WO2015155490A1 - Modèle animal présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant pour le récepteur membranaire patched ou ptc - Google Patents

Modèle animal présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant pour le récepteur membranaire patched ou ptc Download PDF

Info

Publication number
WO2015155490A1
WO2015155490A1 PCT/FR2015/050981 FR2015050981W WO2015155490A1 WO 2015155490 A1 WO2015155490 A1 WO 2015155490A1 FR 2015050981 W FR2015050981 W FR 2015050981W WO 2015155490 A1 WO2015155490 A1 WO 2015155490A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ptc
cells
stem cells
glast
neural stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2015/050981
Other languages
English (en)
Inventor
Martial Ruat
Elisabeth Traiffort
Julien FERENT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2015155490A1 publication Critical patent/WO2015155490A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the invention relates to an animal model and its uses.
  • Hedgehog signaling molecule belongs to a family of morphogens (Ingham et al., 2001, Dev Biol, 330 (2); 3059-87) comprising three members (Sonic Hedgehog (Shh), Desert Hedgehog and Indian Hedgehog) homologues to the product of the Hh segmental polarity gene in Drosophila.
  • Shh is synthesized as a precursor that undergoes a series of post-translational modifications during which the protein is cleaved by an enzymatic activity present in its C-terminal portion. This autoproteolysis generates a C-terminal fragment (ShhC) and the biologically active N-terminal fragment (ShhN).
  • the latter is modified by the addition of a C-terminal cholesterol molecule and a fatty acid molecule to the deprotected N-terminal cysteine residue after removal of the signal peptide (Varjosalo et al., 2008).
  • the secretion of the ShhN protein depends on its interaction with other proteins. This is the case of the Dispatched protein which is similar to the family of carriers having a sterol sensor domain, but also components of the extracellular matrix such as heparan sulfate proteoglycans.
  • the formation of oligomeric forms of ShhN or the release of the molecule by proteolysis of its two ends have also been proposed.
  • ShhN transmits its action via a complex containing two transmembrane proteins: Patched (Ptc) a protein with 12 trausmembrane domains (TM) presenting a transporter-like structure and Smoothened (Smo) a protein with 7 TM domains to the members of the G protein-coupled receptor superfamily (GPCR).
  • Ptc Patched
  • TM trausmembrane domains
  • Smo Smoothened
  • the intracellular cascade following the fixation of Shh on Ptc and the removal of the inhibition exerted by Ptc on Smo are accompanied by the accumulation of Smo in a specific organelle, the primary eyelash.
  • Many intracellular factors including Suppressor of Fused (SuFu) and PKA proteins, but also Gli transcription factors are also translocated into the eyelash. This targeting to the eyelash is necessary for the conversion of Gli factors into activating forms that will lead to the transcriptional activation of target genes such as Pic and Gli 1.
  • Hh has been associated with the processes of maintenance and repair of normal tissue, spatiotemporal regulation of cell proliferation and differentiation. Morphogen has been involved in the development of the central nervous system. The essential role of Hh signaling is evidenced by the dramatic consequences of Hh deficient signaling in the human fetus observed in the holoprosencephaly syndrome. More recently, the Shh pathway has been identified in the adult brain, where the aminoterminal active form of the molecule is expressed in many regions of the mature nervous system suggesting new roles for this pathway. This one participates notably in the establishment and the maintenance of the neurogenic niches.
  • Shh regulates the proliferation of oligodendrocyte precursors in the uninjured brain and is a positive regulator of oligodendrocytes during the repair of demyelinated brain tissue.
  • the modulation of the Shh signaling pathway is therefore an issue in the treatment of demyelinating diseases such as multiple sclerosis, but also other neurodegenerative diseases.
  • demyelinating diseases such as multiple sclerosis, but also other neurodegenerative diseases.
  • these assumptions are based on the survival and differentiation activities induced by Shh alone or in the presence of other growth factors.
  • Shh is also able to reduce in vitro the electrical activity of subthalamic nucleus neurons involved in Parkinson's disease.
  • studies have highlighted the positive effects of the activation of the pathway by the Shh protein itself, on the behavioral disorders observed in a model of this same pathology.
  • Shh signaling pathway Malfunctions of the Shh signaling pathway have also been associated with many cancers.
  • inactivating mutations of Ptc are associated with Gorlin's syndrome or basocellular naevomatosis, an autosomal dominant disease characterized by cranofacial and cerebral malformations, but especially by the high incidence of various tumors, more particularly cutaneous basal cell carcinomas.
  • Sporadic forms of medulloblastomas and basal cell carcinomas have also been associated with mutations in human Ptc or Smo genes.
  • Shh mutations have also been identified in basal cell carcinomas.
  • Other types of tumors have also been associated with a defect in the Hh signaling pathway.
  • tumors are closely correlated with the expression sites of the pathway components during embryonic development.
  • Meningiomas associated with Ptc mutations glioblastomas associated with Gli mutations
  • gastrointestinal cancers in particular primary cancers of the stomach and colon
  • cancers of the prostate, bladder, ovary cancers of the prostate, bladder, ovary
  • rhabdomyosarcomas cancers small cell lung.
  • transgenic animals Pic ' ' For example, the international application WO 99/61582 teaches transgenic animals Pic ' '. These animals die at the embryonic stage because of a defect of closure of the neural tube and for reasons of cardiac malformation.
  • One of the objects of the invention is to obviate these disadvantages by proposing model animals for studying in vivo the function of wild Ptc, especially in the brain.
  • Another object of the invention is to propose a method for invalidating the Ptc gene making it possible to control the expression of said gene in space and in time.
  • the present invention relates to a non-human transgenic mammal having biallelic functional invalidation of the gene encoding the patched membrane receptor or Ptc in neural stem cells and / or glial cells, said mammal having a total body mass at least 30% less than the total body mass of said transgenic mammal not exhibiting functional invalidation of said gene encoding the Ptc membrane receptor in said neural stem cells and / or in said glial cells, said mammal having a wild genotype for the Ptc gene, with the exception of the cells neural stem and / or glial cells that have a PTC genotype ". '"
  • the inventors have devised an animal model showing an invalidation of the specific Patched gene in certain cells, making use of the techniques of transgenesis and sexual crossing of animals.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that adult animals invalidated for the Patched gene (Ptc) do not develop tumors and have a reduced mass.
  • Ptc Patched gene
  • An example of reduction of the mass of transgenic mice according to the invention is given by way of illustration below.
  • the inventors have also made the unexpected finding that deletion, or functional invalidation, of the Ptc gene had the consequence of inhibiting the differentiation of stem cells and thus increasing their number.
  • deletion, or functional invalidation, of the Ptc gene had the consequence of inhibiting the differentiation of stem cells and thus increasing their number.
  • wild type genotype for the Ptc gene is meant in the invention the fact that the Ptc gene is expressed normally. This means that the Ptc gene is unmodified, or that the gene has been modified, for example by inserting exogenous sequences, or by introducing mutations, which do not affect the expression of the gene or the function of the product. that is, the function of the Ptc receiver.
  • An example of wild type genotype would be an insertion on either side of the Ptc gene of Lox type recombination sequences. These sequences modified the gene sequence of the gene, but did not affect, before recombination, either the expression of the gene or the function of the receptor.
  • the invention relates to an adult nonhuman transgenic mammal exhibiting a biallelic functional invalidation of the gene coding for the patched membrane receptor or Ptc in neural stem cells and / or in glial cells, said mammal having a total body mass of at least 30. % less than the total body weight of said transgenic mammal not exhibiting functional invalidation of said gene encoding the Ptc membrane receptor in said neural stem cells and / or in said glial cells.
  • “functional invalidation” is understood to mean any genetic or epigenetic action making it possible to inhibit the expression of one or more genes or having the effect of rendering the product of a gene devoid of its activity.
  • the functional invalidation passes by the total or partial deletion of one or more coding sequences of a gene having the effect of inhibiting the expression of the product of said gene, or of allowing the expression of a product not exhibiting plus its biological properties (loss or modification of enzymatic activity, loss or modification of its three-dimensional conformation ).
  • the deletion of genes in animals generally involves the technique of "Knock-out” which consists in excising all or part of a gene (in particular the deletion of one or more exons) in order to suppress its expression or to suppress the activity of the protein that it codes.
  • knock-in techniques, which consist of introducing a genetic element in a specific gene in a targeted way in order either to inhibit the expression or to modify the reading frame, so that the product of said gene is then non-functional.
  • non-human transgenic animals of the invention are therefore homozygous for the deletion of the Ptc gene in neural stem cells and / or glial stem cells.
  • the invention does not concern non-human transgenic animals heterozygous for the Ptc gene, that is to say animals of Ptc + / - genotype, in particular of animals whose neural and / or glial stem cell genotype is Ptc + / ⁇
  • invalidation techniques are well known to those skilled in the art, such as, for example, random mutagenesis using DNA modifying chemicals.
  • the invention advantageously relates to "an adult non-human transgenic mammal”.
  • transgenic animal in the invention a genetically modified animal whose genetic heritage has been modified by humans.
  • transgenic mammals do not concern humans.
  • an adult non-human transgenic mammal is meant in the invention a biologically stable mammal having reached sexual maturity and therefore likely to reproduce, if it is fertile.
  • the mammal according to the invention is in particular a rodent, in particular a rat or a mouse, or a laboratory animal (dog, cat, monkey, rabbit, hamster ). More particularly, the transgenic mammal according to the invention is a rodent, in particular a mouse.
  • the invention relates to a non-human transgenic mammal as defined above, wherein said neural stem cells and / or said glial cells are cells expressing the Glast neural gene.
  • animals no longer expressing a Patched receptor in neural stem cells or glial cells, or expressing a non-functional form of the Patched gene have a mass reduced by at least 30% less than the same one. animal expressing the Patched gene in said neural stem cells and glial cells.
  • At least 30% below means at least 30%, at least 31%, at least 32%, at least 33%, at least 34%, at least 35%, at least 36%, at least less than 37%, at least 38%, at least 39%, at least 40%, at least 41%, at least 42%, at least 43%, at least 44%, at least 45%, at least 46%, at least less than 47%, at least 48%, at least 49% or at least 50%. More preferably, animals no longer expressing a Patched receptor in neural stem cells or glial cells, or expressing a non-functional form of the Patched gene, have a reduced mass of 30% to 40% less than the same animal expressing the Patched gene in said neural stem cells and glial cells.
  • the invention relates to a non-human transgenic mammal having a functional invalidation of the gene encoding the patched membrane receptor or Ptc in neural stem cells and / or in glial cells, said mammal having a total body mass of at least 30%, but at most 40%, less than the total body mass of said transgenic mammal not exhibiting functional invalidation of said gene encoding the Ptc membrane receptor in said neural stem cells and / or in said glial cells.
  • Neural stem cells are multipotent stem cells, capable of self-renewal, whose differentiation potential is restricted to neural cell types, including: neurons, astrocytes and oligodendrocytes.
  • these neural stem cells are located in the ventricular zone of the neural tube. They generate all the cell types needed by the central nervous system (with the exception of microglia) by a process called neurogenesis.
  • glial cells In the nervous system, glial cells are the cells that form the environment of neurons. They maintain homeostasis, produce myelin and play a role in supporting and protecting nervous tissue by providing nutrients and oxygen, removing dead cells and fighting off pathogens. Glial cells represent about 50% of brain volume and almost 90% of brain cells. There are usually four main types of glial cells: astrocytes, oligodendrocytes, Schwann cells and microglia.
  • Glast (for GLutamate ASpartate Transporter), also known as EAAT1 (for Excitatory Amino Acid Transporter 1), is a protein that is predominantly expressed on the cell membrane and purifies glutamate from the extracellular space. Glast is expressed in the central nervous system and especially in astrocytes.
  • the invention relates to a non-human transgenic mammal as defined above, wherein said glial cells are cells expressing the neural Glast gene, and in particular astrocyte cells.
  • the invention relates to a transgenic mammal as defined above, said mammal having a genotype Glast-CreERT2; Ptc 1 / l , with the exception of neural stem cells and glial stem cells which have a Glast-CreERT2 genotype; Ptc " ' ⁇
  • CreERT2 In order to perform the functional invalidation of Ptc, the inventors took advantage of the Cre recombinase-based invalidation system and its ability to excise nucleic sequences between the LoxP target sequences. In addition, in order to perform a specific invalidation, the inventors have made use of the use of an inducible Cre recombinase: CreERT2.
  • CreERT2 recombinase - allowing the spatio-temporal control of somatic mutagenesis - has become in recent years the technological reference for the in vivo study of mechanisms of action and gene expression, by controlled excision of nucleic acids. between the LoxP sequences. CreERT2 is a fusion between Cre recombinase and the ligand binding domain of the estrogen receptor.
  • Cre ERT2 Spatial control of genetic modifications requires the use of a tissue-specific promoter that controls the expression of Cre recombinase.
  • the enzyme was fused to a new mutated DNA binding domain of the human estrogen receptor (ERT2).
  • ERT2 has no recombinase activity, and is therefore not able to excise nucleic acids between LoxP sequences.
  • Cre ERT2 fusion protein is able to enter the cell nucleus and create genetic modification.
  • ERT2 binds to tamoxifen but not to endogenous estrogen which allows the CreERT2 fusion protein to remain cytoplasmic in untreated animals with tamoxifen.
  • the temporal control by tamoxifen makes it possible to create the genetic modifications at a precise moment of development, at a time defined by those skilled in the art.
  • the inventors in order to specifically target the invalidation of Patched in neural stem cells and glial cells, and in particular astrocyte cells, the inventors have used a CreERT2 placed under the control of the promoter of the Glast gene (also called Glast promoter invention), the expression product of which is found in said neural and glial stem cells.
  • a CreERT2 placed under the control of the promoter of the Glast gene (also called Glast promoter invention), the expression product of which is found in said neural and glial stem cells.
  • transgenic mice junction for Ptc gene bordered by LoxP sequences of genotype Ptc l / l with transgenic mice having inserted at the locus Glast the gene of the recombinase Cre inducible to tamoxifen, of genotype. GLAST-CreERT2.
  • the offspring is selected so that the animals have both types of transgenes: Glast-CreERT2 and Ptc TM. The genotype of these animals is therefore Glast-CreERT2; PTC TM.
  • the Glast gene expresses itself. Also, Cre CreRE2 recombinase is also expressed and is activatable by tamoxifen. These cells will therefore invalidating the PTC gene and will GLAST genotype-CreERT2; Ptc " ⁇
  • the invention relates to a transgenic animal as defined above, said mammal having a genotype Glast-CreERT2; Ptc 1 / l , with the exception of neural stem cells and glial stem cells which have a genotype Glast-CreERT2; Ptc " ' " and express one or more markers allowing that is not expressed in other cells, including cells expressing said Ptc receptor.
  • transgenic animals In order to follow recombination by Cre recombinase, it may be advantageous to have the above-mentioned transgenic animals also having one or more inducible transgenes which will be expressed or activated when the Cre recombinase will be activated by tamoxifen.
  • an advantageous marker is a transgene encoding the yellow fluorescent protein (YFP) having a stop codon surrounded by LoxP sequences.
  • This transgene can be placed under the control of a ubiquitous promoter, in particular the promoter of the ROSA26 gene.
  • Such animals are known to those skilled in the art.
  • the animals possessing said Cre recombinase inducible recombinant YFP protein are in particular the B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / + mice available under number 006148 at the Jackson Laboratory.
  • the mammal according to the invention has a genotype Glast-CreERT2; Ptc l / l , R26R-YFP / +, and the cells express Ptc but do not express the yellow fluorescent protein or YFP, while the neural stem cells and cells Glial strains no longer express Ptc but express YFP.
  • transgenic animal makes it possible to follow the expression of the Cre recombinase to identify the cells in which the recombination has occurred. It is also possible to follow the progeny of the cells that have undergone recombination, and more broadly to follow the evolution, in vivo, of the recombinant cells during the development or adult life of the animal.
  • the invention relates to a transgenic mammal as defined above, wherein despite the reduction of the total body mass of said mammal, said mammal has a brain substantially similar to that of said transgenic mammal having no invalidation of said gene encoding the Ptc membrane receptor in said neural stem cells and / or in said glial cells.
  • the inventors have found that functional invalidation of Ptc in neural stem cells and in glial cells, in particular astrocyte cells, has the consequence of reducing the total mass of animals.
  • the overall mass of the brain of transgenic animals, especially adults, according to the invention is not different from the control animals which do not have functional invalidation of Ptc in neural stem cells and cells. glia.
  • substantially similar is meant in the invention a non-exact similarity which may be due to the individual variability of the animals. It can be considered that two brains have essentially similar masses if they have more or less five per cent the same mass.
  • the brains of the transgenic animals according to the invention are enriched in neural stem cells with respect to animals which do not show invalidation of the Ptc gene.
  • the invention also relates to an isolated cell genotype GLAST-CreERT2; Ptc " ' ⁇
  • the invention further relates to the above cells, said cells atant neural stem cells or glial cells.
  • Glast-CreERT2 cells Ptc " ' " are new. These cells are particularly genotype neural stem cells GLAST-CreERT2; Ptc " ⁇ These cells can be isolated from transgenic animals as defined above.
  • the invention relates to an isolated cell of genotype Glast-CreERT2; Ptc " ' " obtainable from the aforementioned transgenic animal.
  • glial stem cells in particular astrocytes of genotype Glast-CreERT2; Ptc " ' " obtained from the transgenic animals according to the invention.
  • neural stem cells derived from transgenic animals it is possible to isolate and purify them according to the protocol defined by Daynac et al. (Daynac et al., Stem Cell Research (2013) 11, 516-528). Briefly, the brains of the animals are micro dissected and the cells are dissociated using a pipette. The cells are then labeled with antibodies directed against surface antigens specific for neural stem cells. For the mouse, the cells are labeled with anti-CD124, anti-LeX / CD15, anti-Glast and anti EGFR antibodies. If the aforementioned markers are coupled, directly or indirectly with fluorescent markers, it is possible to isolate neural stem cells by flow cytometry and cell sorting. This method will detect heterogeneous population cells that have the appropriate markers. Those skilled in the art are very familiar with these methods of cytometry.
  • the invention further relates to a non-human transgenic mammal having the genotype Glast-CreERT2; Ptc fl / fl .
  • the transgenic mammals Glast-CreERT2; Ptc l / l are mammals derived from the cross of Glast-CreERT2 mice and Ptc TM mice. These mammals are prerequisites for specific invalidation of Ptc gene tissues, including invalidation in neural stem cells and glial cells.
  • the invention further relates to an isolated cell genotype GLAST-CreERT2; Ptc l / l, this particular cell is obtainable from the transgenic mammal as defined above.
  • the abovementioned transgenic mammal is of the genotype Glast-Glast-CreERT2, Ptc1 / fl2 or of CreERT2 genotype, Ptc fl / fl , R26R-YFP / +.
  • the invention further relates to the use of tamoxifen for the invalidation, particularly in vitro, of the Ptc gene in mammalian cells of genotype Glast-CreERT2; Ptc l / l .
  • the invention also relates to the use of tamoxifen for obtaining a transgenic mammal as defined above.
  • the invention also relates to the in vitro use of tamoxifen for the invalidation of the Ptc gene in mammalian cells of genotype Glast-CreERT2; Ptc 1 / l .
  • tamoxifen has the effect of inducing the expression of the Cre CreRE2 recombinase, and of allowing the deletion of the Ptc gene sequences between the LoxP sequences.
  • tamoxifen also makes it possible to induce in vivo the deletion of Ptc in neural stem cells and glial cells, in mammals Glast-CreERT2; Ptc 1 / l , and thus to obtain mammals of genotype Glast-CreERT2 ; PTC l / l and of neural stem cells and / or glial stem cells, including astrocytic GLAST genotype-CreERT2; Ptc " ⁇
  • Tamoxifen is used in the context of the invention at a dose of 0.1 mg to 10 mg, in particular 1 mg in one or more injections when it is betrayed a transgenic animal, or directly in the culture medium. when it comes to cells in culture.
  • tamoxifen can be administered intraperitoneally, but also subcutaneously, intracranially, transdermally or any other well-known method of administration. skilled person. Also in the context of administration in animals, tamoxifen can be administered in one or more doses separated in time.
  • An advantageous dosage regimen consists of a daily administration for 3 to 7 consecutive days, in particular 5 consecutive days.
  • the invention also relates to the use of a transgenic mammal as defined above, for purifying neural stem cells.
  • the invalidation of Ptc has the particular effect of inhibiting the differentiation of neural stem cells. These neural stem cells will therefore accumulate and will therefore be more easily identifiable and purifiable. Also, the transgenic mammal as defined above is very useful for obtaining a larger population of neural stem cells compared to a mammal having no invalidation of the Ptc gene.
  • the invention also relates to a method for inhibiting the differentiation of neural stem cells, in particular in vitro, comprising a step of contacting neural stem cells previously obtained from a non-human transgenic mammal having the genotype Glast-CreERT2 Ptc 1 / l with tamoxifen.
  • CreERT2 has the effect of inhibiting the differentiation of neural stem cells of Glast-CreERT2 genotype; Ptc l / l . Also, if the neural stem cells, which have previously been isolated from a transgenic animal as defined above, are brought into contact, it is possible to inhibit their differentiation by incubating them with an effective dose of tamoxifen.
  • the cells will then express the CreERT2 recombinase and thus lose the expression of the Ptc gene.
  • Another aspect of the invention relates to the use of tamoxifen to induce blocking of differentiation, in particular in vitro, of neural stem cells or glial cells, said stem cells and neural cells having a genotype GLAST-CreERT2; Ptc " ' ⁇
  • the invention furthermore relates to a method for modulating, in vitro in particular, the expression of the Ptc gene in neural stem cells or in glial cells, in particular isolated stem cells, said method comprising a step of contacting said cells.
  • transgenic mammal according to the invention as a model for studying the Hh pathway.
  • this model in reintroducing the cells Ptc "" one or more effectors of the Ptc receptor to dissect the Hh pathway mechanism.
  • the animal model created by the inventors and object of the present invention also makes it possible to decrypt the mechanisms of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, ...
  • Another aspect that emerges from the invention is the blocking of the differentiation of neural stem cells.
  • the transgenic mammal according to the invention could therefore be used to screen compounds or molecules capable of removing the inhibition of the differentiation of neural stem cells that no longer express the Ptc gene.
  • a screening method could consist, for example, of bringing into contact a compound capable of removing the inhibition of differentiation induced by the absence of Ptc expression or activity with neural stem cells of genotype Glast. -CreERT2; Ptc " ' " .
  • Yet another aspect of the invention specifically relates to astrocyte cells.
  • the invention relates in this aspect to a method of studying the plasticity of astrocytes comprising the study of astrocytic cells that can be obtained from the transgenic animals mentioned above.
  • Cx cerebral cortex
  • LV lateral ventricle
  • Sp septal area
  • FIGS. 1A to 1C represent immunohistofluorescence sections indicating the presence of a population of Ptc + cells coexpressing the astroglial marker GFAP in the dorsal zone of the subependymal zone. The enlargements of the framed regions are presented under each figure. The bar represents 50 ⁇ .
  • Figure 1A shows a double marking GFAP and DAPI.
  • Figure 1B shows a double Ptc and DAPI marking.
  • Figure 1C shows a double labeling Ptc and GFAP.
  • FIGS. 2A to 2C show a double immunohistofluorescence on Ptc + / LacZ heterozygous mouse brain slides expressing the reporter on a Ptc allele using anti- ⁇ -galactosidase and anti-GLAST antibodies.
  • the enlargements of the framed regions are presented under each figure and show 3Gal + nuclei surrounded by a GLAST + signal (white arrow heads) or not (white and black arrow heads).
  • the bar represents 50 ⁇ .
  • Figure 2A shows a double GLAST and DAPI marking.
  • Figure 2B shows a double labeling ⁇ -Gal and DAPI.
  • Figure 2C shows the superposition of the markings of Figures 2A and 2B.
  • Figures 3A to 3F show YFP, GLAST and GFAP fluorescent signals of the subependymal region of Glast-CreERT2, R26R-YFP mice (control YFP) two months after administration of tamoxifen.
  • the white arrow indicates a cell co-expressing YP with either the Glast marker or the GFAP marker.
  • the squares correspond to enlargements of the region indicated by the arrow.
  • the nuclei are marked with DAPI.
  • the bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 3A shows double YFP and DAPI labeling.
  • Figure 3B shows a double Glast and DAPI labeling.
  • Figure 3C shows the superposition of the markings of Figures 3A and 3B.
  • Figure 3D shows a double YFP and DAPI marking.
  • Figure 3E shows a double marking GFAP and DAPI.
  • Figure 3F shows the superposition of the markings of Figures 3D and 3E.
  • FIGS 4A to 4E show in situ hybridizations of two hedgehog target genes: Ptc and GN1.
  • Ptc " ' " (Glast-CreERT2; Ptc l / l ) mice exons 8 and 9 are flanked by loxP sites.
  • exons 8 and 9 are deleted by tamoxifen activation of CreERT2 recombinase under the control of the Glast promoter (Galst-CreERT2) which is expressed from the endogenous Glast locus.
  • Ptc TM mice treated with tamoxifen are used in control. The animals are studied two months after tamoxifen treatment.
  • a Ptc del ribonucleic probe covering exons 8 and 9 of the Ptc gene is used to detect wild Ptc transcripts. This probe corresponds to half of the total length of the Ptc transcript and comprises the C-terminal portion.
  • the Ptc del, Ptc and Gli probe allow the detection of a weak marking previously described in the subependymal zone with a more intense marking in the ventral niche.
  • Ptc in the mouse "" strong Ptc and Gli signals are detected in the ventral and dorsal regions of the subependymal zone, while no signal is observed with the riboprobe Ptc del.
  • the framed regions correspond to an enlargement of the region indicated by a black square. The bar represents 200 ⁇ .
  • Figure 4A shows the labeling with the Ptc del probe on the control mice.
  • Figure 4B represents the labeling with the probe Ptc del on mouse Ptc " '”.
  • Figure 4C shows Ptc labeling on control mice.
  • FIG. 4D shows the PTC PTC marking on mice " '".
  • Figure 4E shows the GN1 labeling on the control mice.
  • 4F represents GN1 marking on PTC mouse "".
  • 5A and 5B show the detection by immunohistofluorescence of cell proliferation using an anti BrdU in mouse brain slides PTC "" and witnesses, handled a year earlier with tamoxifen and analyzed two hours after a short pulse from BrdU.
  • the bar represents 10 ⁇ .
  • Figure 5A shows double BrdU and DAPI labeling on control mice.
  • 5B shows a double labeling BrdU and DAPI on PTC mouse "".
  • FIG. 6 represents a histogram showing the evolution of the number of BrdU + and GFAP + cells in the subependymal zone after treatment with tamoxifen.
  • the ordinate axis represents the number of BrdU + cells per mm 2
  • the x-axis represents the time after treatment: 10 days, 2 months, 6 months and 1 year. ** p ⁇ 0.001.
  • 7A to 7F show photographs of immunohistofluorescence indicating expression of the receptor to the FE (EGFR) and PSA-NCAM in the subependymal region of the mouse indicator and Ptc "" one year after administration of tamoxifen .
  • CPu caudate putamen
  • LV lateral ventricle.
  • the bar represents 50 ⁇ .
  • Figure 7A shows EGFR labeling on control mice.
  • Figure 7C shows PSA-NCAM labeling on control mice.
  • Figure 7E shows triple EGFR, PSA-NCAM and DAPI labeling on control mice.
  • 7F is triple marking EGFR, PSA-NCAM and DAPI on PTC mouse "".
  • Fig. 8 is a graph illustrating and quantifying the results described in Figs. 7A-7F.
  • the y-axis represents the number of positive cells per mm 2 . ** p ⁇ 0.001.
  • 9A and 9B show immunohistofluorecences showing expression of GFAP gene in the subependymal region s control mice and PTC "" one year after treatment with tamoxifen.
  • the bar represents 50 ⁇ .
  • Figure 9A shows GFAP labeling in control mice.
  • 9B represents the GFAP staining using mouse PTC "".
  • Figure 10 is a graph illustrating and quantifying the results described in Figures 9A and 9B.
  • the y-axis represents the number of GFAP cells per mm 2
  • the y-axis represents the time after tamoxifen treatment (10 days, 2 months and 1 year).
  • Figures 11A to 11L are fluorescent micrographs of the subependymal region of adult control or Ptc " ' " mice . These micrographs show immunolabelings for Glast and GFAP / K167 as astrocyte markers and stem cells, Sox2 and Sox9. as transcription factors necessary for the formation of neural stem cells, EGFR and PSA-NCAM as a TAP marker and neuroblast migration.
  • BrdU markings indicate cellular proliferation.
  • the discontinuous lines delimit the barrier between the lateral ventricle, or corpus callosum, according to the indication, this corpus callosum; CPu, caudate putamen; LV, lateral ventricle.
  • the bar represents 100 ⁇ except for the double marking GFAP / KÎ67 where it represents 25 ⁇ .
  • Figure 11A shows double DAPI and Glast labeling on control mice.
  • Figure 11 B is double DAPI and GLAST marking on PTC mouse "".
  • Figure 11C shows the double labeling GFAP and Ki67 on the control mice.
  • Figure 11 D is the GFAP double labeling and Ki67 on PTC mouse "".
  • Figure 11E shows the double labeling Sox2 and DAPI on the control mice.
  • Figure 11 F is the double labeling Sox2 and DAPI on PTC mouse "".
  • Figure 11G shows the double labeling Sox9 and DAPI on the control mice.
  • Figure 11H shows the dual Sox9 and DAPI marking on mouse Ptc " '".
  • FIG. 11 shows the double EGFR and DAPI labeling on the control mice.
  • Figure 11 J is the double labeling EGFR and DAPI on mouse Ptc " '".
  • Figure 11 K shows the double labeling BrdU and PSA-NCAM on the control mice.
  • FIG. 12 represents a histogram showing the number of each cell type per mm 2 identified in FIGS. 11A to L. The values are means ⁇ standard deviation for 2 to 4 slides per animal for 3 to 4 animals. * p ⁇ 0.05.
  • 13A to 13H are fluorescence pictures of GLAST + cells in mice YFP-PTC "" or YFP-treated control two months ago with tamoxifen.
  • YFP is detected in the subependymal zone, the rostral migration current (RMS) and the olfactory bulb (OB). A lower density of YFP + cells is observed in the
  • FIG. 11B shows the double DAPI and YFP labeling on the control mice, in the rostral migration current.
  • FIG. 11C shows the double DAPI and YFP labeling on the control mice, in the granular olfactory bulb (GrO).
  • Figure 11D shows double DAPI and YFP labeling on control mice in the glomerular layer (Gl).
  • Figure 11 E shows DAPI double labeling and YFP on mouse Ptc "" in the subependymal area.
  • Figure 11 F is twice YFP and DAPI marking on PTC mouse "" in the rostral migratory stream.
  • Figure 11 G is twice DAPI marking and YFP on PTC mouse "" in Gro.
  • Figure 11H shows the dual DAPI and YFP marking on mouse Ptc "" in the Gl.
  • Figs. 14A-14C show histograms showing the density of YFP + cells in (14A) the subependymal region, (14B) Gro and (14C) Gl. The values are mean ⁇ standard deviation of 2 to 4 slides per animal, for 3 to 4 animals.
  • the x-axis represents the number of YFP + cells per mm 2 .
  • the gray columns represent the control animals, the black columns represent the PTC mouse "”.
  • Figures 15A to 15J show immunohistofluorescence using the NeuN, c-fos, Cb, TH markers, or in situ mybridations using a v-Glut2 probe on YFP-control or YFP-Ptc " " slides at the level of Olfactory bulb.
  • the white arrow heads show a double marking.
  • the bar represents 50 ⁇ .
  • Figure 15A shows the double labeling YFP and NeuN on control YFP mice.
  • Figure 15B shows the double YFP and c-fos labeling on YFP-control mice.
  • Figure 15C shows the double YFP and Cb labeling on YFP-control mice.
  • Figure 15D shows the double YFP and TH labeling on YFP-control mice.
  • Figure 15E shows the double labeling YFP and v-Glut2 on YFP-control mice.
  • Figure 15F is double marking YFP and YFP-NeuN on PTC mouse "".
  • Figure 15G is double YFP marking and c-fos on PTC-YFP mice " '".
  • FIG 15H shows double labeling YFP and YFP-Cb on mouse Ptc " '".
  • Figure 151 represents the double labeling YFP and YFP-TH on mouse Ptc " '".
  • Figure 15J is double marking YFP and v-Glut2 on PTC-YFP mice " '".
  • Figure 16 is a bar graph showing the percentage of each of the cells in the YFP population. *** p ⁇ 0.0005.
  • FIGS. 17A and 17B show brain blades made at the level of OB in control mice (17A) and Ptc " ' " (17B) treated one year earlier with tamoxifen, the slides are stained with eosin and hematoxylin. No alteration of the multilayer cellular architecture is observed in the OB.
  • the bar represents 200 ⁇ .
  • 18A to 18B respectively neurosphere formation tests using cells from control mice and mice PTC ""
  • the neurosphere cells from the subependymal zone are analyzed two months after the administration of tamoxifen.
  • the bar represents 100 ⁇
  • Figure 18C shows the expression of the GN1 gene from the neurospheres described in Figures 18A and 18B. Increased expression of GN1 in Ptc " ' " cells compared with control cells was observed.
  • Figure 19 shows the number of neurospheres obtained at each pass was analyzed by a linear regression model.
  • the rate of clonal expansion is represented by the slope of the curves (Ptc " ' " 0.256 ⁇ 0.047 vs control 0.226 ⁇ 0.016, p> 0.05).
  • Figure 20 is a graph showing the percentage of the total number of spheres obtained from 5000 cells seeded (138 for Ptc mouse "" and 98 to the control mice). The bars represent: in white the number of spheres of diameter greater than 100m, in light gray the number of spheres with a diameter of between 50 and 100 ⁇ , and in dark gray the number of spheres with a diameter of between 5 and 50 m.
  • Figure 21 is a graph showing the evaluation of the expression of progenitor cell markers (Sox2, Sox9 and Nestin) in cells from dissociated neurospheres 12h after seeding in the presence of growth factors. Quantification of each cell type indicates an increase in the number of Sox9 + and Nestin + cells. The average number of cells counted were 227 ⁇ 67 cells for Ptc "" and 356 ⁇ 147 for the control cells. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01.
  • FIGS 22-24 are histograms showing the differentiation potential of neurospheres from mouse Ptc "" and controls cultured 7 days without growth factors in the presence or absence of a pharmacological modulator Hh, including agonist Smo (SAG 0.3 ⁇ ) and an Smo antagonist (MRT-83, 3 ⁇ ).
  • the differentiated cells are analyzed by immunohistofluorescence using anti-Tuj1, anti-GFAP and anti ON2 antibodies to characterize neuronal cells ( Figure 22), astroglial cells ( Figure 23) and oligodendroglial cells ( Figure 24).
  • a significant decrease in the percentage of Tij1 + and Olig2 + cells is observed in Ptc " " cells compared to control cells.
  • the average number of cells for each marker is 1699 ⁇ 309 cells for Ptc "" and 3822 ⁇ 128 for the control cells.
  • the data are means ⁇ standard deviation of the percentage of DAPI + nuclei that express the markers. *** , p ⁇ 0.005; ns, not significant.
  • the black bars represent the Ptc " ' " cells, the gray bars represent the control cells.
  • Ptc deficiency increases the symmetrical division of neural stem cells by positively regulating the Notch signaling pathway.
  • Figures 25A-25H show tests for measuring the symmetry of cell divisions made from cells isolated from the subependymal zone of wild mice.
  • the cells are cultured for 24 to 36 hours in the presence of the indicated drugs.
  • the cells were labeled with Glast and EGFR as markers of expanding neural stem cells and transient progenitors.
  • the nuclei are marked with DAPI.
  • Figure 25A shows a double Glast and DAPI labeling.
  • Figure 25B shows a double EGFR and DAPI labeling.
  • FIG. 25C shows a double Glast and DAPI labeling, after treatment with SAG (0.3 ⁇ ).
  • FIG. 25D shows a double EGFR and DAPI labeling after treatment with SAG (0.3 ⁇ l).
  • FIG. 25E shows a double Glast and DAPI labeling, after treatment with LY411575 (10 ⁇ l).
  • FIG. 25F shows a double EGFR and DAPI labeling after treatment with LY411575 (10 ⁇ l).
  • FIG. 25G shows a double Glast and DAPI labeling after treatment with LY411575 (10 ⁇ ) and SAG (0.3 ⁇ ).
  • FIG. 25H shows a double labeling EGFR and DAPI, after treatment with LY411575 (10 ⁇ ) SAG (0.3 ⁇ ).
  • Figure 26 is a histogram showing the quantitative analysis of the percentage of each type of division. These data show that SAG treatment increases the number of symmetrical Glast + / EGFR-pairs compared to baseline drug-free conditions. This effect is counteracted by simultaneous treatment with a Smo and Notch antagonist, respectively MRT-83 and LY411575.
  • Figure 27 shows an increase in the expression of GN1 (D), Notch1 (A), and effectors of Notch Hes1 (B) and Hes5 (C) in isolated progenitors derived from the subependymal region of adult mice Ptc "" relative to control animals.
  • the results are presented in gel form presenting the results of semi-quantitative PCR. Actin- ⁇ is used as a charge control for RNAs.
  • Figures 28A to 28F represent a test for measuring the symmetry of cell divisions from isolated precursors derived from the subependymal region of mouse Ptc adults "" and controls, indicating that the cells expressing GLAST from mice Ptc "" generate Frequently, two Glast + precursors after 24 to 36h, compared to control cultures.
  • Figure 28A shows a symmetrical division of EGFR- cell, labeled with Glast and DAPI.
  • Figure 28B shows a symmetrical division of EGFR- cell, labeled with EGFR and DAPI.
  • Figure 28C shows a symmetrical division of EGFR + cell, labeled with Glast and DAPI.
  • Figure 28D shows a symmetrical division of EGFR + cell, labeled with EGFR and DAPI.
  • Figure 28E shows an asymmetric division of a Glast labeled cell and DAPI.
  • Figure 28F shows an asymmetric division of an EGFR labeled cell and DAPI.
  • Fig. 29 is a histogram showing the quantized data of the experiments presented in Figs. 28A and 28B.
  • Figures 30A-30D represent fluorescent labels BrdU and Ki67 of subependymal zone blades derived from Ptc mouse "" and controls which were treated with tamoxifen 2 months previously and which were analyzed 2h or 24h after a single injection of BrdU .
  • the arrowheads show the BrdU + Ki67- cells. The bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 30A shows a double BrdU / Ki67 labeling performed 2h after injection of BrdU on cells from control mice.
  • Figure B shows a double BrdU / Ki67 labeling performed 24 hours after injection of BrdU on cells from control mice.
  • Figure 30 C shows double labeling BrdU / Ki67 performed 2h after injection of BrdU to cells derived from mouse Ptc " '".
  • Figure 30 D shows double labeling BrdU / Ki67 performed 24h after injection of BrdU to cells derived from mouse Ptc " '".
  • Figure 31 shows the percentage of BrdU + cells in the population of dividing cells 2h after BrdU injection. The values are means ⁇ standard deviation of three experiments.
  • Figure 32 shows the percentage of BrdU + cells in the dividing cell population 24 hours after the BrdU injection. The values are means ⁇ standard deviation of three experiments. ** , p ⁇ 0.01
  • Figures 33A to 33C correspond to coronary views of the area showing subependymal cells which have incorporated BrdU 10j after removing the pump in animals Ptc "" or controls treated with placebo or AraC.
  • the animals received tamoxifen six months prior to the experiment.
  • the bar represents 100 ⁇
  • Figure 33A shows BrdU / DAPI labeling of control mice treated with placebo.
  • Figure 33B shows BrdU / DAPI labeling of control mice treated with AraC.
  • Figure 33C shows labeling BrdU / mouse DAPI PTC "" treated with placebo.
  • Figure 33D shows labeling BrdU / mouse DAPI PTC "" treated with AraC.
  • Figure 34 is a histogram showing the quantification of BrdU-labeled cells in control animals and in animals PTC "" ***, p ⁇ 0.0001; ns, not significant.
  • Figure 35 is an in situ hybridization of the Ptc transcript in the dorsal portion of the subependymal zone.
  • the bottom photo is an enlargement of the framed region of the top photo.
  • the bar represents 100 ⁇ .
  • Figures 36A-36C are immunohistofluorescent markings made at the dorsal portion of the subependymal area using anti-Ptc serum. The signals associated with Ptc + cells are observed in the subependymal zone.
  • Figure 36A shows the labeling with anti serum. The bar represents 25 ⁇ .
  • Figure 36B shows I labeling with DAPI.
  • Figure 36C shows the overlap of the markings.
  • Figures 37A-37C are immunohistofluorescent markings made at the dorsal portion of the subependymal area using anti-Ptc serum pretreated with a fusion protein used for immunization. The signals associated with Ptc + cells are not observed in the subependymal zone. The bar represents 25 ⁇ .
  • Figure 37A shows labeling with antiserum, pre-treated.
  • Figure 37B shows labeling with DAPI.
  • Figure 37C shows the overlap of the markings.
  • Figures 38 and 39 show immunohistofluorescent markings made at the subependymal area using anti-Ptc serum ( Figure 38) or preimmune serum ( Figure 39).
  • the serum makes it possible to identify the Ptc + cells whereas the pre-immune serum does not allow it.
  • Figure 40 shows a western blot analyzing total lysates (of proteins) of HEK293 cells transiently transfected with an empty vector (mock) or with a vector containing the complete sequence of murine Ptc. Proteins were separated by SDS-PAGE and revealed using anti-Ptc serum. The arrowhead indicates a majority band of 140 kDa detected in HEK293-Ptc cells but not in HEK293-mock cells. A second 200 kDa signal is detected in HEK293-Ptc cells that may show post translational modifications. Cerebellar proteins (Cb, 30 ⁇ g) were analyzed with anti-Ptc serum and a band of 140 kDa was observed. This signal disappears into the cerebellum (Cb * ) when the serum is pretreated with the fusion that allowed the immunization. The charge is controlled by the detection of actin.
  • Cb * cerebellum
  • Figures 41A to 41G show fluorescence images obtained from YFP-control animals that received a dose of tamoxifen for 5 days, and analyzed 2 months after induction.
  • Figure 41A shows a complete brain.
  • the mark represents the expression of the YFP.
  • the bar represents 500 ⁇ .
  • Cb cerebellum; this, corpus callosum; CPu, caudate putamen; Cx, cerebral cortex; DG, dentate gyrus; LV, lateral ventricle; OB, olfactory bulb; RMS, rostral migration current.
  • Figure 41B is an enlargement of the region of the olfactory bulb.
  • Figure 41C is an enlargement of the caudate putamen region.
  • Figure 41D is an enlargement of the region of the subependymal zone.
  • Figure 41E is an enlargement of the region of the cerebral cortex.
  • Figure 41F is an enlargement of the dentate gyrus region.
  • Figure 41 G is an enlargement of the region of the cerebellum.
  • Figures 42A to 42D shows in situ hybridization using a riboprobe of GN1 mice exits blades GLAST-CreERT2 / Ptc l / l treated with a placebo or tamoxifen 10 days before analysis. GN1 induction is detected only after tamoxifen treatment.
  • Figure 42A shows a labeling on treated Glast-CreERT2 / Ptc l / l mice with the placebo.
  • the bar represents 400 ⁇ .
  • Figure 42B is a marking on mice GLAST-CreERT2 / PTC l / s treated with tamoxifen. The bar represents 400 ⁇ .
  • Figure 42C shows an enlargement of the region marked by a square in Figure 42A.
  • the bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 42D shows an enlargement of the region marked by a square in Figure 42B.
  • the bar represents 100 ⁇ .
  • Figures 43A and 43B show that the expression of GN1 is greatly increased from the blades Ptc mouse "" one year after treatment with tamoxifen.
  • the bar represents 200 ⁇ .
  • Figure 43A is an in situ hybridization using the GN1 ribonucleic probe on slides from control mice.
  • FIG 43B is an in situ hybridization using the ribonucleic GN1 probe on mouse blades from Ptc " '".
  • Figures 44A and 44B are experiments measuring apoptosis by TUNEL on subependymal s mouse control areas ( Figure 44B) or mice Ptc "" ( Figure 44A). The bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 45 is a histogram showing the quantification of apoptotic nuclei of cells of the subependymal zone of control or Ptc " " mice 10 days or 1 year after treatment with tamoxifen.
  • Figures 46A and 46B represent immunohistofluorescences detecting Olig2 performed at the corpus callosum of YFP-control mice and YFP-Ptc "" Cells expressing YFP correspond to both endogenous astrocytes expressing GLAST and progeny of stem cells GLAST + born in the subependymal zone and which migrated and differentiated into cells of the oligodendroglial lineage.
  • the bar represents
  • Figure 4A depicts YFP Olig2 double labeling in YFP-control mice.
  • 4A shows double labeling YFP Olig2 in YFP-mouse Ptc " '".
  • Figures 47 and 48 show histograms showing quantification of YFP + cell density ( Figure 47, number of YFP + cells per mm 2 ) and percentage of YFP + cells ( Figure 48) coexpressing Oligo2 in YFP-control and YFP mice -Ptc " ' " The number of cells counted: 187 for YFP-controls and 74 for YFP-Ptc " ' " ).
  • FIGS. 49A to 49F show immunohistofluorescences using anti-Sox2, anti-Sox9 and anti-Nestin antibodies carried out on precursor cultures maintained in the absence of growth factors for 12h before the experiment.
  • the nuclei are marked with DAPI.
  • the bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 49A shows double Sox2 / DAPI labeling on cultures from control mice.
  • Figure 49B is a double marking Sox2 / DAPI in mouse cultures from PTC "".
  • Figure 49C shows a double labeling Sox9 / DAPI on cultures from control mice.
  • Figure 49B is a double marking Sox9 / DAPI in mouse cultures from PTC "".
  • Figure 49D shows a double Nestin / DAPI staining on cultures from control mice.
  • Figure 49E is a double marking Nestine / DAPI in mouse cultures from PTC "".
  • FIGS. 50A to 50R show immunohistofluorescences using anti-Tuj1, anti-Olig2 and anti-GFAP antibodies made on precursor cells derived from control or Ptc " " mice maintained 7 days before the experiment in the presence or in the absence Hh SAG agonist (0.3 ⁇ ) and Hh MRT-83 antagonist (3 ⁇ ). The nuclei are marked with DAPI. The bar represents 100 ⁇ .
  • Figure 50A shows double labeling Tuj1 / DAPI on control cells, without treatment.
  • Figure 50B shows a double Tuj1 / DAPI tag on control cells treated with SAG.
  • Figure 50C shows a double Tuj1 / DAPI tag on control cells treated with MRT-83.
  • Figure 50D shows a double labeling Tuj1 / DAPI on Ptc cells ' ' " ' without treatment.
  • Figure 50E shows a double labeling Tuj1 / DAPI on Ptc " ' ' 'cells treated with SAG.
  • Figure 50F shows a double Tuj1 / DAPI labeling on MRT-83 treated Ptc " ' ' 'cells.
  • Figure 50G shows a double labeling Olig2 / DAPI on control cells, without treatment.
  • FIG. 50H represents a double Olig2 / DAPI labeling on control cells, treated with SAG.
  • Figure 501 shows a double labeling Olig2 / DAPI on control cells treated with MRT-83.
  • Figure 50J shows a double labeling Olig2 / DAPI on Ptc " ' " ' cells without treatment.
  • Figure 50K shows double labeling Olig2 / DAPI on Ptc cells "" treated with SAG.
  • Figure 50L shows double Olig2 / DAPI labeling on MRT-83 treated Ptc " ' ' 'cells.
  • Figure 50M shows a double GFAP / DAPI staining on control cells, without treatment.
  • Figure 50N shows a double GFAP / DAPI labeling on control cells treated with SAG.
  • Figure 50O shows a double GFAP / DAPI labeling on control cells treated with MRT-83.
  • Figure 50P is a dual-labeled GFAP / DAPI on Ptc cells "" without treatment.
  • Figure 50Q shows a double GFAP / DAPI labeling on Ptc " ' ' 'cells treated with SAG.
  • Figure 50R shows a double GFAP / DAPI labeling on MRT-83 treated Ptc " ' ' 'cells.
  • Figures 51A-51C are coronal views of subependymal region showing cells incorporating BrdU after AraC injection or placebo into wild mice.
  • Figure 51A shows a simple BrdU labeling on placebo treated mice.
  • Figure 51B shows a simple BrdU labeling on AraC-treated mice.
  • Figure 51C shows double BrdU / DAPI labeling in placebo-treated mice.
  • Figure 51D shows double BrdU / DAPI labeling on AraC-treated mice.
  • Figure 52 shows a histogram quantifying the number of BrdU + / mm2 cells, denoting a decrease in proliferation in AraC-treated mice. *** , p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 53 shows a histogram showing mass reduction of YFP-Ptc ' ' ' mice compared to YFP-control mice after one week's injection of tamoxifen into mice 2- to 4-months old. The mass is measured 5 months after injection, and there is a 25% decrease in the mass of the Ptc " ' " Student's T test *** p ⁇ 0.0001 mice.
  • NSCs Neural stem cells
  • SEZ subependymal zone
  • aNSCs active NSCs
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • TEPs transient progenitors
  • the quiescent neural stem cells do not express the EGFR receptor (EGFR) and are resistant to anti-mitotic drugs or irradiation. It participates in the renewal of the neurogenesis of the subependymal zone via active neural stem cells and TAP.
  • EGFR EGFR receptor
  • the Sonic Hedgehog (Shh) pathway is active in the adult subependymal zone where it has been proposed its role in the regulation of cell proliferation, and modulates the migration of neuroblasts.
  • Inactivation of the Smoothened (Smo) receptor in cells expressing the Nestine neuroepithelial marker suggests the involvement of this Shh signal transducer for the maintenance of the neural stem cell population.
  • Patched (Ptc) is the main receptor of Shh and is considered an antagonist of this signaling pathway.
  • the embryonic deletion of Ptc in multipotent stem cells (hGFAP) -Cre; Pfc cc leads to the occurrence of medulloblastomas in mice. Tumors only occur when the cells have engaged in the neural lineage. However, the effects of inactivation of Ptc in adult neural stem cells of the subependymal zone remain unknown.
  • the inventors used a tamoxifen-inducible Cre transgene under the control of an astrocyte-specific promoter expressed in neural stem cells.
  • the inventors have taken advantage of Glast-CreERT2 mice expressing a tamoxifen-inductive Cre induced at Glast locus to induce Cre recombinase activity in adult astrocytes and neural stem cells.
  • the Glast-CreERT2 mice were crossed with a reporter line ROSA2, R26R-YF.
  • ROSA2, R26R-YF the reporter line
  • the expression of YFP is initiated after activation of the Cre recombinant tamoxifen and mark all cells girls recombinant cells.
  • Two months after treatment a large number of cells are detected in SEZ and coexpress the Glast and GFAT markers (FIGS. 3A to 3F).
  • Ptc is inactivated in Glast-positive cells by crossing of either Gast-CreERT2 or YFP-control mice with Ptc l / l mouse lines allowing excision of exons 8 and 9 encoding the domain involved in the Shh binding.
  • Adult Glast-CreERT2; Ptc fl / fl (so-called Ptc 1 ' ) mice and their counterpart Ptc TM (called controls) are treated with tamoxifen and studied 10 days, 2, 6 or 12 months later.
  • Ptc 1 ' mice are treated with tamoxifen and studied 10 days, 2, 6 or 12 months later.
  • the rapid proliferation rate of cells is measured by pulsed BrdU administration at 2h intervals.
  • the pulses were performed at different times (10 days, 2, 6, 12 months).
  • the number of positive BrdU cells decreases between 2 and 6 months after treatment, probably indicating a steady decline in age.
  • BrdU positive cells decreased in SEZ cells of Ptc 1 ' mice compared to control mice throughout the study.
  • the 27% decrease is already highly significant and this decrease goes up to 54% at 2 months.
  • the decrease in rapid proliferation is observed up to 6 months after treatment and almost disappeared after one year in Ptc 1 ' mice.
  • the quantification of the SEZ cell populations shows that the deletion of Ptc increases by almost 2 times the number of Glast + cells that correspond to astrocytic and neural stem cells, and almost twice the number of KÎ67 + stem cells. / GFAP +.
  • TAP and neuroblasts decreased by two fold as indicated by EGFR and PSA-NCAM markings ( Figures 11A to 11L and 12).
  • the inventors observed an increase in the number of Sox2 + and Sox9 + cells, both expressed in TAPs and neural stem cells.
  • the daughter cells from the recombinant cells are monitored by the expression of YFP in Glast-CreERT2, Ptc1 / fl ; R26R-YFP (so-called YFP-Ptc '1' ) mice and in control YFP-treated mice. tamoxifen, two months after treatment.
  • strong YFP signals are detected in the SEZ-RMS-OB system of the control mice (FIGS. 13A to 13H) and also in the corpus callosum (CE) where they reveal the new populations from the SEZ and the astroglial cells expressing Glast in the fibrous tract ( Figure 46A and 46B).
  • the inventors investigated the percentage of YFP + cells expressing tyrosine hydoxylase (TH), calbindin or vesicular glutamate transporter (vGlut2), which mark a subset of cells having integrated the Gl layer.
  • TH tyrosine hydoxylase
  • vGlut2 vesicular glutamate transporter
  • the percentage of newly generated cells labeled with calbindin is not significantly modified.
  • the percentage of YFP + cells coexpressing either TH or vGlut2 is respectively three times higher or reduced.
  • the multilayer cellular architecture of the OB is not modified in the Ptc 1 ' mice compared to the control (FIGS. 17A and 17B).
  • the neurospheres are cultured for 12 hours in the absence of growth factors. Significant ways, most cells express the marker Sox9 in neurospheres PTC "" compared to neurospheres witnesses. ( Figure 21, see also Figures 49A to 49F). On the other hand, the expression of Sox2 is not significantly modified in both types of neurospheres, whereas the number of Nestin positive neuroepithelial cells is increased by 1, 6-fold in Ptc deficient mice, which testifies to a decrease in differentiation. To study the multipotency of neural stem cells Ptc " ' " , the neurospheres were cultured for 7 days in the absence of growth factors to allow differentiation into neurons into oligodendrocytes and astrocytes.
  • neural stem cells PTC "" retain their pluripotency, their ability to differentiate is changed ( Figures 21, 22 and 23; see also Figures 50A-50R).
  • the percentage neuroblasts Tuj1 + oligodendrocytes and Olig2 + is significantly reduced in the mice PTC "" while the number of GFAP + astrocytes is not changed by the deletion of PTC. Modulation via Smo has been studied. ( Figures 21, 22 and 23).
  • the number of neuroblasts Tuj1 + oligodendrocyte Olig2 and GFAP + astrocytes + is reduced in the mice after addition of SAG, an activator of Smo.
  • Smo inhibitor MRT-83 does not alter the genesis of cells suggesting that the Hh pathway is antagonized by Ptc.
  • the MRT-83 increases the ability of PTC cells "" to differentiate into neuroblasts, oligodendrocytes and astrocytes.
  • the restoration of the Ptc " " phenotype by the Smo blockade is associated with the constitutive inhibition that Ptc exerts on Smo.
  • the invalidation of Ptc decreases the total number of differentiating cells although it does not inhibit the terminal differentiation of the cells already engaged in the differentiation process.
  • the absence of Ptc in neural progenitors leads to the formation of symmetrical Glast + / EGFR + pairs via the Notch pathway and reduces the cell cycle outflow of TAPs.
  • the primary cells were inoculated directly after isolation from the SEZ and maintained in culture for 24-36h to allow cell division.
  • Anti-Glast and anti-EGFR antibodies were used to label stem cells and their offspring respectively.
  • the cells isolated from the SEZ of control mice were treated with the Smo agonist (SAG) in the presence or absence of a ⁇ -secretase inhibitor, LY411575, which inhibits the activation of the endogenous endogens Notch receptors. proteolysis.
  • SAG Smo agonist
  • LY411575 a ⁇ -secretase inhibitor
  • proteolysis SAG promotes symmetrical Glast + / EGFR- pairs at the expense of Glast + / EGFR + pairs compared to basal conditions.
  • the inventors performed BrdU pulsation experiments in a cell cycle cell population expressing Ki67 in the SEZ of animals dosed with tamoxifen two months previously.
  • a 2h BrdU pulse shows proliferation of TAPs and to a lesser extent neuroblasts.
  • This protocol allowed the inventors to determine that the labeling index is not modified by the inactivation of Ptc (FIGS. 30A to 30C and 31).
  • the inventors have also evaluated the number of cells leaving the cell cycle when the animals are killed 24 hours after the injection of BrdU. Quantifying the number of proliferating cells remaining in cycle 24 hours after BrdU incorporation (ki67 + cells) shows a percentage of 2 times fewer cells outputs of the cell cycle in the Ptc mouse "" than in controls ( Figure 32). These results show that the deletion of Ptc decreases the number of cells leaving the cell cycle proliferating rapidly and therefore their ability to differentiate.
  • Ptc is necessary for the reconstitution of the SEZ stem cell niche after AraC in vitro treatment.
  • AraC antimitotic AraC
  • the damaged SEZ is regenerated by astrocyte-like neural stem cells resulting from increased proliferation and genesis of active neural stem cells and TAP.
  • cells incorporating BrdU were predominantly absent ( Figures 51 and 52).
  • Ten days later (Day 10) the BrdU + cell population returned to normal in control SEZ compared to placebo ( Figures 33A and 33B and 34).
  • Conditional inactivation of Ptc in neural stem cells allows the study of the activation of Hh signaling in vivo independently of the ligand in SEZ. This activation is mediated by the uptake of Ptc inhibition on Smo and promotes the genesis of symmetrical Glast + / EGFR-pairs as observed in vitro.
  • the inventors' data also suggest an alteration of the transition between the active neural stem cells and the TAPs, which accounts for the decrease in APRs and consequently the decrease in neuroblasts. Expression of the Notch pathway and Sox2 and Sox9 transcription factors, known to inhibit neural differentiation is also increased. In connection with this alteration of the transition between the active neural stem cells and the TAPs, the inventors have also found that Ptc-deficient neural stem cells do not correctly regenerate SEZ after treatment with an anti-mitotic agent.
  • Hh in Ptc " ' " mouse SEZs maintains pluripotency, but influences the fate of precursors derived from SEZ to either an oligodendroglial phenotype in the ce or a glutaminergic or dopaminergic phenotype, two populations of Periglomerular OB, this determination being of great interest in the repair mechanisms of the brain.
  • Long-term activation of Hh signaling is still detected one year after recombination of Ptc.
  • the absence of any major alteration of OB morphology observed by the inventors is in agreement with already reported data showing that adult neurogenesis in SEZ only allows partial renewal of new neurons in OB.
  • neural stem cells are both Hh- and Notch- cells. If transcription factors Hes are generally considered to be canonical effectors of the Notch pathway, a Notch-independent Hh / Hes1 activity has been described during proliferation of progenitors in the retina. Although the direct link between Hes1 and the Hh pathway in adult stem cells remains unknown, the results of the inventors show that the effect of Hh activation is Notch dependent. TAPs have been described as regulating the self-renewal of neural stem cells in vivo and an interaction between EGFR and Notch signaling pathways has been proposed as having selective roles in this process where EGFR is an upstream regulator of Notch by through a non-autonomous mechanism.
  • Ptc has been described as a tumor suppressor gene
  • the inventors have shown that its deletion in astrocyte-type neural stem cells increases the strain capacity of these cells without inducing tumor formation.
  • Ptc controls the major steps in the maintenance of stem cells in the SEZ: the absence of antagonist activity on Smo leads to a blocking of the proliferative cells EGFR +, probably by an increase in the symmetrical divisions of the neural stem cells.
  • the Glast-CreERT2 mice (Mori et al., 2006, Glia 54, 21-34) were received in a 129 x C57BL / 6 mixed genetic background and crossed over three generations with C57BL / 6 genetic background mice. Homozygous patched flocked mice (Uhmann et al., 2007, Blood, 110, 1814-1823) were received and maintained in a genetic background C57BL / 6.
  • the reporter mouse line R26R-YFP / + (Srinivas et al., 2001, BMC Dev Biol.1,4) was maintained in a C57BL / 6 genetic context.
  • Tamoxifen (Sigma) was dissolved in corn oil (Sigma) at a concentration of 10 mg / ml and 1 mg was injected intraperitoneally (ip) twice daily for 5 consecutive days. The animals were sacrificed 10 days, 2 months, 6 months or 12 months after the end of tamoxifen treatment. In order to label the proliferative cells, the mice were ip injected with bromodeoxyuridine (BrdU, Sigma, 100 mg / kg body weight) 4 hours or 2 hours before sacrifice (groups of 5 to 6 mice). For the determination of the cell cycle exit, the animals received two ip injections of BrdU at two-hour intervals and were sacrificed 24h after the last injection.
  • ISH In situ hybridization
  • the SEZ telencephalic was dissected from wild adult PTC "" or witnesses (Pastrana et al., 2011, Cell Stem Cell 8, 486-498).
  • the fragments of SEZ were digested in a solution of papain 5sigma) and trypsin (Invitrogen) for 20 min at 37 ° C and mechanically dissociated by passage through a needle of thickness 26.
  • the cells were seeded at 5,000 cells per well in 24-well plates in serum-free medium consisting of DMEM supplemented with B27, penicillin / streptomycin, sodium pyruvate and in the presence of 20 ng / ml EGF and 10 ng / ml basic fibroblast growth factor (FGF, Invitrogen). After 6-9 days in culture, the spheres are harvested, incubated in 0.05% trypsin (Invitrogen) for 30-60 min at 37 ° C, are mechanically dissociated and separated into single cells through a syringe as described. previously. Unless otherwise indicated, experiments using isolated cells or neurospheres (whether or not treated with drugs) are performed after one or two passages or on primary spheres.
  • serum-free medium consisting of DMEM supplemented with B27, penicillin / streptomycin, sodium pyruvate and in the presence of 20 ng / ml EGF and 10 ng / ml basic fibroblast growth factor (
  • cells were fixed in 4% PFA at 4 ° C for 30 min, then blocked for 30 min at room temperature in 0.5% BSA in PBS. The fixed cells were then incubated with a primary antibody at room temperature for 90 min, followed by incubation with the secondary antibodies for 60 min at room temperature and mounted on slides.
  • paired cell assays For paired cell assays, isolated cells are seeded directly after microdissection of the sub ventricular zone (SVZ) on slides at a cell density of approximately 50,000 cells per well. The cultures were maintained for 24 to 36 h in the presence of 10 ng / ml of EGF. The IHF analyzes are carried out as described above. About 60 pairs were studied in each sample from wild animals or mutants.
  • SVZ sub ventricular zone
  • SAG and MRT-83 were synthesized as previously described (Roudaut et al., 2011, Mol., Pharmacol 79, 453-460).
  • RNAs were extracted using the Trizol kit (Invitrogen) from spore cultures derived from tamoxifen-treated animals 2 months previously. The RNAs were reverse transcribed in 20 ⁇ l of solution comprising Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). Polymerase chain reaction (PCR) reactions were performed using Go Taq polymerase (Promega). The specific primers are described below. Actin was used as an RNA load control.
  • Immunofluorescent signals were detected by a conventional epifluorescent microscope (DMRXA2; Leica Microsystems) equipped with a CDD camera (Photometrics) or scanned for Z planes for colocalization by an ApoTome micoscope (ZEISS) and Axiolmager software. The optical sections are 1 ⁇ interval. Immunofluorescent signals are quantified with Image software. Cell counts are presented as averages of several SEZ sections or olfactory bulbs of at least three mice for each group. Statistical analyzes are performed using a two-tailed Student's test. A statistical significance is considered for p ⁇ 0.05.
  • the blocking experiments were performed by incubating the antiserum overnight with a purified recombinant fusion protein GST-Ptc (glutathione-S-transferase Ptc) at a concentration of 15 ⁇ g / ml.
  • GST-Ptc glutthione-S-transferase Ptc
  • TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end; ApoptagR Peroxidase In situ Apoptosis Detection Kit; Millipore markings were made according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for immunohistofluorescence The anti-BrdU, GFAP, NeuN, PSA-NCAM antibodies have been previously described (Angot et al., 2008, Stem cells 26, 2311-220).
  • the other antibodies used are the following: antibodies from the goat directed against c-fos (1/300, Santa Cruz), antibodies derived from rabbit directed against doublecortin (1/500, provided by F.
  • the secondary antibodies are conjugated antibodies of Alexa 546 goat anti-mouse (Molecular Probes), Alexa 555 anti-rabbit goat (Life Technologies), Alexa 546 anti-goat donkey (Life Technologies), FITC anti-mouse goat (Sigma) , DyLight 488 guinea pig (Jackson immunoresearch), Alexa 488 anti-rat goat (Jackson Immunoresearch), Biotin-labeled donkey (biotinylated Vector Laboratories), DyLight 649 anti-mouse donkey, DyLight 649 anti-goat donkey or antilapine donkey DyLight 649 (Jackson Immunoresearch).
  • Hes1 direction 5'- ⁇ AAAGACGGCCTCTGAGCACA-3 '(SEQ ID NO: 3) antisense: 5'- ⁇ TCATGGCGTTGATCTGGGTCA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • Hes5 sense 5'-AAGTACCGTGGCGGTGGAGATGC-3 '(SEQ ID NO: 5) antisense: 5'- ⁇ CGCTGGAAGTGGTAAAGCAGCTT-3' (SEQ ID NO: 6)
  • GN1 sense 5'- ⁇ TTCGTGTGCCATTGGGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • antisense 5'- ⁇ CTTGGGCTCCACTGTGGAGA-3' (SEQ ID NO: 8)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc, et présentant une réduction de sa masse totale par rapport audit mammifère transgénique sauvage.

Description

MODÈLE ANIMAL PRÉSENTANT UNE INVALIDATION FONCTIONNELLE DU GÈNE CODANT POUR LE RÉCEPTEUR MEMBRANAIRE PATCH ED OU PTC
L'invention concerne un modèle animal et ses utilisations.
La molécule de signalisation Hedgehog (Hh) appartient à une famille de morphogènes (Ingham et al. 2001 , Dev Biol, 330(2) ; 3059-87) comprenant trois membres (Sonic Hedgehog (Shh), Désert Hedgehog et Indian Hedgehog) homologues au produit du gène de polarité segmentaire Hh chez la drosophile. Shh est synthétisé sous la forme d'un précurseur qui subit une série de modifications post-traductionnelles au cours desquelles la protéine est clivée par une activité enzymatique présente dans sa partie C-terminale. Cette autoprotéolyse génère un fragment C-terminal (ShhC) et le fragment N-terminal biologiquement actif (ShhN). Ce dernier est modifié par l'addition d'une molécule de cholestérol en C-terminal et d'une molécule d'acide gras sur le résidu cystéine N-terminal déprotégé après l'élimination du peptide signal (Varjosalo et al. 2008). La sécrétion de la protéine ShhN dépend de son interaction avec d'autres protéines. C'est le cas de la protéine Dispatched qui s'apparente à la famille des transporteurs possédant un domaine senseur de stérols, mais aussi des composantes de la matrice extracellulaire telles que les héparanes sulfates protéoglycanes. La formation de formes oligomériques de ShhN ou le relargage de la molécule par protéolyse de ses deux extrémités ont aussi été proposés. ShhN transmet son action par l'intermédiaire d'un complexe contenant deux protéines transmembranaires: Patched (Ptc) une protéine à 12 domaines trausmembranaires (TM) présentant une structure de type transporteur et Smoothened (Smo) une protéine à 7 domaines TM aux membres de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En l'absence de son ligand Shh, Ptc inhibe Smo par un mécanisme qui reste encore hypothétique, mais qui est vraisemblablement de nature catalytique et fait intervenir une potentielle activité de Ptc dans le transport de molécules lipidiques membranaires. La cascade intracellulaire consécutive à la fixation de Shh sur Ptc et la levée de l'inhibition exercée par Ptc sur Smo s'accompagnent de l'accumulation de Smo dans une organelle spécifique, le cil primaire. De nombreux facteurs intracellulaires dont les protéines Suppressor of Fused (SuFu) et PKA, mais aussi les facteurs de transcription Gli sont également transloqués dans le cil. Cet adressage au cil est nécessaire à la conversion des facteurs Gli en formes activatrices qui conduiront à l'activation transcriptionnelle des gènes cibles tels que Pic et Gli 1.
Le rôle régulateur de la voie de signalisation des protéines Hedgehog durant le développement embryonnaire a été largement étudié. Hh a été associé aux processus de maintien et de réparation du tissu normal, à la régulation spatiotemporelle de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Le morphogène a notamment été impliqué dans le développement du système nerveux central. Le rôle essentiel de la signalisation Hh est attesté par les conséquences dramatiques d'une signalisation Hh déficitaire chez le fœtus humain observées dans le syndrome de l'holoprosencéphalie. Plus récemment, la voie Shh a été identifiée dans le cerveau adulte, où la forme active aminoterminale de la molécule est exprimée dans de nombreuses régions du système nerveux mature suggérant de nouveaux rôles pour cette voie. Celle-ci participe notamment à l'établissement et au maintien des niches neurogéniques. Shh régule la prolifération des précurseurs oligodendrocytaires dans le cerveau non lésé et constitue un régulateur positif des oligodendrocytes au cours de la réparation du tissu cérébral démyélinisé. La modulation de la voie de signalisation Shh représente donc un enjeu dans la thérapeutique des pathologies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, mais aussi d'autres maladies neurodégénératives. Pour la maladie de Parkinson et à un moindre degré pour la maladie d'Alzheimer, ces hypothèses reposent sur les activités de survie et de différenciation induites par Shh seul ou en présence d'autres facteurs de croissance. Shh est aussi capable de réduire in vitro l'activité électrique des neurones du noyau subthalamique impliqués dans la maladie de Parkinson. Enfin, des études ont mis en évidence les effets positifs de l'activation de la voie par la protéine Shh elle-même, sur les troubles comportementaux observés dans un modèle de cette même pathologie.
Il existe donc un besoin d'étudier la voie de signalisation Shh afin de pourvoir déterminer, directement chez l'animal, son implication dans les pathologies susmentionnées.
Des dysfonctionnements de la voie de signalisation Shh ont également été associés à de nombreux cancers. En effet, des mutations inactivatrices de Ptc sont associées au syndrome de Gorlin ou naevomatose basocellulaire, une maladie autosomale dominante caractérisée par des malformations cranofaciales et cérébrales, mais surtout par l'incidence élevée de diverses tumeurs, plus particulièrement des carcinomes basocellulaires au niveau cutané et des médulloblastomes au niveau cérébral. Des formes sporadiques de médulloblastomes et de carcinomes basocellulaires ont aussi été associées à des mutations des gènes Ptc ou Smo humains. Des mutations de Shh ont également été identifiées dans des carcinomes basocellulaires. D'autres types de tumeurs ont aussi été associés à un défaut de la voie de signalisation Hh. La localisation de ces tumeurs est étroitement corrélée aux sites d'expression des composantes de la voie au cours du développement embryonnaire. A titre d'exemple non-limitatif on peut citer: des cancers du sein et des méningiomes associés à des mutations de Ptc, des glioblastomes associés à des mutations de Gli, des cancers gastro-intestinaux, notamment des cancers primaires de l'estomac et du colon, des cancers de la prostate, de la vessie, de l'ovaire, les rhabdomyosarcomes, les cancers du poumon à petites cellules.
Toutefois, ces modèles concernent un gène Ptc muté et ne permettent pas d'étudier in vivo la fonction du gène Ptc sauvage.
On connaît de l'état de la technique des modèles animaux d'invalidation de Ptc.
Par exemple, la demande internationale WO 99/61582 enseigne des animaux transgéniques Pic'" Ces animaux meurent au stade embryonnaire du fait d'un défaut de fermeture du tube neural et pour des raisons de malformation cardiaque.
Aussi, la question de la fonction de Ptc dans le cerveau, notamment chez les animaux adultes, demeure irrésolue.
Un des objets de l'invention est d'obvier à ces inconvénients en proposant des animaux modèles permettant d'étudier in vivo la fonction de Ptc sauvage, notamment dans le cerveau.
Un autre objet de l'invention est de proposer une méthode d'invalidation du gène Ptc permettant de contrôler dans l'espace et dans le temps l'expression dudit gène.
L'invention concerne un mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle biallèlique_du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales, ledit mammifère ayant un génotype sauvage pour le gène Ptc, à l'exception des cellules souches neurales et/ou des cellules gliales qui ont un génotype Ptc"'".
Les inventeurs ont conçu un modèle animal présentant une invalidation du gène Patched spécifique dans certaines cellules, en mettant à profit les techniques de transgénèse et de croisement sexués d'animaux.
L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que les animaux adultes invalidés pour le gène Patched (Ptc) ne développent pas de tumeurs et ont une masse réduite. Un exemple de réduction de la masse de souris transgéniques selon l'invention est donné à titre illustratif ci-après.
Par ailleurs, les inventeurs ont également fait la constatation inattendue que la délétion, ou l'invalidation fonctionnelle, du gène Ptc avait pour conséquence d'inhiber la différenciation des cellules souches et ainsi d'augmenter leur nombre. Il y a donc un enrichissement en cellules souches neurales chez les animaux présent l'invalidation fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales.
Une telle réduction de la masse est observée lorsque le gène Ptc est invalidé dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou en d'autre terme dans les cellules exprimant le marqueur Glast.
Par « génotype sauvage pour le gène Ptc », on entend dans l'invention le fait que le gène Ptc est exprimé normalement. Cela signifie donc que le gène Ptc est non modifié, ou que le gène a été modifié, par exemple en y insérant des séquences exogènes, ou en introduisant des mutations, qui n'affectent ni l'expression du gène, ni la fonction du produit, c'est-à-dire la fonction du récepteur Ptc. Un exemple de génotype sauvage serait une insertion de part et d'autre du gène Ptc de séquences de recombinaisons de type Lox. Ces séquences ont modifié la séquence génique du gène, mais n'affectent, avant recombinaison, ni l'expression du gène, ni la fonction du récepteur.
Avantageusement, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain adulte, présentant une invalidation fonctionnelle biallèlique du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales.
Dans l'invention, on entend par « invalidation fonctionnelle » toute action génétique ou épigénétique permettant d'inhiber l'expression d'un ou plusieurs gènes ou ayant pour effet de rendre le produit d'un gène dépourvu de son activité. Généralement, l'invalidation fonctionnelle passe par la délétion totale ou partielle d'une ou plusieurs séquences codantes d'un gène ayant pour effet d'inhiber l'expression du produit dudit gène, ou de permettre l'expression d'un produit ne présentant plus ses propriétés biologiques (perte ou modification d'activité enzymatique, perte ou modification de sa conformation tridimensionnelle...). La délétion de gènes chez les animaux passe généralement par la technique de « Knock-out » qui consiste à exciser tout ou partie d'un gène (en particulier la délétion d'un ou plusieurs exons) en vue d'en supprimer son expression ou de supprimer l'activité de la protéine qu'il code.
Il est également possible d'utiliser des techniques de « Knock-in » qui consistent à introduire de manière ciblée un élément génétique dans un gène déterminé afin soit d'en inhiber l'expression, soit de modifier le cadre de lecture, de sorte que le produit dudit gène est alors non fonctionnel.
Dans l'invention, l'invalidation fonctionnelle est dite biallèlique, ce qui signifie que les deux copies du gène Ptc sont invalidées. Les animaux transgéniques non humains de l'invention sont donc homozygotes pour la délétion du gène Ptc dans les cellules souches neurales et/ou les cellules souches gliales. En outre, il est important de rappeler que l'invention ne concerne pas des animaux transgéniques non humains hétérozygotes pour le gène Ptc, c'est à dire des animaux de génotype Ptc+/", en particulier des animaux dont le génotype des cellules souches neurales et/ou gliales est Ptc+/\
D'autres techniques d'invalidation sont bien connues de l'homme du métier, comme par exemple la mutagenèse aléatoire utilisant des agents chimiques modifiant l'ADN.
Comme mentionné ci-dessus, l'invention concerne avantageusement « un mammifère transgénique non humain adulte ».
Par animal transgénique, on entend dans l'invention un animal génétiquement modifié dont le patrimoine génétique a été modifié par l'homme. Bien évidemment dans le contexte de T'invention, les mammifères transgéniques ne concernent pas les humains. Par « un mammifère transgénique non humain adulte » on entend dans l'invention un mammifère biologiquement stable ayant acquis sa maturité sexuelle et donc susceptible de se reproduire, s'il est fertile.
Le mammifère selon l'invention est notamment un rongeur, notamment un rat ou une souris, ou un animal de laboratoire (chien, chat, singe, lapin, hamster...). Plus particulièrement, le mammifère transgénique selon l'invention est un rongeur, notamment une souris.
L'homme du métier, selon le mammifère considéré, est capable de déterminer aisément si l'animal a acquis le statut d'adulte. Par exemple, dans le cas de souris, les animaux adultes ont plus de 6 semaines notamment plus de 8 semaines. En d'autres termes, chez la souris, les animaux de plus de 6 à 8 semaines sont considérés comme adultes. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain tel que défini précédemment, où lesdites cellules souches neurales et/ou lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast. Dans l'invention, les animaux n'exprimant plus de récepteur Patched dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou encore exprimant une forme non fonctionnelle du gène Patched, présentent une masse réduite d'au moins 30% inférieure par rapport au même animal exprimant le gène Patched dans lesdites cellules souches neurales et les cellules gliales. Par « au moins 30% inférieur » ont entends dans l'invention au moins 30%, au moins 31 %, au moins 32 %, au moins 33 %, au moins 34 %, au moins 35 %, au moins 36 %, au moins 37 %, au moins 38 %, au moins 39 %, au moins 40 %, au moins 41 %, au moins 42 %, au moins 43 %, au moins 44 %, au moins 45 %, au moins 46 %, au moins 47 %, au moins 48 %, au moins 49 % ou au moins 50 %. Plus avantageusement, les animaux n'exprimant plus de récepteur Patched dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou encore exprimant une forme non fonctionnelle du gène Patched, présentent une masse réduite de 30% à 40% inférieure par rapport au même animal exprimant le gène Patched dans lesdites cellules souches neurales et les cellules gliales. Avantageusement, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30%, mais au plus de 40%, inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales.
Les cellules souches neurales sont des cellules souches multipotentes, capables de s'auto-renouveler, dont le potentiel de différenciation est restreint aux types cellulaires neuraux, notamment : les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes.
Durant l'embryogenèse, ces cellules souches neurales sont situées dans la zone ventriculaire du tube neural. Elles génèrent l'ensemble des types cellulaires nécessaires au système nerveux central (à l'exception de la microglie), par un processus appelé neurogenèse.
Dans le système nerveux, les cellules gliales sont les cellules qui forment l'environnement des neurones. Elles assurent le maintien de l'homéostasie, produisent la myéline et jouent un rôle de soutien et de protection du tissu nerveux en apportant les nutriments et l'oxygène, en éliminant les cellules mortes et en combattant les pathogènes. Les cellules gliales représentent environ 50% du volume cérébrah et presque 90 % des cellules du cerveau. On distingue en général 4 principaux types de cellules gliales : les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules de Schwann et la microglie.
Glast (pour GLutamate ASpartate Transporter en anglais) aussi appelé EAAT1 (pour Excitatory Amino Acid Transporter 1 en anglais) est une protéine exprimée de manière prédominante à la membrane cellulaire et permettant d'épurer le glutamate de l'espace extracellulaire. Glast est exprimé dans le système nerveux central et en particulier dans les astrocytes.
De manière plus avantageuse, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain tel que défini précédemment, où lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast, et notamment des cellules astrocytaires.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un mammifère transgénique tel que défini ci-dessus, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l, à l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\
Afin de réaliser l'invalidation fonctionnelle de Ptc, les inventeurs ont tiré profit du système d'invalidation basé sur la recombinase Cre et sa capacité à exciser des séquences nucléiques comprises entre les séquences cibles LoxP. De plus, afin de réaliser une invalidation spécifique, les inventeurs ont mis à profit l'utilisation d'une recombinase Cre inductible : la CreERT2.
La recombinase CreERT2 - permettant le contrôle spatio-temporel de la mutagenèse somatique - est devenue ces dernières années la référence technologique pour l'étude in vivo des mécanismes d'action et de l'expression des gènes, par une excision contrôlée d'acides nucléiques compris entre les séquences LoxP. La CreERT2 est une fusion entre la recombinase Cre et le domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes.
Le contrôle spatial des modifications génétiques nécessite l'emploi d'un promoteur spécifique de tissu qui contrôle l'expression de la recombinase Cre. Pour obtenir un contrôle temporel de la suppression réalisée par la recombinase Cre, l'enzyme a été fusionnée à un nouveau domaine de liaison à l'ADN muté du récepteur humain aux oestrogènes (ERT2). Sous sa forme non liée à un ligand, la CreERT2 ne possède aucune activité recombinase, et n'est donc pas capable d'exciser des acides nucléiques compris entre des séquences LoxP. Suite à l'administration du tamoxifène (un antagoniste aux récepteurs aux estrogènes), la protéine fusion Cre ERT2 est capable de pénétrer dans le noyau cellulaire et de créer la modification génétique. ERT2 se lie au tamoxifène mais pas aux œstrogènes endogènes ce qui permet à la protéine fusion CreERT2 de rester cytoplasmique chez les animaux non traités avec du tamoxifène. Le contrôle temporel par le tamoxifène permet de créer les modifications génétiques à un moment précis du développent, à un temps défini par l'homme du métier.
Dans le cadre de l'invention, afin de cibler spécifiquement l'invalidation de Patched dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, et notamment astrocytaires, les inventeurs ont utilisé une CreERT2 placée sous contrôle du promoteur du gène Glast (aussi appelé dans l'invention promoteur Glast), dont le produit d'expression est retrouvé dans les lesdites cellules souches neurales et gliales.
Au final, tel que décrit dans la partie expérimentale ci-après, les inventeurs ont mis à profit le croisement de souris transgéniques pour le gène Ptc, bordé de séquences LoxP, de génotype Ptc l/ l, avec des souris transgéniques ayant inséré au locus Glast le gène de la recombinase Cre inductible au tamoxifène, de génotype. Glast-CreERT2. Après croisement, la descendance est sélectionnée de sorte que les animaux possèdent les deux types de transgènes : Glast-CreERT2 et Ptc™. Le génotype de ces animaux est donc Glast-CreERT2 ; Ptc™.
Avant traitement au tamoxifène, l'ensemble des cellules des animaux issus des croisements précédents sont de génotype Glast-CreERT2 ; Ptc™'. Après traitement au tamoxifène, les cellules qui n'expriment pas le gène Glast n'exprimeront pas la recombinase Cre. Aussi, dans ces cellules il n'y aura pas d'invalidation de du gène Ptc. Ces cellules demeurerons de génotype Glast-CreERT2 ; Ptc™.
Dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, notamment astrocytaires, le gène Glast s'exprime. Aussi, la recombinase Cre CreERT2 s'exprime également et est activable par le tamoxifène. Ces cellules auront donc une invalidation du gène Ptc, et seront de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un animal transgénique tel que défini précédemment, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l, à l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERT2;Ptc"'" et expriment un ou plusieurs marqueurs permettant qui n'est pas exprimé dans les autres cellules, notamment les cellules exprimant ledit récepteur Ptc.
Afin de suivre la recombinaison par la recombinase Cre, il peut être avantageux de disposer d'animaux transgéniques susmentionnés possédant également un ou plusieurs transgènes inductibles qui seront exprimés ou activés lorsque la recombinase Cre sera activée par le tamoxifène.
Un exemple de marqueur avantageux est un transgène codant la protéine fluorescente jaune (YFP) possédant un codon stop entouré de séquences LoxP. Ce transgène peut être placé sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire, en particulier le promoteur du gène ROSA26. De tels animaux sont connus de l'homme du métier. Par exemple, chez la souris, les animaux possédant ladite protéine YFP recombinante inductible par la recombinase Cre sont notamment les souris B6.129X1 -Gt(ROSA)26Sortm1 (EYFP)Cos/+ disponibles sous le numéro 006148 au Jackson Laboratory.
Le mammifère selon l'invention a un génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l, R26R-YFP/+, et les cellules expriment Ptc mais n'expriment pas la protéine fluorescente jaune ou YFP, tandis que les cellules souches neurales et des cellules souches gliales n'expriment plus Ptc mais expriment la YFP.
Un tel animal transgénique permet de suivre l'expression de la recombinase Cre de d'identifier les cellules dans lesquelles la recombinaison s'est produite. Il est également possible de suivre la descendance des cellules ayant subi la recombinaison, et plus largement suivre l'évolution, in vivo, des cellules recombinée au cours du développement ou de la vie adulte de l'animal.
Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un mammifère transgénique tel que défini précédemment, où malgré la réduction de la masse corporelle totale dudit mammifère, ledit mammifère présente un cerveau essentiellement similaire à celui dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales.
Les inventeurs ont constaté que l'invalidation fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et dans les cellules gliales, notamment les cellules astrocytaires, avait pour conséquence de réduire la masse totale des animaux. Toutefois, et de manière surprenante, la masse globale du cerveau des animaux transgéniques, notamment adultes, selon l'invention n'est pas différente des animaux témoins qui n'ont pas d'invalidation fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales.
Par « essentiellement similaire », on entend dans l'invention une similitude non exacte qui peut être due à la variabilité individuelle des animaux. On peut considérer que deux cerveaux ont des masses essentiellement similaires s'ils ont à plus ou moins cinq pourcents près la même masse.
Ce qui est notable, comme cela a été indiqué précédemment, c'est que le cerveau des animaux transgéniques selon l'invention est enrichi en cellules souches neurales par rapport aux animaux ne présentant pas d'invalidation du gène Ptc.
L'invention concerne également une cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\ L'invention concerne en outre des cellules susmentionnées, lesdites cellules atant des cellules souches neurales ou des cellules gliales.
Les cellules Glast-CreERT2;Ptc"'" sont nouvelles. Ces cellules sont en particulier des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\ Ces cellules peuvent être isolées des animaux transgéniques tels que définis précédemment.
Aussi, avantageusement, l'invention concerne une cellule isolée de génotype Glast- CreERT2;Ptc"'" susceptible d'être obtenue à partir de l'animal transgénique susmentionné.
II peut également s'agir de cellules souches gliales, notamment des astrocytes de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'" obtenus à partir des animaux transgéniques selon l'invention.
Dans le cadre des cellules souches neurales issues des animaux transgéniques selon l'invention, il est possible de les isoler et de les purifier selon le protocole défini par Daynac et al. (Daynac et al., Stem Cell Research (2013) 11 , 516-528). Brièvement, les cerveaux des animaux sont micro disséqués et les cellules sont dissociées à l'aide d'une pipette. Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface spécifiques des cellules souches neurale. Pour la souris, les cellules sont marquées avec les anticorps anti-CD124, anti-LeX/CD15, anti-Glast et anti EGFR. Si les marqueurs susmentionnés sont couplés, directement ou indirectement avec des marqueurs fluorescents, il est possible d'isoler les cellules souches neurales par cytométrie de flux et tri cellulaire. Cette méthode permettra de détecter parmi une population hétérogène les cellules qui présentent les marqueurs appropriés. L'homme du métier connaît très bien ces méthodes de cytométrie.
L'invention concerne en outre un mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptcfl/fl.
Les mammifères transgéniques Glast-CreERT2;Ptc l/ l sont les mammifères issus du croisement de souris Glast-CreERT2 et de souris Ptc™. Ces mammifères sont les prérequis pour obtenir une invalidation spécifique de tissus du gène Ptc, et notamment une invalidation dans les cellules souches neurales et les cellules gliales.
L'invention concerne en outre une cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l, cette cellule est notamment susceptible d'être obtenue à partir du mammifère transgénique tel que défini ci-dessus.
Avantageusement, le mammifère transgénique susmentionné est de génotype Glast- Glast-CreERT2;Ptcfl/fl ou de génotype CreERT2;Ptcfl/fl, R26R-YFP/+.
L'invention concerne de plus l'utilisation du tamoxifène pour l'invalidation, notamment in vitro, du gène Ptc dans des cellules de mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l. L'invention concerne également l'utilisation de tamoxifène pour l'obtention d'un mammifère transgénique tel que défini précédemment.
L'invention concerne également l'utilisation in vitro du tamoxifène pour l'invalidation du gène Ptc dans des cellules de mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l.
L'utilisation de tamoxifène a pour effet d'induire l'expression de la recombinase Cre CreERT2, et de permettre la délétion des séquences du gène Ptc comprises entre les séquences LoxP.
Aussi, in vitro ou in vivo, il est possible d'invalider spécifiquement le gène Ptc dans les cellules souches neurales et/ou les cellules gliales, notamment les cellules astrocytaires. L'utilisation de tamoxifène permet également d'induire in vivo la délétion de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, dans des mammifères Glast-CreERT2;Ptc l/ l, et d'obtenir ainsi des mammifères de génotype Glast- CreERT2;Ptc l/ l, ayant des cellules souches neurales et/ou des cellules souches gliales, notamment astrocytaires de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\
Le tamoxifène est utilisé dans le cadre de l'invention à une dose de 0,1 mg à 10 mg, notamment 1 mg en une ou plusieurs injections lorsqu'il s'agit de traître un animal transgénique, ou directement dans le milieu de culture lorsqu'il s'agit de cellules en culture.
Dans le cadre d'animaux, et d'une utilisation in vivo, le tamoxifène peut être administré par voie intrapéritonéale, mais également par voie sous-cutannée, par voie intracrânienne, par voie transdermale ou toute autre mode d'administration bien connu de l'homme du métier. Toujours dans le cadre d'une administration chez l'animal, le tamoxifène peut être administré en une ou plusieurs doses séparées dans le temps. Un régime posologique avantageux consiste en une administration quotidienne pendant 3 à 7 jours consécutifs, notamment 5 jours consécutifs.
L'invention concerne également l'utilisation d'un mammifère transgénique tel que défini précédemment, pour purifier des cellules souches neurales.
Comme il déjà été mentionné plus haut, l'invalidation de Ptc a pour effet notamment d'inhiber la différentiation des cellules souches neurales. Ces cellules souches neurales vont donc s'accumuler et seront donc plus facilement identifiable et purifiable. Aussi, le mammifère transgénique tel que défini précédemment est très utile pour obtenir une plus grande population de cellules souches neurales comparé à un mammifère n'ayant pas d'invalidation du gène Ptc.
L'invention concerne également une méthode d'inhibition de la différenciation des cellules souches neurales, notamment in vitro, comprenant une étape de mise en contact de cellules souches neurales préalablement obtenues à partir d'un mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l avec du tamoxifène.
Comme mentionné précédemment, l'induction de la CreERT2 a pour effet d'inhiber la différenciation des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l. Aussi, si l'on met en contact les cellules souches neurales, qui ont préalablement été isolées d'un animal transgénique tel que défini précédemment, il est possible d'inhiber leur différenciation en les incubant avec une dose efficace de tamoxifène.
Les cellules vont alors exprimer la recombinase CreERT2 et ainsi perdre l'expression du gène Ptc.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation du tamoxifène pour induire le blocage de la différenciation, en particulier in vitro, de cellules souches neurales ou de cellules gliales, lesdites cellules souches et cellules neurales présentant un génotype Glast-CreERT2;Ptc"'\
L'invention concerne en outre une méthode de modulation, notamment in vitro, de l'expression du gène Ptc dans des cellules souches neurales ou dans des cellules gliales, notamment des cellules souches isolées, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact desdites cellules souches neurales ou desdites cellules gliales avec une dose efficace de tamoxifène, lesdites cellules souches neurales et/ou gliales présentant un génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l.
D'autres aspects peuvent se dégager de l'invention telle qu'elle est exposée ci-dessus. En effet, les inventeurs ont pu réaliser une invalidation du gène Ptc dans des cellules spécifiques, et disposent donc d'un excellent modèle pour étudier la voie de signalisation Hh dans ces cellules.
On peut ainsi envisager l'utilisation du mammifère transgénique selon l'invention en tant que modèle d'étude de la voie Hh. Par exemple il est possible d'utiliser ce modèle en réintroduisant dans les cellules Ptc"'" un ou plusieurs effecteurs du récepteur Ptc afin de disséquer le mécanisme de la voie Hh.
La voie Hh étant également impliquée dans différentes pathologies, le modèle animal créé par les inventeurs et objet de la présente invention permet également de décrypter les mécanismes de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, ...
Un autre aspect qui se dégage de l'invention est le blocage de la différenciation des cellules souches neurales. Le mammifère transgénique selon l'invention pourrait donc être utilisé pour cribler des composés ou des molécules capables de lever l'inhibition de la différenciation des cellules souches neurales n'exprimant plus le gène Ptc.
Un procédé de criblage pourrait consister par exemple en la mise en contact d'un composé, susceptible de lever l'inhibition de la différenciation induite par l'absence d'expression ou d'activité de Ptc, avec des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2 ; Ptc "'".
Encore un autre aspect de l'invention concerne spécifiquement les cellules astrocytaires. L'invention concerne dans cet aspect une méthode d'étude de la plasticité des astrocytes comprenant l'étude des cellules astrocytaires susceptibles d'être obtenues à partir des animaux transgéniques susmentionnés.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples et des figures détaillés ci-après. Légende des figures :
Délétion inductible de Ptc dans les astrocytes et les cellules souches neurales de la zone subépendymaire de cerveau adulte.
Cx : cortex cérébral, LV : ventricule latéral, Sp : aire septale.
Les figures 1A à 1 C représentent des coupes d'immunohistofluorescence indiquant la présence d'une population de cellules Ptc+ co-exprimant le marqueur astroglial GFAP dans la partie dorsale de zone subépendymaire. Les élargissements des régions encadrées sont présentés sous chaque figure. La barre représente 50 μηη.
La figure 1 A représente un double marquage GFAP et DAPI.
La figure 1 B représente un double marquage Ptc et DAPI.
La figure 1 C représente un double marquage Ptc et GFAP.
Les figures 2A à 2C représentent une double immunohistofluorescence sur des lames de cerveau de souris hétérozygotes Ptc+/LacZ exprimant le rapporteur sur un allèle Ptc utilisant des anticorps anti- β-galactosidase et anti-GLAST. Les élargissements des régions encadrées sont présentés sous chaque figure et montrent noyaux 3Gal+ entourés d'un signal GLAST+ (têtes de flèches blanches) ou non (tete de flèche blanche et noire). La barre représente 50 μηι.
La figure 2A représente un double marquage GLAST et DAPI.
La figure 2B représente un double marquage β-Gal et DAPI.
La figure 2C représente la superposition des marquages des figures 2A et 2B.
Les figures 3A à 3F représentent les signaux fluorescents YFP, GLAST et GFAP de la zone subépendymaire de souris Glast-CreERT2;R26R-YFP (YFP témoin) deux mois après l'administration de tamoxifène. La flèche blanche indique une cellule co- exprimant YP avec soit le marqueur Glast, soit le marqueur GFAP. Les carrés correspondent à des agrandissements de la région indiquée par la flèche. Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100 μηη.
La figure 3A représente un double marquage YFP et DAPI.
La figure 3B représente un double marquage Glast et DAPI.
La figure 3C représente la superposition des marquages des figures 3A et 3B.
La figure 3D représente un double marquage YFP et DAPI.
La figure 3E représente un double marquage GFAP et DAPI.
La figure 3F représente la superposition des marquages des figures 3D et 3E.
Les figures 4A à 4E représentent des hybridations in situ de deux gènes cibles de hedgehog : Ptc et GN1 . Dans les souris Ptc"'" (Glast-CreERT2;Ptc l/ l), les exons 8 et 9 sont flanqués de sites loxP. Dans ces souris, les exons 8 et 9 sont délétés par l'activation au tamoxifène de la recombinase CreERT2 sous contrôle du promoteur Glast (Galst-CreERT2) qui est exprimée à partir du locus endogène Glast. Les souris Ptc™ traitées au tamoxifène sont utilisées en contrôle. Les animaux sont étudiés deux mois après le traitement au tamoxifène. Une sonde ribonucléique Ptc del couvrant les exons 8 et 9 du gène Ptc est utilisée pour détecter les transcrits sauvages Ptc. Cette sonde correspond à la moitié de la longueur totale du transcrit Ptc et comprend la partie C-terminale. Dans les souris témoins, la sonde Ptc del, Ptc et Gli permettent la détection d'un faible marquage précédemment décrit dans la zone subépendymaire avec un marquage plus intense dans la niche ventrale. Dans les souris Ptc"'" de forts signaux Ptc et Gli sont détectés dans les régions ventrales et dorsales de la zone subépendymaire, tandis qu'aucun signal n'est observé avec la sonde ribonucléique Ptc del. Les régions encadrées correspondent à un agrandissement de la région indiquée par un carré noir. La barre représente 200 μηη.
La figure 4A représente le marquage avec la sonde Ptc del sur les souris témoins. La figure 4B représente le marquage avec la sonde Ptc del sur les souris Ptc"'" .
La figure 4C représente le marquage Ptc sur les souris témoins.
La figure 4D représente le marquage Ptc sur les souris Ptc"'" . La figure 4E représente le marquage GN1 sur les souris témoins.
La figure 4F représente le marquage GN1 sur les souris Ptc"'" .
Altération de la prolifération cellulaire et phénotype chez l'adulte SEZ/RMS après délétion de Ptc.
Les figures 5A et 5B représentent la détection par immunohistofluorescence de la prolifération des cellules en utilisant un anticorps anti BrdU sur des lames de cerveau de souris Ptc"'" et témoins, traitées un an auparavant avec du tamoxifène et analysées deux heures après une courte pulsation de BrdU. La barre représente 10 μηη.
La figure 5A représente un double marquage BrdU et DAPI sur des souris témoins. La figure 5B représente un double marquage BrdU et DAPI sur des souris Ptc"'" .
La figure 6 représente un histogramme montrant l'évolution du nombre de cellules BrdU+ et GFAP+ dans la zone subépendymaire après traitement au tamoxifène. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules BrdU+ par mm2, et l'axe des abscisses représente le temps après le traitement : 10 jours, 2 mois, 6 mois et 1 an. **p<0.001 . Les figures 7A à 7F représentent des photos d'immunohistofluorescence indiquant l'expression du récepteur à l'EFR (EGFR) et de PSA-NCAM dans la zone subépendymaire des souris témoin et Ptc"'"' un an après l'administration de tamoxifène. CPu, caudate putamen; LV, ventricule latéral. La barre représente 50 μηη.
La figure 7A représente le marquage EGFR sur les souris témoins.
La figure 7B représente le marquage EGFR sur les souris Ptc"'" .
La figure 7C représente le marquage PSA-NCAM sur les souris témoins.
La figure 7D représente le marquage PSA-NCAM sur les souris Ptc"'" .
La figure 7E représente le triple marquage EGFR, PSA-NCAM et DAPI sur les souris témoins.
La figure 7F représente le triple marquage EGFR, PSA-NCAM et DAPI sur les souris Ptc"'" .
La figure 8 représente un graphique illustrant et quantifiant les résultats décrits dans les figures 7A à 7F. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules positives par mm2. **p≤0.001.
Les figures 9A et 9B représentent des immunohistofluorecences montrant l'expression du gène GFAP dans la région subépendymaire s chez des souris témoins et Ptc"'"' un an après le traitement au tamoxifène. La barre représente 50 μηη.
La figure 9A représente le marquage GFAP sur des souris témoins.
La figure 9B représente le marquage GFAP sur des souris Ptc"'" .
La figure 10 représente un graphique illustrant et quantifiant les résultats décrits dans les figures 9A et 9B. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules GFAP par mm2, et l'axe des ordonnées représente le temps après le traitement au tamoxifène (10 jours, 2 mois et 1 an).
Les figures 11 A à 11 L sont des micrographies fluorescentes de la région subépendymaire de souris adultes témoins ou Ptc"'"' Ces micrographies montre les immunomarquages pour Glast et GFAP/KÎ67 en tant que marqueurs astrocytaire et des cellules souches, Sox2 et Sox9 en tant que facteurs de transcriptions nécessaires à la formation des cellules souches neurales, EGFR et PSA-NCAM en tant que marqueur de TAP et de migration des neuroblastes. En parallèle, les marquages au BrdU indiquent la prolifération cellulaire. Les lignes discontinues délimitent la barrière entre le ventricule latéral, ou le corpus callosum, selon l'indication, ce, corpus callosum; CPu, caudate putamen; LV, ventricule latéral. La barre représente 100 μηη sauf pour le double marquage GFAP/KÎ67 où elle représente 25 μηη.
La figure 11 A représente le double marquage DAPI et Glast sur les souris témoins.
La figure 11 B représente le double marquage DAPI et Glast sur les souris Ptc"'" .
La figure 11 C représente le double marquage GFAP et Ki67 sur les souris témoins. La figure 11 D représente le double marquage GFAP et Ki67 sur les souris Ptc"'" .
La figure 11 E représente le double marquage Sox2 et DAPI sur les souris témoins.
La figure 11 F représente le double marquage Sox2 et DAPI sur les souris Ptc"'" .
La figure 11 G représente le double marquage Sox9 et DAPI sur les souris témoins.
La figure 11 H représente le double marquage Sox9 et DAPI sur les souris Ptc"'" .
La figure 11 1 représente le double marquage EGFR et DAPI sur les souris témoins.
La figure 11 J représente le double marquage EGFR et DAPI sur les souris Ptc"'" .
La figure 11 K représente le double marquage BrdU et PSA-NCAM sur les souris témoins.
La figure 11 L représente le double marquage BrdU et PSA-NCAM sur les souris Ptc"'" . La figure 12 représente un histogramme montrant le nombre de chaque type cellulaire par mm2 identifiées aux figures 11 A à L. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type pour 2 à 4 lames par animal pour 3 à 4 animaux. *p<0.05.
Destinée cellulaire après délétion de Ptc dans la zone subépendymaire.
Les figures 13A à 13H sont des photos de fluorescence des cellules Glast+ dans des souris YFP-Ptc"'" ou YFP-témoins traitées deux mois auparavant avec du tamoxifène. La
YFP est détectée dans la zone subépendymaire, le courant de migration rostrale (RMS) et le bulbe olfactif (OB). Une plus faible densité de cellules YFP+ est observé dans le
RMS et l'OB des souris YFP-Ptc"'" comparé aux souris YFP-témoins. Par contre, aucune différence n'est observée dans la zone subépendymaire. La barre représente 50 μηη. La figure 11 A représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans la zone subépendymaire.
La figure 11 B représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans le courant de migration rostrale.
La figure 11 C représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans le bulbe olfactif granulaire (GrO).
La figure 11 D représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans la couche glomérulaire (Gl).
La figure 11 E représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc"'", dans la zone subépendymaire.
La figure 11 F représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc"'", dans le courant de migration rostrale.
La figure 11 G représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc"'", dans le GrO.
La figure 11 H représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc"'", dans la Gl.
Les figures 14A à 14C représentent des histogrammes montrant la densité de cellules YFP+ dans (14A) la région subépendymaire, (14B) Gro et (14C) Gl. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type de 2 à 4 lames par animal, pour 3 à 4 animaux. L'axe des abscisses représente le nombre de cellules YFP+ par mm2. Les colonnes grises représentent les animaux témoins, les colonnes noires représentent les souris Ptc"'" . Les figures 15A à 15J représentent des immunohistofluorescence utilisant les marqueurs NeuN, c-fos, Cb, TH, ou des mybrydations in situ utilisant une sonde v-Glut2 sur des lames de souris YFP-témoins ou YFP-Ptc"'" au niveau du bulbe olfactif. Les têtes de flèches blanches montrent un double marquage. La barre représente 50 μηη. La figure 15A représente le double marquage YFP et NeuN sur des souris YFP- témoins.
La figure 15B représente le double marquage YFP et c-fos sur des souris YFP-témoins. La figure 15C représente le double marquage YFP et Cb sur des souris YFP-témoins. La figure 15D représente le double marquage YFP et TH sur des souris YFP-témoins. La figure 15E représente le double marquage YFP et v-Glut2 sur des souris YFP- témoins.
La figure 15F représente le double marquage YFP et NeuN sur des souris YFP-Ptc"'" .
La figure 15G représente le double marquage YFP et c-fos sur des souris YFP-Ptc"'" .
La figure 15H représente le double marquage YFP et Cb sur des souris YFP-Ptc"'" .
La figure 151 représente le double marquage YFP et TH sur des souris YFP-Ptc"'" .
La figure 15J représente le double marquage YFP et v-Glut2 sur des souris YFP-Ptc"'" . La figure 16 est un histogramme montrant le pourcentage de chacune des cellules dans la population YFP. ***p<0.0005.
Les figures 17A et 17B représentent des lames de cerveaux de réalisées au niveau de OB dans des souris témoins (17A) et Ptc"'" (17B) traitées un an auparavant avec du tamoxifène, les lames sont colorées à l'éosine et à l'hématoxyline. Aucune altération de l'architecture cellulaire multicouche n'est observée dans l'OB. La barre représente 200 μηη.
L'activation soutenue de la voie Hh dans des progéniteurs neuraux dérivés de la région subépendymaire maintient la multipotence des cellules souches neurales dans des tests de formations de neurospères.
Les figures 18A à 18B représentent respectivement des tests de formation de neurosphères à partir de cellules issues de souris témoins et de souris Ptc"'" Les neurosphères de cellules issues de la zone subépendymaire sont analysées deux mois après l'administration de tamoxifène.
La barre représente 100μηη
La figure 18C montre l'expression du gène GN1 à partir des neurosphères décrites aux figures 18A et 18B. On observe une hausse de l'expression de GN1 dans les cellules Ptc"'" par rapport aux cellules témoins.
La figure 19 représente le nombre de neurosphères obtenues à chaque passage a été analysé par un modèle de régression linéaire. Le taux d'expansion clonale est représenté par la pente des courbes (Ptc"'" 0.256±0.047 vs témoin 0.226±0.016, p>0.05).
La figure 20 est un graphique représentant le pourcentage du nombre total de de sphères obtenues à partir de 5000 cellules ensemencées (138 pour les souris Ptc"'" et 98 pour les souris témoins). Les barres représentent : en blanc le nombre de sphères de diamètre supérieur à 100m, en gris clair le nombre de sphères de diamètre compris entre 50 et 100 μηη, et en gris foncé le nombre de sphère de diamètre compris entre 5 et 50 m.
La figure 21 est un graphique représentant l'évaluation de l'expression de marqueurs de cellules progénitrices (Sox2, Sox9 et Nestine) dans les cellules issues de neurosphères dissociées 12h après ensemencement en présence de facteurs de croissances. La quantification de chaque type cellulaire indique une augmentation du nombre de cellules Sox9+ et Nestine+. Les nombres moyens de cellules comptées sont 227±67 pour les cellules Ptc"'" et 356±147 pour les cellules témoins. *, p<0.05, **, p≤0.01 .
Les figures 22 à 24 représentent des histogrammes montrant le potentiel de différentiation de neurosphères issues de souris Ptc"'" et témoins cultivées 7 jours sans facteurs de croissance en présence ou non d'un modulateur pharmacologique de Hh, incluant un agoniste de Smo (SAG ; 0,3 μΜ) et un antagoniste de Smo (MRT-83 ; 3 μΜ). Les cellules différenciées sont analysées par immunohistofluorescence en utilisant des anticorps anti-Tuj1 , anti-GFAP et anti ON2 pour caractériser les cellules neuronales (Figure 22), les cellules astrogliales (figure 23) et oligodendrogliales (figure 24). En absence de drogue, une diminution significative des du pourcentage de cellules Tij1 + et Olig2+ est observée dans les cellules Ptc"'" comparées aux cellules témoins. Le nombre moyen de cellules pour chaque marqueur est 1699±309 pour les cellules Ptc"'" et 3822±128 pour les cellules témoins. Les données sont des moyennes ± l'écart type du pourcentage de noyaux DAPI+ qui expriment les marqueurs. ***, p<0.005; ns, non significatif. Les barres noires représentent les cellules Ptc"'", les barres grises représentent les cellules témoins.
Le déficit en Ptc augmente la division symétrique des cellules souches neurales en régulant positivement la voie de signalisation Notch.
Les figures 25A à 25H représentent des tests de mesurant la symétrie des divisions cellulaires réalisés à partir de cellules isolées de la zone subépendymaire de souris sauvages. Les cellules sont cultivées pendant 24 à 36 heures en présence des drogues indiquées. Les cellules ont marquées avec Glast et EGFR en tant que marqueurs de cellules souches neurales et de progéniteurs transitoires en expansion. Les noyaux sont marqués au DAPI.
La figure 25A représente un double marquage Glast et DAPI.
La figure 25B représente un double marquage EGFR et DAPI.
La figure 25C représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au SAG (0,3 μΜ).
La figure 25D représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au SAG (0,3 μΜ).
La figure 25E représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au LY411575 (10 μΜ).
La figure 25F représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au LY411575 (10 μΜ).
La figure 25G représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au LY411575 (10 μΜ) et au SAG (0,3 μΜ).
La figure 25H représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au LY411575 (10 μΜ) SAG (0,3 μΜ).
La figure 26 est un histogramme montrant l'analyse quantitative du pourcentage de chaque type de division. Ces données montrent que le traitement au SAG augmente le nombre de paires symétriques Glast+/EGFR- comparé aux conditions basales sans drogue. Cet effet est contrecarré par un traitement simultané avec un antagoniste de Smo et Notch, respectivement MRT-83 et LY411575.
La figure 27 montre une augmentation de l'expression de GN1 (D), Notchl (A), et les effecteurs de Notch Hes1 (B) et Hes5 (C) dans les progéniteurs isolés dérivés de la zone subépendymaire de souris adultes Ptc"'" par rapport aux animaux contrôles. Les résultats sont présentés sous forme de gel présentant les résultats de PCR semi- quantitative. L'actine-β est utilisée comme contrôle de charge des ARN.
Les figures 28A à 28F représentent un test de mesure de la symétrie des divisions cellulaires à partir de précurseurs isolés dérivés de la zone subépendymaire de souris adultes Ptc"'" et témoins, indiquant que les cellules exprimant Glast issues des souris Ptc"'" génèrent fréquemment deux précurseur Glast+ après 24 à 36h, comparé aux cultures témoins.
La figure 28A représente une division symétrique de cellule EGFR-, marquée avec Glast et du DAPI.
La figure 28B représente une division symétrique de cellule EGFR-, marquée avec EGFR et du DAPI.
La figure 28C représente une division symétrique de cellule EGFR+, marquée avec Glast et du DAPI.
La figure 28D représente une division symétrique de cellule EGFR+, marquée avec EGFR et du DAPI.
La figure 28E représente une division asymétrique d'une cellule marquée avec Glast et du DAPI.
La figure 28F représente une division asymétrique d'une cellule marquée avec EGFR et du DAPI.
La figure 29 est un histogramme représentant les données quantifiées des expériences présentées aux figures 28A et 28B.
Les figures 30A à 30D représentent des marquages fluorescents BrdU et Ki67 de lames de zone subépendymaire dérivées de souris Ptc"'" et témoins qui ont été traitées avec du tamoxifène 2 mois auparavant et qui ont été analysées 2h ou 24h après une simple injection de BrdU. Les têtes de flèches montrent les cellules the BrdU+Ki67-. La barre représente 100 μηη.
La figure 30 A montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 2h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris témoins.
La figure 30 B montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 24h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris témoins.
La figure 30 C montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 2h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris Ptc"'" .
La figure 30 D montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 24h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris Ptc"'" .
La figure 31 montre le pourcentage de cellules BrdU+ cells dans la population de cellules en division 2h après l'injection de BrdU. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type de trois expériences.
La figure 32 montre le pourcentage de cellules BrdU+ cells dans la population de cellules en division 24h après l'injection de BrdU. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type de trois expériences. **, p<0.01
Reconstitution de la niche de cellules souches de la zone subépendymaire dans des souris Ptc après injection d'AraC in vivo.
Les figures 33A à 33C correspondent à des vues coronaires de la zone subépendymaire montrant les cellules ayant incorporé le BrdU 10j après le retrait de la pompe dans des animaux Ptc"'" ou témoins traités avec un placébo ou de l'AraC. Les animaux ont reçu du tamoxifène six mois avant l'expérience. La barre représente 100 μηη
La figure 33A représente le marquage BrdU/DAPI de souris témoins traitées avec le placébo.
La figure 33B représente le marquage BrdU/DAPI de souris témoins traitées avec l'AraC.
La figure 33C représente le marquage BrdU/DAPI de souris Ptc"'" traitées avec le placébo.
La figure 33D représente le marquage BrdU/DAPI de souris Ptc"'" traitées avec l'AraC. La figure 34 est un histogramme montrant la quantification des cellules marquées au BrdU chez les animaux témoins et chez les animaux Ptc"'" ***, p<0.0001 ; ns, non significatif.
Expression de Ptc dans la zone subépendymaire adulte.
La figure 35 est une hybridation in situ du transcrit Ptc dans la partie dorsale de la zone subépendymaire. La photo du bas est un agrandissement de la région encadrée de la photo du haut. La barre représente 100 μηη.
Les figures 36A à 36C sont des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la partie dorsale de la zone subépendymaire en utilisant un sérum anti Ptc. Les signaux associés aux cellules Ptc+ sont observés dans la zone subépendymaire. La figure 36A représente le marquage avec l'anti sérum. La barre représente 25 μηη. La figure 36B représente I marquage avec le DAPI.
La figure 36C représente la superposition des marquages.
Les figures 37A à 37C sont des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la partie dorsale de la zone subépendymaire en utilisant un sérum anti Ptc prétraité avec une protéine de fusion utilisée pour l'immunisation. Les signaux associés aux cellules Ptc+ ne sont pas observés dans la zone subépendymaire. La barre représente 25 μηη. La figure 37A représente le marquage avec l'anti sérum, pré traité.
La figure 37B représente I marquage avec le DAPI.
La figure 37C représente la superposition des marquages.
Les figures 38 et 39 représentent des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la zone subépendymaire en utilisant le sérum anti-Ptc (Figure 38) ou le sérum pré-immun (figure 39). Le sérum permet d'identifier les cellules Ptc+ tandis que le sérum pré-immun ne le permet pas.
La figure 40 représente un western-blot analysant des lysats totaux ^g de protéines) de cellules HEK293 transfectées transitoirement avec un vecteur vide (mock) ou avec un vecteur contenant la séquence complète du Ptc murin. Les protéines ont été séparée par SDS-PAGE et révélée en utilisant un sérum anti-Ptc. La tête de flèche indique un bande majoritaire de 140 kDa détectées dans les cellules HEK293-Ptc mais pas dans les cellules HEK293-mock. Un second signal de 200 kDa est détecté dans les cellules HEK293-Ptc pouvant témoigner de modifications post traductionnelles. Des protéines de cervelet (Cb, 30μg) ont été analysées avec le sérum anti Ptc et on observe une bande de 140 kDa. Ce signal disparait dans le cervelet (Cb*) lorsque le sérum est prétraité avec la fusion ayant permis l'immunisation. La charge est contrôlée par la détection de l'actine.
Caractérisation de la recombinaison Cre-dans des souris transgéniques.
Les figures 41 A à 41 G représentent des images de fluorescence obtenue à partir d'animaux YFP-témoins ayant reçus une dose de tamoxifène pendant 5 jours, et analysés 2 mois après l'induction.
La figure 41A représente un cerveau complet. Le marquage représente l'expression de la YFP. La barre représente 500μηι. Cb, cervelet; ce, corpus callosum; CPu, caudate putamen; Cx, cortex cérébral; DG, dentate gyrus; LV, ventricule latéral; OB, bulbe olfactif; RMS, courant de migration rostrale.
La figure 41 B est un agrandissement de la région du bulbe olfactif.
La figure 41 C est un agrandissement de la région du caudate putamen.
La figure 41 D est un agrandissement de la région de la zone subépendymaire .
La figure 41 E est un agrandissement de la région du cortex cérébral.
La figure 41 F est un agrandissement de la région du dentate gyrus.
La figure 41 G est un agrandissement de la région du cervelet.
Les figures 42A à 42D représente des hybridations in situ utilisant une sonde ribonucléique de GN1 sur des lames issues de souris Glast-CreERT2/Ptc l/ l traitées avec un placébo ou du tamoxifène 10 jours avant l'analyse. L'induction de GN1 est détectée seulement après traitement au tamoxifène.
La figure 42A représente un marquage sur des souris Glast-CreERT2/Ptc l/ l traitées avec le placébo. La barre représente 400 μηι.
La figure 42B représente un marquage sur des souris Glast-CreERT2/Ptc l/ l traitées avec le tamoxifène. La barre représente 400 μηη.
La figure 42C représente un agrandissement de la région marquée par un carré sur la figure 42A. La barre représente 100 μηη.
La figure 42D représente un agrandissement de la région marquée par un carré sur la figure 42B. La barre représente 100 μηη.
Les figures 43A et 43B montrent que l'expression de GN1 est fortement augmentée sur les lames issues de souris Ptc"'" un an après le traitement au tamoxifène. La barre représente 200 μηη.
La figure 43A est une hybridation in situ utilisant la sonde ribonucléique GN1 sur des lames issues de souris témoins.
La figure 43B est une hybridation in situ utilisant la sonde ribonucléique GN1 sur des lames issues de souris Ptc"'" .
La délétion conditionnelle de Ptc dans les cellules Glast+ de la zone subépendymaire ne modifie pas l'apoptose cellulaire.
Les figures 44A et 44B sont des expériences de mesure d'apoptose par TUNEL sur des zones subépendymaire s de souris témoins (Figure 44B) ou de souris Ptc"'" (figure 44A). La barre représente 100 μηη.
La figure 45 est un histogramme montrant la quantification des noyaux apoptotiques de cellules de la zone subépendymaire de souris témoins ou Ptc"'" 10jours ou 1 an après traitement au tamoxifène.
Recombinaison dans le lignage oligodendroglial.
Les figures 46A et 46B représentent des immunohistofluorescences détectant Olig2 réalisées au niveau du corpus callosum de souris YFP-témoins et YFP-Ptc"'" Les cellules exprimant la YFP correspondent à la fois aux astrocytes endogènes exprimant Glast et aux progénitures des cellules souches Glast+ née dans la zone subépendymaire et qui ont migré et se sont différenciées en cellules du lignage oligodendroglial. La barre représente
La figure 4A représente un double marquage YFP Olig2 dans des souris YFP-témoins. La figure 4A représente un double marquage YFP Olig2 dans des souris YFP-Ptc"'" . Les figures 47 et 48 représentent des histogrammes montrant la quantification de la densité de cellules YFP+ (figure 47 ; nombre de cellules YFP+ par mm2) et le pourcentage de cellules YFP+ (figure 48) qui coexpriment Oligo2 dans des souris YFP- control et YFP-Ptc"'" Le nombre de cellules comptées : 187 pour YFP-témoins et 74 pour YFP-Ptc"'" ).
Visualisation de cultures cellulaires dérivées de la zone subépendymaire de souris témoins et de souris Ptc '
Les figures 49A à 49F représentent des immunohistofluorescences utilisant des anticorps anti- Sox2, anti-Sox9 et anti-Nestine réalisées sur des cultures de précurseurs maintenus en absence de facteurs de croissance pendant 12h avant l'expérience. Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100 μηη.
La figure 49A représente un double marquage Sox2/DAPI sur des cultures issues de souris témoins.
La figure 49B représente un double marquage Sox2/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc"'" .
La figure 49C représente un double marquage Sox9/DAPI sur des cultures issues de souris témoins.
La figure 49B représente un double marquage Sox9/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc"'" .
La figure 49D représente un double marquage Nestine/DAPI sur des cultures issues de souris témoins.
La figure 49E représente un double marquage Nestine/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc"'" .
Les figures 50A à 50R représentent des immunohistofluorescences utilisant des anticorps anti-Tuj1 , anti-Olig2 et anti-GFAP réalisé sur des cellules précurseurs issues de souris témoins ou Ptc"'" maintenues 7 jours avant l'expérience en présence ou en l'absence de l'agoniste de Hh SAG (0,3 μΜ) et l'antagoniste de Hh MRT-83 (3μΜ). Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100μηη.
La figure 50A représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, sans traitement.
La figure 50B représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG.
La figure 50C représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83.
La figure 50D représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc"'"' sans traitement.
La figure 50E représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc"'"' traitées avec du SAG.
La figure 50F représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc"'"' traitées avec du MRT-83.
La figure 50G représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, sans traitement.
La figure 50H représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG.
La figure 501 représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83.
La figure 50J représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc"'"' sans traitement.
La figure 50K représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc"'" traitées avec du SAG.
La figure 50L représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc"'"' traitées avec du MRT-83.
La figure 50M représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, sans traitement.
La figure 50N représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG.
La figure 50O représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83.
La figure 50P représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc"'" sans traitement.
La figure 50Q représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc"'"' traitées avec du SAG.
La figure 50R représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc"'"' traitées avec du MRT-83.
Déplétion des cellules incorporant du BrdU dans la région subépendymaire s de souris sauvages.
Les figures 51 A à 51 C sont des vues coronales de région subépendymaire s montrant des cellules incorporant du BrdU après injection d'AraC ou de placébo dans des souris sauvages.
La figure 51A représente un simple marquage BrdU sur des souris traitées avec le placébo.
La figure 51 B représente un simple marquage BrdU sur des souris traitées avec l'AraC. La figure 51 C représente un double marquage BrdU/DAPI sur des souris traitées avec le placébo.
La figure 51 D représente un double marquage BrdU/DAPI sur des souris traitées avec l'AraC.
La figure 52 représente un histogramme quantifiant le nombre de cellules BrdU+/mm2, dénotant d'une diminution de la prolifération dans les souris traitées à l'AraC. ***, p≤0.0001 .
Influence de la délétion de Ptc sur la masse des souris La figure 53 représente un histogramme montrant la réduction de masse des souris YFP-Ptc"'" par rapport aux souris YFP-témoins après l'injection pendant une semaine de tamoxifène à des souris âgées de 2 à 4 mois. La masse est mesurée 5 mois après injection, et on observe une diminution de 25% de la masse des souris Ptc"'"' Test T de Student *** p<0.0001 .
EXEMPLE
Les cellules souches neurales (NSC) sont confinées dans des niches spécialisées du cerveau tout au long de la vie et donnent des nouveaux neurones qui intègrent les circuits neuronaux. Il est proposé qu'elles participent à la réparation des tissus endommagés. La zone subépendymaire (SEZ), une des principales niches dans le cerveau mammifère adulte, est constitué de NSC de type astrocytes correspondant à une population hétérogène de cellules. Parmi les sous populations identifiées, les NSC actives (aNSC) exprimant le récepteur aux facteurs de croissance épidermique (EGFR) donne lieu à des progéniteurs transitoires à amplification rapide (TAP). La plupart de ces cellules génèrent des neuroblastes migrants le long de la tige ventrale.
Les cellules souches neurales quiescentes n'expriment pas le récepteur à l'EGF (EGFR) et sont résistantes aux drogues anti mitotique ou un l'irradiation. Elle participe au renouvellement de la neurogenèse de la zone subépendymaire via des cellules souches neurales actives et les TAP.
La voie Sonic Hedgehog (Shh) est active dans la zone subépendymaire adulte où il a été proposé son rôle dans la régulation de la prolifération cellulaire, et module la migration des neuroblastes. L'inactivation du récepteur Smoothened (Smo) dans les cellules exprimant le marqueur neuroépithéliales Nestine suggère l'implication de ce transducteur du signal Shh pour le maintien de la population de cellules souches neurales. Patched (Ptc) est le principal récepteur de Shh et est considéré comme un antagoniste de cette voie de signalisation. La délétion embryonnaire de Ptc dans les cellules souches multipotentes (hGFAP)-Cre;Pfcc c conduit à l'apparition médulloblastomes chez la souris. Les tumeurs ne se manifestent que lorsque les cellules se sont engagées dans le lignage neural. Toutefois les effets de l'inactivation de Ptc dans les cellules souches neurales adultes de la zone subépendymaire reste inconnus.
Les inventeurs ont utilisé un transgène Cre inductible au tamoxifène sous contrôle d'un promoteur spécifique des astrocytes exprimé dans les cellules souches neurales.
Les résultats montrent que l'inactivation de Ptc cellules souches neurales adultes de la zone subépendymaire conduit à une diminution drastique processus de neurogenèse et une expansion notable des cellules souches dans la zone subépendymaire. Le blocage de la neurogenèse et du à une modification de la division cellulaire, qui passe d'un mode asymétrique à un mode symétrique, conduisant à une diminution processus de différenciation impliquant la voie Notch.
La délétion conditionnelle de Ptc dans des cellules exprimant Glast induit une activation endogène du signal Hh dans la zone subépendymaire.
Pour étudier le rôle de Ptc dans les cellules souches neurales de la zone subépendymaire adulte, les inventeurs ont utilisé une approche génétique basée sur la délétion conditionnelle du récepteur dans la population astrogliale dans laquelle ils avaient formellement démontré cette expression (Figures 1 à 4 et 35 à 40). Les transcrits Ptc et les protéines Ptc ont été identifié dans la SEZ. Une analyse par microscopique confocale utilisant un sérum dirigé contre Ptc (Figures 35 à 40) montre que l'expression de Ptc est retrouvée dans les cellules GFAP 36±5%) (Figures 1A à 1 C). De plus, l'analyse de souris Ptc+ILacZ permet de visualiser les cellules 3gal+/Ptc+ Tycho exprime Glast, un marqueur des cellules souches neurales de type astrocytes. Par conséquent, les inventeurs ont tiré avantage des souris Glast-CreERT2 exprimant une Cre inductive au tamoxifène inséré en locus Glast pour induire une activité recombinase Cre dans les astrocytes adultes et les cellules souches neurales. Les souris Glast-CreERT2 ont été croisées avec une lignée reporteur ROSA2, R26R-YF. Dans la descendance Glast-CreERT2;Ptcwt/wt;R26R-YFP, l'expression de la YFP est initiée après activation de la Cre recombinant par le tamoxifène et marque toutes les cellules filles des cellules recombinées. Deux mois après le traitement, un grand nombre de cellules est détecté dans la SEZ et coexpriment les marqueurs Glast et GFAT (Figures 3A à 3F). L'analyse confocale de la niche SEZ montre que le rapporteur YFP est exprimé dans 85±5% des cellules positives pour Glast. La recombinaison a également lieu dans les cellules astrogliales de la zone subgranulaire de l'hypocampe et dans d'autres populations astrogliales à travers le cerveau, comme cela est attendu pour le gène Glast.
Ptc est inactivé dans les cellules positive pour Glast par croisement de souris Gast- CreERT2 ou YFP-témoin avec des lignées de souris Ptc l/ l permettant l'excision des exons 8 et 9 codant le domaine impliqué dans la liaison à Shh. Les souris adultes Glast-CreERT2;Ptcfl/fl (dites Ptc1') et leur contrepartie Ptc™ (appelées témoins) sont traitées avec du tamoxifène et étudiées 10 jours, 2, 6 ou 12 mois après. Malgré la perte de masse des animaux Ptc1' traités avec le tamoxifène (Figure 53) un an avant, le cerveau de ces animaux est macroscopiquement similaire à celui des souris témoins. Aucune tumeur n'est détectable. L'étude de l'expression de GN1 ou de Ptc est mesurée comme contrôle de l'activation de la voie Hh. Dans les souris Ptc'1', les deux gènes sont fortement régulés positivement dans la région dorsale et ventrale de la SEZ montrant ainsi une activation soutenue de la voie Hh par rapport aux témoins. Des expériences témoins additionnelles montrent la spécificité de la transcription à la fois de GN1 et Ptc dans les animaux Pfc "(Figures 4A à 4F; mais également Figures 42A à 42D et 43A et 43B).
Ces résultats montrent que la recombinaison médiée par la recombinase Cre permet une délétion efficace de Ptc dans les cellules positives pour Glast conduisant ainsi à une activation persistante de la voie Hh dans la niche SEZ adulte.
La délétion de Ptc affecte la prolifération et diminue la neurogenèse.
Pour déterminer l'effet de la délétion de Ptc dans les cellules Glast+ dans la SEZ, le taux de prolifération rapide des cellules (TAP et neuroblastes) est mesuré par administration de BrdU par impulsion à des intervalles de 2h. Les impulsions ont été réalisées à différents temps (10 jours, 2, 6, 12 mois). Dans les animaux témoins, le nombre de cellules BrdU positives diminue entre 2 et 6 mois après le traitement, ce qui révèle probablement un déclin régulier lié à l'âge. De manière intéressante, les cellules BrdU positives diminuent dans les cellules de la SEZ des souris Ptc1' comparées aux souris témoins tout au long de l'étude. A 10 jours, la diminution de 27% est déjà hautement significative et cette diminution va jusqu'à 54% à 2 mois. La diminution de la prolifération rapide est observé jusqu'à 6 mois après traitement et a quasiment disparue au bout d'un an dans les souris Ptc1'. Les inventeurs ont exclu de leur hypothèses la diminution de la survie cellulaire puisque le nombre de cellules TUNEL positives n'est pas significativement différent dans la SEZ des souris Ptc'1', tout au long de l'étude. De manière remarquable, la visualisation des cellules EGFR+ dans la SEZ, montre une diminution de plus de 93% dans les souris Ptc'1', au bout de 12 mois. Le nombre de cellules PSA-NCAM est également réduit de plus de 90% dans les souris Ptc'1', ce qui est corrélé avec le fort taux d'excision dans ces animaux ce qui a pour conséquence une quasi absence de neuroblastes migrant de la SEZ (Figures 7A à 7F et 8). Par contre, la densité de cellules GFAP+ qui correspond aux astrocytes et aux cellules souches neurales dans la SEZ montre une augmentation de 62% dans les souris Ptc'1', après 12 mois (Figures 9A et 9B et 10).
A 2 mois, la quantification des populations cellules de la SEZ montre que la délétion de Ptc augmente de presque 2 fois le nombre de cellules Glast+ qui correspondent aux cellules astrocytaires et aux cellules souches neurales, et de presque 2 fois le nombre de cellules souches KÎ67+/GFAP+. Les TAP et les neuroblastes diminuent de deux fois comme l'indique les marquages par l'EGFR et PSA-NCAM (Figures 11 A à 11 L et 12). De plus, en l'absence de Ptc, les inventeurs ont observé une augmentation du nombre de cellules Sox2+ et Sox9+, tous deux exprimés dans les TAP et les cellules souches neurales.
Ces données montrent que la délétion de Ptc est associée à une augmentation du nombre de cellules souches neurales de type astrocytes dans la SEZ et une diminution du nombre de TAP et de neuroblastes migrants.
Les cellules filles issues des cellules recombinées sont suivies grâce à l'expression de la YFP dans les souris Glast-CreERT2;Ptcfl/fl;R26R-YFP (dites YFP-Ptc'1') et dans les souris YFP-témoins traitées au tamoxifène, deux mois après le traitement. Comme attendu, de forts signaux YFP sont détectés dans le système SEZ-RMS-OB des souris témoins (Figure 13A à 13H) et également dans le corpus callosum (ce) où elles révèlent les populations nouvelles issues de la SEZ et les cellules astrogliales exprimant Glast dans les tractus fibreux (Figure 46A et 46B). Dans les animaux YFP- Ptc'1', la quantification des cellules YFP+ dans les couches granuleuses (GrO) et gloméruleuses (Gl) du bulbe olfactif (OB) (Figure 14A à 14C) et dans le ce (Figures 46A et 46B and 47) montre une diminution respective de 69%, 36% et 51 %. De plus, le signal fluorescent est drastiquement réduit dans le RMS (qui relie la SEZ au OB) (Figures 13A à 13H).
Comme les résultats montrent une diminution des nouvelles cellules dans la SEZ, les inventeurs ont étudié le phénotype des cellules dérivées de la SEZ dans leurs organes de destination : OB (Figures 15A à 15J et 16), et ce (Figure 48). Dans le GrO, la couche de ΓΟΒ où les cellules maturent en interneurones gabaergiques, le pourcentage de cellules YFP+ exprimant le marqueur neural NeuN ou cfos, un facteur de transcription rapidement régulé par l'activité neurale, reste inchangé dans les souris Ptc1'. Ces données indiquent qu'il n'y a pas de différence dans la proportion de neurones ayant intégré la couche GrO. The inventeurs ont alors étudié le pourcentage de cellules YFP+ exprimant la tyrosine hydoxylase (TH), la calbindine ou le transporteur 2 vésiculaire du glutamate {vGlut2), qui marquent un sous-groupe de cellules ayant intégré la couche Gl. Dans les mutants conditionnels Ptc, le pourcentage de cellules nouvellement générées marquées à la calbindine n'est pas significativement modifié. Par contre, le pourcentage de cellules YFP+ coexprimant soit TH ou vGlut2 est respectivement trois fois plus élevé ou réduit. De manière remarquable, un an après le traitement au tamoxifène, l'architecture cellulaire multicouche de l'OB n'est pas modifiée dans les souris Ptc1' comparé au témoin (Figure 17A et 17B). Dans le ce, une diminution de deux fois des cellules YFP+ exprimant Olig2 est observée dans les souris Ptc'1' (Figure 48) suggérant que la délétion de Ptc diminue la capacité de genèse de nouveaux précurseurs d'oligodendrocytes. L'ensemble de ces résultats montre que la genèse de nouveaux précurseurs est largement diminuée dans la SEZ des mutant Ptc conditionnels. Bien que ces précurseurs aient encore la capacité de se différencier en neurones et en oligodendrocytes respectivement dans l'OB ou le ce, ils ne présentent pas les caractéristiques de la différenciation. L'invalidation de Ptc dans les progéniteurs neuraux dérivés de la SEZ modifie la capacité de différenciation cellulaire dans des tests de neurospère.
Pour évaluer les conséquences de l'invalidation de Ptc dans les progéniteurs SEZ, les inventeurs ont utilisé le test des neurosphères pour étudier les propriétés des cellules souches et des cellules progénitrices dans les deux modèles Ptc"'" et témoin. Aucune différence de formation des sphères de cellules dérivées de la SEZ de souris Ptc"'" n'est observée deux mois après le traitement au tamoxifène, malgré une augmentation de l'expression de Gli (Figures 18A à 18C et 19). L'expansion clonale montre que l'absence de Ptc n'altère pas l'apparente capacité d'auto-renouvellement des neurosphères. Toutefois la quantification des sous populations des neurosphères selon leur diamètre montre un grand nombre de neurosphères larges (≥100 μηη) dérivées de la SEZ de souris Ptc"'" (Figure 20). Cette observation suggère que les neurosphères issues de la SEZ de souris Ptc"'" possèdent plus de cellules souches que celles issues de la SEZ de souris témoin, puisque cela avait déjà été proposé que les cellules souches neurales actives donnent naissance à des sphères de large taille alors que les progéniteurs donnent naissance à des sphères plus petites. Ces résultats sont cohérents avec la diminution de TH dans la SEZ des animaux Ptc"'"
Une fois dissociées, les neurosphères sont cultivées pendant 12h en l'absence de facteurs de croissance. De manières significative, plus de cellules expriment le marqueur Sox9 dans les neurosphères Ptc"'" comparé aux neurosphères témoins. (Figure 21 ; voir également Figures 49A à 49F). Par contre, l'expression de Sox2 n'est pas modifiée de manière significative dans les deux types de neurosphères, alors que le nombre de cellules neuroépithéliales Nestine positives est augmenté de 1 ,6 fois dans les souris déficientes en Ptc, ce qui témoigne d'une diminution de la différenciation. Pour étudier la multipotence des cellules souches neurales Ptc"'", les neurosphères ont été cultivées pendant 7 jours en l'absence de facteurs de croissance pour permettre la différenciation en neurones en oligodendrocytes et en astrocytes. Bien que les cellules souches neurales Ptc"'" conservent leur multipotence, leur capacité à se différencier est modifiée (Figures 21 , 22 et 23; voir également Figures 50A à 50R). Le pourcentage de neuroblastes Tuj1 + et d'oligodendrocytes Olig2+ est réduit significativement dans les souris Ptc"'" tandis que le nombre d'astrocytes GFAP+ n'est pas modifié par la délétion de Ptc. La modulation par l'intermédiaire de Smo a été étudiée. (Figures 21 , 22 et 23). En accord avec l'activation de Smo dans le phénotype Ptc"'", le nombre de neuroblastes Tuj1 +, d'oligodendrocytes Olig2+ et d'astrocytes GFAP+ est réduit dans les souris témoins après addition de SAG, un activateur de Smo. Par contre, l'inhibiteur de Smo MRT-83 ne modifie pas la genèse des cellules suggérant que la voie Hh est antagonisée par Ptc. Toutefois, le MRT-83 augmente la capacité des cellules Ptc"'" à se différencier en neuroblastes, en oligodendrocytes et en astrocytes. Aussi, la restauration du phénotyoe Ptc"'" par le blocage de Smo est associé à l'inhibition constitutive que Ptc exerce sur Smo. De plus, l'invalidation de Ptc diminue le nombre total de cellules entrant en différenciation bien qu'elle n'inhibe pas la différenciation terminale des cellules déjà engagée dans le processus de différentiation. L'absence de Ptc dans les progéniteurs neuraux conduit à la formation de paires symétriques Glast+/EGFR+ par l'intermédiaire de la voie Notch et réduit la sortie du cycle cellulaire des TAP.
L'inactivation de Ptc dans les cellules Glast+ de la SEz adulte conduisant à une augmentation des cellules souches neurales a conduit les inventeurs à évaluer la potentielle interconnexion entre les voies Hh et Notch qui a été impliquée dans la régulation du cycle cellulaire durant la corticogénèse et le maintien des cellules souches neurales. Dans un premier temps, les inventeurs ont utilisé le test de clonalité des paires de cellules adapté du protocole décrit dans (Dave et al. 2011 , PloS one 6, e14680).
Les cellules primaires ont été ensemencées directement après leur isolement de la SEZ et maintenues en culture pendant 24 à 36h pour permettre la division cellulaire. Les anticorps anti-Glast et anti-EGFR ont été utilisés pour marquer respectivement les cellules souches et leur descendance. Les cellules isolées de la SEZ de souris contrôles ont été traitées avec l'agoniste de Smo (SAG) en présence ou en l'absence d'inhibiteur de la γ-sécrétase, le LY411575, qui inhibe l'activation des récepteurs Notch endogens dépendants de la protéolyse. Le SAG promeut les paires symétriques Glast+/EGFR- au dépens des paires Glast+/EGFR+ compare aux conditions basales. L'effet médié par le SAG est contrebalancé par le traitement au LY411575 comme par le traitement à l'antagoniste de Smo MART-83 (Figures 25A à 25H et 26). Ces résultats indiquent la genèse de paires symétriques Glast+/EGFR- est dépendante de la voie Hh, correspondant à un état activé des cellules souches neurales différent de celui des cellules Glast+/EGFR+ qui est dépendant de la voie Notch. Les inventeurs ont alors réalisés des analyses par RT-PCR dans les neurosphères dérivées de zone sous ventriculaire (SVZ) d'animaux Pet"'" ou contrôles traités au tamoxifène pendant deux mois. Notch, Hes1 et Hes5 sont surexprimés lorsque Ptc est invalidé (Figures 27A à 27E), démontrant que la voie Notch est activée par la délétion de Ptc.
Les inventeurs ont ensuite testé si l'effet sur la symétrie des cellules souches neurales Glast+EGFR- observée sous activation pharmacologique de Smo pourrait être observé dans la cadre de la délétion de Ptc dans les cellules souches adultes. Dans des cultures de cellules dérivées de souris Ptc"'" traitées au tamoxifène deux mois auparavant, une augmentation de 4 à 5 fois des paires symétriques Glast+/EGFR- est observée au dépens des paires symétriques Glast+/EGFR+ comparé aux contrôles (Figures 28A à 28F et 29). La délétion de Ptc dans les cellules souches neurales dérivées de la SEZ favorise donc la formation de cellules souches neurales Glast+/EGFR- symétriques. L'absence de diminution significative de paires symétriques Glast+/EGFR+ suggère que l'activation pharmacologique de Smo dans les neurosphères contrôles n'est pas complètement comparable à l'invalidation in vivo de Ptc en ce qui concerne le mécanisme d'auto-renouvellement des cellules souches neurales Glast+/EGFR- et les cellules souches neurales actives.
Les inventeurs ont réalisé des expériences de pulsation de BrdU dans une population de cellules en cycle cellulaire exprimant Ki67 dans la SEZ d'animaux ayant reçu une dose de tamoxifène deux mois auparavant. Une pulsation de BrdU de 2h montre une prolifération des TAP et dans une moindre mesure des neuroblastes. Ce protocole a permis aux inventeurs de déterminer que l'index de marquage n'est pas modifié par l'inactivation de Ptc (Figures 30A à 30C et 31 ). Les inventeurs ont également évalué le nombre de cellules sortant du cycle cellulaire lors que les animaux sont tués 24h après l'injection de BrdU. La quantification du nombre de cellules en prolifération restant en cycle 24h après incorporation du BrdU (cellules KÏ67+) montre un pourcentage de 2 fois moins de cellules sorties du cycle cellulaires dans les souris Ptc"'" que dans les contrôles (Figure 32). Ces résultats montrent que la délétion de Ptc diminue le nombre de cellules sortant du cycle cellulaire proliférant rapidement et donc leur capacité à différencier.
Ptc est nécessaire à la reconstitution de la niche de cellules souches de la SEZ après un traitement in vitro à l'AraC.
Les inventeurs ont testé dans les animaux Ptc"'" et témoins traités au tamoxifène 6 mois auparavant le taux de cellules souches neurales restant après traitement à l'antimitotique AraC, agent qui tue les cellules souches en prolifération, les T et le neuroblastes proliférant, mais préserve les cellules souches neurales quiescentes. Après une inactivation transitoire de la neurogénèse par traitement à l'AraC, la SEZ endommagée est régénérée par des cellules souches neurales de type astrocyte résultant de l'augmentation de la prolifération et de la genèse de cellules souches neurales actives et de TAP. Immédiatement après le traitement à l'AraC (Jour 0), les cellules ayant incorporé le BrdU sont majoritairement absentes (Figures 51 et 52). Dix jours après (Jour 10), la population cellulaire BrdU+ est revenue à la normale dans les SEZ témoins comparé au placébo (Figures 33A et 33B et 34). Toutefois, le nombre de cellules BrdU+ dans les SEZ Ptc"'" est 3 fois plus bas après traitement à l'AraC comparé au placebo (Figures 33C et 33D et 34). Ces données montrent que, suite au traitement AraC, l'absence de Ptc inhibe l'activation des cellules souches neurales quiescentes et inhibe leur induction vers des TAP. Aussi, Ptc est requis pour la régénération de la SEZ après lésion.
Discussion
L'inactivation conditionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales permet d'étudier l'activation de la signalisation Hh in vivo de manière indépendante du ligand dans la SEZ. Cette activation est médiée par la levée de l'inhibition de Ptc sur Smo et promeut la genèse de paires symétriques Glast+/EGFR- comme cela est observé in vitro.
De plus, les données des inventeurs suggèrent également une altération de la transition entre les cellules souches neurales actives et les TAP, ce qui rend compte de la diminution des TAP et pat conséquent de la diminution des neuroblastes. L'expression de la voie Notch et des facteurs de transcription Sox2 et Sox9, connus pour inhiber la différentiation neurale est également augmentée. En relation avec cette altération de la transition entre les celles souches neurales actives et les TAP, les inventeurs ont également que les cellules souches neurales déficientes en Ptc ne régénéraient pas correctement la SEZ après traitement avec un agent anti-mitotique. L'activation soutenue de Hh dans les SEZ de souris Ptc"'" maintient la pluripotence, mais influence la destinée des précurseurs dérivés de la SEZ vers soit un phénotype oligodendroglial dans le ce ou un phénotype glutaminergique ou dopaminergique, deux populations des interneurones de l'OB periglomérulaire, cette détermination étant d'un grand intérêt dans les mécanismes de réparation du cerveau. L'activation à long terme de la signalisation Hh est toujours détectée un an après la recombinaison de Ptc. Cependant, l'absence d'altération majeure de la morphologie de l'OB observée par les inventeurs est en accord avec les données déjà rapportées montrant que la neurogenèse adulte dans la SEZ permet seulement un renouvellement partiel des nouveaux neurones dans l'OB.
Les résultats des inventeurs montrent que l'interaction entre les voies de signalisation Hh et Notch dans la neurognèse adulte peut contribuer au maintien des cellules souches neurales, inhibant ainsi leur transition vers les TAP. Une telle interconnexion a été proposée comme étant requise pour la régulation des divisions neurogéniques et dans le développement d'une corticogenèse correcte. L'activation constitutive de la voie Hh par l'intermédiaire de la délétion Ptc dans les cellules de la crête neurale entérique active également fortement la voie Notch par l'intermédiaire de la surexpression de Hes-1 et induit une gliogenèse prématurée inhibant la formation par ces cellules de ganglions durant le développement du système nerveux entérique.
En accord avec l'interconnexion des voies Hh et Notch dans la SEZ adulte, les cellules souches neurales sont à la fois des cellules Hh- et Notch-. Si les facteurs de transcription Hes sont généralement considérés comme des effecteurs canoniques de la voie Notch, une activité Hh/Hes1 indépendante de Notch a été décrite au cours de la prolifération des progéniteurs dans la rétine. Bien que le lien direct entre Hes1 et la voie Hh dans les cellules souches adultes reste inconnu, les résultats des inventeurs montrent que l'effet de l'activation de Hh est dépendant de Notch. Les TAP ont été décrites comme régulant l'auto-renouvèlement des cellules souches neurales in vivo et une interaction entre les voies de signalisation EGFR et Notch a été proposée comme ayant des rôles sélectifs dans ce processus où EGFR est un régulateur en amont de Notch par l'intermédiaire d'un mécanisme non autonome. Puisque l'inactivation conditionnelle de Ptc conduit à une grande diminution des TAP exprimant EGFR dans la SEZ, la diminution subséquente d'EGFR pourrait amplifier l'induction de la voie Notch et être responsable des effets observés. Egalement, l'augmentation de Sox9 dans les mutant Ptc"'" est en accord avec les résultats indiquant que la signalisation Hh active induit la transcription de Sox9 résultant en la capacité des cellules neuroépithéliale à former des neurosphères.
Bien que Ptc ait été décrit comme un gène suppresseur de tumeur, les inventeurs ont montré que sa délétion dans les cellules souches neurales de type astrocytaire augmente la capacité souche de ces cellules sans induire de formation de tumeurs. Une des explications est que Ptc contrôle les étapes majeures du maintien de cellules souches dans la SEZ : l'absence d'activité antagoniste sur Smo conduit à un blocage des cellules prolifératives EGFR+, probablement par une augmentation des divisions symétriques des cellules souches neurales.
Les résultats des inventeurs montrent que les signaux médiés par Ptc sont impliqués dans la régulation de la genèse des cellules souches requises pour le maintien d'au taux de neurogenèse normal. Plutôt que promouvoir l'expansion des cellules souches neurales et de leurs précurseurs, la délétion de Ptc est associé à un blocage de la prolifération des cellules EGFR+ conduisant à une quasi disparition de la neurogenèse. Ainsi, les souris Glast-CreERT2;Ptcfl/fl sont un bon modèle pour évaluer la régulation et les mécanismes de transduction du signal dans les cellules souches de la SEZ, dans les conditions normales ou pathologiques. Ces souris sont d'un intérêt majeur pour évaluer l'effet de Ptc dans le maintien des cellules souches neurales dans la zone subgranulaires de l'hippocampe.
Procédures expérimentales
Animaux. Sauf indications contraires, des animaux de 8 à 12 semaines ont été utilisés. Les souris Glast-CreERT2 (Mori et al. 2006, Glia 54, 21-34) ont été reçues dans un contexte génétique mélange 129 x C57BL/6 et croisées sur trois générations avec des souris de contexte génétique C57BL/6. La lignée de souris Patched floxé homozygote (Uhmann et al.; 2007, Blood, 110, 1814-1823) ont été reçues et maintenue dans un contexte génétique C57BL/6. La lignée de souris rapporteuse R26R-YFP/+ (Srinivas et al., 2001 , BMC Dev. Biol. 1 , 4) ont été maintenues dans un contexte génétique C57BL/6.
Les souris Glast-CreERT2 ont été croisées avec les souris Patched floxées. La descendance a alors été croisée avec les souris R26R-YFP/+ comme décrit précédemment (Soriano, 1999, Nature 21 , 70-71 ). Toutes les procédures ont été mises en œuvre selon les directives européennes 86/806/EEC.
Administration de tamoxifène et de BrdU. Le tamoxifène (Sigma) a été dissout dans de l'huile de maïs (Sigma) à une concentration de 10 mg/mL et 1 mg a été injecté aux animaux par voie intrapéritonéale (i.p.) deux fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Les animaux ont été sacrifiés 10 jours, 2 mois, 6 mois ou 12 mois après la fin du traitement au tamoxifène. Afin de marquer les cellules prolifératives, les souris ont reçu par voie i.p. une injection de bromodéoxyuridine (BrdU; Sigma; 100 mg/kg de masse corporelle) 4heures ou 2 heures avant le sacrifice (groupes de 5 à 6 souris). Pour la détermination de la sortie du cycle cellulaire, les animaux ont reçu deux injections i.p. de BrdU à deux heures d'intervalle et ont été sacrifiées 24h après la dernière injection. Perfusion à l'aide de mini pompes osmotiques. Pour tuer les cellules proliférant rapidement dans la SEZ, de l'AraC (2% Sigma) dans un véhicule (0,9% de sel) a été perfuse dans le ventricule latéral de souris témoins et Ptc"'" qui ont été traitées 6 mois auparavant avec du tamoxifène. Les inventeurs ont utilisé des mini pompes osmotiques (Alzet). Après 7 jours de perfusion, les pompes sont retirées et les souris tuées 10 jours après la fin du traitement AraC. N=4 par conditions. Des canules ont été implantées stéréotacicalement dans le ventricule latéral aux coordonnées suivantes : AP, 0.2 mm; ML, 0.8 mm; DV, -2.5 mm (en rapport avec Bregma).
Histologie et marquages immunologiques. Les animaux ont été perfusés, ou non, avec de la paraformaldéhyde à 4% et les sections de tissus ont été découpées au cryostat. Les anticorps utilisés sont décrits ci-après. Pour les marquages hématoxyline et éosine, l'hématoxyline (Vector) et l'éosine (Polysciences) ont été utilisés. Les noyaux sont marqués au DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole ; Vector).
Hybridation in situ (ISH). Le protocole et la synthèse des sondes ribonucléiques Ptc, GN1 et GFAP ont été décrits précédemment (Traiffort et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11 , 3199-3214). La sonde Ptc del correspond aux nucléotides 1025-1305 de Ptc murin (Genbank n° d'accession NM_008957.2). La sonde vGlut2 a été décrite précédemment (Borgius et al., 2010, Mol. Cell. Neurosci. 45, 245-257).
Cultures de neurosphères. La SEZ télencéphalique a été disséquée à partir d'adultes sauvages, Ptc"'" ou témoins (Pastrana et al., 2011 , Cell stem cell 8, 486-498). Les fragments de SEZ ont été digérés dans une solution de papaïne 5sigma) et de trypsine (Invitrogen) pendant 20 min à 37°C et dissociées mécaniquement par passage dans une aiguille d'épaisseur 26. Sans indications contraires, les cellules ont été ensemencées à 5000 cellules par puits dans des plaques 24-puits dans du milieu sans sérum consistant en du DMEM additionné avec du B27, de la pénicilline/streptomycine, du sodium pyruvate et en présence de 20 ng/mL d'EGF et 10 ng/mL de facteur basique de croissance des fibroblastes (FGF, Invitrogen). Après 6 à 9 jours en culture, les sphères sont récoltées, incubées dans 0,05% de trypsine (Invitrogen) pendant 30 à 60 min à 37°C, sont dissociées mécaniquement et séparées en cellules uniques au travers d'une seringue comme décrit précédemment. Sauf indication contraire, les expériences utilisant des cellules isolées ou des neurosphères (traitées ou non avec des drogues) sont réalisées après un ou deux passages ou sur des sphères primaires.
Pour les expériences de multipotence, 5 à 10 sphères ont été cultivées sur des lamelles recouvertes de la poly-lysine (Sigma) dans le milieu dépourvu de sérum décrit ci-dessus pendant 7 jours.
Pour les études de fluorescence, les cellules ont été fixées dans 4% PFA à 4°C pendant 30 min, avant de bloquer pendant 30 min à température ambiante dans 0,5% de BSA dans du PBS. Les cellules fixées ont alors été incubées avec un anticorps primaire à température ambiante pendant 90 min, suivi par une incubation avec les anticorps secondaires pendant 60 min à température ambiante et montées sur des lames.
Pour les tests de cellules appariées, des cellules isolées sont ensemencées directement après microdissection de la zone sous ventriculaire (SVZ) sur des lamelles à une densité cellulaire d'environ 50 000 cellules part puits. Les cultures ont été maintenues pendant 24 à 36 h en présence de 10ng/mL d'EGF. Les analyses IHF sont réalisées comme décrit ci-dessus. Environ 60 paires ont été étudiées dans chaque échantillon issu d'animaux sauvages ou mutants.
Drogues. Le SAG et le MRT-83 ont été synthétisées comme décrit précédemment (Roudaut et al, 2011 , Mol. Pharmacol. 79, 453-460).
RT-PCR semi-quantitative. Les ARN totaux ont été extraits en utilisant le kit Trizol (Invitrogen) à partir de cultures de sphères dérivées d'animaux traités au tamoxifène 2 mois auparavant. Les ARN ont subi une transcription inverse dans 20 μΙ de solution comprenant la reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen). Les réactions de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ont été réalisées en utilisant la polymérase Go Taq (Promega). Les amorces spécifiques sont décrites ci-après. L'actine a été utilisée comme témoin de charge des ARN.
Quantification et analyse statistique. Les signaux immunofluorescents ont été détectés par un microscope épifluorescent conventionnel (DMRXA2; Leica Microsystems) équipé d'une caméra CDD (Photometrics) or scannée pour les plans Z pour la colocalisation par un micoscope ApoTome (ZEISS) et le logiciel Axiolmager. Les sections optiques sont de 1 μηι d'intervalle. Les signaux immunofluorescents sont quantifiés avec le logiciel Image. Les comptages cellulaires sont présentés en tant que moyennes de plusieurs coupes de SEZ ou bulbes olfactifs d'au moins trois souris pour chaque groupe. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant un test bilatéral f de Student. Une signifiance statistique est considérée pour p<0.05.
Analyses par western blot. Les cervelets de souris P5 OF1 (Charles Rivers, Saint- Germain sur l'ArbresIe, France) ont été homogénéisés. Les protéines dérivées du culot obtenu après 20 min de centrifugation à 9000 g ont été séparé par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 8% comme décrit précédemment (Coulombe et al., 2004, Mol. Cell. Neurosci. 25, 323-333). Ptc murin est détecté avec un antisérum polyclonal (130Ab, 1 :1000; Bidet et al., 2011 ). Les expériences de blocage ont été réalisée en incubant toute la nuit l'antisérum avec une protéine de fusion recombinante purifiée GST-Ptc (glutathione-S-transferase Ptc) à une concentration de 15 μg/mL.
Analyses par TUNEL. Les marquages TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end; ApoptagR Peroxidase In situ Apoptosis Détection Kit; Millipore) ont été realizes en suivant les instructions du fabricant.
Anticorps utilisés pour l'immunohistofluorescence. Les anticorps anti BrdU, GFAP, NeuN, PSA-NCAM ont été décrits précédemment (Angot et al., 2008, Stem cells 26, 2311 -2320). Les autres anticorps utilisés sont les suivants : anticorps issus de la chèvre dirigés contre c-fos (1/300; Santa Cruz), anticorps issus de lapin dirigés contre doublecortin (1/500, fourni par F. Francis), anticorps issus de souris dirigés contre Ki67 (1/300; BD Pharmagen), anticorps issus de cobaye dirigés contre Glast (1/100; Millipore), anticorps issus de souris dirigés contre Nestine (1/500; Millipore), anticorps issus de lapin dirigés contre Olig2 (1/1000; Millipore), PDGFRa de rat(1/400; BD Pharmagen), anticorps issus de lapin dirigés contre Sox2 (1/400; Millipore), anticorps issus de la chèvre dirigés contre Sox9 (1/400; R&D Systems), anticorps issus de lapin dirigés contre Tuj1 (1/500; abcam), anticorps issus de lapin dirigés contre Calbindine (1/500, Swant). Les anticorps secondaires sont des anticorps conjugués de : chèvre anti-souris Alexa 546 (Molecular Probes), chèvre anti-lapin Alexa 555 (Life Technologies), âne anti-chèvre Alexa 546 (Life Technologies), chèvre anti-souris FITC (Sigma), cobaye DyLight 488 (Jackson immunoresearch), chèvre anti-rat Alexa 488 (Jackson Immunoresearch), âne marqué à la biotine anti-rat (biotinylée Vector Laboratories), âne anti-souris DyLight 649, âne anti-chèvre DyLight 649 ou âne antilapin DyLight 649 (Jackson Immunoresearch).
Séquences des amorces utilisées pour les RT-PCR semi-quantitatives Notchl sens: 5'-■CCAGCATGGCCAGCTCTGG-3' (SEQ ID NO : 1 ) antisens: 5'- ■CATCCAGATCTGTGGCCCTGTT-3' (SEQ ID NO : 2)
Hes1 sens: 5'- ■AAAGACGGCCTCTGAGCACA-3' (SEQ ID NO : 3) antisens: 5'- ■TCATGGCGTTGATCTGGGTCA-3' (SEQ ID NO : 4)
Hes5 sens: 5'-AAGTACCGTGGCGGTGGAGATGC-3' (SEQ ID NO : 5) antisens: 5'- ■CGCTGGAAGTGGTAAAGCAGCTT-3' (SEQ ID NO : 6)
GN1 sens: 5'- ■TTCGTGTGCCATTGGGGAGG-3' (SEQ ID NO : 7) antisens: 5'- ■CTTGGGCTCCACTGTGGAGA-3' (SEQ ID NO : 8)

Claims

Revendications
1. Mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle biallèlique du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales, ledit mammifère ayant un génotype sauvage pour le gène Ptc, à l'exception des cellules souches neurales et/ou des cellules gliales qui ont un génotype Ptc"'".
2. Mammifère transgénique non humain selon la revendication 1 , où lesdites cellules souches neurales et/ou lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast.
3. Mammifère transgénique selon la revendication 1 ou la revendication 2, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l, à l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERT2;Ptc"'".
4. Cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptc"'".
5. Mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast- CreERT2;Ptcfl/fl.
6. Utilisation du tamoxifène pour l'invalidation, notamment in vitro, du gène Ptc dans des cellules de mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptc l/ l.
7. Méthode d'inhibition de la différenciation, notamment in vitro, des cellules souches neurales, comprenant une étape de mise en contact de cellules souches neurales préalablement obtenues à partir d'un mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptcfl/fl.
8. Utilisation du tamoxifène pour induire le blocage de la différenciation, en particulier in vitro, de cellules souches neurales ou de cellules gliales, lesdites cellules souches et cellules neurales présentant un génotype Glast-CreERT2;Ptc"'".
9. Méthode de modulation, notamment in vitro, de l'expression du gène Ptc dans des cellules souches neurales ou dans des cellules gliales, notamment des cellules souches isolées, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact desdites cellules souches neurales ou desdites cellules gliales avec une dose efficace de tamoxifène, lesdites cellules souches neurales et/ou gliales présentant un génotype Glast-CreERT2;Ptcfl/fl.
PCT/FR2015/050981 2014-04-11 2015-04-13 Modèle animal présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant pour le récepteur membranaire patched ou ptc Ceased WO2015155490A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1453268 2014-04-11
FR1453268A FR3019712B1 (fr) 2014-04-11 2014-04-11 Modele animal et ses utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015155490A1 true WO2015155490A1 (fr) 2015-10-15

Family

ID=51225701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2015/050981 Ceased WO2015155490A1 (fr) 2014-04-11 2015-04-13 Modèle animal présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant pour le récepteur membranaire patched ou ptc

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3019712B1 (fr)
WO (1) WO2015155490A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125273A (zh) * 2021-03-29 2022-09-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061582A2 (fr) 1998-05-29 1999-12-02 The Board Of Trustees Of The Leland S. Stanford, Jr. University Animaux transgeniques a transduction du signal du 'patched' et leurs utilisations associees

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061582A2 (fr) 1998-05-29 1999-12-02 The Board Of Trustees Of The Leland S. Stanford, Jr. University Animaux transgeniques a transduction du signal du 'patched' et leurs utilisations associees

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGOT ET AL., STEM CELLS, vol. 26, 2008, pages 2311 - 2320
BORGIUS ET AL., MOL. CELL. NEUROSCI., vol. 45, 2010, pages 245 - 257
COULOMBE ET AL., MOL. CELL. NEUROSCI., vol. 25, 2004, pages 323 - 333
DAVE ET AL., PLOS ONE, vol. 6, 2011, pages E14680
DAYNAC ET AL., STEM CELL RESEARCH, vol. 11, 2013, pages 516 - 528
ELISABETH TRAIFFORT ET AL: "Discrete localizations of hedgehog signalling components in the developing and adult rat nervous system", EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 11, no. 9, 1 September 1999 (1999-09-01), pages 3199 - 3214, XP055137274, ISSN: 0953-816X, DOI: 10.1046/j.1460-9568.1999.00777.x *
ELISABETH TRAIFFORT ET AL: "Regional Distribution of Sonic Hedgehog, Patched, and Smoothened mRNA in the Adult Rat Brain", JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, vol. 70, no. 3, 1 March 1998 (1998-03-01), pages 1327 - 1330, XP055137279, ISSN: 0022-3042, DOI: 10.1046/j.1471-4159.1998.70031327.x *
INGHAM ET AL., DEV BIOL, vol. 330, no. 2, 2001, pages 3059 - 87
J. FERENT ET AL: "Sonic Hedgehog Signaling Is a Positive Oligodendrocyte Regulator during Demyelination", JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 33, no. 5, 30 January 2013 (2013-01-30), pages 1759 - 1772, XP055137297, ISSN: 0270-6474, DOI: 10.1523/JNEUROSCI.3334-12.2013 *
L. V. GOODRICH: "Altered Neural Cell Fates and Medulloblastoma in Mouse patched Mutants", SCIENCE, vol. 277, no. 5329, 22 August 1997 (1997-08-22), pages 1109 - 1113, XP055137240, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.277.5329.1109 *
MARTA BOCCAZZI ET AL: "Purines regulate adult brain subventricular zone cell functions: Contribution of reactive astrocytes", GLIA, vol. 62, no. 3, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 428 - 439, XP055137656, ISSN: 0894-1491, DOI: 10.1002/glia.22614 *
MARTIAL RUAT ET AL: "Sonic Hedgehog, un morphogène en quête de fonction dans le cerveau adulte", MÉDECINE/SCIENCES, vol. 27, no. 11, 1 November 2011 (2011-11-01), pages 979 - 985, XP055137288, ISSN: 0767-0974, DOI: 10.1051/medsci/20112711014 *
MORI ET AL., GLIA, vol. 54, 2006, pages 21 - 34
PASTRANA ET AL., CELL STEM CELL, vol. 8, 2011, pages 486 - 498
ROUDAUT ET AL., MOL. PHARMACOL., vol. 79, 2011, pages 453 - 460
SONIA BONILLA ET AL: "Identification of midbrain floor plate radial glia-like cells as dopaminergic progenitors", GLIA, vol. 56, no. 8, 1 June 2008 (2008-06-01), pages 809 - 820, XP055137652, ISSN: 0894-1491, DOI: 10.1002/glia.20654 *
SORIANO, NATURE, vol. 21, 1999, pages 70 - 71
SRINIVAS ET AL., BMC DEV. BIOL., vol. 1, 2001, pages 4
TETSUJI MORI ET AL: "Inducible gene deletion in astroglia and radial glia-A valuable tool for functional and lineage analysis", GLIA, vol. 54, no. 1, 1 July 2006 (2006-07-01), pages 21 - 34, XP055137644, ISSN: 0894-1491, DOI: 10.1002/glia.20350 *
TRAIFFORT ET AL., EUR. J. NEUROSCI., vol. 11, 1999, pages 3199 - 3214
UHMANN ET AL., BLOOD, vol. 110, 2007, pages 1814 - 1823
WARD RYAN J ET AL: "Multipotent CD15(+) Cancer Stem Cells in Patched-1-Deficient Mouse Medulloblastoma", CANCER RESEARCH, vol. 69, no. 11, June 2009 (2009-06-01), pages 4682 - 4690, XP002729159, ISSN: 0008-5472 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125273A (zh) * 2021-03-29 2022-09-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用
CN115125273B (zh) * 2021-03-29 2023-11-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
FR3019712B1 (fr) 2018-02-09
FR3019712A1 (fr) 2015-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Teissier et al. Early-life stress impairs postnatal oligodendrogenesis and adult emotional behaviour through activity-dependent mechanisms
Niederkofler et al. Functional interplay between dopaminergic and serotonergic neuronal systems during development and adulthood
Lake et al. Enteric nervous system development: migration, differentiation, and disease
Wang et al. p75NTR regulates Aβ deposition by increasing Aβ production but inhibiting Aβ aggregation with its extracellular domain
Takahashi et al. Glutamate input in the dorsal raphe nucleus as a determinant of escalated aggression in male mice
Alpár et al. Hypothalamic CNTF volume transmission shapes cortical noradrenergic excitability upon acute stress
Mao et al. Shank1 regulates excitatory synaptic transmission in mouse hippocampal parvalbumin‐expressing inhibitory interneurons
González-Sepúlveda et al. Cellular distribution of the histamine H3 receptor in the basal ganglia: functional modulation of dopamine and glutamate neurotransmission
Jourdon et al. Prss56, a novel marker of adult neurogenesis in the mouse brain
Jänicke et al. Zebrafish grainyhead-like1 is a common marker of different non-keratinocyte epidermal cell lineages, which segregate from each other in a Foxi3-dependent manner
Timón-Gómez et al. Tissue-specific mitochondrial HIGD1C promotes oxygen sensitivity in carotid body chemoreceptors
Chatzi et al. Localized hypoxia within the subgranular zone determines the early survival of newborn hippocampal granule cells
Yamada et al. C ux2 activity defines a subpopulation of perinatal neurogenic progenitors in the hippocampus
Liu et al. Deletion of Calsyntenin-3, an atypical cadherin, suppresses inhibitory synapses but increases excitatory parallel-fiber synapses in cerebellum
DK2733205T3 (en) Corticospinal upper motor neurons, methods and compositions for differentiating neural stem cells by modulating CB1 cannabinoid receptor signaling and applications thereof
Pignatelli et al. A potential reservoir of immature dopaminergic replacement neurons in the adult mammalian olfactory bulb
Brown et al. Molecular organization and timing of Wnt1 expression define cohorts of midbrain dopamine neuron progenitors in vivo
Golf et al. Astrocytic Neuroligins Are Not Required for Synapse Formation or a Normal Astrocyte Cytoarchitecture.
WO2015155490A1 (fr) Modèle animal présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant pour le récepteur membranaire patched ou ptc
Guo et al. Identity and lineage fate of proteolipid protein 1 gene (Plp1)‐expressing cells in the embryonic murine spinal cord
Tamura et al. Loss of newborn neuron function accelerates neuroinflammation and amyloid accumulation via dentate gyrus circuit alteration in a mouse model of Alzheimer’s disease
Zini Generation and characterization of a novel transgenic line expressing human alpha-synuclein in the zebrafish nervous system as a new complementary model of Parkinson's Disease
Sarrafha Investigating cell type-specific vulnerability in Parkinson’s Disease using an in vitro genetic model
Moghimyfiroozabad C1QL1 & c-KIT molecular complexes: cell surface signaling pathways acting at neuronal synapses and beyond
Sokolov Regulation of Neuron Development by Slc7a5-mTOR-Ulk1

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15725729

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15725729

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1