WO2015129018A1 - Method and kit for diagnosing glaucoma in dogs - Google Patents

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正樹 今安
水木信久
目黒明
信行 印牧
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株式会社メニコン
公立大学法人横浜市立大学
学校法人麻布獣医学園
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers

Abstract

 Provided are a canine glaucoma susceptibility gene and a method for using the same. By analyzing and comparing single nucleotide polymorphism in dogs with glaucoma and normal dogs, it was discovered that an SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on the newly discovered canine ADAMTS10 gene is effective in diagnosis.

Description

イヌの緑内障を診断する方法及びキットMethod and kit for diagnosing glaucoma in dogs
 本発明は、イヌの緑内障を診断する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for diagnosing glaucoma in dogs.
 イヌの緑内障は、角膜と水晶体の間を流れる房水の流れが障害され、眼圧の上昇が起こり、網膜や視神経が圧迫され、視野狭窄などの視覚障害がもたらされる疾患である。 Glaucoma in dogs is a disease in which the flow of aqueous humor flowing between the cornea and the lens is impaired, an increase in intraocular pressure occurs, the retina and optic nerve are compressed, and visual impairment such as visual field stenosis is caused.
 高眼圧になれば、眼の疲れや頭痛、めまい、吐き気などが起こるが、イヌには自覚症状がなく、また、そのような不調を感じても、飼い主に訴えることができない。視野狭窄が始まっても、いつも通りに駆け回わり、行動の変化が見られるものではない。そのために、発見が遅れ、症状が進行してから、動物病院へ連れてこられるケースが多い。 When high intraocular pressure occurs, eye fatigue, headache, dizziness, nausea, etc. occur, but dogs have no subjective symptoms, and even if they feel unwell, they cannot appeal to their owners. Even if the stenosis of the visual field begins, it runs around as usual, and changes in behavior are not seen. For this reason, they are often taken to animal hospitals after discovery is delayed and symptoms progress.
 緑内障には予防方法がないが、早期発見することができれば、病気の進行を抑える方法はある。例えば、点眼薬(縮瞳薬、β-アドレナリン作用遮断薬、プロスタグランジン関連薬など)・内服薬(浸透圧利尿薬、炭酸脱水酵素阻害薬など)の投与、眼房水産生を減少させるための手術、眼房水流出を増加させるための手術などである。 緑 There is no prevention method for glaucoma, but if it can be detected early, there is a method to suppress the progression of the disease. For example, administration of eye drops (miotics, β-adrenergic blockers, prostaglandin-related drugs, etc.) and oral drugs (osmotic diuretics, carbonic anhydrase inhibitors, etc.), to reduce production of aqueous humor Surgery, surgery to increase aqueous humor outflow, etc.
 これまでのところ、イヌ緑内障の診断は、眼圧測定、隅角鏡検査法、眼底検査により行われている。 So far, canine glaucoma has been diagnosed by measuring intraocular pressure, gonioscopic examination, and fundus examination.
 しかし、これらの方法では、緑内障の早期発見に十分とは言えず、より早期により確実に診断可能な方法が求められている。 However, these methods are not sufficient for early detection of glaucoma, and there is a need for a method that can be diagnosed earlier and more reliably.
 一方、イヌ緑内障に関する疾患感受性遺伝子の探索が進められており、Kuchteyらは、ビーグル犬の緑内障疾患感受性遺伝子の候補として、ADAMTS10遺伝子におけるGly661Argバリアントを報告している(非特許文献1)が、この変異はビーグル犬以外の犬種では見つからなかったことが報告されている(非特許文献3)。また、水木らは、イヌとヒトに共通な緑内障感受性遺伝子として、SRBD1遺伝子における複数のSNPsを報告している(非特許文献2、特許文献1)。 On the other hand, the search for a disease susceptibility gene related to canine glaucoma has been advanced, and Kuchtey et al. Have reported a Gly661Arg variant in the ADAMTS10 gene as a candidate for a glaucoma disease susceptibility gene in beagle dogs (Non-patent Document 1). It has been reported that the mutation was not found in breeds other than beagle dogs (Non-patent Document 3). Mizuki et al. Have reported a plurality of SNPs in the SRBD1 gene as glaucoma susceptibility genes common to dogs and humans (Non-patent Document 2, Patent Document 1).
WO2003/008709国際公開パンフレットWO2003 / 008709 international publication pamphlet
 本発明は、イヌの緑内障の診断に有効な疾患感受性遺伝子を見出し、その利用方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to find a disease susceptibility gene effective for diagnosis of glaucoma in dogs and to provide a method for using the gene.
 本発明者らは、緑内障イヌ集団と健常イヌ集団を対象にSNP解析を行ったところ、緑内障の診断に特に有効なSNPを見出した。 The present inventors conducted SNP analysis on glaucoma dog populations and healthy dog populations, and found SNPs that are particularly effective for the diagnosis of glaucoma.
本発明はこれらの知見に基づいて完成された。 The present invention has been completed based on these findings.
 本発明の要旨は以下の通りである。
(1)イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を同定することを含む、イヌ緑内障の検査方法。
(2)下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、イヌ緑内障の検査をするための試薬。
(a)イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域を増幅することができるプライマー
(b) イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
(3)プローブが固相に固定されている(2)記載の試薬。
(4)(2)又は(3)記載の試薬を含む、イヌ緑内障の検査キット。
The gist of the present invention is as follows.
(1) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism in the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism A method for examining canine glaucoma, comprising identifying a type.
(2) A reagent for examining canine glaucoma, comprising at least one component selected from the group consisting of the following components (a) and (b):
(a) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, which is a polymorphism in the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a linkage disequilibrium with the polymorphism Primer that can amplify the region containing the type
(b) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism The probe according to (2), wherein a probe capable of hybridizing to a region containing a mold (3) is immobilized on a solid phase.
(4) A test kit for canine glaucoma comprising the reagent according to (2) or (3).
 本発明により、イヌの緑内障をより早期、かつより正確に診断することが可能となった。既に発症した個体では確定診断が可能となり、積極的な治療をおこなうことが可能となった。また、未発症個体では発症の予測が可能となり、検査を頻回に行うことを勧め、早期発見につなげることができる。 The present invention makes it possible to diagnose canine glaucoma earlier and more accurately. Individuals who have already developed a definitive diagnosis, and can be actively treated. In addition, it is possible to predict the onset of an unaffected individual, and it is recommended to conduct examinations frequently, leading to early detection.
 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
 本発明は、イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を同定することを含む、イヌ緑内障の検査方法を提供する。イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)である。この一塩基多型(SNP)は、イヌ第20染色体の位置番号53096346に存在する。 The present invention is a single nucleotide polymorphism existing on the canine ADAMTS10 gene, and is in a state of linkage disequilibrium with the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or the polymorphism. A method for examining canine glaucoma comprising identifying a polymorphism is provided. A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene It is. This single nucleotide polymorphism (SNP) exists at position number 53096346 of canine chromosome 20.
 イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型と連鎖不平衡にある多型は、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型のLDブロック内にある多型であるとよい。配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型と連鎖不平衡にある多型は、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型を含む領域内にあるp値(緑内障個体と健常個体間での有意差の指標)が0.05未満の他の多型であるかもしれない。イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型と連鎖不平衡にある多型としては、イヌ第20染色体位置番号53097497のSNP(rs22878605)などを例示することができるが、これらに限定されることはない。 The single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, which is in linkage disequilibrium with the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, is represented by the DNA represented by SEQ ID NO: 1. The polymorphism in the LD block of the polymorphism at the 901st position of the sequence is good. The polymorphism that is in linkage disequilibrium with the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is within the region containing the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1. Other polymorphisms may have p-values (an indicator of significant differences between glaucoma and healthy individuals) less than 0.05. A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, which is in linkage disequilibrium with the polymorphism at position 901 of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, canine chromosome 20 position number 53097497 SNP (rs22878605) and the like can be exemplified, but not limited thereto.
 SNP間のD'が大きければ連鎖不平衡にあると考えられている(Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21(2):263-265.; Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002;296(5576):2225-2229.)。従って、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型と連鎖不平衡にある多型は、例えば、これらのSNPとの間のD'がより大きい多型である。 If D 'between SNPs is large, it is considered to be in linkage disequilibrium (Barrett JC, Fry B, Maller J, Dally MJ.loHaploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005; 21 (2) : 263-265 .; Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002; 296 (5576): 2225-2229.). Therefore, the polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism in the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, a polymorphism having a larger D ′ between these SNPs.
 LDブロックはHaploviewソフト(Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21(2):263-265.)を用いてGabrielらの方法(Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002;296(5576):2225-2229.)で決定することができる。 LD block is the method of Gabriel et al. Using Haploview software (Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005; 21 (2): 263-265.) (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002; 296 (5576): 2225-2229.).
 本明細書において、「緑内障の検査」とは、被検個体が緑内障に罹患する可能性が高いか低いかを判定するための検査、すでに被検個体が緑内障に罹患している場合にはその確定診断を行うための検査が含まれる概念である。 In this specification, “test for glaucoma” is a test for determining whether or not a test individual is highly likely to suffer from glaucoma, and if the test individual already suffers from glaucoma It is a concept that includes a test for making a definitive diagnosis.
 配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型は、イヌ第20染色体の位置番号53096346の部位におけるアデニン(A)/グアニン(G)の多型であり、この部位の塩基がAAのときをノンリスク型、AGのときをヘテロ型、GGのときをリスク型と判定される。 The polymorphism at position 901 of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a polymorphism of adenine (A) / guanine (G) at position 53096346 in canine chromosome 20, and the base at this position is AA is judged as non-risk, AG is judged as heterozygous, and GG is judged as risk.
 同定するSNPは、一種類でもよいし、他のSNPと組み合わせてもよい。また、遺伝子のセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。 The SNP to be identified may be one type or may be combined with other SNPs. Moreover, the sense strand of the gene may be analyzed, or the antisense strand may be analyzed.
 配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型は、イヌADAMTS10遺伝子のエクソン15中に存在し、アミノ酸置換を伴わない変異であるが、この多型と連鎖不平衡の状態にある多型は、遺伝子のエクソン中、遺伝子の発現を制御する領域(例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域等)中、遺伝子のイントロン中、あるいはこれら遺伝子と連鎖不平衡にあるその前後の領域に存在しうる。多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基(時には数千塩基)が置換、欠失、挿入、転移あるいは逆位している多型などが挙げられるが、これらに特に限定されない。 The polymorphism at position 901 of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is present in exon 15 of the canine ADAMTS10 gene and is a mutation without amino acid substitution, but is in linkage disequilibrium with this polymorphism. Some polymorphisms exist in exons of genes, in regions that control gene expression (eg, promoter regions, enhancer regions, etc.), introns of genes, or in regions before or after linkage disequilibrium with these genes. sell. Examples of polymorphisms include single nucleotide polymorphisms, polymorphisms in which one to several tens of bases (sometimes several thousand bases) are substituted, deleted, inserted, transferred, or inverted. There is no particular limitation.
 本発明の検査方法において、多型部位の塩基の同定(すなわち、塩基種の決定)は、公知の一塩基多型解析方法によって行うことができる。一塩基多型解析方法としては、シークエンス解析、PCR、PCR-SSCP、ハイブリダイゼーション、RFLP法、Taqman-PCR法、インベーダー法、cycleave-PCR法、HRM法などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 In the inspection method of the present invention, the identification of the base at the polymorphic site (that is, the determination of the base type) can be performed by a known single nucleotide polymorphism analysis method. Examples of single nucleotide polymorphism analysis methods include sequence analysis, PCR, PCR-SSCP, hybridization, RFLP method, Taqman-PCR method, invader method, cycleave-PCR method, HRM method, etc. It is not limited.
 多型部位の塩基を同定するために、被検個体の生体試料からゲノムDNAを抽出するとよい。生体試料は、例えば、被検個体の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液(唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿など)等である。生体試料としては、四肢のいずれか又は首などの静脈から採血した全血が好ましい。市販のDNA抽出キットを用いて、生体試料からゲノムDNAを抽出することができる。次いで、必要に応じて、多型部位を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、多型部位を含むDNAにハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、ゲノムDNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことができる。 In order to identify the base of the polymorphic site, genomic DNA may be extracted from the biological sample of the subject individual. Biological samples include, for example, blood, skin, oral mucosa, tissues or cells collected or excised by surgery, body fluids collected for the purpose of examination (saliva, lymph, airway mucosa, semen, sweat, urine, etc.) ) Etc. The biological sample is preferably whole blood collected from a vein such as one of the extremities or the neck. Genomic DNA can be extracted from a biological sample using a commercially available DNA extraction kit. Then, if necessary, DNA containing the polymorphic site is isolated. The DNA can be isolated by PCR or the like using genomic DNA or RNA as a template, using a primer capable of hybridizing to DNA containing a polymorphic site.
 緑内障の検査の対象となる犬種は、緑内障に罹患しやすい犬腫、例えば、シバイヌ、シーズー、アメリカン・コッカー・スパニエル、ミニチュアダックス、ボーダーコリー、シープドッグ、チワワ、ダックスフンド、ルブラドール・レトリバー、マルチーズ、ミニチュア・ピンシャー、パグ、コーギーなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。 Canine glands that are subject to glaucoma testing include canine tumors that are susceptible to glaucoma, such as Syvine, Shih Tzu, American Cocker Spaniel, Miniature Ducks, Border Collie, Sheepdog, Chihuahua, Dachshund, Rubrador Retriever, Maltese, Examples include, but are not limited to, miniature pinschers, pugs, and corgis.
 また、本発明は、下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、イヌ緑内障の検査をするための試薬を提供する。 The present invention also provides a reagent for examining canine glaucoma, comprising at least one component selected from the group consisting of the following components (a) and (b).
(a)イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域を増幅することができるプライマー
(b) イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
 配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及びその多型と連鎖不平衡の状態にある多型は、上記の通りである。
(a) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, which is a polymorphism in the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a linkage disequilibrium with the polymorphism Primer that can amplify the region containing the type
(b) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism Probe capable of hybridizing to the region containing the type The polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism are as described above. .
 さらにまた、本発明は、上記の試薬を含む、イヌ緑内障の検査キットを提供する。 Furthermore, the present invention provides a test kit for canine glaucoma comprising the reagent described above.
 本発明の試薬の成分であるプライマー及びプローブは、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドであるとよい。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp~100bpであり、好ましくは17bp~30bpである。プライマーは、上記多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。プライマーが増幅することができるDNAの長さは、通常、15~1000bp、好ましくは、20~500bp、より好ましくは20~200bpである。また、該オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、その長さは、通常5bp~200bpであり、好ましくは7bp~100bpであり、より好ましくは7bp~50bpである。プローブは、上記多型部位を含むDNAとハイブリダイズしうるものであれば、特に制限されない。 The primer and probe that are components of the reagent of the present invention may be an oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides. When the oligonucleotide is used as a primer, its length is usually 15 to 100 bp, preferably 17 to 30 bp. The primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA containing the polymorphic site. The length of DNA that can be amplified by the primer is usually 15 to 1000 bp, preferably 20 to 500 bp, more preferably 20 to 200 bp. When the oligonucleotide is used as a probe, the length is usually 5 bp to 200 bp, preferably 7 bp to 100 bp, more preferably 7 bp to 50 bp. The probe is not particularly limited as long as it can hybridize with the DNA containing the polymorphic site.
 本発明において、多型部位を含む領域を増幅することができるプライマーは、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるものであるとよい。 In the present invention, a primer capable of amplifying a region containing a polymorphic site is preferably one that can initiate complementary strand synthesis toward the polymorphic site using a DNA containing the polymorphic site as a template.
 本発明の試薬の成分であるプライマーとしては、以下のようなフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対を挙げることができる。 As a primer which is a component of the reagent of the present invention, the following primer pair consisting of a forward primer and a reverse primer can be mentioned.
Forward Primer: 5’-CACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3’(配列番号2)
Reverse Primer: 5’-CACTTGTCCTCCCTCAGGTC-3’(配列番号3)
 配列番号2の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における765番目~784番目の塩基配列と同一の配列である。
 配列番号3の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における1083番目~1102番目の塩基配列に相補的な配列である。
Forward Primer: 5'-CACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Reverse Primer: 5'-CACTTGTCCTCCCTCAGGTC-3 '(SEQ ID NO: 3)
The base sequence of SEQ ID NO: 2 is the same sequence as the 765th to 784th base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The base sequence of SEQ ID NO: 3 is a sequence complementary to the 1083th to 1102nd base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Forward Primer: 5’-ACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3’ (配列番号4)
Reverse Primer: 5’-GTGGAAGTGGGAGTGTCAA-3’ (配列番号5)
 配列番号4の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における766番目~784番目の塩基配列と同一の配列である。
 配列番号5の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における1015番目~1033番目の塩基配列に相補的な配列である。
Forward Primer: 5'-ACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 4)
Reverse Primer: 5'-GTGGAAGTGGGAGTGTCAA-3 '(SEQ ID NO: 5)
The base sequence of SEQ ID NO: 4 is the same sequence as the 766th to 784th base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The base sequence of SEQ ID NO: 5 is a sequence complementary to the 1015th to 1033rd base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
 プライマーは、多型部位を含む領域にハイブリダイズできる塩基配列を有するが、配列番号2~5の塩基配列と同一又は相補的な多型部位を含む領域から数塩基ずつずらした領域と同一又は相補的な配列であってもよい。 The primer has a base sequence that can hybridize to a region containing a polymorphic site, but is the same or complementary to a region shifted by several bases from a region containing a polymorphic site that is identical or complementary to the base sequence of SEQ ID NOs: 2 to 5 It may be a typical arrangement.
 プライマーには、多型部位を含む領域の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。更に、プライマーは修飾してもよい。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーを利用してもよい。 In addition to the base sequence identical or complementary to the base sequence of the region containing the polymorphic site, an arbitrary base sequence can be added to the primer. For example, in a primer for a polymorphism analysis method using a type IIs restriction enzyme, a primer to which a recognition sequence for a type IIs restriction enzyme is added is used. Furthermore, the primer may be modified. For example, a primer labeled with a fluorescent substance or a binding affinity substance such as biotin or digoxin may be used.
 本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるものであればよく、多型部位を含む領域の塩基配列を有するDNAに特異的にハイブリダイズするものが好ましい。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件)において、多型部位を含む領域の塩基配列を有するDNA以外のDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブが好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。 In the present invention, the probe that can hybridize to the region containing the polymorphic site may be any probe that can hybridize to the polynucleotide having the base sequence of the region containing the polymorphic site. Those that specifically hybridize to DNA having the base sequence of the region to be included are preferred. Here, “specifically hybridizes” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular® Cloning, Cold® Spring® Harbor® Laboratory® Press, New® York, USA, In the condition described in the second edition 1989), it means that cross-hybridization does not occur significantly with DNA other than DNA having the base sequence of the region containing the polymorphic site. More specifically, a probe containing a polymorphic site in the base sequence of the probe is preferable. Alternatively, depending on the base analysis method at the polymorphic site, the probe may be designed so that the end of the probe corresponds to a base adjacent to the polymorphic site. Therefore, although the polymorphic site is not included in the base sequence of the probe itself, a probe including a base sequence complementary to the region adjacent to the polymorphic site can also be shown as a desirable probe in the present invention.
 プローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
 本発明の試薬の成分であるプローブとしては、以下のようなProbe-1とProbe-2を挙げることができる。
The probe is allowed to modify the base sequence, add the base sequence, or modify the same as the primer. For example, a probe used for the Invader method is added with a base sequence unrelated to the genome constituting the flap. Such a probe is also included in the probe of the present invention as long as it hybridizes to a region containing a polymorphic site. The base sequence constituting the probe of the present invention can be designed according to the analysis method based on the base sequence of the DNA region surrounding the polymorphic site of the present invention in the genome.
Examples of the probe that is a component of the reagent of the present invention include Probe-1 and Probe-2 as follows.
Probe-1: 5’-gccgt(A)gtg-3’ 
Probe-2: 5’-gccgt(G)gt-3’ 
 Probe-1の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における896番目~904番目(901番目の塩基はA)の塩基配列と同一の配列である。
 Probe-2の塩基配列は、配列番号1で表されるDNA配列における896番目~903番目(901番目の塩基はG)の塩基配列と同一の配列である。
Probe-1: 5'-gccgt (A) gtg-3 '
Probe-2: 5'-gccgt (G) gt-3 '
The base sequence of Probe-1 is the same sequence as the base sequence of the 896th to 904th positions (the 901st base is A) in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The base sequence of Probe-2 is the same sequence as the base sequence of the 896th to 903th (the 901st base is G) in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
 当業者であれば、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマー及びプローブをデザインすることができる。プライマー及びプローブを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
 配列番号1で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドにおける901番目の塩基(多型部位)の多型は、ビーグル犬には見られない多型であるため、ビーグル犬の緑内障群と健常群との間で統計学的に有意差が認められる遺伝子多型と組み合わせることで、ビーグル犬を含む多種類の犬種における緑内障の検出が可能となる。
 ビーグル犬の緑内障群と健常群との間で統計学的に有意差が認められる遺伝子多型としては、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339、Gly661Arg)(CanFam3.1)を例示することができ、この多型は、配列番号8で表されるDNA配列の908番目の部位における多型である。イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339、Gly661Arg)(CanFam3.1)は、イヌ第20番染色体の位置番号53096339の部位におけるアデニン(A)/グアニン(G)の多型であり、この部位の塩基がAAのときをノンリスク型、AGのときをヘテロ型、GGのときをリスク型と判定される。
 イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339、Gly661Arg)(CanFam3.1)を含む領域を増幅することができるプライマーとしては、以下のようなフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマー対を挙げることができる。
Forward Primer: 5’-CACAGAGCAAGCAGGGAGT-3’(配列番号6)
Reverse Primer: 5’-GGGTGGAAGTGGGAGTG-3’(配列番号7)
 配列番号6の塩基配列は、配列番号8で表されるDNA配列における765番目~783番目の塩基配列と同一の配列である。
 配列番号7の塩基配列は、配列番号8で表されるDNA配列における1019番目~1035番目の塩基配列に相補的な配列である。
 イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339、Gly661Arg)(CanFam3.1)を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブとしては、以下のようなProbe-11とProbe-12を挙げることができる。
A person skilled in the art can design primers and probes according to the analysis method based on the base sequence information about the surrounding DNA region including the polymorphic site. The base sequences constituting the primers and probes can be modified as appropriate as well as the base sequences that are completely complementary to the genomic base sequences.
Since the polymorphism at the 901st base (polymorphic site) in the polynucleotide consisting of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a polymorphism that is not found in beagle dogs, beagle glaucoma groups and healthy groups Glaucoma can be detected in many types of dogs, including beagle dogs, by combining with genetic polymorphisms that are statistically significantly different from each other.
As a genetic polymorphism in which a statistically significant difference is observed between the glaucoma group and the healthy group of beagle dogs, SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene can be exemplified, This polymorphism is a polymorphism in the 908th position of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8. SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene is a polymorphism of adenine (A) / guanine (G) at the position of position number 53096339 of canine chromosome 20, and the base at this position is AA is judged as non-risk, AG is judged as heterozygous, and GG is judged as risk.
Examples of primers that can amplify a region containing SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene include the following primer pairs consisting of a forward primer and a reverse primer.
Forward Primer: 5'-CACAGAGCAAGCAGGGAGT-3 '(SEQ ID NO: 6)
Reverse Primer: 5'-GGGTGGAAGTGGGAGTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
The base sequence of SEQ ID NO: 6 is the same sequence as the 765th to 783th base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8.
The base sequence of SEQ ID NO: 7 is a sequence complementary to the 1019th to 1035th base sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8.
Examples of probes that can hybridize to a region containing SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene include Probe-11 and Probe-12 as follows.
Probe-11: 5’-gtggac(A)gg-3’ 
Probe-12: 5’-tggac(G)gga-3’ 
 Probe-11の塩基配列は、配列番号8で表されるDNA配列における902番目~910番目(908番目の塩基はA)の塩基配列と同一の配列である。
 Probe-12の塩基配列は、配列番号8で表されるDNA配列における903番目~911番目(908番目の塩基はG)の塩基配列と同一の配列である。
Probe-11: 5'-gtggac (A) gg-3 '
Probe-12: 5'-tggac (G) gga-3 '
The base sequence of Probe-11 is the same sequence as the base sequence of the 902st to 910th positions (the 908th base is A) in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8.
The base sequence of Probe-12 is the same sequence as the base sequence of the 903th to 911th positions (the 908th base is G) in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8.
 プライマー及びプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素(FAM、ROXなど)やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。 Primers and probes can be synthesized by any method based on the base sequences constituting them. A technique for synthesizing an oligonucleotide having the base sequence based on the given base sequence is known. Furthermore, in the synthesis of the oligonucleotide, any modification can be introduced into the oligonucleotide using a nucleotide derivative modified with a fluorescent dye (FAM, ROX, etc.) or biotin. Alternatively, a method of binding a fluorescent dye or the like to a synthesized oligonucleotide is also known.
 プローブは、固相に固定されていてもよい(DNAアレイ)。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA(あるいはRNA)をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。ヌクレオチドの固定(アレイ)方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常in situで合成される。例えば、リソグラフィー方式(Affymetrix社)、インクジェット方式(Agilent社)、ビーズアレイ方式(Illumina社)等によるオリゴヌクレオチドのin situ合成法が知られている。 The probe may be fixed on a solid phase (DNA array). In the DNA array, sample DNA (or RNA) is hybridized to a large number of probes arranged on the same plane, and the hybridization to each probe is detected by scanning the plane. Since responses to many probes can be observed simultaneously, for example, a DNA array is useful for analyzing a large number of polymorphic sites simultaneously. Examples of nucleotide immobilization (array) methods include arrays based on oligonucleotides developed by Affymetrix. In an array of oligonucleotides, the oligonucleotides are usually synthesized in situ. For example, in-situ synthesis methods of oligonucleotides by lithography method (Affymetrix), inkjet method (Agilent), bead array method (Illumina), etc. are known.
 オリゴヌクレオチドは、検出すべき多型部位を含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常8~100bpであり、好ましくは8~50bpであり、さらに好ましくは8~25bpである。 Oligonucleotide is composed of a base sequence complementary to a region containing a polymorphic site to be detected. The length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is usually 8 to 100 bp, preferably 8 to 50 bp, more preferably 8 to 25 bp when the oligonucleotide is immobilized.
 DNAアレイ法によるSNP検出のための試料は、被検個体から採取された生体試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生体試料は特に限定されない。例えば被検個体の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出したゲノムDNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、ゲノムDNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。 A sample for SNP detection by the DNA array method can be prepared by a method well known to those skilled in the art based on a biological sample collected from a test individual. The biological sample is not particularly limited. For example, a DNA sample can be prepared from genomic DNA extracted from tissues or cells of blood, skin, oral mucosa, etc., tears, saliva, urine, feces, or hair of a subject. A specific region of genomic DNA is amplified using a primer for amplifying a region containing a polymorphic site to be determined. At this time, a plurality of regions can be simultaneously amplified by the multiplex PCR method. The multiplex PCR method is a PCR method using a plurality of primer sets in the same reaction solution. When analyzing multiple polymorphic sites, the multiplex PCR method is useful.
 一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、固相に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。 In general, in the DNA array method, a DNA sample is amplified by the PCR method and the amplified product is labeled. A labeled primer is used for labeling the amplification product. For example, genomic DNA is first amplified by PCR using a primer set specific to the region containing the polymorphic site. Next, biotin-labeled DNA is synthesized by a labeling PCR method using a biotin-labeled primer. The biotin-labeled DNA synthesized in this way is hybridized to the oligonucleotide probe on the chip. The hybridization reaction solution and reaction conditions can be appropriately adjusted according to conditions such as the length of the nucleotide probe immobilized on the solid phase and the reaction temperature. One skilled in the art can design appropriate hybridization conditions. In order to detect the hybridized DNA, avidin labeled with a fluorescent dye is added. The array is analyzed with a scanner, and the presence or absence of hybridization is confirmed using fluorescence as an index.
 DNAアレイ法を用いて本発明の検査方法を実施する手順の一例を示せば、被検個体から調製した多型部位を含むDNA及びヌクレオチドプローブが固定された固相を用意した後、該DNAと該固相を接触させる。次いで、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、多型部位の塩基種を決定する。 An example of the procedure for carrying out the test method of the present invention using the DNA array method is as follows. After preparing a solid phase on which a DNA and nucleotide probe containing a polymorphic site prepared from a test individual are immobilized, The solid phase is contacted. Subsequently, the base species of the polymorphic site is determined by detecting DNA hybridized to the nucleotide probe immobilized on the solid phase.
 本明細書において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。固相としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本明細書において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。 In this specification, “solid phase” means a material capable of immobilizing nucleotides. The solid phase is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, and specific examples include a solid phase containing microplate wells, plastic beads, magnetic particles, a substrate, and the like. As the solid phase, a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used. In the present specification, the “substrate” means a plate-like material capable of fixing nucleotides. In the present invention, the nucleotide includes oligonucleotides and polynucleotides.
 上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。 In addition to the above method, an allele-specific oligonucleotide (Aligonucleotide / ASO) hybridization method can be used to detect a base at a specific site. An allele-specific oligonucleotide (ASO) is composed of a base sequence that hybridizes to a region where a polymorphic site to be detected exists. When ASO is hybridized to sample DNA, the hybridization efficiency decreases if a mismatch occurs at the polymorphic site due to the polymorphism. Mismatches can be detected by Southern blotting or a method that uses the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the hybrid gap. Mismatches can also be detected by the ribonuclease A mismatch cleavage method.
 本発明の試薬およびキットには、塩基の同定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを含めることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基同定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。 The reagents and kits of the present invention can contain various enzymes, enzyme substrates, buffers, and the like depending on the base identification method. Examples of the enzyme include enzymes necessary for the various analysis methods exemplified as the base identification method, such as DNA polymerase, DNA ligase, or IIs restriction enzyme. As the buffer solution, a buffer solution suitable for maintaining the activity of the enzyme used for these analyzes is appropriately selected. Furthermore, as the enzyme substrate, for example, a substrate for complementary strand synthesis is used.
 さらに、本発明の試薬およびキットには、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照としては、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノムDNA、あるいはゲノムDNAの断片を用いることができる。ゲノムDNAは、細胞から抽出されたものを対照として添付してもよいし、あるいは、細胞又は細胞の分画を対照として添付しておき、そこから使用者がゲノムDNAを抽出してもよい。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターを対照として用いてもよい。あるいは多型部位に相当する数十から数百bpのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。 Furthermore, a control in which the base at the polymorphic site is clear can be attached to the reagent and kit of the present invention. As a control, genomic DNA or a fragment of genomic DNA in which the base type of the polymorphic site is known in advance can be used. Genomic DNA extracted from cells may be attached as a control, or a cell or a fraction of cells may be attached as a control, and a user may extract genomic DNA therefrom. If a cell is used as a control, the result of the control can prove that the genomic DNA extraction operation was performed correctly. Alternatively, DNA comprising a base sequence containing a polymorphic site can be used as a control. Specifically, a YAC vector or a BAC vector containing a genome-derived DNA whose base type at the polymorphic site has been clarified may be used as a control. Alternatively, a vector in which only tens to hundreds of bp corresponding to the polymorphic site are excised and inserted can be used as a control.
 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
〔実施例1〕
1.イヌ緑内障の診断およびDNAの精製
1) 麻布大学附属動物病院を来院したシバイヌ90匹、シーズー115匹、ビーグル41匹、アメリカンコッカースパニエル46匹、ミニチュアダックスフンド47匹、ボーダーコリー39匹、シープドッグ28匹の合計406匹を対象とした。
2) 両眼にベノキシールを点眼し、局部麻酔を施した。
3) 両眼の眼圧をトノペンで測定し、眼圧25mmHg以上の個体を緑内障、25mmHg未満の個体を健常と判定した。
4) 頚静脈より血液を1cc採取し、DNA全血キット・スピン法(FUJI FILM社)でDNAを精製した。 
5)  DNAの濃度と純度をGeneQuant Pro(GEヘルスサイエンス社)で測定した。

2.DNA塩基配列の決定およびSNP遺伝子型の判定
1) TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社)を用いてPCRを実施した。 PCRの条件は以下のとおりとした。
       <試薬>
       Taq酵素 0.25μL
       10×Buffer       5μL
       dNTPs 4μL
       Template       2μL
       Forward Primer    1μL
       (5’-CACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3’)(配列番号2)
       Reverse Primer    1μL
       (5’-CACTTGTCCTCCCTCAGGTC-3’)(配列番号3)
       H2O   11.75μL
       総容量   25μL
       <増幅条件>
       (94℃ 5分) 1サイクル
       (98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 1分) 40サイクル
       (72℃ 7分) 1サイクル

2) PCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によりPCR産物がシングルバンドとして検出されることを確認し、1.5mLのチューブに回収した。
3) 50μLのTEバッファーを添加し、-80℃で3時間以上凍結した。
4) サンプルを溶解し、Qiagen Dye Ex 2.0 スピンキット(QIAGEN社)でサンプルDNAを精製した。
5) 以下の条件でサイクルシーケンシングを実施した。
<試薬>
       5×Buffer       4μL
       Big Dye       6μL
       Template       6μL
       Forward Primer   1μL(またはReverse Primer 1μL)
       H2O   3μL
       総容量   20μL
       <シーケンシング条件>
       (95℃ 2分) 1サイクル
       (94℃ 1分、50℃ 30秒、72℃ 4分) 30サイクル
       (72℃ 7分) 1サイクル
6) Qiagen Dye Ex 2.0 スピンキットで再度サンプルDNAを精製し、乾燥した。
7) 20μLのHigh Dye Mix(ライフテクノロジーズ社)を添加し、90℃で3分間処理したのち、5分間氷冷した。
8) サンプルをシーケンシングチューブに移し、ABI 3730 DNA Analyzer(ライフテクノロジーズ社)で塩基配列を解析した。
9) イヌADAMTS10遺伝子のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の塩基配列よりサンプルの遺伝子型がAAのときをノンリスク型、AGのときをヘテロ型、GGのときをリスク型と判定した。
10) イヌADAMTS10遺伝子のSNP(53096339, Gly661Arg)(CanFam3.1)の塩基配列よりサンプルの遺伝子型がAAのときをノンリスク型、AGのときをヘテロ型、GGのときをリスク型と判定した。
11) さらにイヌADAMTS遺伝子の2か所のSNP遺伝子型の再確認のため、CycleavePCRを実施した。 CycleavePCRの条件を以下に示す。
       <試薬>
       CycleavePCR Reaction Mix(タカラバイオ)12.5μL
       Forward Primer (10μM) (タカラバイオ)0.5μL
       Reverse Primer (10μM) (タカラバイオ)0.5μL
       Probe-1 (5μM)     (タカラバイオ)1μL
         Probe-2 (5μM)     (タカラバイオ)1μL
       Template            1μL
       dH2O  8.5μL
       総容量   25μL
       <CycleavePCR条件>
       (95℃ 10秒) 1サイクル
       (95℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 20秒) 45サイクル
13) リアルタイムPCR装置(タカラバイオTP800)付属の解析ソフト(Thermal Cycler Dice Real Time System Ver 3.00)でSNPを解析した。
14) イヌADAMTS10遺伝子のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)について、FAMの蛍光強度が強い場合をノンリスク型(non-risk)、ROXの蛍光強度が強い場合をリスク型(risk)、両方の蛍光強度が強い場合をヘテロ型(hetero)と判定した。
15) イヌADAMTS10遺伝子の(53096339, Gly661Arg)(CanFam3.1)について、ROXの蛍光強度が強い場合をノンリスク型(non-risk)、FAMの蛍光強度が強い場合をリスク型(risk)、両方の蛍光強度が強い場合をヘテロ型(hetero)と判定した。
16) 各SNPがリスク型、ヘテロ型、ノンリスク型のときのリスクアレル数をそれぞれ2個、1個、0個とし、リスクアレル頻度を求めた。
17) 緑内障群と健常群のリスクアレル頻度を比較し、オッズ比検定とFisher確立変数検定を行った。





Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

 ADAMTS10(Val658Val)の解析結果とADAMTS10(Gly661Arg)の解析結果をそれぞれ表2及び3に示す。
 ADAMTS10(Val658Val)については、シバイヌの緑内障群のリスクアレル頻度は92.7%、健常群のリスクアレル頻度は82.1%となり、両群を比較したとき、リスクアレルを保持している場合の緑内障の発症リスクは2.76倍となり、Fisher確立変数検定で有意差(P=0.0398)を認めた。シーズーの緑内障群のリスクアレル頻度は70.8%、健常群のリスクアレル頻度は58.9%となり、両群を比較したとき、リスクアレルを保持している場合の緑内障の発症リスクは1.69倍となり、Fisher確立変数検定で有意差(P=0.0408)を認めた。一方、ビーグルでは、緑内障群と健常群のリスクアレル頻度はともに0%であり、このSNPは存在しなかった。
 ADAMTS10(Gly661Arg)については、シバイヌとシーズーでは、緑内障群と健常群のリスクアレル頻度はともに0%であり、このSNPは存在しなかったが、ビーグルでは、緑内障群のリスクアレル頻度は50.0%、健常群のリスクアレル頻度は21.8%となり、両群を比較したとき、リスクアレルを保持している場合の緑内障のリスクは4.57倍となった。




















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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
[Example 1]
1. Diagnosis of canine glaucoma and DNA purification
1) A total of 406 animals including 90 Shivaine, 115 Shih Tzu, 41 Beagle, 46 American Cocker Spaniel, 47 Miniature Dachshunds, 39 Border Collies, 28 Sheep Dogs who visited Azabu University Hospital .
2) Benoxeal was instilled into both eyes and local anesthesia was performed.
3) The intraocular pressure in both eyes was measured with tonopen, and individuals with an intraocular pressure of 25 mmHg or higher were determined to be glaucoma, and individuals with an intraocular pressure of less than 25 mmHg were determined to be healthy.
4) 1 cc of blood was collected from the jugular vein, and DNA was purified by DNA whole blood kit spin method (FUJI FILM).
5) The DNA concentration and purity were measured with GeneQuant Pro (GE Health Sciences).

2. Determination of DNA base sequence and determination of SNP genotype
1) PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Bio Inc.). PCR conditions were as follows.
<Reagent>
Taq enzyme 0.25μL
10 × Buffer 5μL
dNTPs 4μL
Template 2μL
Forward Primer 1μL
(5'-CACAGAGCAAGCAGGGAGTC-3 ') (SEQ ID NO: 2)
Reverse Primer 1μL
(5'-CACTTGTCCTCCCTCAGGTC-3 ') (SEQ ID NO: 3)
H 2 O 11.75μL
Total volume 25μL
<Amplification conditions>
(94 ℃ 5 minutes) 1 cycle (98 ℃ 10 seconds, 55 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 1 minute) 40 cycles (72 ℃ 7 minutes) 1 cycle

2) The PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, confirmed that the PCR product was detected as a single band by ethidium bromide staining, and collected in a 1.5 mL tube.
3) 50 μL of TE buffer was added and frozen at −80 ° C. for 3 hours or more.
4) The sample was dissolved and the sample DNA was purified using the Qiagen Dye Ex 2.0 spin kit (QIAGEN).
5) Cycle sequencing was performed under the following conditions.
<Reagent>
5 × Buffer 4μL
Big Dye 6μL
Template 6μL
Forward Primer 1μL (or Reverse Primer 1μL)
H 2 O 3μL
Total volume 20μL
<Sequencing conditions>
(95 ° C 2 minutes) 1 cycle (94 ° C 1 minute, 50 ° C 30 seconds, 72 ° C 4 minutes) 30 cycles (72 ° C 7 minutes) 1 cycle
6) The sample DNA was purified again with the Qiagen Dye Ex 2.0 spin kit and dried.
7) 20 μL of High Dye Mix (Life Technologies) was added, treated at 90 ° C for 3 minutes, and then cooled on ice for 5 minutes.
8) The sample was transferred to a sequencing tube, and the nucleotide sequence was analyzed with ABI 3730 DNA Analyzer (Life Technologies).
9) Based on the nucleotide sequence of the SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) of the canine ADAMTS10 gene, when the sample genotype was AA, it was judged as non-risk type, when AG was heterozygous, and when it was GG, it was judged as risk type .
10) Based on the nucleotide sequence of the SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) of the canine ADAMTS10 gene, when the sample genotype was AA, it was judged as non-risk type, when AG was heterozygous, and when it was GG, it was judged as risk .
11) In addition, CycleavePCR was performed to reconfirm the two SNP genotypes of the canine ADAMTS gene. The conditions of CycleavePCR are shown below.
<Reagent>
CycleavePCR Reaction Mix (Takara Bio) 12.5μL
Forward Primer (10μM) (Takara Bio) 0.5μL
Reverse Primer (10μM) (Takara Bio) 0.5μL
Probe-1 (5μM) (Takara Bio) 1μL
Probe-2 (5μM) (Takara Bio) 1μL
Template 1μL
dH 2 O 8.5μL
Total volume 25μL
<CycleavePCR conditions>
(95 ℃ 10 seconds) 1 cycle (95 ℃ 5 seconds, 55 ℃ 10 seconds, 72 ℃ 20 seconds) 45 cycles
13) SNP was analyzed with the analysis software (Thermal Cycler Dice Real Time System Ver 3.00) attached to the real-time PCR device (Takara Bio TP800).
14) Canine ADAMTS10 gene SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1), when FAM fluorescence intensity is strong, non-risk type (non-risk), when ROX fluorescence intensity is strong, risk type (risk), The case where both fluorescence intensities were strong was judged as a hetero type (hetero).
15) For the canine ADAMTS10 gene (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1), when ROX fluorescence intensity is strong, non-risk type (non-risk), when FAM fluorescence intensity is strong, risk type (risk), both The case where the fluorescence intensity was strong was determined to be hetero.
16) The number of risk alleles when each SNP is risk type, hetero type, and non-risk type was 2, 1 and 0, respectively, and the risk allele frequency was determined.
17) The risk allele frequencies of the glaucoma group and the healthy group were compared, and the odds ratio test and the Fisher established variable test were performed.





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The analysis results of ADAMTS10 (Val658Val) and ADAMTS10 (Gly661Arg) are shown in Tables 2 and 3, respectively.
For ADAMTS10 (Val658Val), the risk allele frequency in the Sibaine glaucoma group was 92.7%, and the risk allele frequency in the healthy group was 82.1%. Was 2.76 times, and a significant difference (P = 0.0398) was recognized by Fisher Established Variable Test. Shih Tzu glaucoma risk allele frequency is 70.8%, healthy group risk allele frequency is 58.9%, comparing the two groups, the risk of developing glaucoma when holding the risk allele is 1.69 times, Fisher established A significant difference (P = 0.0408) was observed by variable test. On the other hand, in the beagle, the risk allele frequency in the glaucoma group and the healthy group were both 0%, and this SNP did not exist.
For ADAMTS10 (Gly661Arg), in Shivaine and Shih Tzu, the risk allele frequency in the glaucoma group and the healthy group were both 0%, and this SNP did not exist, but in Beagle, the risk allele frequency in the glaucoma group was 50.0%, The risk allele frequency in the healthy group was 21.8%, and when the two groups were compared, the risk of glaucoma when holding the risk allele was 4.57 times higher.




















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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 本発明は、獣医学、診断などに利用可能である。 The present invention can be used for veterinary medicine, diagnosis, and the like.
<配列番号1>
配列番号1は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の多型部位を901番目(r=A/G)に含む1801塩基長の塩基配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の多型部位検出(シーケンス)に用いたForward Primerの塩基配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の多型部位検出(シーケンス)に用いたReverse Primerの塩基配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の多型部位検出(リアルタイムPCR)に用いたForward Primerの塩基配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096346, Val658Val)(CanFam3.1)の多型部位検出(リアルタイムPCR)に用いたReverse Primerの塩基配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339, Gly661Arg)(CanFam3.1)の多型部位検出(リアルタイムPCR)に用いたForward Primerの塩基配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339, Gly661Arg)(CanFam3.1)の多型部位検出(リアルタイムPCR)に用いたReverse Primerの塩基配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、イヌADAMTS10遺伝子上のSNP(53096339, Gly661Arg)(CanFam3.1)の多型部位を908番目(r=A/G)に含む1801塩基長の塩基配列を示す。
<SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows a 1801-base long base sequence containing the polymorphic site of SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene at the 901st (r = A / G).
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of Forward Primer used for polymorphic site detection (sequence) of SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 3>
SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of Reverse Primer used for polymorphic site detection (sequence) of SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 4>
SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of Forward Primer used for polymorphic site detection (real-time PCR) of SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 5>
SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of Reverse Primer used for polymorphic site detection (real-time PCR) of SNP (53096346, Val658Val) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 6>
SEQ ID NO: 6 shows the base sequence of Forward Primer used for polymorphic site detection (real-time PCR) of SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 7>
SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of Reverse Primer used for polymorphic site detection (real-time PCR) of SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on canine ADAMTS10 gene.
<SEQ ID NO: 8>
SEQ ID NO: 8 shows a 1801-base long base sequence containing the polymorphic site of SNP (53096339, Gly661Arg) (CanFam3.1) on the canine ADAMTS10 gene at the 908th position (r = A / G).

Claims (4)

  1. イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を同定することを含む、イヌ緑内障の検査方法。 Identifies a single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism at position 901 in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism A method for examining canine glaucoma, comprising:
  2. 下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、イヌ緑内障の検査をするための試薬。
    (a)イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域を増幅することができるプライマー
    (b) イヌADAMTS10遺伝子上に存在する一塩基多型であって、配列番号1で表されるDNA配列の901番目の部位における多型及び/又はその多型と連鎖不平衡の状態にある多型を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
    A reagent for examining canine glaucoma, comprising at least one component selected from the group consisting of the following components (a) and (b):
    (a) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, which is a polymorphism in the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a linkage disequilibrium with the polymorphism Primer that can amplify the region containing the type
    (b) A single nucleotide polymorphism present on the canine ADAMTS10 gene, the polymorphism at the 901st site of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or a polymorphism in linkage disequilibrium with the polymorphism Probe that can hybridize to the region containing the mold
  3. プローブが固相に固定されている請求項2記載の試薬。 The reagent according to claim 2, wherein the probe is immobilized on a solid phase.
  4. 請求項2又は3記載の試薬を含む、イヌ緑内障の検査キット。 A test kit for canine glaucoma comprising the reagent according to claim 2 or 3.
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