WO2015169980A1 - Cepas bacterianas y sus usos en reacciones de acilación y/o desacilación - Google Patents

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Almudena ESCOBAR NIÑO
Leyre SÁNCHEZ BARRIONUEVO
David CÁNOVAS LÓPEZ
Encarnación MELLADO DURÁN
Alejandro GONZÁLEZ BENJUMEA
Oscar LÓPEZ LÓPEZ
Inés MAYA CASTILLA
José María FERNÁNDEZ-BOLAÑOS GUZMÁN
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Universidad de Sevilla
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to the microbial strains of the genera Terribacillus called Terribacillus sp. AE2B122, Bacillus, called Bacillus sp. HR21-6, Enterobacter, called Enterobacter sp. AE1 B89 and Pseudomonas, called Pseudomonas sp. AE2B120 with the ability to carry out regioselective alcoholysis and esterification reactions and their use in acylation and / or deacilation reactions, in general and more specifically, in acylation and / or deacilation reactions for the production of lipophilic carbohydrates and polyphenols of interest in the pharmaceutical and food industry.
  • the invention also relates to a method of obtaining these microbial strains capable of carrying out these reactions.
  • the invention is useful in the fields of Industrial Microbiology and Chemical Engineering, in particular, in the sector of the production of compounds of interest in the pharmaceutical and food industry.
  • Biocatalysis and particularly the use of hydrolytic enzymes such as lipases, is an alternative to conventional methods in organic synthesis and may be useful for stereo- and regioselective protections and protections in carbohydrates (Filice, M. et al. Nat. Protoc. .7, 1783-1796; 2012) and polyphenols (Torres, P. et al. J. Agrie. Food Chem. 58, 807-813; 2010). Certain carbohydrates and polyphenols are of interest in the pharmaceutical and food industry as explained below.
  • the olive contains, in addition to hydroxytyrosol, a wide variety of phenolic compounds, such as 3,4-dihydroxyphenylglycol (Brenes, MJ Agrie Food Chem 47, 3535-3540; 1999) and protocatechic alcohol (Saitta, M. et al. Food Chem 1 12, 525-532, 2009).
  • phenolic compounds such as 3,4-dihydroxyphenylglycol (Brenes, MJ Agrie Food Chem 47, 3535-3540; 1999) and protocatechic alcohol (Saitta, M. et al. Food Chem 1 12, 525-532, 2009).
  • Bouallagui et al. (Bouallagui et al., Appl Biochem Biotechnol 163, 592-599, 201 1) have described the enzymatic production of hydroxytyrosol acetate and hydroxytyrosol oleate using C. antarctic lipase (Novozym 435), obtaining compounds with optimized biological activities in terms of bioavailability and antioxidant activity.
  • Acylation catalyzed with C. antárctica B lipase takes place chemoselectively on the aliphatic chain hydroxyl versus aromatic hydroxyls (Torres de Pinedo et al., Tetrahedron 61, 7654-7660; 2005).
  • sugars partially esterified or with different functions in the different carbons constitute important "building blocks" for the synthesis of a wide variety of more complex derivatives.
  • monosaccharides and oligosaccharides with a single free hydroxyl are intermediate compounds for the synthesis of heterooligosaccharides of biomedical interest and pharmacological activity such as antitumor, anti-inflammatory, etc. (Plou et al., J Biotechnol 96, 55-66; 2002).
  • a first aspect of the present invention describes microbial strains selected from the list comprising Bacillus strain deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the CECT access number 8464, Enterobacter strain deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the access number CECT 8462, Pseudomonas strain deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the CECT access number 8463 and Terribacillus strain deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the accession number CECT 8231 that have the ability to carry out regioselective reactions of acylation (esterification) and / or deacilation (alcoholysis), preferably on polyphenols and / or carbohydrates, preferably natural , which allows obtaining a collection of acylated and / or etherified compounds of interest in different p ossifications
  • acylation esterification
  • alcoholysis preferably on polyphenols and / or carbohydrates, preferably natural
  • Another aspect described in the present invention relates to the use of bacterial strains or to the use of the enzyme extract of the invention as catalysts for the enzymatic reactions of acylation and / or deacilation of compounds, with polyphenol compounds and / or carbohydrates or their compounds being preferred. acylated derivatives.
  • Another aspect described in the present invention relates to a method for obtaining acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates by enzymatic reactions of acylation or deacylation on polyphenols and / or carbohydrates, comprising the following steps:
  • step (a) placing the enzyme extract as described in the present invention, in contact with polyphenols, carbohydrates or any of its acylated derivatives, in the presence of an acylating agent or an aliphatic alcohol to carry out enzymatic acylation or deacylation reactions, respectively; and b) purifying the acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates obtained in step (a).
  • Another aspect described in the present invention relates to the compound of the general formula
  • R 2 is an acyl group (-COR 3 ), where R 3 is a C 1 -C 20 alkyl group, or a hydrogen.
  • Another aspect described in the present invention relates to the use of the compound of general formula (I) previously described for the preparation of a medicament.
  • Another aspect described in the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula (I) as previously described together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another aspect described in the present invention refers to the use of at least one compound of general formula (I) as previously described for the preparation of a food composition.
  • Another aspect described in the present invention refers to the non-therapeutic use of at least one compound of general formula (I) as previously described, as an antioxidant, preferably food, or as a component of cosmetic compositions.
  • Another aspect described in the present invention relates to a food or cosmetic composition
  • a food or cosmetic composition comprising at least one compound of general formula (I) as previously described.
  • Another aspect described in the present invention relates to a process for obtaining the compounds of formula (I) as previously described throughout the present invention, which comprises:
  • step (b) the enzymatic reaction of the compound 3,4-dihydroxyphenyl glycol perazylated with RiOH and subsequently the reaction with methanol of the compound obtained in step (a) under basic catalysis;
  • R- is an alkyl group (CC 2 o), an alkenyl group (C 2 -C 20 ), an alkynyl group (C 2 -C 20 ), or an arylalkyl group; as defined for the substituent of the general compound of formula (I).
  • Another aspect described in the present invention relates to a compound of formula 2,3,4,6,6'-penta-0-acetyl-a, ot-D-trehalose or 2,3,4,6-tetra-0 -acetyl-a, aD-trehalose, as well as the use of said compounds as reaction intermediates for the synthesis of trehalose derivatives, as well as in the preparation of glycolipid analogs present in Mycobacterium tuberculosis.
  • Another aspect described in the present invention relates to a process for obtaining the compounds 2,3,4,6,6'-penta-0-acetyl-a, aD-trehalose or 2,3,4,6-tetra- 0-acetyl-a, a-D-trehalose comprising:
  • Figure 1 Phylogenetic relationship of Terribacillus sp. AE2B 122, Bacillus sp. HR21-6 with other Gram positive bacteria (A), and Enterobacter sp. AE1 B89 and Pseudomonas sp. AE2B120 with other phylogenetically related Gram negative bacteria (B).
  • A Gram positive bacteria
  • B Enterobacter sp. AE1 B89
  • Pseudomonas sp. AE2B120 with other phylogenetically related Gram negative bacteria
  • the Neighbor-Joining method Next to the branches is the percentage of replicas of the trees that present these taxa together in the same grouping in the bootstrap statistical test (500 replicas). Evolutionary distances have been calculated using the Maximum Composite Likelihood method, and are expressed in units of the number of base substitutions per site. The sequences comprised between 640 and 650 positions.
  • the MEGA4 program http://www.megasoftware.net/mega4/m
  • FIG. 1 H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectrum ( 1 H-NMR) (A) and extended nuclear magnetic resonance spectrum (1 H-NMR) (B) of the deacylation procedure of compound 30 (per-0-acetyl-a, aD -trehalosa) by the enzyme extract of the present invention.
  • Figure 5. Nuclear Magnetic Resonance Spectrum ( 1 H-NMR) (A) and extended nuclear magnetic resonance spectrum (1 H-NMR) (B) of the deacilation procedure of compound 34 (per-O-acetylsacarose) by extract Enzymatic of the present invention.
  • the inventors of the present invention have identified a series of microbial strains, in particular, the bacterial strains Terribacillus sp. AE2B 122, Bacillus sp. HR21 -6, Enterobacter sp. AE1 B89 and Pseudomonas sp. AE2B120 deposited in the Spanish Type Crops Collection (CECT) with registration numbers 8231 (with deposit date 20.1 1.2012), 8464, 8462, 8463 (with deposit date of October 22, 2013), respectively, which have the ability to carry out regioselective reactions of acylation (for example esterification) and / or deacilation (for example alcoholysis).
  • CECT Spanish Type Crops Collection
  • Said acylation and / or deacylation reactions are preferably carried out on polyphenols and / or natural carbohydrates, and etherification in benzyl positions of polyphenols during the alcoholysis of phenolic hydroxyl esters, which allows obtaining a collection of compounds of interest. acylated and / or etherified in different positions.
  • one aspect of the invention relates to the microbial strains of the invention, which belong to the genera Terribacillus, Bacillus, Enterobacter and Pseudomonas which, in another even more particular embodiment, are the microbial strains called Terribacillus sp. strain AE2B122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • one aspect of the invention relates to the four microbial strains, capable of carrying out acylation / deacylation reactions that are deposited in the CECT with the registration numbers CECT 8231, CECT 8464, CECT 8462 and CECT 8463
  • the preferred strains are: CECT 8464, CECT 8462 and CECT 8463.
  • the microbial strains of the invention can be grown in a liquid culture medium to obtain a supernatant which, after being subjected to concentration processes and optionally, lyophilization and / or dialysis, an extract is obtained enzymatic which, like any of the strains of the invention, can be used to carry out acylation and / or deacylation reactions, being useful in the production of the compounds of interest.
  • the microbial strains of the invention can be cultured in the presence or absence of a lipid substrate in order to obtain supernatants containing the enzymes and compounds necessary to carry out the acylation and / or deacylation reaction.
  • lipid substrate refers to a compound of a lipid nature, on which the lipases of the microbial strains will act.
  • lipid substrates include, without limitation, surfactants, triglycerides, essential oils, more particularly, tributyrin, Tween 80, Tween 20 and vegetable oils, such as olive oil and / or sunflower oil.
  • the lipid substrate is tributyrin.
  • the concentration of the lipid substrate in the culture medium can be variable, and concentrations of between 0.1-4% and even higher can be used.
  • the concentration of the lipid substrate in the culture medium is about 2% by weight with respect to the final culture.
  • the invention relates to an enzymatic extract obtainable from the culture of the microbial strains of the invention, capable of carrying out acylation and / or deacylation reactions.
  • an enzymatic extract obtainable from the culture of the microbial strains of the invention, capable of carrying out acylation and / or deacylation reactions.
  • supernatant and enzyme extract are used interchangeably.
  • the term "enzyme extract” or “supernatant” refers to the supernatant obtainable from the culture of the strains of the invention, which may optionally be subjected to concentration, lyophilization and / or dialysis procedures and comprising Enzymes that the microbial strains described in the present invention excrete into the culture medium and that have lipolytic activity and that are capable of carrying out regieoselective reactions of esterification (acylation) and / or alcoholysis (deacilation), that is, they are used as catalysts Biological
  • the enzyme extract or supernatant of the invention is, for the purposes of the present invention, an enzyme cocktail obtained from the cultures of the strains of the invention.
  • the inventors consider that, in the supernatant obtained from the cultures of the strains of the invention, in liquid medium, the enzymes necessary to carry out said acylation and / or deacilation reactions are included.
  • the enzymes that can be part of said supernatant are lipases that are enzymes that catalyze a wide range of reactions (hydrolysis, interesterifications, alcoholysis, acidolysis, esterification and aminolysis, among others), including the reactions that are detected and shown in the tests and examples described throughout the present invention.
  • the supernatant obtained by culturing the strains of the invention may contain not only the enzymes necessary to carry out acylation and / or deacilation reactions, but may also contain other types of compounds that can interact with said enzymes, decreasing or enhancing the efficiency of conversion of the substrate to the products resulting from the reactions. Therefore, it may be convenient to subject the supernatant to a concentration and dialysis process to remove those undesirable particles or compounds.
  • concentration and / or dialysis is understood as the process of separating the molecules in a solution by the difference in their diffusion rates through a semipermeable membrane.
  • a solution of several types of molecules is placed in a semipermeable dialysis bag, such as a cellulose membrane with pores, and the bag is sealed.
  • the sealed dialysis bag is placed in a container with a different solution, or pure water. Molecules small enough to pass through the pores (often water, salts and other small molecules) tend to move in or out of the dialysis bag in the direction of the lowest concentration.
  • the dialysis technique is widely known in the state of the art and its implementation is routine for the person skilled in the art.
  • the supernatant of the invention was poured into a 12 KDa dialysis bag and after being concentrated with 8 KDa polyethylene glycol, it was dialyzed with potassium phosphate buffer.
  • the enzyme extract described in the present invention obtained from the cultures of the strains of the invention, is concentrated and / or dialyzed.
  • the enzyme extract of the invention is concentrated and / or dialyzed or not, it can be subjected to a lyophilization process. Therefore, in another particular embodiment, the supernatant of the invention is lyophilized. Freeze-drying is a process in which the product is frozen and subsequently introduced into a vacuum chamber to perform water separation by sublimation. In this way the water is removed from the solid state to the gaseous environment without going through the liquid state.
  • the lyophilization technique is widely known in the state of the art and its application is routine practice for the person skilled in the art.
  • both the microbial strains of the invention are obtained, as well as the enzymatic extracts produced from their cultivation, and proven that they are capable of carrying out acylation and / or deacilation reactions, the person skilled in the art understands that both Microbial strains, such as the enzyme extracts of the invention, can be used to produce the compounds of interest indicated below.
  • the invention relates to the use of microbial strains or enzymatic extracts obtained from cultures of said strains, according to the invention, for the production of acylated derivatives, preferably the starting substrates, polyphenols and / or carbohydrates, natural or not.
  • acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates is carried out by regioselective reactions of acylation or deacylation of polyphenols and / or carbohydrates, preferably natural.
  • regioselective or “regioselectivity” refer to the preference of an esterification or hydrolysis reaction in an aliphatic hydroxyl of several possible, or an aromatic hydroxyl of several possible.
  • chemoselective or “chemoselectivity” refer to the preference of an esterification or alcoholysis reaction in an aliphatic hydroxyl (alcohol) over an aromatic hydroxyl (phenol) or vice versa.
  • the inventors have discovered new microbial strains capable of carrying out acylation and / or deacylation reactions on polyphenols and / or carbohydrates, preferably natural or not, whereby both microbial strains, such as enzymatic extracts obtained from the cultivation thereof, can be used in obtaining the compounds indicated below.
  • the invention relates to a method for obtaining acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates, preferably from polyphenols and / or natural carbohydrates, by acylation or deacylation reactions on polyphenols and / or carbohydrates, which comprises the following stages:
  • step (a) placing the enzyme extract as defined throughout the present invention, in contact with polyphenols, carbohydrates or any of its acylated derivatives, in the presence of an acylating agent or an aliphatic alcohol to carry out enzymatic reactions of acylation or deacylation , respectively and, optionally b) purify the acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates obtained in step (a).
  • the term "purify” or “purification” refers, as used in the description, to the separation of acylated derivatives of polyphenols and / or carbohydrates obtained by the method described in the invention and its concentration.
  • the separation of said compounds from the rest of the products that may accompany it and that are not of interest can be carried out by means of differential solubility techniques, chromatography, electrophoresis or isoelectric focusing. Chromatography techniques can be based on molecular weight, loading or affinity of the protein and can be performed on a column, on paper or on a plate.
  • the separation of the compounds can be carried out, for example, by fast liquid chromatography (FPLC), in an automated system that significantly reduces the purification time and increases the purification performance.
  • FPLC fast liquid chromatography
  • the microbial strains of the invention are grown in the presence or absence of a lipid substrate in order to obtain enzymatic extracts containing the enzymes and compounds necessary to carry carry out the acylation and / or deacylation reaction on the polyphenols and / or carbohydrates.
  • the bacterial strains of the invention are grown in a liquid culture medium to extract the supernatant and subsequently obtain the enzyme extracts.
  • Bacillus sp. HR21-6 Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8234) has been used as a culture medium, PYA (agar, peptone and yeast extract).
  • PYA agar, peptone and yeast extract
  • Enterobacter sp. AE1 B89 CECT 8232
  • Pseudomonas sp. AE2B120 CECT 8233
  • LB Lia-Bertani
  • the liquid culture can be supplemented with a lipid substrate to increase the secretion of the enzymes present in the enzyme extract of the invention, secreted by the strains of the invention and which are responsible for carrying out the acylation / deacylation reactions.
  • a lipid substrate to increase the secretion of the enzymes present in the enzyme extract of the invention, secreted by the strains of the invention and which are responsible for carrying out the acylation / deacylation reactions. about polyphenols and / or carbohydrates.
  • said enzymes are considered to be, preferably, lipases.
  • the culture medium may be supplemented with a lipid substrate, according to as previously described in the present description of the invention.
  • the cultures are carried out at a temperature between 22 ° C and 37 ° C, with stirring for 2-3 days. After these days, the supernatant which, as mentioned above, will contain the enzymes, preferably lipases, responsible for carrying out the reactions described in the present invention.
  • the supernatant resulting from the cultures can be isolated by routine techniques for the person skilled in the art. For example, after the incubation period has elapsed, the culture can be allowed to stand so that the cells decant or can be subjected to centrifugation, thus achieving both ways to separate the cells from the culture medium. liquid. Subsequently, the supernatant can be obtained, for example by aspiration with a pipette.
  • step (a) Once the enzyme extract is obtained, it is contacted with the compounds that are to be subjected to the acylation / deacylation reactions [step (a)]. Suitable conditions for carrying out these reactions are explained in detail in each of the examples contained in the present invention.
  • the starting compounds are preferably polyphenols or carbohydrates.
  • the phenolic type substrates of step a) of the method of the invention are preferably selected from any of the following: hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenyl glycol, protocatecholic alcohol and acetylated derivatives thereof, preferably: triacetylated hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenylglocol tetraacylated and peracylated protocatecholic alcohol.
  • the carbohydrate-type substrates of step a) of the method of the invention are selected from mono-, di-, oligo-, polysaccharides or any of their added derivatives, preferably: methyl ⁇ -D-glucopyranoside per -O-acetylated, octaacetylated trehalose and octaacetylated sucrose.
  • acetylated derivatives refers to phenolic compounds or carbohydrates with at least one -OH group substituted by a -OCOCH 3 group.
  • supernatants obtained at a stage prior to step a) of the method of the invention may be concentrated and / or dialyzed, as previously explained, or may be used as such.
  • the method of obtaining additives derived from polyphenols and / or carbohydrates of the invention comprises between steps (a) and (b), an optional step directed to the concentration and / or dialysis of the supernatants as well as to its subsequent lyophilization. Concentration, dialysis and lyophilization techniques are described in detail in Example 2.
  • the enzymatic reaction is deacylating
  • the polyphenol of step (a) is an acetylated derivative of hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenylglycol or protocatecholic alcohol, preferably triacetylated hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenylglocol tetraacetyl or peracylated protocatecholic alcohol, and the reaction is carried out in the presence of an aliphatic alcohol.
  • aliphatic alcohol in the present invention is meant a linear (branched or branched) alkyl group (C ⁇ C 7 ), with at least one -OH radical, for example, but not limited to methanol, ethanol, propanol, butanol, between others.
  • the aliphatic alcohol is methanol (MeOH).
  • the aliphatic alcohol may be optionally deuterated at room temperature (approx. 18-30 ° C).
  • the enzymatic reaction is deacylation
  • the polyphenol of step (a) is a triacetylated hydroxytyrosol and the reaction is carried out in the presence of methanol.
  • the enzymatic reaction is of deacylation of the aromatic hydroxyls
  • the polyphenol of step (a) is 3,4-dihydroxyphenyl glycol tetraacylated or peracylated protocatechogric alcohol and the reaction is carried out in the presence of an aliphatic alcohol to produce the etherification in the benzyl position.
  • the enzymatic reaction is acylation
  • the polyphenol in step (a) is hydroxytyrosol, 3,4-dihydroxyphenyl glycol or protocatecholic alcohol and the reaction is carried out in the presence of an acylating group and optionally a co-solvent.
  • acylating group is meant a reagent capable of reacting with a compound by adding an acyl group to its structure, for example, the acylating group may be without being limited to isopropenyl acetate or vinyl acetate, which in turn act as solvent
  • the acylation reaction can be done in the absence or presence of an adsorbent of the culture supernatant of the strains of the invention, such as celite. Better results are obtained with the enzyme extract supported on celite. If the phenolic compound used is poorly soluble in the acylating agent, a co-solvent can be used, for example DMF (A, A-dimethyl formamide).
  • the enzymatic reaction is deacylation
  • the carbohydrate of step (a) is methyl ⁇ -D-glucopyranoside per-O-acetylated, per-0-acetyl-a, aD-trehalose, per-O-acetyl.
  • the enzymatic reaction is from per-0-acetyl- ⁇ , d-trehalose with methanol or deuterated methanol at a temperature between 16-28 ° C, the compounds being obtained 2,3,4,6,6 '-penta-0-acetyl-a, aD-trehalose or 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a, d-trehalose or the enzymatic reaction of per-O-acetyl-sucrose with methanol or deuterated methanol at a temperature between 16-28 ° C, obtaining the compounds 2,3,4,6, 1 ', 6'-hexa-0-acetyl-sucrose or 2,3,4,6,6'-penta-0 -acetyl-sucrose.
  • the enzymatic reaction is acylation
  • the carbohydrate of step (a) is methyl ⁇ -D-glucopyranoside and the reaction is carried out in the presence of isopropenyl acetate and DMF at a temperature between 50-70 ° C.
  • Another aspect of the present invention describes a compound of general formula (I)
  • (l) where: it is an alkyl group ((C 2 0), an alkenyl group (C 2 -C 2 o), an alkynyl group (C 2 -C 2 o), or an arylalkyl group; and
  • R 2 is an acyl group (-COR 3 , where R 3 is a Ci-C 20 alkyl group) or a hydrogen.
  • alkyl refers in the present invention to an aliphatic chain, linear or branched, having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms and more preferably 1 to 5 carbon atoms, for example , methyl, ethyl, n-propyl, / - propyl, n-butyl, / -butyl, n-pentyl, among others.
  • alkenyl in the present invention refers to a carbon chain, linear or branched, which has at least one double bond and contains between 2 and 20 carbon atoms, preferably between 2 and 10 carbon atoms and more preferably from 2 to 5 carbon atoms
  • alkynyl refers in the present invention to a carbon chain, linear or branched, which has at least one triple bond and contains between 2 and 20 carbon atoms, preferably between 2 and 10 carbon atoms and more preferably from 2 to 5 carbon atoms
  • arylalkyl is meant in the present invention an aryl group attached to the rest of the molecule by an alkyl group (CC 20 ), as defined above.
  • alkyl group CC 20
  • a non-limiting example of arylalkyl is a benzyl group.
  • the compound of general formula (I) of the present invention is characterized in that R 2 is an acetyl group (-COCH 3 ).
  • the compound of general formula (I) of the present invention is characterized in that R 2 is a hydrogen.
  • the compounds of general formula (I) are selected from the list comprising: 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-methoxyethyl acetate, 2- (3,4-dihydroxyphenyl) acetate - 2-ethoxyethyl, 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-propoxyethyl acetate, and 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-butoxyethyl acetate.
  • the compounds of general formula (I) are selected from the list comprising: 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-methoxyethanol, 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-ethoxyethanol, 2 - (3,4-dihydroxyphenyl) -2-propoxyethanol and 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -2-butoxyethanol.
  • the present invention also describes the process for obtaining the compounds of formula (I) described above, comprising:
  • step (a) the enzymatic reaction of the peracylated 3,4-dihydroxyphenyl glycol compound with b. the enzymatic reaction of the compound 3,4-dihydroxyphenylglycol perazylated with F ⁇ OH and subsequently the reaction of the compound obtained in step (a) by basic catalysis, preferably with Cs 2 C0 3 , in methanol;
  • R is an alkyl group (CC 2 o), an alkenyl group (C 2 -C 20 ), an alkynyl group (C 2 -C 2 o), or an arylalkyl group.
  • the process described above is characterized in that the enzymatic reaction is carried out in the presence of the enzyme extract described in the present invention.
  • the present invention also relates to the use of at least one compound of general formula (I), as previously described, for the preparation of a medicament or a cosmetic composition or a food composition, where the food composition is selected from between a food, nutritional supplement, functional or nutraceutical food.
  • the term “medicament” refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • pharmaceutical composition as defined in the present invention refers to a set of components that are formed by at least one product of general formula (I) as described in the present invention, in any concentration, which has at least one application in the improvement of the physical or physiological or psychological well-being of a subject, which implies an improvement of the general state of his health.
  • Said compositions further comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may comprise a "vehicle” or carrier, which is preferably an inert substance.
  • vehicle preferably an inert substance.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the compounds and compositions of the present invention can be used together with other medicaments in combination therapies.
  • the other drugs may be part of the same composition or of a different composition, for administration at the same time or at different times.
  • compositions or “cosmetic” refers to those preparations consisting of natural or synthetic substances or mixtures thereof, for external use in the various parts of the human body.
  • the term "food composition” refers to that food that, regardless of providing nutrients to the subject who takes it, beneficially affects one or more functions of the organism, so that it provides a better state of health and wellness. As a consequence, said composition may be intended for the prevention and / or treatment of a disease or the causative factor of a disease. Therefore, the term “food composition” of the present invention can be used as a synonym for functional food or food for specific nutritional purposes or medicinal food.
  • the term “food composition” is, or is part of a food, functional, nutraceutical or food supplement.
  • nutraceutical as used in the present invention refers to substances isolated from a food and used in a dosage form that have a beneficial effect on health.
  • supply synonymous with any of the terms “dietary supplement”, “nutritional supplement” or “food supplement” is a “food ingredient” intended to supplement the diet.
  • the present invention also relates to the non-therapeutic use of at least one compound of general formula (I), as previously described, as an antioxidant, preferably as a food antioxidant.
  • antioxidant is meant a composition capable of retarding or preventing the oxidation of other molecules.
  • Another object described in the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula (I), as previously described, together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another object described in the present invention relates to a food or cosmetic composition
  • a food or cosmetic composition comprising at least one compound of general formula (I), as previously described.
  • acylated carbohydrate derivatives preferably compounds of formula 2,3,4,6,6'-penta-0-acetyl- ⁇ , ⁇ -D-trehalose or 2,3 , 4,6-tetra-0-acetyl-a, aD-trehalose.
  • Another aspect described in the present invention relates to the use of said acylated carbohydrate derivatives previously described as reaction intermediates for the synthesis of trehalose derivatives or for the elaboration of glycolipid analogs present in Mycobacterium tuberculosis.
  • Another aspect described in the present invention relates to the method of obtaining the glycolipid analogs present in Mycobacterium tuberculosis comprising: to. the enzymatic reaction of per-0-acetyl-a, aD-trehalose with methanol or deuterated methanol at a temperature between 16-28 ° C.
  • said process is carried out in the presence of an enzyme extract as defined in the present invention.
  • Example 1 Phylogenetic analysis of Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
  • the phylogenetic study was carried out by sequence analysis of the ribosomal ribonucleic acid (rRNA) 16S gene.
  • the 16S rRNA gene of each of the strains of the invention was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primers 16F27, whose sequence is 5 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 1), and 16R1 88, with the sequence 5'-CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3 '(SEQ ID NO: 2) (Moreno ML, et al. FEMS Microbio! Ecol, 2009; 68, 59-71.).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR reaction conditions were as follows: a cycle of 95 ° C for 5 minutes, 25 cycles of 94 ° C for 1 minutes, 50 ° C for 1 minutes and 72 ° C for 2 minutes, and then a step of 10 minute extension at 72 ° C.
  • the amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the amplified DNA is sequenced by the Sanger method.
  • AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus, as Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464), Enterobacter, as Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas as Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
  • the MEGA4 program package was used. First, a multiple alignment was performed, using Clustal W, of the 650 bp sequences (corresponding to the fragment between positions 53 to 703 ( Figure 1A) and between positions 80 to 730 ( Figure 1 B) of Escherichia coli 16S rRNA) ) of the strains and sequences of greater identity obtained with BlastN. Finally the trees were built using several methods, obtaining similar results with all of them. Trees constructed by the Neighbor-Joining method are shown in the present invention ( Figure 1).
  • Example 2 Preparation of the supernatants of the Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
  • Bacillus sp. HR21 -6 (CECT8464) was grown in LB medium overnight. The next day, said culture was used to inoculate PYA medium. After growing the culture in PYA medium, the supernatant was collected. Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463) were grown in LB medium overnight. The next day, said culture was used to inoculate LB + tributyrin (TRI) medium 2%. After growing the culture in LB + 2% TRI medium, the supernatant was collected.
  • TRI tributyrin
  • Each of the supernatants was poured into a 12 KDa dialysis bag (SIGMA, D-9527).
  • the dialysis bags were left overnight at 4 ° C covered in 8 KDa polyethylene glycol and when the dialysis bags were completely dry, the exterior was cleaned with distilled water and dialyzed with 0.05M potassium phosphate buffer pH 7.8 at 4 ° C and magnetic stirring. These dialysates were frozen at -80 ° C.
  • Such supernatants can be lyophilized in order to prevent hydrolysis reactions from occurring.
  • lyophilizing the supernatant helps to concentrate and preserve the enzyme of the microbial strain, and also to be stored.
  • Example 3 Preparation of lipophilic polyphenols. Acylation / deactivation reactions catalyzed by the supernatants / enzymatic extracts of the strains of Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) and Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
  • the radical R 1 of the aliphatic alcohol of type R 1 OH is preferably selected from any of the following: -CH 3 (methyl), -C 2 H 5 (ethyl), -C 3 H 7 (propyl) or -C 4 H 9 (butyl).
  • compounds 4a, 4b, 4c or 4d are obtained (Scheme 2).
  • Reaction times range from 24 h for obtaining compound 4a to 6 days for obtaining compound 4d.
  • the acetyl group of compound 4 can be removed by an alcoholysis (deacylation) with basic catalysis, using as catalyst any basic catalyst, preferably Cs 2 C0 3 in methanol.
  • compounds 4a-4d by a deacetylation reaction give rise to compounds 5a-5d with yields of 31-62% (Scheme 2).
  • Example 3.2 Acylation reaction of phenolic compounds by enzymatic catalysis to obtain lipophilic polyphenols.
  • Said polyphenols are compound 8 (hydroxytyrosol), compound 14 (3,4-dihydroxyphenyl glycol) and compound 20 (protocatechic alcohol).
  • the acylating agent used is isopropenyl acetate, which in turn acts as a solvent for polyphenol and its derivatives. Acylation can be done in the absence or presence of an adsorbent of the culture supernatant of the strains of the invention, such as celite. Better results are obtained with the enzyme extract supported on celite. If the phenolic compound used is poorly soluble in the acylating agent, DMF (A / JV-dimethyl formamide) can be used as a co-solvent. The acylation result is quantified by 1 H-NMR after removal of the supernatant or enzyme extract containing the enzymes responsible for carrying out the acylation reaction.
  • the major product obtained from the acylation (esterification) reaction of the polyphenol hydroxytyrosol (compound 8) after 24 h (Table 1) is compound 9 which is monoacylated derivative in position 4 of the aromatic ring.
  • Compound 9 and its regioisomer in the position 3 (compound 10) are formed in the ratio of 2: 1.
  • three other compounds that are the diacylated derivatives 11, 12 and 13 are detected in smaller quantities.
  • the degree of conversion ranges from 88 to 96%.
  • the results contrast with the regioselectivity that is obtained with the lipase from C. antárctica, which leads exclusively to the regioisomer compound 2, acylated in the side chain.
  • the acylation (esterification) reaction of compound 20: protocatechic alcohol after 24 h leads to a mixture of mono, di and triacylated derivatives.
  • the ratio of monoacylated derivatives in position 4, 3 and side chain is sensitive to the enzyme extract used; thus, the proportions are 1: 1: 1 for the culture supernatant of Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), 1: 2: 2 for the culture supernatant of Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462), 1: 3.5: 1 for the culture supernatant of Pseudomonas sp.
  • 3,4-Dihydroxyphenyl glycol (50 mg) is dissolved in a mixture of DMF / isopropenyl acetate 1: 1 (6.0 ml) and the corresponding enzyme extract obtained from the cultures of the strains of the invention (50 mg) is added. Stir at 40 ° C and in darkness 24 hours. The solvent is removed and the resulting residue is redissolved in dry acetone and filtered. Finally, it is concentrated to dryness. The result of the acylation is analyzed by H-NMR (See Table 1)
  • the results obtained in the anti-radical activity test against DPPH for compounds 4a-4d, 5a-5d, 2 and 14. are represented below.
  • the anti-radical activity expressed as EC50 against DPPH represents the amount of antioxidant needed to decrease the DPPH concentration to 50%.
  • the Sánchez-Moreno method (Sánchez-Moreno, C. et al. J. Sci. Food Agrie. 1998, 76, 270-276) was used with the modifications of Jiménez et al. J. Agrie. And Food Chem. 2005, 53, 5212-5217).
  • Example 5 Preparation of partially added carbohydrates. Acylation / deaciation reactions of carbohydrates catalyzed by enzymatic extracts obtained from cultures of Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacilius sp. HR21-6 (CECT 8464), Enierobacter sp. AE1B89 (CECT 8462).
  • the reaction medium consists of a suspension of compound 27 and the corresponding enzyme extract or lipase, in methanol or in deuterated methanol (CD 3 OD).
  • the culture supernatants of the strains described in the present invention also allow partial deacetylation of compound 30 (octaacetylated trehalose), using the same conditions as in the case of monosaccharide 27 (Scheme 6).
  • compound 32 is the result of a deimetrization in only two stages (acetylation and selective deacetylation) of trehalose.
  • Deimetrization is the process by which the per-O-acetylated trehalose 30 loses its original symmetry and becomes 31 and 32, where one unit of sugar is acetylated and the other totally or partially deacetylated. This process has been achieved in two stages (acetylation of commercial trehalose and regioselective deacetylation with the enzyme extract of the invention and represents a number of 2015/000062
  • compounds 31 and 32 can be used as raw materials in the preparation of trehalose derived glycolipids, which are of interest as vaccines against tuberculosis, caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis (M. Gilleron et al. J. Exp. Med 2004, 199, 649-659).
  • Method A A suspension of per-0-acetyl-a, aD-trehalose (compound 30) (6.0 mg, 8.8 ⁇ ) and of the culture supernatant of the strains of the corresponding invention (3.0 mg) in CD 3 OD (1.0 mL) is stirred at room temperature for the time indicated in each case.
  • the 1 H-NMR spectrum of the reaction mixture [ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD)] is shown in Figure 4; The results are shown in Table 3.
  • Method B A suspension of per-O-acetyl-aa-D-trehalose 30 (60.0 mg, 88.0 ⁇ ) and the culture supernatant of the bacterial strain Bacillus sp. HR21 -6 CECT 8464 (30.0 mg) in MeOH (20 mL) is stirred at room temperature for 3.5 h. It is then purified by column chromatography (CH 2 CI 2 ⁇ CH 2 CI 2 -MeOH 1: 2) to give 31 and 32 as syrups.
  • Method A A suspension of per-O-acetylsacarose (compound 34) (6.0 mg, 8.8 ⁇ ) and the culture supernatant of the corresponding invention strains (3.0 mg) in CD 3 OD (1.0 ml) is stirred at room temperature for the time indicated in each case.
  • the 1 H-NMR spectrum of the reaction mixture [H-NMR (500 MHz, CD 3 OD)] is shown in Figure 5; The results are shown in Table 4.
  • Method B A suspension of per-O-acetylsacarose (compound 34) (50.0 mg, 74 ⁇ ) and the culture supernatant of the strain Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (25.0 mg) in MeOH (16.0 ml_) is stirred at room temperature for 4h. It is then purified by column chromatography (CH 2 CI 2 ⁇ CH 2 CI 2 -MeOH 1: 2) to give compound 35 (1 1.2 mg, 26%) and compound 36 (10.9 mg, 27%) As sirupos.
  • acylation preferably acetylation of compound 29 (methyl aD-glucopyranoside) using isopropenyl acetate as acylating agent, Bacillus stratosphericus enzyme extract as enzyme catalyst and DMF as co-solvent (Scheme 8), has resulted in obtaining compounds 37 and 28, which have acyl groups in positions 4 and 6, respectively.

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Abstract

La presente invención describe cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en la producción de carbohidratos y polifenoles lipófilos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención divulga el método de obtención de las cepas microbianas y el método de obtención de los carbohidratos y polifenoles lipofílicos.

Description

CEPAS BACTERIANAS Y SUS USOS EN REACCIONES DE ACILACIÓN Y/O
DESACILACIÓN
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a las cepas microbianas de los géneros Terribacillus denominada Terribacillus sp. AE2B122, Bacillus, denominada Bacillus sp. HR21-6, Enterobacter, denominada Enterobacter sp. AE1 B89 y Pseudomonas, denominada Pseudomonas sp. AE2B120 con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en reacciones de acilación y/o desacilación, en general y más específicamente, en reacciones de acilación y/o desacilación para la producción de carbohidratos y polifenoles lipófilos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención también se refiere a un método para obtener estas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo estas reacciones. Así como la obtención de regioisómeros de los azúcares y polifenoles parcialmente adiados. Por lo tanto, la invención es de utilidad en los campos de la Microbiología Industrial e Ingeniería Química, en particular, en el sector de la producción de compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La protección y desprotección quimio-, regio- y estereoselectiva constituye una de las estrategias más utilizadas en síntesis orgánica, especialmente valiosa en la síntesis de moléculas complejas y polifuncionales, entre las que se encuentran los carbohidratos y los polifenoles. Aunque son muchos los avances que se han conseguido en este campo en las últimas décadas, aún se está muy lejos de alcanzar la perfección de las reacciones naturales, por lo que este aspecto sigue siendo hoy en día uno de los grandes retos en síntesis orgánica.
La biocatálisis, y particularmente el uso de enzimas hidrolíticas como las lipasas, constituye una alternativa a los métodos convencionales en síntesis orgánica y puede ser útil para realizar protecciones y desprotecciones estéreo- y regioselectivas en carbohidratos (Filice, M. et al. Nat. Protoc. 7, 1783-1796; 2012) y polifenoles (Torres, P. et al. J. Agrie. Food Chem. 58, 807-813; 2010). Determinados carbohidratos y polifenoles son de interés en la industria farmacéutica y alimentaria como se explica a continuación. Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto los efectos beneficiosos para la salud que se derivan del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, ya que previenen el desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas, incluidas enfermedades cardiovasculares y cáncer (Grez et al., Curr Opin Pharmacol 104, 362-368; 2010). Dichos compuestos evitan los daños producidos por el estrés oxidativo en ciertas biomoléculas (ADN, lípidos, proteínas), que se encuentran asociados con un incremento en el riesgo de problemas cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades crónicas (Cilla et al., Ann Nutr Metab 54, 35-42; 2009).
Algunos estudios demuestran que los compuestos polifenólicos naturales son, in vitro, más efectivos como antioxidantes que la vitamina A o C (Miller et al., J Nutr Environ Med 12, 39-51 ; 2002), por lo que existe un creciente interés de este tipo de compuestos, en especial aquellos que pueden ser obtenidos a partir de subproductos generados en la industria alimentaria. En este contexto, destaca el hidroxitirosol, que predomina en el olivo (Olea europea), tanto en las hojas como en su fruto, ya sea libre o en forma de derivado, y que es un compuesto fenólico de una reconocida eficacia como antioxidante (Fernández-Bolaños et al., Curr Org Chem 12, 442-463; 2008).
En los últimos años, se ha comprobado que este antioxidante natural posee además importantes propiedades biológicas: antiagregante plaquetario (González Correa et al. Br J Nutr, 101 , 1 157-1 164, 2009), antiinflamatorio (Gong et al., Phytother Res 23, 646-650, 2009), cardioprotector (Poudyal, H.J. Nutrition 140, 946-953; 2010), antimicrobiano (Medina et al. J Agrie Food Chem 55, 9817-9823; 2007), y anti-VIH (Lee-Huang et al., Biochem Biophys Res Commun 354, 872-878; 2007). Actualmente, son numerosas las investigaciones que intentan demostrar el beneficio de este compuesto en el tratamiento de ciertas enfermedades neurodegenerativas (Schaffer et al., J Agrie Food Chem 55, 5043-5049, 2007), y de la piel (Guo et al,. Phytother Res 24, 352-359; 2010), en la prevención del ictus cerebral isquémico y en la prevención y tratamiento del cáncer (Sirianni et al., Mol Nutr Food Res 54, 833-840, 2010).
La aceituna contiene, además de hidroxitirosol, una amplia variedad de compuestos fenólicos, tales como el 3,4-dihidroxifenilglicol (Brenes, M.J. Agrie Food Chem 47, 3535- 3540; 1999) y el alcohol protocatecuico (Saitta, M. et al. Food Chem 1 12, 525-532, 2009).
Figure imgf000005_0001
Hidroxitirosol 3,4-Dihidroxifenilglicol Alcohol protocatecuico
Diversos estudios sobre los compuestos fenólicos del olivo muestran la importancia de los acil derivados en la cadena lateral de estos compuestos polifenólicos naturales, ya que el carácter lipófilo permite su dispersión en aceite, el atravesar membranas celulares y la captación por las células, y la protección de constituyentes de membrana y de LDL (Gupta et al., Adv. Food Nutr. Res. 69, 183-217; 2013). Es decir, se mejoran las propiedades físico-químicas y se conservan las propiedades antioxidantes. Por lo tanto, es de gran interés para la industria alimentaria la obtención de nuevos antioxidantes lipofílicos mediante modificación de polifenoles naturales. Estos análogos estructurales lipófilos tienen una mejor biodisponibilidad, son más eficaces que los polifenoles naturales utilizados como material de partida, y son útiles en la formulación de "alimentos funcionales" que presentan efectos beneficiosos para la salud.
Bouallagui y colaboradores (Bouallagui et al., Appl Biochem Biotechnol 163, 592-599, 201 1) han descrito la producción enzimática de hidroxitirosol acetato e hidroxitirosol oleato usando la lipasa de C. antárctica (Novozym 435), obteniendo compuestos con actividades biológicas optimizadas en cuanto a la biodisponibilidad y actividad antioxidante. La acilación catalizada con lipasa de C. antárctica B tiene lugar quimioselectivamente sobre el hidroxilo de la cadena alifática frente a los hidroxilos aromáticos (Torres de Pinedo et al., Tetrahedron 61 , 7654-7660; 2005).
Por otra parte, azúcares esterificados parcialmente o con diferentes funciones en los distintos carbonos, constituyen importantes "building blocks" para la síntesis de una amplia variedad de derivados más complejos. Así por ejemplo, los monosacáridos y oligosacáridos con un único hidroxilo libre son compuestos intermedios para la síntesis de heterooligosacáridos de interés biomédico y actividad farmacológica como antitumorales, antiinflamatorios, etc. (Plou et al., J Biotechnol 96, 55-66; 2002). Desafortunadamente, el elevado número de grupos hidroxilo en los azúcares y su similar reactividad hace que en muchos casos no sea posible introducir regioselectivamente determinadas funciones, o requiera recurrir a una larga y costosa secuencia de síntesis, para llevar a cabo transformaciones en solo alguno de los grupos hidroxilo.
A pesar del interés de las reacciones de carbohidratos biocatalizadas con lipasas, los antecedentes de casos de protección o desprotección regioselectiva de monosacáridos en posiciones distintas a C-1 y C-6 son muy escasos. Asimismo, son también muy pocos los ejemplos en los que se describen reacciones de protección/desprotección regioselectiva en uno de los dos carbonos primarios (C-6 y C-6') de disacáridos de hexosas.
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de encontrar nuevas enzimas capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación regioselectivas con la finalidad de obtener nuevos compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Para superar los problemas existentes en el estado de la técnica mencionados previamente, un primer aspecto de la presente invención describe cepas microbianas seleccionada de la lista que comprende cepa de Bacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8464, cepa de Enterobacter depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8462, cepa de Pseudomonas depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8463 y cepa de Terribacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8231 que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (esterificación) y/o desacilación (alcoholisis), preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación. Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de cualquiera de las cepas bacterianas descritas en la presente invención.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de las cepas bacterianas o al uso del extracto enzimático de la invención como catalizadores para las reacciones enzimáticas de acilación y/o desacilación de compuestos, siendo preferidos los compuestos polifenoles y/o carbohidratos o sus derivados acilados.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un método para obtener derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:
a) poner el extracto enzimático según se describe en la presente invención, en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente; y b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a).
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al compuesto de fórmula general
(
Figure imgf000007_0001
(I) donde: es un grupo alquilo (C C20), un grupo alquenilo (C2-C2o), un grupo alquinilo (C2-C20), o un grupo arilalquilo; y
R2 es un grupo acilo (-COR3), donde R3 es un grupo alquilo C1-C20, o un hidrógeno.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) descrito previamente para la elaboración de un medicamento. Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito previamente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso de al menos un compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito previamente para la elaboración de una composición alimenticia.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferiblemente alimentario, o como componente de composiciones cosméticas.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (I) según se ha descrito previamente a lo largo de la presente invención, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con
Figure imgf000008_0001
b. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con RiOH y posteriormente la reacción con metanol del compuesto obtenido en el paso (a) bajo catálisis básica;
donde R-, es un grupo alquilo (C C2o), un grupo alquenilo (C2-C20), un grupo alquinilo (C2-C20), o un grupo arilalquilo; según se ha definido para el sustituyente del compuesto general de fórmula (I).
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 2,3,4,6,6'-penta-0-acetil-a,ot-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-0-acetil-a,a-D-trehalosa, así como al uso de dichos compuestos como intermediarios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa, así como en la preparación de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis. Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos 2,3,4,6,6'-penta-0-acetil-a,a-D-trehalosa o 2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a,a- D-trehalosa que comprende:
a. la reacción enzimática de per-0-acetil-a,a-D-trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Relación filogenética de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122, Bacillus sp. HR21-6 con otras bacterias Gram positivas (A), y las cepas Enterobacter sp. AE1 B89 y Pseudomonas sp. AE2B120 con otras bacterias Gram negativas (B) filogenéticamente relacionadas. Para su realización se ha utilizado el método de Neighbor-Joining. Junto a las ramas se muestra el porcentaje de réplicas de los árboles que presentan esos taxones juntos en un mismo agrupamiento en el test estadístico bootstrap (500 réplicas). Las distancias evolutivas se han calculado con el método Máximum Composite Likelihood, y se expresa en unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Las secuencias comprendían entre 640 y 650 posiciones. Para los análisis filogenéticos se ha usado el programa MEGA4 (http://www.megasoftware.net/mega4/mega.html).
Figura 2. Se representa la actividad antirradicalaria (captación de radicales libres mediante donación de átomos de hidrógeno) frente al radical libre DPPH (2,2-difenil-1 - picrilhidracilo) expresada en valores de EC50 (μΜ) del acetato de hidroxitirosilo 2, de los éteres fenólicos 4a -4d, 5a-5d, y del 3,4-dihidroxifenilglicol 14.
Figura 3. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear (1H-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 27 (metil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranósido) mediante el extracto enzimático de la invención.
Figura 4. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear (1H-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 30 (per-0-acetil-a,a-D-trehalosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención. Figura 5. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear (1H-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 34 (per-O-acetilsacarosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han identificado una serie de cepas microbianas, en particular, las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE2B 122, Bacillus sp. HR21 -6, Enterobacter sp. AE1 B89 y Pseudomonas sp. AE2B120 depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con los números de registro 8231 (con fecha de depósito 20.1 1.2012), 8464, 8462, 8463 (con fecha de depósito de 22 de Octubre de 2013), respectivamente, que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (por ejemplo esterificación) y/o desacilación (por ejemplo alcoholisis). Dichas reacciones de acilación y/o desacilación se llevan a cabo preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos naturales, y de eterificación en posiciones bencílicas de polifenoles durante la alcoholisis de ésteres de hidroxilos fenólicos, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.
Cepas microbianas de la invención y sus usos
Mediante métodos de screening sobre muestras obtenidas de diferentes lugares de procedencia, como por ejemplo almazaras, industrias de conservas de pescado, etc, se han seleccionado una serie de cepas microbianas con actividad lipolítica y capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación), en particular sobre carbohidratos y/o polifenoles, preferentemente naturales.
Estas cepas microbianas fueron sometidas a un análisis filogenético mediante el análisis de la secuencia del gen 16S ARNr. De este análisis se identificaron las cepas con las que mayor valor de identidad presentaban las cepas microbianas de la invención, siendo Terribacillus goriensis CL-GR16 (número de acceso a GeneBank: NR_043895), Bacillus stratosphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336), Enterobacter ludwigii EN-1 19 (número de acceso a GeneBank AJ853891 ) y Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a las cepas microbianas de la invención, que pertenecen a los géneros Terribacillus, Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas que, en otra realización todavía más particular, son las cepas microbianas denominadas Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CECT 8231 ), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Las cepas microbianas de la invención fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) [Pare Científic Universitat de Valencia, calle Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia)] el 20 de Noviembre de 2012 (CECT 8231 ), y el 22 de Octubre de 2013 (CECT 8464, CECT 8462 y CECT 8463).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se relaciona con las cuatro cepas microbianas, con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación / desacilación que están depositadas en la CECT con los números de registro CECT 8231 , CECT 8464, CECT 8462 y CECT 8463. En una realización particular, las cepas preferidas son: CECT 8464, CECT 8462 y CECT 8463.
Como entiende el experto en la materia, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en un medio de cultivo líquido para obtener un sobrenadante que, después de ser sometido a procesos de concentración y opcionalmente, liofilización y/o dialización, se obtiene un extracto enzimático que, al igual que cualquiera de las cepas de la invención, puede usarse para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, siendo útil en la producción de los compuestos de interés.
Además, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener sobrenadantes que contendrán las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación.
A efectos de la presente invención, el término "sustrato lipídico" se refiere a un compuesto de naturaleza lipídica, sobre el cual actuarán las lipasas de las cepas microbianas. Ejemplos de sustratos lipidíeos incluyen, sin limitar a, surfactantes, triglicéridos, aceites esenciales, más particularmente, tributirina, Tween 80, Tween 20 y aceites vegetales, tales como aceite de oliva y/o aceite de girasol. En una realización particular, el sustrato lipídico es tributirina. La concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo puede ser variable, pudiendo emplearse concentraciones de entre 0,1 - 4%, e incluso mayores. Preferiblemente, la concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo es de alrededor del 2% en peso con respecto al cultivo final.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de las cepas microbianas de la invención, capaz de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación. A efectos de la presente invención los términos sobrenadante y extracto enzimático se utilizan indistintamente.
A efectos de la presente invención, el término "extracto enzimático" o "sobrenadante" se refiere al sobrenadante obtenible del cultivo de las cepas de la invención, que opcionalmente puede ser sometido a procedimientos de concentración, liofilización y/o dialización y que comprende las enzimas que las cepas microbianas descritas en la presente invención excretan al medio de cultivo y que presentan actividad lipolítica y que son capaces de llevar a cabo reacciones regíoselecti as de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación), es decir se utilizan como catalizadores biológicos. El extracto enzimático o sobrenadante de la invención es, a efectos de la presente invención, un cóctel enzimático obtenido de los cultivos de las cepas de la invención.
Sin querer estar vinculado a ninguna teoría, los inventores consideran que, en el sobrenadante obtenido de los cultivos de las cepas de la invención, en medio líquido, están comprendidas las enzimas necesarias para llevar a cabo dichas reacciones de acilación y/o desacilación. Entre las enzimas que pueden formar parte de dicho sobrenadante se encuentran las lipasas que son enzimas que catalizan un amplio rango de reacciones (hidrólisis, interesterificaciones, alcoholisis, acidólisis, esterificación y aminolisis, entre otras), incluyendo las reacciones que se detectan y se muestran en los ensayos y ejemplos que se describen lo largo de la presente invención.
El sobrenadante obtenido mediante el cultivo de las cepas de la invención pueden contener no sólo las enzimas necesarias para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, sino que también puede contener otro tipo de compuestos que pueden interaccionar con dichas enzimas, disminuyendo o potenciando la eficacia de conversión del sustrato a los productos resultantes de las reacciones. Por lo tanto, puede ser conveniente someter al sobrenadante a un proceso de concentración y de diálisis para eliminar aquellas partículas o compuestos no deseables.
En la presente invención se entiende por "concentración y/o diálisis" al proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable. Típicamente, una solución de varios tipos de moléculas es puesta en una bolsa semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de celulosa con poros, y la bolsa es sellada. La bolsa de diálisis sellada se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera de la bolsa de diálisis en la dirección de la concentración más baja. La técnica de diálisis es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su puesta en práctica es rutinaria para el experto en la materia. En la puesta en práctica de la presente invención, el sobrenadante de la invención se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa y tras ser concentrado con polietilenglicol 8 KDa, se dializó con tampón fosfato potásico.
Por lo tanto, en una realización particular, el extracto enzimático descrito en la presente invención, obtenido a partir de los cultivos de las cepas de la invención, está concentrado y/o dializado.
Adicionalmente, tanto si el extracto enzimático de la invención está concentrado y/o dializado o no, éste puede ser sometido a un proceso de liofilización. Por lo tanto, en otra realización particular, el sobrenadante de la invención está liofilizado. La liofilización es un proceso en el que se congela el producto y, posteriormente, se introduce en una cámara de vacio para realizar la separación del agua por sublimación. De esta manera se elimina el agua desde el estado sólido al gaseoso del ambiente sin pasar por el estado líquido. La técnica de liofilización es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su aplicación es práctica de rutina para el experto en la materia.
Una vez obtenidas tanto las cepas microbianas de la invención, como los extractos enzimáticos producidos a partir del cultivo de éstas, y probado que son capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, el experto en la materia entiende que, tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos de la invención, pueden emplearse para producir los compuestos de interés que se indican más adelante.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos obtenidos de cultivos de dichas cepas, según la invención, para la producción de derivados acilados, siendo preferentemente los sustratos de partida, polifenoles y/o carbohidratos, naturales o no.
En una realización particular, la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos se lleva a cabo mediante reacciones regioselectivas de acilación o desacilación de polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales.
A efectos de la presente invención los términos "regioselectivo/a" o "regioselectividad" se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o hidrólisis en un hidroxilo alifático de varios posibles, o un hidroxilo aromático de varios posibles.
A efectos de la presente invención los términos "quimioselectivo/a" o "quimioselectividad" se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o alcoholisis en un hidroxilo alifático (alcohol) frente a un hidroxilo aromático (fenol) o viceversa.
Más detalles sobre la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante el empleo de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos de las mismas, descritos en la presente invención, puede encontrarse en los Ejemplos 3 y 5 donde se describe el método de producción de los mismos. Biotransformaciones regioselectivas para la obtención de derivados adiados lipofílicos de polifenoles y/o carbohidratos.
Como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto nuevas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales o no, por lo que tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos obtenidos a partir del cultivo de las mismas, pueden emplearse en la obtención de los compuestos que se indican a continuación.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente a partir de polifenoles y/o carbohidratos naturales, mediante reacciones de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:
a) poner el extracto enzimático según se define a lo largo de la presente invención, en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente y, opcionalmente b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a).
A efectos de la presente invención, el término "purificar" o "purificación" se refiere tal y como se emplea en la descripción, a la separación de los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos mediante el método descrito en la invención y a su concentración. La separación de dichos compuestos del resto de productos que le puedan acompañar y que no sean de interés, puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga o la afinidad de la proteína y puede realizarse en columna, en papel o en placa. La separación de los compuestos puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein Liquid Cromatography), en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempo de purificación e incrementa el rendimiento de la purificación. En una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, las cepas microbianas de la invención son cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener unos extractos enzimáticos que contengan las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos.
Las cepas bacterianas de la invención se crecen en un medio de cultivo líquido para extraer el sobrenadante y posteriormente obtener los extractos enzimáticos. Para Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8234) se ha utilizado como medio de cultivo, PYA (agar, peptona y extracto de levadura). En el caso de Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8232) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8233) se ha utilizado como medio de cultivo, LB (Luria-Bertani), aunque es importante mencionar que se podría utilizar cualquier otro medio de cultivo en el cual las cepas de la invención puedan crecer.
Opcionalmente, el cultivo líquido se puede suplementar con un sustrato lipídico para incrementar la secreción de las enzimas presentes en el extracto enzimático de la invención, secretadas por las cepas de la invención y que son las responsables de llevar a cabo las reacciones de acilación/desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos. Como se ha comentado previamente, dichas enzimas se considera que son, preferentemente, lipasas. Así, en una realización particular, el medio de cultivo puede estar suplementado con un sustrato lipídico, de acuerdo a como se ha descrito previamente en la presente descripción de la invención.
Los cultivos se realizan a temperatura de entre 22°C y 37°C, en agitación durante 2-3 días. Transcurridos estos días se extrae el sobrenadante que como hemos mencionado anteriormente, contendrá las enzimas, preferentemente lipasas, encargadas de llevar a cabo las reacciones descritas en la presente invención.
El sobrenadante resultante de los cultivos puede aislarse por técnicas de rutina para el experto en la materia. Por ejemplo, una vez transcurrido el periodo de incubación, el cultivo puede dejarse reposar para que las células decanten o puede someterse a centrifugación, consiguiendo de ambas formas separar las células del medio de cultivo líquido. Posteriormente, puede obtenerse el sobrenadante, por ejemplo por aspiración con una pipeta.
Una vez obtenido el extracto enzimático, éste se pone en contacto con los compuestos que se quieran someter a las reacciones de acilación/desacilación [etapa (a)]. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo estas reacciones se explican detalladamente en cada uno de los ejemplos que contiene la presente invención.
En una realización preferida, los compuestos de partida son preferentemente polifenoles o carbohidratos.
En otra realización preferida, los sustratos de tipo fenólico de la etapa a) del método de la invención, se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de los siguientes: hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol, alcohol protocatecuico y derivados acetilados de los mismos, preferiblemente: hidroxitirosol triacetilado, 3.4-dihidroxifenilglocol tetraacilado y alcohol protocatecuico peracilado.
En otra realización preferida, los sustratos de tipo carbohidratos del paso a) del método de la invención, se seleccionan de entre mono-, di-, oligo-, polisacáridos o cualquiera de sus derivados adiados, preferiblemente: metil α-D-glucopiranosido per-O-acetilado, trehalosa octaacetilada y sacarosa octaacetilada.
Por "derivados acetilados" se refiere a compuestos fenólicos o carbohidratos con al menos un grupo -OH sustituido por un grupo -OCOCH3.
Tal como se ha explicado previamente, en el presente documento, los sobrenadantes obtenidos en una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, pueden concentrarse y/o dializarse, según se ha explicado previamente, o pueden usarse tal cuales.
Por lo tanto, en una realización particular, el método de obtención de derivados adiados de polifenoles y/o carbohidratos de la invención comprende entre las etapas (a) y (b), una etapa opcional dirigida a la concentración y/o dialización de los sobrenadantes, así como a su posterior liofilización. Las técnicas de concentración, dialización y liofilización se describen con detalle en el Ejemplo 2.
A continuación se detallan las diferentes reacciones de acilación/desacilación de compuestos fenólicos y/o carbohidratos mediante las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas presentes en los sobrenadantes o extractos enzimáticos recogidos de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, para la obtención de compuestos fenólicos y/o carbohidratos acilados lipofílicos.
En una realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso (a) es un derivado acetilado de hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico, preferiblemente hidroxitirosol triacetilado, 3,4-dihidroxifenilglocol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado, y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.
Por "alcohol alifático" se entiende en la presente invención a un grupo alquilo (C^C7), lineal o ramificado, con al menos un radical -OH, por ejemplo, pero sin limitarse a metanol, etanol, propanol, butanol, entre otros. Preferiblemente el alcohol alifático es metanol (MeOH). El alcohol alifático puede estar opcionalmente deuterado a temperatura ambiente (aprox. 18-30°C).
En una realización más preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso (a) es un hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metanol.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación de los hidroxilos aromáticos, el polifenol del paso (a) es 3,4-dihidroxifenilglicol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación en la posición bencílica.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el polifenol del paso (a) es hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un grupo acilante y opcionalmente de un co-disolvente. Por "grupo acilante" se entiende a un reactivo capaz de reaccionar con un compuesto agregando un grupo acilo a su estructura, como por ejemplo, el grupo acilante puede ser sin limitarse a acetato de isopropenilo o acetato de vinilo, que a su vez actúan de disolvente.
La reacción de acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita. Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar un co- disolvente, por ejemplo DMF (A,A-dimetil formamida).
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil α-D-glucopiranósido per-O-acetilado, per-0-acetil-a,a-D-trehalosa, per-O-acetil-sacarosa, trehalosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada y la reacción se lleva a cabo en presencia de alcohol alifático, preferiblemente metanol o metanol deuterado a temperatura ambiente (16-28°C).
En un realización más preferida, la reacción enzimática es de per-0-acetil-a,a-D- trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2,3,4,6,6'-penta-0-acetil-a,a-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-O- acetil-a,a-D-trehalosa o la reacción enzimática de per-O-acetil-sacarosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2,3,4,6, 1 ',6'-hexa-0-acetil-sacarosa o 2,3,4,6,6'-penta-0-acetil-sacarosa.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el carbohidrato del paso (a) es metil α-D-glucopiranósido y la reacción se lleva a cabo en presencia de acetato de isopropenilo y DMF a una temperatura de entre 50-70°C.
Otro aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (I)
Figure imgf000019_0001
(l) donde: es un grupo alquilo (( C20), un grupo alquenilo (C2-C2o), un grupo alquinilo (C2-C2o), o un grupo arilalquilo; y
R2 es un grupo acilo (-COR3, donde R3 es un grupo alquilo Ci-C20) o un hidrógeno.
Por "alquilo" se refiere en la presente invención a una cadena alifática, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 20 átomos de carbonos, preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /- propilo, n-butilo, /-butilo, n-pentilo, entre otros.
Por "alquenilo" se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un doble enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por "alquinilo" se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un triple enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por "arilalquilo" se entiende en la presente invención a un grupo arilo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo (C C20), tal y como se ha definido anteriormente. Un ejemplo, no limitante, de arilalquilo es un grupo bencilo.
En una realización preferida, el compuesto de fórmula general (I) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un grupo acetilo (-COCH3).
En una realización preferida, el compuesto de fórmula general (I) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un hidrógeno.
En otra realización más preferida, los compuestos de fórmula general (I) se seleccionan de la lista que comprende: acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-metoxietilo, acetato de 2- (3,4-dihidroxifenil)-2-etoxietilo, acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietilo, y acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietilo. En otra realización preferida, los compuestos de fórmula general (I) se seleccionan de la lista que comprende: 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-metoxietanol, 2-(3,4-dihidroxifenil)-2- etoxietanol, 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietanol y 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietanol.
La presente invención también describe el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con b. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con F^OH y posteriormente la reacción del compuesto obtenido en el paso (a) mediante catálisis básica, preferiblemente con Cs2C03, en metanol;
donde R es un grupo alquilo (C C2o), un grupo alquenilo (C2-C20), un grupo alquinilo (C2- C2o), o un grupo arilalquilo.
Figure imgf000021_0001
En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que la reacción enzimática se lleva a cabo en presencia del extracto enzimático descrito en la presente invención.
La presente invención se refiere también al uso de al menos un compuesto de fórmula general (I), según se ha descrito previamente, para la elaboración de un medicamento o de una composición cosmética o de una composición alimenticia, dónde la composición alimenticia se selecciona de entre un alimento, complemento alimenticio, alimento funcional o nutracéutico.
A efectos de la presente invención el término "medicamento" hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. A efectos de la presente invención el término "composición farmacéutica" tal y como se define en la presente invención se refiere a conjunto de componentes que están formados por al menos un producto de fórmula general (I) según se describe en la presente invención, en cualquier concentración, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud. Dichas composiciones comprenden además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede comprender un "vehículo" o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica.
Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
A efectos de la presente invención el término "composición cosmética" o "cosmético" se refiere a aquellas preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintéticas o sus mezclas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano.
A efectos de la presente invención el término "composición alimenticia" se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término "composición alimentaria" de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales específicos o alimento medicinal. A efectos de la presente invención, el término "composición alimenticia" es, o forma parte de un alimento, alimento funcional, nutracéutico o suplemento alimenticio. A efectos de la presente invención el término "nutracéutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.
A efectos de la presente invención el término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional" o "suplemento alimenticio" es un "ingrediente alimenticio" destinado a complementar la alimentación.
La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (I), según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferentemente como antioxidante alimentario.
Por el término "antioxidante" se entiende una composición capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I), según se ha descrito previamente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I), según se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a los derivados acilados de carbohidratos, preferentemente a los compuestos de fórmula 2,3,4,6,6'-penta-0-acetil- α,α-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-0-acetil-a,a-D-trehalosa.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de dichos derivados acilados de carbohidratos descritos previamente como intermedios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa o para la elaboración de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis que comprende: a. la reacción enzimática de per-0-acetil-a,a-D-trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.
En una realización preferida, dicho procedimiento se lleva a cabo en presencia de un extracto enzimático según se define en la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1 : Análisis filogenético de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
El estudio filogenético se llevó a cabo mediante análisis de la secuencia del gen ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 16S. Para ello se amplificó el gen del ARNr 16S de cada una de las cepas de la invención mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 16F27, cuya secuencia es 5 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1), y 16R1 88, con la secuencia 5'-CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3' (SEQ ID NO: 2) (Moreno M.L., et al. FEMS Microbio! Ecol, 2009; 68, 59-71.). Las condiciones de la reacción de PCR fue la siguiente: un ciclo de 95 °C durante 5 minutos, 25 ciclos de 94 °C durante 1 minutos, 50 °C durante 1 minutos y 72 °C durante 2 minutos, y luego un paso de extensión de 10 minutos a 72 °C. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN amplificado es secuenciado medíante el método Sanger. Se utilizan entre 640 y 650 pb para la búsqueda de secuencias similares entre las secuencias depositadas en GenBank, usando el algoritmo BlastN, resultando ser Terribacillus goriensis CL-GR16 (Número de acceso a GeneBank NR_043895), Bacillus stratosphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336), Enterobacter ludwigii EN-1 19 (número de acceso a GeneBank AJ853891 ) y Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934) los que mayor valor de identidad muestran con las secuencias de las cepas de la invención. Por lo tanto, las cepas de la invención se asignaron a los géneros Terribacillus como Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), Bacillus, como Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464), Enterobacter, como Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas como Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la realización del árbol filogenético se utilizó el paquete de programas MEGA4. Primero se realizó un alineamiento múltiple, usando Clustal W, de las secuencias de 650 pb (correspondiente al fragmento entre las posiciones 53 hasta la 703 (Figura 1A) y entre las posiciones 80 hasta 730 (Figura 1 B) del ARNr 16S de Escherichia coli) de las cepas y de las secuencias de mayor identidad obtenidas con BlastN. Finalmente los árboles se construyeron utilizando varios métodos, obteniendo resultados similares con todos ellos. En la presente invención se muestran los árboles construidos mediante el método Neighbor-Joining (Figura 1).
Ejemplo 2: Preparación de los sobrenadantes de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la preparación de los extractos enzimáticos o sobrenadantes, se creció un pre- inóculo de cada una de las cuatro cepas descritas en la presente invención. Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ) se cultivó en medio PYA durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante.
Bacillus sp. HR21 -6 (CECT8464) se cultivó en medio LB durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante. Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463) se cultivaron en medio LB durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio LB + tributirina (TRI) 2%. Tras crecer el cultivo en medio LB+TRI 2%, se recogió el sobrenadante.
Cada uno de los sobrenadantes se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa (SIGMA, D- 9527). Las bolsas de diálisis se dejaron toda la noche a 4 °C cubiertas en polietilenglicol de 8 KDa y cuando las bolsas de diálisis estaban completamente secas, se limpió el exterior con agua destilada y se dializaron con tampón fosfato potásico 0,05M pH 7,8 a 4 °C y agitación magnética. Estos dializados se congelaron a -80 °C.
Dichos sobrenadantes pueden ser liofilizados para así evitar que se produzcan las reacciones de hidrólisis. Además, liofilizar el sobrenadante ayuda a concentrar y conservar la enzima de la cepa microbiana, y también para poder ser almacenado.
Ejemplo 3: Preparación de polifenoles lipófilos. Reacciones de acilación/desacilación catatalizadas por los sobrenadantes/extractos enzimáticos de las cepas de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
A continuación se muestran a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo, rutas sintéticas que conducen a la obtención de derivados fenólicos por desacilación regioselectiva catalizada por los extractos enzimáticos/sobrenadantes en medio alcohólico.
Ejemplo 3.1. Reacción de desacilación de compuestos fenólicos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofílicos.
Ejemplo 3.1.1.
Acetato de hidroxitirosilo (2)
La desacilación del compuesto 1 (hidroxitirosol peracetilado) mediante alcoholisis (desacilación) catalizada por los extractos enzimáticos, obtenidos de los cultivos de las cepas de la invención, usando como disolvente un alcohol alifático, tal como el MeOH, da lugar al derivado monoacilado (compuesto 2) mediante una reacción totalmente regioselectiva, según se describe en el Esquema 1.
Figure imgf000027_0001
A una disolución del compuesto 1 (hidroxitirosol triacetilado) (50 mg, 0.18 mmol) en MeOH se le añade el extracto enzimatico obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231 ) (50 mg) y gel de sílice (63-200 μιη, 100 mg). Se agita a 40 °C durante 18 horas. Se filtra sobre celita y se concentra a sequedad. El residuo se purifica por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1 :2 → 1 :1) obteniéndose el acetato de hidroxitirosilo 2 (31 mg, 90%). (Ver Esquema 1 ). El rendimiento para la obtención del compuesto 2 purificado por técnicas cromatográficas fue del 75-91 % dependiendo del extracto enzimatico utilizado.
Ejemplo 3.1.2.
La desacilacion del compuesto 3 (3,4-dihidroxifenilglicol peracetilado) mediante alcoholisis catalizada por los extractos enzimáticos descritos en la presente invención y usando como disolvente un alcohol alifático de tipo R1OH, tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 2). En la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi F^O procedente del alcohol dando lugar a la formación del compuesto 4 que puede ser aislado con rendimientos del 40-90%. El radical R1 del alcohol alifático de tipo R1OH se selecciona preferiblemente de entre cualquiera de los siguientes: -CH3 (metilo), -C2H5 (etilo), -C3H7 (propilo) o -C4H9 (butilo). En función del alcohol alifático utilizado como disolvente se obtienen los compuestos 4a, 4b, 4c o 4d (Esquema 2). Los tiempos de reacción van desde 24 h para la obtención del compuesto 4a hasta 6 días para la obtención del compuesto 4d. El grupo acetilo del compuesto 4 puede ser eliminado mediante una alcoholisis (desacilacion) con catálisis básica, utilizando como catalizador cualquier catalizador básico, preferentemente Cs2C03 en metanol. De esta manera, los compuestos 4a-4d mediante una reacción de desacetilación dan lugar a los compuestos 5a-5d con rendimientos del 31-62% (Esquema 2).
Figure imgf000028_0001
4a R = Me 5a R = Me 4b R = Et 5b R = Et 4c R = Pr 5c R = Pr 4d R = Bu 5d R = Bu
Esquema 2
Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-metoxietilo (4a)
Figure imgf000028_0002
Se disuelve el compuesto 3 (tetraacetilado) (28 mg, 0.08 mmol) en MeOH (3 ml_) y se añaden 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) y 56 mg de gel de sílice (63-200 μπι). Se agita a temperatura ambiente durante dos días. Se añaden otros 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) y se prosigue con la agitación a temperatura ambiente durante dos días. Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (CH2CI2- MeOH 60:1 ). Rendimiento: 17 mg, 90%, RF 0.6 (CH2CI2-MeOH 10:1).
1H-RMN (300 MHz, CD3OD): δ 6.80 (d 1 H, J5,6 = 8.0 Hz, Ar-5), 6.79 (d, 1 H, J2,6 = 2.0 Hz, Ar-2), 6.68 (dd, 1 H, J6,5 = 8.0 Hz, J62 = 2.0 Hz, Ar-6), 4.32 (dd, 1 H, J = 8.0 Hz, J= 3.9 Hz, CH), 4.18 (dd, 1 H, J = 11 ,4 Hz, J = 8.0 Hz, CH2), 4.07 (dd, 1 H, J = 11 ,4 Hz, J = 3.9 Hz, CH2), 3.25 (s 3H, OMe), 2.06 (s 3H, OAc). 13C-RMN (75.5 MHz, CD3OD): δ 173.6 (CO), 145.7 (Ar-3 y 4), 131.4 (Ar-1), 120.7 (Ar-6), 1 17.2 (Ar-5), 1 15.8 (Ar-2), 83.4 (CH), 69.5 (CH2), 57.7 (OMe), 21.6 (OAc).
Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-etoxietilo (4b)
Figure imgf000029_0001
Se disuelve el compuesto 3 (60 mg, 0.18 mmol) en EtOH (6 ml_) y se añaden 60 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) y 120 mg de gel de sílice (63-200 μιη). Se calienta a 60 °C durante 24 horas y pasado ese tiempo se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice (CH2CI2-EtOH 60:1 ). Rendimiento: 24 mg, 55%, RF 0.5 (CH2CI2-MeOH 10:1 ). H-RMN (300 MHz, CDCI3): δ 6.89 (d, 1 H, J2 6= 2.0 Hz, Ar-2), 6.83 (d, 1 H, J5,6= 8.1 Hz, Ar- 5), 6.72 (dd, 1 H, J6,5= 8.1 Hz, J6,2= 2.0 Hz, Ar-6), 4.42 (dd, 1 H, J= 6.9 Hz, J= 5.0 Hz, CH), 4.20-4.12 (m, 2H, CH2), 3.43 (2dd, 1 H cada uno, 2J = 16.4 Hz, 3J = 7.0 Hz, CH2CH3), 2.06 (s, 3H, OAc), 1.17 (t, 3H, J= 7.0 Hz, CH2CH3). 3C-RMN (75.5 MHz, CDCI3): δ 172.0 (CO), 144.5 (Ar-4), 144.4 (Ar-3), 131.0 (Ar-1), 1 19.9 (Ar-6), 1 15.5 (Ar-5), 1 13.9 (Ar-2), 79.6 (CH), 68.4 (CH2), 64.8 (CH2CH3), 21.3 (OAc), 15.4 (CH2CH3).
Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietilo (4c)
Figure imgf000029_0002
Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en PrOH (4 ml_) y se añaden 190 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) y 380 mg de gel de sílice (63-200 μιη). Se agita a 60 °C durante dos días. Se añaden otros 190 mg del mismo extracto y se prosigue con la agitación durante dos días. Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (AcOEt- hexano 1 :3→ 1 : 1). Rendimiento: 81.4 mg, 57%, RF 0.6 (AcOEt-hexano 1 :1 ).
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): δ 6.90 (d, 1 H, J2fl= 2.0 Hz, Ar-2), 6.84 (d, 1 H, J5,6= 8.1 Hz, Ar- 5), 6.73 (dd, 1 H, Je,5 = 8.1 Hz, J6 2= 2.0 Hz, Ar-6), 4.41 (dd, 1 H, J= 7.6 Hz, J= 4.5 Hz, CH), 4.21 -4.10 (m, 2H, CH2), 3.40-3.24 (m, 2H, OCH2CH2), 2.06 (s 3H, OAc), 1.59 (sexteto, 2H, J = 7.4 Hz, OCH2CH2), 0.88 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI3): δ 171.9 (CO), 144.4 (Ar-4), 144.3 (Ar-3), 131.2 (Ar-1 ), 120.0 (Ar-6), 1 15.5 (Ar-5), 1 13.9 (Ar- 2), 79.7 (CH), 71.1 (CH2), 68.4 (OCH2CH2), 23.1 (CH2CH2), 21.3 (OAc), 10.8 (CH3).
Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietilo (4d)
Figure imgf000030_0001
Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en BuOH (4 mL) y se añaden 190 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) y 380 mg de gel de sílice (63-200 μητι), calentándose a 60 °C durante 2 días. Se concentra a sequedad y se purifica por cromatografía en columna con AcOEt- Hex 1 :2. Rendimiento: 91 mg, 61 %, RF 0.6 (CH2CI2-MeOH 10:1 ).
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): δ 6.90 (d, 1 H, J2fi= 1.9 Hz, Ar-2), 6.84 (d, 1 H, J5,6= 8.0 Hz, Ar- 5), 6.73 (dd, 1 H, J6,5= 8.0 Hz, J6,2= 1.9 Hz, Ar-6), 6.50 (s, 1 H, OH), 5.95 (s, 1 H, OH), 4.44 (dd, 1 H, J= 7.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH), 4.22-4.10 (m, 2H, CH2), 3.45-3.28 (m, 2H, OCH2CH2), 2.07 (s, 3H, OAc), 1.55 (m, 2H, J = 6.6 Hz, OCH2CH2), 1.39-1.25 (m, 2H, CH2CH3), 0.86 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH2CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI3): δ 172.1 (CO), 144.4 (Ar-4), 144.3 (Ar-3), 131.1 (Ar-1 ), 120.0 (Ar-6), 1 15.5 (Ar-5), 1 13.9 (Ar-2), 79.7 (CH), 69.2 (OCH2CH2), 68.4 (CH2), 32.0 (OCH2CH2), 21.3 (OAc), 19.6 (CH2CH3), 14.2 (CH2CH3). 2-(3,4-Dihidroxifenil)-2- metoxietanol (5a)
Figure imgf000031_0001
A una disolución del compuesto 4a (54 mg, 0.24 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs2C03 (231 mg, 0.72 mmol) y ascorbato sódico (48 mg, 0.24 mmol) en presencia de Ar y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2CI2-EtOH (1 :0 → 1 : 10). Rendimiento: 23 mg, 53%, RF 0.2 (CH2CI2-MeOH 10:1).
1H-RMN (300 MHz, D20): δ 6.94 (d, 1 H, J5 6= 8.1 Hz, Ar-5), 6.89 (d, 1 H, J2 6= 2.0 Hz, Ar- 2), 6.80 (dd, 1 H, J6,5= 8.1 Hz, J6,2= 2.0 Hz, Ar-6), 4.29 (dd, 1 H, J= 7.5 Hz, J= 4.6 Hz, CH), 3.71 (dd, 1 H, J= 1 1.9 Hz, J = 7.5 Hz, CH2), 3.64 (dd, 1 H, J = 1 1.9 Hz, J = 4.6 Hz, CH2),3.27 (s, 3H, OMe). 13C-RMN (75.5 MHz, D20): δ 144.1 (Ar-1), 144.0 (Ar-2), 130.5 (Ar-4), 1 19.8 (Ar-5), 1 16.1 (Ar-6), 1 14.7 (Ar-3), 83.6 (CH), 65.0 (CH2), 56.0 (OMe).
2-(3,4-Dihidroxifenil)-2-etoxietanol (5b)
Figure imgf000031_0002
A una disolución del compuesto 4b (25 mg, 0.10 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs2C03 (66 mg, 0.20 mmol) y ascorbato sódico (20 mg, 0.10 mmol) en presencia de Ar y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2CI2-EtOH (1 :0 → 1 :10). Rendimiento: 12.4 mg, 62%, Rf 0.3 (CH2CI2-MeOH 10: 1 ). 1H-RMN (300 MHz, CD3OD): δ 6.91 (d, 1H, J5,6= 8.1 Hz, Ar-5), 6.88 (d, 1H, J 6= 1.8 Hz, Ar-2), 6.80 (dd, 1H, Je,5= 8.1 Hz, J62= 2.0 Hz, Ar-6), 4.38 (dd, 1H, J= 7.7 Hz, J= A A Hz, CH), 3.70 (dd, 1H, J= 11.7 Hz, J= 8.0 Hz, CH2), 3.61 (dd, 1H, J= 11.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH2) 3.48 (c, 2H, J= 6.9 Hz, CH2CH3), 1.19 (t, 3H, J= 7.1 Hz, CH2CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CD3OD): δ 146.1 (Ar-4), 145.9 (Ar-3), 133.1 (Ar-1), 121.3 (Ar-6), 117.7 (Ar-5), 116.3 (Ar-2), 83.9 (CH), 67.3 (CH2), 66.3 (CH2CH3), 16.1 (CH2CH3).
2-(3,4-Dihidroxifenil)-2-propoxietanol (5c)
Figure imgf000032_0001
A una disolución del compuesto 4c (55 mg, 0.22 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs2C03 (66 mg, 0.20 mmol) y ascobato sódico (44 mg, 0.22 mmol) en presencia de Ar y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente (AcOEt-hexano 1:1). Rendimiento: 14.5 mg, 31%, RF 0.1 (AcOEt-Hex 1:1).
1H-RMN (300 MHz, CD3OD): δ 6.78 (d, 1H, J26= 1.9 Hz, Ar-2), 6.76 (d, 1H, J5,6= 8.0 Hz, Ar-5), 6.65 (dd, 1H, J6,5= 8.0 Hz, J62= 2.0 Hz, Ar-6), 4.22 (dd, 1H, J= 8.0 Hz, J= 4.1 Hz, CH), 3.64 (dd, 1H, J = 11.6 Hz, J= 8.0 Hz, CH2), 3.51 (dd, 1H, J= 11.6 Hz, J= 4.1 Hz, CH2), 3.37-3.29 (m, 2H, OCH2CH2), 1.61 (s, 2H, J = 7.2 Hz, OCH2CH2), 0.93 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CD3OD): δ 147.3 (Ar-4), 146.9 (Ar-3), 133.3 (Ar-1), 120.6 (Ar-6), 117.0 (Ar-5), 115.8 (Ar-2), 85.2 (CH), 72.5 (CH2), 68.9 (OCH2CH2), 24.9 (OCH2CH2), 11.8(CH3).
2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietanol (5d)
Figure imgf000032_0002
A una disolución del compuesto 4d (78 mg, 0.29 mmol) en MeOH seco (2 mi), se añaden ascorbato sódico (58 mg, 0.29 mmol) y Cs2C03 (280 mg, 0.88 mmol) y se agita a temperatura ambiente, en oscuridad y atmósfera de argón durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente AcOEt-Hex (1 : 1 ).
Rendimiento: 28.1 mg, 43%, RF 0.3 (CH2CI2-MeOH 10:1). H-RMN (300 MHz, CDCI3): δ 6.84 (d, 1 H, J2,6= 1.8 Hz, Ar-2), 6.83 (d, 1 H, J5,6= 8.0 Hz, Ar-5), 6.72 (dd, 1 H, 6,5= 8.0 Hz, J6i2= 1.8 Hz, Ar-6), 6.04 (sa, 3H, OH), 4.29 (dd, 1 H, J = 7.8 Hz, J = 4.4 Hz, CH), 3.69-3.57 (m, 2H, CH2), 3.47-3.28 (m, 2H, OCH2CH2), 1.60-1.51 (m, 2H, OCH2CH2), 1.43-1.26 (m, 2H, CH2CH3), 0.88 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH2CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI3): δ 144.3 (Ar- 4), 144.2 (Ar-3), 131.8 (Ar-1), 1 19.9 (Ar-6), 1 15.7 (Ar-5), 1 14.1 (Ar-2), 82.5 (CH), 69.2 (OCH2CH2), 67.6 (CH2), 32.2 (OCH2CH2), 19.7 (CH2CH3), 14.2 (CH2CH3).
Ejemplo 3.1.3.
La desacilación (alcoholisis) del compuesto 6 (alcohol protocatecuico peracilado) con un grupo acetoxilo en posición bencílica catalizada por los extractos enzimáticos usando como disolvente un alcohol alifático de tipo ROH, también tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 3). De manera similar al comportamiento observado en el compuesto 3, en la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi procedente del alcohol usado como disolvente. Así, por ejemplo, usando como disolvente el MeOH se puede obtener el compuesto 7 de forma cuantitativa en 24 h. El compuesto 7 ha sido aislado previamente del caldo de fermentación del hongo marino Y26-02 (Wu, H.-H. et al. J Asían Nat Prod Res 1 1 , 747- 750; 2009).
Figure imgf000033_0001
6 7
Esquema 3 4-(Metoximetil)benceno-1 ,2-diol (7)
Figure imgf000034_0001
A una disolución del compuesto 6 (30 mg, 0.19 mmol) en MeOH (1 mi) se añaden 30 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) y 60 mg de gel de sílice (63-200 μπτι) y se calienta a 40 °C durante 24 h. Se concentra a sequedad y se purifica mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1 : 1) obteniéndose el producto como un sirupo rojizo. Rendimiento: 29 mg, cuantitativo RF 0.6 (AcOEt-hexano 1 :1).
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): δ 6.83-6.78 (m, 2H, Ar-3, Ar-5), 6.70 (d, 1 H, J6 5= 7.7 Hz, Ar- 6), 4.30 (s, 2H, CH2), 3.33 (s, 3H, OMe).
Ejemplo 3.2. Reacción de acilación de compuestos fenólicos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofílicos.
Se llevaron a cabo reacciones de acilación (esterificación) regioselectiva de diversos polifenoles, preferentemente de polifenoles presentes en el aceite de oliva (Esquema 4).
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
Esquema 4 Extracto
Figure imgf000036_0001
20 21 22
Figure imgf000036_0002
23 24
Figure imgf000036_0003
25 26
Figure imgf000036_0004
Esquema 4 (continuación)
Dichos polifenoles son el compuesto 8 (hidroxitirosol), el compuesto 14 (3,4- dihidroxifenilglicol) y el compuesto 20 (alcohol protocatecuico). Como agente acilante se empleo el acetato de isopropenilo, que a su vez actúan de disolvente del polifenol y de sus derivados adiados. La acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita. Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar DMF (A/JV-dimetil formamida) como co-disolvente. El resultado de la acilación se cuantifica mediante 1H-RMN previa eliminación del sobrenadante o extracto enzimático que contiene las enzimas encargadas de llevar a cabo la reacción de acilación.
El producto mayoritario obtenido de la reacción de acilación (esterificación) del polifenol hidroxitirosol (compuesto 8) tras 24 h (Tabla 1) es el compuesto 9 que es derivado monoacilado en posición 4 del anillo aromático. El compuesto 9 y su regioisómero en la posición 3 (compuesto 10), se forman en la proporción de 2:1. Además, de los compuestos derivados monoacilados 2, 9 y 10, se detectan, en menor cantidad, otros tres compuestos que son los derivados diacilados 11 , 12 y 13. El grado de conversión oscila del 88 al 96%. Los resultados contrastan con la regioselectividad que se obtiene con la lipasa procedente de C. antárctica, que conduce exclusivamente al compuesto regioisómero 2, acilado en la cadena lateral.
La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 14: 3,4-dihidroxifenilglicol tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los compuestos 15 y 16 que son los derivados monoacilados en el anillo aromático, y del compuesto 17 que es el derivado monoacilado en el extremo de la cadena lateral, en proporción 1 :1 :1 , con los extractos de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ) y Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462), y en la relación 1 : 1 :2 con Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462), Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464) y la lipasa pura de C. antárctica. El grado de conversión va del 53 al 70%. El menor grado de conversión se consigue con la C. antárctica. No se detecta la acilación del hidroxilo bencílico del compuesto 14 con ninguna de las enzimas, ni extractos enzimáticos.
La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 20: alcohol protocatecuico tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los derivados mono, di y triacilados. La relación de los derivados monoacilados en posición 4, 3 y cadena lateral es sensible al extracto enzimático utilizado; así, la proporciones son 1 :1 : 1 para el sobrenadante del cultivo de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), 1 :2:2 para el sobrenadante del cultivo de Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462), 1 :3.5:1 para el sobrenadante del cultivo de Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462), 1 :3:2 para el sobrenadante del cultivo de Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464) y 1 :0: 16 para la lipasa de C. antárctica. El grado de conversión va del 77 al 81 % para los 4 sobrenadantes ensayados, mientras que con la lipasa de C. antárctica, la conversión es cuantitativa. La formación del compuesto 6: derivado triacetilado, solo se detecta con la lipasa de C. antartica. Tabla 1. Porcentaje determinado por H-RMN en la mezcla de reacción formada por acilación de los compuestos 8, 14 y 20 con extractos de los sobrenadante obtenido del cultivo de las cepas bacterianas de la invención o de una lipasa comercial.
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Acilación del hidroxitirosol (compuesto 8). Se disuelve hidroxitirosol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añaden celita (50 mg) y el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 °C y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H-RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1). Acilación del 3,4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14). Se disuelve 3,4- dihidroxifenilglicol (50 mg) en una mezcla de DMF/acetato de isopropenilo 1 :1 (6.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 °C y en oscuridad 24 horas. Se elimina el disolvente y el residuo que resulta se redisuelve en acetona seca y se filtra. Por último, se concentra a sequedad. Se analiza por H-RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Acilación del alcohol protocatecuico (compuesto 20). Se disuelve el alcohol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 °C y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H- RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad antioxidante de los polifenoles lipófilos descritos en la presente invención.
A continuación se representa los resultados obtenidos en la prueba de actividad antirradicalaria frente al DPPH para los compuestos 4a-4d, 5a-5d, 2 y 14. La actividad antirradicalaria expresada como EC50 frente al DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) representa la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentración de DPPH al 50%. Se utilizó el método de Sánchez-Moreno (Sánchez-Moreno, C. et al. J. Sci. Food Agrie. 1998, 76, 270-276) con las modificaciones de Jiménez y col. J. Agrie. And Food Chem. 2005, 53, 5212-5217).
De los nuevos compuestos sintetizados, el más activo resultó ser el compuesto 4a con una actividad parecida al acetato de hidroxitirosilo (Compuesto 2), aunque menor que el 3,4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14) (Tabla 2 y Figura 2)
Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a DPPH expresada en valores de ECS0 (μ )
Compuesto EC50 (μΜ)
4a 14.5 ± 0.500
4b 21.6 ± 2.84
4c 21.7 ± 0.480 Tabla 2. Actividad antirradicaiaria frente a DPPH
expresada en valores de ΕΟ50(μΜ)
5a 17.5 ± 2.19
5b 20.3 ± 1.73
5c 20.3 + 1.74
5d 16.7 ± 1.81
2 14.3 ± 0.800
14 12.0 ± 0.550
Ejemplo 5: Preparación de carbohidratos parcialmente adiados. Reacciones de acilación/desaciiación de carbohidratos catalizadas por los extractos enzimáticos obtenidos de los cultivos de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacilius sp. HR21-6 (CECT 8464), Enierobacter sp. AE1B89 (CECT 8462).
Ejemplo 5.1.
Se ha llevado a cabo la reacción de desacetilación del compuesto 27 (metil ct-D- glucopiranósido per-O-acetilado) por alcoholisis en medio metanólico catalizada por los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Entarobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Bacilius sp. HR21-6 (CECT 8464). Se han comparado los resultados obtenidos con las cepas de la invención con los resultados obtenidos con las lipasas comerciales procedentes de Pseudomonas cepacea 30 U/mg (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) y C. antárctica soportada sobre resina acrílica 5,000 U/g (Sigma-Aldrich, EC 3.1.1.3, Novozyme 435) (Esquema 5).
El medio de reacción consiste en una suspensión del compuesto 27 y del extracto enzimático o de la lipasa correspondiente, en metanol o en metanol deuterado (CD3OD). Una vez que se da por finalizada la reacción, las proporciones entre los distintos compuestos detectados en el crudo de reacción (compuestos 27-29) se obtienen a partir del correspondiente espectro de ^-RMN en CD3OD, tras la eliminación del extracto enzimático o de las enzimas correspondientes.
Figure imgf000041_0001
27 28 29
Esquema 5
El extracto enzimático procedente de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) sólo permitió un 28% de conversión (Tabla 3) tras 12 h de reacción. Dicha conversión resultó ser totalmente regioselectiva, ya que sólo se observó la presencia del compuesto 28 (derivado metil 6-O-acetil-a-D-glucopiranósido), junto con el compuesto 27 utilizado como materia prima (72%).
Destacan los extractos enzimáticos procedentes de los cultivos de Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), que mostraron un 84 y un 86% de conversión, respectivamente en un tiempo de reacción sensiblemente inferior (6 h). Dichos extractos enzimáticos muestran una tendencia elevada a la desacetilación completa, para dar el compuesto 29 (metil α-D-glucopiranósido), que se encuentra en una proporción en la mezcla del 64% o del 65%, respectivamente. El compuesto 28 que es el derivado acetilado en C-6 se encuentra en una proporción del 20 y 21 %, respectivamente.
Las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antárctica, estando esta última soportada sobre resina acrílica, no condujeron a reacción alguna, a pesar de llevar a cabo la reacción a una temperatura sensiblemente superior (hasta 60 °C) y usar una mayor proporción de enzima (hasta 1.5 veces el peso del monosacárido).
Tabla 3. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 27 5 000062
40
Figure imgf000042_0001
Desacilación del compuesto 27 (metil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranósido).
Una suspensión del compuesto 27 (6.0 mg, 17 μηιοΙ) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en CD3OD (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En el caso de las lipasas procedentes de P. cepacea y C. antárctica soportada sobre resina acrílica, se usó una relación monosacárido/lipasa 1 :1.5, una temperatura de 60 °C y un tiempo de reacción de 22 h. En la Figura 3 se muestra el espectro de 1H-R N de la mezcla de reacción [1H- RMN (300 MHz, CD3OD)]; los resultados se muestran en la Tabla 3.
Ejemplo 5.2.
Los sobrenadantes de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, también permiten la desacetilación parcial del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada), usando las mismas condiciones que en el caso del monosacárido 27 (Esquema 6).
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Esquema 6
Los extractos enzimáticos de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT8462) y Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), permitieron una conversión entre el 89-91 % en un tiempo de reacción comprendido entre 7-12 h (Tabla 4). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en los sobrenadantes de los cultivos de las cepas mencionadas anteriormente por llevar a cabo la desacetilación sobre uno de los anillos de glucopiranosa (Tabla 4), permitiendo la detección de dos compuestos nuevos, el compuesto 31 (2,3,4,6,6'-penta-0-acetil-oc,oc-D-trehalosa) (26-35%) y el compuesto 32 (2,3,4,6-tetra-0-acet¡l-oc,oc-D-trehalosa) (38-40%), de los que no existen antecedentes en el estado de la técnica.
Cabe destacar, además, que el compuesto 32 es el resultado de una desimetrización en tan sólo dos etapas (acetilación y desacetilación selectiva) de la trehalosa. La desimetrización es el proceso mediante el cual se consigue que la trehalosa per-O- acetilada 30 pierda su simetría original y se transforme en 31 y 32, donde una unidad de azúcar se encuentra acetilada y la otra total o parcialmente desacetilada. Este proceso se ha conseguido en dos etapas (acetilación de la trehalosa comercial y desacetilación regioselectiva con el extracto enzimático de la invención y representa un número de 2015/000062
42 etapas muy inferior con respecto a cualquier ruta puramente química conocida y utilizada en el estado de la técnica para el mismo fin.
Tabla 4. Proporciones encontradas para la desacetil ación del compuesto
30 (trehalosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales
Figure imgf000044_0001
Este mismo ensayo también se llevó a cabo con fines cuantitativos utilizando el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), lo cual permitió el aislamiento de los compuestos 31 y 32 (29% y 49%, respectivamente, tras purificación cromatográfica) y su caracterización.
Es destacable que los compuestos 31 y 32 pueden emplearse como materias primas en la preparación de glicolípidos derivados de trehalosa, que presentan interés como vacunas frente a la tuberculosis, provocada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis (M. Gilleron et al. J. Exp. Med. 2004, 199, 649-659).
De nuevo, cuando la reacción se llevó a cabo usando las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antárctica soportada sobre resina acrílica, no se observó reacción alguna. Desacilación del compuesto 30 (per-0-acet¡l-a,oc-D-trehalosa)
Método A. Una suspensión de per-0-acetil-a,a-D-trehalosa (compuesto 30) (6.0 mg, 8.8 μηιοΙ) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en CD3OD (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 4 se muestra el espectro de 1 H-RMN de la mezcla de reacción [1 H-RMN (500 MHz, CD3OD)]; los resultados se muestran en la Tabla 3.
Método B. Una suspensión de per-O-acetil-a.a-D-trehalosa 30 (60.0 mg, 88,0 μηηοΙ) y el sobrenadante del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21 -6 CECT 8464 (30.0 mg) en MeOH (20 mL) se agita a temperatura ambiente durante 3.5 h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CI2→ CH2CI2-MeOH 1 :2) para dar lugar a 31 y 32 como sirupos.
2,3,4,6,6' -Penta-0-acetil-a,a-D-trehalosa (compuesto 31 )
Figure imgf000045_0001
Rendimiento: 14 mg (29%). 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 5.57 (dd, 1 H, J2,3= 10.2 Hz, J3,4= 9.5 Hz, H-3), 5.30 (d, 1 H, J1i2= 3.7 Hz, H-1 ), 5.07 (dd, 1 H, J4,5= 10.3 Hz, H-4), 5.04 (d, 1 H, J 2 - 3.7 Hz, H-1 '), 4.94 (dd, 1 H, H-2), 4.43 (ddd, 1 H, J5,ea= 4.1 Hz, J5,6b= 2.4 Hz, H-5), 4.28 (dd, 1 H, Js¡(sa.= 2.0 Hz, J6a ,6b = 1 1.7 Hz, H-6a'), 4.24 (dd, 1 H, J6a 6b= 12.4 Hz, H- 6a), 4.15 (dd, 1 H, J5. eb.= 7.3 Hz, H-6b'), 4.12 (dd, 1 H, H-6b), 3.82 (ddd, 1 H, J4.5-= 9-7 Hz, H-5'), 3.74 (dd, 1 H, J2 ,3 = 9.7 Hz, J3.4.= 9.1 Hz, H-3'), 3.51 (dd, 1 H, H-2'), 3.26 (dd, 1 H, H- 4'), 2.08, 2.05 (x2), 2.01 , 2.00 (5s, 3H cada uno, 50Ac); 13C-RMN (125.7 MHz, CD3OD) δ 172.7, 172.4, 171.7, 171.5, 171.3 (5 CO), 96.3 (C-1 '), 92.8 (C-1), 74.6 (C-3'), 72.8 (C-2'), 72.2 (C-5'), 72.0 (C-4'), 71.9 (C-2), 71.5 (C-3), 69.9 (C-4), 69.1 (C-5), 65.0 (C-6'), 62.9 (C- 6). 2,3,4,6-Tetra-0-acetil- -D-trehalosa (compuesto 32).
Figure imgf000046_0001
Rendimiento: 22 mg (49%).1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 55.55 (dd, 1H, J2¡3= 10.2 Hz, JZA= 9.5 Hz, H-3), 5.34 (d, 1H, J,,2= 3.7 Hz, H-1), 5.07 (dd, 1H, J4¡5= 10.3 Hz, H-4), 5.05 (d, 1H, Jr,2= 3.3 Hz, H-1'), 4.96 (dd, 1H, H-2), 4.46 (ddd, 1H, J5fia= 3.8 Hz, J5,6b= 2.4 Hz, H-5), 4.23 (dd, 1H, JBa,Bb= 12.4 Hz, H-6a), 4.12 (dd, 1H, H-6b), 3.75 (dd, 1H, J5.tW= 2.1 Hz, « = 11-3 Hz,H-6a'), 3.75 (t, 1H, J3-,4~ 9.7 Hz, H-3'), 3.70 (ddd, 1H, J4-,s-= 9.8 Hz, Js.tW = 5.7 Hz, H-5'), 3.65 (dd, 1H, H-6b'), 3.50 (dd, 1H, H-2'), 3.31 (m, 1H, H-4'), 2.06, 2.05, 2.01, 1.99 (4s, 3H cada uno, 40Ac); 13C-RMN (125.7 MHz, CD3OD) δ 172.4, 171.7, 171.6, 171.3 (4CO), 96-8 (C-1'), 93.3 (C-1), 74.7 (C-3', C-5'), 72.9 (C-2'), 71.7 (x2), 71.6 (C-2, C- 3, C-4'), 69.9 (C-4), 69.0(C-5), 62.9 (C-6), 62.6 (C-6').
Ejemplo 5.3
En la presente invención también se llevó a cabo el proceso de desacetilación parcial del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) (Esquema 7), usando las mismas condiciones que en el caso del monosacárido 27.
Figure imgf000047_0001
Esquema 7
Los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de Terribacillus sp. AE2B122 (CECT 8231 ), Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464) permitieron una conversión comprendida entre el 82-90% (Tabla 5). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en dicho sobrenadantes por llevar a cabo la desacetilación del anillo de fructofuranosa (Tabla 5), permitiendo la detección de los compuestos 35 (2,3,4,6, 1 ', 6'- hexa-O-acetilsacarosa) y 36 (2,3,4,6,6'-penta-0-acetilsacarosa).
Adicionalmente, se observó una mayor conversión (90%) en un tiempo de reacción inferior (4h) para el caso del sobrenadante obtenido del cultivo de la cepa de Terribacillus sp. AE2B122 (CECT 8231 ).
Tabla 5. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales
Porcentaje calculado (RMN)
Microorganismo/Lipasa t (h)
34 35 36
CECT 8231 10% 38% 52% 4
CECT 8462 18% 43% 39% 7.5
CECT 8464 14% 44% 42% 8.5
Lipasa P. cepacea 100% 0% 0% 10
(Sigma-Aldrich, EC 232-619-9)
Lipasa C. antárctica 100% 0% 0% 10
(Novozyme 435)
Para el aislamiento de los compuestos mencionados previamente, también se realizó este mismo ensayo con el sobrenadante obtenido de los cultivos de Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) y se efectuó una purificación cromatográfica, para dar lugar a los compuestos 35 (26%) y 36 (27%).
Con las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antárctica soportada sobre resina acrílica, tampoco se observó reacción alguna para este sustrato.
Desacilación de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34)
Método A. Una suspensión de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34) (6.0 mg, 8.8 μπιοΙ) y el sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en CD3OD (1 .0 ml_) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 5 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción [ H- RMN (500 MHz, CD3OD)]; los resultados se muestran en la Tabla 4.
Método B. Una suspensión de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34) (50.0 mg, 74 μπιοΙ) y el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (25.0 mg) en MeOH (16.0 ml_) se agita a temperatura ambiente durante 4h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CI2 → CH2CI2-MeOH 1 :2) para dar lugar al compuesto 35 (1 1.2 mg, 26%) y al compuesto 36 (10.9 mg, 27%) como sirupos. Ejemplo 5.4. Acilación regioselectiva de carbohidratos
Los extractos enzimáticos de las cepas bacterianas descritas en la presente invención también permiten las reacciones de acilación regioselectiva de carbohidratos. Así, por ejemplo la acilación, preferentemente acetilación del compuesto 29 (metil a-D- glucopiranósido) usando acetato de isopropenilo como agente acilante, el extracto enzimático de Bacillus stratosphericus como catalizador enzimático y DMF como co- disolvente (Esquema 8), ha dado lugar a la obtención de los compuestos 37 y 28, que presentan grupos acilos en las posiciones 4 y 6, respectivamente.
Figure imgf000049_0001
Esquema 8
A pesar de llevar a cabo calentamientos prolongados (60 °C durante 105 h), la conversión es del 49%, aunque con una alta regioselectividad, ya que se observa la presencia del producto monoacetilado en C-6 (compuesto 28) (13%), y el compuesto 37 (metil 4,6-di-O- acetil-a-D-glucopiranósido) como derivado acetilado mayoritario (36%), no detectado en los correspondientes ensayos de desacetilación.
Acilación del metil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranósido (compuesto 29)
Una disolución del compuesto 29 (6.0 mg, 0.017 mmol), el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacillus sp. HR21 -6 CECT 8464 (3.0 mg) y acetato de isopropenilo (0.5 ml_) en DMF (0.3 ml_) se calienta con agitación a 60 °C durante 105 h. A continuación se concentra a sequedad y el residuo se analiza mediante 1H-RMN, mostrando una mezcla de los compuestos 28, 29 y 37 en una proporción de 13%, 51 % y 36%, respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa microbiana de Bacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8464.
2. Extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de la cepa bacteriana descrita según la reivindicación 1.
3. Extracto enzimático según la reivindicación 2, caracterizado por que está concentrado y/o dializado.
4. Extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 caracterizado por que el extracto enzimático está liofilizado.
5. Extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que el cultivo además comprende un sustrato lipídico.
6. Extracto enzimático según la reivindicación 5 donde el sustrato lipídico se selecciona de entre surfactantes, triglicéridos o aceites esenciales.
7. Uso de la cepa bacteriana según la reivindicación 1 , o del extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 como catalizador para reacciones enzimáticas de acilación y/o desacilación de compuestos.
8. Uso según la reivindicación anterior, donde los compuestos son polifenoles y/o carbohidratos.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, donde las reacciones son regioselectivas. Método para obtener derivados adiados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:
a) poner el extracto enzimático descrito según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados adiados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente; y b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa a).
Método según la reivindicación 10, donde los polifenoles del paso a) son hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenillgicol, alcohol protocateuico o cualquiera de sus derivados acilados.
Método según la reivindicación 10 donde los carbohidratos del paso a) se seleccionan de entre mono-, di-, oligo-, polisacáridos o cualquiera de sus derivados acilados, preferiblemente metil-a-D-glucoporanósido per-O- acetilado, tetrahelosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada.
Método según la reivindicación 10 u 11 , donde la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso a) es un derivado acetilado de hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenillgicol o alcohol protocateuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.
Método según la reivindicación 13, donde la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso a) es hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metanol.
Método según la reivindicación 13, donde la reacción enzimática es de desacilación de los hidroxilos aromáticos, el polifenol del paso a) es 3,4- dihidroxifenilglicol tetraacilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación en la posición bencílica.
16. Método según la reivindicación 13, donde la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso a) es alcohol protocatecuico peracilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación de la posición bencílica.
17. Método según la reivindicación 10 u 11 , donde la reacción enzimática es de acilación, el polifenol del paso a) es hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenillgicol o alcohol protocateuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente acilante y opcionalmente de un co-disolvente.
18. Método según la reivindicación 17 donde el agente acilante es acetato de isopropilo o acetato de vinilo y/o el co-disolvente es DMF.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, donde la reacción enzimática es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-D- glucopiranósido per-O-acetilado, trehalosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada y la reacción se lleva a cabo en presencia de alcohol alifático opcionalmente metanol deuterado a temperatura ambiente.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, donde la reacción enzimática es de acilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-D- glucopiranósido y la reacción se lleva a cabo en presencia de acetato de isopropenilo y DMF a una temperatura de entre 50-70°C.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUALLAGUI Z ET AL.: "Hydroxytyrosol acyl esters: Biosynthesis and activities", APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 163, no. 5, March 2011 (2011-03-01), pages 592 - 599, XP055235500, ISSN: 0273-2289 *
GUPTA APOORVA ET AL.: "Biotransformation of Polyphenols for Improved Bioavailability and Processing Stability", ADVANCES IN FOOD AND NUTRITION RESEARCH, vol. 69, SAN DIEGO, pages 183 - 207, ISSN: 1043-4526, ISBN: 978-0-12-410540-9 *
ISHIMOTO RYO ET AL.: "Screening and characterization of trehalose-oleate hydrolyzing lipase", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 195, no. 2, 20 February 2001 (2001-02-20), pages 231 - 235, XP055235503, ISSN: 0378-1097 *
PAMELA TORRES ET AL.: "Regioselective lipase catalized synthesis of 3-O-acyl derivatives of resveratrol and study of their antioxidant properties", J. AGRIC FOOD CHEM, vol. 58, no. 2, 27 January 2010 (2010-01-27), pages 807 - 813, XP055235501 *
T. RAKU ET AL.: "Enzymatic synthesis of trehalose esters having lipophilicity", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 100, no. 3, 2003, pages 203 - 208, XP055235496 *

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