WO2015197884A1 - Línea celular de carcinoma inflamatorio mamario canino - Google Patents

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WO2015197884A1
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canine
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bmi
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Juan Carlos Illera Del Portal
Laura PEÑA FERNÁNDEZ
Sara CÁCERES RAMOS
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Universidad Complutense de Madrid
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Universidad Complutense de Madrid
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C12N5/063—Kereatinocyte stem cells; Keratinocyte progenitors

Definitions

  • the invention falls within the field of animal cell lines, more specifically in that of high-malign tumor cell lines. Particularly, it is related to the establishment of mammary inflammatory carcinoma cell lines for use as specific biomodels for this tumor type, for the evaluation and development of future prognostic systems and treatments.
  • IBC Inflammatory Breast Cancer
  • IBC Inflammatory Breast Cancer
  • the IBC is considered a special type of breast cancer with genetic, biological, pathological and clinical behavior differential characteristics. Histopathology reveals a tumor of high malignancy that is not represented by a specific histological type.
  • the only differential histological microscopic characteristic of IBC compared to other malignant mammary tumors is the presence of a massive tumor invasion of the lymphatic vessels of the dermis that are the cause, in the end, of edema and other signs of apparent inflammation.
  • the treatment Current "multimodal" which includes aggressive chemotherapy and radiotherapy, usually before using surgery, has slightly improved the disease-free period and overall survival. In spite of everything, the survival of women with IBC is very low.
  • SUM149 cells are triple negative and SUM190 cells are RE / RP negative and HER-2 positive.
  • Other less studied IBC cell lines are: MDA-IBC3, KPL4 and WIBC-9 (all RE / RP negative and HER-2 positive).
  • the new FC-IBC02 cell line also triple negative, has been described and characterized.
  • TMC Canine mammary tumors
  • canine BMI canine BMI
  • Canine breast inflammatory carcinoma cell line Canine breast inflammatory carcinoma cell line.
  • the present invention relates to an established canine mammary carcinoma cell line.
  • these are rounded or polygonal cells from large to very large (they can reach values close to 60 ⁇ ), with high cytological malignancy.
  • Cellular and nuclear pleomorphism are very marked, with very large nuclei and numerous nucleoli, and multinucleated cells are also frequent. It is characterized, therefore, by anisocytosis, anisocariosis and multinucleated cells.
  • vascular mimicry is observed in the culture, that is, cells that resemble the endothelial cells of the capillaries by presenting small and numerous or large cytoplasmic voids.
  • the immunohistochemical characterization of the cell line revealed that it is basal epithelial cells and, in addition, it was negative in terms of the expression of the estrogen receptor (RE), the progesterone receptor (RP) and the receptor 2 of the Human epidermal growth factor (both C-ERBb2 and HER-2).
  • Negative cells to these three receptors are called triple negatives, both in the case of breast cancers in women and in dogs, and have been of interest to the medical and scientific community for several years due to the high aggressiveness of the Breast cancers called triple negatives, the poor prognosis they have and the few therapeutic tools available to combat them, to which we must add the fact that they frequently affect young women and present a very high risk of metastasis. Also, at the moment, it was not possible establish a clear classification of triple negative tumors, perhaps due to their high heterogeneity.
  • the invention relates to a cell line from a 10-year-old mixed breed dog. Internally it has been called IPC-366, and its deposit has been made, dated 05/22/2014, at the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures, in Sofia (Bulgaria), obtaining access number 8815.
  • IPC-366 Internally it has been called IPC-366, and its deposit has been made, dated 05/22/2014, at the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures, in Sofia (Bulgaria), obtaining access number 8815.
  • the development of A triple negative cell line from canine BMI allows the study of tumor growth and its pathogenic mechanisms in vitro, including the initial stages in which analyzes are more difficult to perform due to the rapid evolution of the tumor.
  • the IPC-366 canine BMI cell line is the only one existing so far, its use serves to perform comparative studies of pathogenic and therapeutic mechanisms (angiogenesis, motility, metastasis, response to treatments, to growth factors) of this disease between both species (canine and human) and, potentially, test drugs prior to their administration in the spontaneous canine model, which has the advantage of presenting a shorter waiting time before the results, compared to the human species.
  • Canine BMI is a very aggressive neoplasm and its cells have a very high malignancy, so the development of a BMI cell line also serves to study the mechanisms of tumor malignancy in general and metastasis with a privileged model, since both IBC as BMI they are characterized by being highly lymphangioinvasive and lymphangiogenic.
  • Another aspect of the invention relates to a method for obtaining stable xenotransplants in mice from triple canine BMI cells. negative, specifically, from the IPC-366 cell line. The development of mouse xenotransplantation from IPC-366 occurs rapidly (at approximately 3 weeks), which gives an idea of its high tumorigenicity.
  • both the xenotransplant and the cell line allows to study early stages of the disease and, in the case of the cell line, allows to know the cellular pathogenic processes directly;
  • a cell line is easy to transport and is capable of being used in different laboratories, so that experiments and results can be unified.
  • Another aspect of the invention relates to a kit for the in vitro study of canine BMI and / or human IBC and of potentially usable drugs against human IBC that includes the cell line of the invention.
  • Figure 1 Growth curve of the IPC-366 cell line. The number of cells (x10 5 ) is plotted against time in days (t). A latency phase (first 24 hours), an exponential growth phase (following 5 days) and a plateau phase (seventh day) can be seen.
  • Figure 2 Morphology of the IPC-366 cell line.
  • A Diff-Quick stained cytology (x4).
  • B and C paraffin cut of a pellet, stained with Hematoxylin / Eosin (B, x10; C x40)
  • Figure 3 Pellet of the IPC-366 cell line, stained with Hematoxylin / Eosin.
  • A rounded cell morphology, variable size. Measurement using image analyzer. The cell with the black line measures 26.03 ⁇ .
  • B Cytoplasmic empty space that gives the cell the appearance of an endothelial cell (arrow), a phenomenon known as vascular mimicry.
  • Figure 4 Multinucleated cells of high cytological malignancy. Basophilic aggregate rounded in the cytoplasm (arrow). IPC-366 cytology stained with Diff-Quick.
  • Figure 5 Morphology of the IPC-366 cell line in a semi-thin section stained with methylene blue. Marked anisocytosis, anisocariosis, multinucleated cells and vascular mimicry (arrow).
  • Figure 6 A: Large nucleus cells and evident nucleoli; mitosis. B: Large nucleus cell and nucleolus evident with abundant organelles, vacuoles and protein secretion. C: Tumor cell with protein secretion. D: detail of B. E: Tumor cell with empty cytoplasmic holes covered by cytoplasmic membrane. F: Binucleated cell with empty hollow inside morphologically resembling a capillary (vascular mimicry).
  • Figure 7 Tumor development 4 weeks after the cells of the IPC-366 cell line were transplanted in BALB / c-SCID mice.
  • Figure 8 Xenotransplantation of IPC-366 in BALB / c-SCID mouse. Hematoxylin / Eosin.
  • A solid tumor that infiltrates the dermis.
  • B tumor plunger in the dermis (arrow), histological characteristic of mammary inflammatory carcinoma.
  • C Tumor at higher magnifications (x40) showing the cytological characteristics of malignancy.
  • Figure 9 Xenotransplantation of IPC-366 in BALB / c-SCID mouse. Hematoxylin / Eosin.
  • A Tumor neovascularization.
  • B Vascular mimicry. Note the difference between the cells that cover the vascular space in A and B. In A the capillaries are upholstered by normal endothelial cells. In B the vascular spaces are upholstered by tumor cells of high malignancy.
  • FIG. 10 IPC-366 cell line. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase broad-spectrum anti-cytokeratins (AE1-AE3) as markers of epithelial cells in general. Positive cells. A: cytology. B: pellet.
  • FIG 11 IPC-366 cell line. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase anti-vimentin as a marker of mesenchymal cells and cells in culture. Most cells are positive. A: cytology. B: pellet. Figure 12: IPC-366 cell line pellet. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase anti-cytokeratin of basal epithelial cells (CK 14). Positive cells.
  • Figure 13 IPC-366 cell line. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase anti-p63 as a marker of myoepithelial cells. Negative cells. A: cytology. B: pellet.
  • Figure 14 IPC-366 cell line. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase smooth muscle anti-actin as a marker of myoepithelial cells. Negative cells. A: cytology. B: pellet.
  • FIG. 15 IPC-366 cell line pellet. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase. A: estrogen anti-receptor. B: Progesterone anti-receptor. C: anti-HER-2 Dako. D: anti-HER-2 P4. Negative cells.
  • Figure 16 IPC-366 cell line. Immunohistochemical technique of Streptavidin Biotin Peroxidase anti-Ki-67 as a marker of cell proliferation. Numerous positive nuclei, that is, high Ki-67 index.
  • the IPC-366 cell line was obtained from samples of a canine inflammatory breast carcinoma taken immediately after the humanitarian slaughter of the animal (a 10-year-old female mixed breed female dog) for the realization of the primary culture as detailed below. .
  • the tumor was collected under sterile conditions and maintained in an HBSS solution (Hank's Balanced Salt Solution) + 1% penicillin-streptomycin antibiotic.
  • the tumor was washed well with the same HBSS solution and cut into small fragments. To perform the digestion of the tumor fragments, they were placed in a Falcon tube with collagenase III and left under continuous agitation at 37 ° C for 2 hours. At that time, tissue digestion was helped by mechanical disintegration with the pipette.
  • DMEM / F12 medium Dulbecco's Modified Eagle Medium I nutrient mixture F12
  • FB fetal bovine serum
  • the resulting pellet or pellet was resuspended in DMEM / F12 culture medium supplemented with 10% SFB; 1% L-glutamine (Sigma); 1% antibiotic penicillin-streptomycin. Finally, the content was transferred to T-75 cm 2 culture bottles (specifically, 3 bottles) which were kept in an oven at 37 ° C with 5% CO2.
  • the culture medium was changed every 7 days by fresh culture to clean the culture and nourish the cells.
  • the cells took to adhere approximately 24 hours.
  • a week after culturing the cells cell proliferation began to be seen.
  • the progress of the culture was monitored by observation under a microscope. When the cell confluence reached approximately 75%, the cells were detached with trypsin and transferred to another culture flask.
  • the IPC-366 cell line was established. As indicated above, when the cell confluence in a culture bottle reached approximately 75%, the cells were detached with trypsin and transferred to another culture bottle (this action is what is known as "pass") . This fact was repeated successively over a year and a half. As mentioned, for a cell line to be stable it must overcome the successive transfer in new culture bottles. In March 2014, the IPC-366 cell line successfully exceeded 50 passes, indicating its stability and unlimited growth.
  • the culture medium was extracted from the culture bottles and washed with HBSS solution. 3 ml of 0.25% Trypsin-EDTA Solution was added and allowed to incubate at 37 ° C for 1 to 5 minutes. When you see the light, you can see that the cells have taken off, or it can be seen in the inverted microscope if the cells are rounded, indicating that they are peeling.
  • the entire contents of the culture flask were collected and placed in a Falcon tube. It was centrifuged at 1000 rpm, 5 min at 20 ° C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in 1ml DMEM / F12 culture medium supplemented with 10% SFB; 1% L-glutamine; 1% antibiotic penicillin-streptomycin. A minimum of 1x10 6 cells were frozen so that, when thawing, the viability was greater. Therefore, the cell count was necessary in each case. In a cryovial, 0.2 ml of DMSO and 0.8 ml of SFB were added (in this way it was frozen with 10% DMSO and 40% SFB).
  • the cells were cooled gradually until finally frozen by following the steps below. First the cryovials were left 15-20 min in the fridge. Then, another 15-20 minutes were left in the freezer at -20 ° C. Finally, they were stored in a freezer of -80 ° C, properly labeled. After a week, they were frozen in a liquid nitrogen tank.
  • cryovials were thawed. First they were defrosted at 37 ° C. Once thawed, the cryovial content was added in a Falcon with 20ml DMEM / F12 medium without supplementing. The content was centrifuged at 1000 rpm, 5 min at 20 ° C and the pellet was resuspended in DMEM / F12 culture medium supplemented with 10% SFB, 1% L-glutamine, 1% antibiotic penicillin-streptomycin. It was homogenized and grown in a 25 cm 2 culture flask that was incubated at 37 ° C.
  • the cells after cryopreservation, showed good growth in multiple passages, preserving, a priori, the characteristics of the cell line and with a viability of 95-99%.
  • the cells that were in passage 20 were subcultured in culture plates at a concentration of 10 5 cells per well. They were incubated with DMEM / F12 medium supplemented with 10% SFB, 1% L-glutamine, 1% antibiotic penicillin-streptomycin at 37 ° C. Each day, for a week, the three well cells were counted using a hemocytometer. The average of the daily count was used to subsequently repress it and observe the evolution of the growth of the cells in culture ( Figure 1). After the latency phase, of adapting the cells to the culture conditions, which lasted 24 hours, it was observed that the cells entered an exponential growth phase where they began to proliferate massively. Finally, on the seventh day, the cells entered the plateau phase, where the cells cease to proliferate and differentiation begins. 5. Cellular morphology with optical microscopy
  • the pellets were paraffinized. For the observation of cells by histological paraffin sections, it was necessary to obtain a sufficient number of cells. From 1 to 3 culture bottles, and after trypsinization, the entire contents of the culture bottles were centrifuged at 1000 rpm, 5 min, at 20 ° C, the supernatant being removed. The sediment was resuspended in buffered formalin and centrifuged again, obtaining the pellet. The pellet was included in paraffin following routine procedures of the pathology laboratory and sections of 3-4 microns were stained, also routinely stained with the hematoxylin-eosin technique. The morphology of the cells in cytology and paraffin sections was similar ( Figure 2).
  • Cellular, nuclear and nucleololar diameters were measured in 12 fields of a pellet, with the objective of 40 magnifications and using the Image J image analyzer (Table 1), the cell size being between 7.35 and 583.33 ⁇ , the nuclear size between 5,255 and 13,385 ⁇ (anisocariosis) and the size of the most evident nucleoli between 3,744 and 8,245 ⁇ .
  • Table 1 Cellular measurements
  • the cells are of high malignancy, have a surface covered by short cytoplasmic extensions, have numerous organelles and secretion products, and cells with small and numerous cytoplasmic voids are often seen, or larger and in smaller numbers, resembling endothelial cells of capillaries (vascular mimicry) (Figure 6).
  • the IPC-366 cell line (10 7 cells / animal) was inoculated with two male and two female BALB / c-SCID mice, previously anesthetized, on the right ventral flank, at the height of the second breast and subcutaneously.
  • the implantation and development of the IPC-366 cell line in mice demonstrates its tumorigenicity ( Figure 7). Three weeks after inoculation, the presence of a tumor mass was observed by palpation, and four weeks later, when the tumor exceeded 2cm 3 , the animals were slaughtered, and the tumors and their metastases were removed (in lung and liver). The existence of distant metastases revealed the metastatic capacity of the cell line in xenotransplantation.
  • Ki-67 index of 87, 15% The cell proliferation measured with Ki-67 by immunohistochemical technique is very high (Ki-67 index of 87, 15%) (Table 3).

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Abstract

La presente invención se refiere a una línea celular establecida de carcinoma inflamatorio mamario canino, de células epiteliales basales triple negativas. La invención también se refiere a un método para la obtención de xenotransplantes estables de carcinoma inflamatorio mamario canino en animales de experimentación, y al uso de la línea celular y de los xenotransplantes en el estudio del carcinoma inflamatorio mamario canino así como del carcinoma inflamatorio mamario humano y su uso para identificar in vitro compuestos terapéuticamente útiles para el tratamiento del cáncer inflamatorio mamario humano. También se refiere a un kit para el estudio in vitro de IMC canino y/o IBC humano y de fármacos potencialmente utilizables frente al IBC humano, que incluye la línea celular de la invención.

Description

Título
Línea celular de carcinoma inflamatorio mamario canino
Sector de la Técnica
La invención se encuadra dentro del campo de las líneas celulares animales, más concretamente en el de líneas celulares tumorales de alta malignidad. Particularmente, se relaciona con el establecimiento de líneas celulares de carcinoma inflamatorio mamario para su uso como biomodelos específicos para este tipo tumoral, para la evaluación y desarrollo de futuros sistemas de pronóstico y tratamientos.
Estado de la técnica
El cáncer inflamatorio mamario, conocido por sus siglas en inglés IBC ("Inflammatory Breast Cáncer") es la neoplasia mamaria más agresiva y de peor pronóstico en la mujer. Afortunadamente, es una enfermedad de baja prevalencia, aunque de elevada mortalidad. Clínicamente, es un tumor que presenta un curso clínico fulminante. Los signos clínicos iniciales aparecen en la piel que recubre el tejido mamario que se presenta con edema, eritema, aumento de la temperatura, "piel de naranja" y sensación de dolor en la piel que recubre la glándula mamaria. Todos estos síntomas, característicos de inflamación, unidos al hecho de que frecuentemente no se observan nodulos mamarios, provocan que el diagnóstico inicial de cáncer sea difícil en muchas ocasiones, ya que se puede confundir con una dermatitis o mastitis. Es, sin embargo, un proceso tumoral muy agresivo y de difícil tratamiento. Actualmente, el IBC se considera un tipo especial de cáncer mamario con características diferenciales desde el punto de vista genético, biológico, patológico y de comportamiento clínico. La histopatología revela un tumor de elevada malignidad que no está representado por un tipo histológico concreto. La única característica microscópica histológica diferencial del IBC respecto a otros tumores mamarios malignos, es la presencia de una invasión tumoral masiva de los vasos linfáticos de la dermis que son los causantes, en último extremo, del edema y de otros signos de aparente inflamación. El tratamiento actual "multimodal" que incluye quimioterapia agresiva y radioterapia, normalmente antes de emplear la cirugía, ha mejorado ligeramente el periodo libre de enfermedad y la supervivencia total. A pesar de todo, la supervivencia de las mujeres con IBC es muy baja. En los últimos años se han realizado varios estudios sobre la caracterización inmunohistoquímica del IBC humano (receptores hormonales, proliferación tumoral, etc.) que proporcionan pronósticos y tratamientos más acertados para cada caso. Actualmente se siguen probando nuevos tratamientos que mejoren la supervivencia y tiempo libre de enfermedad de las pacientes con IBC y se buscan nuevos factores pronóstico. Así mismo, es necesario encontrar biomodelos específicos para este tipo tumoral, especialmente para los casos que son triple negativos (negativos al receptor de estrógenos -RE-, al receptor de progesterona -RP- y al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano -HER-2-), ya que su tratamiento es aún más difícil. Hay pocos modelos disponibles que permitan estudiar la peculiar biología de IBC, especialmente del IBC triple negativo. La mayoría de estudios se ha llevado a cabo usando las líneas celulares humanas SUM149 y SUM190. Las células SUM149 son triple negativas y las células SUM190 son negativas a RE/RP y positivas a HER-2. Otras líneas celulares IBC menos estudiadas son: MDA-IBC3, KPL4 y WIBC- 9 (todas RE/RP negativas y HER-2 positivas). En el último año, se ha descrito y caracterizado la nueva línea celular FC-IBC02, también triple negativa.
La posible utilización del modelo espontáneo canino es una opción muy interesante sobre todo para la evaluación y desarrollo de futuros tratamientos y para el estudio del proceso metastásico. Los tumores mamarios caninos (TMC) son las neoplasias más frecuentes en la perra, especialmente en países mediterráneos, como España, donde la ovariohisterectomía a edad temprana no se suele practicar, aumentándose de forma drástica el riesgo de padecer tumores mamarios en esta especie animal. Aproximadamente el 50% de los TMC son malignos y de éstos, el carcinoma inflamatorio mamario canino, conocido por sus siglas en inglés IMC (Inflammatory Mammary Οβηοβή es el de mayor gravedad. Hasta que comenzaron nuestros trabajos en este tipo tumoral, muy poco se conocía sobre su existencia en la perra, ya que sólo se había publicado una breve descripción que recogía las características clínicas más evidentes de diez animales afectados por IMC. La utilización del IMC canino como modelo comparativo animal viene avalada por su mayor prevalencia respecto a la mujer, por la menor duración de los estudios en esta especie animal (lo que permite obtener resultados de tratamientos y supervivencia en un tiempo relativamente corto) y por ser de carácter espontáneo, aunque quedan aspectos importantes de la enfermedad que merecen ser comparados entre ambas especies para poder validar los estudios en el modelo canino. Además, al ser la especie canina un animal de compañía, ambas especies están sometidas, en gran medida, a los mismos efectos ambientales, incluyendo algunos carcinógenos.
Aún así, existen varios problemas en el modelo canino de IMC espontáneo: su baja prevalencia, aunque ésta sea mayor que la del carcinoma inflamatorio humano, y que la evolución del tumor es tan rápida que no se pueden estudiar las fases iniciales de la enfermedad, ni es posible la predicción de la metástasis tumoral temprana. En la investigación del carcinoma inflamatorio mamario canino, los inventores desarrollaron un biomodelo de xenotransplante en ratón obtenido directamente a partir de muestras de una perra con carcinoma inflamatorio (Camacho, L. Res Vet Sci (2013) 95(3): 1068-75). Los xenotransplantes descritos en este documento reproducían las características histológicas del tumor primario y eran positivos a los receptores hormonales y negativos al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano. Podían, por lo tanto, utilizarse como modelo canino para el estudio del IBC.
Sin embargo, es necesario reducir la experimentación con animales vivos, para no causarles innecesariamente dolor, sufrimiento, angustia o lesión prolongados. Es fundamental, por lo tanto, encontrar métodos alternativos que faciliten y mejoren el estudio de esta enfermedad que, a su vez, se puede utilizar como modelo para el estudio del cáncer inflamatorio mamario humano.
Descripción detallada de la invención
Línea celular de carcinoma inflamatorio mamario canino.
La presente invención se refiere a una línea celular establecida de carcinoma inflamatorio mamario canino. Al analizar la morfología celular de la línea se comprobó que se trata de células redondeadas o poligonales de grandes a muy grandes (pueden alcanzar valores cercanos a los 60Όμιη), con una alta malignidad citológica. El pleomorfismo celular y nuclear son muy marcados, con núcleos muy grandes y numerosos nucléolos, siendo también frecuentes las células multinucleadas. Se caracteriza, por lo tanto, por anisocitosis, anisocariosis y células multinucleadas. Además, se observa mimetismo vascular en el cultivo, es decir, células que se asemejan a las células endoteliales de los capilares por presentar huecos vacíos de citoplasma pequeños y numerosos o grandes y en menor número.
Por otro lado, la caracterización inmunohistoquímica de la línea celular reveló que se trata de células epiteliales básales y, además, resultó negativa en cuanto a la expresión del receptor de estrógeno (RE), el receptor de progesterona (RP) y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (tanto C-ERBb2 como HER-2). Las células negativas a estos tres receptores se denominan triples negativas, tanto en el caso de los cánceres de mama en mujeres como en las perras, y son objeto de interés para la comunidad médica y científica desde hace varios años debido a la elevada agresividad de los cánceres de mama llamados triple negativos, al mal pronóstico que tienen y a las pocas herramientas terapéuticas de las que se dispone para combatirlos, a lo que hay que sumar el hecho de que afectan frecuentemente a mujeres jóvenes y presentan un riesgo de metástasis muy elevado. Además, por el momento, no se ha podido establecer una clasificación clara de los tumores triple negativos, tal vez debido a su elevada heterogeneidad.
En concreto, la invención se refiere a una línea celular procedente de una perra de raza mestiza de 10 años de edad. Internamente se ha denominado IPC-366, y se ha realizado su depósito, con fecha 22/05/2014, en el National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures, de Sofía (Bulgaria), obteniendo el número de acceso 8815. El desarrollo de una línea celular triple negativa a partir de IMC canino permite el estudio del crecimiento tumoral y de sus mecanismos patogénicos in vitro, incluyendo las fases iniciales en las que los análisis son más difíciles de realizar debido a la rápida evolución del tumor. La línea celular de IMC canino IPC-366 es la única existente hasta el momento, su empleo sirve para realizar estudios comparativos de mecanismos patogénicos y terapéuticos (angiogénesis, motilidad, metástasis, respuesta a tratamientos, a factores de crecimiento) de esta enfermedad entre ambas especies (canina y humana) y, potencialmente, probar fármacos previamente a su administración en el modelo espontáneo canino, que tiene la ventaja de presentar un menor tiempo de espera ante los resultados, en comparación con la especie humana. El IMC canino es una neoplasia muy agresiva y sus células presentan una malignidad muy elevada, por lo que el desarrollo de una línea celular de IMC sirve también para estudiar los mecanismos de malignidad tumoral en general y metástasis con un modelo privilegiado, ya que tanto IBC como IMC se caracterizan por ser altamente linfangioinvasivos y linfangiogénicos.
Una vez establecida la línea celular, se ha comprobado que inoculándola directamente en ratones Balb-c/SCID se reproduce el tumor, con lo que se puede establecer un modelo de xenotransplante estable in vivo. Otro aspecto de la invención, por lo tanto, se refiere a un método para la obtención de xenotransplantes estables en ratón a partir de células de IMC canino triple negativo, concretamente, a partir de la línea celular IPC-366. El desarrollo del xenotrasplante en ratón a partir de IPC-366 se produce rápidamente (a las 3 semanas aproximadamente), lo que da una idea de su elevada tumorigenicidad.
El uso de estos modelos, tanto el xenotrasplante como la línea celular, permite estudiar fases tempranas de la enfermedad y, en el caso de la línea celular, permite conocer los procesos patogénicos celulares directamente; además, una línea celular es fácil de transportar y es susceptible de ser utilizada en distintos laboratorios, por lo que se pueden unificar experimentaciones y resultados.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para el estudio in vitro de IMC canino y/o IBC humano y de fármacos potencialmente utilizables frente al IBC humano que incluye la línea celular de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Curva de crecimiento de la línea celular IPC-366. Se representa el número de células (x105) frente al tiempo en días (t). Se aprecia una fase de latencia (primeras 24 horas), una fase de crecimiento exponencial (siguientes 5 días) y una fase de meseta (séptimo día).
Figura 2: Morfología de la línea celular IPC-366. A: citología teñida con Diff-Quick (x4). B y C: corte en parafina de un pellet, teñido con Hematoxilina/ Eosina (B, x10; C x40)
Figura 3: Pellet de la línea celular IPC-366, teñido con Hematoxilina/Eosina. A: morfología celular redondeada, tamaño variable. Medición mediante analizador de imágenes. La célula con la línea negra mide 26,03μιτι. B: Espacio vacío citoplasmático que confiere a la célula aspecto de célula endotelial (flecha), fenómeno que se conoce como mimetismo vascular.
Figura 4: Células multinucleadas de alta malignidad citológica. Agregado basófilo redondeado en el citoplasma (flecha). Citología de IPC-366 teñida con Diff-Quick. Figura 5: Morfología de la línea celular IPC-366 en un corte semifino teñido con azul de metileno. Marcada anisocitosis, anisocariosis, células multinucleadas y mimetismo vascular (flecha).
Figura 6: A: Células de núcleos grandes y nucléolos evidentes; mitosis. B: Célula de núcleo grande y nucléolo evidente con abundantes organelas, vacuolas y secreción proteica. C: Célula tumoral con secreción proteica. D: detalle de B. E: Célula tumoral con huecos vacíos citoplasmáticos recubiertos por membrana citoplásmica. F: Célula binucleada con hueco vacío en interior asemejándose morfológicamente a un capilar (mimetismo vascular).
Figura 7: Desarrollo de tumor 4 semanas después de ser trasplantadas las células de la línea celular IPC-366 en ratón BALB/c-SCID.
Figura 8: Xenotrasplante de IPC-366 en ratón BALB/c-SCID. Hematoxilina/ Eosina. A: tumor sólido que infiltra en dermis. B: émbolo tumoral en dermis (flecha), característica histológica del carcinoma inflamatorio mamario. C: Tumor a más aumentos (x40) mostrando las características citológicas de malignidad.
Figura 9: Xenotrasplante de IPC-366 en ratón BALB/c-SCID. Hematoxilina/ Eosina. A: Neovascularización tumoral. B: Mimetismo vascular. Nótese la diferencia entre las células que tapizan el espacio vascular en A y en B. En A los capilares están tapizados por células endoteliales normales. En B los espacios vasculares están tapizados por células tumorales de elevada malignidad.
Figura 10: Línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-citoqueratinas de amplio espectro (AE1- AE3) como marcadores de células epiteliales en general. Células positivas. A: citología. B: pellet.
Figura 11 : Línea celular IPC-366.Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-vimentina como marcador de células mesenquimatosas y células en cultivo. La mayoría de las células son positivas. A: citología. B: pellet. Figura 12: Pellet de línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-citoqueratina de células epiteliales básales (CK 14). Células positivas.
Figura 13: Línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-p63 como marcador de células mioepiteliales. Células negativas. A: citología. B: pellet.
Figura 14: Línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-actina de músculo liso como marcador de células mioepiteliales. Células negativas. A: citología. B: pellet.
Figura 15: Pellet de línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa. A: anti-receptor de estrógenos. B: anti-receptor de progesterona. C: anti-HER-2 Dako. D: anti- HER-2 P4. Células negativas.
Figura 16: Línea celular IPC-366. Técnica inmunohistoquímica de Streptavidina Biotina Peroxidasa anti-Ki-67 como marcador de proliferación celular. Numerosos núcleos positivos, es decir, alto índice de Ki-67.
Modo de realización de la invención
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
1. Cultivo primario de carcinoma inflamatorio mamario canino
La línea celular IPC-366 se consiguió a partir de muestras de un carcinoma mamario inflamatorio canino tomadas inmediatamente después del sacrificio humanitario del animal (una perra hembra de raza mestiza de 10 años de edad) para la realización del cultivo primario como se detalla a continuación. El tumor se recogió en condiciones de esterilidad y se mantuvo en una solución HBSS (Hank's Balanceó Salt Solution) + 1 % de antibiótico penicilina- streptomicina. Se lavó bien el tumor con la misma solución HBSS y se cortó en pequeños fragmentos. Para realizar la digestión de los fragmentos tumorales, se introdujeron en un tubo Falcon con colagenasa III y se dejaron en agitación continua a 37°C durante 2 horas. En ese tiempo se ayudó a la digestión del tejido realizando una disgregación mecánica con la pipeta.
Una vez realizada la digestión del tejido, se filtraron los fragmentos con un cell Strainer y se inactivo la colagenasa añadiendo medio DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Médium I mezcla de nutrientes F12) con 10% suero fetal bovino (SFB). Posteriormente, se procedió a centrifugar el contenido (1000 rpm, 2 min, 4°C).
El sedimento o pellet resultante se resuspendió en medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% SFB; 1 % de L-glutamina (Sigma); 1 % antibiótico penicilina-streptomicina. Por último, el contenido se transfirió a frascos de cultivo T-75 cm2 (en concreto, 3 frascos) los cuales se mantuvieron en estufa a 37°C con un 5% de CO2.
Cada 7 días se cambió el medio de cultivo por medio de cultivo fresco para limpiar el cultivo y nutrir a las células. Las células tardaron en adherirse 24 horas, aproximadamente. A la semana de cultivar las células, se empezó a ver proliferación celular. El progreso del cultivo se monitorizó mediante su observación al microscopio. Cuando la confluencia celular alcanzó, aproximadamente, un 75%, las células fueron despegadas con tripsina y transferidas a otro frasco de cultivo.
2. Establecimiento de la línea celular IPC-366
A partir del cultivo primario obtenido según se describe en el ejemplo 1 , se estableció la línea celular IPC-366. Tal y como se ha indicado anteriormente, cuando la confluencia celular en un frasco de cultivo, alcanzó aproximadamente un 75%, las células fueron despegadas con tripsina y transferidas a otro frasco de cultivo (esta acción es lo que se conoce como "pase"). Este hecho se repitió sucesivamente a lo largo de un año y medio. Como se ha comentado, para que una línea celular sea estable debe superar la sucesiva transferencia en nuevos frascos de cultivo. En marzo de 2014, la línea celular IPC-366, superó satisfactoriamente 50 pases, lo que indica su estabilidad y crecimiento ilimitado.
3. Criopreservación de la línea celular IPC-366
3.1. Congelación celular
Con el fin de observar si la línea celular resiste la criopreservación, a los 20 pases, se congelaron las células de 3 frascos de cultivo en crioviales de 2ml.
Para ello, se extrajo el medio de cultivo de los frascos de cultivo y se lavó con solución HBSS. Se agregaron 3 mi de Trypsin-EDTA Solution al 0,25% y se dejó incubando a 37°C entre 1 y 5 minutos. Al trasluz se puede ver que las células se han despegado, o bien, se observa en el microscopio invertido si las células se van redondeando, lo que indica que se están despegando.
Sin desechar la tripsina, se añadió la misma cantidad de medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% de SFB (3 mi) para inactivarla.
Se recogió todo el contenido del frasco de cultivo y se depositó en un tubo Falcon. Se centrifugó a 1000 rpm, 5 min a 20°C. Se quitó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 1ml de medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% SFB; 1 % de L-glutamina; 1% antibiótico penicilina-streptomicina. Se congeló un mínimo de 1x106 células para que, al descongelar, la viabilidad fuera mayor. Por lo tanto, fue necesario en cada caso el contaje de las células. En un criovial, se añadieron 0,2 mi de DMSO y 0,8 mi de SFB (de esta forma se congeló con un 10% de DMSO y un 40% de SFB).
Por último, se enfriaron las células poco a poco hasta congelarlas finalmente siguiendo los siguientes pasos. Primero se dejaron los crioviales 15-20 min en nevera. Luego, se dejaron otros 15-20 minutos en congelador a -20°C. Finalmente, se conservaron en congelador de -80°C, debidamente etiquetados. Pasada una semana, se ultracongelaron en un tanque de nitrógeno líquido.
3.2. Descongelación Celular
Transcurridas 2, 3, y 4 semanas del proceso de congelación, se procedió a descongelar los crioviales. En primer lugar se pusieron a descongelar a 37°C. Una vez descogelados, se añadió el contenido del criovial en un Falcon con 20ml de medio DMEM/F12 sin suplementar. Se centrifugó el contenido a 1000 rpm, 5 min a 20°C y se resuspendió el pellet en medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% SFB, 1% de L-glutamina, 1 % antibiótico penicilina- streptomicina. Se homogeneizó y se cultivó en un frasco de cultivo de 25 cm2 que se incubó a 37°C.
Las células, después de la crioconservación, presentaron buen crecimiento en múltiples pases conservando, a priori, las características de la línea celular y con una viabilidad di 95-99%.
4. Crecimiento de la línea IPC-366
Para saber cuál es el tipo de crecimiento de la línea celular, las células que se encontraban en el pasaje 20 (pasaje óptimo para considerar establecida la línea celular) fueron subcultivadas en placas de cultivo en una concentración de 105 células por pocilio. Se incubaron con medio DMEM/F12 suplementado con 10% SFB, 1% de L-glutamina, 1 % antibiótico penicilina-streptomicina a 37°C. Cada día, durante una semana, se contaron las células de tres pocilios usando un hemocitómetro. Se utilizó la media del contaje de cada día para, posteriormente, represetnarla y observar la evolución del crecimiento de las células en cultivo (Figura 1). Tras la fase de latencia, de adaptación de las células a las condiciones del cultivo, cuya duración fue de 24 horas, se observó que las células entraron en una fase de crecimiento exponencial donde comenzaron a proliferar masivamente. Por último, al séptimo día, las células entraron en la fase de meseta, donde las células cesan de proliferar y comienza su diferenciación. 5. Morfología celular con microscopía óptica
5.1. La observación directa de las células en cultivo mediante el microscopio invertido reveló una morfología epitelioide y marcadas diferencias de tamaño (anisocitosis).
5.2. Observación de las células en citología y en corte de parafina. Tras la separación de las células del frasco de cultivo mediante tripsinización (añadir 3ml de tripsina al frasco de cultivo e incubar 1-2 min; posteriormente, desactivar la tripsina con medio de cultivo completo), se procedió a la centrifugación de todo el contenido del frasco de cultivo (células y medio de cultivo) en una centrífuga a 1000rpm, 5 min, a 20°C; se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento con 0,5 mi de tampón (TBS, Tris Buffer Sulfate, pH=7,4). Inmediatamente después se realizaron extensiones en varios portas y se tiñeron con la técnica de Diff Quick (Figura 2A). Para aumentar el número de células observadas se procedió a la inclusión de pellets en parafina. Para la observación de células mediante cortes histológicos en parafina, fue necesaria la obtención de un número suficiente de células. A partir de 1 a 3 frascos de cultivo, y tras tripsinización, se centrifugó a 1000rpm, 5 min, a 20°C, todo el contenido de los frascos de cultivo, eliminándose el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en formol tamponado y se procedió de nuevo a su centrifugado, obteniéndose el pellet. El pellet se incluyó en parafina siguiendo procedimientos rutinarios del laboratorio de anatomía patológica y se cortaron secciones de 3-4 mieras que se tiñeron, también de forma rutinaria, con la técnica de hematoxilina-eosína. La morfología de las células en citología y cortes de parafina fue semejante (Figura 2).
Se comprobó que se trata de unas células redondeadas o poligonales de grandes a muy grandes con una alta malignidad citológica. El pleomorfismo celular y nuclear son muy marcados. Los núcleos son muy grandes y presentan evidentes y numerosos nucléolos; son frecuentes las células multinucleadas (Figuras 2, 3 y 4).
Se midieron los diámetros celulares, nucleares y nucleololares en 12 campos de un pellet, con el objetivo de 40 aumentos y mediante el analizador de imágenes Image J (Tabla 1 ), siendo el tamaño celular entre 7,35 y 583,33 μιτι, el tamaño nuclear entre 5,255 y 13,385 μιη (anisocariosis) y el tamaño de los nucléolos más evidentes entre 3,744 y 8,245 μιη. Tabla 1 : Medidas celulares
Figure imgf000014_0002
El contaje de células multinucleadas en 4 campos a 20 aumentos reveló una media de 8,72% de células multinucleadas por campo (Tabla 2). Tabla 2: Porcentaje de células multinucleadas
Figure imgf000014_0001
Las células presentan frecuentemente en el citoplasma espacios blancos "vacíos" y en ocasiones se asemejan a las células endoteliales de un capilar, fenómeno conocido como mimetismo vascular (Figura 3), y que se ha descrito en cáncer inflamatorio mamario humano y canino, así como agregados citoplasmáticos basófilos de forma redondeada más teñidos con la hematoxilina (Figura 4).
6. Morfología con microscopía electrónica
A partir de un pellet de células tripsinizadas y fijadas en glutaraldehido se siguió el método de procesado rutinario para microscopía electrónica que se lleva a cabo en el Centro Nacional de Microscopía Electrónica (UCM), donde se procesaron las muestras. La observación de cortes semifinos (1 μιτι) previos a los cortes ultrafinos permitió confirmar la morfología ya descrita: marcada anisocitosis, anisocariosis, células multinucleadas y mimetismo vascular (Figura 5). Las células son de alta malignidad, presentan una superficie cubierta por prolongaciones cortas citoplasmáticas, presentan numerosas organelas y productos de secreción, y con frecuencia se ven células con huecos vacíos citoplasmáticos pequeños y numerosos, o más grandes y en menor número, asemejándose a células endoteliales de capilares (mimetismo vascular) (Figura 6).
7. Tumorigenicidad
La línea celular IPC-366 (107 células/animal) se inoculó a dos ratones macho y dos hembras BALB/c-SCID, previamente anestesiados, en el flanco ventral derecho, a la altura de la segunda mama y de forma subcutánea. La implantación y desarrollo de la línea celular IPC-366 en los ratones demuestra su tumorigenicidad (Figura 7). A las tres semanas de la inoculación se observó por palpación la presencia de una masa tumoral, y cuatro semanas después, cuando el tumor superó los 2cm3, se procedió al sacrificio de los animales, y extracción de los tumores y sus metástasis (en pulmón e hígado). La existencia de metástasis a distancia reveló la capacidad metastásica de la línea celular en xenotrasplante. Las muestras se fijaron en formol tamponado y se incluyeron en parafina para estudio histológico. Histológicamente se observaron tumores muy infiltrantes en dermis, que en ocasiones ulceraban epidermis, formados por células agrupadas de forma sólida, con semejante morfología a la descrita en los ejemplos 5 y 6, y elevado índice mitótico. Se encontraron émbolos en los capilares de la dermis, lo que reproduce el patrón característico del cáncer inflamatorio mamario (Figura 8). Así mismo, se evidenciaron imágenes de mimetismo vascular (Figura 9).
8. Caracterización del fenotipo inmunohistoquímico de la línea celular IPC-366
Mediante técnicas inmunocitoquímicas sobre citologías fijadas en acetona y en cortes de parafina procedentes de pellets, se analizaron diversos marcadores de caracterización tumoral utilizados para identificar líneas celulares epiteliales en general y células neoplásicas mamarias en particular. Se empleó la técnica inmunocitoquímica (citologías) e inmunohistoquímica (pellets) de streptavidina biotina peroxidasa. Los resultados se recogen en la Tabla 3. Las células fueron positivas a citoqueratinas de amplio espectro (AE1/AE3), lo que indicó su origen epitelial (Figura 10), y a vimentina (marcador de células mesenquimatosas) (Figura 1 1 ), lo que es habitual en células epiteliales de alta malignidad y en células en cultivo. La mayoría expresaron CK14 (marcador de células epiteliales básales), indicando que se trataba de epiteliales básales (Figura 12). Por el contrario, las células fueron negativas a p63 (Figura 13) y actina (Figura 14), lo que indicó que no se trataba de células mioepiteliales. Los receptores hormonales receptor de estrógenos α (RE) y receptor de progesterona (RP) fueron también negativos, así como el marcador Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (C- ERBb2, también conocido como HER-2), de dos casa comerciales (Dako y Novocastra) que resultó negativo siguiendo las recomendaciones internacionales de evaluación de este marcador (ASCO: American Society of Clinical Oncology) (Figura 15). Los resultados recogidos en este ejemplo 8 indican que IPC-366 está formada por células epiteliales básales triple negativas que sobreexpresan COX-2. Según la información de que disponen los inventores, IPC-366 es la única línea celular establecida de carcinoma inflamatorio canino triple negativo.
La proliferación celular medida con Ki-67 mediante técnica inmunohistoquímica es muy alta (índice de Ki-67 de 87, 15%) (Tabla 3).
Tabla 3. Resultados de marcadores inmunohistoquímicos en pellet.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Línea celular establecida de carcinoma inflamatorio mamario (IMC) canino constituida por células básales que son negativas en cuanto a la expresión del receptor de estrógeno, el receptor de progesterona y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano.
2. Línea celular establecida, según la reivindicación 1 , caracterizada por anisocitosis, anisocariosis, células multinucleadas y mimetismo vascular.
3. Línea celular establecida de IMC canino depositada en el National Bank for Industrial Micoorganisms and Cell Cultures, de Sofía (Bulgaria), con número de acceso 8815.
4. Uso de una línea celular según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la elaboración de una composición para la obtención de xenotrasplantes estables de IMC canino en animales de experimentación.
5. Xenotrasplante estable en animales de experimentación constituido por células de IMC canino triple negativo definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. Uso de una línea celular según reivindicaciones 1-3 en el estudio del IMC canino y/o del carcinoma inflamatorio mamario humano (IBC).
7. Uso de un xenotrasplante según reivindicación 5 en el estudio del IMC canino y/o del IBC humano.
8. Uso de una línea celular según reivindicaciones 1-3 en la identificación in vitro de compuestos terapéuticamente útiles para el tratamiento de IBC humano.
9. Kit para el estudio in vitro de IMC canino y/o IBC humano y de fármacos potencialmente utilizables frente al IBC humano, que incluye una línea celular definida según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
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