO: 2 can be adopted as the base sequence of the primer for amplifying the target region.
- the 2nd aspect of the design method of the primer and primer set in this invention comprises the following processes.
- a 1 a first target region selection step of selecting a first target region for designing a primer set to be subjected to the polymerase chain reaction from the target region for determining the gene state selected in the target region selection step;
- B 1 At least one base sequence of candidate primers for amplifying the first target region is determined based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the first target region on the genome.
- Creating a first primer candidate base sequence (C 1 )
- For the base sequence of the primer candidate a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence of the primer candidate.
- N-th primer candidate base sequence creating step (C n ) Regarding the base sequence of the candidate primer for amplifying the n-th target region and the base sequence of the primer already employed, the partial sequences to be compared are the base sequence of the candidate primer and the primer sequence already employed.
- An nth first stage selection process (E n ) Pairwise global alignment of a base sequence of a preset sequence length including the base sequence of a candidate primer for amplifying the n-th target region and the 3 ′ end of the base sequence of the primer already employed To obtain a global alignment score, the nth global alignment step, (F n ) Based on the global alignment score obtained in the (e n ) th global alignment step, the second stage selection of the base sequences of candidate primers for amplifying the second target region is performed.
- n is an integer greater than or equal to 2
- steps up to the primer adoption step are repeated for all target regions until the primer base sequence for amplifying the target region is adopted.
- both the (c 1 ) first local alignment step and the (d 1 ) first first stage selection step include the above (e 1 ) first global alignment step and (f 1 ) above. Before or after both steps of the first second stage selection step, or in parallel with both steps of the above (e 1 ) first global alignment step and (f 1 ) the first second stage selection step.
- both the (c n ) th n-th local alignment step and the (d n ) n-th first stage selection step include the (e n ) th global alignment step and the (f n) after or before the two steps of the second-step selection process of the n, or the (e n) of the global alignment process and the (f n) second-step selection process of the n of the n It is performed in parallel with the process.
- (A 1 ) First target region selection step This is shown as “(first) target region selection step” in the block diagram of FIG. Except that one of the target areas is selected as the first target area, it is the same as “(a) target area selection step” of the first aspect described above.
- (B 1 ) First Primer Candidate Base Sequence Creation Step This is shown as “(First) Primer Candidate Base Sequence Creation Step” in the block diagram of FIG. (A 1 ) Except that a base sequence of a candidate primer for amplifying the first target region selected in the first target region selection step is prepared, “ This is the same as “(b) Step of preparing candidate primer base sequence”.
- This step is the same as the “specificity check step” of the first aspect of the design method of the present invention. This step is an optional step and may or may not be performed.
- (C 1 ) First local alignment process This is shown as “(first) local alignment process” in the block diagram of FIG.
- the first of the designing methods of the present invention is that local alignment is performed on the base sequence of the candidate primer for amplifying the first target region created in the above (b 1 ) first primer candidate base sequence creation step. This is the same as “(c) Local alignment step” of the embodiment.
- (D 1 ) First first stage selection process This is shown as “(first) first stage selection process” in the block diagram of FIG.
- candidate primers for amplifying the first target region created in the (b 1 ) first primer candidate base sequence creation step Is the same as “(d) first stage selection step” in the first aspect of the design method of the present invention, except that the selection is performed on the base sequence.
- (E 1 ) First global alignment step This is shown as “(first) global alignment step” in the block diagram of FIG.
- the first of the designing methods of the present invention except that global alignment is performed on the nucleotide sequences of candidate primers for amplifying the first target region created in the above (b 1 ) first candidate primer nucleotide sequence creating step. This is the same as the “(e) global alignment step” in the above aspect.
- (F 1 ) First second stage selection process This is shown as “(first) second stage selection process” in the block diagram of FIG.
- a candidate primer for amplifying the first target region created in the (b 1 ) first primer candidate base sequence creation step Is the same as “(f) the second stage selection step” in the first aspect of the design method of the present invention, except that the selection is performed on the base sequence.
- both the (c 1 ) first local alignment step and the (d 1 ) first first stage selection step are the same as the above (e 1 ) 1 global alignment step and (f 1 ) before or after the first second stage selection step, or (e 1 ) first global alignment step and (f 1 ) You may implement in parallel with both processes of a 1st 2nd step selection process.
- both the (e 1 ) first global alignment step and the (f 1 ) first second stage selection step are performed first, and the (f 1 ) It is preferable to perform both the above-mentioned (c 1 ) first local alignment process and the above-mentioned (d 1 ) first first-stage selection process for the combination that has passed through the first second-stage selection process.
- the effect of reducing the amount of calculation increases, and the overall processing speed can be increased.
- Amplification sequence length check process This is the same as the “amplified sequence length check step” in the first embodiment. This step is an optional step and may or may not be performed.
- (G 1 ) First primer adoption step This is shown as “(first) primer adoption step” in the block diagram of FIG.
- the first aspect of the design method of the present invention except that it is adopted from the base sequence of the candidate primer for amplifying the first target region created in the above (b 1 ) first primer candidate base sequence creation step This is the same as “(g) Primer adoption step”.
- a primer for amplifying the nth (n is an integer of 2 or more) target region is designed.
- (A n ) nth target region selection step This is shown as the “nth target region selection step” in the block diagram of FIG.
- the selection of the nth target region can be performed simultaneously with or after the selection of the (n ⁇ 1) th target region.
- n is an integer of 2 or more.
- (B n ) n-th primer candidate base sequence creation step This is shown as the “n-th primer candidate base sequence creation step” in the block diagram of FIG.
- a base sequence of a candidate primer for amplifying the n-th target region selected in the (a n ) -th target region selection step is prepared. This is the same as “(b) Step of preparing candidate primer base sequence”.
- This step is the same as the “specificity check step” of the first aspect of the design method of the present invention. This step is an optional step and may or may not be performed.
- (C n ) nth local alignment step This is shown as “nth local alignment step” in the block diagram of FIG. (B n ) Except that the primer candidate base sequence for amplifying the n-th target region created in the n-th primer candidate base sequence creating step and local alignment is performed for the primer base sequence already adopted This is the same as “(c) Local alignment step” in the first aspect of the design method of the present invention.
- the base sequences of the primers that have already been adopted are all the base sequences of the primers that are used to amplify the respective target regions from the first target region to the (n-1) th target region.
- the nucleotide sequence (the same applies hereinafter).
- (D n ) nth first stage selection step This is shown as “nth first stage selection step” in the block diagram of FIG. Said (c n) on the basis of the local alignment score was calculated in the local alignment step of the n, the (b n) candidate primers for amplifying a target region of the n created in candidate primer nucleotide sequence creation step of the n
- (E n ) nth global alignment step This is shown as “nth global alignment step” in the block diagram of FIG. (B n ) Except that the base sequence of candidate primers for amplifying the n-th target region prepared in the n-th candidate primer sequence creation step and the base sequence of primers already employed are globally aligned. This is the same as “(e) Global alignment step” in the first aspect of the design method of the present invention.
- (F n ) n-th second stage selection process This is shown as “nth second stage selection process” in the block diagram of FIG.
- Primer candidates for amplifying the n-th target region created in the (b n ) n-th primer candidate base sequence creation step based on the global alignment score obtained in the (e n ) -th global alignment step This is the same as “(f) second stage selection step” in the first aspect of the design method of the present invention, except that selection is performed on the base sequence of and the base sequence of the primer already employed.
- both the (c n ) th n-th local alignment step and the (d n ) n-th first-stage selection step are the same as the steps (e n ) may be carried out before or after the two steps of the global alignment process and the (f n) second-step selection process of the n of the n, the (e n) global alignment process and (f of the n n ) It may be performed in parallel with both steps of the nth second stage selection step.
- both the (e n ) th global alignment step and the (f n ) n second stage selection step are performed first, and the (f n ) th step is performed. It is preferable to perform both the (c n ) th n-th local alignment process and the (d n ) n-th first stage selection process for the combination that has passed through the n second-stage selection process.
- the effect of reducing the amount of calculation increases, and the overall processing speed can be increased.
- Amplification sequence length check process This is the same as the “amplification sequence length check step” of the first aspect of the design method of the present invention. This step is an optional step and may or may not be performed.
- (G n ) n-th primer adoption step This is shown as “n-th primer adoption step” in the block diagram of FIG. Except employing the above (b n) the nucleotide sequence of the candidate primer for amplifying a target region of the n created in candidate primer nucleotide sequence creation step of the n, a first aspect of the design method of the present invention This is the same as “(g) Primer adoption step”.
- Example 1 ⁇ Select target area> Table 8 shows SNPs on chromosomes 13, 18, 21, 21 and X, and Table 9 shows regions specific to the Y chromosome.
- ⁇ Single cell isolation> Pulheral blood sample acquisition
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- 7 mL of peripheral blood is collected into the blood collection tube as volunteer blood after giving informed consent from a pregnant volunteer I got it. Thereafter, the blood was diluted with physiological saline.
- This glass substrate was immersed in the May-Günwald staining solution for 3 minutes, immersed in a phosphate buffer solution and washed, and then diluted with a phosphate buffer solution to a concentration of 3% for 10 minutes. Thereafter, it was washed with pure water and dried to produce a plurality of stained glass substrates.
- an electric XY stage In order to select nucleated red blood cell candidates from cells coated on a slide glass substrate, an electric XY stage, an optical microscope measurement system including an objective lens and a CCD camera, an XY stage controller, and a Z direction controller A control unit including an equipped control unit, an image input unit, an image processing unit, and an XY position recording unit was prepared. Prepared as described above, blood cells applied on a glass slide substrate are placed on an XY stage, focused on the glass slide, scanned, and an image obtained from an optical microscope is captured. A nucleated red blood cell was searched. In the image analysis, cells satisfying the following two conditions were detected, and the XY position was recorded.
- N is the area of the nucleus region of the cell for image analysis
- C is the cytoplasm area of the cell for image analysis
- L is the length of the major axis of the cell nucleus for image analysis. That's it.
- the length of the major axis of the cell nucleus was defined as the length of the ellipse major axis circumscribing the complex-shaped cell nucleus. From the nucleated red blood cells present on the slide glass substrate, those satisfying the above formulas (1) and (2) were selected and used as nucleated red blood cell candidates for the next step.
- Spectral information was analyzed for the nucleated red blood cell candidates identified in the step of identifying the nucleated red blood cells based on the cell morphology information using a microspectroscope. Nucleated erythrocyte candidates on the slide glass substrate were identified, and one of the cells was irradiated with monochromatic light near 415 nm, and the absorption coefficient of the cell was measured. Next, for the leukocytes in which the shape of the nucleus in the vicinity of the cell does not satisfy the above formula (2), three cells are selected from the cells closest to the candidate for the nucleated red blood cell. The absorption coefficient was calculated and the average absorption coefficient 2 was calculated.
- the absorption coefficient was measured for the remaining cells of the nucleated red blood cell candidate on the slide glass substrate, and the average value of the absorption coefficient was calculated for three leukocytes in the vicinity of each cell. From these results, as a result of extracting cells in which the ratio of the absorption coefficient of the nucleated red blood cell candidate to the average absorption coefficient of leukocytes was 1 or more, 8 cells clearly having 1 or more were detected.
- Cell recovery Eight cells determined as described above were harvested using a micromanipulator.
- a primer set for amplifying the target region has a sequence length of 20 bp, a Tm value in the range of 56 to 64 ° C., and a PCR amplification product size of 140 to 180 base pairs.
- a primer set that is designed to be within the range, and from among these, the 3 'end-fixed local alignment score between each primer is less than 3, and the 3' end 3 base global alignment score of each primer is 0 25 sets were selected (Table 10).
- each prepared primer set was confirmed by single plex PCR.
- 2 ⁇ L of the prepared genomic DNA 0.5 ng / ⁇ L
- 2 ⁇ L of primer mix 12.5 ⁇ L of multiplex PCR mix 2
- 0.125 ⁇ L of multiplex PCR mix 1 0.125 ⁇ L of multiplex PCR mix 1 and an appropriate amount of water were mixed to obtain the final solution.
- a volume of 25 ⁇ L of reaction solution was prepared.
- the primer mix is a mixture of each primer constituting one primer set so that the final concentration of the primer is 50 nM.
- the multiplex PCR mix 1 and the multiplex PCR mix 2 are multiplex PCR.
- ⁇ Amplification by polymerase chain reaction Multiplex PCR was performed using 25 types of primer sets in which amplification by single plex PCR was confirmed. Specifically, the prepared genomic DNA (0.5 ng / ⁇ L) 2 ⁇ L, 25 sets of primer mix 2 ⁇ L, multiplex PCR mix 2 12.5 ⁇ L, multiplex PCR mix 1 0.125 ⁇ L, and an appropriate amount of water were mixed, A final solution volume of 25 ⁇ L was prepared.
- the 25-set primer mix is a mixture of the primers constituting 25 types of primer sets whose amplification by single plex PCR has been confirmed so that the final concentration is 50 nM, and the multiplex PCR mix 1
- the multiplex PCR mix 2 is a reagent contained in a multiplex PCR assay kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Using the prepared reaction solution, initial thermal denaturation at 94 ° C. for 60 seconds was performed, and thermal cycles of thermal denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 90 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds were repeated 30 cycles. Plex PCR was performed.
- the obtained multiplex PCR product was purified using an AMPure XP kit (manufactured by Beckman Coulter). 45 ⁇ L of AMPure XP was added to 25 ⁇ L of the reaction solution, and the PCR reaction product was bound to the magnetic beads. The magnetic beads were separated by the magnetic force of Magna Stand (manufactured by Nippon Genetics) to remove impurities. After washing with 70% ethanol, the nucleic acid bound to the magnetic beads was eluted with a TE (Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -EDTA: tris-ethylenediaminetetraacetic acid) buffer.
- TE Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane)
- the multiplex PCR mix 1 and the multiplex PCR mix 2 are reagents contained in a multiplex PCR assay kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
- the obtained PCR product was purified using an AMPure XP kit, and quantified using a KAPA library quantification kit (manufactured by Nippon Genetics) as an accurate quantification of the amplified product.
- the amplification product was sequenced in the same manner as in Example 1 except that multiplex PCR was performed using these primer pairs. As a result, the mapping rate was remarkably reduced, and the dispersion of the amount of amplified product between cells was large, so that the variation was so great that numerical abnormality could not be clearly determined.
- the present invention is a technique for analyzing a single cell derived from a fetus, and the detection region can include a genetic polymorphism site and a somatic mutation site that are already known. However, it is possible to determine the gene status.
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Abstract
ヒトゲノム上の領域から遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、母体血試料から単一細胞を単離する工程と、単一細胞からゲノムDNAを抽出する工程と、単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、目的領域をPCR増幅する工程と、目的領域のPCR増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、とを備え、目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットは、ローカルアラインメントスコアに基づく第1段階選抜工程と、グローバルアラインメントスコアに基づく第2段階選抜工程とを有するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法が提供される。
Description
本発明は、胎児の遺伝子状態を判定する方法に関する。
出生前診断として、従来、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われてきた。しかし、この方法では、流産の可能性があることが、大きな問題として指摘されている。
安全な出生前診断として、最近では、母体血液中に母親の無細胞DNA(Deoxyribonucleic acid:デオキシリボ核酸)と混在して存在する胎児由来の無細胞DNAを分析する方法で出生前診断が行われるようになった。この方法は、非侵襲性であり、胎児の遺伝的情報を高い確率で取得できる方法として注目を集めている。特許文献1には、胎児の母親由来のDNAと胎児由来のDNAの混合試料から測定された遺伝子型データ、および必要に応じて、母親および父親からの遺伝子型データを利用して妊娠中の胎児における染色体の倍数性状態を決定するための方法が記載されている。
一方、母体の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが知られている。このような胎児細胞中のゲノムDNAを再現性よく確実に分析することが可能となれば、流産の可能性のない、安全で、しかも直接胎児由来のDNAを分析する出生前診断が実現できることとなる。
しかし、母体の血液中に存在する胎児細胞(例えば、胎児有核赤血球)は、母体血の数mL中に1個程度しか存在しないことが理解されるようになったことから、胎児細胞を確実に取得する方法が種々検討されている。このような公知の技術を用いて希少な胎児細胞を確実に選別した場合に得られる胎児細胞の数は、高々数個、あるいは1つに限られる場合がある。
細胞中のDNAを増幅する増幅技術に関して、特許文献1には、複数のプライマーセットを用いてマルチプレックスPCR(Polymerase Chain Reaction:ポリメラーゼ連鎖反応)により複数の関心対象座を増幅し、突然変異および染色体異常などの遺伝子疾患を検出する方法が記載されている。また、特許文献2には、胎児由来のゲノムDNAの特定の配列を、高度多重標的化ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、シークエンサーで各標的遺伝子座における対立遺伝子頻度を決定する方法が開示されている。
2つ以上の増幅対象領域を一つの反応系で同時に増幅する反応としてマルチプレックスPCRが知られている。マルチプレックスPCRは微量の血液から抽出される少量のDNAから増幅対象領域を効率よく増幅し、多数のSNPs(Single Nucleotide Polymorphisms:一塩基多型)をタイピングするのに有用な技術であることが知られている。特許文献3には、複数の増幅部位(ターゲット)を効率よく増幅できるマルチプレックスPCR用のプライマー設計方法が開示されている。
胎児由来の有核赤血球を分離し、公知の技術を用いて、取得した細胞中のDNAを分析して胎児の遺伝子状態を判定するためには、単一細胞からDNAを抽出して解析に必要な量まで増幅を行う必要があり、全ゲノム増幅が行われる場合が多い。
しかし、全ゲノム増幅は、一細胞から抽出した微量のゲノムDNAを飛躍的に増加させるという利点を有するものの、増幅領域により増幅倍率を一定に保つことが難しく、増幅によりPCR産物にバイアスがかかるという欠点があった。
そのため、全ゲノム増幅を行わなかったとしても、単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として目的領域のPCR増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態の判定をする方法が求められている。
しかし、全ゲノム増幅は、一細胞から抽出した微量のゲノムDNAを飛躍的に増加させるという利点を有するものの、増幅領域により増幅倍率を一定に保つことが難しく、増幅によりPCR産物にバイアスがかかるという欠点があった。
そのため、全ゲノム増幅を行わなかったとしても、単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として目的領域のPCR増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態の判定をする方法が求められている。
そこで、本発明は、目的領域のポリメラーゼ連鎖反応(PCR: Polymerase Chain Reaction)による増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態を判定する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーダイマー形成性の評価を、プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下で、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求め、求めたローカルアラインメントスコアに基づいて第1段階の選抜を行い、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求め、求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて第2段階の選抜を行い、第1段階および第2段階のいずれにおいても選抜されたプライマーを採用すると、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを得られることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、次の(1)~(6)である。
(1)胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、
上記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、上記目的領域選択工程は、上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、
上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
上記第1段階選抜工程および上記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第1段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(2)上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
上記第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
上記第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
上記第1の第1段階選抜工程および上記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
上記第2のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
上記第2のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
上記第2の第1段階選抜工程および上記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第1のローカルアラインメント工程および上記第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第2のローカルアラインメント工程および上記第2の第1段階選抜工程の両工程は、上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が3箇所以上である場合は、上記第2の標的領域選択工程から上記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記(1)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(3)上記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも上記ゲノムDNA抽出工程から上記DNAシークエンシング工程までを繰り返す、上記(1)または(2)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(4)上記遺伝子状態が染色体の数的異常である、上記(1)~(3)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(5)上記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と上記DNAシークエンシング工程との間に、さらに、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、上記(1)~(4)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(6)上記DNAシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、上記(1)~(5)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(1)胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、
上記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、上記目的領域選択工程は、上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または上記単一細胞単離工程および上記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、
上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
上記第1段階選抜工程および上記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第1段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(2)上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
上記第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
上記第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
上記第1の第1段階選抜工程および上記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
上記第2のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
上記第2のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
上記第2の第1段階選抜工程および上記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第1のローカルアラインメント工程および上記第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第2のローカルアラインメント工程および上記第2の第1段階選抜工程の両工程は、上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が3箇所以上である場合は、上記第2の標的領域選択工程から上記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記(1)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(3)上記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも上記ゲノムDNA抽出工程から上記DNAシークエンシング工程までを繰り返す、上記(1)または(2)に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(4)上記遺伝子状態が染色体の数的異常である、上記(1)~(3)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(5)上記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と上記DNAシークエンシング工程との間に、さらに、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、上記(1)~(4)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
(6)上記DNAシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、上記(1)~(5)のいずれか1つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
本発明によれば、目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態を判定する方法を提供することができる。
また、本発明によれば、目的領域における遺伝子配列決定を、短い工程で、確実に、効率良く行えるようになる。
本発明は、概して、基板上に固定した細胞を剥離してゲノムDNAを抽出し、増幅対象領域のDNA増幅を行って、胎児由来の有核赤血球の遺伝子状態を判定する技術に関する。より詳細には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅対象領域のDNA増幅を行う際に、プライマー間の相補性が低下するように設計したプライマーを用いてDNA増幅を行うことによって、作業工程を短くし、複数細胞間においてPCR増幅産物の量がばらつく課題を解決する技術に関するものである。
従来の非侵襲的出生前診断は、母体血液中に母親の無細胞DNAと混在して存在する胎児由来の無細胞DNAを分析する方法である。この方法は、胎児染色体の数的異常を検出する方法として有用であるが、母親の無細胞DNAと胎児由来の無細胞DNAが混在した状態で分析するため、数的異常以外の遺伝子状態を判定することが難しいという欠点を有する。これに対して、本発明は、胎児由来の単一細胞を解析する技術であり、検出領域には、既に公知である遺伝的多型部位および/または体細胞突然変異部位を含むことが可能であるので、数的異常に限らない遺伝子状態を判定することが可能である。
増幅産物の配列解析において、増幅産物を効率よく解析するためには、シークエンスライブラリーに混入するプライマーダイマーのような非特異産物を減少させて、精度よく増幅を行う必要がある。本発明では、ポリメラーゼ連鎖反応に使用するプライマーおよびプライマーセットの設計方法を改良し、単一細胞の非常に少ないDNAからでも様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に胎児の遺伝子異常の有無を検出することを可能にした。
以下、本発明の胎児の遺伝子状態を判定する方法について説明する。
本発明の胎児の遺伝子状態を判定する方法は、ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、上記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、上記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をPCR増幅するPCR増幅工程と、上記目的領域のPCR増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、を備え、ここで、前記目的領域選択工程は、前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、上記目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットは、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において説明するプライマーおよびプライマーセットの設計方法によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法である。
〈目的領域選択工程〉
目的領域選択工程では、ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する。
目的領域選択工程では、ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する。
(ヒトゲノム上の領域)
本発明において「ヒトゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患および/またはがん等に関係する部位が存在するゲノムDNA上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、1塩基以上であればよい。
目的領域が選択されるヒトゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームRNA(Ribonucleic acid:リボ核酸)遺伝子およびトランスファーRNA遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、5’-リーダー配列および3’-トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
本発明において「ヒトゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患および/またはがん等に関係する部位が存在するゲノムDNA上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、1塩基以上であればよい。
目的領域が選択されるヒトゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームRNA(Ribonucleic acid:リボ核酸)遺伝子およびトランスファーRNA遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、5’-リーダー配列および3’-トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
遺伝子多型は、例えば、SNP(Single Nucleotide Polymorphism:一塩基多型)、SNV(Single Nucleotide Variant:一塩基変異)、STRP(Short Tandem Repeat Polymorphism:縦列型反復配列多型)、ミューテーション、ならびに挿入および/または欠失(インデル)などである。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに/または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および/もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、SNPの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性(家族性)のがんが存在し、遺伝子腫瘍(家族性腫瘍)などと称される。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに/または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および/もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、SNPの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性(家族性)のがんが存在し、遺伝子腫瘍(家族性腫瘍)などと称される。
ヒトゲノム上の領域の数は特に限定されない。ヒトゲノム上の領域は、目的領域を選択する際の候補リストであり、膨大な数がリストされていたとしても、そのすべてについて解析しなければならないわけではないからである。
(目的領域)
目的領域は、上記ヒトゲノム上の領域から、遺伝子状態を判定する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、またはがん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は1つに限定されず、2つ以上の目的を有していてもよい。
目的領域は、上記ヒトゲノム上の領域から、遺伝子状態を判定する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、またはがん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は1つに限定されず、2つ以上の目的を有していてもよい。
目的領域として選択するヒトゲノム上の領域の数は、目的とする遺伝子状態により異なり、1箇所以上であれば特に限定されないが、好ましくは3箇所以上、より好ましくは5箇所以上、さらに好ましくは10箇所以上である。
(遺伝子状態の判定)
単一遺伝子の異常が疾患の原因となるメンデル遺伝性疾患について、検出を所望する原因遺伝子をOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man:オンライン・ヒトメンデル遺伝形質)データベースから選択し、検査したい変異箇所の数のプライマーを設計する。設計したプライマーセットを用いて、胎児有核赤血球から抽出したゲノムDNAの標的遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列をシークエンサーで求める。解読した塩基配列を健常なリファレンスゲノムと比較したとき、遺伝子の欠失、重複、逆位および/または転座を認めた場合、胎児が遺伝子疾患を有すると予想される。
単一遺伝子の異常が疾患の原因となるメンデル遺伝性疾患について、検出を所望する原因遺伝子をOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man:オンライン・ヒトメンデル遺伝形質)データベースから選択し、検査したい変異箇所の数のプライマーを設計する。設計したプライマーセットを用いて、胎児有核赤血球から抽出したゲノムDNAの標的遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列をシークエンサーで求める。解読した塩基配列を健常なリファレンスゲノムと比較したとき、遺伝子の欠失、重複、逆位および/または転座を認めた場合、胎児が遺伝子疾患を有すると予想される。
〈単一細胞単離工程〉
単一細胞単離工程では、母体血試料から単一細胞を単離する。
単一細胞単離工程では、母体血試料から単一細胞を単離する。
母体血試料は、母体(妊婦)から採取した血液試料であれば特に限定されないが、母体の末梢血が好ましい。母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球およびリンパ球等の白血球、ならびに核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球および胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後6週程度から母体血中に存在するといわれている。そのため、本発明では、妊娠後6週程度以降の妊婦の末梢血を検査することが好ましい。
単一細胞は、胎児由来のものであれば特に限定されないが、胎児由来の有核赤血球が好ましい。胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中は、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の106個に1個程度の割合で存在しているといわれており、妊婦の抹消血中の存在確率は非常に小さい。
(胎児有核赤血球の濃縮)
国際公開第2012/023298号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065~1.095g/mL程度である。一方、母体の血球の密度は、赤血球が1.070~1.120g/mL程度であり、好酸球は1.090~1.110g/mL程度であり、好中球は1.075~1.100g/mL程度であり、好塩基球は1.070~1.080g/mL程度であり、リンパ球は1.060~1.080g/mL程度であり、単核球は1.060~1.070g/mL程度である。
国際公開第2012/023298号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065~1.095g/mL程度である。一方、母体の血球の密度は、赤血球が1.070~1.120g/mL程度であり、好酸球は1.090~1.110g/mL程度であり、好中球は1.075~1.100g/mL程度であり、好塩基球は1.070~1.080g/mL程度であり、リンパ球は1.060~1.080g/mL程度であり、単核球は1.060~1.070g/mL程度である。
単一細胞を単離する際の好ましい実施態様として、密度勾配遠心分離を用いて、胎児由来の有核赤血球を濃縮することが可能である。この態様で使用する、第一の媒体および第二の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径15~30nmのケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール(Percoll,GEヘルスケアバイオサイエンス社製)、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコールパック(Ficoll-Paque,GEヘルスケアバイオサイエンス社製)、および/またはポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック(Histopaque,シグマアルドリッチ社製)等の媒体を使用することができる。
本発明では、パーコールおよびヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度1.130g/cm3(比重1.130)の製品が市販されており、希釈することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。また、ヒストパックは、密度1.077g/cm3(比重1.077)の媒体および密度1.119g/cm3(比重1.119)の媒体が市販されており、これらを混合することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。パーコールおよびヒストパックを使用することによって、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
本発明では、パーコールおよびヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度1.130g/cm3(比重1.130)の製品が市販されており、希釈することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。また、ヒストパックは、密度1.077g/cm3(比重1.077)の媒体および密度1.119g/cm3(比重1.119)の媒体が市販されており、これらを混合することによって、目的とする密度(比重)の媒体を調製することができる。パーコールおよびヒストパックを使用することによって、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
密度が1.065~1.095g/mL程度である、胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。胎児由来の有核赤血球の中心密度は、1.080g/mL程度であるため、この中心密度を挟む2つの異なる密度の媒体(第一の媒体および第二の媒体)を作成し、隣接して重層すると、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、第一の媒体の密度を1.080g/mL以上、1.100g/mL以下に設定し、第二の媒体の密度を1.060g/mL以上、1.080g/mL以下に設定する。より好ましくは、第一の媒体の密度を1.080g/mL以上、1.090g/mL以下に設定し、第二の媒体の密度を1.065g/mL以上、1.080g/mL以下に設定する。具体的な一実施態様としては、第一の媒体の密度を1.085g/mLに、および第二の媒体の密度を1.075g/mLに、それぞれ設定して、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが好ましい。また、このように設定することによって、赤血球、好中球およびリンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第一の媒体および第二の媒体は、同じ種類の媒体であってよいし、異なる種類の媒体であってもよいが、好ましくは同じ種類の媒体である。
(有核赤血球候補の単離)
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板(血球細胞標本)を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板(血球細胞標本)を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
血球細胞標本から得られる血球細胞の形態情報に基づいて、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。好ましい実施態様としては、細胞の、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合いおよび/または核領域の面積等を利用して、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。特に、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合または核の円形度合いが条件を満足する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。
一例として、本発明では、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合「N/C」が下記式(1)を満足する細胞を選別することが好ましい。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
ただし、式(1)中、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
ただし、式(1)中、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
別の一例として、本発明では、核の長径の長さの平方に対する核領域の面積の割合「N/L2」が下記式(2)を満足する細胞を選別することが好ましい。
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ただし、式(2)中、「N」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ただし、式(2)中、「N」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補を選別するシステムは、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理PC、制御PC、およびディスプレイを装備している。光学搬送系は、対物レンズおよびCCDカメラを備える。画像処理PCは、データ解析およびデータ記憶を行う処理系を備える。制御PCは、スライドガラス用のステージの位置制御および全体の処理を制御する制御系を備える。
人を含むすべての脊椎動物の血液中にある赤血球に存在する蛋白質がヘモグロビンである。有核赤血球は、血液中の有核細胞の1種である白血球とはヘモグロビンの有無が異なる。ヘモグロビンは、酸素と結合した場合、鮮明な赤色を呈する酸化ヘモグロビン、酸素と結合していない場合、暗赤色を呈する還元ヘモグロビンであり、動脈中および静脈中には、酸素結合量が異なるヘモグロビンが流れている。ヘモグロビンは、380nm~650nmに吸収を持つため、この波長領域の吸光度の違いに起因する少なくとも1つの単色光の情報でヘモグロビンを検出することが可能である。ヘモグロビンの存在を確認するには単色光を用いることが好ましく、ヘモグロビンの吸収が大きい400nm~500nmの波長領域の単波長の光、または525nm~580nmの波長領域の単色光を選択することができる。これらの波長領域の吸収係数は、ヘモグロビンが存在することで高い値を示すため、白血球の細胞質の吸収係数との比は1以上となる。
実施態様として、円形に近い細胞核が存在する細胞で、しかもヘモグロビンを有する細胞を、有核赤血球の候補として識別することが可能である。さらに、胎児由来の有核赤血球および成人由来の有核赤血球は、胎児のヘモグロビンがヘモグロビンF(HbF)であり、成人のヘモグロビンがヘモグロビンA(HbA)であることから、異なる酸素結合能力により生じる分光特性の差異を利用して、胎児由来の有核赤血球を選別することが可能である。
細胞質の吸収係数を測定する場合には、顕微分光光度計を用いることができる。顕微分光光度計は、通常の分光光度計と同じ原理を、顕微鏡の光学系を利用する光度計であり、市販の装置を使用することが可能である。
本発明の好ましい実施態様では、マイクロマニュピュレーターにより透明基板上から単一の細胞を剥離して細胞を取得することが可能である。
細胞の形態情報および/または吸光度のみによっては、単離した有核赤血球が胎児由来であるか、または母体(妊婦)由来であるかの確定をすることができない場合がある。しかし、本発明においては、SNPおよび/またはSTR(Short Tandem Repeat:短鎖縦列反復配列)等による多型解析、ならびにY染色体の存在の確認など、DNA解析によって、単離した有核赤血球の由来を判別することができる。DNA解析は、後述のDNAシークエンシング工程の「(胎児有核赤血球の同定)」において説明するとおり、遺伝子状態の判定と同時に行うことが可能である。
〈ゲノムDNA抽出工程〉
ゲノムDNA抽出工程では、上記「〈単一細胞単離工程〉」において単離した単一細胞からゲノムDNAを抽出する。
ゲノムDNA抽出工程では、上記「〈単一細胞単離工程〉」において単離した単一細胞からゲノムDNAを抽出する。
〈PCR増幅工程〉
PCR増幅工程では、上記「〈ゲノムDNA抽出工程〉」において抽出したゲノムDNAを鋳型として、目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をPCR増幅する。なお、「目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセット」の設計方法については、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において、詳細に説明する。
PCR増幅工程では、上記「〈ゲノムDNA抽出工程〉」において抽出したゲノムDNAを鋳型として、目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をPCR増幅する。なお、「目的領域をPCR増幅するように設計されたプライマーセット」の設計方法については、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において、詳細に説明する。
(ポリメラーゼ連鎖反応)
ポリメラーゼ連鎖反応は、DNAポリメラーゼを使用して鋳型DNAを繰り返し複製させる。増幅させるDNA塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型DNAとハイブリダイズする短いDNAプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型2本鎖DNAの2本の鎖が解離し別々に複製される。
ポリメラーゼ連鎖反応は、DNAポリメラーゼを使用して鋳型DNAを繰り返し複製させる。増幅させるDNA塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型DNAとハイブリダイズする短いDNAプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型2本鎖DNAの2本の鎖が解離し別々に複製される。
マルチプレックスPCRは、一般的なPCRに用いられる耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、夫々のプライマー対が鋳型DNAにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスPCRに最適化された耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、マルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)を用いて反応することがより好ましい。
プライマーおよびプライマーセットの設計方法についての詳細は後述するため、ここでは、例示として、13番、18番および/または21番染色体の異数性を検出する場合の概略を述べる。
目的領域の数は、13番、18番および/または21番染色体の異数性を検出する場合では、上記染色体に特異的なDNA配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の標的領域を選択して、各標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、単一細胞のような微量のゲノムDNAに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
目的領域の数は、13番、18番および/または21番染色体の異数性を検出する場合では、上記染色体に特異的なDNA配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の標的領域を選択して、各標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、単一細胞のような微量のゲノムDNAに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
次世代シークエンサー技術は飛躍的に進化しているものの、シークエンス解析に用いるサンプルの調製は非常に複雑な工程が必要となる。サンプルの前処理は、最も広く応用されているゲノム解析の場合、サンプルから核酸の抽出後、(1)DNAの断片化、(2)DNAサイズセレクション、(3)DNA末端の平滑化処理、(4)DNA末端へのアダプター配列の付加、(5)DNAの精製、および(6)DNAの増幅というプロセスを必要とする。
複雑なサンプル調整工程は時間および労力を要し、工程が適切に行われていることを確認しなければならない。また、各工程においてバイアスが生じていくため、特に結果の精度および確度を高いレベルで要求される医療現場での診断ツールとしての使用に際しては、このバイアスを減らす必要がある。
これらを解決するために、本発明においては、後述する特定の方法を用いて設計したプライマーを用いてマルチプレックスPCRを行うことによって、遺伝子状態を判別するために選択した目的領域のより均一な増幅が可能となる。さらに、PCR産物を磁性ビーズにより精製することによって、より効果的な増幅産物の回収が可能となる。PCR反応溶液中には、余剰のプライマー、dNTPs(Deoxynucleotides:デオキシヌクレオチド)、および酵素等の夾雑物が残留しているため、高精度のシークエンスデータを得る際の障害となる場合がある。しかし、PCR増幅産物を、磁性ビーズを用いて精製することによって、PCR増幅産物の損失を著しく抑制しながら、十分な精製を行うことができる。この場合、単一細胞の非常に少ないDNAからでも、(1)DNAの増幅、および(2)DNAの精製という、シンプルなサンプル調整工程のみで、様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に胎児の遺伝子異常の有無を検出する方法を用いることが好ましい。
増幅されたDNAの量の測定は、例えば、260nmの波長の吸収度を測定する超微量分光光度計ナノドロップ(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)、レーザー蛍光検出法を用いたAgilent 2100バイオアナライザ(アジレント社製)、または蛍光法により2本鎖DNAを定量するQuantusフルオロメーター(プロメガ社製)等を用いて行うことが可能である。
〈PCR増幅産物の精製工程〉
PCR増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。
核酸の精製方法としては、例えば、フェノール/クロロホルム/エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびPEG(Polyethylene glycol:ポリエチレングリコール)存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、マルチプレックスPCR増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製法を選択することができる。
PCR増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。
核酸の精製方法としては、例えば、フェノール/クロロホルム/エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびPEG(Polyethylene glycol:ポリエチレングリコール)存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、マルチプレックスPCR増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製法を選択することができる。
(磁性ビーズ精製工程)
PCR増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。磁性ビーズを利用した精製方法は、磁性ビーズの粒子表面に核酸を可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したDNA断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、dNTPs、PCRプライマー、プライマーダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、DNAシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。
磁性ビーズは市販されており、例えば、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)、NucleoMag(タカラバイオ社製)、またはEpiNext DNA Purification HT System(エピジェンテック社製)等を用いることができる。なかでも、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製することが好ましい。
PCR増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。磁性ビーズを利用した精製方法は、磁性ビーズの粒子表面に核酸を可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したDNA断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、dNTPs、PCRプライマー、プライマーダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、DNAシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。
磁性ビーズは市販されており、例えば、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)、NucleoMag(タカラバイオ社製)、またはEpiNext DNA Purification HT System(エピジェンテック社製)等を用いることができる。なかでも、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製することが好ましい。
〈DNAシークエンシング工程〉
PCR増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、MiSeq(イルミナ社製)を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスPCR産物を次世代シークエンサー「MiSeq」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスPCR産物に6~8塩基で構成されるサンプル識別配列(インデックス配列)ならびにMiSeqフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのP5配列およびP7配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大96種類のマルチプレックスPCR産物を1回で測定することが可能である。
インデックス配列、P5配列およびP7配列をマルチプレックスPCR産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはPCR法などを用いることが可能である。
PCR増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、MiSeq(イルミナ社製)を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスPCR産物を次世代シークエンサー「MiSeq」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスPCR産物に6~8塩基で構成されるサンプル識別配列(インデックス配列)ならびにMiSeqフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのP5配列およびP7配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大96種類のマルチプレックスPCR産物を1回で測定することが可能である。
インデックス配列、P5配列およびP7配列をマルチプレックスPCR産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはPCR法などを用いることが可能である。
また、複数のマルチプレックスPCR産物を混合してMiSeqで測定する場合には、それぞれのPCR産物を正確に定量することが望ましい。PCR産物の定量方法としては、Agilent 2100バイオアナライザ(アジレント社製)またはQuantusフルオロメーター(プロメガ社)を用いることも可能であるが、マルチプレックスPCR産物を定量PCR法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、KAPAライブラリー定量キット(日本ジェネティクス社製)を用いて定量することが好ましい。
MiSeqで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、BWA(Burrows-Wheeler Aligner;バーロウズ-ホィーラー・アライナー:Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、p.1754-1760.;Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、p.589-595)を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、SAMtools(Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、p.2078-2079;SAMは“Sequence Alignment/Map”に由来する。)、および/またはBEDtools(Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、p.841-842)を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
MiSeqで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、BWA(Burrows-Wheeler Aligner;バーロウズ-ホィーラー・アライナー:Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、p.1754-1760.;Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、p.589-595)を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、SAMtools(Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、p.2078-2079;SAMは“Sequence Alignment/Map”に由来する。)、および/またはBEDtools(Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、p.841-842)を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
(配列リード数の決定)
DNAシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的領域をPCR増幅して得たDNA断片に対して、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求めることができる。基準(あるいは参照)として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)と、母親由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、1:1.5(または2:3)となることが予想される。
DNAシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的領域をPCR増幅して得たDNA断片に対して、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求めることができる。基準(あるいは参照)として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された140bp以上180bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量(配列リード数)をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)と、母親由来の増幅産物の増幅量(配列リード数)とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、1:1.5(または2:3)となることが予想される。
本発明においては、あらかじめ、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母親由来のPCR増幅産物の量(配列リード数)に対する胎児由来のPCR増幅産物の量(配列リード数)の比を複数求め、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠した場合の母親由来の増幅産物の量(配列リード数)に対する胎児由来の増幅産物の量(配列リード数)の比を複数求め、その分布を求める。この2つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定することもできる。この、あらかじめ決定したカットオフ値と、増幅産物の比を求めた結果とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである、と検査結果を解釈することも可能である。
結果が得られない場合には、母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程に戻って、再度、本発明の方法を実施してもよい。
(単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認)
単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認を行って、胎児由来の単一細胞の遺伝子状態の判定を行ったことを確定させてもよい。
妊娠母体から採取した抹消血の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球が混在していることが知られており、本発明の方法は胎児の遺伝子状態を判定しながら、胎児由来の有核赤血球を同定することができる。遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にSTRも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、1%以上の頻度で観察されるSNPsも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、有核赤血球の中に、異なるSTRまたはSNPsを有する細胞の有無により、胎児細胞と、母親細胞を識別することもできる。また、別に遺伝子状態の判定に補助的な情報を使って、胎児由来の有核赤血球か否かを判定するには、例えば、母親由来の白血球を取得して、同様にSTRまたはSNPsを分析することによって、行うことができる。
単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認を行って、胎児由来の単一細胞の遺伝子状態の判定を行ったことを確定させてもよい。
妊娠母体から採取した抹消血の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球が混在していることが知られており、本発明の方法は胎児の遺伝子状態を判定しながら、胎児由来の有核赤血球を同定することができる。遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にSTRも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、1%以上の頻度で観察されるSNPsも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、有核赤血球の中に、異なるSTRまたはSNPsを有する細胞の有無により、胎児細胞と、母親細胞を識別することもできる。また、別に遺伝子状態の判定に補助的な情報を使って、胎児由来の有核赤血球か否かを判定するには、例えば、母親由来の白血球を取得して、同様にSTRまたはSNPsを分析することによって、行うことができる。
また、有核赤血球を採取する前に超音波検査で胎児が男児であると確認されている場合であれば、採取した有核赤血球のY染色体の有無を検出することによって、有核赤血球が胎児由来であるか否かを判定することができる。一般的に、採取した細胞のY染色体の有無を検出する方法としては、Y染色体特異的な蛍光プローブを用いるFISH(Fluorescent in situ hybridization:蛍光in situ ハイブリダイゼーション)法が知られている。一例としては、CEP X/Y DNAプローブキット(アボット社製)が使用されている。本発明では、Y染色体に特異的な塩基配列を持つプライマーを作製しPCRを用い、その増幅有無を確認することで男児の胎児由来の有核赤血球であることを同定することが好ましい。
〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉
本発明の特徴的な点の一つである、プライマーおよびプライマーセットの設計方法は、概していえば、複数の特定の標的領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、標的領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得る。プライマー配列の相補性の確認は、ローカルアライメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマー配列の端部に対して、グローバルアライメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点に特徴がある。以下に詳細に説明する。
本発明の特徴的な点の一つである、プライマーおよびプライマーセットの設計方法は、概していえば、複数の特定の標的領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、標的領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得る。プライマー配列の相補性の確認は、ローカルアライメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマー配列の端部に対して、グローバルアライメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点に特徴がある。以下に詳細に説明する。
本発明における、プライマーおよびプライマーセットの設計方法の第1の態様は、以下の工程を備える。
(a)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
(b)上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
(d)上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
(e)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
(f)上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
(g)上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記(c)ローカルアラインメント工程および上記(d)第1段階選抜工程の両工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
(a)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
(b)上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
(d)上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
(e)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
(f)上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
(g)上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記(c)ローカルアラインメント工程および上記(d)第1段階選抜工程の両工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
本発明におけるプライマーおよびプライマーセットの設計方法の第1の態様の各工程について詳細に説明する。
(a)標的領域選択工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、目的領域選択工程において、ヒトゲノム上の領域から選択された胎児の遺伝子状態を判定するための目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、目的領域選択工程において、ヒトゲノム上の領域から選択された胎児の遺伝子状態を判定するための目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する工程である。
(標的領域)
標的領域は、上記目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する対象として選択された領域である。
標的領域は、上記目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する対象として選択された領域である。
(ポリメラーゼ連鎖反応)
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAポリメラーゼを用いて、鋳型DNAからDNAを合成する反応である。細胞内でのDNA合成とは異なり、PCRでは、DNAを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが1種類以上、通常は2種類以上、必要となる。1つのPCR反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
PCRは、1ペアのプライマーセットを用いて1つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系(マルチプレックスPCR)まで、容易に拡張することができる。
PCRの利点は、ヒトのゲノム(30億塩基対)のような非常に長大なDNA分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムDNAを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、PCRの利点としては、プログラムにもよるが、概ね、増幅に要する時間が2時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、PCRの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAポリメラーゼを用いて、鋳型DNAからDNAを合成する反応である。細胞内でのDNA合成とは異なり、PCRでは、DNAを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが1種類以上、通常は2種類以上、必要となる。1つのPCR反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
PCRは、1ペアのプライマーセットを用いて1つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系(マルチプレックスPCR)まで、容易に拡張することができる。
PCRの利点は、ヒトのゲノム(30億塩基対)のような非常に長大なDNA分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムDNAを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、PCRの利点としては、プログラムにもよるが、概ね、増幅に要する時間が2時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、PCRの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
(b)プライマー候補塩基配列作成工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
標的領域の近傍領域とは、標的領域の5’端から外側の領域、および標的領域の3’端から外側の領域を総称していう。標的領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、PCRによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するDNAフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および/またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。PCRにおいて用いる酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは20~500塩基程度、より好ましくは20~300塩基程度、さらに好ましくは20~200塩基程度、いっそう好ましくは50~200塩基程度である。
近傍領域の長さは特に限定されないが、PCRによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するDNAフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および/またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。PCRにおいて用いる酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは20~500塩基程度、より好ましくは20~300塩基程度、さらに好ましくは20~200塩基程度、いっそう好ましくは50~200塩基程度である。
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、GC含量(全核酸塩基中のグアニン(G)およびシトシン(C)の合計モル百分率をいう。)、Tm値(二本鎖DNAの50%が解離して一本鎖DNAになる温度である。Tmはmelting temperatureに由来する。)、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
プライマーの長さ(ヌクレオチド数)は、特に限定されないが、好ましくは15mer~45mer、より好ましくは20mer~45mer、さらに好ましくは20mer~30merである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
GC含量は、特に限定されないが、好ましくは40モル%~60モル%、より好ましくは45モル%~55モル%である。GC含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
Tm値は、特に限定されないが、好ましくは50℃~65℃の範囲内、より好ましくは55℃~65℃の範囲内である。
Tm値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のA、T、GおよびCの数(それぞれ、nA、nT、nGおよびnCとする)から、下記式によって計算により求めることもできる。
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってTm値を算出することができる。
Tm値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のA、T、GおよびCの数(それぞれ、nA、nT、nGおよびnCとする)から、下記式によって計算により求めることもできる。
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってTm値を算出することができる。
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にGCリッチな配列および部分的にATリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Tおよび/またはCの連続(ポリピリミジン)、ならびにAおよび/またはGの連続(ポリプリン)も避けることが望ましい。
また、Tおよび/またはCの連続(ポリピリミジン)、ならびにAおよび/またはGの連続(ポリプリン)も避けることが望ましい。
さらに、3’末端塩基配列が、GCリッチな配列またはATリッチな配列を避けることが好ましい。3’末端塩基はGまたはCが好ましいが、これらに限定はされない。
(特異性チェック工程)
所望により、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムDNAに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムDNAの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムDNAに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムDNAの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが1本鎖DNAであるのに対して、ゲノムDNAは2本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
所望により、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムDNAに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムDNAの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムDNAに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムDNAの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが1本鎖DNAであるのに対して、ゲノムDNAは2本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムDNA塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool:ブラスト)(Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、p.403-410)およびFASTA(ファストエー)(Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、p.2444-2448)等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
スコアリング・システム、およびローカルアラインメントスコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および/またはPCR条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基(マッチ)=+1、非相補塩基(ミスマッチ)=-1、挿入および/または欠失(ギャップペナルティ)=-3を採用し、閾値を+15に設定することが考えられる。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基(マッチ)=+1、非相補塩基(ミスマッチ)=-1、挿入および/または欠失(ギャップペナルティ)=-3を採用し、閾値を+15に設定することが考えられる。
プライマー候補の塩基配列がゲノムDNA上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてPCRを行った際に、標的領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
(c)ローカルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
ローカルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m-1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m-1)/2」通りである。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m-1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m-1)/2」通りである。
なお、後述する(e)グローバルアラインメント工程および(f)第2段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、(f)第2段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する(d)第1段階選抜工程を行ってもよい。
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の3’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の3’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の3’末端から始まり他方の配列の3’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「-」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の3’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の3’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の3’末端から始まり他方の配列の3’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「-」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
例えば、以下の表2に示す配列番号1および2の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表1に示すとおりとする。
配列番号1および2の塩基配列から、表3に示すドット行列(ドットマトリックス)を作成する。具体的には、配列番号1の塩基配列を左から右へ、5’から3’の向きで並べ、配列番号2の塩基配列を下から上へ、5’から3’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表3に示すドットマトリクスを得る。
表3に示すドットマトリクスから、以下の表4に示す、部分配列のアラインメント(ペアワイズアラインメント)を得る(表3の斜線部分参照)。
マッチ(+1)×9、ミスマッチ(-1)×9、インデル(-3)×0なので、ローカルアラインメントスコアは「±0」である。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
(d)第1段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
第1段階選抜工程は、上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
第1段階選抜工程は、上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う工程である。
ローカルアラインメントスコアの閾値(第1の閾値)を予め設定しておく。
ローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第1の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第1の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第1の閾値を設定してもよい。
ローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第1の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第1の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第1の閾値を設定してもよい。
ここで、上記(c)ローカルアラインメント工程に示した例において、第1の閾値を「3」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「±0」であり、第1の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「±0」であり、第1の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
なお、本工程は、上記(c)ローカルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
(e)グローバルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
グローバルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m-1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m-1)/2」通りである。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m-1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m-1)/2」通りである。
なお、上述した(c)ローカルアラインメント工程および(d)第1段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、(d)第1段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する(f)第2段階選抜工程を行ってもよい。
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「-」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「-」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
例えば、以下の表5に示す配列番号1および2の塩基配列について、それぞれの3’末端の3塩基(大文字部分。「3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列」に該当する。)についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表1に示すとおりとする。
スコアが最大となるように、配列番号1の塩基配列の3’末端の3塩基(大文字箇所)および配列番号2の3’末端の3塩基(大文字箇所)の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表6に示すアラインメント(ペアワイズアラインメント)を得ることができる。
マッチ(+1)×0、ミスマッチ(-1)×3、インデル(-3)×0なので、グローバルアラインメントスコアは「-3」である。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
(f)第2段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
第2段階選抜工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う工程である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
第2段階選抜工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う工程である。
グローバルアラインメントスコアの閾値(第2の閾値)を予め設定しておく。
グローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第2の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第2の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第2の閾値を設定してもよい。
グローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第2の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第2の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第2の閾値を設定してもよい。
なお、プライマーの3’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアを第2の閾値未満とすることができる。
ここで、上記(e)グローバルアラインメント工程に示した例において、第2の閾値を「3」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「-3」であり、第2の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「-3」であり、第2の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
なお、本工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
上記(c)ローカルアラインメント工程および上記(d)第1段階選抜工程の両工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
また、計算量を低減させるため、上記(e)グローバルアラインメント工程および上記(f)第2段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記(f)第2段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記(c)ローカルアラインメント工程および上記(d)第1段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
これは、上記(e)グローバルアラインメント工程では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、3’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアライメントスコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアライメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
(増幅配列長チェック工程)
所望により、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムDNAまたは染色体DNA上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等のPCR条件によって、適宜設定することができる。例えば、100~200塩基(対)の範囲内、120~180塩基(対)の範囲内、140~180塩基(対)の範囲内、140~160塩基(対)の範囲内、160~180塩基(対)の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
所望により、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムDNAまたは染色体DNA上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等のPCR条件によって、適宜設定することができる。例えば、100~200塩基(対)の範囲内、120~180塩基(対)の範囲内、140~180塩基(対)の範囲内、140~160塩基(対)の範囲内、160~180塩基(対)の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
(g)プライマー採用工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
例えば、表7に示す配列番号1および2の塩基配列について、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
既に記載したように、ローカルアラインメントスコアは「±0」であり、第1の閾値である「3」未満である。そして、グローバルアラインメントスコアは「-3」であり、第2の閾値である「3」未満である。
したがって、配列番号1で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号2で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
したがって、配列番号1で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号2で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
本発明における、プライマーおよびプライマーセットの設計方法の第2の態様は、以下の工程を備える。
(a1)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
(b1)上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c1)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
(d1)上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
(e1)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
(f1)上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
(g1)上記(d1)第1の第1段階選抜工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
さらに、
(an)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第nの標的領域を選択する、第nの標的領域選択工程と、
(bn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第nの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第nのプライマー候補塩基配列作成工程と、
(cn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第nのローカルアラインメント工程と、
(dn)上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第nの第1段階選抜工程と、
(en)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第nのグローバルアラインメント工程と、
(fn)上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第nの第2段階選抜工程と、
(gn)上記(dn)第nの第1段階選抜工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第nのプライマー採用工程。
ただし、nは2以上の整数であり、nが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記(an)第nの標的領域選択工程から上記(gn)第nのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程は、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
(a1)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
(b1)上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c1)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
(d1)上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
(e1)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
(f1)上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
(g1)上記(d1)第1の第1段階選抜工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
さらに、
(an)目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第nの標的領域を選択する、第nの標的領域選択工程と、
(bn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第nの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第nのプライマー候補塩基配列作成工程と、
(cn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第nのローカルアラインメント工程と、
(dn)上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第nの第1段階選抜工程と、
(en)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第nのグローバルアラインメント工程と、
(fn)上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第nの第2段階選抜工程と、
(gn)上記(dn)第nの第1段階選抜工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第nのプライマー採用工程。
ただし、nは2以上の整数であり、nが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記(an)第nの標的領域選択工程から上記(gn)第nのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程は、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
本発明におけるプライマーおよびプライマーセットの設計方法の第2の態様の各工程について詳細に説明する。
(a1)第1の標的領域選択工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
目的領域の1つを第1の標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
目的領域の1つを第1の標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(a1)第1の標的領域選択工程において選択した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(a1)第1の標的領域選択工程において選択した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
(特異性チェック工程)
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
(c1)第1のローカルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
(d1)第1の第1段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
(e1)第1のグローバルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
(f1)第1の第2段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様と同様に、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
また、計算量を低減させるため、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記(f1)第1の第2段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
(増幅配列長チェック工程)
第1の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
第1の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
(g1)第1のプライマー採用工程
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
本発明の第2の態様では、第1の標的領域を増幅するためのプライマーを設計した後、第n(nは2以上の整数)の標的領域を増幅するためのプライマーを設計する。
(an)第nの標的領域選択工程
図1のブロックダイアグラムに「第nの標的領域選択工程」として示す。
目的領域のうち第(n-1)標的領域選択工程までに選択されていないものから1つの目的領域を第nの標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
なお、第nの標的領域の選択は、第(n-1)の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、nは2以上の整数である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの標的領域選択工程」として示す。
目的領域のうち第(n-1)標的領域選択工程までに選択されていないものから1つの目的領域を第nの標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
なお、第nの標的領域の選択は、第(n-1)の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、nは2以上の整数である。
(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(an)第nの標的領域選択工程において選択した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(an)第nの標的領域選択工程において選択した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
(特異性チェック工程)
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
(cn)第nのローカルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「第nのローカルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第1の標的領域から第(n-1)の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である(以下同じ)。
図1のブロックダイアグラムに「第nのローカルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第1の標的領域から第(n-1)の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である(以下同じ)。
(dn)第nの第1段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「第nの第1段階選抜工程」として示す。
上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第1段階選抜工程」として示す。
上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
(en)第nのグローバルアラインメント工程
図1のブロックダイアグラムに「第nのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
(fn)第nの第2段階選抜工程
図1のブロックダイアグラムに「第nの第2段階選抜工程」として示す。
上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第2段階選抜工程」として示す。
上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
なお、本発明の設計方法の第1の態様と同様に、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程は、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
また、計算量を低減させるため、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記(fn)第nの第2段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
(増幅配列長チェック工程)
本発明の設計方法の第1の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
本発明の設計方法の第1の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
(gn)第nのプライマー採用工程
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー採用工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー採用工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
〈目的領域選択〉
13番染色体、18番染色体、21番染色体およびX染色体上のSNPを表8に、Y染色体に特異的な領域を表9に示す。
〈目的領域選択〉
13番染色体、18番染色体、21番染色体およびX染色体上のSNPを表8に、Y染色体に特異的な領域を表9に示す。
〈単一細胞単離〉
(末梢血液試料取得)
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid:エチレンジアミン四酢酸)のナトリウム塩を10.5mg添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
(末梢血液試料取得)
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid:エチレンジアミン四酢酸)のナトリウム塩を10.5mg添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
(有核赤血球の濃縮)
パーコール液(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を使用して、密度1.070(g/cm3)の液および密度1.095(g/cm3)の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095の液2mLを添加し、冷蔵庫で4℃に30分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度1.095(g/cm3)の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070(g/cm3)の液2mLを重層した。
その後、密度1.070(g/cm3)の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。
遠沈管を取り出し、密度1.070(g/cm3)と密度1.095(g/cm3)の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板1を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板2を持ち、1端をスライドガラス基板1に30°の角度で接触させ、スライドガラス基板2の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により2枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板2をスライドガラス基板1の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板1上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、1時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度3%としたギムザ染色液に10分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
パーコール液(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を使用して、密度1.070(g/cm3)の液および密度1.095(g/cm3)の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095の液2mLを添加し、冷蔵庫で4℃に30分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度1.095(g/cm3)の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070(g/cm3)の液2mLを重層した。
その後、密度1.070(g/cm3)の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。
遠沈管を取り出し、密度1.070(g/cm3)と密度1.095(g/cm3)の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板1を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板2を持ち、1端をスライドガラス基板1に30°の角度で接触させ、スライドガラス基板2の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により2枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板2をスライドガラス基板1の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板1上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、1時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度3%としたギムザ染色液に10分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
(細胞の形態情報により有核赤血球を識別する)
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動XYステージと、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、XYステージ制御部、Z方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の2つの条件を満たす細胞を検出し、XY位置を記録した。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ここで、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式(1)および(2)を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動XYステージと、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、XYステージ制御部、Z方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の2つの条件を満たす細胞を検出し、XY位置を記録した。
0.25<N/C<1.0 ・・・(1)
0.65<N/L2<0.785 ・・・(2)
ここで、「N」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「C」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「L」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式(1)および(2)を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。
(胎児有核赤血球の選別)
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの1つの細胞に対して、415nm近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記(2)式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から3個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数2を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球3個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が1以上となる細胞を抽出した結果、明らかに1以上である細胞が8個検出された。
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの1つの細胞に対して、415nm近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記(2)式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から3個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数2を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球3個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が1以上となる細胞を抽出した結果、明らかに1以上である細胞が8個検出された。
(細胞回収)
上述したとおり決定された8個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。
上述したとおり決定された8個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。
〈ゲノムDNA抽出〉
採取した単一細胞に対して、Single Cell WGA kit(New England Biolabs社製)を用いて細胞溶解を行った。具体的には、キット付属の説明書の「Sample Preparation Methods」および「Pre-Amplification Protocol」の記載に従って、各単一細胞を5μLの Cell extraction buffer に混合した後、4.8μLの Extraction Enzyme Dilution Buffer および0.2μLの Cell Extraction Enzyme を混合して総液量を10μLとし、75℃で10分間インキュベートした後、さらに95℃で4分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムDNAを調製した。
採取した単一細胞に対して、Single Cell WGA kit(New England Biolabs社製)を用いて細胞溶解を行った。具体的には、キット付属の説明書の「Sample Preparation Methods」および「Pre-Amplification Protocol」の記載に従って、各単一細胞を5μLの Cell extraction buffer に混合した後、4.8μLの Extraction Enzyme Dilution Buffer および0.2μLの Cell Extraction Enzyme を混合して総液量を10μLとし、75℃で10分間インキュベートした後、さらに95℃で4分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムDNAを調製した。
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計〉
(プライマーの作製)
胎児細胞の由来および染色体の数的異常を分析する目的で、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体およびY染色体上の領域から25個所の標的領域を選択した。各標的領域について、当該標的領域を増幅するためのプライマーセットを、配列長20bpであり、Tm値が56~64℃の範囲内であり、かつ、PCR増幅産物のサイズが140~180塩基対の範囲内となるように設計し、これらの中から、各プライマー間の3’末端固定のローカルアラインメントスコアが3未満、かつ、各プライマーの3’末端3塩基のグローバルアラインメントスコアが0となるプライマーセットを25セット選抜した(表10)。
(プライマーの作製)
胎児細胞の由来および染色体の数的異常を分析する目的で、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体およびY染色体上の領域から25個所の標的領域を選択した。各標的領域について、当該標的領域を増幅するためのプライマーセットを、配列長20bpであり、Tm値が56~64℃の範囲内であり、かつ、PCR増幅産物のサイズが140~180塩基対の範囲内となるように設計し、これらの中から、各プライマー間の3’末端固定のローカルアラインメントスコアが3未満、かつ、各プライマーの3’末端3塩基のグローバルアラインメントスコアが0となるプライマーセットを25セット選抜した(表10)。
(シングルプレックスPCRによる増幅の確認)
作製した各プライマーセットが標的領域を増幅できることを確認するため、シングルプレックスPCRにより増幅の確認を行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、プライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記プライマーミックスは1つのプライマーセットを構成する各プライマーをそのプライマーの終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、シングルプレックスPCRを行った。
シングルプレックスPCRを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。
作製した各プライマーセットが標的領域を増幅できることを確認するため、シングルプレックスPCRにより増幅の確認を行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、プライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記プライマーミックスは1つのプライマーセットを構成する各プライマーをそのプライマーの終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、シングルプレックスPCRを行った。
シングルプレックスPCRを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。
〈ポリメラーゼ連鎖反応による増幅〉
シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを用いて、マルチプレックスPCRを行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、25セットプライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記25セットプライマーミックスは、シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを構成する各プライマーをその終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、マルチプレックスPCRを行った。
シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを用いて、マルチプレックスPCRを行った。
具体的には、調製したゲノムDNA(0.5ng/μL) 2μL、25セットプライマーミックス 2μL、マルチプレックスPCRミックス2 12.5μL、マルチプレックスPCRミックス1 0.125μL、および水 適量を混合して、最終液量 25μLの反応溶液を調製した。なお、上記25セットプライマーミックスは、シングルプレックスPCRによる増幅が確認できた25種類のプライマーセットを構成する各プライマーをその終濃度が50nMとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性94℃ 60秒を行った後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 90秒、および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを30サイクル繰り返して、マルチプレックスPCRを行った。
(PCR産物の精製)
得られたマルチプレックスPCR産物は、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製された。反応溶液 25μLに、AMPure XP 45μLを加え、磁性ビーズにPCR反応産物を結合させた。磁性ビーズをマグナスタンド(Magna Stand)(日本ジェネティクス社製)の磁力で分離し、夾雑物を除いた。70%エタノールで洗浄後、磁性ビーズに結合した核酸をTE(Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane ) - EDTA:トリス-エチレンジアミン四酢酸)緩衝液で溶出した。
得られたマルチプレックスPCR産物は、AMPure XPキット(ベックマンコールター社製)を用いて精製された。反応溶液 25μLに、AMPure XP 45μLを加え、磁性ビーズにPCR反応産物を結合させた。磁性ビーズをマグナスタンド(Magna Stand)(日本ジェネティクス社製)の磁力で分離し、夾雑物を除いた。70%エタノールで洗浄後、磁性ビーズに結合した核酸をTE(Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane ) - EDTA:トリス-エチレンジアミン四酢酸)緩衝液で溶出した。
(インデックス配列およびフローセル結合用配列の付加)
MiSeq(イルミナ社製)を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列、ならびにフローセル結合用のP5配列およびP7配列を、マルチプレックスPCR産物の両末端に付加した。プライマーとして、各1.25μMのP5_F(D501)およびP7_R(D701~D705)(表11に示す。)を用い、マルチプレックスPCR産物、マルチプレックスPCRミックス1、マルチプレックスPCRミックス2および水と混合して反応溶液を調製し、初期熱変性94℃ 3分の後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング50℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを5サイクル、さらに、熱変性94℃ 45秒、アニーリング 55℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを11サイクル行った。なお、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
MiSeq(イルミナ社製)を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列、ならびにフローセル結合用のP5配列およびP7配列を、マルチプレックスPCR産物の両末端に付加した。プライマーとして、各1.25μMのP5_F(D501)およびP7_R(D701~D705)(表11に示す。)を用い、マルチプレックスPCR産物、マルチプレックスPCRミックス1、マルチプレックスPCRミックス2および水と混合して反応溶液を調製し、初期熱変性94℃ 3分の後、熱変性94℃ 30秒、アニーリング50℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを5サイクル、さらに、熱変性94℃ 45秒、アニーリング 55℃ 60秒および伸長反応72℃ 30秒のサーマルサイクルを11サイクル行った。なお、上記マルチプレックスPCRミックス1および上記マルチプレックスPCRミックス2はマルチプレックスPCRアッセイキット(タカラバイオ社製)に含まれる試薬である。
得られたPCR産物は、AMPure XPキットを用いて精製し、正確な増幅産物の定量として、KAPAライブラリー定量キット(日本ジェネティクス社製)を用いて定量を行った。
〈DNAシークエンシング〉
単一細胞由来のマルチプレックスPCR産物を、MiSeq Reagent Kit v2 300 Cycle(イルミナ社製)を用いてシーケンスを行い、得られたFastQファイルを、BWA(Burrows-Wheeler Aligner:バーロウズ-ホィーラー・アライナー)を用いてヒトゲノム配列(hg19)へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出し、BEDtoolsにより各検出領域のシーケンスリード数を算出することで解析を行った。
単一細胞由来のマルチプレックスPCR産物を、MiSeq Reagent Kit v2 300 Cycle(イルミナ社製)を用いてシーケンスを行い、得られたFastQファイルを、BWA(Burrows-Wheeler Aligner:バーロウズ-ホィーラー・アライナー)を用いてヒトゲノム配列(hg19)へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出し、BEDtoolsにより各検出領域のシーケンスリード数を算出することで解析を行った。
(単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認)
各細胞から増幅したPCR増幅産物の、13番、18番および21番染色体のSNPを比較することによって、8個の細胞のうち、1個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認出来た。別途、核の形状より白血球と予想される細胞を、マイクロマニュピュレーターを用いて、血液を塗布したスライドガラス上から回収し、8個の細胞の増幅時に使用したプライマーを用いて、同様にしてDNAを増幅し、SNPを調べたところ、7個の細胞のSNPと一致することが確認された。以上より、1個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞と確定し、7個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。また、Y染色体の情報が得られなかったことから胎児は女児であることが確認された。
各細胞から増幅したPCR増幅産物の、13番、18番および21番染色体のSNPを比較することによって、8個の細胞のうち、1個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認出来た。別途、核の形状より白血球と予想される細胞を、マイクロマニュピュレーターを用いて、血液を塗布したスライドガラス上から回収し、8個の細胞の増幅時に使用したプライマーを用いて、同様にしてDNAを増幅し、SNPを調べたところ、7個の細胞のSNPと一致することが確認された。以上より、1個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞と確定し、7個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。また、Y染色体の情報が得られなかったことから胎児は女児であることが確認された。
(増幅産物の量(配列リード数)の測定)
マルチプレックスPCR増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の21番染色体の検出領域の増幅産物の量を、次世代シーケンサーMiSeq(登録商標;イルミナ社製)を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞の21番染色体の検出領域の増幅産物の量(配列リード数)を、MiSeqを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。これらの増幅産物の量(配列リード数)を比較したところ、細胞間でのばらつきは小さく、かつ、この2つの量比を計算したところ、1:1.5に近い値となり、胎児はトリソミーであることが推定された。
マルチプレックスPCR増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の21番染色体の検出領域の増幅産物の量を、次世代シーケンサーMiSeq(登録商標;イルミナ社製)を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞の21番染色体の検出領域の増幅産物の量(配列リード数)を、MiSeqを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。これらの増幅産物の量(配列リード数)を比較したところ、細胞間でのばらつきは小さく、かつ、この2つの量比を計算したところ、1:1.5に近い値となり、胎児はトリソミーであることが推定された。
[比較例1]
マルチプレックスPCR増幅工程では、実施例1で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対に代えて、相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例1と同じ染色体位置ないしは遺伝子に対し、Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)を使用して、Tm値が56℃~64℃、かつPCR増幅塩基長としては、140~180塩基対となる20bpのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスPCRを行ったことを除き、他は実施例1と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、マッピング率が著しく低下し、かつ細胞間の増幅産物量の分散が大きく、数的異常を明確に判断できないほど、ばらつきが大きかった。
マルチプレックスPCR増幅工程では、実施例1で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対に代えて、相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例1と同じ染色体位置ないしは遺伝子に対し、Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)を使用して、Tm値が56℃~64℃、かつPCR増幅塩基長としては、140~180塩基対となる20bpのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスPCRを行ったことを除き、他は実施例1と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、マッピング率が著しく低下し、かつ細胞間の増幅産物量の分散が大きく、数的異常を明確に判断できないほど、ばらつきが大きかった。
本発明は、胎児由来の単一細胞を解析する技術であり、検出領域には、既に公知である遺伝的多型部位、体細胞突然変異部位を含むことが可能であるので、遺伝子異常の検出に限定されず、遺伝子状態を判定することが可能である。
Claims (6)
- 胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムDNAを抽出するゲノムDNA抽出工程と、
前記単一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のDNA塩基配列を解読するDNAシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、前記目的領域選択工程は、前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程の前もしくは後に、または前記単一細胞単離工程および前記ゲノムDNA抽出工程の両工程と並行して行われ、
前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
前記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
前記第1段階選抜工程および前記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第1段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
前記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
前記第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
前記第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
前記第1の第1段階選抜工程および前記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
前記第2のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
前記第2のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
前記第2の第1段階選抜工程および前記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記第1のローカルアラインメント工程および前記第1の第1段階選抜工程の両工程は、前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第2のローカルアラインメント工程および前記第2の第1段階選抜工程の両工程は、前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記標的領域が3箇所以上である場合は、前記第2の標的領域選択工程から前記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、請求項1に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも前記ゲノムDNA抽出工程から前記DNAシークエンシング工程までを繰り返す、請求項1または2に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
- 前記遺伝子状態が染色体の数的異常である、請求項1~3のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と前記DNAシークエンシング工程との間に、さらに、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、請求項1~4のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。 - 前記DNAシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、請求項1~5のいずれか1項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
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