WO2015061871A1 - Processo para micropropagação in vitro de material de planta e processo para a produção, em larga escala e alto volume, de mudas clonais de plantas prontas para o desenvolvimento em campo - Google Patents

Processo para micropropagação in vitro de material de planta e processo para a produção, em larga escala e alto volume, de mudas clonais de plantas prontas para o desenvolvimento em campo Download PDF

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WO2015061871A1 PCT/BR2014/000391 BR2014000391W WO2015061871A1 WO 2015061871 A1 WO2015061871 A1 WO 2015061871A1 BR 2014000391 W BR2014000391 W BR 2014000391W WO 2015061871 A1 WO2015061871 A1 WO 2015061871A1
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Ricardo Miguel PENCHEL
Jocemar Palauro dos REIS
Mila Liparize de OLIVEIRA
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Fibria Celulose S.A
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Abstract

A presente invenção se refere a um processo para micropropagação in vitro de material de planta compreendendo as etapas de multiplicação e alongamento dos brotos desenvolvidos a partir de propágulos de planta. A invenção compreende, ainda, um processo para a produção de mudas clonais de plantas em larga escala prontas para o desenvolvimento em campo, como substituição dos jardins clonais tradicionais por biofábricas 'in vitro'.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção
"PROCESSO PARA MICROPROPAGAÇÃO IN VITRO DE MATERIAL DE PLANTA E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO, EM LARGA ESCALA E ALTO VOLUME, DE MUDAS CLONAIS DE PLANTAS PRONTAS PARA O
DESENVOLVIMENTO EM CAMPO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a um processo de produção de mudas clonais de espécies arbóreas, especialmente eucalipto, em larga escala e alto volume, segundo o qual a etapa de propagação vegetativa, realizada in vitro, ocorre em condições tais que é maximizada a obtenção de microestacas . sadias e vigorosas da espécie arbórea enquanto é minimizada a taxa de hiper-hidricidade na fase de micropropagação em regime de imersão temporária. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A micropropagação' consiste em uma técnica de cultura de tecidos vegetais que é utilizada como base para formação de mudas, sendo um método prático, rápido e seguro de propagação massal de plantas em espaço reduzido. Convencionalmente, a micropropagação é realizada via sistema semissólido, normalmente em meio gelificante com ágar. Contudo, esta ainda é uma prática onerosa, abrindo espaço para o uso de equipamentos e novas tecnologias, que auxiliam na produção de plantas em larga escala operacional, com redução dos altos custos de mão de obra, em equipamentos chamados biorreatores . Os biorreatores são equipamentos para' o cultivo de propágulos em regime de imersão temporária ou permanente para obtenção de plantas. 0 biorreator consiste em um conjunto de recipientes contendo compartimentos e acessórios para manejo ótimo dos principais fatores de crescimento visando maximizar as reações biológicas. Por meio destes equipamentos é possível obter maiores taxas de multiplicação da cultura pelo uso de meio nutriente liquido, injeção e trocas de gases, por exemplo, de ar enriquecido com gás carbónico, dentro do recipiente, assim como de melhor controle fisiológico das: condições de cultivo e automatização do processo. Vários são os modelos de biorreatores, podendo variar em função dos recipientes de cultivo e do meio de cultura, do tipo de imersão (temporária ou permanente) e de sua funcionalidade. Os sistemas de imersão temporária que são mais conhecidos no Brasil são RITA® (recipiente de imersão temporária automatizada - por exemplo, o empregado no CIRAD-França) e BIT® (biorreator de imersão, temporária - por exemplo, aquele criado na Embrapa-Cenargen) .
Devido ao potencial da técnica de micropropagação, há crescente interesse nessa tecnologia como demonstra o estado da técnica. Por exemplo, no documento WO 2012/061950 é descrito um método e biorreator para micropropagação de uma espécie vegetal antártica, em que, o método é caracterizado pela utilização de condições e meio nutriente apropriados para o desenvolvimento da dita espécie vegetal e, adicionalmente, é empregado um protocolo de fornecimento de radiação UV e controle de temperatura para a produção de metabólitos valiosos para emprego medicinal e cosmético.
No documento WO 2012/156440 é descrito um sistema de imersão temporária e método de micropropagação de espécies vegetais caracterizados pelo provimento de condições adequadas ao desenvolvimento do propágulo, tal como iluminação, temperatura e regime de imersão com intervalos variando de 1 até 10 vezes ao dia e com tempo de imersão de 1 a 2 minutos, ou de 3 a 4 minutos, dependendo da espécie vegetal em desenvolvimento.
Síatt (ver Watt, M.P. "The status of temporary immersion system (TIS) technology for plant micropropagation" . African Journal of Siotechnology, Vo. 11(76), pp. 14025-14035, 20/09/2012) fez uma retrospectiva das técnicas de micropropagação de plantas, particularmente com relação às propostas para reduzir a hiper-hidricidade, mencionando como principais fatores, o encurtamento do tempo de imersão e o aumento do periodo de descanso (tempo entre duas imersões sucessivas) . González (ver González, R. e colaboradores. 'Multiplicación in vitro de Eucalyptus globulus mediante sistema de immersión temporal". Bosque 32(2): 147-154, 2011) relata os fatores que afeta o estágio de multiplicação in vitro de Eucalyptus globulus por imersão temporária e conclui que a taxa de multiplicação de m.icroestacas dessa espécie arbórea aumenta significativamente quando se emprega um tempo de imersão de 1-2 minutos e uma frequência de imersão (periodo de descanso) de 12 horas. Esses autores também concluíram que a hiper-hidricidade aumenta com a concentração de macronutrientes e sacarose.
Oliveira (ver Oliveira M.L. de, "Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de imersão temporária". Dissertação de Tese de Mestrado. Universidade Federal de Viçosa. 2011) relata o estudo de micropropagação in vitro de duas espécies de eucalipto, concluindo que há ocorrência de elevado percentual de hiper-hidricidade no desenvolvimento dos propágulos quando é empregada a técnica de imersão temporária. A autora também conclui que "há necessidade de ajuste no manejo da cultura nas fases de multiplicação e alongamento para a obtenção de brotos com maior vigor, aptos a enraizar em condições e vitro para tornar tal técnica viável em larga escala".
0 estado da técnica acima mencionado mostra que apesar de ter havido grande avanço na técnica de micropropagação in vitro de plantas, ainda resta resolver o problema da hiper-hidricidade e, ao mesmo tempo, empregar condições adequadas à obtenção de mudas clonais de plantas, em particular de espécies arbóreas e mais particularmente da espécie eucalipto, para possibilitar a produção de ditas mudas clonais em larga escala e grande volume e alcançar a produção comercial de mudas sadias e viçosas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à obtenção de mudas clonais de plantas, em particular de espécies arbóreas, e particularmente espécies de eucalipto, empregando a técnica de micropropagação in vitro de material vegetal, incluindo as etapas de multiplicação, alongamento, enraizamento, aclimatização, crescimento e aclimatação das mudas prontas para comercialização. Em uma primeira concretização, a presente invenção diz respeito a um processo para micropropagação in vitro de material de planta, especialmente de planta arbórea, particularmente de uma espécie de eucalipto, compreendendo as etapas de multiplicação e alongamento dos brotos desenvolvidos a partir de propágulos de planta pelo método de imersão temporária, sendo que: (a); na etapa de multiplicação dos brotos, o material a ser propagado é colocado sobre suporte adequado em um primeiro recipiente (recipiente de propagação vegetativa) e é submetido a manejo de imersão temporária em meio nutriente liquido, proveniente de um segundo recipiente (recipiente de armazenamento do meio liquido) , dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso, o período de imersão sendo preferivelmente por pelo menos 1 minuto, preferivelmente por no máximo 3 minutos, mais preferivelmente por 1 a 2 minutos, e o período de descanso sendo preferivelmente por pelo menos 2 horas, preferivelmente por no máximo 4 horas, mais preferivelmente por 2 a 3 horas; (b) na etapa de alongamento dos brotos, o material em propagação é submetido a manejo de imersão temporária, preferivelmente empregando o mesmo meio nutriente da etapa (a), dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso, o período de imersão sendo preferivelmente por pelo menos 20 segundos, preferivelmente por no máximo 60 segundos, mais preferivelmente por 20 a 30 segundos, e o período de descanso sendo preferivelmente por pelo menos 4 horas, preferivelmente por no máximo 6 horas, mais preferivelmente por 4 a 5 horas; dito processo sendo caracterizado pelo fato de que, na dita etapa de alongamento, os ditos períodos de imersão são significativamente mais curtos e os ditos períodos de descanso são mais longos em comparação com os períodos de imersão e de descanso, respectivamente, na etapa de multiplicação.
Em uma segunda concretização, a invenção diz respeito a um processo para a produção de mudas clonais de plantas prontas para o desenvolvimento em campo compreendendo as etapas de: (í) submeter propágulos de planta a condições de propagação vegetativa in vitro por imersão temporária compreendendo os estágios de: (a) multiplicação dos brotos em que o material a ser propagado é colocado sobre suporte adequado em um primeiro recipiente (recipiente de micropropagação) e submeter o dito material a manejo de imersão temporária em meio nutriente líquido, proveniente de um segundo recipiente (recipiente de armazenamento do meio líquido), dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso, o período de imersão sendo preferivelmente por pelo menos 1 minuto, preferivelmente por no máximo 3 minutos, mais preferivelmente por 1 a 2 minutos, e o período de descanso sendo preferivelmente por pelo menos 2 horas, preferivelmente por no máximo 4 horas, mais preferivelmente por 2 a 3 horas; (b) alongamento dos brotos em que o material em propagação é submetido a manejo de imersão temporária, preferivelmente empregando o mesmo meio nutriente do estágio (a) , dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso, o período de imersão sendo preferivelmente por pelo menos 20 segundos, preferivelmente por no máximo 60 segundos, mais preferivelmente por 20 a 30 segundos, e o período de descanso sendo preferivelmente por pelo menos 4 horas, preferivelmente por no máximo 6 horas, mais preferivelmente por 4 a 5 horas; (ii) enraizamento e aclimatização das multibrotações obtidas na etapa (i) em recipientes e condições apropriadas para manter o turgor vegetal e diminuir a demanda evaporativa; e (iii) crescimento e aclimatação das microestacas obtidas na etapa (ii) . BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 ilustra o processo da presente invenção mostrando o material micropropagado/microestacas em cada etapa .
A Figura 2 mostra a etapa de micropropagação in vítro em regime de imersão temporária em meio nutriente líquido.
A Figura 3 mostra as etapas de desenvolvimento de mudas clonais em larga escala e alto volume, desde a seleção do clone adequado até a introdução no mercado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O sistema de produção de microestacas clonais de espécies arbóreas, por exemplo, eucalipto, em alta escala e alta produtividade em biorreatores de imersão temporária tem como principal objetivo a substituição gradativa dos tradicionais jardins clonais dos viveiros florestais operacionais por biofábricas de plantas, visando à produção industrial de microestacas, para subsequente enraizamento e aclimatização em casas de vegetação especificas (estufins) .
Em biorreatores é possível a obtenção de maiores taxas de multiplicação e crescimento da cultura pelo uso continuo de meio nutriente líquido, suplementado com injeção de ar e enriquecimento com gás carbónico e radiação fotossinteticamente ativa com lâmpadas de diodos-leds dentro do recipiente das plantas. Desta forma, o manejo de produção de brotos e fitomassa é otimizado ao máximo via manipulação automatizada dos principais fatores de crescimento, permitindo melhor controle fisiológico das condições de cultivo.
O que tem sido buscado nesta técnica é a minimização da hiper-hidricidade , que causa distúrbios e degenerações às mudas clonais obtidas pelo método de imersão temporária e, ao mesmo tempo, mantendo as vantagens desta técnica em termos de custos de produção e de saúde/vigor das mudas produzidas. Esse desafio foi enfrentado pelos inventores desta invenção que criaram um método no qual os períodos alternados de imersão e de descanso do material em propagação vegetativa são diferenciados nos estágios de multiplicação e de alongamento dos brotos. Esse procedimento tornou possível minimizar a hiper-hidricidade e maximizar a produção de mudas clonais de plantas, particularmente de espécies arbóreas, e mais preferencialmente de espécies de eucalipto. Na Figura 1, esses dois estágios são representados como atividades realizadas no laboratório, sendo que a micropropagação, ou seja, a etapa incluindo os estágios de multiplicação e alongamento, em geral, leva um tempo de cerca 45 dias. O processo da presente invenção foi customizado para atender as demandas fisiológicas para a propagação vegetativa de espécies arbóreas, especialmente o eucalipto, permitindo o desenvolvimento intensivo e de precisão de plantas, diferenciado para resultar em melhor padrão de qualidade, uniformidade e vigor de brotos produzidos, proporcionando maior . enraizamento de microestacas e subsequente melhor aclimatização e precocidade de produção de mudas clonais para uso industrial em larga-escala .
O processo da presente invenção possibilita obter produtividade no mínimo 30 vezes superior ao sistema tradicional de produção de mudas dos viveiros comerciais, além de proporcionar redução em 33% no tempo do ciclo de produção de uma muda clonal. Adicionalmente, a implantação operacional do processo da invenção em viveiros permite redução de mão de obra e redução no custo de construção civil dos jardins clonais.
0 processo da invenção permite resolver, entre outros, os seguintes problemas:
— Produção de mudas clonais em larga escala e alto volume, com uniformidade e qualidade, para máxima1 eficiência e produtividade da propagação vegetativa de plantas arbóreas, por exemplo, eucalipto, com ciclos de produção e custos operacionais mais reduzidos. Redução de distúrbios e anomalias fisiológicas relacionadas à hiper-hidricidade dos explantes, fenómeno comumente conhecido como vitrificação das plantas. O manejo de trocas gasosas é um dos diferenciais do processo da invenção, que preferencialmente é realizado em biorreator do tipo BIT, mas que pode ser realizado em outro tipo de biorreator, tal como o RITA, e que praticamente elimina estes problemas biológicos.
Redução do custo de produção de mudas clonais de eucalipto associado à redução da mão de obra envolvida em jardins clonais no processo operacional.
Uniformização do padrão de qualidade fisiológica das plantas matrizes e de microestacas na propagação vegetativa, realizada em biorreator de imersão temporária, contrasta com a falta de uniformidade das plantas e miniestacas obtidas em plantas , cultivadas nos jardins clonais, onde as condições ambientais não são uniformes.
Dificuldades de propagação vegetativa de espécies e clones de espécies arbóreas, incluindo eucalipto, recalcitrantes são contornados com a propagação vegetativa in vitro em biorreator.es , permitindo a utilização de clones novos e mais produtivos que não seriam produzidos pelas vias convencionais.
Limpeza clonal, por meio da obtenção de plantas matrizes e culturas livres de microrganismos fitopatogênicos e, também, culturas de alta fidelidade genética de único clone sem misturas de outros clones. — Aceleração dos programas de melhoramento pela multiplicação de clones superiores, visando produzir mudas em menor tempo e maior quantidade em espaço reduzido, além do rejuvenescimento de clones e matrizes selecionados .
É importante observar que a utilização dos brotos (ou produtos da micropropagação) obtidos de acordo com o processo da invenção, para plantio direto em recipientes específicos (que podem ser tubetes, plugs, bandejas de isopor ou outro tipo) , substitui o fornecimento, ao mercado, de brotos dos conhecidos jardins clonais (ou mini- jardins clonais ou micro-j ardins clonais). Este é um grande diferencial da técnica de micropropagação empregada no processo da presente invenção e que faz com a produção de eucaliptos apresente um rendimento em termos de quantidade e qualidade incomparável com a técnica utilizada nos jardins clonais.
Descrição dos Meios Nutritivos para Cultura em Biorreator de Acordo com a Invenção Durante todo o processo de crescimento e desenvolvimento das plantas no biorreator, podem ser utilizados dois meios básicos de cultura, conforme quadro a seguir. Estes meios são modificados quimicamente de acordo com a presente invenção para atender clones específicos, conforme a necessidade e fase fisiológica da cultura. Os meios são suplementados com fitorreguladores do crescimento, visando promover a multiplicação de gemas, alongamento dos brotos e pré-indução do enraizamento ex vitro das microestacas .
Os tipos de concentrações dos fitoreguladores, assim como seu manejo de utilização no processo do biorreator são os aqueles comumente empregados na técnica,, com a devida adaptação para o cultivo da espécie que se deseja propagar, incluindo preferencialmente a espécie arbórea e mais preferencialmente o eucalipto.
Quadro 1: Meio nutriente liquido do tipo JADS (ver Correia, D. 1993. "Crescimento e desenvolvimento de gemas na multiplicação de Eucalyptus in vitro em meio de cultura liquido e sólido". Dissertação de Mestrado em Ciências Florestais, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba)
JADS
Tipo Reagente Formulação Concentração (mg/L)
Nitrato de amónio NH4NO3 1650
Nitrato de potássio KNO3 809
Fosfato de potássio monobásico KHzP04 408
Sulfato de magnésio heptahidratado MgS04.7H20 739,6
Nitrato de cálcio tetrahidratado Ca(N03)2.4H20 1181
Sulfato ferroso heptahidratado FeS04.7H20 55,6
Inorgânicos EDTA dissódico NA2EDTA 74,6
Sulfato de manganês hidratado MnS04.H20 17
Sulfato de zinco heptahidratado ZnS04.7H20 4,32 olibdato dihidratado Na2Mo0 .2H20 0,15
Sulfato cúprico pentahidratado CuS04.5H20 1,25
Cloreto de cobalto hexahidratado CoCI2.6H20 0,25
Ácido bórico H3B03 3,1
Ácido nicotínico 0,5
Pirodoxina 0,5
Tiamina 5
Meso Inositol 100
Orgânicos
Glutamina 146
Arginina 7
Cisteína 5
Pantotenato de Cálcio 2,4 Quadro 2: Meio nutriente liquido do tipo MS (ver Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised médium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497
Figure imgf000015_0001
Plantio de Microestacas em Plugs Biodegradáveis
Como mostrado na Figura 1, os brotos alongados são transferidos do laboratório para um ambiente controlado, conhecido pela denominação de Estufim, onde serão realizados os estágios de Enraizamento e Aclimatização. Para isso, os brotos são separados e os indivíduos são colocados, cada um, em recipiente contendo meio sólido, sendo esses recipientes colocados em bandejas ou prateleiras. São diversos os tipos de recipientes específicos para o enraizamento de mudas clonais podendo ser citados os tipos abaixo. Recipientes e Bandejas de Plantio:
Ellepot EP: Tubete degradável produzido pela empresa dinamarquesa Ellegaard®, compreendendo: membrana branca de celulose ou poliéster e furos, tendo forma cilíndrica; Capacidades: 85 cm3 e 110 cm3; Dimensões:
30 x 100 mm e 40 x 100 mm.
Jiffy Pellet: Tubete biodegradável produzido pela empresa norueguesa Jiffy®, compreendendo pastilha expansível com fibra de coco e turfa de sphagnum, de forma cilíndrica; Capacidades 85 cm3 e 100 cm3; Dimensões: 30 x 100 mm e 36 x 100 mm.
Pastilhas Expansíveis tipo Care-Free® Peat Pellet:
Dimensões: 30x100 e 36x100, de uma combinação de Turfa de Sphagnum desidratada e prensada, Perlita e Aditivos Minerais, revestidos por uma membrana permeável e
Biodegradável de PLA, produzidos pela filial canadense da empresa norueguesa Jiffy®.
Bandeja Air-Tray©117 : destinada a servir de suporte dos Jiffy-Pellets CareFree© 30x100 mm, com 390 x 590 mm (2.301 cm2), com 117 células, e com área média de 19,6 cm2/célula, para a bandeja com 100% de ocupação {tratamento T-l) .
Bandeja Air-Tray®64: destinada a servir de suporte dos Jiffy-Pellets CareFree® 36x100 mm, com 380 x 380 mm (1.444 cm2), com 64 células, e com área média de 22,5 cm2/célula, para a bandeja com 100% de ocupação (tratamento T-2) .
Após a devida alocação dos pellets nas bandejas, estas devem ser colocadas com sua parte inferior (base) em contato com uma lâmina rasa de água pura, de modo a que os pellets dentro das bandejas não sejam encobertos (ou flutuem) na água. Este é o processo de expansão dos pellets, que neste caso se "reidratam" por capilaridade. É importante ressaltar que a base dos pellets deve ser mantida em contato com esta lâmina de água, até total expansão dos mesmos. Caso a lâmina de água se reduza (devido à absorção pelos pellets), ela deve ser reposta. Não deve haver preocupação com "excesso de água". Esta operação dura poucos minutos. Caso se queira acelerar o processo de expansão, pode-se lançar mão de água aquecida a aproximadamente 45°C. Neste caso, é essencial efetuar a expansão dos pellets com alguns minutos de antecedência, de modo que a sua temperatura se aproxime da temperatura ambiente, antes de serem levados para receber as microestacas .
Técnica de Aclimatização de Plântulas de Eucalipto ■ Micropropagadas
Em geral, em uma população de plantas micropropagadas de eucalipto, é provável que uma pequena subpopulação apresente anormalidades anatómicas, morfológicas e fisiológicas, em função de desequilíbrios das condições no interior dos biorreatores e outros frascos na micropropagação. Todas estas alterações associadas a condições não adequadas para os processos de enraizamento das microestacas e subsequente aclimatização das plântulas, consequentemente, reduzem as taxas de sobrevivência e qualidade das mudas. A aplicação de técnicas de aclimatização visa proporcionar maior graduação na transição entre o ambiente in vitro (biorreator) e o externo (viveiro) . Dentre estas técnicas, destacam-se a utilização dos sistemas de mist e fog, que contribuem para manter o turgor vegetal e diminuir a demanda evaporativa. O sombreamento auxilia na redução dos elevados níveis de luminosidade do ambiente externo e, também, contribui para reduzir a temperatura e o estresse das plantas em aclimatização. Alternativamente, outros produtos e ambientes protegidos são utilizados no plantio das microestacas produzidas em biorreatores . Dentre os produtos, são utilizados substratos estabilizados por polímeros para plantio em recipientes biodegradáveis de fibra de madeira, fibra de coco e turfa de Sphagnum. Estes recipientes funcionam como pastilhas prensadas e expansíveis quando hidratadas .
Sistema de cultivo com fog em estufim
Este sistema utiliza a geração de uma névoa de gotículas de agua extremamente pequenas, com diâmetro igual ou menor que 15 μπι, que são nebulizadas dentro do ambiente do estufim através de bicos específicos ou nebulizador ultrassônico, que gera um fog ultrafino (< 5 μιη) e seco. Estas gotículas são tão pequenas que permanecem em suspensão no ar até evaporar, contribuindo para o aumento da umidade e redução da temperatura e, ao mesmo tempo, evitando o molhamento foliar. Estas gotículas de água em suspensão são capazes de manter um finíssimo filme de vapor d' água em ambas as faces foliares, o que mantém as mudas túrgidas e com temperatura controlada.
O sistema de fog é utilizado em conjunto com a estrutura de estufim, preferencialmente uma estrutura desenvolvida especificamente para o enraizamento e aclimatização do eucalipto. O estufim consiste da montagem de mini-estufa ou sobre-túneis dentro de uma estufa normal, mantidos suspensos em mesas roliças. Durante o crescimento e desenvolvimento das mudas no estufim, é utilizado o sistema de irrigação de sub-superficie [ floating) , que propicia imersões temporárias da base dos plugs biodegradáveis em água ou solução nutritiva, visando suprir os nutrientes para plantas sem molhamento da parte aérea das mudas. Técnica de Transplantio de Microestacas em Plugs Biodegradáveis
O sistema de plantio das microestacas produzidas no biorreator em recipientes biodegradáveis consiste em selecionar as microestacas de padrão de qualidade satisfatórias e inserir a base das microestacas em sacolas ou pastilhas prensadas previamente hidratadas (plugs) , como acima descritas.
• Estágio de Reidratação e Expansão do Jiffy:
— Após colocação das pastilhas nas bandejas, estas deverão ser posicionadas com sua parte inferior (base) em contato com uma lâmina rasa de água pura, à temperatura ambiente, de modo que os Pellets dentro ■das bandejas não sejam encobertos (ou flutuem) na água, até sua total expansão, antes do plantio das microestacas .
— A reidratação das pastilhas é feita apenas por capilaridade e não por submersão das mesmas na água. É importante ressaltar que a base dos Pellets deve ser mantida em contato com a lâmina de água, até a total expansão dos mesmos. Caso a lâmina de água se reduza (devido absorção pelos Pellets), ela deve ser reposta. Não deve haver preocupação com excesso de água. Esta operação dura poucos minutos.
— Caso se queira acelerar o processo de expansão, pode- ' se lançar mão de água aquecida a aproximadamente 45 °C.
Neste caso, é essencial efetuar a expansão dos pellets com alguns minutos de antecedência, de modo que sua temperatura se aproxime da temperatura ambiente, antes de serem levados para receber as microestacas durante o plantio.
A titulo de exemplo não-limitativo, são fornecidas algumas informações sobre as técnicas disponíveis para realização do plantio das microestacas produzidas no biorreator .
• Especificações Técnicas dos Plugs e Bandejas (PLA Net = resina biodegradável de amido de milho)
Produto Objetivo
Jiffy-7 Care Free Horticulture Peat Plantio direto da microestaca para Plug, 30 x 100 mm, 6 mm indent, produção de mudas para plantio no PLA net campo
Jiffy-7 Care Free Horticulture Peat Plantio direto da microestaca para Plug, 30 x 80 mm, 6 mm indent, PLA produção de mudas para plantio no net campo
Jiffy-7 Forestry Peat Pellet, 18 x 25 Plantio direto da microestaca em mini- mm, 9 mm indent, PLA net plug para produção de mudas para plantio em jardim clonal
Jiffy-7 Forestry Peat Pe!let, 18 x 32 Plantio direto da microestaca em mini- mm, 9 mm indent, PLA net plug para produção de mudas para plantio em jardim clonal
Jiffy-7 Horticulture Peat Pellet, 36 x Transplantio da muda enraizada no mini- 75 mm, TP 40 mm, PLA net plug 18x25 para o plug 36x75 e plantio no campo
Jiffy-7 Horticuíture Peat Pellet, 36 x Transplantio da muda enraizada no mini- 75 mm, TP 25 mm, PLA net plug 18x25 para o plug 36x75 e plantio no campo
New ini-18 mm thermo form tray Bandejas para suporte dos mini-plugs e para J7 pellet 18x32; tray size 33 x crescimento das mudas.
45 x 4 cm
• Manejo de Espaçamento de Mudas nas Bandejas:
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• Manejo de Irrigação:
■— A aplicação de lâmina de água de irrigação deverá ser ajustada para atingir a capacidade de campo de cada substrato, principalmente, nas fases de Enraizamento <CV) e Aclimatação (CA) , onde o Ellepot e Jiffy não devem ficar saturados de água. — Na casa de vegetação, o manejo da irrigação deve contemplar um turno de rega de curta duração e intervalos entre irrigações, por exemplo, 6 segundos de duração a cada 10 a 15 minutos entre irrigações, visando aumentar o teor da umidade relativa do ar sem que ocorra a irrigação do substrato.
— Na casa de aclimatação, o manejo da irrigação deve permitir o completo umedecimento do substrato do Ellepot e Jiffy, sem causar excesso e saturação dos mesmos. 0 sombreamento, por exemplo, com tela do tipo sombrite, deve permanecer estendido apenas nas horas mais quentes do dia, por exemplo, das 11 às 14 horas.
— Nas fases de Crescimento (PC) e Rustificação (PR), ao contrário, o Ellepot e o Jiffy devem ficar quase que saturados, por haver necessidade de uma lâmina maior de água para compensar perdas por evaporação a partir do recipiente, absorção radicular e transpiração foliar.
— No pátio de crescimento e rustificação, adicionalmente, recomenda-se fazer a irrigação dos Ellepot e Jiffy com barra de . irrigação ou chuveiro até o molhamento uniforme de todo o substrato. Monitoramento da Umidade do Substrato:
— Durante os processos de enraizamento e crescimento das mudas no recipiente Ellepot e Jiffy, há necessidade de monitoramento do teor de umidade no substrato, visando recomendar o turno de irrigação (duração e intervalos) para que a umidade do substrato permaneça dentro da faixa ideal de capacidade de campo.
Estas medições instantâneas e em tempo real da umidade do substrato devem ser realizadas por meio do medidor portátil de umidade+condutividade+ temperatura, por exemplo, o de marca Delta-T, modelo WET Sensor. Este equipamento deve ser previamente calibrado no laboratório para o substrato que está sendo utilizado no teste.
0 sensor de umidade deve ser inserido em pelo menos duas posições (profundidades) dentro do Ellepot e Jiffy, pois apenas a ponta do sensor é capaz de registrar os valores com precisão na região da rizosfera. Na CV, esta posição deve ser superficial (2-3 cm) , na CA esta posição deve ser mediana (3-6 cm) e no PC a posição deve ser final (7-9 cm) .
Entre uma medição e outra é necessário aguardar um período de tempo (10-15 segundos) para a estabilização do sensor no substrato úmido. Em um mesmo Ellepot ou Jiffy, deve ser processada a Ia medição em um ponto de menor umidade, e a 2 a medição em um ponto de maior umidade.
Recomendam-se as seguintes faixas de umidade para o substrato utilizado no teste, medido . com Sensor a Úmido, conforme quadro a seguir: Umidade substrato Umidade ecprec Umidade Eltepot e Jiffy Observação
(%, v/v) (% v/v)
Saturado > 40 % < 50 % Excesso elevado água.
Semi-saturado 21 a 40 % 40 a 50 % Excesso moderado água.
Adequado 16 a 20 % 25 a 39 % Condição ideal umidade.
Semi-seco 10 a 15 % 15 a 24 % Deficiência moderada água.
Seco < 10 % < 15 % Deficiência alta água.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Obtenção de mudas clonais de eucalipto
O processo da invenção, aplicado à obtenção de mudas clonais de eucalipto em biorreator pela técnica de imersão temporária, compreende as seguintes etapas:
Etapa 1 - 0 material vegetal permanece em repouso durante o intervalo entre as imersões da cultura vegetal no meio e trocas gasosas da atmosfera do compartimento interno do biorreator. O meio fica armazenado no recipiente externo (inferior) e os explantes no compartimento interno (superior) . A radiação fotossintética ativa do biorreator é feita por meio de luminárias tubulares com lâmpadas Led nas cores azul, vermelha e branca.
Etapa 2 - A válvula solenóide, é acionada por um temporizador em intervalo de tempo e duração pré- estabelecidos . Isso permite a entrada de ar comprimido no recipiente externo, aumentando a pressão no compartimento externo (inferior), fazendo com o meio de cultura liquido seja transferido até o compartimento interno (superior) das plantas, passando por canais de ligação entre os recipientes, e que entre em contato com a base das culturas vegetais. O manejo de imersão temporária varia conforme o tipo de clone de eucalipto e também com a fase da cultura. Na fase de multiplicação de brotos, utiliza-se 2-3 horas de intervalo entre imersões temporárias e imersões com duração entre 1-2 minutos. Na fase de alongamento de brotos, utiliza-se 4-5 horas de intervalo entre imersões temporárias e imersões com duração entre 20-30 segundos. Etapa 3 - Após o período de imersão, a válvula solenóide é desativada e o meio retorna para o compartimento externo através dos drenos, pela força da gravidade. Nesta etapa, ocorre a troca com a injeção de ar comprimido no recipiente interno, onde o material vegetal fica alocado. Esta troca gasosa (ar e gás carbónico) é acionada por uma válvula solenóide controlada por temporizador.
Etapa 4 - A troca gasosa acontece com a injeção de concentrações específicas de C02 no recipiente interno, com vazão de 1,3 litros por minuto, fluxo de 500 μιηοΐ C02 por segundo, na concentração de 800 a 1.000 μπιοΐ C02 por mol de ar, onde cresce o material vegetal, visando aumentar a capacidade fotossintética e produtiva das culturas. Esta troca gasosa também é acionada por uma válvula solenóide controlada por temporizador.
Radiação REA - Durante todo o ciclo de produção utiliza-se a radiação fotossinteticamente ativa (RFA) , que corresponde ao intervalo de 400 a 700 ' nm, para o crescimento e desenvolvimento da cultura. Neste caso, utiliza-se luminárias elétricas com díodos emissores de luz (LED), ao invés das tradicionais lâmpadas fluorescentes empregadas nas biofábricas. A -¾ss pnli3anntt3as0 abκsorvem principalmente os espectros na faixa do vermelho (600-700 nm) e do azul (400-500 nm) , portanto, o manejo de iluminação é controlado para fornecer uma relação de 3/ 1 (vermelho/azul) a 2/ 1 (vermelho/azul) , respectivamente para multiplicação e alongamento. A intensidade de RFA também varia conforme o estágio fisiológico da cultura. Normalmente, na fase de multiplicação utiliza-se 20-30 pmol/m2/s e na fase de alongamento 40-60 pmol/m2/s.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na presente descrição são indicativos do nivel daqueles especialistas na técnica ao qual o presente modelo de utilidade se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados a titulo de referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou cada pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a titulo de referência.
Apesar de certas concretizações terem sido descritas, elas foram apresentadas como um modo exemplificativo somente, e não há intenção de limitar o escopo do presente modelo de utilidade. As reivindicações que acompanham esta descrição e suas equivalentes são consideradas como cobrindo tais formas ou modificações na medida em que elas podem estar dentro do escopo e espirito do presente modelo de utilidade.

Claims

REIVINDICAÇÃO
1. Processo para raicropropagação in vitro de material de planta compreendendo as etapas de multiplicação e alongamento dos brotos desenvolvidos a partir de propágulos de planta pelo método de imersão temporária, sendo que:
(a) na etapa de multiplicação dos brotos, o material a ser propagado é colocado sobre suporte adequado em um primeiro recipiente (recipiente de propagação vegetativa} e é submetido a manejo de imersão temporária em meio nutriente líquido, proveniente de um segundo recipiente (recipiente de armazenamento do meio líquido) , dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso;
(b) na etapa de alongamento dos brotos, o material em propagação é submetido a manejo de imersão temporária, preferivelmente empregando o mesmo meio nutriente da etapa {a}, ,,dito manejo compreendendo períodos alternados de imersão e de descanso,
dito processo sendo caracterizado pelo fato de que, na dita etapa (b) (de alongamento) , os ditos períodos de imersão são significativamente mais curtos e os ditos períodos de descanso são mais longos em comparação com os períodos de imersão e de descanso, respectivamente, na etapa (a) (de multiplicação) .
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito material de planta é de planta arbórea .
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que dita planta arbórea é uma espécie de eucalipto.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (a) , dito período de imersão é de pelo menos 1 minuto e dito período de descanso é de pelo menos 2 horas.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que dito período de imersão é de no máximo 3 minutos e dito período de descanso é de no máximo 4 horas.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que dito período de imersão é de 1 a 2 minutos e dito período de descanso é de 2 a 3 horas.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (b) , dito período de imersão é de pelo menos 20 segundos e dito período de descanso é de pelo menos 4 horas.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito período de imersão é de no máximo 60 segundos e dito período de descanso é de no máximo 6 horas
9. Processo de acordo com qualquer uma das' reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que dito período de imersão é de 20 a 30 segundos e dito período de descanso é de 4 a 5 horas.
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a micropropagação ín vitro do material de planta é realizado em biorreator do tipo BIT.
11. Processo para a produção, em larga escala e alto volume, de mudas clonais de plantas prontas para o desenvolvimento em campo, dito processo sendo caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) realizar a propagação vegetativa de material de planta por processo como definido nas reivindicações 1 a 10; (ii) permitir o enraizamento e aclimatização dos brotos alongados obtidos na etapa (i) em recipientes e condições apropriadas para manter o turgor vegetal e diminuir a demanda evaporativa; e
(iii) possibilitar o crescimento e aclimatação das microestacas obtidas na etapa (ii) até tamanho de mudas clonais adequadas à transferência para o campo.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) é realizada em ambiente úmido, no qual as goticulas de vapor de água são tão pequenas que permanecem em suspensão no ar até evaporar e simultaneamente é evitado o molhamento foliar.
PCT/BR2014/000391 2013-10-30 2014-10-30 Processo para micropropagação in vitro de material de planta e processo para a produção, em larga escala e alto volume, de mudas clonais de plantas prontas para o desenvolvimento em campo WO2015061871A1 (pt)

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WATT.: "The status of temporary immersion system (TIS) technology for plant micropropagation.", AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 11, no. 76, 2012, pages 14025 - 14035, XP055338606 *

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