WO2016088799A1 - 非ヒト哺乳動物 - Google Patents

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貴美子 井上
和史 形山
淳郎 小倉
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer

Definitions

  • the present invention relates to a non-human mammal. More specifically, the present invention relates to a cloned non-human mammal that can be used as an allergy model animal obtained by a somatic cell nuclear transfer method, and a method for preparing the non-human mammal.
  • lymphocytes are classified into two main types, B lymphocytes (hereinafter sometimes referred to as B cells) and T lymphocytes (hereinafter sometimes referred to as T cells). It recognizes specifically and acts on this to protect the living body.
  • the majority of T cells in the periphery are CD4 positive T cells having a CD (Cluster of Differentiation) 4 marker and CD8 positive T cells having a CD8 marker.
  • the majority of CD4 positive T cells are called helper T cells, are involved in assisting antibody production and inducing various immune responses, and differentiate into Th1, Th2, and Th17 types according to the type of cytokine produced by antigen stimulation To do.
  • Most of CD8 positive T cells differentiate into cytotoxic T cells exhibiting cytotoxic activity by antigen stimulation.
  • Analyzing specific biological responses to foreign antigens is important for elucidating the onset mechanism in immune diseases such as allergies caused by the antigen and developing preventive and therapeutic methods.
  • various biological reaction cascades for the purpose of protecting the living body are activated by being specifically recognized by CD4-positive T cells. So far, various studies have been conducted to clarify the function and role of antigen-specific CD4 positive T cells.
  • Antigen-specific CD4-positive T cells can be grown in vivo by administering the antigen to a laboratory animal such as a mouse together with an appropriate adjuvant substance, and the reaction can be observed at the individual level and ex vivo.
  • CD4 positive T cells removed from antigen-sensitized animals are co-cultured with specific antigens and antigen-presenting cells, and cloned by limiting dilution to obtain a group of cells derived from a single antigen-specific CD4 positive T cell. It is possible to obtain.
  • Analyzing the reactivity of a single CD4-positive T cell is important in clarifying its differentiation mechanism, signal transduction mechanism via T cell receptor (TCR), and cell-to-cell variation.
  • TCR T cell receptor
  • mice lacking T cells on the recipient side all existing T cell-deficient mice exhibit some kind of immunodeficiency, and in order to analyze the immune mechanism via the transferred CD4-positive T cells. It is difficult to construct an appropriate experimental system.
  • DO11.10, OT-II, and OVA23-3 mice, and transgenic (Tg) mice into which antigen-specific TCR genes disclosed in Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1 are introduced have been developed.
  • DO11.10 and OT-II mice have come to be frequently used as experimental animals that can solve the above-mentioned problems.
  • the TCR-Tg mice described above can easily prepare CD4-positive T cells having a single TCR in vitro, and can easily induce an antigen-specific reaction even in vivo.
  • T cell-derived mice As a T cell-derived one, first, a T cell-derived mouse whose antigen specificity is unknown was prepared in 2002 (see Non-Patent Document 2), and thereafter, a clone mouse derived from an antigen-specific NKT cell (Patent Document) 2), a clone mouse derived from antigen-specific CD8-positive T cells has been born (see Patent Document 3).
  • the object of the present invention is to establish a technique for producing antigen-specific CD4-positive T cell cloned animals, and to respond to various antigens that are suggested to be associated with immune allergic diseases such as mites and cedar pollen. Is to provide.
  • the present invention relates to the following [1] to [22].
  • [1] A non-human mammal and its progeny obtained by a somatic cell nuclear transfer method using the nucleus of a CD4-positive T cell as a nuclear donor.
  • CD4-positive T cells are CD4-positive T cells in G 0 phase and / or G 1 phase, (1) non-human mammal and its progeny according.
  • [3] The non-human mammal and the progeny thereof according to [1] or [2], wherein the gene region of the T cell receptor is reconstituted as a T cell receptor specific to a tick antigen.
  • CD4 positive T cell is a CD4 positive T cell obtained by culturing with IL-2 added, removing IL-2, and further culturing.
  • the gene region of the T cell receptor is reconstituted as a tick antigen-specific T cell receptor.
  • the mite antigen is a worm body or excrement, extract thereof, recombinant protein, or synthetic peptide of the mite or mite mite.
  • the gene region of the T cell receptor is reconstituted as an ovalbumin-specific T cell receptor.
  • the T cell receptor gene region is reconstituted as a tick antigen-specific T cell receptor, and a single type of T cell receptor derived from the gene region is expressed in an individual.
  • Human mammal Human mammal.
  • the T cell receptor gene region is reconstituted as an ovalbumin-specific T cell receptor, and a single type of T cell receptor derived from the gene region is expressed in an individual. Human mammal.
  • CD4-positive T cells are CD4-positive T cells in G 0 phase and / or G 1 phase, [14], wherein the allergic mouse model.
  • the mite antigen is a worm body or excrement, extract thereof, recombinant protein, or synthetic peptide of a mite or mite mite.
  • the non-human mammal of the present invention has an excellent effect of reliably and efficiently exhibiting an allergic reaction specific to mite antigen, cedar pollen, ovalbumin and the like.
  • an allergy model animal elucidation of the onset mechanism in allergic diseases caused by specific biological reactions to mite antigen, cedar pollen, ovalbumin, etc. It is possible to contribute to development.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the preparation result of antigen-specific CD4 positive T cells.
  • the results of controlling the addition of IL-2 (left figure) and the results of continuing to add IL-2 (right figure) are shown for CD4-positive T cells of sensitized mice.
  • the upper figure shows the purity of CD4-positive T cells after preparation, and the lower figure shows the cell cycle pattern.
  • FIG. 2 shows antigens in peripheral blood CD4-positive T cells using two cloned mice (Df # 1, Df # 2) obtained using Mite Extract-Df (LG5339) as an antigen and CFA as an adjuvant. It is a figure which shows the result of having analyzed specific proliferation reaction.
  • CD4 is the case where CD4 positive T cells are cultured alone
  • APC is the case where antigen-presenting cells obtained by irradiating X-rays on spleen cells of normal mice
  • CD4 + APC is CD4
  • APC CD4 + APC + Df represents the case where CD4, APC and mite antigen are mixed and cultured.
  • FIG. 3 shows the results of cloning of TCR ⁇ chain (TRAV) / TCR ⁇ chain (TRBV) in peripheral blood CD4-positive T cells of cloned mice (Df # 1). The numerical value in the figure represents the primer set number assigned uniquely, and M represents the marker.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of TCR genotyping of cloned mice and their F1 mice.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of analyzing the antigen-specific proliferation reaction in the F1 mouse of the cloned mouse.
  • the “ ⁇ ” column indicates a case where a non-specific antigen is reacted
  • the “Df” column indicates a case where a specific antigen is reacted.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analysis of antigen-specific proliferation reaction in peripheral leukocytes using a cloned mouse (OVA # 6) obtained using OVA 326-339 partial peptide as an antigen.
  • FIG. 7 shows the results of analysis of antigen-specific proliferation reaction in peripheral leukocytes using cloned mice (Dp # 7 to 11) obtained using Derp1 (RP-DP1D-1) as an antigen and CFA as an adjuvant.
  • FIG. 8 shows the results of flow cytometry analysis of reconstituted TCR expression in cloned mouse T cells. The upper row shows the results in CD4 cells, and the lower row shows the results in CD8 cells.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of analyzing the antigen-specific proliferation reaction in cloned mice (Df # 1, Df # 2).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of analyzing an antigen-specific proliferation reaction in a cloned mouse (Dp # 7).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of analyzing the differentiation ability of CD4-positive T cells of cloned mice (Dp # 1, Dp # 2) by flow cytometry. The upper half is for Dp # 1 mice and the lower half is for Dp # 2 mice. In the figure, “***” indicates P ⁇ 0.001 by Dunnett's method.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of analyzing the differentiation ability of CD4-positive T cells of cloned mice (Dp # 1, Dp # 2) by flow cytometry. The upper half is for Dp # 1 mice and the lower half is for Dp # 2 mice. In the figure, “***” indicates P ⁇ 0.001 by Dunnett's method.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of analyzing the differentiation ability of CD4-positive T cells of cloned mice (Dp # 1, Dp # 2) by flow cytometry. The upper half is for Dp # 1 mice and the lower half is for Dp # 2 mice. In the figure, “***” indicates P
  • FIG. 12 is a view showing the results of examining the onset of bronchial asthma-like airway inflammation in a cloned mouse (Dp # 1).
  • the upper graph shows the results of the number of inflammatory cells in the cloned mice having reconstituted TCR, and the lower graph shows the induction results of bronchial asthma-like airway inflammation in normal mice.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of examining the onset of antigen-induced nasal mucosal reaction in cloned mice (OVA # 6).
  • the upper row shows the results for rhinitis reaction (sneezing reaction), and the lower row shows the results for intranasal reaction (number of inflammatory cells).
  • the non-human mammal of the present invention is characterized by being obtained by a somatic cell nuclear transfer method (a somatic cell clone method) using an antigen-specific CD4-positive T cell nucleus as a nuclear donor.
  • a somatic cell nuclear transfer method a somatic cell clone method
  • an antigen-specific CD4-positive T cell nucleus as a nuclear donor.
  • the non-human mammal of the present invention may be described as the cloned animal or the cloned mammal of the present invention.
  • Tg animals are obtained by transplanting fertilized eggs into which artificially recombined DNA has been introduced.
  • TCR-Tg mice existing MHC-class II-restricted TCR-Tg mice (hereinafter referred to as TCR-Tg mice) Since the expression of T cell receptor (TCR) in CD4 positive T cells is regulated by a foreign promoter, its expression level and expression timing are different from those of endogenous TCR.
  • T cell reactivity associated with TCR stimulation is known to vary depending on the affinity for antigen and the expression level of TCR, so the body naturally acquires the response of CD4-positive T cells in TCR-Tg mice. It is not clear whether it completely reflects the response of the antigen-specific CD4-positive T cells.
  • Balb / c mice are said to be susceptible to so-called Th2 type T-cell responses due to antigen sensitization, but when antigen-specific responses are observed at the individual level in DO11.10 mice in the background, Th17 / Th1 Significant responses have been elicited (Lemaire MM, Dumoutier L, Warnier G, Uyttenhove C, Van Snick J, de Heusch M, usStevens M, Renauld JC. Dual TCR expression biases lung DO11 .10 transgenic mice and promotes neutrophilia via microbiota-induced Th17 differentiation. J Immunol 2011; 187: 3530-7.).
  • the cloned animal obtained in the present invention has CD4-positive T cells that express antigen-specific TCR, which is obtained by using nuclei obtained from antigen-specific CD4-positive T cells closer to in vivo as a nuclear donor. Because it is a somatic cell clone animal that has been used and passed the same genetic information as the CD4 positive T cell from which the nucleus was provided, it is not an unnatural reaction feared by TCR-Tg mice, but an antigen that the living body naturally acquired It is presumed that an antigen-specific reaction that completely reflects the response of specific CD4-positive T cells can be observed.
  • a biological cascade caused by mite antigens appears as a complex phenotype of a reaction specific to many epitopes in mite antigen protein. Since an animal that expresses only a positive response can be obtained, it is possible to analyze in detail the nature of each epitope and the CD4 positive T cells that respond to it. In order to perform the same analysis using TCR-Tg mice, it is necessary to prepare transgenic mice after cloning TCR, and to confirm the transgene for each individual obtained. These steps can be omitted by the technique for producing an antigen-specific CD4 positive T cell cloned animal provided by, and a more efficient antigen-specific reaction analysis method can be provided.
  • the non-human mammal is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human, but rodents such as mice, rats, guinea pigs, and rabbits are preferably used, and mice are particularly preferable.
  • rodents such as mice, rats, guinea pigs, and rabbits are preferably used, and mice are particularly preferable.
  • the mouse to be used and a known mouse can be used, but the production efficiency of the nuclear transfer mouse is higher in the F1 mouse than in the pure mouse, and the histocompatibility antigen of the BALB / c mouse and the DBA2 mouse
  • the CD2F1 (BALB / c x DBA2) system is preferably used in the present invention.
  • the CD4 positive T cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antigen-specific T cell.
  • the target antigen include indoor dust such as mites and insect antigens, cedar pollen, cypress pollen, Examples thereof include pollen antigens such as rice pollen, and dietary antigens such as soybeans and eggs.
  • tick antigen-specific T cells are used will be described as an example, but the present invention is not limited thereto.
  • the mite antigen in the present invention is not particularly limited, and the species of mites is not limited. Examples include Dermatophagoides farinae (Df), Dermatophagoides pteronyssinus (Dp)), and the like, or their excrements, extracts prepared from them according to known methods, recombinant proteins, synthetic peptides, Those commercially available products can be suitably used.
  • Df Dermatophagoides farinae
  • Dp Dermatophagoides pteronyssinus
  • Mite Extract-Df Mite-Df Feces AG
  • Mite Extract-Dp Mite-Dp Feces AG
  • DerDf1 Der f2
  • Der f II manufactured by Shiba Gogi Co., Ltd.
  • Kona Leopard Mite Yake Leopard Mite (above, Biosta).
  • Tick antigen-specific T cells used in the present invention are tick antigen-specific CD4-positive T cells obtained by normal sensitization of the mite antigen. Antigen sensitization can be performed according to a known method, and an antigen can be sensitized with a known adjuvant. In addition, in order to obtain a sufficient number of CD4-positive T cells for nuclear transfer, it was obtained by culturing in the presence of a tick antigen and a known factor capable of inducing proliferation of CD4-positive T cells. Also good. Examples of the growth inducer include IL-2 and IL-4. The obtained T cells can be appropriately selected and collected by performing, for example, FACS analysis or known co-culture. The culture conditions here can be appropriately set according to the type of T cell.
  • the T cell is preferably a cell in the G 0 phase and / or the G 1 phase from the viewpoint that when a cell in the cell cycle is used, the production efficiency of the cloned animal is remarkably reduced.
  • the cell in the above state is obtained by adding, for example, a growth-inducing factor, removing it, and further culturing the antigen-specific CD4 synchronized with the G 0 phase and / or G 1 phase. It can be collected from a cell population of positive T cells.
  • pretreatment for reducing the proliferation of antigen non-specific T cells is performed. You may do it.
  • a CD4 positive T cell population collected from a mammal after antigen sensitization is co-cultured with spleen cells lacking proliferative ability and a specific antigen, no growth inducer is added. Proliferation of non-antigen-specific T cells can be reduced. After culturing with the addition of growth inducer cell population became the state, by further culturing to remove the proliferation-inducing factor, antigen-specific CD4-positive tuned to G 0 phase and / or G 1 phase A cell population of T cells can be obtained with high efficiency.
  • the culture period is not particularly limited, but may be a culture period of several days, preferably 3-4 days.
  • IL-2 is preferred as a growth inducing factor.
  • the T cell species is preferably the same species as the non-human mammal produced.
  • tick antigen-specific CD4-positive T cells obtained in this way have a tick antigen epitope displayed on the cell surface by MHC-class II, in addition to having a CD (Cluster-of-Differentiation) 4 marker on the cell membrane.
  • TCRs that can bind to mite antigens are usually composed of ⁇ - and ⁇ -chain heterodimers, which recognize antigens on antigen-presenting cells. Both ⁇ and ⁇ chains are variable regions (V regions) and constant. It is composed of a region (C region) and is reconstructed (reorganized) when reacting with an antigen.
  • VDJ rearrangement of the ⁇ chain is first performed, and then VJ rearrangement of the ⁇ chain is performed. Since wild animals have an opportunity to be exposed to various antigens in nature, each T cell present in the body usually expresses different TCRs corresponding to these many antigenic epitopes.
  • a single species of TCR that is specific to each mite antigen, consisting of ⁇ - and ⁇ -chain heterodimers reconstituted as usual in each cloned mouse, is already present in most T cells in the body before it reacts with the antigen. It has the characteristic that it is expressed. From the gene structure of TCR, it becomes possible to follow the origin of donor cells in the obtained cloned animals.
  • Nuclear transfer is performed using the aforementioned mite antigen-specific CD4-positive T cells.
  • the method of nuclear transfer is not particularly limited as long as it uses a tick antigen-specific CD4-positive T cell nucleus as a nuclear donor. For example, the method described in Nature 1998; 394: 369-74. Can be referred to.
  • nucleus of a tick antigen-specific CD4-positive T cell can be replaced with the nucleus of an unfertilized ovum derived from a mammal of the same species as the cell. Is used to suck and enucleate the nucleus of the unfertilized oocyte and the surrounding cytoplasm, and similarly, the nucleus extracted from the tick antigen-specific CD4-positive T cells is introduced using a pipette.
  • nuclear transfer may be performed by introducing a tick antigen-specific CD4-positive T cell itself containing the nuclear donor and cell fusion.
  • a treatment for eliminating the cytoskeleton in advance at the time of enucleation may be performed, or the same treatment may be performed after the nuclear transfer. The disappearance of the cytoskeleton can be performed by using cytochalasin.
  • the oocyte to be subjected to nuclear transfer is not particularly limited as long as it is derived from the same kind of mammal as the nuclear donor cell, and can be obtained by, for example, known superovulation treatment. Further, the oocyte may or may not be activated, but an activated state is preferable. The activation may be performed before or after the nuclear transfer, and can be performed by stimulation with an electrical treatment method or a drug treatment method. Specifically, it can be carried out by increasing the divalent cation concentration in the oocyte, decreasing the degree of phosphorylation of the cellular protein in the oocyte, or the like.
  • a divalent cation eg, magnesium, strontium, barium, calcium
  • Other methods for increasing the divalent cation concentration include electric shock, ethanol treatment, and cage chelating agent treatment methods.
  • a method for reducing the degree of phosphorylation include a method of adding a kinase inhibitor (for example, a serine-threonine kinase inhibitor such as 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, and sphingosine).
  • phosphatase can be introduced into the oocyte to inhibit oxidation.
  • reconstructed embryo means an embryo reconstructed with a nuclear donor and an oocyte-derived cytoplasmic component.
  • the transplantation of the reconstructed embryo into the host mammal can be performed according to a method known in the art. Specifically, for example, a reconstructed embryo cultured until reaching the 2-8 cell stage can be transplanted.
  • the culture conditions of the reconstructed embryo can be appropriately set according to the oocyte, and may be cultured together with the feeder cells according to a known method.
  • the host mammal is not particularly limited as long as it can generate a reconstructed embryo therein, but is preferably a mammal derived from the same species as the collected oocyte, more preferably a pseudopregnant female. It is a chewed animal.
  • pseudopregnant female mice can be obtained by mating normal-period female mice with male mice castrated by vas deferment or the like.
  • a cloned animal can be prepared by transferring the above-described reconstructed embryo (clone embryo) into the uterus, especially in the fallopian tube for pregnancy and birth to the produced pseudopregnant mouse.
  • the pseudopregnant mouse to be a foster parent is preferably selected from a group of female mice in the same sexual cycle as the female mouse from which the oocyte is collected.
  • cloned animals derived from CD4 positive T cells specific for antigens other than mite antigens can be obtained in the same manner as described above.
  • ovalbumin (OVA) and OVA-derived portions are used.
  • Peptides and the like can be preferably used. These may be synthetic products or commercial products, and may be used alone or in combination of two or more.
  • the length of the partial peptide is not particularly limited, and examples thereof include OVA326-339, OVA323-339, and the like.
  • the egg seed is preferably the same species as the non-human mammal produced.
  • the cloned animal of the present invention is obtained.
  • CD4 positive T cells specific to mite antigen are proliferated and immune response is induced.
  • CD4 positive T cells specific to OVA Proliferate and induce an immune response.
  • the origin of cloned animals can be confirmed by examining the genetic information of TCR in CD4-positive T cells. Since the cloned animal obtained as described above has the same histocompatibility antigen as the cells of the nuclear donor, the tissues and organs of the obtained cloned animal were transplanted to the mammal which is the donor of the nuclear donor. In this case, immune tolerance is not recognized as non-self and immune rejection does not occur.
  • the progeny can be obtained using the cloned animal of the present invention. Specifically, it can be obtained by mating a cloned animal generated from the reconstructed embryo with a second mammal. As the second mammal, a wild-type animal of the same kind as the cloned animal, or an animal generated from the cloned embryo or its progeny can be used.
  • the term ⁇ offspring '' refers to the offspring generation (F1) whose parent is the cloned animal of the present invention, the offspring generation whose parent is Fl (F2), the offspring generation whose parent is F2 (F3), etc. Includes those derived from cloned animals.
  • the gene region of the T cell receptor is reconstituted as, for example, a tick antigen-specific T cell receptor or an OVA-specific T cell receptor.
  • a single species of T cell receptor preferably only the T cell receptor, is expressed in the individual, so it has the same tick antigen-specific TCR or OVA-specific TCR as the cell from which the nuclear donor was collected.
  • T cells having such a TCR have normal differentiation ability against antigen stimulation. Therefore, the progeny of the cloned animal of the present invention can greatly contribute to, for example, research on diseases and / or pathologies caused by mite antigens and OVA, for example, elucidation of the onset mechanism.
  • diseases and / or pathologies caused by mite antigens include allergic diseases, and specifically include bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, and allergic conjunctivitis.
  • OVA Hapsinogen activator a dermatitis .
  • foods that induce respiratory symptoms such as urticaria and cough, and gastrointestinal symptoms such as diarrhea, abdominal pain and vomiting It includes allergies, bronchial asthma, and atopic dermatitis.
  • the present invention also provides a method for preparing a non-human mammal, in which somatic cell nucleus transplantation is performed using the nucleus of a mite antigen-specific T cell or OVA-specific T cell as a nuclear donor.
  • mite antigen-specific T cells those described in the section of the non-human mammal of the present invention can be used, and the preparation thereof can also be performed.
  • a method for expressing TCR specific to mite antigen in T cells and a method for somatic cell nuclear transfer can be performed in the same manner as the procedure described in the section of the non-human mammal of the present invention. The same applies to OVA-specific T cells.
  • the non-human mammal of the present invention can be used as an experimental model because an immune response is induced by antigen sensitization. That is, the present invention also provides an allergy model mouse comprising the non-human mammal of the present invention and its progeny.
  • the allergic model mouse can be obtained by sensitizing the non-human mammal of the present invention and its progeny with an antigen corresponding to the CD4-positive T cell used at the time of production.
  • mite antigen or OVA it is possible to obtain a model mouse exhibiting a pathological condition of bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis, or gastrointestinal allergy. .
  • mite antigen or OVA it is possible to obtain a model mouse exhibiting a pathological condition of bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, allergic conjunctivitis, or gastrointestinal allergy.
  • By using an experimental model exhibiting such a pathological condition it is possible to
  • Example 1 Preparation of antigen-specific CD4-positive T cells
  • Mite antigens Dermatophagoides farinae (Df) and Dermatophagoides pteronyssinus (Dp)
  • Alum aluminum hydroxide
  • CFA Complete Freund's adjuvant
  • inguinal lymph nodes were excised and suspended in a culture medium containing fetal calf serum to prepare cells.
  • a culture medium containing fetal calf serum After concentrating CD4 positive T cells with a magnetic sorting system using CD4 antibody beads, the culture was started with spleen cells prepared from the same mouse and X-irradiated to lack proliferation ability and a specific antigen.
  • the cells were cultured without adding IL-2, and then IL-2 was added and further cultured for 3 to 4 days.
  • Example 2 (Preparation of a nuclear transplant mouse) Using the CD4-positive T cells obtained in Example 1 as nuclear donor cells, nuclear transfer mice were prepared. Embryo preparation is performed according to the method described in Nature 1998; 394: 369-74, Biology of Reproduction 2012; 86: 1-6, and the embryo culture solution is Lawitts JA, and Biggers JD 1993. Culture of preimplantation embryos. KSOM medium was used according to the method described in Methods Enzymol. 225: 153-164.
  • nuclear donor cells were injected with a piezo drive micromanipulator. After the injection, the cells were cultured for 1 to 2 hours in an environment of 37.5 ° C. and 6% CO 2 and then activated in a KSOM medium in the presence of 50 nM trichostatin A, 5 ⁇ M latrunculin A, and 3 mM strontium. Subsequently, after culturing for 7 hours in the presence of latrunculin A, the cells were cultured in a normal KSOM medium.
  • Example 3 (antigen reactivity 1 in CD4 positive T cells of cloned mice)
  • White blood cells or CD4 positive T cells were prepared from the peripheral blood of Df-specific CD4-positive T cell cloned mice established in Example 2, and cultured with spleen cells and specific antigen (Df) irradiated with X-rays from normal mice.
  • the cell proliferation reaction was analyzed using Cell proliferation reagent (Roche) on the 4th to 5th days from the start of the culture. The results are shown in FIG.
  • Example 4 TCR cloning of cloned mice. Prepare mRNA from peripheral blood of established Df-specific CD4-positive T cell clone mice, and perform RT-PCR for TCR ⁇ and TCR ⁇ chains, respectively, using a library of variant chain-specific primers and constant chain-specific primer sets It was. As a result, the TCR ⁇ / TCR ⁇ chain expressed in each cloned mouse could be cloned (see FIG. 3).
  • Example 5 Genetic properties related to antigen specificity of cloned mice
  • the TCR sequence after cloning in Example 4 was determined by sequencing, and a Genotyping primer set for detecting it was designed. At the same time, a primer set for detecting wild type allele was also prepared.
  • the cloned mice were back crossed with BALB / c mice to produce F1 mice, and genomic DNA was extracted together with the parent mice to perform PCR genotyping. The results are shown in FIG.
  • leukocytes were prepared from the peripheral blood of the obtained F1 mice (Df # 1-1-7) and cultured with spleen cells and normal antigen (Df) or non-specific antigen (ME06) irradiated with X-rays from normal mice.
  • the antigen-specific proliferation reaction was analyzed using Cell-proliferation-reagent (Roche).
  • Fucosadium-proliferation-reagent Roche
  • an antigen-specific proliferation reaction was observed in F1 mice Df # 1-1, Df # 1-3, and Df # 1-7 that inherited the rearrangement allele of both the TCR ⁇ chain and the TCR ⁇ chain from the parent mouse.
  • FIG. 5 See FIG. 5). From this, it is clear that antigen reactivity in cloned mice generated from antigen-specific CD4-positive T cells requires both reconstituted TCR ⁇ and TCR ⁇ chains, and that traits are inherited by offspring. became.
  • Example 6 (antigen reactivity 2 in CD4 positive T cells of cloned mice)
  • OVA-specific CD4 positive T cell clone mouse OVA # 6 obtained with reference to Examples 1 and 2 and the Dp-specific CD4 positive T cell clone mouse (Dp # 7 to 11) obtained in Example 2 ) was analyzed for antigen reactivity.
  • peripheral leukocytes of a cloned mouse produced using an OVA 326-339 partial peptide as an antigen, an OVA 326-339 partial peptide, an OVA 323-339 partial peptide, or an OVA protein and an antigen-presenting cell (antigen-).
  • the cells were cultured together with spleen cells from normal BALB / c mice irradiated with X-rays as presenting cells (APC).
  • APC presenting cells
  • peripheral leukocytes were cultured with Der p1 and APC.
  • the cell proliferation reaction was analyzed using Cell proliferation reagent (Roche) on the 4th to 5th days from the start of the culture.
  • FIG. 6 shows the result of the cloned mouse (OVA # 6)
  • FIG. 7 shows the result of the cloned mouse (Dp # 7 to 11).
  • Example 7 TCR expression in cloned mice It was examined whether the reconstituted TCR chain was expressed on the surface of cloned mouse T cells. In addition, it was confirmed in advance by PCR cloning that V ⁇ 13-1 was included in the reconstructed TCR ⁇ chain of OVA # 6 and Dp # 8 among the produced cloned mice.
  • TCRV ⁇ 13-1 was expressed on the surface of CD4 positive T cells and CD8 positive T cells in OVA # 6 and Dp # 8 cloned mice. It has been clarified that the reconstituted TCR chain in the cloned mouse functions by being expressed on the surface of the T cell.
  • Example 8 Antigen specificity in CD4 positive T cells of cloned mice
  • Antigen specificity was examined using cloned mice of Df # 1, Df # 2, and Dp # 7.
  • CD4 positive T cells of Df # 1 and Df # 2 showed proliferative reaction in response to Der f crude extract (Der f) and Der f insect body extract (Der fb). It did not react with the extract (Der p) and the Der p insect extract (Der pb) (Fig. 9).
  • CD4 positive T cells of Dp # 7 showed a proliferative reaction in response to the mature Der p1 full-length protein (amino acids 99-320) and its partial protein (amino acids 169-248) (FIG. 10, left figure).
  • Example 9 (differentiation ability of cloned mouse CD4-positive T cells) CD4-positive T cells are known to proliferate in response to TCR stimulation and to differentiate into various Th cells. Therefore, the differentiation ability of CD4-positive T cells in cloned mice established from Der f-specific CD4-positive T cells was examined.
  • Offspring obtained by mating Df # 1 mice with normal mice are V ⁇ 2 and / or V ⁇ 6D-4 reconstituted in one-sided allele, or wild-type V ⁇ (WT-V ⁇ ) and V ⁇ (WT- V ⁇ ) is known to have a gene (see Example 5).
  • WT-V ⁇ wild-type V ⁇
  • WT- V ⁇ wild-type V ⁇
  • V ⁇ V ⁇
  • V ⁇ wild-type V ⁇
  • V ⁇ Wild-type V ⁇
  • V ⁇ Wild-type V ⁇
  • V ⁇ V ⁇
  • Df # 1 mice and Df # expressing reconstituted TCR ⁇ and ⁇ were compared to wild type mice in which both alleles were WT-V ⁇ and WT-V ⁇ under the stimulation conditions with anti-CD3 + anti-CD28 antibody beads.
  • the production of IFN- ⁇ and IL-17A was enhanced and the production of IL-4 was attenuated (upper diagram of each mouse). It was suggested that Th1 and Th17 differentiation was enhanced in these mice.
  • a similar trend was seen in Df # 1 mice expressing reconstituted TCR ⁇ (results not shown).
  • Example 10 (Bronchial asthma-like airway inflammation reaction in cloned mice) Der f antigen once daily for 3-4 days to offspring of Df # 1 mice with reconstituted V ⁇ 2, V ⁇ 6D-4, wild type V ⁇ (WT-V ⁇ ) or V ⁇ (WT-V ⁇ ) allele A total of 4-12 nasal challenges were performed at intervals to examine the development of bronchial asthma-like airway inflammation.
  • mice with WT-V ⁇ and WT-V ⁇ allele showed a slight increase in the number of eosinophils in the respiratory tract and lymphocyte infiltration by the antigen challenge four times compared to the saline challenge.
  • Response and neutrophil infiltration number were markedly enhanced in mice expressing V ⁇ 2 and V ⁇ 6D-4 (FIG. 12, upper panel).
  • the mice expressing either V ⁇ 2 or V ⁇ 6D-4 were not as potent as mice expressing both, the same enhanced reactivity was observed.
  • mice expressing V ⁇ 2 and / or V ⁇ 6D-4 challenged with antigen four times MCh is gradually inhaled compared to wild-type mice having WT-V ⁇ and WT-V ⁇ allele and control mice challenged with saline.
  • Rrs that is, the airway stenosis reaction
  • bronchial asthma-like BHR developed (FIG. 12, lower left).
  • CD2F1 mice and BALB / c mice were similarly examined, slight BHR was observed in CD2F1 mice as a result of 12 antigen challenge, but the reactivity expressed reconstituted TCR. It was clearly weaker than the cloned mouse (FIG. 12, bottom right).
  • the allergic airway inflammation reaction induced by the antigen challenge is enhanced, and it was revealed that a bronchial asthma-like pathological model can be established in a very short period of time compared to the wild-type mice.
  • Example 11 (Allergic rhinitis-like reaction in cloned mice) Offspring of OVA # 6 mice with reconstituted V ⁇ 13-1, V ⁇ 4-4, wild type V ⁇ (WT-V ⁇ ) or V ⁇ (WT-V ⁇ ) allele, once daily for 5 consecutive days A nasal challenge was performed to examine allergic rhinitis-like sneezing reaction or nasal inflammation reaction.
  • OVA # 6 mice and BALB / c mice were challenged with OVA and saline (control) as described above, and the number of sneezes immediately after antigen challenge (5 Per minute) and the number of sneezing (per 5 minutes) immediately after administration of histamine or BSA as a nonspecific stimulus 6 hours after challenge.
  • nasal washing nasal lavage: NAL
  • NAF fluid NALF
  • mice having WT-V ⁇ and WT-V ⁇ allele the sneezing reaction was hardly induced by any of the 3 or 5 antigen challenge.
  • mice expressing V ⁇ 13-1 and V ⁇ 4-4 the number of sneezes immediately after challenge was clearly higher than in wild-type mice, and the onset of so-called immediate rhinitis response (INR) was observed ( FIG. 13, upper left).
  • the sneezing reaction induced by nonspecific stimulation after antigen challenge was hardly induced in wild type mice, but was clearly induced in mice expressing both V ⁇ 13-1 and V ⁇ 4-4. It was clarified that nasal mucosal hyperresponsiveness (nasal hyperresponsiveness: NHR) developed in a cloned mouse with a slight antigen challenge (FIG. 13, upper middle and right).
  • mice expressing both V ⁇ 13-1 and V ⁇ 4-4 have increased infiltration of eosinophils, neutrophils, and lymphocytes into the nasal mucosa compared to wild-type mice. (FIG. 13, bottom).
  • cloned mice it became clear that inflammatory cell infiltration into the nasal mucosa and allergic rhinitis-like pathology with NHR can be established in a very short time.
  • mice expressing reconstituted TCR ⁇ and TCR ⁇ showed a tendency to differentiate into Th1 and Th17 compared to wild-type mice, but it was also clear that they acquired Th2 cytokine production ability under more physiological conditions. became.
  • various allergic diseases are not simple Th2-type diseases, but show a complicated state involving many subsets including Th1 and Th17 (Osamu Kanuma et al. : 1526-1534, 2015.).
  • the cloned mice obtained this time are considered suitable for analyzing such complicated allergic conditions.
  • mice can establish a bronchial asthma-like and allergic rhinitis-like pathological model in a very short period of time compared to wild-type mice.
  • an antigen is administered systemically with an adjuvant substance such as alum for sensitization, and then an antigen challenge is performed on a target organ to develop a disease state.
  • an adjuvant substance such as alum for sensitization
  • This cloned mouse was shown to be useful not only for bronchial asthma but also for analysis of allergic rhinitis.
  • this model is expected to be useful for elucidating the pathogenesis of allergic rhinitis.
  • the non-human mammal of the present invention exhibits an allergic reaction specific to a mite antigen reliably and efficiently, it can be suitably applied as an onset model of allergic diseases.
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a partial peptide consisting of amino acid sequences 169 to 188 of the Japanese white mite protein.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a partial peptide consisting of the amino acid sequence 179 to 198 of the white mite protein.
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is a partial peptide consisting of the amino acid sequence 189 to 208 of the white mite protein.
  • SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is a partial peptide consisting of the amino acid sequences 202 to 221 of the white mite protein.
  • SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is a partial peptide consisting of the amino acid sequence 209 to 228 of the white mite protein.
  • SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is a partial peptide consisting of the amino acid sequence 219 to 238 of the white mite protein.
  • SEQ ID NO: 7 in the sequence listing is a partial peptide consisting of amino acid sequences 229 to 248 of the Japanese white mite protein.

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Abstract

　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、非ヒト哺乳動物及びその子孫。本発明の非ヒト哺乳動物は、ダニやスギ花粉など、免疫アレルギー疾患との関連性が示唆されているさまざまな抗原に、特異的なアレルギー反応を確実かつ効率的に呈することから、アレルギー疾患の発症モデルとして、当該疾患に対する応用の可能性などを研究又は追求することによって、さまざまな疾患の研究に好適に用いることができる。

Description

非ヒト哺乳動物
　本発明は、非ヒト哺乳動物に関する。更に詳しくは、体細胞核移植法により得られるアレルギーモデル動物として使用可能なクローン非ヒト哺乳動物、及び該非ヒト哺乳動物を調製する方法に関する。
　生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はBリンパ球(以下、B細胞と記載することがある)とTリンパ球(以下、T細胞と記載することがある)という２種類の主要なタイプに分類され、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
　T細胞は、末梢ではCD(Cluster of Differentiation)4マーカーを有するCD4陽性T細胞とCD8マーカーを有するCD8陽性T細胞が大部分を占める。CD4陽性T細胞の大部分は、ヘルパーT細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類によってTh1型、Th2型、Th17型に分化する。CD8陽性T細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性T細胞に分化する。
　外来抗原に対する特異的生体反応を解析することは、それに起因するアレルギー等の免疫疾患における発症機構を解明し、その予防・治療法を開発する上で重要である。例えば、外来抗原が生体に侵入してくると、CD4陽性T細胞によって特異的に認識されることで生体防御を目的とした種々の生体反応カスケードが稼動されることになる。これまで、抗原特異的CD4陽性T細胞の機能や役割を明らかにするべく、さまざまな研究が実施されてきた。
　抗原特異的CD4陽性T細胞は、マウス等の実験動物に抗原を適当なアジュバント物質と共に投与することによって生体内で増殖させることが可能であり、その反応を個体レベル及びex vivoで観察できる。さらに、抗原感作した動物から取り出したCD4陽性T細胞を特異抗原及び抗原提示細胞と共培養し、限界希釈によるクローニングを経ることによって、単一の抗原特異的CD4陽性T細胞由来の細胞群を得ることが可能である。
　単一のCD4陽性T細胞の反応性を解析することは、その分化機構、T細胞受容体(TCR)を介するシグナル伝達機構及び細胞間のばらつきを明らかにする上で重要である。in vitroで樹立した抗原特異的CD4陽性T細胞クローンを正常マウスに移入することによって、単一のCD4陽性T細胞の反応性をin vivoでも検討することは可能であるが、その場合は生体内の全てのCD4陽性T細胞を抗原特異的にすることはできない。レシピエント側にT細胞を欠如したマウスを用いることも可能であるが、現存するT細胞欠損マウスは全て何らかの免疫不全を呈するものであり、移入したCD4陽性T細胞を介する免疫機構を解析する上で適切な実験系を構築することは困難である。
　近年、DO11.10、OT-II、及びOVA23-3マウスや特許文献１及び非特許文献１に開示の抗原特異的なTCR遺伝子を導入したトランスジェニク(Tg)マウス等が開発された。DO11.10及びOT-IIマウスは、先述の問題点を解決しうる実験動物として頻用されるようになってきた。前記したTCR-Tgマウスは、単一のTCRを有するCD4陽性T細胞をin vitroで容易に調製することが可能であり、またin vivoでも抗原特異的反応を容易に誘発できる。
　一方、体細胞クローン技術の進歩に伴い、さまざまな臓器由来の細胞からクローンマウスを作製することが可能となっている。T細胞を起源とするものとしては、まず2002年に抗原特異性が不明なT細胞由来のマウスが作製され(非特許文献２参照)、以降、抗原特異的NKT細胞由来のクローンマウス(特許文献２参照)、抗原特異的CD8陽性T細胞由来のクローンマウスが誕生している(特許文献３参照)。
ＷＯ２０１０／１０７４００号公報 ＷＯ２００６／０１８９９８号公報 ＷＯ２０１０／００３１０３号公報
E. R. Jarman, K. A. L. Tan, J. R. Lamb. Transgenic mice expressing the T cell antigen receptor specific for an immunodominant epitope of a major allergen of house dust mite develop an asthmatic phenotype on exposure of the airways to allergen. Clin Exp Allergy 2005; 35:960-969. Hochedlinger K, Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 2002;415:1035-8.
　しかしながら、抗原特異的CD4陽性T細胞のクローンマウスは未だ樹立されていない。
　本発明の課題は、抗原特異的CD4陽性T細胞クローン動物の作製技術を確立し、ダニやスギ花粉など、免疫アレルギー疾患との関連性が示唆されているさまざまな抗原に反応する非ヒト哺乳動物を提供することである。
　本発明は、以下の〔１〕～〔２２〕に関する。
〔１〕　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、非ヒト哺乳動物及びその子孫。
〔２〕　CD4陽性T細胞が、G0期及び／又はG1期のCD4陽性T細胞である、〔１〕記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
〔３〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔１〕又は〔２〕記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
〔４〕　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、前記〔３〕記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
〔５〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔１〕又は〔２〕記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
〔６〕　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用いて体細胞核移植する、非ヒト哺乳動物の調製方法。
〔７〕　CD4陽性T細胞が、IL-2を添加して培養したのちIL-2を除去し、さらに培養して得られる、CD4陽性T細胞である、〔６〕記載の方法。
〔８〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔６〕又は〔７〕記載の方法。
〔９〕　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、前記〔７〕記載の方法。
〔１０〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔６〕又は〔７〕記載の方法。
〔１１〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されており、該遺伝子領域由来の単一種のT細胞受容体を個体内で発現している、非ヒト哺乳動物。
〔１２〕　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、前記〔１１〕記載の非ヒト哺乳動物。
〔１３〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されており、該遺伝子領域由来の単一種のT細胞受容体を個体内で発現している、非ヒト哺乳動物。
〔１４〕　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、アレルギーモデルマウス。
〔１５〕　CD4陽性T細胞が、G0期及び／又はG1期のCD4陽性T細胞である、〔１４〕記載のアレルギーモデルマウス。
〔１６〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔１４〕又は〔１５〕記載のアレルギーモデルマウス。
〔１７〕　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、前記〔１６〕記載のアレルギーモデルマウス。
〔１８〕　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔１４〕又は〔１５〕記載のアレルギーモデルマウス。
〔１９〕　前記〔１〕～〔５〕、〔１１〕～〔１３〕いずれか記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫をアレルギーモデルマウスとして使用する方法。
〔２０〕　前記〔１〕～〔５〕、〔１１〕～〔１３〕いずれか記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫に、抗原感作を行ってアレルギーモデルマウスを作製する方法。
〔２１〕　前記〔２０〕記載の方法で得られるアレルギーモデルマウス。
〔２２〕　前記〔１〕～〔５〕、〔１１〕～〔１３〕いずれか記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫から得られる細胞、組織、器官、又は生産物。
　本発明の非ヒト哺乳動物は、ダニ抗原やスギ花粉、卵白アルブミンなどに特異的なアレルギー反応を確実かつ効率的に呈するという優れた効果を奏するものである。また、本発明の非ヒト哺乳動物をアレルギーモデル動物として用いることによって、ダニ抗原やスギ花粉、卵白アルブミンなどに対する特異的生体反応に起因するアレルギー疾患における発症機構を解明し、その予防・治療法の開発に寄与することが可能となる。
図１は、抗原特異的CD4陽性T細胞の調製結果の一例を示す図である。感作マウスのCD4陽性T細胞について、IL-2の添加を制御した場合の結果と(左図)、IL-2を添加し続けた場合の結果(右図)を示す。なお、上図は調製後におけるCD4陽性T細胞の純度を、下図は細胞周期パターンを示す。 図２は、抗原としてＭｉｔｅ Ｅｘｔｒａｃｔ－Ｄｆ （ＬＧ５３３９）を、アジュバントとしてＣＦＡを用いて得られた２匹のクローンマウス(Df＃１、Df＃２)を用いて、末梢血CD4陽性T細胞における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、CD4はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、APCは正常マウスの脾臓細胞にX線を照射することによって得た抗原提示細胞の単独培養した場合を、CD4+APCは CD4、APCを混合して培養した場合を、CD4＋APC＋DfはCD4、APCとダニ抗原を混合して培養した場合を表す。 図３は、クローンマウス(Df＃１)の末梢血CD4陽性T細胞におけるTCRα鎖（TRAV）／TCRβ鎖（TRBV）のクローニング結果を示す図である。図中の数値は独自に付与したプライマーセット番号を、Mはマーカーを表す。 図４は、クローンマウス及びそのF1マウスのTCR genotypingの結果を示す図である。図中、親マウス（＃１）、F1マウス（＃１－１～７）、野生型マウス（WT）を示す。 図５は、クローンマウスのF1マウスにおける抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、「－」カラムは非特異抗原を反応させた場合、「Df」カラムは特異抗原を反応させた場合を示す。 図６は、抗原としてOVA 326-339部分ペプチドを用いて得られたクローンマウス（OVA＃６）を用いて、末梢白血球における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、－はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、OVA proteinはOVA proteinとAPCを混合培養した場合を、OVA 326-339はOVA 326-339部分ペプチドとAPCを混合培養した場合、OVA 323-339はOVA 323-339部分ペプチドとAPCを混合して培養した場合を表す。 図７は、抗原としてＤｅｒｐ１（ＲＰ－ＤＰ１Ｄ－１）を、アジュバントとしてＣＦＡを用いて得られたクローンマウス（Dp＃７～１１）を用いて、末梢白血球における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、－はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、Der p1はDer p1とAPCを混合培養した場合を表す。 図８は、クローンマウスのT細胞における再構成TCRの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。上段がCD4細胞における結果、下段がCD8細胞における結果である。 図９は、クローンマウス（Df＃１、Df＃２）における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。 図１０は、クローンマウス（Dp＃７）における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。左図がタンパク全体とその部分ペプチドについて調べた結果、右図が左図において反応性を示したペプチド領域についてエピトープを調べた結果である。なお、図の下部に用いた部分ペプチドの詳細を示す。 図１１は、クローンマウス（Dp＃１、Dp＃２）のCD4陽性T細胞の分化能をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。上半分がDp＃１マウスについて、下半分がDp＃２マウスについての結果である。なお、図中の「＊＊＊」はDunnett’s法によるP<0.001を示す。 図１２は、クローンマウス（Dp＃１）の気管支喘息様気道炎症の発症を検討した結果を示す図である。上段が再構成TCRを有するクローンマウスにおける炎症細胞数についての結果、下段が通常マウスにおける気管支喘息様気道炎症の誘導結果を示す図である。 図１３は、クローンマウス（OVA＃６）の抗原誘発鼻粘膜反応の発症を検討した結果を示す図である。上段が鼻炎反応（くしゃみ反応）についての結果、下段が鼻腔内反応（炎症細胞数）についての結果を示す図である。
　本発明の非ヒト哺乳動物は、抗原特異的なCD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法(体細胞クローン法)によって得られることを大きな特徴とする。なお、本明細書において、本発明の非ヒト哺乳動物のことを、本発明のクローン動物又はクローン哺乳動物と記載することもある。
　トランスジェニック(Tg)動物は人為的に組み替えたDNAを導入した受精卵を移植して得られるが、例えば、現存するMHC-class II拘束性TCR-Tgマウス(以降はTCR-Tgマウスと表記)のCD4陽性T細胞におけるT細胞受容体(TCR)の発現は、いずれも外来プロモーターによって調節されていることから、その発現レベルや発現タイミングは内在性のTCRとは異なる。また、TCR刺激に伴うT細胞の反応性は、抗原に対する親和性やTCRの発現レベルによって異なることが知られているので、TCR-TgマウスにおけるCD4陽性T細胞の反応が、生体が自然に獲得した抗原特異的CD4陽性T細胞の反応を完全に反映するか否かは明らかではない。事実、Balb/cマウスは抗原感作によっていわゆるTh2タイプとよばれるT細胞反応を起こしやすいといわれるが、それをバックグラウンドとしたDO11.10マウスにおいて抗原特異的反応を個体レベルで観察すると、Th17/Th1有意な反応が誘発されることが報告されている(Lemaire MM, Dumoutier L, Warnier G, Uyttenhove C, Van Snick J, de Heusch M, Stevens M, Renauld JC. Dual TCR expression biases lung inflammation in DO11.10 transgenic mice and promotes neutrophilia via microbiota-induced Th17 differentiation. J Immunol 2011;187:3530-7.参照)。本発明において得られるクローン動物は、抗原特異的なTCRを発現するCD4陽性T細胞を有するが、それは、より生体内に近い状態の抗原特異的CD4陽性T細胞から得られた核を核ドナーとして用い、そして、核提供元のCD4陽性T細胞と同じ遺伝情報が伝授された体細胞クローン動物であることから、TCR-Tgマウスに危惧される不自然な反応ではなく、生体が自然に獲得した抗原特異的CD4陽性T細胞の反応を完全に反映した抗原特異的反応が観察できると推定される。また、例えば、ダニ抗原に起因して生じる生体カスケードは、ダニ抗原蛋白中の多数のエピトープに特異的な反応の複合的な表現型として現れるが、本発明における技術によって、各々のエピトープに特異的な反応のみを表現する動物を得られることから、各エピトープ及びそれに反応するCD4陽性T細胞の性質を詳細に解析できる。TCR-Tgマウスを利用して同様の解析を行うためには、TCRのクローニングを行った後に遺伝子導入マウスを作製し、さらに得られた各個体について導入遺伝子を確認する必要があるが、本発明が提供する抗原特異的CD4陽性T細胞クローン動物の作製技術によって、それらの工程を省略することが可能になり、より効率的な抗原特異的反応解析法を提供しうる。
　本明細書において非ヒト哺乳動物とは、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定はないが、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類が用いられ、中でもマウスが好ましい。使用するマウスに特に限定はなく、公知のマウスを使用することができるが、核移植マウスの作製効率は純系マウスに比べてF1マウスで高いこと、BALB/cマウスとDBA2マウスの組織適合性抗原ハプロタイプがほぼ完全に一致していることなどの観点から、本発明においては、CD2F1（BALB/c x DBA2）系を好適に使用する。
　本発明で用いるCD4陽性T細胞は、抗原特異的なT細胞であれば特に限定はないが、その対象となる抗原としては、例えば、ダニなどの室内塵及び昆虫抗原、スギ花粉、ヒノキ花粉、イネ花粉などの花粉抗原、大豆、卵などの食餌性抗原等が例示される。以下に、ダニ抗原特異的なT細胞を用いる場合を例に挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明におけるダニ抗原としては、特に限定はなく、ダニの種も限定されない。例えば、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae(Df))、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus(Dp))等が挙げられ、その虫体若しくは排泄物、それらから公知の方法に従って調製した抽出物、リコンビナント蛋白質、合成ペプチドの他、それらの市販品を好適に用いることができる。市販品としては、Mite Extract-Df、Mite-Df Feces AG、Mite Extract-Dp、Mite-Dp Feces AG（以上、エス・エル・エス社製）、Der f1、Der f2（以上、アサヒフードアンドヘルスケア社製）、Der f II（シバヤギ社製）、コナヒョウヒダニ虫体、ヤケヒョウヒダニ虫体（以上、ビオスタ社製）等の製品が挙げられる。これらは、単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。
　本発明で用いるダニ抗原特異的なT細胞は、前記ダニ抗原を通常感作させることで得られるダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞である。抗原感作は公知の方法に従って行うことができ、抗原を公知のアジュバントと共に感作することもできる。また、核移植を行うのに充分数のCD4陽性T細胞を得るため、CD4陽性T細胞の増殖誘導能を有する公知の因子とダニ抗原の共存下で培養することによって得られたものであってもよい。増殖誘導因子としては、IL-2及びIL-4などが挙げられる。得られたT細胞は、例えば、FACS解析や公知の共培養を行って、適宜、選別及び回収を行うことができる。なお、ここでの培養条件は、T細胞の種に応じて適宜設定することができる。本発明においては、細胞周期が進行中の細胞を用いた場合にはクローン動物の作製効率が著しく低下するという観点から、T細胞はG0期及び／又はG1期の細胞であることが好ましく、前記状態の細胞は、例えば、増殖誘導因子を添加して培養したのち、それを除去してさらに培養することにより得られたG0期及び／又はG1期に同調された抗原特異的CD4陽性T細胞の細胞集団より採取することができる。
　また、別の態様としては、G0期及び／又はG1期に同調された抗原特異的CD4陽性T細胞の細胞集団を得るために、抗原非特異的T細胞の増殖を低減させる前処理を行なってもよい。より具体的には、抗原感作後の哺乳動物より採取されたCD4陽性T細胞の集団を、増殖能を欠失した脾臓細胞及び特異抗原と共培養する際に増殖誘導因子を添加しないことで抗原非特異的T細胞の増殖を低減させることができる。前記状態となった細胞集団に増殖誘導因子を添加して培養した後、増殖誘導因子を除去してさらに培養することで、G0期及び／又はG1期に同調された抗原特異的CD4陽性T細胞の細胞集団を高効率に得ることができる。これらの培養期間は特に限定されないが、数日間の培養期間でよく、好ましくは３－４日の培養期間である。T細胞をG0期及び／又はG1期に同調させるために、増殖誘導因子としては、IL-2が好ましい。なお、T細胞の種は産生される非ヒト哺乳動物と同種であることが好ましい。
　このようにして得られたダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞は、細胞膜上に、CD(Cluster of Differentiation)4マーカーを有する以外に、MHC-class IIによって細胞表面に提示されたダニ抗原エピトープと結合し得るTCRを発現している。ダニ抗原と結合し得るTCRは通常α鎖・β鎖のヘテロダイマーからなるものであり、抗原提示細胞上の抗原を認識するが、α鎖及びβ鎖はいずれも可変領域(V領域)と定常領域(C領域)から構成されるものであり、抗原に反応する際に再構成(再編成)される。より詳しくは、抗原に反応する際に、先ずβ鎖のVDJ再構成が行なわれ、次いでα鎖のVJ再構成が行なわれる。野生動物は、自然界でさまざまな抗原に暴露される機会があることから、体内に存在するそれぞれのT細胞は、通常それら多くの抗原エピトープに対応した異なるTCRを発現しているが、本発明におけるそれぞれのクローンマウスが有する通常通りに再構成されたα鎖・β鎖のヘテロダイマーからなる各々ダニ抗原特異的な単一種のTCRは、それが抗原に反応する以前にすでに体内の殆どのT細胞に発現しているといった特徴を有する。TCRの遺伝子構成から、得られたクローン動物におけるドナー細胞の起源を追跡することが可能となる。
　前記したダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞を用いて核移植を行う。核移植の方法は、ダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用いる方法であれば特に限定されない。例えば、Nature 1998;394:369-74.に記載の方法を参照することができる。
　具体的には、ダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞の核を、該細胞と同じ種の哺乳動物由来の未授精卵子の核と置換することができればよく、例えば、卵母細胞に微小なピペットを用いて未受精卵母細胞の核と周りの細胞質を吸い込み除核した後、同様にピペットを用いて前記ダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞から抜き出した核を導入する。また、核ドナーの代わりに、核ドナーを含むダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞そのものを導入して、細胞融合することで核移植してもよい。除核の際に細胞骨格を予め消失させる処理を行っていてもよく、核移植後に同処理を行ってもよい。細胞骨格の消失はサイトカラシンを用いることで実施できる。
　核移植が施される卵母細胞としては、核ドナーの細胞と同じ種の哺乳動物由来であれば特に限定はないが、例えば、公知の過排卵処理によって得ることができる。また、卵母細胞は活性化されていてもいなくても構わないが、活性化されている状態が好ましい。当該活性化は核移植の前後いずれでもよく、電気的処理法や薬剤処理法による刺激によって行うことができる。具体的には、卵母細胞中の2価のカチオン濃度を上げること、卵母細胞中の細胞性タンパク質のリン酸化の程度を低下させること等によって行うことができる。例えば、2価のカチオン(例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、カルシウム)を、例えばイオノフォアの形で、卵母細胞の細胞質に導入することによって行われる。2価のカチオン濃度を増加させる他の方法としては、電気ショック、エタノール処理、ケージキレート剤の処理の方法が挙げられる。また、リン酸化の程度を低減する方法としては、例えばキナーゼ阻害剤(例えば、6－ジメチルアミノプリン、2－アミノプリン、及びスフィンゴシンのようなセリン－スレオニンキナーゼ阻害剤)を添加する方法が挙げられる。あるいはホスファターゼを卵母細胞に導入して酸化を阻害することもできる。
　核移植を行った細胞は再構築胚が形成されるまで培養後、それを宿主の哺乳動物に移植して該再構築胚を宿主哺乳動物に発生させることで、クローン動物を得ることができる。なお、本明細書において、「再構築胚」とは、核ドナーと卵母細胞由来の細胞質成分とで再構成された胚を意味する。
　再構築胚の宿主哺乳動物への移植は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。具体的には、例えば、再構築胚を2～8細胞期になるまで培養したものを移植することができる。再構築胚の培養条件は、卵母細胞に応じて適宜設定することができ、公知の方法に従ってフィーダー細胞と共に培養してもよい。
　宿主哺乳動物は、その中で再構築胚を発生させることができるものであれば特に限定されないが、好ましくは採取した卵母細胞と同じ種由来の哺乳動物であり、より好ましくは偽妊娠した雌の噛乳動物である。例えば、マウスの場合、偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結染等により去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、前記した再構築胚(クローン胚)を子宮内移植、中でも卵管内に移植して、妊娠、出産させることによりクローン動物を作製することができる。クローン胚の着床・妊娠がより確実に生じるために、仮親になる偽妊娠マウスは、卵母細胞を採取する雌マウスと同一の性周期にある雌マウス群から選択することが好ましい。
　また、ダニ抗原以外の抗原に特異的なCD4陽性T細胞に由来するクローン動物も前記と同様にして得ることができ、例えば、抗原として卵を用いる場合、卵白アルブミン(OVA)及びOVA由来の部分ペプチド等を好適に用いることができる。これらは合成品であっても市販品であってもよく、単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。また、部分ペプチドの長さは特に限定されず、例えば、OVA326-339、OVA323-339等が例示される。なお、卵の種は産生される非ヒト哺乳動物と同種であることが好ましい。
　かくして、本発明のクローン動物が得られる。得られたクローン動物は、ダニ抗原を感作させると、ダニ抗原特異的なCD4陽性T細胞が増殖して免疫応答が誘導され、OVA抗原を感作させると、OVA特異的なCD4陽性T細胞が増殖して免疫応答が誘導される。なお、クローン動物の起源は、CD4陽性T細胞におけるTCRの遺伝情報を調べることで確認することができる。上記のようにして得られたクローン動物は、核ドナーの細胞と同一の組織適合性抗原を有することから、得られたクローン動物の組織、器官を核ドナーの提供者である哺乳動物に移植した場合、非自己と認識されることなく免疫寛容状態となり、免疫拒絶反応が起こらない。
　また、本発明のクローン動物を用いて、その子孫を得ることができる。具体的には、再構築胚から発生したクローン動物を第２の哺乳動物と交配させることによって得ることができる。第２の哺乳動物としては、クローン動物と同種の野生型動物、あるいは、同様にクローン胚から発生した動物又はその子孫等を用いることができる。本発明において「子孫」とは、本発明のクローン動物を親とする仔世代(F1)、Flを親とする仔世代(F2)、F2を親とする仔世代(F3)等、本発明のクローン動物を起源とするものが含まれる。
　本発明のクローン動物の子孫は、T細胞受容体の遺伝子領域が、例えば、ダニ抗原特異的なT細胞受容体やOVA特異的なT細胞受容体として再構成されており、該遺伝子領域由来の単一種のT細胞受容体を、好ましくは当該T細胞受容体のみを個体内で発現しているので、核ドナーを採取した細胞と同一のダニ抗原特異的なTCRやOVA特異的なTCRを有する。また、かかるTCRを有するT細胞は、抗原刺激に対して通常の分化能を有するものである。従って、本発明のクローン動物の子孫は、例えば、ダニ抗原やOVAに起因して生じる疾患及び／又は病態の研究、例えば、発症機構の解明に大きく寄与することができる。例えば、通常実験動物を用いてダニ抗原やOVAに起因して生じる疾患及び／又は病態を再現するためには、動物を公知の方法でダニ抗原やOVAに感作した後に、同種抗原で誘発する必要があるが、本発明のクローン動物の子孫を用いた場合は、その準備段階が必要ないか、又は大幅に短縮／簡略化できる。
　ダニ抗原に起因して生じる疾患及び／又は病態としては、アレルギー疾患が挙げられるが、具体的には、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎も含まれる。
　OVAに起因して生じる疾患及び／又は病態としては、アレルギー疾患が挙げられるが、具体的には、蕁麻疹、咳嗽などの呼吸器症状、下痢・腹痛・嘔吐などの消化器症状を誘発する食物アレルギーをはじめ、気管支喘息、アトピー性皮膚炎も含まれる。
　本発明はまた、ダニ抗原特異的なT細胞あるいはOVA特異的なT細胞の核を核ドナーとして用いて体細胞核移植する、非ヒト哺乳動物の調製方法を提供する。
　ダニ抗原特異的なT細胞としては、本発明の非ヒト哺乳動物の項において記載されたものを用いることができ、その調製も準じて行うことができる。また、T細胞にダニ抗原特異的なTCRを発現させる方法及び体細胞核移植の方法も本発明の非ヒト哺乳動物の項において記載された手順と同様に実施することができる。OVA特異的なT細胞に関しても同様である。
　また、本発明の非ヒト哺乳動物は抗原感作させることで免疫応答が誘導されるため、実験モデルとして用いることができる。即ち、本発明はまた、本発明の非ヒト哺乳動物及びその子孫からなる、アレルギーモデルマウスを提供する。アレルギーモデルマウスは、本発明の非ヒト哺乳動物及びその子孫に、その作製時に用いたCD4陽性T細胞に対応する抗原を感作することで得ることができる。具体的には、例えば、ダニ抗原やOVAなどを感作させることで、気管支喘息やアレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギーの病態を呈したモデルマウスとすることができる。かかる病態を呈した実験モデルを用いることで、当該病態の解析や発症機構を解明したり、その予防や治療のための候補化合物の薬効評価を行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
実施例１(抗原特異的CD4陽性T細胞の調製)
　ダニ抗原(Dermatophagoides farinae(Df)及びDermatophagoides pteronyssinus(Dp))を水酸化アルミニウム(Alum)又はComplete Freund's adjuvant(CFA)と表１の組み合わせで混合して、CD2F1マウス(１０週齢、雄)の尾基底部に注射した。CD2F1マウスは、BALB/c及びDBA2のF1である。
　抗原感作１週間後に鼠径リンパ節を摘出し、牛胎児血清を含む培養メディウムに懸濁して細胞を調製した。CD4抗体ビーズを用いた磁気ソーティングシステムでCD4陽性T細胞を濃縮した後、同一マウスより調製し、X線照射して増殖能を欠失させた脾臓細胞及び特異抗原と共に培養を開始した。培養開始後３～４日間は抗原非特異的T細胞の増殖を低減するためにIL-2を添加せずに培養し、その後IL-2を添加してさらに３～４日間培養した。それにより、抗原反応性のCD4陽性T細胞のみを充分に増殖させた後、細胞を回収、洗浄して、再度IL-2を除いた培養液に懸濁し３～４日間培養した。比較対象として、培養期間中IL-2を添加したままで細胞を培養したものを用い、得られた細胞の周期パターンをClick-IT Edu Flow Cytometry Assay Kit(Invitrogen社製)を用いて調べた。結果の一例を図１に示す。
　図１より、IL-2を培養期間中添加したままにしていた場合に比して、IL-2の添加を制御した条件下で培養した場合に、明らかに多くの細胞をG1／G0期に収束させることに成功した。
実施例２(核移植マウスの作製)
　実施例１により得られたCD4陽性T細胞を核ドナー細胞として用いて、核移植マウスの作製を行った。胚の作製は、Nature 1998;394:369-74, Biology of Reproduction 2012;86:1-6 記載の方法に準じて行い、胚の培養液は、Lawitts J.A., and Biggers J.D. 1993. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol. 225:153-164. の記載方法に準じてKSOM培地を用いた。具体的には、成熟CD2F1B6D2F1雌より過排卵処理によって得られた卵子を5μg/mLのサイトカラシンB存在下で除核後、ピエゾドライブマイクロマニピュレーターで核ドナー細胞の注入を行った。注入後、37.5℃、6％ CO2の環境下で１～２時間培養した後、50nMトリコスタチンA・5μMラトランキュリンA・3mMストロンチウム存在下のKSOM培地で活性化を行った。続けて、ラトランキュリンA存在下で7時間の培養を行った後、通常のKSOM培地で培養した。翌日、2細胞期胚を精管結紮雄と交配させた偽妊娠ICR雌の卵管内に移植し、19日後に開腹して産仔を獲得した。詳細な作製効率は表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３(クローンマウスのCD4陽性T細胞における抗原反応性１)
　実施例２で樹立したDf特異的CD4陽性T細胞クローンマウスの末梢血より白血球又はCD4陽性T細胞を調製し、正常マウスのX線照射した脾臓細胞及び特異抗原(Df)と共に培養した。培養開始４～５日目にCell proliferation reagent(Roche社製)を用いて細胞増殖反応を解析した。結果を図２に示す。
　図２より、Df抗原を感作させたマウスにおいて、抗原特異的な増殖反応が認められた。このことから、ドナー細胞の抗原特異性を保持したクローンマウスを目的通りに樹立できたことが明らかとなった。
実施例４(クローンマウスのTCRクローニング)
　樹立したDf特異的CD4陽性T細胞クローンマウスの末梢血よりmRNAを調製し、バリアント鎖特異的プライマー及び定常鎖特異的プライマーセットのライブラリーを用い、各々TCRα鎖及びTCRβ鎖についてRT-PCRを行った。その結果、各クローンマウスに発現するTCRα鎖/TCRβ鎖をクローニングできた(図３参照)。
実施例５(クローンマウスの抗原特異性に関する遺伝的性質)
　実施例４でクローニングした後のTCR配列をシークエンスにより決定し、それを検出するGenotyping用プライマーセットを設計した。同時に野生型alleleを検出するプライマーセットも準備した。クローンマウスをBALB/cマウスとバッククロスしてF1マウスを作出し、親マウスと共に各々genomic DNAを抽出してPCR genotypingを行った。結果を図４に示す。
　図４より、親マウス(Df＃１)でTCRα鎖及びTCRβ鎖の再構成と野生型両者のalleleが検出され、対立遺伝子排除機構に基づき片側alleleのみが再構成されていることが確認できた。一方、F1マウス(Df＃１－１～７)では、メンデルの法則に基づき全てのマウスで野生型alleleが検出され、約半数のマウスに再構成alleleが受け継がれた。なお、Df＃１－５のF1マウスにおいては、再試験により野生型alleleが検出された(結果を示さず)。
　またさらに、得られたF1マウス(Df＃１－１～７)の末梢血より白血球を調製し、正常マウスのX線照射した脾臓細胞及び特異抗原(Df)あるいは非特異抗原(ME06)と共に培養して、抗原特異的増殖反応をCell proliferation reagent(Roche社製)を用いて解析した。その結果、親マウスよりTCRα鎖及びTCRβ鎖の両者の再構成alleleを受け継いだF1マウスDf＃１－１、Df＃１－３、Df＃１－７において、抗原特異的な増殖反応が観察された(図５参照)。このことから、抗原特異的CD4陽性T細胞より作出したクローンマウスにおける抗原反応性には、再構成されたTCRα鎖及びTCRβ鎖両者が必要であり、またその形質は子孫に受け継がれることが明らかとなった。
実施例６(クローンマウスのCD4陽性T細胞における抗原反応性２)
　実施例１及び２を参照して得られたOVA特異的CD4陽性T細胞クローンマウス(OVA＃６)と、実施例２で得られたDp特異的CD4陽性T細胞クローンマウス(Dp＃７～１１)について抗原反応性を解析した。
　具体的には、抗原としてOVA 326-339部分ペプチドを用いて作出したクローンマウスの末梢白血球を、OVA 326-339部分ペプチド、OVA 323-339部分ペプチド、又は又はOVAタンパクと抗原提示細胞（antigen-presenting cells : APC）としてX線照射した正常BALB/cマウス由来の脾臓細胞と共に培養した。
　また、クローンマウス(Dp＃７～１１)については、その末梢白血球をDer p1とAPCと共に培養した。
　培養開始４～５日目にCell proliferation reagent(Roche社製)を用いて細胞増殖反応を解析した。クローンマウス(OVA＃６)の結果を図６に、クローンマウス(Dp＃７～１１)の結果を図７に示す。
　図６、７より、いずれのクローンマウス由来の細胞も、その特異抗原に反応して増殖反応を示した。このことから、クローンマウス(Df)と同様に、ドナー細胞の抗原特異性を保持し、異なる抗原反応性を示す一連のクローンマウスを樹立できたことが明らかとなった。
実施例７(クローンマウスのTCR発現)
　再構成されたTCR鎖がクローンマウスT細胞表面に発現しているかを検討した。なお、作出したクローンマウスのうち、OVA＃６、Dp＃８の再構成TCRβ鎖にVβ13-1が含まれることをPCRクローニングにより予め確認した。
　Df＃１、OVA＃６、Dp＃７、及びDp＃８のクローンマウスについて、脾臓CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞におけるTCRVβ13-1の発現をフローサイトメトリーで確認した。結果を図８に示す。
　結果、OVA＃６、Dp＃８のクローンマウスにおいて、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞の表面に、TCRVβ13-1が発現していることが確認された。クローンマウスにおける再構成TCR鎖は、確かにそのT細胞表面に発現することによって機能していることが明らかとなった。
実施例８(クローンマウスのCD4陽性T細胞における抗原特異性)
　Df＃１、Df＃２、Dp＃７のクローンマウスを用いて、抗原特異性を検討した。
　具体的には、各クローンマウスからCD4陽性T細胞を調製後、Df＃１、Df＃２については、Der f粗抽出物（Der f）、Der f虫体抽出物（Der f-b）、Der p粗抽出物（Der p）及びDer p虫体抽出物（Der p-b）を抗原として用い、一方、Dp＃７については、大腸菌を使って作製したリコンビナントDer p1-GST融合蛋白又はその各種部分ペプチド（図１０に示す）を抗原として用い、それらをAPCと共に培養した。培養開始４～５日目にCell proliferation reagent(Roche社製)を用いて細胞増殖反応を解析した。クローンマウス(Df＃１、Df＃２)の結果を図９に、クローンマウス(Dp＃７)の結果を図１０に示す。
　結果、Df＃１、Df＃２のCD4陽性T細胞は、Der f粗抽出物（Der f）及びDer f虫体抽出物（Der f-b）に反応して増殖反応を示したが、Der p粗抽出物（Der p）及びDer p虫体抽出物（Der p-b）には反応しなかった（図９）。一方、Dp＃７のCD4陽性T細胞は、成熟Der p1蛋白全長（アミノ酸99-320）及びその部分蛋白（アミノ酸169-248）に反応して増殖反応を示した（図１０、左図）。さらに部分蛋白を細分化した合成ペプチドを用いて検討した結果、Dp＃７のCD4陽性T細胞が反応するエピトープが、アミノ酸189-208の部分ペプチドであることが判明した（図１０、右図）。各クローンマウスのCD4陽性T細胞は、抗原特異的反応性を示すことが明らかとなった。
実施例９(クローンマウスCD4陽性T細胞の分化能)
　CD4陽性T細胞は、TCR刺激に応答して増殖すると共に、各種Th細胞に分化することが知られる。そこで、Der f特異的CD4陽性T細胞より樹立したクローンマウスにおけるCD4陽性T細胞の分化能を検討した。
　Df＃１マウスを正常マウスと交配して得た子孫は、片側alleleにそれぞれ再構成されたVβ2及び／又はVα6D-4、又は両alleleとも野生型のVβ（WT-Vβ）及びVα（WT-Vα）遺伝子を有することが分かっている（実施例５参照）。同様に、Df＃２マウスの子孫はVβ5及び／又はVα10を発現しうることが分かった。それらをgenotypingで確認した後、脾臓CD4陽性T細胞を調製して、抗CD3＋抗CD28抗体ビーズあるいはDer f抗原＋APCと共に培養した。培養開始２日後よりIL-2を添加して反応性T細胞の増殖を促し、その５～７日後に回収した。それを1μg/mL ionomycin＋10nM PMAで6時間再刺激培養した後、抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体、抗IL-17A抗体、及び抗Foxp3抗体で細胞内染色し、各サイトカイン及び転写因子の発現をフローサイトメトリーで解析した。結果を図１１に示す。
　その結果、抗CD3＋抗CD28抗体ビーズによる刺激条件下において、両alleleともWT-Vβ及びWT-Vαである野生型マウスに比して、再構成TCRα及びβを発現するDf＃１マウス及びDf＃２マウスでは、IFN-γ及びIL-17Aの産生が増強し、IL-4の産生が減弱した（各マウスの上段図）。これらのマウスでは、Th1及びTh17の分化が亢進していることが示唆された。同様の傾向は、再構成TCRβを発現するDf＃1マウスでもみられた（結果示さず）。一方、Der f刺激して得たDf＃１マウス及びDf＃２マウスのCD4陽性T細胞では、再刺激によってIFN-γ及びIL-17AだけでなくIL-4の産生もみられたことから、より生理的な抗原刺激を受ける生体内においては、Th1、Th2及びTh17等、さまざまなT細胞サブセットに分化しうる可能性が示された。また、制御性T細胞（Treg）の分化マーカーであるFoxp3の発現レベルは、再構成TCRの発現によって明らかな影響を受けなかった（各マウスの下段図）。
実施例１０(クローンマウスにおける気管支喘息様気道炎症反応)
　再構成されたVβ2、Vα6D-4、野生型のVβ（WT-Vβ）又はVα（WT-Vα）alleleを有するDf＃１マウスの子孫に、Der f抗原を一日一回、３～４日間隔で合計４～１２回の点鼻チャレンジを行って、気管支喘息様の気道炎症の発症を検討した。
　具体的には、Df＃１クローンマウス、CD2F1マウス、及びBALB/cマウスに、上記の如くDer fとsaline（コントロール）のチャレンジを行った。最終チャレンジの72時間後に麻酔下で気管挿管し、人工呼吸下でmethacholine（MCh）溶液を低濃度から段階的に吸入させることによって誘導される呼吸器抵抗（respiratory system resistance：Rrs）を測定し、気管支喘息でみられる特徴的な病態生理学的変化である気道過敏性亢進（bronchial hyperresponsiveness：BHR）の発現を評価した。その直後に気管支肺胞洗浄（bronchoalveolar lavage：BAL）を行い、BAL液（BAL fluid：BALF）中に回収された炎症細胞数を計数した。結果を図１２に示す。
　結果、WT-Vβ及びWT-Vα alleleを有する野生型のマウスでは、４回の抗原チャレンジによってsalineチャレンジに比べ僅かな気道内好酸球数及びリンパ球浸潤数の増加が見られたが、その反応及び好中球浸潤数は、Vβ2及びVα6D-4を発現するマウスで著しく増強していた（図１２、上段）。さらにVβ2又はVα6D-4のどちらかを発現するマウスでも、両者を発現するマウスほどではないものの、同様の反応性増強がみられた。一方、核移植ドナーに用いたCD2F1マウス及び誕生したクローンマウスのバッククロスに用いたBALB/cマウスを用いて同様の検討を行ったところ、抗原を１２回チャレンジすることによって漸く、CD2F1マウスにおける好酸球数の僅かな増加がみられたが、その反応性は再構成TCRを発現するクローンマウスに比べ明らかに弱かった（図１２、中段）。
　また、抗原を４回チャレンジしたVβ2及び／又はVα6D-4発現マウスでは、WT-Vβ及びWT-Vα alleleを有する野生型のマウスならびにsalineチャレンジしたコントロールマウスに比し、MChを段階的に吸入させることによってRrsの上昇、すなわち気道狭窄反応が亢進しており、気管支喘息様のBHRが発症した（図１２、下段左）。一方、CD2F1マウス及びBALB/cマウスについて同様の検討を行ったところ、抗原を１２回チャレンジすることによって漸く、CD2F1マウスにおいて僅かなBHRがみられたが、その反応性は再構成TCRを発現するクローンマウスに比べ明らかに弱かった（図１２、下段右）。クローンマウスでは、抗原チャレンジによって惹起されるアレルギー性気道炎症反応が亢進しており、野生型マウスに比べ非常に短期間で気管支喘息様の病態モデルが樹立できることが明らかとなった。
実施例１１(クローンマウスにおけるアレルギー性鼻炎様反応)
　再構成されたVβ13-1、Vα4-4、野生型のVβ（WT-Vβ）又はVα（WT-Vα）alleleを有するOVA＃６マウスの子孫に、OVAを一日一回、５日間連続で点鼻チャレンジを行って、アレルギー性鼻炎様のくしゃみ反応又は鼻腔炎症反応を検討した。
　具体的には、OVA＃６マウス及びBALB/cマウスに、上記の如くOVAとsaline（コントロール）のチャレンジを行い、３日目と５日目の各時点について、抗原チャレンジ直後のくしゃみ回数（５分間あたり）とチャレンジ６時間後に非特異的刺激としてヒスタミン又はBSAを投与した直後のくしゃみ回数（５分間あたり）を数えた。また、５回目の抗原チャレンジ６時間後に、鼻腔洗浄（nasal lavage：NAL）を行い、NAL液（NAF fluid：NALF）中の炎症細胞数を計数した。結果を図１３に示す。
　結果、WT-Vβ及びWT-Vα alleleを有する野生型のマウスでは、３回、５回の抗原チャレンジのいずれによっても、くしゃみ反応は殆ど誘発されなかった。一方、Vβ13-1及びVα4-4を発現するマウスでは、チャレンジ直後のくしゃみ回数は野生型マウスに比べて明らかに多く、いわゆる即時型鼻炎反応（immediate nasal response：INR）の発症が認められた（図１３、上段左）。また、抗原チャレンジ後の非特異的刺激によって誘発されるくしゃみ反応は、野生型マウスでは殆ど誘発されなかったが、Vβ13-1及びVα4-4の両者を発現するマウスでは明らかに誘発され、その程度は抗原チャレンジ回数と共に増強され、クローンマウスでは、僅かな抗原チャレンジによって鼻粘膜過敏性亢進反応（nasal hyperresponsiveness：NHR）が発症することが明らかとなった（図１３、上段中央及び右）。
　鼻腔内の炎症反応については、Vβ13-1及びVα4-4の両者を発現するマウスでは、野生型マウスに比べ、鼻粘膜への好酸球、好中球、及びリンパ球の浸潤が増加していた（図１３、下段）。クローンマウスを用いれば、鼻粘膜への炎症細胞浸潤とNHRを伴うアレルギー性鼻炎様病態を極めて短期間に樹立できることが明らかとなった。
（考察）
　本発明の抗原感作マウスのCD4陽性T細胞より作出したクローンマウスを用いることによって、気管支喘息及びアレルギー性鼻炎の病態を模した実験モデルが短期間に樹立できるようになった。それらは今後さまざまな研究に広く活用できる。
　具体的には、例えば、Df＃１及びDf＃２クローンマウスだけでなく、Der p1及びOVA326-339反応性CD4陽性T細胞から作製したクローンマウスも、その特異抗原に対して反応性を示すことが明らかとなった。少なくともそれらの一部は抗原特異性も示したことから、クローンマウスの多くは、ドナーT細胞の抗原反応性を受け継いでいることが明らかとなった。さらに、再構成されたTCRがクローンマウスT細胞表面上に発現していることも確認できたことから、本発明の抗原特異的CD4陽性T細胞を用いたクローンマウス作製法は、目的とする抗原反応性を示すマウス系統を得るために有用であることが示された。
　また、再構成TCRα及びTCRβを発現するクローンマウスは、野生型マウスに比べTh1及びTh17への分化傾向を示したが、より生理的刺激条件下ではTh2サイトカインの産生能も獲得することが明らかとなった。近年さまざまなアレルギー疾患は、単純なTh2型の疾患ではなく、Th1やTh17を含めた多くのサブセットが複雑に関与する病態を示すことが明らかにされつつある（神沼　修ほか、アレルギー・免疫 22:1526-1534, 2015.）。今回得られたクローンマウスは、そのような複雑なアレルギー病態を解析するのに適していると考えられる。
　さらにクローンマウスでは、野生型マウスに比べ非常に短期間で気管支喘息様及びアレルギー性鼻炎様の病態モデルを樹立できることが明らかとなった。一般的にアレルギー疾患の動物モデルでは、抗原をalum等のアジュバント物質と共に全身性に投与して感作した後、標的臓器に対して抗原チャレンジを行って病態を発症させる。しかしながら、ヒトにおけるアレルギー疾患の発症機序として、抗原が全身性に投与される状況は考えられないことから、最近、局所的な抗原暴露だけによってアレルギー病態を発症させるモデルの開発も進められている。しかしこれまでのモデルでは、明らかな気管支喘息様病態を誘導するために、抗原チャレンジをほぼ毎日かつ一ヶ月以上も継続する必要があった（Shimizu H et al., Inflamm Res 62:911-917, 2013.他）。今回我々も、BALB/c及びCD2F1において同様の病態を誘導するためには、３－４日おきの経気道的な抗原暴露を１２回以上行う必要があることを確認した。それに対してクローンマウスでは、僅か４回の抗原チャレンジでBHRと炎症細胞浸潤を伴う強い気道炎症を惹起できたことから、本マウスにおける気管支喘息モデル動物としての高い有用性が示された。なお、本実験系では、アレルギー性疾患に重要な役割を果たすといわれる好酸球に加え、多数の好中球及びリンパ球の浸潤がみられた。我々はこれまでに、in vitroで樹立した抗原特異的Th細胞移入マウスを用いた気管支喘息モデルを解析した結果、Th2細胞は好酸球浸潤を、またTh1及びTh17は好中球浸潤を特に強く誘導することを明らかにしている（Kaminuma O et al., Clin Exp Allergy 42:315-325, 2012）。従って本モデルでは、Th2だけでなくTh1ないしTh17も関与する複合的な気道炎症が発症しており、それは本クローンマウスCD4陽性T細胞のin vitroにおける分化傾向を反映したものと考えられた。
　また、クローンマウスにおけるCD4陽性細胞のin vitroにおける抗原反応性には、再構成されたTCRα及びTCRβの両者が必要であることを明らかにしたが、in vivoにおいて発症するアレルギー性炎症の程度は、再構成TCRαないしはTCRβの片方を発現するマウスでも野生型マウスに比べて亢進していることが明らかとなった。この要因は不明だが、in vivoで複数回抗原提示を受けることによって、単一の再構成TCRを発現するCD4陽性T細胞は、両者が野生型alleleのT細胞よりも高い確率で抗原反応性TCRヘテロダイマーを形成する可能性が考えられる。ヒトにおいても、ある種のTCRレパトアが、アレルギー疾患発症に関与する可能性が示されている（Bankakos P et al., Clin Exp Immunol 128:295-301, 2002.）。単一の再構成TCRを発現することによって抗原反応性の閾値が低下した状態は、そのようなアレルギー素因としての単一TCRレパトアの役割を反映しているとも考えられ、本クローンマウスの有用性の高さをさらに示したものといえる。
　驚くべきことに、クローンマウスをアレルギー性鼻炎モデルに供したところ、僅か３～５日間でINR、NHR及び鼻腔内炎症細胞浸潤を伴う鼻粘膜炎症の発症が確認された。本クローンマウスは、気管支喘息だけでなくアレルギー性鼻炎病態の解析にも有用であることが示された。我々は、感作マウスにおける抗原誘発NHR及び炎症細胞浸潤反応が、主にCD4陽性T細胞によって制御されていることを既に明らかにしており（Nishimura T et al., PLOS ONE, under revision.）、今回の結果はそれと合致したものといえる。さらに詳細な解析に用いることによって、本モデルはアレルギー性鼻炎の病態解明に役立つと期待される。
　今回、抗原特異的CD4陽性T細胞クローンマウスを利用して、短期間で発症する気管支喘息及びアレルギー性鼻炎モデルの作製に成功したことによって、それらの病態解析や医薬品の薬効評価における本クローンマウスの有用性が明らかとなった。今後、その他のアレルギー及び非アレルギー性疾患に対する応用の可能性を追求することによって、抗原特異的CD4陽性T細胞由来クローンマウスは、さまざまな疾患研究に大きく貢献することが示唆される。
　本発明の非ヒト哺乳動物は、ダニ抗原に特異的なアレルギー反応を確実かつ効率的に呈することから、アレルギー疾患の発症モデルとして好適に適用することができる。
配列表の配列番号１は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列１６９～１８８からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号２は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列１７９～１９８からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号３は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列１８９～２０８からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号４は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列２０２～２２１からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号５は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列２０９～２２８からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号６は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列２１９～２３８からなる部分ペプチドである。
配列表の配列番号７は、コナヒョウヒダニ蛋白質のアミノ酸配列２２９～２４８からなる部分ペプチドである。

Claims (12)

  1. 　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、非ヒト哺乳動物及びその子孫。
  2. 　CD4陽性T細胞が、G0期及び／又はG1期のCD4陽性T細胞である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
  3. 　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、請求項１又は２に記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
  4. 　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、請求項３に記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
  5. 　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されている、請求項１又は２に記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。
  6. 　CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用いて体細胞核移植する、非ヒト哺乳動物の調製方法。
  7. 　CD4陽性T細胞が、IL-2を添加して培養したのちIL-2を除去し、さらに培養して得られる、CD4陽性T細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、請求項８に記載の方法。
  10. 　T細胞受容体の遺伝子領域が、卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されている、請求項６又は７に記載の方法。
  11. 　T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原又は卵白アルブミン特異的なT細胞受容体として再構成されており、該遺伝子領域由来の単一種のT細胞受容体を個体内で発現している、非ヒト哺乳動物。
  12. 　ダニ抗原が、コナヒョウダニ又はヤケヒョウヒダニの、虫体又は排泄物、あるいはそれらの抽出物、リコンビナント蛋白質、もしくは合成ペプチドである、請求項１１に記載の非ヒト哺乳動物。
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