WO2015099313A1 - 근적외선 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법 - Google Patents

근적외선 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법 Download PDF

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김경훈
백열창
지석우
양시용
박민아
곽철원
이승헌
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    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/22—Methane [CH4], e.g. from rice paddies

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the amount of methane generated from feedstock using a near infrared system. More specifically, the present invention relates to a method for analyzing and predicting methane generation amount and methane index by applying the methane generation value of feedstock using the rumen model continuous culture system to the near infrared system.
  • a method using a culture method was mainly used to measure the amount of methane generated by feed.
  • the method of using the culture bottle is a method of measuring the amount of methane generated actually by culturing microorganisms in a feed material sample for 24 hours, and thus has a disadvantage in that it takes time and cost.
  • Conventional near-infrared spectroscopy has been used mainly to analyze the components of feed, but only the components of the feed are effective in reducing the methane generated in the rumen of cattle and at the same time directly maintaining the rate of decomposition of the feed. It does not provide a solution.
  • the near-infrared spectroscopy is described below.
  • Near-infrared rays are a part of the infrared rays adjacent to the visible light region and generally refer to electromagnetic waves in the range of 780 to 2500 nm.
  • Near-infrared spectroscopy is the study of near-infrared light (or energy) absorbed by molecules and is a branch of molecular spectroscopy on the interaction between electromagnetic waves and materials. In general, infrared and near-infrared light excite molecules, and molecules that absorb near-infrared and infrared light vibrate at specific frequencies and amplitudes, like vibrating dipoles.
  • the molecule absorbs light, and when the new energy level transitions to a high state, the vibration frequency does not change but the amplitude increases. However, if the energy of molecular vibration and the energy of light do not match, the light is reflected.
  • the material which absorbs infrared rays contains the component which consists of O-H, C-H, N-H, and S-H group.
  • the near-infrared wavelength region exhibits overtone absorption or combination absorption wavelength compared to the reference absorption wavelength induced in the infrared wavelength region, and the harmonic absorption is approximately twice or three times the reference absorption frequency (reference absorption wavelength). Occurs at a frequency (or wavelength) that is one half or one third times greater than that). For example, if the reference absorption of C-H stretch occurs in the infrared region of 3,380 nm, the first harmonic occurs in the near infrared region of 1,690 nm and the second harmonic of 1,126 nm.
  • the absorption becomes more complicated.
  • the number of reference absorption bands increases to 3n-6 when the number of members is n, and thus the harmonic absorption becomes more complicated.
  • binding absorption occurs in the near infrared region.
  • the harmonic absorption and the binding absorption of the reference absorption band show a material-specific absorption spectrum in the near infrared region. For example, if the reference absorption wavelength of the C-H stretch is 2960 nm and the reference absorption wavelength of the C-H bend is 6,849 nm in the infrared region, the bond absorption wavelength appears in the 2,262 nm near infrared region. Therefore, by irradiating near-infrared rays on organic matter and quantifying the amount of energy absorbed at each frequency, it is possible to measure the component content by a quantitative chemical method.
  • the present invention is to improve the conventional problems, to derive a methane index that can be used as an indicator for evaluating the digestibility and nutritional value of feedstock in ruminants, feedstock using a ruminant model continuous culture system
  • the purpose of this study is to provide a method for analyzing and predicting methane production and methane index by applying the methane production measurement of to a near-infrared system.
  • a method for analyzing methane generation of feedstock using a near infrared system may be provided.
  • the feed material may be selected from the group consisting of wheat, corn, soybean meal, soybean hull, palm gourd, rapeseed gourd and palm gourd.
  • the near-infrared ray to be irradiated may have a wavelength of 0.80 ⁇ 2.50 ⁇ m.
  • the method may further include performing a mathematical pretreatment according to a differential method or multiplicative scatter correction after obtaining a near infrared spectrum in the step (b).
  • the methane generation formula generated in step (c) is a standard prediction error, standard prediction error and correlation coefficient for the methane generation amount measured in the continuous culture fermenter using any optional feedstock
  • the verification may further include using.
  • the methane generation amount and the methane index of the feed material can be analyzed early through the near-infrared spectrum with only the feed sample, it is environmentally friendly to maintain the digestibility of the ruminant and the decomposition rate of the feed while reducing the methane generation amount. It can be used to develop feed.
  • Figure 1 shows the pH value for each major feed material measured in the rumen model continuous culture system.
  • Figure 2 shows the total amount of gas generated by the main feed material measured in the rumen model continuous culture system.
  • Figure 3 shows the amount of methane gas generated by the main feed material measured in the rumen model continuous culture system.
  • Figure 4 shows the prediction result of the methane generation amount of the feed material using the methane generation prediction formula according to an embodiment of the present invention.
  • a method for analyzing methane generation of feedstock using a near infrared system may be provided.
  • the near-infrared spectrum shows a complicated shape by overlapping absorption spectra of several components. Differentiation is the most commonly used method to precisely find the spectrum of each component by separating the absorption bands from the overlapping spectra.
  • the first or second derivative is most used, and the third or fourth derivative may also be used, but may cause over-fitting.
  • (Bavg-Aavg) and (Cavg-Bavg) are calculated to obtain a moving average of the entire spectrum and calculate the slope of each section.
  • (Cavg-Bavg)-(Bavg-Aavg) are calculated to obtain the moving average of the entire spectrum and the slope of each section.
  • the absorption peak of the one spectrum appears as a negative peak.
  • the near-infrared spectrum is synthesized by combining the harmonic and combined absorption of the reference absorption in the infrared region, but the spectrum shape is not very complicated in a simple substance, but in the actual grains, the absorption spectrum is combined for each component, thus exhibiting a fairly complicated shape.
  • a multivariate analysis of this complex spectrum produces a calibration model to predict parameters such as moisture, protein, or starch properties, processing titrations, and the like.
  • multivariate analysis such as regression analysis, discriminant analysis, canonical correlation analysis, principal component analysis, atomic analysis, cluster analysis, but the three most commonly used methods are: multiple regression analysis, principal component regression analysis, and PLS regression analysis.
  • multiple linear regression is the most widely used multivariate analysis, and the prediction model is prepared by selecting several wavelengths from the spectrum as follows.
  • Y i component value
  • a 0 integer term
  • a i regression coefficient
  • X i absorbance for each wavelength (log (1 / R)), second derivative, and the like
  • e i residual
  • Total variable method Analyze all explanatory variables and select the combination that gives the highest regression coefficient.
  • Variable increase method Select one explanatory variable representing the highest correlation coefficient with the objective variable, and select the explanatory variable representing the highest regression variable by repeating the following combination of variables.
  • Variable Reduction Method Write a regression equation using the entire explanatory variable, and then remove the explanatory variables with the least regression coefficient.
  • Variable increase method Obtain a regression equation by increasing explanatory variables one by one, and exclude it from the regression equation unless it helps to increase the regression coefficient.
  • Variable designation method Select variables that are empirically important and use them in the regression analysis.
  • PCR Principal Component Regression
  • Principal components have the following characteristics when compared with the original explanatory variables: In other words, information can be collected in a principal component that is much smaller than the original explanatory variables, thereby greatly reducing the number of samples required for regression analysis. In addition, since the main components are orthogonal to each other and do not correlate with each other, there is no fear of multicollinearity. In addition, since information and noise are concentrated on large principal components regardless of large or small eigenvalues, even if the principal component number is increased, the risk of overfitting is small and a stable prediction model can be obtained.
  • PLS Partial Least Square regression analysis assumes an error in both the explanatory and objective variables, in contrast to the assumption of the error for each explanatory variable.
  • PLS regression analysis like the principal component regression analysis, potential factors are extracted and explained as explanatory variables. The difference between the PLS regression and the explanatory variable is that the objective variable is used together.
  • the regression equation is calculated using the entire information of the variable, so that the prediction accuracy is higher than that of the principal component regression analysis.
  • Principal Component Analysis there is an advantage that it is possible to simultaneously solve the problems of multicollinearity and number of samples and variables.
  • the feed material may be selected from the group consisting of wheat, corn, soybean meal, soybean hull, palm gourd, rapeseed gourd and palm gourd.
  • the near-infrared ray to be irradiated may have a wavelength of 0.80 ⁇ 2.50 ⁇ m.
  • the method may further include performing a mathematical pretreatment according to a differential method or multiplicative scatter correction after obtaining a near infrared spectrum in the step (b).
  • near-infrared spectra are excellent in reproducibility, but may be accompanied by slight changes, such as baseline changes, depending on the type, condition, and measurement conditions of the sample.
  • the mathematical pretreatment step according to the differential method or polydispersity correction is performed. By further including the calibration result can be improved.
  • Polydispersity correction is a method of eliminating scattering effects by linearizing individual spectra into the ideal spectrum of a sample.
  • Standard normalization removes spectral scattering by normalizing the standard deviation of absorbance over the entire spectrum, rather than using the ideal spectrum, with polydispersity correction.
  • preprocessing spectra with polydispersity correction and standard normalization and spectrum without pretreatment were used, respectively.
  • the methane generation formula generated in step (c) is a standard prediction error, standard prediction error and correlation coefficient for the methane generation amount measured in the continuous culture fermenter using any optional feedstock
  • the verification may further include using.
  • This step is to evaluate the predictive power of the selected methane predictive formula and to estimate the prediction accuracy of the predicted formula generated using an independent feedstock or unknown feedstock that is not used in the methane predictive formula (NIRs calibration).
  • NIRs calibration methane predictive formula
  • standard prediction errors, standard correction errors, and correlation coefficients for methane generation may be used, but are not necessarily limited thereto.
  • Culture solution The collected gastric juice was filtered with 8 layers of gauze and filtered with glass wool. The filtered gastric juice remained anaerobic while bubbling with carbon dioxide (CO 2 ) gas. The prepared buffer was mixed with gastric juice while maintaining the carbon dioxide gas (gastric juice 250mL, buffer 600mL).
  • Substrate 10 g of substrate was added to the fermenter.
  • Buffer bottle A buffer solution was added to the buffer container while maintaining the anaerobic state.
  • a Tedlar bag filled with carbon dioxide gas was connected to a buffer container, and a tube connected to the buffer container was connected to a buffer inlet in a fermenter lid.
  • Feeding tube The feed tube was inserted into the feed inlet of the fermenter lid so as to be sufficiently immersed in the culture solution.
  • the lid of the fermenter was connected to the fermenter and kept anaerobic using vacuum grease and Teflon tape. Subsequently, carbon dioxide gas was introduced into the fermenter for about 10 minutes through the gas collecting port of the fermenter lid (the inside of the fermenter was changed to anaerobic state, and the carbon dioxide gas was continuously flowed until the culture started).
  • the connection parts of all instruments were sealed with vacuum grease and Teflon tape, the peristaltic pump was operated, and a buffer solution was introduced into the fermenter (1000-1200 ml / day).
  • the anaerobic culture was introduced into the fermenter until it overflowed through the feed inlet, and the CO2 gas was stopped and all inlets were blocked.
  • the circulation water tank and the fermentation tank were connected and the temperature was set (37-40 ° C.).
  • the rpm of the stirring rod was set to 10-20 rpm, and culture was started.
  • the methane production was measured as the average of methane production measured for 3 days after the first adaptation period of the rumen and 7 days of the first sample adaptation period.
  • Soybean meal, wheat, soybean meal, palm meal, protein skin, palm gourd and corn were used as main feedstocks to measure methane production.
  • methane generation and NIR spectroscopy of the rumen model continuous culture system of each sample were performed in parallel.
  • the total number of samples analyzed was 55.
  • the spectral data output from the near infrared measuring device was input to a computer in real time as described below and databased.
  • FOSS XDS Model was used for the equipment for near infrared spectroscopy (Model name: FOSS XDS NIRs instrument, Scan range: 400 ⁇ 2500nm, Resolution: 0.5nm, Detector type: Si & Pb detecter, Measurement Method: rock measurement method, operation S / W: ISIScan, Calibration S / W: WinISI)
  • the first derivative of the NIRs DB was used to generate the calibration equation, and the generation of the calibration equation was performed using the spectrum of 400 ⁇ 2500 nm.
  • PCA Principal Component Analysis
  • the total gas generation by feed material using the continuous culture device appeared in the order of protein skin> chaejong> corn> wheat> coconut palm> soybean meal> palm gourd.
  • the standard deviation was high in chaejong and palm bak, and the smallest variation of mothership in soybean meal.
  • the total amount of gas generated can be used to estimate the fermentation behavior of feedstock in fermenters in continuous culture systems.
  • the amount of methane gas produced by feed material using the continuous culture device appeared in the order of wheat> corn> soybean meal> chaejong> palm gourd> palm gourd> protein skin. Higher standard deviations were observed in palm bak, with the least variation of mothership in soybean meal.
  • the overall methane production tended to be similar to the total gas generation, but the soybean meal and protein skin methane production tended to be opposite to the total gas production.
  • the methane generation amount of each feed material measured in the rumen model continuous culture system was combined with the near-infrared system to generate a methane generation equation, and the methane generation amount of each feed material was calculated using the above equation.
  • the correlation coefficient was 0.842, and the result was applicable to the statistically significant level.
  • the methane generation amount analysis method of the feed material using the near-infrared system it is possible to overcome the limitations of animal biological experiments, and the burden of time and cost is small.
  • a continuous culture system similar to the ruminant digestive system accurate and objective methane production and methane indexes can be analyzed and predicted.
  • the methane generation amount and the methane index of the feed material can be analyzed early through the near-infrared spectrum with only the feed sample, it is environmentally friendly to maintain the digestibility of the ruminant and the decomposition rate of the feed while reducing the methane generation amount. It can be used to develop feed.
  • the method of analyzing methane generation amount of feed material using the near-infrared system according to the present invention can be utilized to develop an environment-friendly feed that reduces the amount of methane generated while maintaining the digestion rate and the decomposition rate of feed of ruminant animals.

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Abstract

본 발명은 근적외선시스템을 이용하여 사료원료에서 발생되는 메탄 발생량을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 반추위 모형 연속배양 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 측정값을 근적외선시스템에 적용하여 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법을 이용함으로써 동물 생체실험의 한계를 극복할 수 있고, 소요되는 시간 및 비용의 부담이 적으며, 실제 반추위 동물의 소화 시스템과 유사한 연속배양 시스템을 도입함으로써 정확하고 객관성있는 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측할 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하여 사료 원료에 대한 메탄 발생량 및 메탄지수를 사료 시료만을 가지고 근적외선 스펙트럼을 통해 조기에 분석할 수 있으므로, 반추위 동물의 소화율 및 사료의 분해율을 유지함과 동시에 메탄 발생량을 저감시키는 친환경 사료를 개발하는데 활용될 수 있다.

Description

근적외선 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법
본 발명은 근적외선시스템을 이용하여 사료원료에서 발생되는 메탄 발생량을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 반추위 모형 연속배양 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 측정값을 근적외선시스템에 적용하여 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측하는 방법에 관한 것이다.
소의 반추위에는 수많은 미생물들이 생활하면서, 소가 섭취한 사료를 소 대신 분해하며, 소는 그 분해 과정에서 나오는 산물들을 다시 이용하는 매우 특이한 방식으로 진화해왔다. 이 과정에서 유기물이 분해되면 수소와 이산화탄소도 발생하는데, 수소가 반추위에 축적이 되면 미생물의 대사활동을 방해하는 문제가 발생하여 반추위 건강이 악화된다. 따라서, 수소를 반추위 밖으로 배출하는 방법으로 메탄생성균이 수소와 이산화탄소를 이용해 메탄을 생성하게 된다. 즉, 메탄이 만들어지는 것은 소의 반추위내 미생물 생태계를 건강하게 유지하는 중요한 방법 중 하나이다.
현재 세계적으로 많은 연구자들의 노력에 의해 소의 반추위에서 메탄이 생성되는 기작이 밝혀짐에 따라 소를 포함한 다양한 반추위 동물들로부터 발생되는 메탄을 줄일 수 있는 메탄저감제 연구가 많이 수행되고 있다. 다만, 주요 방법으로 지방산, 항생제, 또는 화학적 합성제 등이 이용되었고, 이들 물질들이 배양병을 이용하는 실험에서는 메탄 발생량을 줄이는 효과가 있음을 확인하였지만, 소화율 감소, 항생제 사용금지, 또는 독성 잔류 등의 문제로 인해 아직 실용화할 수 있는 정도로 성숙한 기술은 없는 실정이다.
종래 사료원료별 메탄 발생량을 측정하는 방법으로는 배양법을 이용한 방법이 주로 사용되었다. 상기의 배양병 이용법은 사료 원료 시료에 미생물을 24시간 배양하여 실제 발생하는 메탄 발생량을 측정하는 방법이므로, 시간 및 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다. 종래 근적외선 분광 분석법은 주로 사료의 성분을 분석하기 위해 사용된 예가 있으나, 사료의 성분만 가지고는 소의 반추위에서 발생하는 메탄을 효과적으로 감소시킴과 동시에 사료의 분해율을 유지하는 소위 "그린사료" 개발에 직접적인 해결책을 제공해주지 못하고 있다.
근적외선 분광 분석법에 대하여 살펴보면 하기와 같다.
근적외선은 가시광선 영역과 인접하고 있는 적외선의 일부로서 통상 780~2,500㎚ 범위의 전자파를 말한다. 근적외선 분광은 분자(molecule)에 의해 흡수되는 근적외광선(또는 에너지)에 관해 연구하는 것으로서 전자파와 물질 사이의 상호작용에 관한 분자 분광의 한 분야이다. 일반적으로 적외선 및 근적외선은 분자의 진동을 여기시키며, 근적외선 및 적외선을 흡수한 분자는 진동 쌍극자(vibrating dipoles)처럼 특정한 주파수와 진폭으로 진동한다. 이 때 분자진동을 일으키는 에너지와 빛의 에너지가 일치하게 되면 분자는 빛을 흡수하게 되고, 새로운 에너지 준위가 높은 상태로 천이하면서 진동 주파수는 변화되지 않으나 진폭이 커진다. 그러나, 분자진동을 일으키는 에너지와 빛의 에너지가 일치하지 않으면 빛은 반사되어 버린다.
일반적으로 유기물을 구성하고 있는 분자의 관능기(O-H, C-H, N-H, S-H기 등)는 적외선 영역에서 고유의 흡광 밴드(기준 진동밴드)를 가지고 있다. 즉, 적외선을 흡수하는 물질은 O-H, C-H, N-H, S-H기로 구성된 성분을 함유하고 있다. 이러한 특성을 이용하여 어떤 유기물에 적외선을 조사하고 적외선이 흡수(또는 반사)되는 정도를 측정함으로써 그 유기물에 함유된 성분을 측정할 수 있다. 그러나, 적외선을 유기물에 조사하면 흡광성이 너무 강하여 정량이 곤란하므로 근적외선 영역의 파장을 주로 이용하게 된다.
일반적으로 근적외선 파장영역에서는 적외선 파장영역에서 유도되는 기준흡수파장에 비하여 배음(overtone)흡수 또는 결합(combination)흡수 파장을 나타내는데, 배음 흡수는 대략적으로 기준 흡수 주파수보다 2 배 또는 3 배(기준흡수 파장보다 1/2 배 또는 1/3 배)가 되는 주파수(또는 파장)에서 일어난다. 예를 들면, C-H stretch의 기준흡수가 3,380㎚의 적외선 영역에서 발생한다고 하면, 제1배음은 1,690㎚, 제2배음은 1,126㎚의 근적외선 영역에서 일어난다.
유기물을 구성하고 있는 단백질이나 전분 등과 같은 다원자 관능기의 경우에는 흡수가 더욱 복잡해지는데 기준 흡수 밴드의 수는 구성원자의 수를 n 개라고 하면 3n - 6 개로 올라가고, 따라서 배음 흡수도 보다 복잡하게 된다. 또한, 2 개 이상의 흡수가 동시에 발생하면, 결합 흡수가 근적외역에 발생한다. 이와 같이 기준흡수 밴드에 대한 배음 흡수 및 결합 흡수에 의해 근적외역에서 물질 특유의 흡수스펙트럼이 나타난다. 예를 들어, C-H 스트레치의 기준흡수 파장이 2,960 nm, C-H 벤드의 기준흡수 파장이 6,849 nm의 적외선 영역에서 발생한다면 결합흡수 파장은 2,262 nm의 근적외선 영역에서 나타난다. 따라서, 유기물에 근적외선을 조사하고 각 주파수에서 흡수되는 에너지의 양을 정량화하면, 그 성분함량을 계량 화학(chemometric)적인 방법으로 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 종래 기술로는 한국초지조사료학회지 제24권 제1호(2004. 3) pp. 81-90 1013-9354 KCI가 있다.
이와 같은 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 근적외선시스템을 이용하여 사료원료에서 발생되는 메탄 발생량을 분석하는 방법을 개발하기에 이르렀다.
결국, 본 발명은 종래의 문제점을 개선하기 위한 것으로서, 반추동물에서 사료 원료의 소화율 및 영양적 가치를 평가하기 위한 지표로서 이용할 수 있는 메탄지수를 도출하기 위하여, 반추위 모형 연속배양 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 측정값을 근적외선시스템에 적용하여 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해,
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 반추위 동물로부터 채취한 위액, 완충액, 및 반추위 미생물 배양액으로 구성된 연속배양 발효조에 사료 원료를 투입하고 메탄 발생량을 측정하는 단계; (b) 사료 원료에 근적외선을 조사하여 근적외선 스펙트럼을 얻는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 측정된 메탄 발생량 및 상기 (b) 단계에서 얻어진 근적외선 스펙트럼을 이용하여 메탄 발생 예측식을 생성하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식을 데이터베이스화하는 단계; 및 (e) 임의의 사료 원료에 대한 근적외선 스펙트럼에 상기 메탄 발생 예측식을 적용하여 메탄 발생량을 예측하는 단계;를 포함하는 근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 사료 원료는 소맥, 옥수수, 대두박, 대두피, 야자박, 채종박 및 팜박으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조사되는 근적외선은 0.80 ~ 2.50 ㎛의 파장일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 근적외선 스펙트럼을 얻은 다음, 미분법 또는 다분산 보정(Multiplicative scatter correction)에 따른 수학적 전처리 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식은 별도의 임의의 사료 원료를 이용하여 상기 연속배양 발효조에서 측정된 메탄발생량에 대한 표준예측오차, 표준예측보정오차 및 상관계수를 이용하여 검증하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법을 이용함으로써 동물 생체실험의 한계를 극복할 수 있고, 소요되는 시간 및 비용의 부담이 적으며, 실제 반추위 동물의 소화 시스템과 유사한 연속배양 시스템을 도입함으로써 정확하고 객관성있는 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측할 수 있다.
또한, 본 발명을 이용하여 사료 원료에 대한 메탄 발생량 및 메탄지수를 사료 시료만을 가지고 근적외선 스펙트럼을 통해 조기에 분석할 수 있으므로, 반추위 동물의 소화율 및 사료의 분해율을 유지함과 동시에 메탄 발생량을 저감시키는 친환경 사료를 개발하는데 활용될 수 있다.
도 1은 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사료 원료별 pH 값을 나타낸 것이다.
도 2는 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사료 원료별 총 가스 발생량을 나타낸 것이다.
도 3은 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사료 원료별 메탄가스 발생량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 메탄 발생 예측식을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량의 예측 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 반추위 동물로부터 채취한 위액, 완충액, 및 반추위 미생물 배양액으로 구성된 연속배양 발효조에 사료 원료를 투입하고 메탄 발생량을 측정하는 단계; (b) 사료 원료에 근적외선을 조사하여 근적외선 스펙트럼을 얻는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 측정된 메탄 발생량 및 상기 (b) 단계에서 얻어진 근적외선 스펙트럼을 이용하여 메탄 발생 예측식을 생성하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식을 데이터베이스화하는 단계; 및 (e) 임의의 사료 원료에 대한 근적외선 스펙트럼에 상기 메탄 발생 예측식을 적용하여 메탄 발생량을 예측하는 단계;를 포함하는 근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법이 제공될 수 있다.
근적외선 스펙트럼은 여러 개의 성분의 흡수 스펙트럼이 겹쳐져서 복잡한 형상을 나타낸다. 이와 같이 서로 겹쳐진 스펙트럼에서 흡수밴드를 분리하여 성분별 스펙트럼을 정확하게 찾아내기 위하여 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법이 미분이다. 통상적으로 1차 또는 2차 미분이 가장 많이 사용되며, 3차 또는 4차 미분도 사용될 수 있으나 over-fitting의 원인이 될 수 있다.
1차 미분에서는 (Bavg-Aavg)과 (Cavg-Bavg)를 계산하여 전체스펙트럼의 이동평균(moving average)을 구하고 각 구획의 기울기를 계산한다. 2차 미분에서는 (Cavg-Bavg) - (Bavg-Aavg)를 계산하여 전체 스펙트럼의 이동평균을 구하고 각 구획의 기울기를 계산한다. 2차 미분에서는 원스펙트럼의 흡수 피크가 음(-)의 피크로 되어 나타난다. 미분 처리에 의해 원래 스펙트럼의 피크가 나누어지면서 서로 겹쳐진 흡수 피크를 분리하는 것이 가능해진다. 따라서, 미분처리를 하게 되면 스펙트럼의 특성 추출이 용이해지고, 원 스펙트럼에서 고려해야 하는 기울기를 제거할 수 있다. 같은 시료에서 입자 크기의 상이로 인하여 스펙트럼의 기준선(baseline)이 상이해지는 것을 2차 미분에 의해 상쇄시킬 수 있다.
다음으로, 다변량 분석 방법에 관하여 살펴본다. 근적외 스펙트럼은 적외역의 기준 흡수의 배음 및 결합 흡수가 합성되어 나타나므로 단순 물질에서는 스펙트럼형상이 그다지 복잡하지 않지만, 실제의 곡물 등에서는 성분마다 흡수 스펙트럼이 결합되어 상당히 복잡한 형상을 나타낸다.
근적외 분광법에서는 이 복잡한 스펙트럼을 다변량 분석하여 수분, 단백질 등의 성분, 또는 전분의 호화특성, 가공 적정등의 매개변수(parameter) 등을 예측하기 위해서 캘리브래이션(calibration)모델을 작성한다. 다변량 분석에는 중회귀분석, 판별분석, 정준상관분석, 주성분분석, 원자분석, 클러스터분석 등 많은 방법이 있지만, 주로 사용되는 것은 다음의 3가지(중회귀분석, 주성분회귀분석, PLS회귀분석)이다.
먼저, 중회귀분석(MLR ; Multiple Linear Regression)은 현재 가장 넓게 이용되고 있는 다변량 분석법으로서 스펙트럼 중에서 여러 개의 파장을 선택하여 다음과 같이 예측모델을 작성한다.
수학식 1
Figure PCTKR2014011900-appb-M000001
여기서, Y i : 성분값; a 0 : 정수항; a i : 회귀계수; X i : 각 파장에 대한 흡광도(log(1/R)), 2차 미분값 등; e i : 잔차
a 0 및 a i 는 최소제곱법에 의해 구한다. 회귀에 포함되는 파장수(m)와 시료수(n)는 n = m+1만 만족하면 어떠한 데이터가 있더라도 중상관계수 r은 1.0이 된다. 따라서, 가능한 적은 파장으로 정도가 높은 예측모델을 작성하기 위해서는 n을 충분히 크게 해야 한다. 또, 서로 높은 상관을 가지는 설명변수가 회귀식 중에 포함되면 예측 정도가 현저하게 저하되는 다중공선성의 문제가 발생한다. 따라서, 보다 적은 설명변수에 의해 정도가 높은 예측 모델을 작성하기 위하여 다음과 같은 여러 가지의 변수 선택법이 개발되어 있다.
총변수법 : 모든 설명변수를 조합하여 분석하고, 가장 높은 회귀계수를 얻을 수 있는 조합을 선택한다.
변수증가법 : 목적변수와 가장 높은 상관계수를 나타내는 설명변수 한 개를 선택해고, 여기에 다음의 변수를 조합시키는 작업을 반복하면서 가장 높은 회귀변수를 나타내는 설명변수를 선택한다.
변수감소법 : 전체 설명변수를 사용하여 중회귀식을 작성한 다음, 회귀계수를 낮게 하는 정도가 가장 적은 설명 변수들을 제거해 나간다.
변수증가법 : 설명변수를 하나씩 증가시키면서 회귀식을 구하고, 회귀계수를 높이는데 도움이 되지 않으면 중회귀식으로부터 제외시킨다.
변수지정법 : 경험적으로 중요성이 명확한 변수를 선택하여 중회귀분석에 사용한다.
다음으로, 주성분 회귀분석(PCR ; Principal Component Regression)은 중회귀 분석이 가지는 고유의 결점, 즉, 시료수(n)가 많아야 하는 것, 다중공선성의 문제를 해결하기 위해 개발된 방법으로서, 본래의 변수(x)에서 추출한 주성분(z)을 설명변수로 사용하여 중회귀식을 구하는 것이다. 주성분회귀분석의 예측모델은 다음과 같이 작성한다. 회귀계수를 구하는 방법은 중회귀분석과 같다.
수학식 2
Figure PCTKR2014011900-appb-M000002
여기서, Y i : 성분값; a 0 : 정수항; a q : 회귀계수; Z q : q번째 주성분; e i : 잔차
주성분은 원래의 설명변수와 비교할 때 다음과 같은 특징을 가진다. 즉, 원래의 설명변수 보다 개수가 훨씬 적은 주성분에 정보를 집약할 수 있으므로 회귀분석에 필요한 시료수를 대폭적으로 줄일 수 있다. 또한, 주성분은 서로 직교하여 상호 상관성이 없으므로 다중공선성의 우려가 없다. 그리고, 고유값이 크거나 적은데 관계없이 커다란 주성분에 각각 정보와 잡음을 집약하고 있기 때문에 주성분수를 늘이더라도 오버피팅(overfitting)의 위험성이 적고, 안정된 예측모델을 얻을 수 있다.
한편, PLS(Partial Least Square)회귀분석에서는 통상의 회귀분석에서 오차를 설명변수마다 가정하는 것과 달리 설명변수와 목적변수의 양 변수에 모두 오차를 가정한다. PLS회귀분석에서는 주성분회귀분석과 마찬가지로, 잠재적인 인자를 추출해서 설명변수로 하는데, 추출할 때에 설명변수와 목적변수를 함께 이용하는 것이 주성분분석과의 차이점이다. PLS법에서는 변수가 가지고 있는 전체 정보를 이용해서 회귀식를 산출하기 때문에 주성분회귀분석 보다 높은 예측정도를 얻을 수 있다. 또 주성분 분석과 마찬가지로 다중공선성과 시료수 및 변수의 문제를 동시에 해결이 가능하다는 이점이 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 사료 원료는 소맥, 옥수수, 대두박, 대두피, 야자박, 채종박 및 팜박으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조사되는 근적외선은 0.80 ~ 2.50 ㎛의 파장일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 근적외선 스펙트럼을 얻은 다음, 미분법 또는 다분산 보정(Multiplicative scatter correction)에 따른 수학적 전처리 단계를 더 포함할 수 있다.
일반적으로 근적외선 스펙트럼은 재현성이 우수하나, 시료의 종류, 상태, 및 측정 조건 등에 따라 바탕선 변화 등의 약간의 변화를 수반할 수 있으므로 일 실시예에 있어서, 미분법 또는 다분산 보정에 따른 수학적 전처리 단계를 더 포함함으로써 검량 결과를 향상시킬 수 있다.
다분산 보정은 개개의 스펙트럼을 시료의 이상적 스펙트럼(ideal spectrum)으로 선형화하여 산란효과를 제거하는 방법이다. 표준 정규화는 다분산 보정과 달리 이상적 스펙트럼을 이용하지 않고 전체 스펙트럼에 대한 흡광도의 표준편차를 각 스펙트럼에 대해 정규화하여 스펙트럼의 산란을 제거한다. 각 모델의 개발 과정에는 다분산 보정 및 표준 정규화를 적용한 전처리 스펙트럼과 전처리를 실시하지 않은 스펙트럼이 각각 이용되었다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식은 별도의 임의의 사료 원료를 이용하여 상기 연속배양 발효조에서 측정된 메탄발생량에 대한 표준예측오차, 표준예측보정오차 및 상관계수를 이용하여 검증하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계는 선발된 메탄 예측 발생식의 예측 능력을 평가하기 위한 것으로서 메탄 예측 발생식(NIRs 검량식)에 사용되지 않는 독립적인 사료 원료 또는 미지의 사료 원료를 이용하여 생성된 예측식의 예측 정확성을 평가하는 것으로서, 메탄발생량에 대한 표준예측오차, 표준예측보정오차 및 상관계수를 이용할 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 반추위 모형 연속배양시스템(Rumen simulation continuous culture system)의 구축
(1) 배양액 : 채취한 위액을 8겹의 가제로 거른 후 유리솜으로 걸렀다. 걸러진 위액은 이산화탄소(CO2)가스로 유지(bubbling)하면서 혐기상태를 유지하였다. 미리 제조한 버퍼를 이산화탄소 가스로 유지 하면서 위액과 혼합하였다(위액 250mL, 버퍼 600mL).
(2) 기질 : 발효조에 10 g의 기질을 투입하였다.
(3) 완충액통 : 혐기상태를 유지하면서 완충액통에 완충액을 투입하였다. 이산화탄소 가스를 충진시킨 테들러백(Tedlar bag)을 버퍼통과 연결하고, 버퍼통과 연결된 튜브는 발효조 뚜껑 중 버퍼 투입구와 연결하였다.
(4) 가스 포집 주머니 : 가스 포집 주머니와 연결된 튜브를 발효조 뚜껑 중 가스 포집구와 연결(연결 튜브는 가스용 튜브를 사용)하였다.
(5) pH 및 온도 전극 : 전극이 배양액에 충분히 닿을 정도로 넣었다. 이 때, 교반봉에 닿지 않도록 주의하여야 한다.
(6) 사료투입관 : 발효조 뚜껑 중 사료 투입구에 사료투입관을 배양액에 충분히 잠길 정도로 삽입하였다.
(7) 발효조의 뚜껑을 발효조와 연결하고 진공용 구리스와 테프론 테입을 이용하여 혐기상태를 유지하였다. 이어서 발효조 뚜껑 중 가스 포집구를 통해 발효조 내부에 이산화탄소 가스를 약 10분간 투입하였다(발효조 내부를 혐기상태로 변화, 이산화탄소 가스는 배양이 시작되기 전까지 계속 흘려보냈다). 모든 기기의 연결부위는 진공용 구리스와 테프론 테이프로 봉합하였으며, 연동펌프를 작동 시키고, 발효조 내부로 완충액을 투입하였다(1000 ~ 1200 ml/일).
(8) 혐기상태의 배양액을 사료투입구를 통해 오버플로우될 때 까지 발효조로 투입하였으며, 이산화탄소 가스 투입을 중지하고, 모든 입구를 막았다. 순환수조와 발효조를 연결하고 온도를 설정하였다(37 ~ 40 ℃).
(9) 교반봉의 rpm을 10 ~ 20 rpm으로 설정하고, 배양을 시작하였다. 반추위 적응기간 7일, 1번째 샘플 적응기간 7일 후 각 모선별 시료 3일간의 메탄발생 측정값의 평균으로 메탄발생량을 측정하였다. 메탄발생값을 측정하기 위한 주요 사료 원료로서 대두박, 소맥, 채종박, 야자박, 단백피, 팜박 및 옥수수가 사용되었다.
2. 근적외선 시스템(NIRs)을 이용한 메탄 발생 예측식의 생성
(1) NIRs DB 확보
검량식 작성과 검정을 위하여 각 샘플의 반추위 모형 연속배양시스템의 메탄발생량 측정법과 NIRs 스펙트럼 분석법을 병행하였으며, 분석 대상 샘플의 수는 총 55개였다. 근적외선 측정장치로부터 출력되는 스펙트럼 데이터는 하기와 같이 실시간으로 컴퓨터에 입력되어 데이터베이스화되었다.
① 사료 원료 분석 샘플에 대한 각각의 근적외선 스펙트럼을 측정한다.
② 측정된 스펙트럼에 각각의 사료 원료의 메탄발생량의 결과값을 입력한다.
③ 상기 ① 및 ② 단계 완료 후 생성된 Cal 파일을 추출하여 NIRs DB를 준비한다.
근적외선 분광분석을 하기 위한 장비는 FOSS XDS Model이 사용되었다(모델명: FOSS XDS NIRs instrument, Scan range(측정 범위): 400~2500nm, Resolution(분해능): 0.5nm, Detector type: Si & Pb detecter, 측정 방식: 반석 측정 방식, 운영 S/W: ISIScan, Calibration S/W: WinISI)
(2) NIRs 검량식(메탄 발생 예측식) 생성
상기 확보된 NIRs DB로부터 메탄발생량 분석결과와 NIRs 스펙트럼간의 수학 통계알고리즘을 이용한 검량식을 하기와 같이 생성하였다.
① 상기 확보된 NIRs DB의 스펙트럼을 검량식 생성을 위하여 1차 미분된 스펙트럼을 사용하였고 검량식 생성시 스펙트럼은 400 ~ 2500 nm 전 영역의 스펙트럼을 활용하였다.
② 상기 ① 단계의 전처리된 스펙트럼을 이용하여 PCA(Principal Component Analysis) 알고리즘을 적용하여 그룹을 형성하여 pca file을 생성하여 그룹의 이상치 판별 도구로 활용하였다
③ 상기 ① 단계의 전처리된 스펙트럼과 사료 원료의 분석결과는 PLS(Partial Least Squares) regression알고리즘을 적용하여 NIR 검량식(eqa 파일)을 생성하였다.
(3) NIRs 검량식(메탄 발생 예측식) 검증
NIRs 검량식(메탄 발생 예측식)을 검증하기 위하여, 미지의 사료 원료 시료를 이용한 분석 결과를 토대로 표준예측오차, 표준예측보정오차 및 상관계수를 통해 NIRs 검량식(메탄 발생 예측식)의 타당성을 하기와 같이 검증하였다.
① 상기 생성된 검량식(eqa 파일)의 RSQ(R-square), 표준검량오차 SEC(Standard Error of calibration)를 이용하여 검량식의 적용 정도를 파악하였다.
② 일반적인 호환정도(RSQ > 0.7)가 획인된 검량식은 SEC를 확인하여 현 분석치의 허용 가능 정도(허용 오차 기준)를 확인 후 적합 정도를 파악하여 활용가능 수준의 경우 미지의 사료 원료를 이용 하여 실제 적용 시의 오차를 검증한다.
③ 미지의 사료 원료에 대해 검증하여, 상기 실험 설계의 수준에서 적용 가능한 표준 예측 보정 오차(SEPc: Standard Error of Prediction corrected)를 보일 경우 기 검량식을 활용가능한 것으로 판정하여 향후 메탄발생량의 사료 원료 실험을 대체하여 NIRs 예측치(Predicted value)를 활용한다.
실험 결과
1. 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사요 원료별 pH 값
도 1에 나타난 바와 같이, 연속배양장치를 이용하여 사료원료별 pH 수준을 측정하였을 때 사료 원료별 pH 값의 평균은, 대두박 > 소맥 > 채종박 > 야자박 > 단백피 > 옥수수 = 팜박의 순서로 측정되었다. 옥수수에서 가장 높은 표준편차를 보였고, 대두박, 소맥, 채종박, 단백피, 팜박이 모선별 변이가 적었다.
2. 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사료 원료별 총 가스 발생량
도 2에 나타난 바와 같이, 연속배양장치를 이용한 사료 원료별 총 가스발생량은 단백피 > 채종박 > 옥수수 > 소맥 > 야자박 > 대두박 > 팜박의 순서로 나타났다. 채종박과 야자박에서 높은 표준편차를 보였고, 대두박에서 가장 모선별 변이가 적었다. 총 가스 발생량을 통해 연속배양장치 중 발효조에서 원료사료의 발효 양상을 추정할 수 있다.
3. 반추위 모형 연속배양시스템에서 측정한 주요 사료 원료별 메탄 가스 발생량
도 3에 나타난 바와 같이, 연속배양장치를 이용한 사료 원료별 메탄가스 발생량은 소맥 > 옥수수 > 대두박 > 채종박 > 야자박 > 팜박 > 단백피의 순서로 나타났다. 팜박에서 높은 표준편차를 보였고, 대두박에서 가장 모선별 변이가 적었다. 전체적인 메탄가스 발생량의 경향은 총 가스발생량과 비슷한 경향을 보였지만, 대두박과 단백피의 메탄가스 발생량은 총 가스발생량과 반대의 경향을 나타내었다.
4. NIRs 검량식(메탄 발생 예측식)을 이용한 메탄 발생량 예측 결과
표 1 및 도 4에 나타난 바와 같이, 반추위 모형 연속배양 시스템에서 측정한 각 사료 원료별 메탄 발생량을 근적외선 시스템에 접목시켜 메탄 발생 예측식을 생성하였으며, 상기 예측식을 이용하여 사료 원료별 메탄 발생량을 예측한 결과, 상관계수는 0.842로써 통계적으로 유의한 정도로 적용 가능한 수준의 결과를 얻을 수 있었다.
표 1
근적외선 시스템을 이용한 메탄 발생량 예측 결과
검증샘플수(개) 69
평균 13.576
표준예측오차 2.664
표준예측보정오차 4.563
표준편차 6.154
상관계수 0.842
따라서, 상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법을 이용함으로써 동물 생체실험의 한계를 극복할 수 있고, 소요되는 시간 및 비용의 부담이 적으며, 실제 반추위 동물의 소화 시스템과 유사한 연속배양 시스템을 도입함으로써 정확하고 객관성있는 메탄 발생량 및 메탄지수를 분석 및 예측할 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하여 사료 원료에 대한 메탄 발생량 및 메탄지수를 사료 시료만을 가지고 근적외선 스펙트럼을 통해 조기에 분석할 수 있으므로, 반추위 동물의 소화율 및 사료의 분해율을 유지함과 동시에 메탄 발생량을 저감시키는 친환경 사료를 개발하는데 활용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 의한 근적외선 시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법은 반추위 동물의 소화율 및 사료의 분해율을 유지함과 동시에 메탄 발생량을 저감시키는 친환경 사료를 개발하는데 활용될 수 있다.

Claims (4)

  1. (a) 반추위 동물로부터 채취한 위액, 완충액, 및 반추위 미생물 배양액으로 구성된 연속배양 발효조에 사료 원료를 투입하고 메탄 발생량을 측정하는 단계;
    (b) 사료 원료에 근적외선을 조사하여 근적외선 스펙트럼을 얻는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계에서 측정된 메탄 발생량 및 상기 (b) 단계에서 얻어진 근적외선 스펙트럼을 이용하여 메탄 발생 예측식을 생성하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식을 데이터베이스화하는 단계; 및
    (e) 임의의 사료 원료에 대한 근적외선 스펙트럼에 상기 메탄 발생 예측식을 적용하여 메탄 발생량을 예측하는 단계;를 포함하는
    근적외선시스템을 이용한 사료 원료의 메탄 발생량 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조사되는 근적외선은 0.80 ~ 2.50 ㎛의 파장인 것인 메탄 발생량 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 근적외선 스펙트럼을 얻은 다음, 미분법 또는 다분산 보정(Multiplicative scatter correction)에 따른 수학적 전처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 발생량 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 생성된 메탄 발생 예측식은 별도의 임의의 사료 원료를 이용하여 상기 연속배양 발효조에서 측정된 메탄발생량에 대한 표준예측오차, 표준예측보정오차 및 상관계수를 이용하여 검증하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 발생량 분석 방법.
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