WO2016005642A1 - Vidrios y andamiajes bioactivos, procedimientos de preparación y usos de los mismos - Google Patents

Vidrios y andamiajes bioactivos, procedimientos de preparación y usos de los mismos Download PDF

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scaffolding
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vitreous
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Felipe Orgaz Orgaz
Leonor Santos Ruiz
María Flora BARBA MARTÍN-SONSECA
José BECERRA RATIA
Daniel AMAT TRUJILLO
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Universidad de Malaga
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Universidad de Malaga
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    • C03C3/087—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing aluminium oxide or an iron compound containing an oxide of a divalent metal containing calcium oxide, e.g. common sheet or container glass

Definitions

  • This invention generally relates to bioactive materials for use in biomedical technologies for tissue regeneration and engineering.
  • this invention relates to bioactive glasses and three-dimensional networks or scaffolds ("scaffolds") of bioactive glass.
  • the invention relates to methods of preparation and uses thereof.
  • An increase in clinical demand for bone tissue engineering has advanced the research effort to improve the bioactivity of the materials used as bone substitutes.
  • Tissue engineering for regenerative medicine is the process by which functional three-dimensional tissues are produced by combining temporary scaffolds of biomaterials that have a well-defined architecture and act as transporters of cells and growth factors (or other signaling biomolecules), which facilitate cell growth and differentiation, and promote tissue regeneration.
  • Biomaterial scaffolding when successfully functionalized, not only acts as a passive mechanical support for bone cells, but also positively influences bone formation by stimulating proliferation and differentiation of osteoblast cells, and stimulating vascularized bone growth.
  • Scaffolding architecture is critical to provide cells with an optimized microenvironment for the synthesis of new tissue; as well as to allow the flow and diffusion of nutrients between the cells and the surrounding microenvironment.
  • the scaffolding must have a hierarchical structure of pores, which comprises interconnected macroporos with diameters greater than 100 ⁇ , which are necessary to favor the growth of vascularized bone; and on the other hand interconnected mesopores (2 - 50 nm), which favor the adhesion of osteoprogenitor cells.
  • the cellular response depends not only on chemical composition and porosity, but also on scaffolding characteristics such as surface roughness and topography, grain size and crystallinity, as well as chemical radicals present on its surface.
  • the ability of the constituent biomaterial of scaffolding to promote cell adhesion and bone growth is critical in tissue engineering. Cells must adhere and colonize the substrate before beginning proliferation and differentiation processes. Therefore, the main function of scaffolding in tissue engineering is to serve as a substrate for cell adhesion. It has been proposed that the cells do not adhere directly to the substrates, but to components present in the cell culture medium, or in the extracellular matrix (for example, proteins such as collagen and fibronectin), which are previously adsorbed on the substrate and are then recognized by specific cell surface receptors (for example, integrins).
  • cell adhesion and growth on a biomaterial that acts as a substrate can be improved by functionalizing it by chemical modifications that increase the adsorption of extracellular matrix proteins on its surface, which will favor the interaction of cells with said surface by processes mediated by specific receptors of the cellular membrane.
  • Various functionalization techniques have been employed, for example the silanization of glass and ceramic surfaces, or the immobilization of proteins and peptides.
  • bioactive glasses and ceramics have excellent osteoconductivity, because they can deposit hydroxyapatite, a material with a high capacity to bind proteins, surface functionalization may be necessary to maintain and strengthen the ability to bind proteins in bioactive systems.
  • Bone scaffolds calcium phosphates (CaP), hydroxyapatite (HAp) or tricalcium phosphate A or B. These Materials are bioactive, osteoconductive and can bind directly to the bone.
  • Bioactive glasses based on silicates, phosphates or borates represent another important group of bioactive inorganic biomaterials that can be used as bone substitutes or as scaffolds in bone tissue engineering, because they have osteoconductive and osseointegrating properties: ability to bind both soft tissues and hard, due to the formation of a film of a bone-like material on its surface (carbonated hydroxyapatite). This osteosimilar material is formed when the material comes into contact with physiological fluids, and is the result of a rapid sequence of reactions on the surface of the bioactive glass implant (Hench LL. Bioceramics; J Am Ceram Soc 1998; 81 (7): 1705 -28) that include:
  • ACP amorphous calcium phosphate
  • bioactive glasses have excellent osteogenic properties, thanks to the ions released by partial dissolution, mainly calcium and silicon ions, which are thought to stimulate the expression of various genes that promote the differentiation and proliferation of osteoblastic cells and rapid bone growth.
  • bioactive glasses in the form of particles, in the form of porous scaffolds or as dense structures have been used to repair bone defects. Furthermore, it has been described that bioactive glasses stimulate angiogenesis "in vitro” and “in vivo” and possible antibacterial and anti-inflammatory effects have also been described.
  • bioactive glasses are considered of great interest in tissue engineering.
  • the ionic dissolution of the products released by the bioactive glasses stimulate the genes towards regeneration and self-repair.
  • Bioactive silicate glass known as 45S5, as well as other vitreous bioactive and ceramic glass based on the composition of 45S5, such as 13-93 and ICIE 16, have been the most researched for tissue engineering applications. From 45S5 it is difficult to obtain porous and amorphous scaffolds, because its narrow sintering margin causes it to crystallize forming a vitreous ceramic, which significantly reduces its bioactivity.
  • compositions that can be sintered avoiding crystallization and obtaining scaffolding of amorphous bioactive glasses.
  • Said compositions can be sintered in porous structure materials by methods widely used to prepare interconnected porous structures, such as the polymeric sponge infiltration method, or gel gels ("gel casting").
  • the 1393 glass could be sintered avoiding crystallization.
  • scaffolding was only capable of nuclear apatite in simulated body fluid (FCS) after 7 days of immersion, with FCS daily soda, which is too slow.
  • FCS simulated body fluid
  • Wu et al. Wang ZY, Hill RG, Yue S, Nightingale D, Lee PD, Jones JR. Melt-derived bioactive glass scaffolds produced by a gel-cast foaming technique. Acta Biomaterialia, Vol 7, Issue 4, April 201 1, pp .: 1807-1816) have developed a porous bioactive glass scaffolding obtained by amorphous fusion, called ICIE 16, which has a porous structure suitable for bone growth inside.
  • the composition of ICIE 16 was designed to allow sintering, but maintaining a bioactivity similar to that of the 45S5 bioglass, thanks to maintaining the connectivity of the structure (understood as oxygen bridge bonds for each silicon atom) as close as possible to 2.
  • This material has the potential to bind to the bone more rapidly and to better stimulate bone growth than other artificial porous bone substitutes available in the market.
  • the size of the glass powder is critical for sintering efficiency. Sintering temperature is also crucial, since temperatures above 700 ° C trigger crystallization, while temperatures below 680 to C do not allow complete sintering of the particles. Faced with the aforementioned possibilities, silicate-based bioactive glasses have some drawbacks that limit their use in tissue repair:
  • borate-based bioactive glasses have shown a faster degradation thanks to their lower chemical durability and are more fully converted into HAp, compared to silicate-based bioactive glasses.
  • Borate-based bioactive glasses have been shown to favor cell proliferation and differentiation “in vitro”, as well as tissue infiltration “in vivo.” They can also serve as substrates for drug release and for the treatment of bone infection.
  • boron nitride is increased in the presence of Li>Na> K and also when the temperature of the treatment with gas ammonia flow increases. At low temperatures, the most frequent groups were -NH 2 and NH.
  • a first object of the present invention is a bioactive glass comprising boron oxide and which has a substitution of B-0 bonds in the structure due to the formation of B-N bonds caused by nitriding.
  • the bioactive glass further comprises silicon dioxide, calcium oxide, sodium oxide, potassium oxide and phosphorus pentoxide.
  • said oxides included in the porous bioactive glass composition are ordered, according to their molar percentage, and from highest to lowest, according to the sequence Si0 2 >CaO> Na 2 0> K 2 0> B 2 0 3 > P 2 0 5.
  • the porous bioactive glass comprises
  • compositions of the glasses are expressed in molar percentages, that is, molar fractions (number of moles of the component divided by the total moles of all the components in the mixture) expressed as a percentage (relative percentage of the number of moles of the component with respect to the total moles of all components in the mixture).
  • BN bonds are formed in triangular BN 3 planar units, which form amorphous boron nitride films on the surface of the bioactive glass.
  • Another object of the present invention is a process for preparing a porous bioactive glass comprising the following steps:
  • the vitreous powders to be mixed further comprise silicon dioxide, calcium oxide, sodium oxide, potassium oxide and phosphorus pentoxide and more preferably said oxides comprised in the vitreous powder mixture are ordered, according to their molar%, and of major to minor, according to the sequence Si0 2 >CaO> Na 2 0> K 2 0> B 2 0 3 > P 2 0 5
  • the vitreous powder mixture comprises:
  • the vitreous powders to be mixed are partially or totally obtained from one or more pre-existing bioactive glasses, comprising obtaining a mixture of vitreous powders from said one or more pre-existing glasses the following steps:
  • vitreous powders obtained from one or more pre-existing bioactive glasses are mixed with each other, and / or with other vitreous powders, in the desired proportion to, after the nitriding stage, obtain a bioactive glass porous.
  • vitreous powders are obtained from two pre-existing bioactive glasses.
  • the first bioactive glass is ICIE16 glass
  • the second bioactive glass is a borosilicate glass (BSG)
  • the resulting vitreous powder is mixed in a proportion of 80 % by weight of the first bioactive glass with 20% by weight of the second bioactive glass.
  • - the melting of the first bioactive glass takes place at 1420 ° C for 1.5 hours
  • the grinding is done in the attrition mill and the sizes below 5 - 10 ⁇ are selected in the sieve,
  • - nitriding is carried out by contact with NH 3 flow at temperatures between 400 ° C and 800 ° C.
  • the sizes between 5 ⁇ and 10 ⁇ are selected in the sieve.
  • the sizes smaller than 5 ⁇ are selected in the sieve.
  • the present invention also extends to porous bioactive glasses obtained by the process object of the invention, including the variants and particular embodiments of said process.
  • Another object of the present invention is the use of the porous bioactive glasses also object of the invention, or of the bioactive glasses obtained by the process (including its variants and particular embodiments) also object of the invention, in the preparation of engineering scaffolds tissue.
  • the glass comprises boron oxide and has a substitution of B-0 bonds in the structure due to the formation of B-N bonds caused by nitriding.
  • the bioactive glass is formed by:
  • the bioactive glass is formed by:
  • Another object of the present invention is a scaffolding for tissue engineering that comprises a bioactive glass with boron oxide and that presents a replacement of B-0 bonds in the structure due to the formation of BN bonds caused by nitriding, or a bioactive glass obtained by the process object of the invention (including its variants and particular embodiments).
  • the bioactive glass of the scaffolding is formed by:
  • the bioactive scaffolding glass is formed by:
  • the scaffolds have a porous structure comprising:
  • Another object of the invention is the scaffolding preparation process comprising the following steps:
  • the monomer is methacrylamide
  • the crosslinking agent is ⁇ , ⁇ 'methylene bisacrylamide
  • the initiator is ammonium persulfate solution
  • the porosity forming agent is corn starch and the surfactant comprises casein
  • the catalyst is tetramethylene ethyl diamide
  • the cultivation is carried out at 37 ° C and with 5% C0 2 .
  • scaffolds in osteoinduction is also an object of the present invention.
  • cells are induced by eliminating the culture medium and culturing them in differentiation medium.
  • the cells are induced after a culture period of 4 days. In an alternative embodiment, the cells are induced directly after seeding.
  • Fig. 1 flow chart of the procedure for scaffolding preparation.
  • Fig. 2 Infrared spectrum of the ICIE16-SBG glass after nitriding in an ammonia atmosphere.
  • Fig. 3 Scanning electron microscopy (SEM) image of the ICIE16-SBG scaffolding resulting from the sintering process at 1025 ° C for 20 min. A trabecular hierarchical porous structure with macro and microscale pore sizes and with good interconnection between them has been formed.
  • Fig. 4 Hoechst staining of the cell nucleus
  • Fig. 5 SEM transmission electron microscopy image
  • Fig. 6 MTT assay for cell quantity estimation
  • Fig. 7 ALP - Hoechst staining (ALP: alkaline phosphatase)
  • Fig. 8 ALP activity (pNPP assay)
  • Bioactive glass scaffolds were prepared from a mixture of two types of molten vitreous powders:
  • the bioactive glass ICIE16 developed by Wu et al. It was melted in a platinum crucible at 1420 ° C for 1.5 hours from Si0 2 (49.46% molar), CaO (36.27%) molar), Na 2 0 (6.6% molar), P 2 O 5 (1, 07 molar%) and K 2 0 (6.6 molar%).
  • Borosilicate glass with a composition of Si0 2 (78.51% molar), B 2 0 3 (1 1, 37% molar), Na 2 0 (10.12% molar) was melted at 1550 ° C for 2 hours in a vertical oven using a platinum crucible. Both glasses were subjected to rapid cooling in water at room temperature from the melting temperature and subsequently dried at 1 10 ° C for 12 hours, to be subsequently ground in an attrition mill and sieved, selecting sizes between 5 ⁇ and 10 ⁇ . A dry mixing process was used to obtain the composite of two vitreous phases formed by 80% by weight of ICIE 16 and 20% by weight of BSG.
  • Silicate or phosphate glasses give rise to nitrogen dissolved in the vitreous structure (oxynitride glasses) when subjected to nitriding.
  • the procedure used in this case to prepare the scaffolding of porous bioactive glass has been a combination of the techniques of gel gels and polymeric sponge infiltration, starting from the molten vitreous powders to reach the vitreous structure with the desired architecture and geometry .
  • the structure was subsequently subjected to sintering to join the particles in a 3D grid, mechanically reliable and interconnected between pores.
  • the flowchart of the scaffolding / structure formation process is shown in Figure 1.
  • a catalyst tetramethylene ethyl diamide, TEMED
  • vitreous powder tetramethylene ethyl diamide, TEMED
  • Ultra-turrax® stirrer vigorous stirring with an Ultra-turrax® stirrer.
  • the paste formed in previous stages is poured into rectangular molds filled with polyurethane foam. After gelation, curing (80 ° C, 2 hours) and drying at 120 ° C for 12h, a hard and porous vitreous material, green in color, is obtained.
  • Sintered bioglass scaffolds with highly interconnected porous structure are obtained through a two-phase process:
  • the microstructure of the scaffolds was characterized using scanning electron microscopy (JSM6300, JEOL, Japan). This device was equipped to perform X-ray dispersive energy (EDX) spectroscopy.
  • JSM6300 scanning electron microscopy
  • JEOL JEOL
  • EDX X-ray dispersive energy
  • the degradation or dissolution rate of the glass was calculated by measuring the amount of released ions and soluble species in the simulated body fluid solution and the corresponding weight losses, changes in pH and ionic concentration of the solution as a function of time. For this, inductive coupling plasma emission spectroscopy (ICP-OES) was used.
  • ICP-OES inductive coupling plasma emission spectroscopy
  • the murine osteoblastic line MC3T3-E1 (1 1 1) was used to evaluate the biocompatibility and osteoconductivity of the biovidrios.
  • MC3T3-E1 (subclone-4) cells purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured in minimal essential alpha (alpha-MEM) medium with ribonucleosides, deoxyribonucleosides, 1mM sodium pyruvate and 2mM L-glutamine, but without ascorbic acid (GIBCO). To promote adhesion and cell growth, the cells were cultured in growth medium, consisting of alpha-MEM supplemented with 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin (GIBCO) and 10% fetal bovine serum (FBS ; PAA).
  • alpha-MEM minimal essential alpha
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured in differentiation medium, consisting of alpha-MEM supplemented with antibiotics, 2% FBS, 10 nM dexamethasone, 2 nM ⁇ -glycerophosphate, 0.2 mM L-ascorbate (all of SIGMA) and 300 ng / mL BMP-2 (from R&D Systems). In all cases, the medium was replaced every 2 days.
  • differentiation medium consisting of alpha-MEM supplemented with antibiotics, 2% FBS, 10 nM dexamethasone, 2 nM ⁇ -glycerophosphate, 0.2 mM L-ascorbate (all of SIGMA) and 300 ng / mL BMP-2 (from R&D Systems). In all cases, the medium was replaced every 2 days.
  • biocide ICIE 16, ICIE16 / BSG and ICIE16 / BSG-Nitri were presented in the form of scaffolding with a cubic geometry of volume between 3 and 5 mm 3 .
  • the biovidrios were washed in double-distilled water for seven days, with daily water change. They were subsequently sterilized in autoclave and kept in sterile storage conditions before being used in cell assays.
  • the scaffolds of the ICIE 16, ICIE16 / BSG and ICIE16 / BSG-Nitri bioglasses were seeded with 8 x 10 5 cells per scaffold and were grown in multiwell plates with growth medium and under standard culture conditions (37 ° C, 5% of C0 2 ). On days 1, 2, 3 and 7 after sowing, the cell nuclei were stained, by incubating the cells for 15 minutes in Hoechst 33342 (SIGMA) dissolved in the culture medium. The stained cultures were observed with a binocular magnifying glass (Nikon AZ-100) under epifluorescent light with a UV-2A filter. Images were captured with a digital camera (Nikon Digital sight DS-5Mc) operated with Nis-Elements software. Three scaffolds of each type of bioglass were used in these experiments.
  • the medium was transferred to 96-well plates and the spectrophotometric absorbance at 570 nm was measured using a microplate reader (ELISA, reference wavelength 690 nm). Data were plotted and analyzed statistically using SPSS software.
  • Bone differentiation in the bioglasses was evaluated by osteoinduction of the cells seeded in the scaffolds, followed by detection of alkaline phosphatase. 10 5 cells were seeded in each scaffold that were allowed to adhere for 4 hours in culture medium. Next, the cells were either allowed to grow for 4 days (indirect osteoinduction) or osteoinduced directly after the adhesion period (direct osteoinduction). In both cases, osteoinduction was performed by removing the culture medium and culturing the samples in differentiation medium for 4 days. Three replicates were used for each experimental condition.
  • the alkaline phosphatase activity was measured by the method based on modification of the pNPP substrate by the enzyme alkaline phosphatase (ALP). Briefly, the biovidrios with seeded cells were washed with PBS and covered with a solution containing 1 mg / mL of pNPP, 0.2 M tris buffer and 5 mM magnesium chloride. They were incubated in dark conditions at room temperature for 60 min and the reaction was stopped by adding a volume of 3M NaOH for every 3 volumes of pNPP substrate solution. The solution was transferred to a 96-well plate and the absorbance was read at 405 nm. Data were plotted and statistically analyzed using SPSS software.
  • ALP enzyme alkaline phosphatase
  • the enzyme was revealed by staining with "Fast Red Violet LP'VNaftol AS-Bl phosphate".
  • the cell-seeded scaffolds were fixed for 15 min in an acetone solution containing 3% formaldehyde, 4.6 mM citric acid, 2.3 mM sodium citrate and 3 mM sodium chloride.
  • Figure 2 shows the IR spectrum of the ICIE16 / BSG glass after nitriding in an ammonia atmosphere.
  • the main bands shown in Figure 2A are attributed to the vibrational modes of silicate and borosilicate reticles located at:
  • Figure 2B shows the low intensity spectral results in the range between 1300 and 1800 cm "1. Several peaks are observed.
  • the band located at 1420 cm “ 1 corresponds to the asymmetric stretches of the triangular borate (BO), which descends in nitride glasses.
  • BO triangular borate
  • Figure 3 shows an SEM image of the microstructure of a sintered ICIE16 / BSG composite material at 1025 ° C / 20 min, in which a trabecular hierarchical porous structure with pore sizes ranging from macropores well connected to pores in micro scale
  • a manufacturing process was used consisting of a combined protocol in which a polyurethane foam template is placed in a mold on which a suspension of a molding gel is left that is left gel. It is not possible to suggest an exact pore size and hollow volume to achieve an optimal tissue generation, but scaffolds with better interconnectivity were obtained with minimum pore diameters greater than 100 ⁇ , while maintaining sufficient amorphous structure in the glass for sintering to occur.
  • micropores size less than 10 microns
  • This microporosity is also necessary to provide the cells with nutrients and oxygen in the structure and helps to increase the surface area of the scaffolding and therefore improves:
  • Biodegradability of bioglass scaffolds Weight loss, changes in the pH of the simulated body fluid solution and conversion into hydroxyapatite
  • the evaluation of the scaffold degradation rate and its conversion into hydroxyapatite-like material was performed by immersion in aqueous phosphate solution, such as simulated body fluid at 37 ° C and measurement of scaffolding weight loss and changes in the pH of the body fluid solution over time.
  • Biocompatibility and osteoconductivity of glass scaffolding Cell adhesion, growth and differentiation.
  • Figure 4 shows that Hoechst staining of cell nuclei reveals the presence of cells in the three glasses tested (ICIE16, ICIE16 / BSG and ICIE16 / BSG-Nitri).
  • the Cellular density increased with time, so that after seven days of culture, the entire surface of the biovidrios appeared covered by cells ( Figure 4). This was confirmed by scanning electron microscopy, which showed that the cells had an indicator phenotype of good relationship with the substrates, with extended cell bodies and abundant phylopodia connecting the cells with each other and with the substrate. It is interesting to note that it was observed that the cells also grew on the edges of the pores of the bioglass, as if trying to fill them (figure 5).
  • Bone differentiation of osteoblastic cells seeded on the biovidries was evaluated by the detection of alkaline phosphatase activity (ALP).
  • ALP alkaline phosphatase activity
  • the "in situ" detection of ALP by an ALP fluorescent chromophore revealed that all cells cultured on both ICIE16 and ICIE16 / BSG-Nitri expressed ALP after 4 days of growth and 4 days of chemical osteoinduction ( Figure 7).
  • the cells that gave positive ALP were uniformly distributed on the surfaces in the two types of bioglasses.
  • both ICIE16 and ICIE16 / BSG-Nitri were seeded with osteoblast cells and were osteoinduced after four days of growth.
  • the ICIE16 / BSG-Nitri bioglass has been developed to improve the positive biological properties of ICIE16 and, in fact, cell assays have shown an improvement in the response on ICIE16 / BSG-Nitri compared to ICIE16.
  • Cell growth is significantly higher in the ICIE16 / BSG-Nitri bioglasses and cell differentiation takes place earlier.
  • indirect osteoinduction assays in which cells osteoinduce after they have time to grow and populate the material, ALP activity is similar in ICIE16 and ICIE16 / BSG-Nitri.
  • both the ICIE16 and ICIE16 / BSG / Nitri bioglass can be considered biocompatible and osteoconductors, with ICIE16 / BSG / Nitri being the most favorable to osteoblastic differentiation.

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Abstract

Son objeto de la invención vidrios bioactivos, y sus usos, que comprenden óxido de boro y que presentan una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración. Preferentemente, dichos vidrios comprenden adicionalmente otros óxidos, tales como los incluidos, y así preferentemente ordenados conforme a su porcentaje molar y de mayor a menor, en la secuencia SiO2 > CaO > Na2O > K2O > B2O3 > P2O5. La presente invención también se refiere a procedimientos de obtención de vidrios bioactivos nitrurados que comprenden la mezcla de polvos vitreos que comprenden óxido de boro y, en su caso, óxidos adicionales, y la nitruración de dicha mezcla. Asimismo, son objeto de la invención andamiajes nitrurados que comprenden dichos vidrios bioactivos, procedimientos de preparación de los mismos, y aplicaciones de los mismos.

Description

VIDRIOS Y ANDAMIAJES BIOACTIVOS. PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION Y
USOS DE LOS MISMOS
DESCRIPCION
CAMPO DE LA INVENCION
Esta invención se refiere en general a materiales bioactivos para ser usados en tecnologías biomédicas para la regeneración e ingeniería tisular. En particular, esta invención se refiere a vidrios bioactivos y a redes tridimensionales o andamiajes ("scaffolds") de vidrio bioactivo. Además, la invención se refiere a métodos de preparación y a usos de los mismos.
ESTADO DE LA TECNICA
Los materiales bioactivos juegan un papel crucial en el desarrollo de la tecnología biomédica para la regeneración e ingeniería tisular. Un aumento de la demanda clínica sobre la ingeniería tisular ósea ha hecho avanzar el esfuerzo en investigación para mejorar la bioactividad de los materiales empleados como sustitutos óseos. La ingeniería tisular para la medicina regenerativa es el proceso por el cual se producen tejidos tridimensionales funcionales combinando andamiajes temporales de biomateriales que tienen una arquitectura bien definida y que actúan como transportadores de células y de factores de crecimiento (u otras biomoléculas de señalización), los cuales facilitan el crecimiento y la diferenciación celulares, y promueven la regeneración tisular. Los andamiajes de biomaterial, cuando se funcionalizan con éxito, no sólo actúan como un soporte mecánico pasivo para las células óseas, sino que también influyen positivamente en la formación de hueso mediante la estimulación de la proliferación y diferenciación de células osteoblásticas, y la estimulación del crecimiento óseo vascularizado. Un objetivo importante de la medicina regenerativa es restaurar la función del tejido con estructuras implantables, cultivadas en laboratorio, las cuales contienen las células específicas de cada tejido que replicarán la función de las células del tejido nativo sano. La comprensión de los mecanismos biológicos de osificación "in vitro" puede contribuir al diseño de materiales específicos que apoyen dicho proceso de osificación, y con ello al diseño de implantes ingenierizados más exitosos. Los desafíos más importantes en el campo de las estructuras de ingeniería tisular consisten en imitar tanto la microarquitectura de los tejidos como el microambiente que rodea a las células in vivo. Para ello es necesario capturar la complejidad del hueso y reproducirla en modelos tridimensionales "in vitro", a fin de obtener un mayor control sobre la respuesta biológica y conseguir que los biomateriales actúen como guías morfogenéticas.
La arquitectura del andamiaje es crítica para proporcionar a las células un microambiente optimizado para la síntesis de tejido nuevo; así como para permitir el flujo y la difusión de nutrientes entre las células y el microambiente circundante. Los andamiajes deben presentar una estructura jerárquica de poros, que comprenda por un lado macroporos interconectados con diámetros superiores a los 100 μιη, los cuales son necesarios para favorecer el crecimiento de hueso vascularizado; y por otro lado mesoporos interconectados (2 - 50 nm), que favorecen la adherencia de las células osteoprogenitoras.
Obviamente, la respuesta celular depende no solo de la composición química y de la porosidad, sino también de características del andamiaje tales como la rugosidad y topografía superficiales, el tamaño de grano y la cristalinidad, así como de los radicales químicos presentes en su superficie. La capacidad del biomaterial constituyente del andamiaje para promover la adhesión celular y el crecimiento óseo es crítica en ingeniería tisular. Las células deben adherirse y colonizar el sustrato antes de comenzar los procesos de proliferación y diferenciación. Por tanto, la función principal del andamiaje en ingeniería tisular es servir como sustrato para la adhesión celular. Se ha propuesto que las células no se adhieren directamente a los sustratos, sino a componentes presentes en el medio de cultivo celular, o en la matriz extracelular (por ejemplo, proteínas como colágeno y fibronectina), que previamente se adsorben sobre el sustrato y son después reconocidos por receptores específicos de la superficie celular (por ejemplo, las integrinas).
En consecuencia, la adhesión y el crecimiento celulares sobre un biomaterial que ejerza de sustrato pueden ser mejorados funcionalizando el mismo mediante modificaciones químicas que incrementen la adsorción de proteínas de matriz extracelular sobre su superficie, lo que favorecerá la interacción de las células con dicha superficie mediante procesos mediados por receptores específicos de la membrana celular. Se han empleado diversas técnicas de funcionalización, por ejemplo la silanización de vidrios y superficies cerámicas, o la inmovilización de proteínas y péptidos. Aunque los vidrios y cerámicas bioactivos presentan una excelente osteoconductividad, debido a que pueden depositar hidroxiapatito, material con una alta capacidad para enlazar proteínas, la funcionalización de las superficies puede ser necesaria para mantener y reforzar la capacidad de enlazar proteínas en sistemas bioactivos.
Se han utilizado materiales de diferente naturaleza en ingeniería tisular tales como cerámicas, polímeros, materiales compuestos ("composites") y vidrios. En los últimos años se han publicado varios libros y revisiones bibliográficas. Debido a su semejanza química con la fase inorgánica del hueso, hay algunos materiales que se han investigado con más profundidad en relación a posibles aplicaciones como andamiajes óseos: fosfatos de calcio (CaP), hidroxiapatito (HAp) o fosfato tricálcico A o B. Estos materiales son bioactivos, osteoconductivos y pueden unirse directamente al hueso.
Los vidrios bioactivos basados en silicatos, fosfatos o boratos, representan otro importante grupo de biomateriales inorgánicos bioactivos que pueden ser utilizados como sustitutos de hueso o como andamiajes en ingeniería tisular ósea, porque presentan propiedades osteoconductoras y osteointegradoras: capacidad de unirse tanto a tejidos blandos como duros, debido a la formación de una película de un material similar al hueso en su superficie (hidroxiapatito carbonatado). Este material osteosimilar se forma al entrar el material en contacto con fluidos fisiológicos, y es resultado de una rápida secuencia de reacciones en la superficie del implante de vidrio bioactivo (Hench LL. Bioceramics; J Am Ceram Soc 1998;81 (7): 1705-28) que incluyen:
- degradación del vidrio,
- reacción de los iones calcio disueltos fuera del vidrio con el fosfato del medio para precipitar como una capa de fosfato de calcio amorfo (ACP),
- liberación iónica continuada y crecimiento de la capa de ACP,
- conversión final de la capa de ACP en una meso estructura porosa de finos cristales de Hap,
manteniéndose una interfase estable durante un periodo suficientemente largo como para promover la interacción con colágenos y otras biomoléculas, lo que da lugar en última instancia a una fuerte interfase de unión entre el vidrio del implante y los tejidos vivos circundantes. La bioactividad del vidrio se mide por la tasa de conversión en HAp. Por otro lado, se ha demostrado explícitamente que los vidrios bioactivos tienen excelentes propiedades osteogénicas, gracias a los iones liberados por disolución parcial, principalmente iones calcio y silicio, los cuales se piensa que estimulan la expresión de diversos genes que promueven la diferenciación y proliferación de células osteoblásticas y el rápido crecimiento del hueso.
Hoppe y col. [A. Hoppe, N.S.GüIdal and A.R. Bocaccini. A review of the biológica! response to ionic dissolution producís from bioactive glasses and glass-ceramics. Biomaterials. 32 (201 1 ) 2757-2774], han realizado una revisión bibliográfica sobre las respuestas biológicas a los productos iónicos disueltos a partir de vidrios bioactivos y cerámicas vitreas. Estudios previos revelaron que las características del sustrato, tales como la porosidad o los grupos silanoles superficiales, pueden ser cruciales en la formación y degradación de apatito. "Bioglass 4585" (referido frecuentemente como Bioglass®) fue el primer material encontrado que se unía al hueso y ha sido ampliamente estudiado y analizado como referencia. En cirugía ortopédica y en ortodoncia se han utilizado, para reparar defectos óseos, vidrios bioactivos en forma de partículas, en forma de andamios porosos o como estructuras densas. Aún más, se ha descrito que los vidrios bioactivos estimulan la angiogénesis "in vitro" e "in vivo" y también se han descrito posibles efectos antibacterianos y antiinflamatorios.
Otras ventajas de los vidrios bioactivos sobre otros materiales bioactivos son:
- flexibilidad en la composición,
- facilidad de preparación,
- capacidad de controlar y ajustar la tasa de degradación a la tasa de regeneración ósea, manipulando la composición del material, y
- la capacidad de constituirse en fuente de otros componentes menores que se sabe favorecen el crecimiento del hueso (tales como Zn, Cu, F, Mn, Sr o B), los cuales, liberados a tasas biológicamente aceptables, inducen la mineralización de células osteogénicas.
Por todo ello los vidrios bioactivos son considerados como de gran interés en ingeniería tisular. La disolución iónica de los productos liberados por los vidrios bioactivos estimulan los genes hacía la regeneración y auto-reparación. El vidrio silicato bioactivo conocido como 45S5, así como otros vidrios bioactivos y cerámicas vitreas basadas en la composición del 45S5, tales como la 13-93 y la ICIE 16, han sido los más investigados para aplicaciones de ingeniería tisular. A partir del 45S5 es difícil obtener andamiajes porosos y amorfos, debido a que su estrecho margen de sinterización hace que cristalice formando una cerámica vitrea, lo cual reduce notablemente su bioactividad.
Con el objetivo de ampliar el rango de la sinterización del 45S5, se han desarrollado diferentes composiciones que pueden ser sinterizadas evitando la cristalización y obtener andamiajes de vidrios bioactivos amorfos. Dichas composiciones pueden sinterizarse en materiales de estructura porosa mediante métodos ampliamente utilizados para preparar estructuras porosas interconectadas, tales como el método de infiltración de esponja polimérica, o el colaje de geles ("gel casting").
El vidrio 1393 podía sinterizarse evitando la cristalización. Sin embargo, los andamiaje solo fueron capaces de nuclear apatito en fluido corporal simulado (FCS) tras 7 días de inmersión, con refresco diario del FCS, lo cual es demasiado lento. Wu y col. (Wu ZY, Hill RG, Yue S, Nightingale D, Lee PD, Jones JR. Melt-derived bioactive glass scaffolds produced by a gel-cast foaming technique. Acta Biomaterialia, Vol 7, Issue 4, April 201 1 , pp.:1807-1816) han desarrollado un andamiaje de vidrio bioactivo poroso obtenido por fusión amorfa, denominado ICIE 16, que presenta una estructura porosa adecuada para el crecimiento de hueso en su interior. La composición del ICIE 16 se diseñó para permitir la sinterización, pero manteniendo una bioactividad similar a la del biovidrio 45S5, gracias a que se mantiene la conectividad de la estructura (entendida como enlaces puente de oxígeno por cada átomo de silicio) lo más cercana posible a 2. Este material tiene la potencialidad de unirse al hueso más rápidamente y de estimular mejor el crecimiento óseo que otros sustitutos óseos porosos artificiales disponibles en el mercado. El tamaño del polvo de vidrio es crítico para la eficacia de la sinterización. También es crucial la temperatura de sinterización, ya que temperaturas por encima de 700 °C disparan la cristalización, mientras que temperaturas por debajo de 680aC no permiten la sinterización completa de las partículas. Frente a las posibilidades referidas, los vidrios bioactivos basados en silicatos presentas algunos inconvenientes que limitan su empleo en reparación tisular:
- conversión lenta e incompleta a HAp
- ralentización de la degradación del vidrio, debido a la pasivación que ejerce el crecimiento de la capa de apatito, lo que impide la reabsorción completa del material y da lugar a la persistencia del vidrio no convertido "in vivo" y por tanto a una pobre degradación.
Vidrios bioactivos basados en boratos recientemente desarrollados han mostrado una degradación más rápida gracias a su menor durabilidad química y se convierten de forma más completa en HAp, comparados con vidrios bioactivos basados en silicatos.
Además presentan tasas de degradación controladas en combinación con propiedades deseables relacionadas con la osteogénesis y la angiogénesis. La conversión del vidrio bioactivo basado en boratos en HAp parece seguir un proceso similar al descrito para el vidrio 45S5, pero evitando la formación de una capa rica en Si02. Estos vidrios presentan una alta potencialidad para ser usados como una nueva clase de biomateriales.
Los vidrios bioactivos basados en boratos han mostrado que favorecen la proliferación y la diferenciación celular "in vitro", así como la infiltración tisular "in vivo". Asimismo, pueden servir como sustratos para la liberación de fármacos y para el tratamiento de la infección ósea.
Por otro lado se dispone de evidencia que sugiere que la nitruración de vidrios de silicatos, fosfatos y boratos, altera sus propiedades físicas y químicas tanto internas como de la superficie. La presencia de nitrógeno disuelto químicamente en una estructura vitrea que contiene óxidos, da lugar a la formación de oxinitruros que mejoran algunas propiedades físicas tales como la dureza o el módulo elástico de resistencia a la fractura. Esto significa que el reemplazo de oxígenos por nitrógenos supone un reforzamiento de la estructura vitrea como consecuencia de la sustitución de átomos de oxígeno con n° de coordinación 2, por átomos de nitrógeno con n° de coordinación 3. La duración química, así como las propiedades mecánicas y eléctricas de los vidrios de fosfato pueden mejorarse considerablemente incorporando nitrógeno en una atmósfera de NH3. Se cree que el nitrógeno reemplaza a los hidroxilos (-OH) terminales y los átomos de oxígeno enlazantes (-0-) y no enlazantes (=0) del tetraedro de P04, dando lugar a la formación de enlaces -NH< y -N= que incrementan el reticulado de la estructura vitrea. La intensidad de la banda de absorción IR a 480 cm"1, que es la característica de la vibración del enlace P-N, aumenta al crecer en contenido de nitrógeno en el vidrio de base. Estudios de nitruración de vidrios basados en borato han mostrado que pueden nitrurarse de forma similar. Al analizarse los espectros de transmisión infrarroja aparece que el estiramiento más fuerte de B-N se mide a 1390 cm"1 y 1 100 cm"1para BN3 triangular y BN4 tetragonal. Se ha encontrado que el nitruro de boro amorfo consiste casi exclusivamente en unidades triangulares planares de BN3. Los mecanismos de incorporación de nitrógeno en vidrios de boratos o borosilicatos alcalinos, indican un equilibrio dinámico entre las formas -NH2, -NH y -N= que se desplaza dependiendo de los diferentes rangos de temperatura y también de la composición del material. Se cree que el amoniaco reacciona con los grupos BOH y SiOH y el agua generada rompe los enlaces B-O-B y B-O-Si para dar lugar a la formación de hidroxilos BOH y SiOH. En vidrios Si02-B203- Na20 con contenidos de B203 inferiores al 30% molar, los grupos -NH2 prevalecen a temperaturas entre 400 y 500 °C. los grupos -NH prevalecen a temperaturas entre 400 y 600 °C y los -N= a temperaturas superiores a 800°C.
La formación de nitruro de boro se incrementa en presencia de Li>Na> K y también al aumentar la temperatura del tratamiento con flujo de amoniaco gaseoso. A bajas temperaturas, los grupos más frecuentes fueron los -NH2 y NH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Constituye un primer objeto de la presente invención un vidrio bioactivo que comprende óxido de boro y que presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración.
Preferentemente, el vidrio bioactivo comprende adicionalmente dióxido de silicio, óxido de calcio, óxido de sodio, óxido de potasio y pentóxido de fósforo.
Preferentemente, dichos óxidos comprendidos en la composición del vidrio bioactivo poroso se ordenan, conforme a su porcentaje molar, y de mayor a menor, según la secuencia Si02 > CaO > Na20 > K20 > B203 > P205.
En un modo de realización particular el vidrio bioactivo poroso comprende
- 55,27% molar de dióxido de silicio, Si02
- 29,02% molar de óxido de calcio, CaO - 7,30% molar de óxido de sodio, Na20
- 5,28% molar de óxido de potasio, K20
- 2,27% molar de óxido de boro, B203
- 0,86% molar de pentóxido de fósforo, P205
y presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración.
Las composiciones de los vidrios se expresan en porcentajes molares, esto es, fracciones molares (número de moles del componente dividido por el total de moles de todos los componentes en la mezcla) expresadas en porcentaje (porcentaje relativo del número de moles del componente respecto del total de moles de todos los componentes en la mezcla).
Los enlaces B-N se forman en unidades triangulares BN3 planares, las cuales forman películas de nitruro de boro amorfo en la superficie del vidrio bioactivo.
Constituye otro objeto de la presente invención un procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso que comprende las siguientes etapas:
- mezcla de polvos vitreos que comprenden óxido de boro, y
- nitruración por contacto con un flujo gaseoso que comprende amoniaco, NH3
Preferentemente los polvos vitreos a mezclar comprenden adicionalmente dióxido de silicio, óxido de calcio, óxido de sodio, óxido de potasio y pentóxido de fósforo y más preferentemente dichos óxidos comprendidos en la mezcla de polvos vitreos se ordenan, conforme a su % molar, y de mayor a menor, según la secuencia Si02 > CaO > Na20 > K20 > B203 > P205
En un modo particular de realización, la mezcla de polvos vitreos comprende:
- 55,27% molar de dióxido de silicio, Si02
- 29,02% molar de óxido de calcio, CaO
- 7,30% molar de óxido de sodio, Na20
- 5,28% molar de óxido de potasio, K20
- 2,27% molar de óxido de boro, B203
- 0,86% molar de pentóxido de fósforo, P205 En un modo particular de realización, los polvos vitreos a mezclar se obtienen parcial o totalmente a partir de uno o más vidrios bioactivos preexistentes, comprendiendo la obtención de una mezcla de polvos vitreos a partir de dichos uno o más vidrios preexistentes las siguientes etapas:
- fusión de dichos uno o más vidrios preexistentes,
- enfriamiento de dichos uno o más vidrios preexistentes fundidos,
- secado de dichos uno o más vidrios preexistentes tras la etapa anterior, y
- molienda y tamizado de dichos uno o más vidrios preexistentes tras la etapa anterior. En un modo más particular de realización, los polvos vitreos obtenidos a partir de uno o más vidrios bioactivos preexistentes se mezclan entre sí, y/o con otros polvos vitreos, en la proporción deseada para, tras la etapa de nitruración, obtener un vidrio bioactivo poroso. En un modo aún más particular de realización, los polvos vitreos se obtienen a partir de dos vidrios bioactivos preexistentes.
Constituye un modo preferente de realización de la presente invención un procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso que comprende las siguientes etapas:
- fusión de un primer vidrio bioactivo que comprende Si02, CaO, K20, Na20 y P205.
- fusión de un segundo vidrio bioactivo que comprende Si02, B203 y Na20.
- enfriamiento de ambos vidrios fundidos
- secado de los vidrios tras la etapa anterior
- molienda y tamizado de los vidrios secados procedentes de la etapa anterior
- mezcla de los polvos vitreos procedentes de la etapa anterior en proporciones adecuadas
- nitruración por contacto con un flujo gaseoso que comprende amoniaco, NH3 Preferentemente, el primer vidrio bioactivo es vidrio ICIE16, el segundo vidrio bioactivo es un vidrio borosilicato (BSG) y la mezcla de los polvos vitreos resultantes se efectúa en una proporción de 80% en peso del primer vidrio bioactivo con 20% en peso del segundo vidrio bioactivo. En un modo de realización particular del referido procedimiento: - la fusión del primer vidrio bioactivo tiene lugar a 1420°C durante 1 ,5 horas
- la fusión del segundo vidrio bioactivo tiene lugar a 1550°C durante 2 horas
- el enfriamiento rápido de los vidrios fundido se hace en agua a temperatura ambiente
- la etapa de secado se desarrolla 1 10°C durante 12 horas
- la molienda se hace en molino de atrición y en el tamizado se seleccionan los tamaños inferiores a 5 - 10 μιη,
- la mezcla de los polvos vitreos se hace en seco
- la nitruración se efectúa por contacto con flujo de NH3 a temperaturas comprendidas entre 400°C y 800°C.
En un modo de realización más particular del referido procedimiento, en el tamizado se seleccionan los tamaños comprendidos entre 5 μιη y 10 μιη.
En un modo de realización aún más particular del referido procedimiento, en el tamizado se seleccionan los tamaños inferiores a 5 μιη.
La presente invención también se extiende a vidrios bioactivos porosos obtenidos mediante el procedimiento objeto de la invención, incluidas las variantes y realizaciones particulares de dicho procedimiento.
Otro objeto de la presente invención es la utilización de los vidrios bioactivos porosos también objeto de la invención, o de los vidrios bioactivos obtenidos por el procedimiento (incluidas sus variantes y realizaciones particulares) también objeto de la invención, en la preparación de andamiajes para ingeniería tisular.
Preferentemente, el vidrio comprende óxido de boro y presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración. En una forma de realización particular, el vidrio bioactivo está formado por:
- 55,27% molar de Si02
- 29,02% molar de CaO
- 7,30% molar de Na20
- 5,28% molar de K20
- 2,27% molar de B203 - 0,86% molar de P205
En otra forma de realización especialmente preferida el vidrio bioactivo está formado por:
- 55,27% molar de Si02
- 29,02% molar de CaO
- 7,30% molar de Na20
- 5,28% molar de K20
- 2,27% molar de B203
- 0,86% molar de P205
y presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración.
Otro objeto de la presente invención lo constituye un andamiaje para ingeniería tisular que comprende un vidrio bioactivo con óxido de boro y que presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración, o un vidrio bioactivo obtenido mediante el procedimiento objeto de la invención (incluidas sus variantes y realizaciones particulares). En una forma de realización particular, el vidrio bioactivo del andamiaje está formado por:
- 55,27% molar de Si02
- 29,02% molar de CaO
- 7,30% molar de Na20
- 5,28% molar de K20
- 2,27% molar de B203
- 0,86% molar de P205
En otra forma de realización especialmente preferida, el vidrio bioactivo del andamiaje está formado por:
- 55,27% molar de Si02
- 29,02% molar de CaO
- 7,30% molar de Na20
- 5,28% molar de K20
- 2,27% molar de B203 - 0,86% molar de P205
y presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración. En todas las realizaciones referidas los andamiajes presentan una estructura porosa que comprende:
- poros interconectados con diámetros mínimos superiores a 100 μιη que permiten la migración celular, la proliferación y la vascularización.
- microporos con tamaño inferior a 10 μιη que aumentan la superficie del andamiaje y permiten el aporte de nutrientes y oxígeno a las células.
Otro objeto de la invención lo constituye el procedimiento de preparación de andamiajes que comprende las siguientes etapas:
- adición de un agente dispersante al 1 ,5% en peso a agua purificada
- adición progresiva a la solución acuosa resultante de la etapa anterior de:
- un monómero
- un agente entrecruzante
- iniciador
- adición de un agente porógeno y un surfactante
- adición de un catalizador y de los polvos vitreos correspondientes al vidrio bioactivo utilizado y agitación vigorosa
- vertido de la pasta formada tras las etapas anteriores en moldes rectangulares rellenos de espuma de poliuretano
- gelificación, curado y secado dando lugar a un material vitreo poroso de color verde. - posterior sinterización del biovidrio integrado en el andamiaje
En un modo de realización particular del procedimiento de preparación de los andamiajes:
- el agente dispersante es Dolapix CE64®
- el monómero es metacrilamida, el agente entrecruzante es Ν,Ν' metilenbisacrilamida y el iniciador es solución de persulfato amónico
- el agente formador de porosidad es almidón de maíz y el agente surfactante comprende caseína
- el catalizador es tetrametiletiléndiamida
- el curado tiene lugar a 80°C durante 2 horas y el secado a 120°C durante 12 horas - la sinterización tiene lugar en dos fases:
- 5 horas a 550°C
- calentamiento en rampa durante 20 min hasta alcanzar la temperatura de sinterización.
Constituye también un objeto de la presente invención el uso de los andamiajes en ingeniería tisular. Para ello, se procede según las siguientes etapas:
- presentación de los andamiajes con geometría cuboidal de volumen comprendido entre 3 y 5 mm3.
- lavado con agua bidestilada durante siete días con cambio diario del agua
- esterilización en autoclave y mantenimiento en condiciones de almacenamiento estéril
- siembra celular sobre los andamiajes
- cultivo de las células sembradas sobre los andamiajes.
Preferentemente:
- se siembran 8 x 105 células por andamiaje y
- el cultivo se realiza a 37°C y con un 5% de C02.
Por último, constituye también un objeto de la presente invención el uso de los andamiajes en osteoinducción. Para ello, las células se inducen eliminando el medio de cultivo y cultivándolas en medio de diferenciación.
En un posible modo de realización, las células se inducen tras un periodo de cultivo de 4 días. En un modo de realización alternativo, las células se inducen directamente tras la siembra.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1 : diagrama de flujo del procedimiento para la preparación del andamiaje.
Fig. 2: Espectro de infrarrojos del vidrio ICIE16-SBG tras nitruración en una atmósfera de amoniaco.
Fig. 3: Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) del andamiaje de ICIE16- SBG resultante del proceso de sinterización a 1025°C durante 20 min. Se ha formado una estructura porosa jerárquica trabecular con tamaños de poro a macro y microescala y con buena interconexión entre ellos.
Fig. 4: tinción Hoechst del núcleo celular Fig. 5: imagen de microscopía electrónica de transmisión SEM
Fig. 6: ensayo MTT de estimación de la cantidad de células
Fig. 7: tinción ALP - Hoechst (ALP: Fosfatasa alcalina)
Fig. 8: actividad ALP (ensayo pNPP)
MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones. Los contenidos de dichas publicaciones, así como las referencias contenidas en las mismas, se consideran incorporados en la presente solicitud. La terminología empleada se utiliza con el fin de describir modos particulares de realización de la invención y sin carácter limitante.
Diseño y preparación de vidrios bioactivos
Se prepararon andamiajes de vidrios bioactivos a partir de una mezcla de dos tipos de polvos vitreos fundidos:
- un vidrio ICIE 16 (80%) y
- un vidrio de borosilicato de sodio (20%)
Los compuestos constituyentes de ambos vidrios se pesaron y mezclaron en sus proporciones relativas, se fundieron por separado y luego se mezclaron.
El vidrio bioactivo ICIE16, desarrollado por Wu y col. fue fundido en un crisol de platino a 1420°C durante 1 ,5 horas a partir de Si02 (49,46% molar), CaO (36,27%) molar), Na20 (6,6% molar), P2O5 (1 ,07% molar) y K20 (6,6% molar).
El vidrio borosilicato (BSG) con una composición de Si02 (78,51 % molar), B203 (1 1 ,37% molar), Na20 (10,12% molar) se fundió a 1550°C durante 2 horas en un horno vertical usando un crisol de platino. Ambos vidrios fueron sometidos a un enfriamiento rápido en agua a temperatura ambiente desde la temperatura de fusión y posteriormente secados a 1 10°C durante 12 horas, para ser posteriormente molidos en un molino de atrición y tamizados seleccionándose los tamaños entre 5 μιη y 10 μιη. Se usó un proceso de mezcla en seco para obtener el material compuesto de dos fases vitreas formadas por un 80% en peso de ICIE 16 y un 20% en peso de BSG.
Los vidrios de silicato o de fosfato dan lugar a nitrógeno disuelto en la estructura vitrea (vidrios de oxinitruro) cuando son sometidos a nitruración. Sin embargo, los vidrios de borosilicato se eligieron porque son capaces de llegar a un equilibrio simultáneo entre los grupos NH-, -NH2 y -N=, con un desplazamiento hacia alguna de la formas según la composición y la temperatura del tratamiento.
Proceso de formación y de caracterización de los andamiajes porosos 3-D
Existe una variedad de diferentes técnicas de fabricación tridimensional que se emplean para producir estructuras vitreas con porosidad jerarquizada, entre otras: infiltración de esponja polimérica ("polymer foam replication"), colaje de geles ("gel casting"), sinterización de partículas de vidrio fundido ("thermal bonding of melt derived particles"), sol-gel ("sol-gel foaming"), electrohilado de soluciones o de fundidos viscosos ("electro-spinning from solution or from viscous melt"), o los métodos de prototipado rápido ("solid free form fabrication") tales como la sinterización láser selectiva ("selective láser sintering"), la fabricación por extrusión congelada ("freeze extrusión fabrication") y el colaje robotizado ("robocasting"). El procedimiento utilizado en este caso para preparar los andamiajes de vidrios bioactivos porosos ha sido una combinación de las técnicas de colaje de geles y de infiltración de esponja polimérica, para partiendo de los polvos vitreos fundidos llegar a la estructura vitrea con la arquitectura y geometría deseada. La estructura fue subsiguientemente sometida a sinterización para unir las partículas en una retícula 3D, mecánicamente fiable y con interconexión entre poros. El diagrama de flujo del proceso de formación del andamiaje/estructura se muestra en la figura 1.
Para la fabricación de los andamiajes/estructuras vitreas se siguió el siguiente proceso secuencial:
1 ) se añadió el agente dispersante Dolapix CE64 a agua purificada
2) a esta solución acuosa se añadieron progresivamente un monómero (metacrilamida), un agente entrecruzante (Ν,Ν' metilenbisacrilamida) y un iniciador (solución de persulfato amónico).
3) a continuación se adicionan un agente porógeno (almidón de maíz) y un agente surfactante que comprende caseína.
4) se añaden un catalizador (tetrametiletiléndiamida, TEMED) y el polvo vitreo, seguido de agitación vigorosa con un agitador Ultra-turrax®. Finalmente, la pasta formada en etapas anteriores se vierte en moldes rectangulares rellenos de espuma de poliuretano. Tras gelificación, curado (80°C, 2 horas) y secado a 120°C durante 12h se obtiene un material vitreo duro y poroso, de color verde.
Los andamiajes de biovidrio sinterizado con estructura porosa altamente interconectada se obtienen mediante un proceso en dos fases:
- 5 horas a 550°C y
calentamiento en rampa durante 20 min para alcanzar la temperatura de sinterización. Los parámetros que se consideran críticos para cumplir con los requerimientos mínimos que permiten el crecimiento tisular en estos andamiajes porosos son la porosidad, el tamaño de poro y la interconectividad de los poros.
Se caracterizó la microestructura de los andamiajes usando microscopía electrónica de barrido (JSM6300, JEOL, Japón). Este aparato estaba equipado para poder realizar espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (EDX).
Funcionalización superficial de los andamiajes porosos por nitruración con gas amoniaco
Los andamiajes preparados según el procedimiento descrito se expusieron a reacción con amoniaco en un horno de tubo de vidrio de sílice mediante contacto con un flujo de N2/amoniaco a 550°C durante dos horas y con una tasa de calentamiento de 10°C/min. Las muestras nitruradas fueron analizadas mediante reflexión IR. Los espectros de IR fueron obtenidos mediante el método de dilución con BrK usando un Spectrum BX (Perkin-Elmer) en el rango de 1500-1600 cm"1 con una resolución de 1 cm"1. Para ello se mezcla 1 mg de muestra con 300 mg de BrK y se presionan a 5 Tm durante dos minutos. En cada barrido se restan los valores de fondo.
Evaluación "in vitro" de los andamiajes de vidrio bioactivo poroso: cinética de liberación de iones y conversión en hidroxiapatito
Se realizó la evaluación "in vitro" de los andamiajes de vidrio bioactivo mediante:
a) Inmersión en fluido corporal simulado (SBF) para estudiar las tasas de biodegradación, la liberación de iones y la conversión en hidroxiapatito. b) Cultivo de células osteoblásticas murinas sobre los andamiajes y monitorización de la respuesta celular: adhesión, migración, crecimiento y diferenciación ósea. Para evaluar la cinética de degradación, los andamiajes de vidrio poroso se sumergieron en solución de fluido corporal simulado a 37°C durante 200 horas. Se calculó la tasa de degradación o disolución del vidrio midiendo la cantidad de iones liberados y de especies solubles en la solución de fluido corporal simulado y las correspondientes pérdidas de peso, cambios en el pH y concentración iónica de la solución en función del tiempo. Para ello, se utilizó espectroscopia de emisión de plasma por acoplamiento inductivo (ICP-OES).
Adicionalmente, la tasa de deposición de la conversión en material tipo HAp fue investigada mediante SEM/EDX tras la inmersión en solución de fluido corporal simulado.
Métodos para evaluar la respuesta celular "in vitro" a los andamiajes de vidrio bioactivo poroso.
Se empleó la línea osteoblástica murina MC3T3 - E1 (1 1 1 ) para evaluar la biocompatibilidad y osteoconductividad de los biovidrios.
Las células de MC3T3 - E1 (subclón-4) adquiridas a la American Type Culture Collection (ATCC) se cultivaron en medio esencial mínimo alfa (alfa-MEM) con ribonucleósidos, desoxiribonucleósidos, piruvato de sodio 1 mM y L-glutamina 2mM, pero sin ácido ascórbico (GIBCO). Para favorecer la adhesión y el crecimiento celular, las células fueron cultivadas en medio de crecimiento, consistente en alfa-MEM suplementado con 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (GIBCO) y 10% de suero fetal bovino (FBS; PAA). Para estimular la diferenciación ósea, las células se cultivaron en medio de diferenciación, consistente en alfa-MEM suplementado con antibióticos, 2% de FBS, dexametasona 10 nM, β-glicerofosfato 2 nM, L-ascorbato 0,2 mM (todo ello de SIGMA) y 300 ng/mL BMP-2 (de R&D Systems). En todos los casos, el medio fue reemplazado cada 2 días.
Los biovidrios ICIE 16, ICIE16/BSG y ICIE16/BSG-Nitri se presentaron en forma de andamiajes con geometría cuboidal de volumen entre 3 y 5 mm3. Antes de la siembra celular, los biovidrios se lavaron en agua bidestilada durante siete días, con cambio diario del agua. Posteriormente fueron esterilizados en autoclave y mantenidos en condiciones de almacenamiento estéril antes de su utilización en los ensayos celulares.
Seguimiento y toma de imágenes de los andamiajes sembrados con células.
Los andamiajes de los biovidrios ICIE 16, ICIE16/BSG y ICIE16/BSG-Nitri se sembraron con 8 x 105 células por andamiaje y fueron cultivados en placas multipocillo con medio de crecimiento y en condiciones estándar de cultivo (37°C, 5% de C02). En los días 1 , 2, 3 y 7 tras la siembra, los núcleos celulares fueron teñidos, mediante incubación de las células durante 15 minutos en Hoechst 33342 (SIGMA) disuelto en el medio de cultivo. Los cultivos teñidos fueron observados con una lupa binocular (Nikon AZ -100) bajo luz epifluorescente con un filtro UV-2A. Se capturaron imágenes con una cámara digital (Nikon Digital sight DS-5Mc) operada con software de Nis-Elements. Se usaron tres andamiajes de cada tipo de biovidrio en estos experimentos.
Al séptimo día de cultivo, tras observar y tomar imágenes de las muestras, éstas se fijaron durante 45 min en una solución tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1 % de paraformaldehido y 3% de glutaraldehído. Las muestras fijadas se lavaron por dos veces en PBS, se deshidrataron mediante incubación secuencial (60 min cada serie) en etanol de 20°, 50°, 70°, 96° y 100°. Las muestras fueron deshidratadas y desecadas mediante método de punto crítico (Bal-tec CPD 030), montadas en soportes de aluminio usando cinta de carbono de doble cara, y recubiertas con una película muy fina de oro (JEOL JCC 1 100). Posteriormente, fueron observadas y fotografiadas con un microscopio electrónico de barrido modelo JEOL JSM-840.
Ensayos MTT
La evaluación del crecimiento celular sobre las andamiajes se llevó a cabo mediante un ensayo MTT sobre los andamiajes sembrados a diferentes tiempos tras la siembra. Los andamiajes se sembraron con 5 x 105 células por cada andamiaje y cultivados en placas multipocillo bajo condiciones estándar de cultivo. En los días 2 y 7 tras la siembra, el medio normal de cultivo se reemplazó con 1 ,2 mL de medio de cultivo que contenía 0,5 mg/mL de MTT. Se incubaron los cultivos con MTT en condiciones de cultivo estándar (37°C y 5% de C02) durante 4 horas. Posteriormente, se añadió 1 ,2 ml_ de solución de solubilización (10% SDS en HCI 0,01 M) a los pocilios y se incubó durante 24 h en condiciones de cultivo. Tras evaluar la completa solubilización de los cristales de formazán mediante observación en un microscopio de inversión, se transfirió el medio a placas de 96 pocilios y se midió la absorbancia espectrofotométrica a 570 nm usando un lector de microplacas (ELISA, longitud de onda de referencia 690 nm). Se representaron los datos gráficamente y se analizaron estadísticamente mediante el software SPSS.
Expresión de fosfatasa alcalina
Se evaluó la diferenciación ósea en los biovidrios mediante osteoinducción de las células sembradas en los andamiajes, seguido de detección de fosfatasa alcalina. Se sembraron 105 células en cada andamiaje que se dejaron adherir durante 4 horas en medio de cultivo. A continuación, las células fueron o bien dejadas crecer durante 4 días (osteoinducción indirecta) o bien osteoinducidas directamente tras el periodo de adhesión (osteoinducción directa). En ambos casos, la osteoinducción se realizó eliminando el medio de cultivo y cultivando las muestras en medio de diferenciación durante 4 días. Se usaron tres réplicas para cada condición experimental.
La actividad fosfatasa alcalina se midió mediante el método basado en modificación del sustrato pNPP por parte de la enzima fosfatasa alcalina (ALP). Brevemente, los biovidrios con células sembradas se lavaron con PBS y se cubrieron con una solución que contenía 1 mg/mL de pNPP, tampón tris 0,2 M y cloruro de magnesio 5 mM. Se incubaron en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min y se detuvo la reacción añadiendo un volumen de NaOH 3 M por cada 3 volúmenes de solución sustrato pNPP. Se trasegó la solución a una placa de 96 pocilios y se leyó la absorbancia a 405 nm. Los datos se representaron gráficamente y se analizaron estadísticamente mediante el software SPSS.
Para observar la distribución de las células que expresaban fosfatasa alcalina en los andamiajes se reveló la enzima mediante tinción con "Fast Red Violet LP'VNaftol AS- Bl fosfato". Los andamiajes sembrados con células fueron fijados durante 15 min en una solución de acetona que contenía 3% de formaldehido, ácido cítrico 4,6 mM, citrato de sodio 2,3 mM y cloruro de sodio 3 mM. Se enjuagaron con agua desionizada y se incubaron durante 15 min (protegidos de la luz) en un colorante alcalino recién preparado que contenía 0,1 mg/mL "Fast Red Violet" y 0,1 mg/mL de naftol AS-BI fosfato en tampón AMDP 0,05 M más cloruro sódico 8,5 mM y nitrito de sodio 2 mM. A continuación, las muestras fueron enjuagadas de nuevo en agua desionizada y los núcleos fueron teñidos con Hoechst 33342 tal y como se ha descrito anteriormente. Las muestras fueron observadas y fotografiadas con un microscopio láser confocal (Leica SP5 II) operado mediante software Leica Las AF.
Demostración de la incorporación de grupos funcionales -NH2 en la superficie de los biovidrios mediante espectroscopia IR
Las modificaciones estructurales inducidas por la introducción de nitrógeno en los vidrios BSG se midieron y analizaron mediante espectroscopia infrarroja. La figura 2 muestra el espectro IR del vidrio ICIE16/BSG tras nitruración en atmósfera de amoniaco. Las bandas principales que aparecen en la figura 2A se atribuyen a los modos vibracionales de las retículas de silicato y borosilicato localizadas en:
- 969 cm"1 correspondiente al estiramiento del enlace Si-0
- 913 cm"1 correspondiente al estiramiento del enlace Si-O-B
- 739 cm"1 correspondiente a la deformación del enlace B-0
- 2350 cm"1 correspondiente a la vibración del C02.
La figura 2B muestra los resultados espectrales de baja intensidad en el rango comprendido entre 1300 y 1800 cm"1. Se observan diversos picos. La banda localizada en 1420 cm"1 corresponde a los estiramientos asimétricos del borato triangular (B-O), que desciende en los vidrios nitrurados. Al nitrurar, se produce un reajuste continuo de la estructura del borato debido a la formación de enlaces B-N, principalmente en unidades triangulares, en las que el estiramiento más fuerte se mide a 1390 cm"1 para grupo BN3. Es interesante comprobar que las películas de nitruro de boro amorfo consistían casi exclusivamente en unidades BN3 triangulares planares. Sin embargo, se hace difícil detectar la existencia de enlaces B-N porque la banda localizada a 1410 cm"1 puede explicarse por la suma de las vibraciones del enlace B- O y del B-N, enmascarando la banda B-0 y la B-N. Las bandas localizadas a 1695 cm"1 y 1517 cm"1, corresponden a los modos vibracionales de estiramiento de los grupos B-NH2. Se observa que estas dos bandas se incrementan cuando los vidrios se nitrurizan. Debido a la baja temperatura de nitruración utilizada, predominan los grupos NH2 sobre los grupos -NH y los B-N, los cuales requieren de temperaturas más altas para formarse. Caracterización microestructural de los andamiajes 3D
La figura 3 muestra una imagen SEM de la microestructura de un material compuesto ICIE16/BSG sinterizado a 1025°C/20 min, en el cual se ha formado un estructura porosa jerárquica trabecular con tamaños de poro que van desde macroporos bien conectados a poros en escala micro. Para conseguir la interconectividad de esta estructura jerárquica porosa abierta se utilizó un proceso de fabricación consistente en un protocolo combinado en el cual una plantilla de espuma de poliuretano se coloca en un molde sobre el cual se vierte una suspensión de un gel de moldeo que se deja gelificar. No es posible sugerir un tamaño exacto de poros y de volumen hueco para conseguir una generación óptima de tejido, pero los andamiajes con mejor interconectividad se obtuvieron con diámetros de poro mínimos superiores a los 100 μιη, manteniendo al mismo tiempo suficiente estructura amorfa en el vidrio para que se produzca la sinterización. Estos poros interconectados permiten la migración celular, la proliferación y la vascularización. Aún más, se ha demostrado la existencia de microporos (tamaño inferior a 10 mieras) en los andamiajes (figuras 3b y 3c). Esta microporosidad es también necesaria para aportar a las células nutrientes y oxígeno en la estructura y contribuye a aumentar la superficie del andamiaje y por tanto mejora:
- la adsorción de factores que inducen la diferenciación celular
- el intercambio iónico
- la organización de las capas de proteína adsorbida, lo que a su vez determina la respuesta celular específica.
Biodegradabilidad de los andamiajes de biovidrios. Pérdidas de peso, cambios en el pH de la solución de fluido corporal simulado y conversión en hidroxiapatito
La evaluación de la tasa de degradación de los andamiajes y su conversión en material tipo hidroxiapatito se realizó mediante inmersión en solución acuosa de fosfato, tal como fluido corporal simulado a 37°C y medida de la pérdida de peso de los andamiajes y de los cambios en el pH de la solución de fluido corporal con el tiempo.
Biocompatibilidad y osteoconductividad de los andamiajes de vidrio. Adhesión celular, crecimiento y diferenciación.
La figura 4 muestra que la tinción Hoechst de los núcleos celulares revela la presencia de células en los tres vidrios ensayados (ICIE16, ICIE16/BSG y ICIE16/BSG-Nitri). La densidad celular aumentó con el tiempo, de manera que tras siete días de cultivo, la superficie completa de los biovidrios aparecía cubierta por células (figura 4). Esto se confirmó mediante microscopía electrónica de barrido, la cual mostraba que las células presentaban un fenotipo indicador de buena relación con los sustratos, con cuerpos celulares extendidos y abundantes filopodios conectando las células entre sí y con el sustrato. Es interesante hacer notar que se observó que las células crecían también en los bordes de los poros del biovidrio, como si intentaran rellenarlos (figura 5).
Para comparar cuantitativamente el crecimiento celular en cada uno de los biovidrios, se realizó un ensayo MTT. En los momentos iniciales (2 días tras la siembra) había importantes diferencias entre los tres biovidrios en cuanto a cantidad de células, siendo Nitru el material con más células y ICIE-16 el menos poblado. En etapas posteriores, no se observaban diferencias entre ICIE16 y ICIE16/BSG, pero había una impactante diferencia entre el biovidrio ICIE16/BSG-Nitri comparado con los otros dos (figura 6).
Se evaluó la diferenciación ósea de células osteoblásticas sembradas sobre los biovidrios mediante la detección de la actividad fosfatasa alcalina (ALP). La detección "in situ" de ALP mediante un cromóforo fluorescente de ALP reveló que todas las células cultivadas tanto sobre ICIE16 como sobre ICIE16/BSG-Nitri expresaban ALP tras 4 días de crecimiento y 4 días de osteoinducción química (figura 7). Las células que daban ALP positiva estaban uniformemente distribuidas sobre las superficies en los dos tipos de biovidrios. Para comparar la diferenciación celular en los diferentes biovidrios, se sembraron tanto ICIE16 como ICIE16/BSG-Nitri con células osteoblásticas y fueron osteoinducidas tras cuatro días de crecimiento. El ensayo pNPP mostró un considerable incremento de la actividad ALP en ambos biovidrios cuando se comparaba con los controles en los que se había efectuado osteoinducción (figura 8a). En cambio, cuando la osteoinducción se efectuó inmediatamente tras la siembra, solo las células sembradas sobre el biovidrio ICIE16/BSG-Nitri mostraron un incremento en la actividad ALP (figura 8b). Para evaluar la biocompatibilidad y propiedades osteoconductivas del biovidrio ICIE16/BSG-Nitri, se comparó su comportamiento con el del material precursor, ICIE16, en una serie de ensayos "in vitro". Los resultados muestran que las células osteoblásticas se adhieren tanto a ICIE16 como a ICIE16/BSG-Nitri. Las células adheridas pueden crecer sobre ambos materiales y poblarlos, e incluso pueden diferenciarse tras una estimulación apropiada. Por tanto, ambos biovidrios son biocompatibles y osteoconductores "in vitro".
Wu y col. habían postulado que el ICIE16, presenta una buena compatibilidad con el tejido óseo (y por tanto una potencial aplicabilidad en reparación ósea), basándose en la formación de capas de HAp tras inmersión en fluido corporal simulado. En nuestro trabajo se han llevado a cabo ensayos "in vitro" con células osteoblásticas que proporcionan más evidencia de la potente interacción positiva entre ICIE16 y el hueso. Estas propiedades se muestran por primera vez, ya que Wu y col. no realizaron ensayos biológicos.
El biovidrio ICIE16/BSG-Nitri ha sido desarrollado para mejorar las propiedades biológicas positivas de ICIE16 y, de hecho, los ensayos celulares han mostrado una mejora en la respuesta sobre ICIE16/BSG-Nitri en comparación con ICIE16. El crecimiento celular es significativamente mayor en los biovidrios ICIE16/BSG-Nitri y la diferenciación celular tiene lugar antes. En ensayos de osteoinducción indirecta, en los cuales las células se osteoinducen después de que tengan tiempo para crecer y poblar el material, la actividad ALP es similar en ICIE16 y en ICIE16/BSG-Nitri. Sin embargo, en ensayos de osteoinducción directa, en los cuales las células son estimuladas directamente tras la adhesión, solo las células sembradas sobre biovidrios ICIE16/BSG-Nitri fueron capaces de responder al estímulo osteogénico. Esto puede ser debido a la mejor adherencia de las células sobre el biovidrio ICIE16/BSG/Nitri, dando lugar a un cultivo confluente. Se ha descrito que es necesario un cierto grado de confluencia para que las células osteoblásticas se diferencien. Sin embargo, los ensayos MTT realizados y la observación de las células teñidas con Hoechst no mostraron grandes diferencias en la densidad celular en los primeros días. Esto puede deberse a que los grupos NH2 en la superficie nitrurada interaccionan con las proteínas séricas del medio de cultivo y con las proteínas de la superficie celular creando un ambiente favorable en el cual las células establecen con el sustrato las conexiones necesarias para llevar a cabo su actividad normal.
En conclusión, tanto el biovidrio ICIE16 como el ICIE16/BSG/Nitri se pueden considerar biocompatibles y osteoconductores, siendo el ICIE16/BSG/Nitri el más favorable a la diferenciación osteoblástica.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Vidrio bioactivo poroso que comprende óxido de boro, caracterizado por que presenta una sustitución de enlaces B-0 en la estructura debida a la formación de enlaces B-N originada por nitruración.
2. - Vidrio bioactivo poroso según la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende adicionalmente dióxido de silicio, óxido de calcio, óxido de sodio, óxido de potasio y pentóxido de fósforo.
3. - Vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que dichos óxidos comprendidos en la composición del vidrio bioactivo poroso se ordenan, conforme a su % molar, y de mayor a menor, según la secuencia Si02 > CaO > Na20 > K20 > B203 > P205
4. - Vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende:
- 55,27% molar de dióxido de silicio, Si02
- 29,02% molar de óxido de calcio, CaO
- 7,30% molar de óxido de sodio, Na20
- 5,28% molar de óxido de potasio, K20
- 2,27% molar de óxido de boro, B203
- 0,86% molar de pentóxido de fósforo, P205
5.- Vidrio bioactivo poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los enlaces B-N se forman en unidades triangulares BN3 planares, las cuales forman películas de nitruro de boro amorfo en la superficie del vidrio bioactivo.
6.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
- mezcla de polvos vitreos que comprenden óxido de boro, y
- nitruración por contacto con un flujo gaseoso que comprende NH3
7. - Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que los polvos vitreos a mezclar comprenden adicionalmente dióxido de silicio, óxido de calcio, óxido de sodio, óxido de potasio y pentóxido de fósforo.
8. - Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que dichos óxidos comprendidos en la mezcla de polvos vitreos se ordenan, conforme a su % molar, y de mayor a menor, según la secuencia Si02 > CaO > Na20 > K20 > B203 > P205
9. - Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que la mezcla de polvos vitreos comprende:
- 55,27% molar de dióxido de silicio, Si02
- 29,02% molar de óxido de calcio, CaO
- 7,30% molar de óxido de sodio, Na20
- 5,28% molar de óxido de potasio, K20
- 2,27% molar de óxido de boro, B203
- 0,86% molar de pentóxido de fósforo, P205
10.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 caracterizado por que los polvos vitreos a mezclar se obtienen parcial o totalmente a partir de uno o más vidrios bioactivos preexistentes, comprendiendo la obtención de una mezcla de polvos vitreos a partir de dichos uno o más vidrios preexistentes las siguientes etapas:
- fusión de dichos uno o más vidrios preexistentes,
- enfriamiento de dichos uno o más vidrios preexistentes fundidos,
- secado de dichos uno o más vidrios preexistentes tras la etapa anterior, y
- molienda y tamizado de dichos uno o más vidrios preexistentes tras la etapa anterior.
1 1 .- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que los polvos vitreos obtenidos a partir de uno o más vidrios bioactivos preexistentes se mezclan entre sí, y/o con otros polvos vitreos, en la proporción deseada para, tras la etapa de nitruración, obtener un vidrio bioactivo poroso conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 1 1 caracterizado por que los polvos vitreos se obtienen a partir de dos vidrios bioactivos preexistentes.
13.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
- fusión de un primer vidrio bioactivo que comprende Si02, CaO, K20, Na20 y P205.
- fusión de un segundo vidrio bioactivo que comprende Si02, B203 y Na20.
- enfriamiento de ambos vidrios fundidos
- secado de los vidrios tras la etapa anterior
- molienda y tamizado de los vidrios secados procedentes de la etapa anterior
- mezcla de los polvos vitreos procedentes de la etapa anterior en las proporciones adecuadas, y
- nitruración por contacto con un flujo gaseoso que comprende NH3
14. - Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior caracterizado por que el primer vidrio bioactivo es vidrio ICIE 16, el segundo vidrio bioactivo es vidrio BSG, y la mezcla de los polvos vitreos resultantes se mezclan en una proporción de 80% en peso del primer vidrio bioactivo con 20% en peso del segundo vidrio bioactivo.
15. - Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior, donde:
- la fusión del primer vidrio bioactivo tiene lugar a 1420°C durante 1 ,5 horas
- la fusión del segundo vidrio bioactivo tiene lugar a 1550°C durante 2 horas
- el enfriamiento de los vidrios fundido se hace en agua a temperatura ambiente
- la etapa de secado se desarrolla 1 10°C durante 12 horas
- la molienda se hace en molino de atrición y en el tamizado se seleccionan los tamaños inferiores a 10 μιη
- la mezcla de los polvos vitreos se hace en seco
- la nitruración se efectúa por contacto con flujo de NH3 a temperaturas comprendidas entre 400°C y 800°C.
16.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación anterior, donde se seleccionan los tamaños comprendidos entre 5 y 10 μιη
17.- Procedimiento de preparación de un vidrio bioactivo poroso según la reivindicación 15, donde se seleccionan los tamaños inferiores a 5 μιη
18. Vidrio bioactivo poroso obtenido mediante un procedimiento conforme a las reivindicaciones 6 a 17.
19. - Utilización de vidrios bioactivos porosos conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de andamiajes para ingeniería tisular.
20. - Utilización de vidrios bioactivos porosos obtenidos mediante un procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17 en la preparación de andamiajes para ingeniería tisular.
21 . - Andamiaje para ingeniería tisular que comprende un vidrio bioactivo poroso conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
22. - Andamiaje para ingeniería tisular que comprende un vidrio bioactivo obtenido mediante un procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17 conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
23.- Andamiaje según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, caracterizado porque presenta una estructura porosa que comprende:
- poros interconectados con diámetros mínimos superiores a 100 μιη que permiten la migración celular, la proliferación y la vascularización.
- microporos con tamaño inferior a 10 μιη que aumentan la superficie del andamiaje y permiten el aporte de nutrientes y oxígeno a las células.
24.- Procedimiento de preparación de andamiajes según se definen en las reivindicaciones 21 a 22, que comprende las siguientes etapas:
- adición de un agente dispersante al 1 ,5% en peso a agua purificada
- adición progresiva a la solución acuosa resultante de la etapa anterior de: - un monómero
- un agente entrecruzante
- iniciador
- adición de un agente porógeno y un surfactante
- adición de un catalizador y de los polvos vitreos correspondientes al vidrio bioactivo utilizado y agitación vigorosa
- vertido de la pasta formada tras las etapas anteriores en moldes rectangulares rellenos de espuma de poliuretano
- gelificación, curado y secado dando lugar a un material vitreo poroso de color verde. - posterior sinterización del biovidrio integrado en el andamiaje
25. - Procedimiento de preparación de andamiajes según la reivindicación anterior, donde:
- el agente dispersante es Dolapix CE64®
- el monómero es metacrilamida, el agente entrecruzante es Ν,Ν' metilenbisacrilamida y el iniciador es solución de persulfato amónico
- el agente formador de porosidad es almidón de maíz y el agente surfactante comprende caseína
- el catalizador es tetrametiletiléndiamida
- el curado tiene lugar a 80°C durante 2 horas y el secado a 120°C durante 12 horas
- la sinterización tiene lugar en dos fases:
- 5 horas a 550°C
- calentamiento en rampa durante 20 min hasta alcanzar la temperatura de sinterización.
26. - Uso de andamiajes según se definen en las reivindicaciones 21 a 22 en ingeniería tisular.
27. - Uso de andamiajes según la reivindicación anterior, que comprende:
- presentación de los andamiajes con geometría cuboidal de volumen comprendido entre 3 y 5 mm3.
- lavado con agua bidestilada durante siete días con cambio diario del agua
- esterilización en autoclave y mantenimiento en condiciones de almacenamiento estéril
- siembra celular sobre los andamiajes - cultivo de las células sembradas sobre los andamiajes
28. - Uso de andamiajes según la reivindicación anterior, donde:
- se siembran 8 x 105 células por andamiaje
- el cultivo se realiza a 37°C y con un 5% de C02.
29. - Uso de andamiajes según se definen en las reivindicaciones 15 y 16 en osteoinducción.
30. - Uso de andamiajes según la reivindicación anterior, donde las células se inducen eliminando el medio de cultivo y cultivándolas en medio de diferenciación.
31 . - Uso de andamiajes según la reivindicación anterior, dónde las células se inducen tras un periodo de cultivo de 4 días.
32. - Uso de andamiajes según la reivindicación 30, dónde las células se inducen directamente tras la siembra.
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