WO2016117765A1 - 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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filaggrin
skin tissue
expression
tissue model
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손상욱
이하나
김진희
류우인
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Korea University Research and Business Foundation
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin

Definitions

  • the present invention relates to atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model and a method for screening for atopic dermatitis treatments using the same, more specifically, expression of filaggrin (Filaggrin) through the treatment of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) or environmental factors toluene
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • environmental factors toluene To prepare a three-dimensional skin tissue model showing a reduced atopic dermatitis-like findings with reduced expression of the antimicrobial peptides ⁇ -defensin or Psoriasin, and thus a candidate for atopic dermatitis treatment
  • candidates for increasing the expression of filaggrin and further increasing the expression of the antimicrobial peptide ⁇ -defensin or thyrasine are selected as a therapeutic agent for the screening method of atopic dermatitis therapeutic
  • the three-dimensional skin model is an artificial skin model (RhE, which reconstructs the human epidermis in three dimensions by inducing differentiation of keratinocytes, the major cells that form the epidermis of human skin, at the air-liquid interphase). Reconstituted human skin equivalent model).
  • RhE artificial skin model
  • Atopic dermatitis is a chronic inflammatory skin disease that is accompanied by severe itching and overall dry skin, and eczema lesions recur in certain areas.They have a genetic predisposition and allergic marches associated with allergic diseases such as food allergy, allergic asthma and allergic rhinitis.
  • allergic diseases such as food allergy, allergic asthma and allergic rhinitis.
  • the pathogenesis of atopic dermatitis today is largely divided into the pathogenesis associated with skin barriers and the pathogenesis associated with abnormal immune responses, with mutations in the filaggrin gene occurring in about 40% of patients with atopic dermatitis and with severe symptoms or even persisting in adults.
  • external allergens more easily pass through the stratum corneum and sensitize the body in people with innately damaged skin barriers, leading to atopic dermatitis.
  • the core proteins constituting the skin barrier is known to play an important role in the formation of the stratum corneum (Filaggrin), Loricrin (Loricrin), Involucrin (Involucrin).
  • filaggrin is present in the form of propyllagrin, a protein constituting kerathaialin granule in the granule layer, and is decomposed into filaggrin during the final differentiation of keratinocytes to form keratinocyte membranes.
  • the filament aggregates to form a solid, flat structure of keratinocytes, which acts as a brick in the skin barrier.
  • the filaggrin breaks down into amino acids and changes into free amino acids and pyrrolidone carboxylic acids (PCAs), which are very important for moisture.
  • Filaggrin produces citrulline, PCA, and trans-UCA through degradation processes, which perform stratum corneum hydration, normalization of stratum corneum pH, permeation barrier, firmness of the stratum corneum, antibacterial and anti-inflammatory activity.
  • TSLP thymic stromal lymphopoietin
  • the top protein of abnormal signaling is the TSLP cytokine.
  • substances such as TSLP stimulate dendritic cells to respond, causing symptoms of atopic dermatitis.
  • TSLP stimulates CD11c + dendritic cells to increase TARC (Thymus and activation-regulated chemokine) and MDC production.
  • TARC Thymus and activation-regulated chemokine
  • Antibacterial peptides are an important component of the innate immune system of the human body. They are cationic peptides that are produced in epithelial tissues to establish a first line of defense against all bacteria, including viruses, bacteria, and fungi. It activates immunity and is involved in wound repair function after living injury. The lowering of these antimicrobial peptides is due to increased inhibition of Th-2 cytokines in atopic dermatitis, and ⁇ -defensin and cathelicidine when IL-4 and IL-13 are administered to keratinocytes. increase in cathelicidin) has been reported.
  • VOCs Volatile Organic Compounds
  • VOCs are liquid or gaseous organic compounds that easily evaporate into the atmosphere due to their high vapor pressure. Recently, researches related to allergic diseases have been actively conducted.
  • the mechanism of atopic dermatitis caused by TSLP, a cytokine that is overexpressed in the lesions of toluene and atopic dermatitis patients, which is an environmental hazard among volatile organic compounds (VOCs), is presented using a three-dimensional skin model. .
  • the present inventors have made intensive efforts to develop an animal replacement model that can be used for screening methods for treating atopic dermatitis based on atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model studies. Reduction of the expression level of the antimicrobial peptide gene and reduction of the expression level of the filaggrin gene according to toluene treatment was confirmed in the three-dimensional skin tissue model, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention to provide atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model and a method for screening atopic dermatitis treatment using the same.
  • the present invention comprises the steps of: (a) treating a three-dimensional skin tissue model TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) or toluene (Toluene); (b) confirming the expression of Filaggrin and antimicrobial peptides in the treated three-dimensional skin tissue model; And (c) obtaining a three-dimensional skin tissue model with reduced expression of Filaggrin as atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model compared to the control group. to provide.
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • Toluene toluene
  • the present invention also provides an atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model prepared by the above method and having reduced expression of Filaggrin compared to the control group.
  • the present invention also comprises the steps of: (a) treating atopic dermatitis candidates to the atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model, and then confirming the expression of filaggrin and antimicrobial peptides in the cells of the skin tissue model; And (b) provides a method for screening atopic dermatitis therapeutics using atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model comprising the step of selecting a candidate to increase the expression of the filaggrin compared to the control.
  • Figure 1 shows the change in the expression of filaggrin (Filaggrin) in keratinocytes according to the concentration of TSLP treatment
  • (A) is the change in the expression of pilaggrin (Filaggrin) according to TSLP treatment confirmed by RT-PCR
  • (B) Shows changes in pilaggrin protein expression according to TSLP treatment confirmed by Western blot
  • (C) shows changes in pilaggrin protein expression in keratinocytes identified by immunofluorescence staining.
  • Figure 2 shows the change in the expression of filaggrin (Filaggrin) in keratinocytes according to the concentration of toluene (Toluene) for each concentration
  • (A) is the change in the expression of pilaggrin (Filaggrin) RNA according to TSLP treatment confirmed through RT-PCR
  • (B) is a change in the expression of pilaggrin protein (Filaggrin) protein according to the toluene treatment confirmed by Western Bull
  • (C) is a change in the expression of Filaggrin (Filaggrin) protein in keratinocytes confirmed by immunofluorescence staining method.
  • Figure 3 shows the expression change of the filaggrin (Filaggrin) in the three-dimensional skin model according to the TSLP treatment, (A) decreases the expression of Filaggrin (TS) treatment according to the TSLP treatment, (B) ⁇ according to the TSLP treatment Decreased expression of defensin and ⁇ -defensin (Psoriasin, S100 calcium-binding protein A7).
  • Figure 4 shows the decrease in the expression of Filaggrin (Filaggrin) in the three-dimensional skin model according to toluene (Toluene) treatment.
  • TSLP Thymic stromal lymphopoietin
  • TSLP Thymic stromal lymphopoietin
  • TSLP Thymic stromal lymphopoietin
  • RNA and protein of filaggrin in keratinocytes cultured with a monolayer treated with TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) compared to a control treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS) The amount was confirmed to decrease TSLP concentration dependent.
  • RNA and protein of pilaggrin in keratinocytes cultured in toluene-treated monolayers were dependently reduced in toluene concentration.
  • the present invention comprises the steps of: (a) treating a three-dimensional skin tissue model with TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) or toluene; (b) confirming the expression of Filaggrin and antimicrobial peptides in the treated three-dimensional skin tissue model; And (c) obtaining a three-dimensional skin tissue model having reduced expression of pilaggrin as atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model compared to the control group.
  • the control means a three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS).
  • the cells constituting the three-dimensional skin tissue model may be characterized in that the human keratinocytes (keratinocytes), the antimicrobial peptide is ⁇ -defensin ( ⁇ -defensin) or thyrasine (Psoriasin ),
  • the expression of the filaggrin (Filaggrin) and the antimicrobial peptide may be characterized by using reverse transcription-polymerase chain reaction (Reverse Transcription-PCR), Western blot or immunohistochemical staining method .
  • the step (c) is characterized in that to obtain a three-dimensional skin tissue model with atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model, the expression of pilaggrin (Filaggrin) is reduced and the antimicrobial peptide is further reduced compared to the control group can do.
  • the control means a three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS).
  • the present invention relates to an atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model prepared by the above method and having reduced expression of Filaggrin as compared to the control group.
  • the control means a three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • the cells constituting the three-dimensional skin tissue model may be characterized in that the human keratinocytes (keratinocytes), the atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model of the filaggrin (Filaggrin) compared to the control group It may be characterized in that the expression is reduced, the expression of the antimicrobial peptide is further reduced, the antimicrobial peptide may be characterized in that the ⁇ -defensin ( ⁇ -defensin) or sarirasin (Psoriasin), Expression of filaggrin and antimicrobial peptides can be characterized by using reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR), western blot or immunohistochemical staining.
  • the control means a three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS).
  • the present invention (a) treatment of atopic dermatitis candidates to the atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model, and then confirmed the expression of filaggrin (Filaggrin) and antimicrobial peptides in the cells of the skin tissue model Doing; And (b) relates to a method for screening atopic dermatitis treatment using atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model comprising the step of selecting a candidate to increase the expression of the filaggrin compared to the control.
  • the control group refers to atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the cells constituting the three-dimensional skin tissue model may be characterized in that the human keratinocytes (keratinocytes), the antimicrobial peptide is ⁇ -defensin ( ⁇ -defensin) or thyrasine (Psoriasin ),
  • the expression of the filaggrin (Filaggrin) and the antimicrobial peptide may be characterized by using reverse transcription-polymerase chain reaction (Reverse Transcription-PCR), Western blot or immunohistochemical staining method
  • the step (b) may be characterized in that to increase the expression of the filaggrin (Filaggrin) compared to the control, and to select a candidate substance to further increase the expression of the antimicrobial peptide as a therapeutic agent.
  • the control group refers to atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • Example 1 Changes in the expression of Filaggrin in keratinocytes cultured in monolayer following TSLP or toluene treatment
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • HaCaT cell line (order no. 300493, CLS, Eppelheim, Germany; German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany) (Boukamp et al., J. Cell) Biol. 106: 761-771, 1988) and treated with 0, 1, 10, 100ng / ml of TSLP in the culture for 16 hours (control was treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS)), followed by TRIzol reagent. After addition, it was ground finely using a homogenizer (homogenizer: OMNI-inc, USA), and RNA was isolated according to the manufacturer's method.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Filaggrin (Filaggrin) primer SEQ ID NO: 1): 5'-ggtctggacgttcagggtct-3 '
  • Filaggrin-r (reverse) SEQ ID NO: 2]: 5'- ggatgtggtgtggctgtgat-3 '
  • GAPDH primer GAPDH primer
  • 35 cycles were performed using the denaturation step (95 ° C., 30 sec), the annealing step (56 ° C., 30 sec), and the extension step (72 ° C., 40 sec) as one cycle, and amplified by PCR (Polymerase
  • the human keratinocyte line (HaCaT cell line) was cultured and treated with 0, 1, 10, 100ng / ml of TSLP in the culture solution for 16 hours (the control group was PBS (Phosphate).
  • -Buffered Saline), RIPA buffer (Elpis, Korea) were treated with the cells and allowed to stand on ice for 30 minutes, and then centrifuged for 13000rpm and 30 minutes in a refrigerated centrifuge. was loaded onto an SDS-PAGE gel.
  • the protein contained in the loaded gel was then transferred to PVDF and then blocked with 5% Bovine Serum Albumin (BSA) for 1 hour, followed by a 1: 1000 dilution of the Filaggrin antibody (Santa Cruz, USA). Then incubated. Then, after the HRP-attached secondary antibody reaction and washing process, the band of the protein was confirmed using the ECL solution (FIG. 1B).
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • cytoperm / cytofix (BD, USA) was treated in the cultured human HaCaT cell line according to the experimental method provided to fix the cells and filaggrin (Filaggrin).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Cy3 attached secondary antibody 100 for 1 hour at 4 ° C.
  • RNA and protein of filaggrin in keratinocytes were reduced in a TSLP concentration-dependent manner compared to the control group treated with PBS compared to the physiological stromal lymphopoietin (TSLP) treated monolayer.
  • TSLP physiological stromal lymphopoietin
  • toluene was treated to each concentration of keratinocytes cultured in a monolayer, and the change in the expression level of the filaggrin at the RNA and protein levels was confirmed.
  • the human keratinocyte line (HaCaT cell line) was cultured and treated with 0, 12.5, 25, 50 nM of toluene in the culture solution for 24 hours (the control group was PBS (Phosphate-Buffered). Saline)), TRIzol reagent was added and finely ground using a homogenizer (homogenizer) and RNA was isolated according to the manufacturer's method. The isolated RNA was prepared cDNA of each tissue using a reverse transcriptase (Super-bio, Korea).
  • Filaggrin primer (Filaggrin-f (SEQ ID NO: 1): 5'-ggtctggacgttcagggtct-3 '
  • Filaggrin-r (reverse) [SEQ ID NO: 2]: 5'-ggatgtggtgtggctgtgat using the prepared cDNA as a template -3 ') and GAPDH primers (GAPDH-f (forward) [SEQ ID NO: 3]: 5'-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3'
  • 35 cycles were carried out using a denaturation step (95 ° C., 30 seconds), annealing step (56 ° C., 30 seconds), and an extension step (72 ° C., 40 seconds) as one cycle, and amplified by PCR.
  • the amplified samples were observed for expression in 1% agarose gel (FI
  • the human keratinocyte line (HaCaT cell line) was cultured and treated with 0, 12.5, 25 and 50 nM of toluene in the culture solution for 24 hours (the control group was PBS (Phosphate-Buffered). Saline)) and RIPA buffer (Elpis, Korea) were treated with the cells and allowed to stand on ice for 30 minutes, followed by centrifugation at 13000 rpm for 30 minutes in a refrigerated centrifuge. Loading on SDS-PAGE gels.
  • the proteins contained in the loaded gels were then transferred to PVDF and blocked for 1 hour with 5% BSA, followed by incubation with 1: 1000 dilution of the Filaggrin antibody (Santa Cruz, USA). After the HRP-attached secondary antibody reaction and washing process, the band of the protein was confirmed using the ECL solution (FIG. 2B).
  • cytoperm / cytofix (BD, USA) was treated in the cultured human HaCaT cell line according to the experimental method provided to fix the cells and filaggrin (Filaggrin).
  • RNA and protein of pilaggrin in keratinocytes cultured in toluene-treated monolayers decreased in a toluene concentration-dependent manner compared to the control group treated with PBS.
  • the three-dimensional skin model used in Examples 2 and 3 is a normal human epidermal keratinocyte derived from Neonatal-foreskin tissue or adult breast tissue.
  • Human Epithelial Keratinocytes (NHEK) consists of 8 to 15 cell layers, which have a basal-, spinous-, granular- and cornified-layer Similar to in vivo epithelial tissue (Carlson et al., Curr Protoc Cell Biol., Chapter 19: Unit 19.9. Doi: 10.1002 / 0471143030.cb1909s41, 2008).
  • the three-dimensional skin model has metabolic and cell division activity, pro-filaggrin, K1 / K10 cytokeratin pair, and involucrin, which are mature epithelial specific differentiation markers. ) And type 1 epidermal transglutaminase.
  • the three-dimensional skin model maintains normal epidermal morphology for up to three weeks in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing epidermal growth factor, insulin, hydrocortisone, and antibiotics. Can be cultured in the meantime.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the three-dimensional skin model was cultured using a culture method of MatTek, followed by administration (treatment) of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) or toluene, and the expression changes of filaggrin (Filaggrin) and antimicrobial peptides were confirmed.
  • TSLP physiological stromal lymphopoietin
  • a three-dimensional skin model consisting of normal human epithelial keratinocytes (The EpiDerm TM Skin Model, EPI-100, MatTek) was developed using MatTek's culture method. After culturing, 100ng / ml TSLP was treated in the culture solution for 16 hours (control was treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS)), and a three-dimensional skin model was taken (the three-dimensional skin model treated with TSLP was obtained in Example 3). Used for the screening of atopic dermatitis treatments), fixed in 4% formaldehyde (Sigma, USA), and then embedded in paraffin to prepare slides.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • the tissue slides were subjected to deparinization using xylene and dehydration using alcohol, and then the slides were immersed in a citrate buffer for 10 minutes in a microwave oven, and then cooled at room temperature for 1 hour.
  • the slides were washed with distilled water and allowed to react with 5% goat serum at room temperature for 1 hour, followed by anti-Plaggrin, anti- ⁇ -defensin, and anti-Psoriasin antibodies. Incubation was by diluting to 1:50. After reacting the HRP-attached secondary antibody, it was developed using a DAB kit to confirm the change in the expression of Filaggrin in the tissue.
  • the amount of expression of ⁇ -defensin and psoriasin in the three-dimensional skin model of TSLP-treated filaggrin and antibacterial peptides compared to the control group to which PBS was administered was TSLP. It was found to decrease in a concentration dependent manner, which was similar to the trend of filaggrin expression in the keratinocytes cultured with monolayers.
  • a three-dimensional skin model (The EpiDerm TM Skin Model, EPI-100, MatTek) was incubated by MatTek's culture method, and 50 ⁇ M of toluene was treated in the culture solution for 24 hours.
  • Control was treated with Phosphate-Buffered Saline (PBS)
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • a three-dimensional skin model was taken (toluene-treated three-dimensional skin model is used for the screening of the atopic dermatitis treatment agent of Example 3) 4% formaldehyde (Sigma, USA), and then embedded in paraffin to make a slide.
  • the tissue slides were subjected to deparinization using xylene and dehydration using alcohol, and then the slides were immersed in a citrate buffer for 10 minutes in a microwave oven, and then cooled at room temperature for 1 hour.
  • the slides were washed with distilled water, reacted with 5% goat serum for 1 hour at room temperature, and then incubated with 1:50 dilution of the Filaggrin antibody.
  • HRP-attached secondary antibody was reacted by color development using DAB kit to confirm the change in the expression of Filaggrin (Filaggrin) in the tissue.
  • Example 1 Statistical analysis in Example 1 and Example 2 was used for the test of significance between the two groups using the t-test test, which is effective when * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001 compared to the control group Considered as a difference. All data are expressed as mean ⁇ measurement standard error (SEM).
  • atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model obtained by administering TSLP or toluene to the three-dimensional skin tissue model (The EpiDerm TM Skin Model, EPI-100, MatTek) in the same manner as in Example 2, the control group was treated with PBS ( Phosphate-Buffered Saline (DMSO) or dimethyl sulfoxide (DMSO) were treated, and the experimental group treated with atopic dermatitis candidates, followed by filaggrin and antimicrobial peptides ( ⁇ -defensin or Psoriasin). Expression was analyzed using Reverse Transcription-PCR, Western blot and / or immunohistochemical staining.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • candidate atopic dermatitis treatment PBS (Phosphate-Buffered Saline) or dimethyl sulfoxide (DMSO) treated in atopic dermatitis-like three-dimensional skin tissue model was treated at an appropriate concentration and exposure time by conventional methods in the art (Thomas K. Petersen, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology , 99: 104-115, 2006).
  • Candidates that increase filaggrin and antimicrobial peptide expression in the experimental group compared to the control group were evaluated and selected as potential atopic dermatitis treatments.
  • a three-dimensional skin tissue model according to the TSLP or toluene treatment of the present invention shows a decrease in the gene expression of pilagrin and the antimicrobial peptide ⁇ -defensin or thyrasine, an important finding in skin lesions of atopic dermatitis. It is of great value and can provide a new animal replacement test method that can be utilized for evaluating the efficacy of mechanisms for treating atopic dermatitis and researching mechanisms.

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Abstract

본 발명은 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 환경인자인 톨루엔의 처리를 통해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드인 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)의 발현이 추가로 감소된 아토피 피부염 유사 소견을 보이는 3차원 피부조직 모델을 제조하고, 이에 아토피 피부염 치료제 후보물질을 처리한 후, 필라그린의 발현을 증가시키고, 항균펩타이드인 β-디펜신 또는 서라이어신의 발현을 추가로 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 TSLP 또는 톨루엔 처리에 따른 3차원 피부조직 모델은 아토피 피부염의 피부병변에서 중요한 소견인 필라그린과 항균펩타이드인 β-디펜신 또는 서라이어신의 유전자 발현 감소를 보여줌으로써 아토피 피부염 유사 피부조직 모델로서의 가치가 크며, 아토피 피부염 치료제의 효능 평가 및 기전 연구 등에 활용할 수 있는 새로운 동물 대체 시험 방법을 제공할 수 있다.

Description

아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법
본 발명은 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 환경인자인 톨루엔의 처리를 통해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드인 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)의 발현이 추가로 감소된 아토피 피부염 유사 소견을 보이는 3차원 피부조직 모델을 제조하고, 이에 아토피 피부염 치료제 후보물질을 처리한 후, 필라그린의 발현을 증가시키고, 항균펩타이드인 β-디펜신 또는 서라이어신의 발현을 추가로 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
3차원 피부 모델은 사람 피부의 표피를 이루는 주요 세포인 각질세포(keratinocytes)를 기체-액체 경계면(air-liquid interphase)에서 분화유도시킴으로써 3차원적으로 사람의 표피를 재구성한 인공피부 모델(RhE, Reconstituted human skin equivalent model)이다. 이를 통해 피부의 일차 자극 대체시험 등 많은 연구가 가능하다. 이미 EPISKINTM, EpiDermTM, SkinEthicTM 등과 같은 인공피부 모델은 다양한 검증(validation) 연구를 통해 피부자극 대체법으로서의 유용성을 인증하여 OECD 가이드라인(guideline)에 등재되어 있다.
아토피 피부염은 심한 가려움증과 전체적인 건조피부를 동반하며 습진 병변이 특정 부위에 반복하여 재발하는 만성 염증성 피부질환으로, 유전적인 소인을 나타내고 음식물 알레르기, 알레르기 천식, 알레르기 비염 등 알레르기 질환과 동반하는 알레르기 행진을 하는 특징을 가지고 있다(Akiharu Kubo et al., J Clin Invest. 122(2):440-447, 2012; Hywel CW et al., N Engl J Med, 352:2314-2324, 2005). 오늘날 아토피 피부염의 병인은 크게 피부장벽과 연관된 병인과 비정상적인 면역반응과 연관된 병인으로 나누어지는데, 필라그린 유전자의 돌연변이가 아토피 피부염 환자의 40% 정도에서 나타나며 심한 증상을 나타내거나 성인까지 지속되는 경우에는 더 흔하게 나타난다고 보고된 이후에는 선천적으로 손상된 피부장벽을 가진 사람에서 외부의 알레르겐이 더 쉽게 각질층을 통과하여 몸에 감작을 일으킴으로써 아토피 피부염을 유발시킨다.
한편, 피부장벽을 구성하는 핵심 단백질은 필라그린(Filaggrin), 로리크린(Loricrin), 인볼루크린(Involucrin) 등으로 각질층의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
그 중, 필라그린은 과립층에서는 케라토하이알린 과립(Keratohyalin granule)을 구성하는 단백질인 프로필라그린 형태로 존재하다가, 각질형성세포의 최종분화 과정에서 필라그린으로 분해되어서 각질세포막을 형성할 때에 케라틴 필라멘트를 응집하여 각질세포의 단단하고 편평한 구조를 만들어 피부장벽에서 벽돌의 역할을 수행한다. 이후 각질층 상부로 올라가면서 필라그린은 아미노산으로 분해되고, 함습에 매우 중요한 자유아미노산과 PCA(pyrrolidone carboxylic acid)로 변화한다. 필라그린의 분해산물이 피부를 촉촉하게 유지하는데 가장 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고된 바 있다(McGrath JA et al., Trends in Molecular Medicine, 14:20-27, 2008; Brown SJ et al., Journal of Investigative Dermatology, 132:751-762, 2012).
필라그린은 분해과정을 통하여 시트룰린(citrulline), PCA, trans-UCA를 생성하며 이들은 각질층 수화, 각질층 pH의 정상화, 투과장벽, 각질층의 견고함(integrity/cohesion), 항균 및 항염작용을 수행한다.
필라그린 유전자(FLG)의 돌연변이로 발생하는 보통 어린선(Ichthyosis vulgaris)은 매우 심한 피부건조를 나타낸다. 즉, 상기 필라그린 유전자의 돌연변이는 필라그린 단백질의 생성을 감소시키고, 자연보습인자의 생성을 감소시켜서 건조피부를 유발하게 된다. 아토피 피부염 환자의 비병변 피부에서 표피 분화 단백질 중 많은 비중을 차지하는 로리크린(Loricrin)이나 인볼루크린(Involucrin) 등은 차이가 없는데 유독 필라그린의 발현만이 감소되었다는 보고가 있으며 이를 통해서 필라그린이 아토피 피부염 병인으로 대두되어 활발히 연구되고 있다.
발견 초기와 달리 필라그린 유전자의 LOF 돌연변이(Loss of function mutation)를 가지지 않은 아토피 피부염 환자들이 보고됨에 따라 유전적 요인이 아닌 다른 외부 환경적 요인에 의한 필라그린의 감소 현상에 대한 연구들이 수행되었다.
아토피 피부염 환자들에서 증가되어 있는 것으로 보고된 바 있는 Th2 사이토카인에 의한 필라그린의 발현 감소 현상이 몇몇 논문들에 의해 보고된 바 있다(Kim BE et al., Journal of Investigative Dermatology, 131:1272-1279, 2011; Howell MD et al., J Allergy Clin Immunol,120:150-5, 2007).
아토피 피부염 환자의 각질형성세포에는 고농도의 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)가 존재한다. 비정상적 신호전달의 최상위 단백질이 바로 TSLP 싸이토카인(cytokine)이다. 알러젠이 몸에 침투되면 TSLP 등의 물질이 수지상 세포를 자극하여 반응을 하게 되는데, 이 과정에서 아토피 피부염의 증상이 나타나는 것이다. TSLP는 CD11c+ 수지상세포를 자극해서 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)와 MDC 생성을 증가시킨다. 이러한 사이토카인의 농도는 아토피 피부염의 증상과 밀접한 연관성을 가지고 있다(Holgate ST et al., Trends in Immunology, 28:248-251, 2007).
항균펩타이드(anti-microbial peptide)의 감소는 아토피 피부염 환자의 급성 병변에서 뚜렷하게 관찰된다. 항균펩타이드는 인체의 선천면역 체계를 구성하는 중요한 요소이며 양이온을 띤 펩타이드로서 상피조직에서 생성되어 바이러스, 세균, 진균 등 모든 균에 대하여 광범위한 항균작용을 나타내는 1차 방어선을 구축하고, 세포면역과 획득면역을 활성화시키고, 생체 손상 후 상처회복 기능에 관여한다. 이러한 항균펩타이드의 저하는 아토피 피부염에서 증가되어 있는 Th-2 싸이토카인에 의한 억제 때문이며, 각질형성세포에 IL-4, IL-13을 투여할때 β-디펜신(β-defensin)과 카텔리시딘(cathelicidin)의 증가가 억제됨이 보고되었다.
이뿐만 아니라 휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs)은 증기압이 높아 대기 중으로 쉽게 증발되는 액체 또는 기체 상 유기 화합물로써 대기 중에서 광화학 반응을 일으켜 오존 등 광화학 산화성 물질을 생성시켜 광화학 스모그를 유발하는 발암성 물질로써 최근 알러지성 질환과 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명에서는 휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs) 중 환경 위해성 물질인 톨루엔과 아토피 피부염 환자의 병변부에서 과발현되어 있는 싸이토카인인 TSLP에 의한 아토피 피부염 발생 기전을 3차원 피부 모델을 이용하여 제시하고자 한다.
본 발명자들은 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 연구에 기반을 둔 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 이용할 수 있는 동물 대체 모델을 개발하고자 예의 노력한 결과, TSLP 처리에 따른 아토피 피부병변에서 중요한 소견인 필라그린 및 항균펩타이드 유전자의 발현량 감소 및 톨루엔 처리에 따른 필라그린 유전자의 발현량 감소를 3차원 피부조직 모델에서 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 3차원 피부조직 모델에 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 톨루엔(Toluene)을 처리하는 단계; (b) 상기 처리된 3차원 피부조직 모델에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및 (c) 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 3차원 피부조직 모델을 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델로 수득하는 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델에 아토피 피부염 치료제 후보물질을 처리한 다음, 상기 피부조직 모델의 세포에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 대조군에 비해 상기 필라그린의 발현을 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
도 1은 농도별 TSLP 처리에 따른 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 나타내는 것으로, (A)는 RT-PCR을 통해 확인한 TSLP 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) RNA 발현 변화, (B)는 웨스턴블랏을 통해 확인한 TSLP 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) 단백질 발현 변화, (C)는 면역형광염색법으로 확인한 각질세포 내 필라그린(Filaggrin) 단백질 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 농도별 톨루엔(Toluene) 처리에 따른 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 나타내는 것으로, (A)는 RT-PCR을 통해 확인한 TSLP 처리에 따라 필라그린(Filaggrin) RNA 발현 변화, (B)는 웨스턴불랏을 통해 확인한 톨루엔 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) 단백질 발현 변화, (C)는 면역형광염색법으로 확인한 각질세포 내 필라그린(Filaggrin) 단백질 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 TSLP 처리에 따른 3차원 피부 모델 내 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 나타내는 것으로, (A)는 TSLP 처리에 따른 필라그린(Filaggrin)의 발현 감소, (B)는 TSLP 처리에 따른 β-디펜신(β-defensin)과 서라이어신(Psoriasin, S100 calcium-binding protein A7(S100A7 유전자 산물))의 발현 감소를 나타낸 것이다.
도 4는 톨루엔(Toluene) 처리에 따른 3차원 피부 모델 내 필라그린(Filaggrin)의 발현 감소를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명에서는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 톨루엔으로 처리된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 통해서, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)를 처리한 경우 아토피 피부염 환자에서 발현량이 증가되어 있는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 의존적인 필라그린 단백질 및 항균펩타이드의 발현 감소를 확인하고, 톨루엔을 처리한 경우 필라그린 단백질이 감소되는 것을 확인함으로써, 아토피 피부염 치료제의 효능 평가 및 기전 연구 등에 활용할 수 있는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용한 새로운 동물 대체 시험 방법을 개발하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)를 처리한 대조군에 비하여 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)를 처리한 단층(monolayer)으로 배양된 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 RNA 및 단백질의 발현량이 TSLP 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 PBS를 처리한 대조군에 비하여 톨루엔을 처리한 단층으로 배양된 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 RNA 및 단백질의 발현량이 톨루엔 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 TSLP 처리에 따른 필라그린(Filaggrin)과 항균펩타이드 발현량의 감소가 3차원 피부 모델 내에서 일어나는 것을 확인하였고, 이는 단층으로 배양된 상기 각질세포에서의 필라그린 발현의 추이와 유사하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 톨루엔 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) 발현량의 감소가 3차원 피부 모델 내에서 일어나는 것을 확인하였고, 이는 단층으로 배양된 상기 각질세포에서의 필라그린 발현의 추이와 유사하였다..
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 3차원 피부조직 모델에 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 톨루엔(Toluene)을 처리하는 단계; (b) 상기 처리된 3차원 피부조직 모델에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및 (c) 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 3차원 피부조직 모델을 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델로 수득하는 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법에 관한 것이다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리된 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계는 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드의 발현이 추가로 감소된 3차원 피부조직 모델을 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델로 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리된 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조되고, 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델에 관한 것이다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리된 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델은 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드의 발현이 추가로 감소된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리된 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델에 아토피 피부염 치료제 후보물질을 처리한 다음, 상기 피부조직 모델의 세포에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 대조군에 비해 상기 필라그린의 발현을 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 처리된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현을 증가시키고, 항균펩타이드의 발현을 추가로 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 처리된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: TSLP 또는 톨루엔 처리에 따른 단층에서 배양된 각질세포에서의 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화
1) TSLP 처리
TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)에 의한 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 확인하기 위하여 단층(monolayer)으로 배양된 각질세포에 TSLP를 농도별로 처리한 다음, 상기 세포로부터 RNA와 단백질을 추출하여 필라그린의 발현량의 변화를 확인하였다.
필라그린의 RNA 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 사람 각질 세포주(HaCaT cell line; order no.300493, CLS, Eppelheim, Germany; German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany)(Boukamp et al., J. Cell Biol. 106:761-771, 1988)를 배양하여 0, 1, 10, 100ng/ml의 TSLP를 16시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), TRIzol 시약을 첨가한 뒤 균질기(homogenizer: OMNI-inc, 미국)를 이용하여 잘게 갈아준 뒤 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 상기 분리된 RNA는 역전사효소(Super-bio, Korea)를 이용하여 각 조직의 cDNA를 제조하였다. 상기 제조된 cDNA를 주형으로 하여 필라그린(Filaggrin) 프라이머(Filaggrin-f(forward)[서열번호 1]: 5’-ggtctggacgttcagggtct-3’, Filaggrin-r(reverse)[서열번호 2]: 5’-ggatgtggtgtggctgtgat-3’)와 GAPDH 프라이머(GAPDH-f(forward)[서열번호 3]: 5’-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3’, GAPDH-r(reverse)[서열번호 4]: 5’- CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3’) 프라이머를 이용하여 변성 단계(95℃, 30초), 어닐링 단계(56℃, 30초) 및 연장 단계(72℃, 40초)를 1싸이클로 하여 35싸이클을 실시하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하였다. 상기 증폭된 시료는 1% 아가로즈 젤에서 발현 양상을 관찰하였다(도 1A).
표 1
이름(서열번호) 서열(5'→3') 타입
Filaggrin-f(서열번호 1) 5'-ggtctggacgttcagggtct-3' 필라그린(filaggrin) 센스 프라이머
Filaggrin-r(서열번호 2) 5'-ggatgtggtgtggctgtgat-3' 필라그린(filaggrin) 엔티센스 프라이머
GAPDH-f(서열번호 3) 5'-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3' GAPDH 센스 프라이머
GAPDH-r(서열번호 4) 5'-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3' GAPDH 엔티센스 프라이머
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 사람 각질 세포주(HaCaT cell line)를 배양하여 0, 1, 10, 100ng/ml의 TSLP를 16시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), RIPA 버퍼(Elpis, Korea)를 세포에 처리하였고 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm, 30분간 원심분리하였고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그다음 로딩된 젤에 함유된 단백질을 PVDF에 트랜스퍼(transfer)한 후 5% BSA(Bovine Serum Albumin)로 1시간 동안 블로킹한 후 필라그린(Filaggrin) 항체(Santa Cruz, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션하였다. 그다음 HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다(도 1B).
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 세포 내에서 확인하기 위하여, 배양된 사람 각질 세포주(HaCaT cell line)에 cytoperm/cytofix(BD, USA)를 제공된 실험법에 따라 처리하여 세포를 고정하고 필라그린(Filaggrin) 항체 PBS(Phosphate-Buffered Saline)에 1:100으로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척한 뒤 Cy3가 부착된 2차 항체를 1:100으로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척한 다음, 형광현미경 하에서 필라그린의 발현을 확인하였다(도 1C).
그 결과, PBS를 처리한 대조군에 비하여 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)를 처리한 단층에서 배양된 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 RNA 및 단백질의 발현량이 TSLP 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
2) 톨루엔(Toluene) 처리
톨루엔(Toluene) 처리에 따른 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 확인하기 위하여 단층으로 배양된 각질세포에 톨루엔을 농도별로 처리한 후 RNA와 단백질 레벨에서의 필라그린의 발현량 변화를 확인하였다.
필라그린의 RNA 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 사람 각질 세포주(HaCaT cell line)를 배양하여 0, 12.5, 25, 50nM의 톨루엔을 24시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), TRIzol 시약을 첨가한 뒤 균질기(homogenizer)를 이용하여 잘게 갈아준 뒤 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 상기 분리된 RNA는 역전사효소(Super-bio, Korea)를 이용하여 각 조직의 cDNA를 제조하였다. 제조된 cDNA를 주형으로 하여 필라그린(Filaggrin) 프라이머(Filaggrin-f(forward)[서열번호 1]: 5’-ggtctggacgttcagggtct-3’, Filaggrin-r(reverse)[서열번호 2]: 5’-ggatgtggtgtggctgtgat-3’)와 GAPDH 프라이머(GAPDH-f(forward)[서열번호 3]: 5’-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3’, GAPDH-r(reverse)[서열번호 4]: 5’- CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3’) 프라이머를 이용하여 변성단계(95℃, 30초), 어닐링 단계(56℃, 30초) 및 연장 단계(72℃, 40초)를 1싸이클로 하여 35싸이클을 실시하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 시료는 1% 아가로즈 젤에서 발현 양상을 관찰하였다(도 2A).
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 사람 각질 세포주(HaCaT cell line)를 배양하여 0, 12.5, 25, 50nM의 톨루엔을 24시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), RIPA 버퍼(Elpis, Korea)를 상기 세포에 처리하여 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm, 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그다음 로딩된 젤에 함유된 단백질을 PVDF에 트랜스퍼한 후 5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 후 필라그린(Filaggrin) 항체(Santa Cruz, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다(도 2B).
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 세포 내에서 확인하기 위하여, 배양된 사람 각질 세포주(HaCaT cell line)에 cytoperm/cytofix(BD, USA)를 제공된 실험법에 따라 처리하여 세포를 고정하고 필라그린(Filaggrin) 항체 PBS에 1:100으로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척한 뒤 Cy3가 부착된 2차 항체를 1:100으로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 세척한 뒤 형광현미경 하에서 필라그린의 발현을 확인하였다(도 2C).
그 결과, PBS를 처리한 대조군에 비하여 톨루엔을 처리한 단층에서 배양된 각질세포 내 필라그린(Filaggrin)의 RNA 및 단백질의 발현량이 톨루엔 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 2: TSLP 또는 톨루엔 투여에 따른 3차원 피부 모델에서의 필라그린(Filaggrin)과 항균펩타이드의 발현 변화
3차원 피부 모델
실시예 2 및 3에서 사용된 3차원 피부 모델(The EpiDerm™ Skin Model, EPI-100, MatTek)은 신생아의 음경 포피 조직(Neonatal-foreskin tissue) 또는 성인 유방 조직 유래의 정상 인간 상피 각질세포(Normal Human Epithelial Keratinocytes: NHEK)를 구성 성분으로 하는 8∼15 세포층(cell layers)으로 이루어져 있으며, 이는 기저층(basal)-, 가시(spinous)-, 과립(granular)- 및 각질(cornified)-층을 가지는 생체 내(in vivo) 상피조직과 유사하다(Carlson et al., Curr Protoc Cell Biol., Chapter 19:Unit 19.9. doi:10.1002/0471143030.cb1909s41, 2008). 또한, 상기 3차원 피부 모델은 대사 및 세포분열 활성을 가지며, 성숙된 상피 특이적인 분화 마커인 프로-필라그린(pro-filaggrin), K1/K10 사이토케라틴 쌍(cytokeratin pair), 인볼루크린(involucrin) 및 1형 상피 트랜스글루타미나아제(type I epidermal transglutaminase)를 발현한다. 상기 3차원 피부 모델은 상피 성장인자(Epidermal growth factor), 인슐린, 하이드로코티손(hydrocortisone), 항생제 등을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 통상 3주까지 정상적 상피 형태(epidermal morphology)를 유지하는 가운데 배양가능하다.
상기 3차원 피부 모델을 MatTek사의 배양방법을 이용하여 배양한 다음, 하기와 같이 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 톨루엔을 투여(처리)하고, 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 변화를 확인하였다.
1) TSLP 처리
실시예 1의 시험관 내(in vitro) 실험을 통해 확인한 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)에 의한 필라그린(Filaggrin)의 발현 감소 현상이 3차원 피부 모델에서도 일어나는 현상인지 확인하기 위하여 3차원 피부 모델에 TSLP를 처리한 후 필라그린의 발현 변화를 면역조직화학염색법으로 확인하였다.
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 사람의 정상 상피 각질세포(Normal Human Epithelial Keratinocytes)로 구성된 3차원 피부 모델(The EpiDerm™ Skin Model, EPI-100, MatTek)을 MatTek사의 배양방법으로 배양하여 100ng/ml의 TSLP를 16시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), 3차원 피부 모델을 채취(TSLP가 처리된 3차원 피부 모델은 실시예 3의 아토피 피부염 치료제의 스크리닝에 이용)하여 4% 포름알데하이드(Sigma, USA)에 고정한 다음, 파라핀에 포매하여 슬라이드를 제작하였다. 조직 슬라이드를 자일렌을 이용하여 탈파린화 과정과 알코올을 이용하여 탈수화 과정을 거친 후 시트레이트 버퍼에 슬라이드를 담궈 전자레인지에서 10분간 돌린 후 실온에서 한 시간 동안 식혀주었다. 증류수로 상기 슬라이드를 세척하여 실온에서 5% 염소 혈청으로 한 시간 동안 반응시킨 후 항-필라그린(Filaggrin), 항-β-디펜신(β-defensin), 항-서라이어신(Psoriasin) 항체를 1:50으로 희석하여 인큐베이션하였다. HRP가 부착된 2차 항체를 반응시킨 후 DAB 키트를 이용하여 발색시켜 조직 내 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, PBS를 투여한 대조군에 비하여 TSLP를 투여한 3차원 피부 모델 내 필라그린(Filaggrin)과 항균펩타인드인 β-디펜신(β-defensin) 및 서라이어신(Psoriasin)의 발현량이 TSLP 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 이는 단층으로 배양된 상기 각질세포에서의 필라그린 발현의 추이와 유사하였다.
2) 톨루엔(Toluene) 처리
실시예 1의 시험관 내(in vitro) 실험을 통해 확인한 톨루엔에 의한 필라그린(Filaggrin)의 발현 감소 현상이 3차원 피부 모델에서도 일어나는 현상인지 확인하기 위하여 3차원 피부 모델에 톨루엔을 처리한 후 필라그린의 발현 변화를 면역조직화학염색법으로 확인하였다.
필라그린의 단백질 발현량의 변화를 확인하기 위하여, 3차원 피부 모델(The EpiDerm™ Skin Model, EPI-100, MatTek)을 MatTek사의 배양방법으로 배양하여 50μM의 톨루엔을 24시간 동안 배양액에 처리한 다음(대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 처리), 3차원 피부 모델을 채취(톨루엔이 처리된 3차원 피부 모델은 실시예 3의 아토피 피부염 치료제의 스크리닝에 이용)하여 4% 포름알데하이드(Sigma, USA)에 고정한 다음, 파라핀에 포매하여 슬라이드를 제작하였다. 조직 슬라이드를 자일렌을 이용하여 탈파린화 과정과 알코올을 이용하여 탈수화 과정을 거친 후 시트레이트 버퍼에 슬라이드를 담궈 전자레인지에서 10분간 돌린 후 실온에서 한 시간 동안 식혀주었다. 증류수로 상기 슬라이드를 세척하고, 실온에서 5% 염소 혈청으로 한 시간 동안 반응시킨 후 필라그린(Filaggrin) 항체를 1:50으로 희석하여 인큐베이션하였다. HRP가 부착된 2차 항체를 반응시킨 후 DAB 키트를 이용하여 발색시켜 조직내 필라그린(Filaggrin)의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, PBS를 투여한 대조군에 비하여 톨루엔을 투여한 3차원 피부 모델 내 필라그린(Filaggrin)의 발현량이 톨루엔 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 이는 단층으로 배양된 상기 각질세포에서의 필라그린 발현의 추이와 유사하였다.
통계처리
실시예 1 및 실시예 2에서의 통계분석은 두 그룹 간 유의성 검사로 t-test 검정법을 이용하였고, 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001인 경우 유효한 차이로 간주하였다. 모든 데이터는 평균(Mean)±측정표준오차(SEM)로 나타내었다.
실시예 3: 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법
실시예 2와 동일한 방법으로 3차원 피부조직 모델(The EpiDerm™ Skin Model, EPI-100, MatTek)에 TSLP 또는 톨루엔을 투여하여 수득한 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용하여, 대조군은 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 처리하였고, 실험군은 아토피 피부염 치료 후보물질을 처리한 다음, 필라그린 및 항균펩타이드(β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin))의 발현을 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 및/또는 면역조직화학염색법을 이용하여 분석하였다. 여기서, 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델에 처리한 아토피 피부염 치료 후보물질, PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 당업계의 통상적인 방법으로 적절한 농도와 노출 시간에서 처리하였다(Thomas K. Petersen, Basic ＆ Clinical Pharmacology ＆ Toxicology, 99:104-115, 2006). 대조군에 비해 실험군의 필라그린 및 항균펩타이드 발현을 증가시키는 후보물질을 잠재적인 아토피 피부염 치료제로 평가하고 선정하였다.
본 발명의 TSLP 또는 톨루엔 처리에 따른 3차원 피부조직 모델은 아토피 피부염의 피부병변에서 중요한 소견인 필라그린과 항균펩타이드인 β-디펜신 또는 서라이어신의 유전자 발현 감소를 보여줌으로써 아토피 피부염 유사 피부조직 모델로서의 가치가 크며, 아토피 피부염 치료제의 효능 평가 및 기전 연구 등에 활용할 수 있는 새로운 동물 대체 시험 방법을 제공할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법:
    (a) 3차원 피부조직 모델에 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 또는 톨루엔(Toluene)을 처리하는 단계;
    (b) 상기 처리된 3차원 피부조직 모델에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및
    (c) 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 3차원 피부조직 모델을 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델로 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드의 발현이 추가로 감소된 3차원 피부조직 모델을 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델로 수득하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델의 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델.
  7. 제6항에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델.
  8. 제6항에 있어서, 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현이 감소하고, 항균펩타이드의 발현이 추가로 감소된 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델.
  11. 다음 단계를 포함하는 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델을 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 아토피 피부염 유사 3차원 피부조직 모델에 아토피 피부염 치료제 후보물질을 처리한 다음, 상기 피부조직 모델의 세포에서 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현을 확인하는 단계; 및
    (b) 대조군에 비해 상기 필라그린의 발현을 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 3차원 피부조직 모델을 구성하는 세포는 인간의 각질세포(keratinocytes)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항균펩타이드는 β-디펜신(β-defensin) 또는 서라이어신(Psoriasin)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 필라그린(Filaggrin) 및 항균펩타이드의 발현 확인은 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-PCR), 웨스턴블랏 또는 면역조직화학염색법을 이용하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 필라그린(Filaggrin)의 발현을 증가시키고, 항균펩타이드의 발현을 추가로 증가시키는 후보물질을 치료제로 선정하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법.
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