WO2015025825A1 - インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法 - Google Patents

インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法 Download PDF

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WO2015025825A1
WO2015025825A1 PCT/JP2014/071591 JP2014071591W WO2015025825A1 WO 2015025825 A1 WO2015025825 A1 WO 2015025825A1 JP 2014071591 W JP2014071591 W JP 2014071591W WO 2015025825 A1 WO2015025825 A1 WO 2015025825A1
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virus
influenza
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良和 黒澤
信子 大島
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学校法人藤田学園
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    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • An object of the present invention is to provide an effective means for pandemic countermeasures for influenza viruses in order to overcome the above-described present situation.
  • Influenza A virus is divided into two groups depending on the type of HA molecule: H2, H5, H1, H6 (above, H1 cluster; H1a), H13, H16 and H11 (above, H1 cluster; H1b) , H8, H12, H9 (above, H9 cluster), H4, H14, H3 (above, H3 cluster), H15, H7, and H10 (above, H7 cluster).
  • the method of the present invention covers these influenza A viruses comprehensively. However, in one aspect, it is selected from the group consisting of H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 and H9N1.
  • the VH1-69 gene can form an antigen-binding site without a VL domain, and can produce antibodies that exhibit a wide range of neutralizing activities.
  • the “antibody using the VH1-69 gene” is an antibody having a VH region in which the VH1-69 gene, which is a Germline gene, is used.
  • the VH1-69 gene encodes FR1, CDR1, FR2, CDR2 and FR3 constituting the VH region. Therefore, in the “antibody using the VH1-69 gene”, high homology (commonality) is recognized in the amino acid sequences of FR1 to FR3.
  • the amino acid at position 53 and the amino acid at position 54 are characteristic, and this characteristic is considered to be important for the physiological function of the “antibody using the VH1-69 gene”.
  • the amino acid residue at position 53 is usually a hydrophobic amino acid (isoleucine, methionine, leucine, valine, etc.), and the amino acid residue at position 54 is also a hydrophobic amino acid (phenylalanine, leucine, etc.) ).
  • the amino acid at position 53 of the antibody using the VH1-69 gene is isoleucine and the amino acid at position 54 is phenylalanine.
  • the sequence of the VH1-69 gene (encoding FR1 to FR3) is shown in SEQ ID NO: 127.
  • the amino acid sequence (FR1 to FR3) encoded by the VH1-69 gene is shown in SEQ ID NO: 128.
  • the subject is not particularly limited, and humans of all ages can be subjects.
  • the biological sample is not particularly limited, but a biological sample capable of detecting an antibody is used.
  • biological samples are blood, plasma, serum, nasal discharge and saliva.
  • a blood sample is used for reasons such as ease of preparation and low invasiveness.
  • serum or plasma is particularly preferable to employ as a sample.
  • the preparation of a biological sample may follow a conventional method.
  • steps (1) to (3) are typically performed.
  • a step of contacting a biological sample of a subject after influenza vaccination with an anti-idiotype antibody that recognizes an antibody using the VH1-69 gene (2)
  • a step of detecting a generated immune complex (3) Determining the strength of resistance to influenza A virus based on the detection result of step (2), wherein the amount of detected immune complex is an indicator of the strength of resistance to influenza A virus; Step to be
  • step (1) a prepared biological sample of a subject after vaccination with influenza is brought into contact with an anti-idiotype antibody that recognizes an antibody using the VH1-69 gene.
  • Step (1) is an antigen-antibody reaction in vitro, and if an antibody using the VH1-69 gene is present in a biological sample, an immune complex is formed with the anti-idiotype antibody.
  • H1N1 influenza for example, A / California / 7 / 2009pdm strain, A / Suita / 1 / 2009pdm strain, A / NewoniaCaledonia / 20/1999 strain, A / Solomon Islands / 3/2006 strain, A / Brisbane / 59 / 2007 (Bri07) strain
  • H3N2 influenza eg A / Panama / 2007/1999 strain
  • H5N1 influenza eg A / Indonesia / 5/2005 / PR8-IBCDC-RG2 strain inactivated vaccine or live vaccine Can be used.
  • Biological samples after multiple vaccinations may be used, and in such a case, biological samples collected at 5 to 3 weeks after the final vaccination are usually used. .
  • an anti-idiotype antibody that recognizes an antibody using the VH1-69 gene is used as a detection antibody.
  • An anti-idiotype antibody is an antibody that specifically recognizes the hypervariable region (CDR) of an antibody, and an antibody specific for an antibody using the VH1-69 gene is used in the present invention.
  • an antibody using the VH1-69 gene is characterized by an amino acid at position 53 (typically isoleucine) and an amino acid at position 54 (typically phenylalanine). Therefore, an anti-idiotype antibody that specifically recognizes the region containing these amino acids may be used.
  • the anti-idiotype antibody is added to the biological sample, or the biological sample is added to a member (for example, a well) on which the anti-idiotype antibody is immobilized. It is done by things. What is necessary is just to set suitably the specific aspect of contact, contact conditions, etc. according to the measuring method to employ
  • an enzyme-labeled antibody is used, and an immune complex is detected using color development or luminescence based on an enzyme reaction as a signal.
  • an enzyme-labeled antibody is used, and an immune complex is detected using color development or luminescence based on an enzyme reaction as a signal.
  • a competitive method may be used.
  • step (3) the strength of resistance against influenza A virus is determined based on the detection result in step (2).
  • the amount of the detected immune complex is used as an index of the strength of resistance against influenza A virus.
  • the strength of resistance to influenza A virus is determined based on the amount of immune complex detected.
  • the determination here can be automatically / mechanically performed without depending on the determination of a person having specialized knowledge such as a doctor or a laboratory technician, as is apparent from the determination criteria. Examples of specific determination criteria are shown below. ⁇ Example of criteria> (a) If immune complexes are detected, they are resistant to influenza A virus (b) If immune complexes are detected, they are highly resistant to influenza A virus (c) The amount of immune complexes is large Strong resistance to influenza A virus
  • the strength of the resistance is preset for each range of detection values, and the resistance is determined from the detection values.
  • Measured value ⁇ a no resistance a
  • ⁇ measured value ⁇ b weak resistance b
  • ⁇ measured value ⁇ c resistant but not sufficient c
  • ⁇ measured value strong resistance
  • the number of classifications can be set arbitrarily. Examples of the number of sections are 2 to 7, preferably 3 to 6.
  • step (4) useful information can be obtained although it is auxiliary. Moreover, when it determines by step (4), a subject can be classified into the following 4 groups typically.
  • Group (a) Basically no measures are required.
  • the second aspect of the present invention relates to a kit used in the determination method of the present invention.
  • the kit of the present invention includes an anti-idiotype antibody that specifically recognizes an antibody using the VH1-69 gene as a main component in order to detect or capture an antibody using the VH1-69 gene.
  • the anti-idiotype antibody is labeled as necessary to suit the application.
  • labeling substances that can be used for labeling antibodies include fluorescent dyes such as fluorescein, rhodamine, Texas red, oregon green, horseradish peroxidase, microperoxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, and other enzymes, luminol, acridine dye And chemical or bioluminescent compounds such as 32 P, 131 I, 125 I and the like, and biotin.
  • a labeled secondary antibody that recognizes the anti-idiotype antibody can also be included in the kit.
  • an anti-idiotype antibody which is usually an unlabeled anti-idiotype, may be immobilized.
  • the insoluble support used for the solid phase is not particularly limited.
  • a resin such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, or an insoluble support made of a water-insoluble substance such as glass can be used.
  • the antibody can be supported on the insoluble support by physical adsorption or chemical adsorption.
  • kits Other reagents (buffer solution, solvent, blocking reagent, enzyme substrate, coloring reagent, etc.) and / or apparatus or instrument (container, reaction apparatus, fluorescent reader, etc.) used in carrying out the determination method of the present invention It may be included in the kit. Moreover, you may include the influenza strain used for preparation of a control, a calibration curve, etc. in a kit. Usually, an instruction manual is attached to the kit of the present invention.
  • buffer solution solvent, blocking reagent, enzyme substrate, coloring reagent, etc.
  • apparatus or instrument container, reaction apparatus, fluorescent reader, etc.
  • a / H1N1pdm A / California / 7 / 2009pdm (Cal09), A / Suita / 1 / 2009pdm (Sui09);
  • a / H1N1 A / New Caledonia / 20/1999 (NC99), A / Solomon Islands / 3/2006 (SI06), A / Brisbane / 59/2007 (Bri07).
  • a / H3N2 A / Panama / 2007/1999.
  • a / H5N1 A / Indonesia / 5/2005 / PR8-IBCDC-RG2.
  • a phage antibody library was constructed according to a previously reported method (reference document 8). Briefly, monocytes (amount corresponding to 3 L of blood) were collected by apheresis from a donor born in 1947 before and after vaccination. The recovered monocytes contained 8.0 x 10 8 (before vaccination) or 1.2 x 10 9 (after vaccination) B lymphocytes. A huge combinatorial antibody library was constructed according to a previously reported phage display method (Reference 17).
  • Library size is 1.6 x 10 9 clones for H chain, 2.0 x 10 9 clones for L chain, 1.4 x 10 10 Fab for vaccination, 3.2 x 10 9 clones for H chain after vaccination, and L chain There were 1.3 x 10 9 clones and Fab was 2.6 x 10 10 clones.
  • Fab-cp3-type antibody is secreted into the medium (Reference Document 19).
  • the culture supernatant containing Fab-cp3 molecules was subjected to ELISA using H1N1 virus (virus strain used for screening) and H3H2 virus as antigens. Clones that bind only to H1 were selected and used for further analysis.
  • ELISA Formalin-treated virus particles were coated on 96-well Maxisorp immunoplate (Nunc), and Fab-cp3 antibody contained in the culture supernatant of E. coli was added to each well. After incubation with a rabbit anti-cp3 antibody (Medical and Biological Laboratories), peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L chain; Medical and Biological Laboratories) was added to the well and further incubated. Thereafter, HRP substrate (OPD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well to cause color development. After the peroxidase reaction was stopped by the addition of H 2 SO 4 , the absorbance at 492 nm was measured.
  • HRP substrate OPD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • VN single cycle method
  • M-VN multicycle method
  • MEM containing 0.4% BSA, 5 ⁇ g / ml acetylated trypsin, 0.5% methylcellulose equivalent to the mixture was added to the cells and incubated at 37 ° C. for 28 hours. Cultured. Subsequently, the cells were fixed with ethanol and stained with PAP (peroxidase and anti-peroxidase) complex. The number of foci containing one or more cells per focus (in the case of VN method) or foci containing four or more cells (in the case of M-VN method) was counted. The results were expressed as the reciprocal of the dilution ratio of the serum, which is expressed as a focus reduction rate (%) for the Fab-pp type antibody and 50% focus reduction rate for the serum.
  • Hemagglutinin aggregation inhibition assay The HI test was performed according to a previously reported method (Reference Document 20). In brief, 160 ⁇ g / ml purified Fab-pp type antibody or donor serum (diluted with PBS) serially diluted was prepared. Serially diluted Fab-pp antibodies or serum were preincubated with 4 HA units of virus per well. 0.75% guinea pig red blood cells diluted in PBS were added to each well and incubated at room temperature for 30-60 minutes. The results were expressed as the minimum concentration of Fab-pp antibody that inhibited hemagglutinin aggregation ( ⁇ g / ml) or the reciprocal of the maximum dilution of serum.
  • Fab-pp type antibody or C179 as an antibody for detecting the binding activity to the virus strain and Fab-cp3 type antibody as a competitor.
  • Fab-cp3 molecules in the culture supernatant were concentrated 20 times.
  • Formalin inactivated virus particles were coated on 96-well Maxisorp immunoplate.
  • Fab-pp type antibody (total amount 50 ⁇ l) adjusted to the optimum concentration was mixed with 50 ⁇ l of 20-fold concentrated Fab-cp3 type antibody and added to virus-coated wells.
  • peroxidase-conjugated rabbit anti-streptavidin antibody was added to each well as a secondary antibody.
  • peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG H + L chain; MBL
  • HRP substrate OPD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • An antibody that binds to an antibody that uses multiple VH1-69 genes but does not bind to an antibody that does not use the VH1-69 gene was selected. Isolation of the K1-18 antibody was performed by Monoclonal Antibody Research Institute (Sapporo, Japan).
  • Virus neutralization activity of serum in the presence of K1-18 antibody was modified and used.
  • serum treated with RDE was diluted in serum-free medium (1:10 or 1:20 dilution) and mixed with an equal volume of K1-18 antibody (800 or 1,600 ⁇ g / ml). After incubation, it was diluted 2-fold, mixed with an equal amount of influenza virus (100 FFU), and added to MDCK cells prepared in a 96-well plate. After incubation, the cells were fixed with ethanol and stained with PAP (peroxidase and anti-peroxidase) complex. The reciprocal of the dilution ratio of serum that showed a 50% focus reduction rate was defined as virus neutralization activity.
  • PAP peroxidase and anti-peroxidase
  • clones 120 clones were isolated after panning twice or three times, and further analysis of clones binding to the H1N1 strain used for screening was performed. Clones that bind to both H1N1 and H3N2 strains with the same strength are likely to be anti-NP antibodies, and were excluded from the analysis (Reference 8). Among 240 clones isolated in each screening, clones judged to be anti-HA antibodies were as follows.
  • Screening 1 (Screening library prepared from B lymphocytes after vaccination with pandemic strain), 105 clones; Screening 2 (Library prepared from B lymphocytes before vaccination screening with pandemic strain), 3 clones; Screening 3 (library prepared from B lymphocytes after vaccination was screened with seasonal strains), 58 clones; Screening 1 (library prepared from B lymphocytes before vaccination was screened with seasonal strains), 16 clone.
  • 182 clones consisted of 96 types of monoclonal antibodies. Furthermore, 96 types could be classified into 63 groups based on amino acid sequence similarity, especially in the CDR3 region. The amino acid sequence of VH is shown in FIG.
  • the 63 group representative clones were measured for HA binding activity, hemagglutination inhibition reaction, and virus neutralization activity (Reference 9). As shown in FIG. 1, all of these clones were classified into two types without exception. A clone belonging to type 1 binds to pandemic H1N1 strain, but does not show binding activity to seasonal H1N1 strain. All clones show HI activity and only clones isolated from Screen 1 belong. Type 2 binds not only to pandemic H1N1 strains but also to all seasonal H1N1 strains. There is no HI activity and most clones neutralize not only the H1N1 strain but also the H5N1 strain virus.
  • type 1 and 7 clones are type 2. Since type 2 clones bind not only to seasonal strains but also to pandemic virus hyaluronan, this small number of isolates is the number of cells that make type 2 antibodies in the blood make type 1 antibodies. It means much less than the number of cells.
  • 98 clones were isolated and could be classified into 31 groups. Of the 31 groups, 19 groups had only 1 clone isolated, and 7 groups had 2 clones isolated.
  • 85 clones were isolated for type 2 antibodies and could be classified into 32 groups. Of the 32 groups, only 1 clone is isolated in 14 groups, and 2 clones are isolated in 8 groups. Given the Poisson distribution, there may still be clones that could not be isolated by this screening. However, we believe that we have not overlooked clones with characteristics that are very different from the clones shown in FIG.
  • F082-317 has very low HI activity (titer: 160 ⁇ g / ml).
  • F082-254 binds not only to pandemic viruses but also seasonal viruses and neutralizes both virus strains. Furthermore, it shows a high mutation rate (18%).
  • F082-317 has a high binding activity to HA but a relatively low neutralizing activity.
  • the sialic acid binding pocket on HA and its surrounding region have a very strong influence in terms of immunogenicity, and B cells that have been newly induced to proliferate by vaccination are substantially free from proliferation. It was concluded that all produced antibodies that recognize these regions. It is also believed that when a purified product of a virus that has been treated with formalin and not live is inoculated as a vaccine, a sufficient amount of B cells that produce antibodies that bind to HA but do not neutralize the virus are not induced. This suggests that epitopes that are not involved in neutralization on HA do not have a significant impact on immunogenicity, even if they are present.
  • type 2 clones are axons in the vicinity of the hyaluronan membrane in the same or similar manner as other antibodies using VH1-69 genes such as CR6261 and F10 already reported by other groups ( stem) (references 12 and 13).
  • FIG. 3 shows that four clones F081-268, F082-243, F082-237, and F083-373 have lower inhibitory activity than other clones.
  • the data shown in FIG. 1 indicates that F081-268 has strong HA binding activity but weak neutralization activity.
  • the other 3 clones have relatively weak binding and neutralizing activities.
  • the epitope recognized by the type 2 antibody is not exactly the same as the epitope recognized by C179, none of the clones have an epitope that is completely different from the epitope of C179. This suggests that this epitope is shared between group 1 viruses and remains stable. Even if the immunogenicity of this epitope is weak, once a human acquires a B cell that produces an antibody that recognizes this epitope, the B cell remains in the body as a memory cell for a long period of time. Will play a major role. Interestingly, F083-115 uses the VH1-69 gene, but can also neutralize the H3 virus.
  • 8484 clones isolated as type 2 antibodies are composed of 49 types of clones and can be classified into 32 groups. Each group is considered to be a group of antibodies made independently from mature B cells when the B cells are differentiated, but some of the clones classified into different groups in FIG. May be derived from the same B cell. Even so, the list of clones summarized in Figure 1 shows that more than 10 B cells using the VH1-69 gene were created independently in the donor's body, perhaps when the donor was young. Is shown. A clone of 16 anti-HA antibodies that have been isolated from screening 4 (screening prevaccinated libraries with seasonal strains) but bind to seasonal H1N1 viruses but not to pandemic virus strains All were type 2 antibodies.
  • the characteristics of the clones isolated from screening 4 are not affected by the proliferation of type 1 B cells by vaccination. Absent. If sufficient levels of B cells producing antibodies that bind to the HA head of seasonal H1N1 virus are present, such a clone should have been isolated.
  • the method used in this study was used in a previous study for repertoire analysis of neutralizing antibodies against H3N2 virus in three blood donors (Refs. 8, 10). The vaccination step was not included and many of the isolated antibodies bound to the HA head (Refs. 10, 14). From these, we concluded that the 1-69 antibody, which neutralizes all group 1 viruses, has played a major role against influenza A group 1 over the long term in the donor's body.
  • HI activity against seasonal H1N1 and H5N1 viruses could not be detected by any serum.
  • HI activity against H1N1 pandemic virus began to appear 2 weeks after the first vaccination.
  • virus neutralization test measured by the general focus reduction method the activity against pandemic H1N1 virus began to increase already 1 week after vaccination and reached a stable state after 2 weeks.
  • virus neutralizing activity was already detected before vaccination and increased one week after vaccination.
  • the H5N1 virus could not be detected by a general focus reduction method (Reference 9), but as described in the method column, it could be detected by a more sensitive method (Reference 15).
  • the neutralizing activity against H5N1 virus is thought to be derived from a series of antibodies originally made against H1N1 and possibly H2N2 in the donor's body. Therefore, the observed difference between seasonal H1N1 and H5N1 viruses may be due to differences in the strength of activity, ie, the activity against seasonal H1N1 virus is several times stronger than against H5N1 virus. It should be noted that neutralizing activity against seasonal viruses is detectable even before vaccination.
  • an antibody that specifically binds to the 1-69 antibody that is, an anti-idiotype antibody was prepared.
  • two hydrophobic amino acids 53th isoleucine and 54th phenylalanine
  • the region containing amino acids would be highly immunogenic in mice.
  • anti-idiotype antibodies are expected to inhibit the binding of 1-69 antibody to HA. did.
  • the IgG amount of 1-69 antibody in serum was measured.
  • the 1-69 antibody was present at a concentration of 4.58 ⁇ g / ml in the serum collected on October 30 before vaccination, but in the serum collected on December 14 after vaccination, The concentration of 1-69 antibody increased to 11.24 ⁇ g / ml.
  • Neutralizing activity against pandemic virus and seasonal virus was measured in the presence of K1-18 antibody.
  • K1-18 clearly inhibited neutralizing activity.
  • Seasonal H1N1 was clearly inhibited but not completely inhibited.
  • the 1-69 antibody is actually present in the serum and functions to neutralize the H1N1 virus.
  • Type 2 bound to the HA of the 1997-2003 strain.
  • the other two types were antibodies that neutralize strains extensively.
  • 1-69 antibodies can be made that can neutralize group 1 viruses extensively in all humans. This is because only the VH1-69 gene can form an antigen-binding site even without the VL domain, making an antibody that exhibits a broad neutralizing activity. The involvement in binding appears to be limited. Further verification is needed to determine whether type 2 antibodies are powerful enough to prevent pandemic infections that are thought to be caused in the future by the pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 virus. The presence of antibody-producing clones as memory cells can help prevent pandemic virus from growing in the body. The treatment of the H5N1 pandemic may be better structured by the individual's immune profile.
  • anti-HA antibodies (1-69 antibodies) that use the VH1-69 gene is a useful indicator to show that antibodies that neutralize influenza viruses are present in the body.
  • anti-idiotypic antibodies against 1-69 antibodies would be useful reagents for detecting antibodies that neutralize influenza viruses broadly.
  • the present invention is useful for pandemic measures against influenza A virus. By utilizing the present invention, it is possible to take a rational and efficient pandemic measure.
  • Sequence number 129 Artificial sequence description: primer T7ETZ

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Abstract

　インフルエンザウイルスのパンデミック対策に有効な手段を提供することを課題とする。被検者由来の生体サンプル中における、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存否を指標として、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力を判定する。

Description

インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法
　本発明は抗体を標的とした検査に関する。詳細には、特定の抗体を指標とした、インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法に関する。本発明はインフルエンザの大流行（パンデミック）対策として有用である。本出願は、２０１３年８月２３日に出願された日本国特許出願第２０１３－１７２９０２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　インフルエンザは毎年、数百万人が感染する呼吸器系の感染症である。インフルエンザに対する防御として抗体が重要な役割を果たすことから、インフルエンザをコントロールする最も効率的な手段としてワクチンが利用されてきた。ヘマグルチニン（HA）はウイルス中和抗体の主要な標的であり、ウイルスの細胞内への進入を２段階で介在する（非特許文献１）。第１段階では、HAは細胞側の受容体、即ちシアル酸に結合する。エンドサイトーシスでウイルスが取り込まれた後、pH低下に伴いHA分子の構造が大きく変化する。これまでの研究によって、中和抗体は以下のいずれかの活性、即ち、HAとシアル酸の結合を阻害する活性（非特許文献２）又はpH低下に伴うHA分子の構造変化を阻害する活性（非特許文献３）を示すことが判明している。前者の活性を示す中和抗体（以下では第１タイプの中和抗体と呼ぶ）はHA分子の球状頭部に位置するシアル酸結合ポケットの近郷に結合する。他方、後者の活性を示す中和抗体はHA分子の軸索部分に結合する。ドミナントな免疫反応は第１タイプの中和抗体が介在すること、及び標的部位が変異しやすいこと（結合活性の喪失を伴わない）から、第１タイプの中和抗体に対して耐性を獲得したウイルスがドミナントになり、毎年の大流行（エピデミック）を引き起こす。歴史的には、有効な中和抗体は全て第１タイプであると考えられてきたため、殆ど毎年、ワクチン用の株を変える必要があった。流行しているウイルスに対応している限りにおいて、このようなワクチンの方法は感染予防に有効である。
　インフルエンザウイルスの感染に対する応答は人によって異なる。例えば、幼少期に数度インフルエンザに感染したものの、その後は感染せず、ワクチンの接種も受けなかった人も多い。２００９年にブタ由来H1N1型インフルエンザウイルス（S-OIV）が流行し、２１世紀で初のパンデミックを引き起こした（非特許文献４）。一般に、新たに出現したインフルエンザウイルスに対してはナイーブであるため、パンデミック発生時には、人は当該ウイルスに対して免疫がないと考えられている。しかしながら、S-OIVの場合、季節性H1N1型ウイルスのみならず、S-OIVに対しても中和活性を示す、長期メモリーB細胞を多くの大人が保有していた（非特許文献５～７）。
Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Ann. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000). Knossow, M. et al. Mechanism of neutralization of onfluenza virus infectivity by antibodies. Virology 302, 294-298 (2002). Okuno, Y., Isegawa, Y., Sasao, F. & Ueda, S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus H1 and H2 strains. J. Virol. 67, 2552-2558 (1993). Fraser, C. et al. Pandemic potential of a strain of influenza A (H1N1): early findings. Science 324, 1557-1561 (2009). Hancock, K. et al. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus. N. Engl. J. Med. 361, 1945-1952 (2009). Wrammert, J. et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011). Li, G.M. et al. Pandemic H1N1 influenza vaccine induces a recall response in humans that favors broadly cross-reactive memory B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 9047-9052 (2012).
　現在、日本では以下のパンデミック対策が講じられている。
　（１）大量の抗インフルエンザウイルス薬（ノイラミニダーゼ阻害剤）の備蓄
　（２）大量のプレパンデミックワクチンの備蓄
　（３）パンデミックワクチンの生産体制の構築
　（１）については、感染・発病過程で抗インフルエンザウイルス薬が有効な時期が限られていること、及び薬剤抵抗性ウイルスの出現の問題がある。（２）についても、実際にパンデミックを起こすウイルスの型（その抗原性）を正確に予測できないという問題がある。（３）については、従来の鶏卵でのウイルスの増殖から培養細胞でのウイルスの増殖に切り替えが進められているものの、ワクチン製造時間の短縮には限度がある。
　本発明は、以上の現状を打開すべく、インフルエンザウイルスのパンデミック対策に有効な手段を提供することを目的とする。
　インフルエンザウイルスに対する中和抗体のレパートリーを網羅的に解析するため、本発明者らの研究グループは以下の実験手法を開発した（参考文献８）。まず、ドナーからアフェレーシスでBリンパ球を回収し、ファージディスプレイ技術を用いて巨大な抗体ライブラリーを構築した。次に、抗体ライブラリーをホルマリン処理ウイルス粒子でスクリーニングし、結合活性及び中和活性を示すクローンを単離し、その特性を詳細に調べた。末梢血中のBリンパ球のみを利用して解析を行ったものの、その結果はドナーの体内に存在する中和抗体の全レパートリーを表していると判断できる（参考文献８）。以上の戦略を用い、インフルエンザワクチン（２００９年に大流行したA型インフルエンザウイルス（H1N1型）株）接種後のヒト体内のおけるヘマグルチニンに対する抗体レパートリーを詳細に調べた。その結果、一部の例外はあるものの、検出された抗体は二つの群、即ち、ワクチン接種によって新たに誘導されたB細胞が産生し、シアル酸結合ポケットの周囲に結合する抗体（第一群；タイプ１の抗体群）と、ワクチン接種の前からメモリー（記憶）細胞として存在していたB細胞が産生する抗体であってVH1-69遺伝子（VH1-69germline遺伝子）を用いており、ヘマグルチニン分子の軸索部分に結合する抗体（第二群；タイプ２の抗体群）に分類された。第二群の抗体の多くはワクチンとして使用したH1N1型ウイルスのみならず、H5N1型ウイルスに対しても中和活性を示した。また、第二群の抗体は変化し難いエピトープを認識している可能性が非常に高く、長期間にわたってウイルス感染に対応していることが示唆された。以上の結果を踏まえると、インフルエンザのパンデミックに備えるための戦略は個人の保有する抗体（有効な中和抗体、即ち第二群の抗体の保有の有無）を考慮してデザインされるべきであり、そのための指標として「VH1-69遺伝子を用いた抗体」が有用であるといえる。即ち、VH1-69遺伝子を用いた抗体を検出し、その結果を利用すれば、有効且つ効率的なパンデミック対策を実現できる。尚、本発明者らの検討によって、VH1-69遺伝子を用いた抗体を分泌型抗体として検出可能であることやワクチン接種によりVH1-69遺伝子を用いた抗体が増加すること等も明らかになるとともに、VH1-69遺伝子を用いた抗体とヘマグルチニンの結合を阻害するモノクローナル抗体（K1-18）がウイルス中和活性を阻害した事実より、VH1-69遺伝子を用いた抗体が中和抗体として機能していることが直接的に示された。
　主として以上の成果に基づき、以下の発明が提供される。
　［１］被検者由来の生体サンプル中における、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存否を指標として、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力を判定する方法。
　［２］以下のステップ（１）～（３）を含む、［１］に記載の方法：
（１）インフルエンザワクチン接種後の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させるステップ；
（２）生成する免疫複合体を検出するステップ；
（３）ステップ（２）の検出結果に基づきA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さを判定するステップであって、検出された免疫複合体の量がA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さの指標となるステップ。
　［３］以下のステップを更に含む、［２］に記載の方法：
（４）インフルエンザワクチン接種前の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させることにより生成する免疫複合体を検出し、該免疫複合体の量と、ステップ（２）で検出された免疫複合体の量を比較し、比較結果に基づき、抵抗力の強さを判定するステップ。
　［４］生体サンプルが血液サンプルである、［２］又は［３］に記載の方法。
　［５］A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H3N2型、H5N1型、H5N2型、H6N1型、H7N2型、H7N3型、H7N7型、H7N9型、H9N2型及びH9N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
　［６］A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H2N2型、H3N2型及びH5N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
　［７］A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H5N1型及びH5N2型らなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
　［８］VH1-69遺伝子を用いた抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体を含む、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力判定用キット。
63グループに分類された代表的なクローンの特徴。左端の３列の数字はスクリーニングで単離されたクローンのグループ番号と、各グループで単離されたクローンの種類及びクローンの単離数に対応する。代表的なクローンと全てのgermline VH遺伝子の間でアミノ酸配列を比較することにより、各クローンのgermline遺伝子を同定した。同一性(%)を示した。CDR3のアミノ酸配列も示した。４つのH1N1株（NC99, SI06, Bri07及びCal09）及びH3N2ウイルス粒子に対する結合活性をELISAで調べた。492nmの吸光度を以下のように表した。≧1.00（赤）、0.50-0.99 (オレンジ), 0.10-0.49 (黄色)。H1N1、H5N1及びH3N2ウイルスに対する100又は250μg/ml Fab-pp型抗体のウイルス中和活性をフォーカス減少法で調べた。減少率（パーセント）を以下のように表した。≧60% (濃い青), 40-60% (青), 20-40% (薄い青)。二つのH1N1株（Bri07及びCal09）を用い、Fab-pp型抗体のHI活性を測定した。ヘマグルチニン凝集をFab-pp型抗体が阻害する最低濃度(μg/ml)を示した。図中に示したCDR3のアミノ酸配列は上から順にDTTVTNEEINFYYGMDV（配列番号１）、DTEVTNEEINFYYGMDV（配列番号２）、DTEVTSEEINFYYGMDV（配列番号３）、DTTVTSEEINFYQGMDV（配列番号４）、EFGANGEDIYFYHGMDV（配列番号５）、SIGGYDGEGIFYNHYGMDV（配列番号６）、DEWFGELGSSGMDV（配列番号７）、DFAGEGHGSGSVDY（配列番号８）、SATSYRDYLDRDFFYYALDV（配列番号９）、SATSYRDYLDRDFYYYALDV（配列番号１０）、DHLNSEIVATITGFLDY（配列番号１１）、DKLNSEMVATITGFLDY（配列番号１２）、DKLNSEMVATITGFMDY（配列番号１３）、DKLNSDEVTTITGFLDY（配列番号１４）、DNLNSELVATITGFLDH（配列番号１５）、DNLNSDEVATISGFLDY（配列番号１６）、DYLNSEMVATITGFLDS（配列番号１７）、EPSNTEDIRGIEGVFDY（配列番号１８）、DAYSSGDTYYYGLDV（配列番号１９）、DRGTGEQIAVVTALIDY（配列番号２０）、HGYGDYVGYFDY（配列番号２１）、VLRWLGEEDADAFDI（配列番号２２）、GFGMVGDTVDDLYNGMDV（配列番号２３）、VQRPYGDYAAGAFDI（配列番号２４）、VQRPYGDYITGAFDI（配列番号２５）、RTWYYDGSGPDPSRDAFDI（配列番号２６）、DLGNGEDIAVQPGTIGVDY（配列番号２７）、DLGNGEDIAVQPGTTGVDY（配列番号２８）、DLGNGEDIVVQPATIGVDY（配列番号２９）、GTEVTTEEIYFYYGMDV（配列番号３０）、GTEVTTEEINFYYGMDV（配列番号３１）、AEKWLADYFYYFGMDV（配列番号３２）、DREESLFAGAIYNYYYDMDV（配列番号３３）、KGGAKLLYFDWLASAFDI（配列番号３４）、GPNYYENFFDY（配列番号３５）、GPNYYESYFDY（配列番号３６）、GPNYYENYFDF（配列番号３７）、GPNYYESYLDF（配列番号３８）、GPNYFESYFDN（配列番号３９）、GPNYYETYLDN（配列番号４０）、GPHYYESHLDY（配列番号４１）、GPHYYVSYFDS（配列番号４２）、GNTYYSSYFDQ（配列番号４３）、GSTYYSSYFDQ（配列番号４４）、SGTYYVSYFDS（配列番号４５）、SGTYYVSYLDS（配列番号４６）、SGTYYVSFFDY（配列番号４７）、SGSYYPDYFQY（配列番号４８）、SPTYYPGALDM（配列番号４９）、APLIYNWYFDL（配列番号５０）、APLIYNWYYDL（配列番号５１）、HPTYHYGSAMDY（配列番号５２）、HPTYYFGSAMEY（配列番号５３）、HPTYYYGSPMDY（配列番号５４）、HPMYHYGSAMDY（配列番号５５）、HSGYHLIGYFDS（配列番号５６）、EEGYYYGSGPLDS（配列番号５７）、NSGYHISGFYLDY（配列番号５８）、SLGYHTQYNGMDV（配列番号５９）、HPTYHFDKSGYRFDS（配列番号６０）、SRGYSFGYGTDYFDY（配列番号６１）、NYYGSGTYFNDAFDI（配列番号６２）、YQSSDYYNSEYFQH（配列番号６３）である。 ワクチン接種により新たに誘導された抗体間における、HAに対する結合の競合阻害。Fab-cp3型抗体（10倍濃縮、左側）の存在下、Cal09ウイルス粒子に対するFab-pp型抗体（上側）の結合活性をELISAで測定した。抗HA抗体ではないF008-009及びF033-367をコントロールに使用した。結合阻害を以下の通り計算した。F008-009cp3の存在下での吸光度値を100%結合とし、各Fab-cp3型抗体の存在下による吸光度値の減少率を測定し、阻害率とした。阻害率を以下のように表した。≧70% (白), 50-70% (灰色), 0-50% (濃い灰色)。実験は二連で行い、少なくとも３回繰り返した。 本検討で単離されたタイプ2抗体による、C179のHAに対する結合の阻害。様々なFab-cp3型抗体の存在下（10倍濃縮）、Bri07ウイルス粒子に対するC179の結合をELISAで調べた。抗HA抗体ではないF008-009及びF033-367をコントロールに使用した。各クローンの名前の下に、グループの番号を付した。実験は二連で行い、２回繰り返した。エラーバーは標準偏差を示す。 ワクチン接種及び採血のスケジュール。1947年生まれのドナーに対してA/California/7/2009pdm株を２回（2009年11月2日、16日）ワクチン接種した。ワクチン接種前に２回（2009年10月30日、11月2日）、１回目のワクチン接種後に１回（2009年11月9日）、２回目のワクチン接種後に５回（2009年の11月17日、23日、30日、12月7日、14日）、採血した。10月30日（ワクチン接種前）と12月14日（ワクチン接種後）の血液からそれぞれ巨大な抗体ライブラリーを構築した。 各クローンのVH（FR1-CDR1-FR2-CDR3-FR4）のアミノ酸配列（上から順に配列番号６４～１２６）。 H1N1株及びH5N1株に関する、血清のHI活性及びウイルス中和活性。血清のウイルス中和活性を測定するためVN法及びM-VN法を利用した。段階希釈した血清を用いて活性を測定し、HI活性は、ヘマグルチニン凝集阻害を示す血清の最大希釈倍率の逆数を、ウイルス中和活性は、50%フォーカス減少率を示したときの血清の希釈倍率の逆数を示した。ワクチン接種前の血清は2009年10月30日と同11月2日に採取したものである。NDは不検出を表す。 K1-18抗体存在下での血清のウイルス中和活性。段階希釈した血清を用いて活性を測定し、50%フォーカス減少率を示す、血清の希釈倍率の逆数を示した。ワクチン接種前の血清は2009年11月2日に採取したものである。 K1-18抗体の特徴。(a) VH1-69遺伝子を使用している抗体へのK1-18抗体の結合活性。VH1-69遺伝子を使用している抗体へのK1-18抗体の結合活性をELISAによって測定した。F004-122、F009-165、F021-112、F021-256、F035-095、F058-031はVH1-69遺伝子を使用していない。グループ番号は、クローン名の下に表記した。(b) 各抗体のK1-18抗体存在下におけるウイルス粒子への結合活性。VH1-69遺伝子を使用している抗体のBri07ウイルス粒子への結合活性を、K1-18抗体（100又は200μg/ml）存在下でELISAにより測定した。F008-009は抗HA抗体ではなく、ネガティブコントロールとして使用した。グループ番号はクローン名の下に表記した。実験は、２連で行い、標準偏差をエラーバーで示した。
１．A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法
　本発明の第１の局面は、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力を判定する方法に関する。本発明によれば、A型インフルエンザウイルスに対する被検者の抵抗力を客観的な指標で判定することができる。本発明の方法は、将来起こり得るインフルエンザのパンデミック対策の手段として有効であり、その価値は極めて高い。本発明の方法では、VH1-69遺伝子を用いる抗体がA型インフルエンザウイルスに対して幅広く中和活性を示すという知見、及びVH1-69遺伝子を用いる抗体を産生するB細胞がメモリー細胞として残存し、A型インフルエンザに対する生体の防御に重要な役割を果たすという知見に基づき（詳細は後述の実施例を参照）、被検者由来の生体サンプル中における、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存否を指標として、A型インフルエンザウイルスに対する被検者の抵抗力を判定する。
　A型インフルエンザウイルスはHA分子の型によって二つのグループ、即ち、H2、H5、H1、H6（以上、H1クラスター；H1a）、H13、H16及びH11（以上、H1クラスター；H1b）からなるグループ１と、H8、H12、H9（以上、H9クラスター）、H4、H14、H3（以上、H3クラスター）、H15、H7及びH10（以上、H7クラスター）からなるグループ２に大別される。本発明の方法は、これらA型インフルエンザウイルスを網羅的に対象とする。但し、一態様ではH1N1型、H1N2型、H2N2型、H3N2型、H5N1型、H5N2型、H6N1型、H7N2型、H7N3型、H7N7型、H7N9型、H9N2型及びH9N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスを対象とする。別の一態様では、特にパンデミック対策の必要性が高いとされる、H1N1型、H2N2型、H3N2型及びH5N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスを対象とする。更に別の一態様では、グループ１ウイルス間で共有されているエピトープをVH1-69遺伝子を用いた各抗体（実施例に示した実験において、被検者由来のサンプル中に見出されたもの）が認識していたという事実に基づき、グループ１ウイルスを対象とする。即ち、この態様では、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H5N1型及びH5N2からなる群より選択される一又は二以上のウイルスが対象となる。
　本発明の判定方法では、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存否が指標となる。換言すれば、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存在、量、レパートリーなどによって、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗性が判定される。
　VH1-69遺伝子はVLドメインがなくとも抗原結合サイトを形成して幅広く中和活性を示す抗体を作り出すことができる。「VH1-69遺伝子を用いた抗体」とは、Germline遺伝子であるVH1-69遺伝子が使用されたVH領域を備える抗体である。VH1-69遺伝子は、VH領域を構成するFR1、CDR1、FR2、CDR2及びFR3をコードする。従って、VH1-69遺伝子を用いた抗体」では、FR1～FR3のアミノ酸配列に高い相同性（共通性）が認められる。また、VH1-69遺伝子を用いた抗体では、５３位のアミノ酸及び５４位のアミノ酸が特徴的であり、この特徴が「VH1-69遺伝子を用いた抗体」の生理機能に重要であると考えられる。VH1-69遺伝子を用いた抗体では、通常、５３位のアミノ酸残基は疎水性アミノ酸（イソロイシン、メチオニン、ロイシン、バリンなど）であり、５４位のアミノ酸残基も疎水性アミノ酸（フェニルアラニン、ロイシンなど）である。典型的には、VH1-69遺伝子を用いた抗体の５３位アミノ酸はイソロイシン、５４位アミノ酸はフェニルアラニンである。尚、VH1-69遺伝子（FR1～FR3をコードする）の配列を配列番号１２７に示す。また、VH1-69遺伝子がコードするアミノ酸配列（FR1～FR3）を配列番号１２８に示す。
　被検者は特に限定されず、全ての年齢層のヒトが被検者となり得る。生体サンプルも特に限定されないが、抗体を検出できる生体サンプルが用いられる。生体サンプルの例を示すと、血液、血漿、血清、鼻汁、唾液である。好ましくは、調製が容易であることや侵襲性が低いことなどの理由から、血液サンプルを用いる。血液サンプルの中でも特に血清又は血漿をサンプルとして採用することが好ましい。尚、生体サンプルの調製は常法に従えばよい。
　本発明の方法では、典型的には以下のステップ（１）～（３）が行われる。
　（１）インフルエンザワクチン接種後の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させるステップ
　（２）生成する免疫複合体を検出するステップ
　（３）ステップ（２）の検出結果に基づきA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さを判定するステップであって、検出された免疫複合体の量がA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さの指標となるステップ
　ステップ（１）では、予め用意した、インフルエンザワクチン接種後の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させる。ステップ（１）は、in vitroにおける抗原抗体反応であり、生体サンプル中にVH1-69遺伝子を用いた抗体が存在すれば、抗イディオタイプ抗体との間で免疫複合体が形成される。
　インフルエンザワクチンには、様々なウイルス株を利用できる。例えばH1N1型インフルエンザ（例えばA/California/7/2009pdm株、A/Suita/1/2009pdm株、A/New Caledonia/20/1999株、A/Solomon Islands/3/2006株、A/Brisbane/59/2007(Bri07)株）、H3N2型インフルエンザ（例えばA/Panama/2007/1999株）、H5N1型インフルエンザ（例えばA/Indonesia/5/2005/PR8-IBCDC-RG2株）の不活化ワクチン又は生ワクチンを用いることができる。
　ワクチン接種によって誘導された抗体が生体サンプルに十分含まれるように、ワクチン接種から５日～３週間経過した時点で採取した生体サンプルを用いるとよい。複数回（例えば２回）のワクチン接種後の生体サンプルを用いてもよく、その場合には、通常、最終のワクチン接種から５日～３週間経過した時点で採取した生体サンプルを用いることにする。
　ステップ（１）には、検出用抗体として、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体が使用される。抗イディオタイプ抗体とは、抗体の超可変領域（CDR）を特異的に認識する抗体であり、VH1-69遺伝子を用いた抗体に特異的なものを本発明では使用する。上記の通り、VH1-69遺伝子を用いた抗体では５３位のアミノ酸（典型的にはイソロイシン）及び５４位のアミノ酸（典型的にはフェニルアラニン）が特徴的である。従って、これらのアミノ酸を含む領域を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体を使用するとよい。本発明で使用する抗イディオタイプ抗体は公知の方法、例えば免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製すればよい。抗体の受託作製のサービスを提供する企業（例えば免疫生物研究所、株式会社アプロサイエンス）や機関もあり、当該サービスを利用して抗イディオタイプ抗体を用意することにしてもよい。抗イディオタイプ抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよいが、好ましくはモノクローナル抗イディオタイプ抗体を用いる。
　生体サンプルと抗イディオタイプ抗体との接触は、生体サンプルに対して抗イディオタイプ抗体を添加することや、抗イディオタイプ抗体が固相化された部材（例えばウェル）に対して生体サンプルを添加することなどによって行われる。接触の具体的な態様や接触の条件などは、採用する測定法に応じて適宜設定すればよい。
　ステップ（２）では、ステップ（１）によって生成する免疫複合体を検出する。検出法（測定法）としてラテックス凝集法、蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法）、放射免疫測定法（RIA法）、ウエスタンブロット法を例示することができる。好ましい検出法としては、FIA法及びEIA法（ELISA法を含む）を挙げることができる。これらの方法によれば高感度、迅速且つ簡便に検出可能である。FIA法では蛍光標識した抗体を用い、蛍光をシグナルとして免疫複合体を検出する。一方、EIA法では酵素標識した抗体を用い、酵素反応に基づく発色ないし発光をシグナルとして免疫複合体を検出する。非競合法に限らず、競合法を用いることにしてもよい。
　ステップ（３）では、ステップ（２）の検出結果に基づきA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さを判定する。本発明では、判定の際、検出された免疫複合体の量をA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さの指標とする。典型的には、検出された免疫複合体の量に基づき、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さを判定する。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。具体的な判定基準の例を以下に示す。
＜判定基準の例＞
　(a) 免疫複合体が検出されればA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力がある
　(b) 免疫複合体が検出されればA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が強い
　(c) 免疫複合体の量が多いほどA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が強い
（定性的判定の例１）
　基準値よりも検出値が高いときに「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力がある」と判定し、基準値よりも検出値が低いときに「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力がない」と判定する。
（定性的判定の例２）
　基準値よりも検出値が高いときに「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が強い」と判定し、基準値よりも検出値が低いときに「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が弱い」と判定する。
（定性的判定の例３）
　検出できたとき（陽性の場合）に「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力がある」と判定し、検出できないとき（陰性の場合）に「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力がない」と判定する。
（定性的判定の例４）
　検出できたとき（陽性の場合）に「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が強い」と判定し、検出できないとき（陰性の場合）に「A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が弱い」と判定する。
（定量的判定の例）
　以下に示すように検出値の範囲毎に抵抗力の強さを予め設定しておき、検出値から抵抗力を判定する。
　測定値＜ａ：抵抗力がない
　ａ≦測定値＜ｂ：抵抗力が弱い
　ｂ≦測定値＜ｃ：抵抗力があるが十分ではない
　ｃ＜測定値：抵抗力が強い
　この例では４段階に区分したが、区分数は任意に設定できる。区分数の例は２～７、好ましくは３～６である。
　本発明の一態様では、ワクチン接種前の生体サンプルとワクチン接種後の生体サンプルを比較してA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力を判定する。即ち、この態様は、以下のステップ（４）も含む。
　（４）インフルエンザワクチン接種前の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させることにより生成する免疫複合体を検出し、該免疫複合体の量と、ステップ（２）で検出された免疫複合体の量を比較し、比較結果に基づき、抵抗力の強さを判定するステップ
　比較の結果、ワクチン接種後に免疫複合体の量の増加が認められれば、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力が強いと判定することができる。また、VH1-69遺伝子を用いた抗体に関して応答性を把握することもできる。このように、ステップ（４）を行うことにより、補助的ではあるものの、有益な情報が得られる。また、ステップ（４）によって判定した場合、典型的には、被検者を以下の４グループに分類することができる。
　(a) VH1-69遺伝子を用いた抗体（A型インフルエンザウイルスに対する中和抗体）を大量に保有する者
　(b) VH1-69遺伝子を用いた抗体（A型インフルエンザウイルスに対する中和抗体）を少量保有する者
　(c) VH1-69遺伝子を用いた抗体（A型インフルエンザウイルスに対する中和抗体）を保有しない者
　(d) ワクチン接種後も、VH1-69遺伝子を用いた抗体（A型インフルエンザウイルスに対する中和抗体）が誘導されない者
　以上のように(a)～(d)に分類すれば、各グループに対して、例えば、以下のごとき対策を講じることができ、極めて有効且つ効率的なパンデミック対策を実現できる。
　グループ(a)：基本的に対策は必要ない。
　グループ(b)：H5N1型インフルエンザワクチン接種による、標的中和抗体産生細胞の選択的増殖刺激
　グループ(c)：数種の異なるグループ１インフルエンザウイルスワクチンの接種による標的中和抗体の産生誘導
　グループ(d)：グループ１インフルエンザウイルス中和ヒト抗体を予防・治療用抗体として準備し、必要に応じて投与
２．インフルエンザウイルス抵抗力判定用のキット
　本発明の第２の局面は本発明の判定方法に用いられるキットに関する。本発明のキットは、VH1-69遺伝子を用いた抗体を検出又は捕捉するため、VH1-69遺伝子を用いた抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体を主要構成要素として含む。抗イディオタイプ抗体はその用途に適するように必要に応じて標識化されている。抗体の標識化に使用可能な標識物質の例はフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、 125I等の放射性同位体、及びビオチンを挙げることができる。抗イディオタイプ抗体を認識する標識化２次抗体をキットに含めることもできる。この場合には、通常、無標識の抗イディオタイプが用いられることになる、抗イディオタイプ抗体が固相化されていてもよい。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体への抗体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行うことができる。
　本発明の判定方法を実施する際に使用するその他の試薬（緩衝液、溶媒、ブロッキング用試薬、酵素の基質、発色試薬など）及び／又は装置ないし器具（容器、反応装置、蛍光リーダーなど）をキットに含めてもよい。また、コントロールや検量線の作成などに用いられるインフルエンザ株をキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
　A型インフルエンザウイルスのパンデミック対策に有効な手段の創出を目指し、以下の検討を行った。
１．材料と方法
（１）ウイルス
　本検討では以下のインフルエンザウイルス株を使用した。A/H1N1pdm: A/California/7/2009pdm (Cal09), A/Suita/1/2009pdm (Sui09); A/H1N1: A/New Caledonia/20/1999 (NC99), A/Solomon Islands/3/2006 (SI06), A/Brisbane/59/2007(Bri07). A/H3N2: A/Panama/2007/1999. A/H5N1: A/Indonesia/5/2005/PR8-IBCDC-RG2.　括弧内は略称。
（２）抗体ライブラリーの構築
　既報の方法（参考文献８）に従ってファージ抗体ライブラリーを構築した。概要を説明すると、まず、ワクチン接種の前後で、１９４７年生まれのドナーからアフェレーシスで単球（血液3Lに相当する量）を回収した。回収した単球は8.0 x 108個（ワクチン接種前）又は1.2 x 109個（ワクチン接種後）のBリンパ球を含んでいた。既報のファージディスプレイ方法（参考文献１７）に従って、巨大なコンビナトリアル抗体ライブラリーを構築した。ライブラリーサイズは、ワクチン接種前ではH鎖が1.6 x 109 クローン、L鎖が2.0 x 109クローン、Fabが1.4 x 1010、ワクチン接種後ではH鎖が3.2 x 109 クローン、L鎖が1.3 x 109クローン、Fabが2.6 x 1010クローンであった。
（３）ライブラリーのスクリーニング
　既報の方法（参考文献１７、１８）に従い、ウイルス粒子に結合するファージを選択した。概要を説明すると、ホルマリン処理後のCal09株又はBri07株ウイルス粒子を使用してスクリーニングした。２回又は３回のパニングの後、E. coli (DH12S)細胞に溶出ファージを感染させ、100μg/mlアンピシリン及び0.2%グルコースを含むLBプレートに播種した。ファージミドを保有するE. coliのコロニーをピックアップし、100μg/mlアンピシリン、0.05%グルコース及び1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを含む2 x YT培地を使用し、30℃で終夜培養した。E. coliの生育に伴い、Fab-cp3型抗体が培地中に分泌される（参考文献１９）。Fab-cp3分子を含む培養上清を、H1N1ウイルス（スクリーニングに使用したウイルス株）及びH3H2ウイルスを抗原としたELISAに供した。H1のみに結合性を示すクローンを選択し、更なる解析に使用した。
（４）ELISA
　ホルマリン処理ウイルス粒子を96ウェルMaxisorp immunoplate (Nunc)にコートし、E. coliの培養上清に含まれるFab-cp3抗体を各ウェルに添加した。ウサギ抗cp3抗体(株式会社医学生物学研究所)とインキュベートした後、ウェルにペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG (H + L鎖; 株式会社医学生物学研究所)を添加し、更にインキュベートした。その後、HRP基質 (OPD;和光純薬工業株式会社)を各ウェルに添加し、発色させた。H2SO4の添加によりペルオキシダーゼ反応を停止させた後、492nmの吸光度を測定した。
（５）配列の解析
　抗体クローンから単離したVH断片のヌクレオチド配列をGenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start Kit (BECKMAN COULTER)及びCEQ2000 DNA Analysis System (BECKMAN COULTER)を使用して決定した。T7ETZ (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’（配列番号１２９)をVHシークエンス用プライマーに使用した。
（６）ウイルス中和試験
　ウイルス中和活性を測定するために、シングルサイクル法(VN)又はマルチサイクル法(M-VN)を実施した。200又は500μg/mlのFab-pp型抗体又は２倍段階希釈した血清と等量の100 FFU インフルエンザウイルスを混合し、96ウェルプレートに用意したMDCK細胞に添加した。VN法では、混合物をインキュベートした後、血清フリーのMEMで洗浄し、0.4% BSAを含むMEMを使用して、37℃で15時間、培養した。M-VN法では、インキュベートの後、混合物を除くことなく、混合物と等量の0.4 % BSA、5μg/mlアセチル化トリプシン、0.5 %メチルセルロースを含むMEMを細胞に添加し、37℃で28時間、培養した。続いて、細胞をエタノールで固定化し、PAP(ペルオキシダーゼ及び抗ペルオキシダーゼ)複合体で染色した。フォーカス当たり１以上の細胞（VN法の場合）を含むフォーカス又は４以上の細胞（M-VN法の場合）を含むフォーカスの数を計数した。結果を、Fab-pp型抗体についてはフォーカス減少率(%)で表し、血清については50%フォーカス減少率を示す、血清の希釈倍率の逆数で表した。
（７）ヘマグルチニン凝集阻害アッセイ
　既報の方法（参考文献２０）に従いHI試験を行った。概要を説明すると、段階希釈した160μg/mlの精製Fab-pp型抗体又はドナー血清（PBSで希釈）を用意した。段階希釈したFab-pp型抗体又は血清をウェル当たり4 HAユニットのウイルスとプレインキュベートした。PBSで希釈した0.75 %のモルモット赤血球細胞を各ウェルに添加し、室温で30～60分インキュベートした。結果は、ヘマグルチニン凝集を阻害した、Fab-pp型抗体の最小濃度 (μg/ml)又は血清の最大希釈倍率の逆数で表した。
（８）競合ELISA
　ウイルス株に対する結合活性の検出用抗体としてFab-pp型抗体又はC179を、競合物質としてFab-cp3型抗体を用いて、競合ELISAを実施した。使用前に培養上清内のFab-cp3分子を20倍濃縮した。ホルマリン不活化ウイルス粒子を96ウェルMaxisorp immunoplateにコートした。最適濃度にしたFab-pp型抗体（総量50μl）を50μlの20倍濃縮Fab-cp3型抗体と混合し、ウイルスでコートしたウェルに添加した。次に、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ストレプトアビジン抗体を２次抗体として各ウェルに添加した。終濃度0.25μg/mlのC179を使用したときには、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(H + L鎖; MBL)を２次抗体に使用した。続いて、HRP基質(OPD; 和光純薬株式会社)を各ウェルに添加し、発色させた。H2SO4の添加によりペルオキシダーゼ反応を停止させた後、492nmの吸光度を測定した。
（９）K1-18抗体の作製
　5種類の1-69抗体のFab-pp型 (F081-007, F083-103, F083-115, F083-305, F083-311)を精製し、完全フロイントアジュバントとともにマウスの足底球に一回注入し、11日後にアジュバントなしでさらに一回注入した。2回目の注入の3日後、リンパ球を鼠径リンパ節から単離し、ミエローマ株化細胞P3-X63AG8.653と融合した。ハイブリドーマをクローニングした後、培養液を上述の1-69抗体とVH1-69遺伝子を使用していない様々な種類の抗体に対し、ELISAによりスクリーニングした。複数のVH1-69遺伝子を使用している抗体には結合するが、VH1-69遺伝子を使用していない抗体には結合しない抗体を選択した。K1-18抗体の単離は、株式会社モノクローナル抗体研究所(札幌, 日本)が実施した。
（１０）VH1-69遺伝子を使用するIgGの血清中濃度の測定
　ヒトIgG ELISA Quantitation set (Bethyl Laboratories, Inc)を多少の修正を加えて使用した。VH1-69遺伝子を使用するIgGの検出用にK1-18抗体を、標準曲線を作成するためにアフィニティー精製ヒトIgGコート抗体（affinity purified Human IgG coating antibody）を96ウェルMaxisorp immuonoplateにコートした。血清及びヒト参照血清(Human reference serum;標準曲線用)を所定のウェルに添加した。HRP結合ヒトIgG検出抗体とインキュベート後、TMB基質を各ウェルに添加した。H2SO4を添加してペルオキシダーゼ反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。ヒト参照血清を用いて作成した標準曲線を利用してK1-18抗体に結合したIgGの濃度を算出した。
（１１）K1-18抗体の存在下での血清のウイルス中和活性
　前述のウイルス中和試験を修正して使用した。概要を説明すると、RDEで処理した血清を血清フリー培地で希釈し（1:10又は1:20の希釈率）、等量のK1-18抗体（800又は1,600 μg/ml）と混合した。インキュベート後、２倍段階希釈し、等量のインフルエンザウイルス（100 FFU）と混合し、96ウェルプレートに用意したMDCK細胞に添加した。インキュベート後、細胞をエタノールで固定し、PAP(ペルオキシダーゼ及び抗ペルオキシダーゼ)複合体で染色した。50%フォーカス減少率を示した、血清の希釈倍率の逆数をウイルス中和活性とした。
２．結果
（１）異なる特徴を持つ2タイプの中和抗体
　S-IOVのワクチンを接種することで誘導された抗体のレパートリーを解析した。ドナーは1947年生まれで、子供の頃に数回インフルエンザに感染し(おそらくH1N1型ウイルスとH2N2型ウイルス)、1968年にも感染している(おそらくH3N2型ウイルス)。その後41年間、インフルエンザにはかかっておらず、ワクチンも接種していない。ワクチン接種と血液採取のスケジュールは図４に示した。ワクチン接種と血液採取は、2009年10月末から12月中ごろの間に行っており、その間S-IOVによる自然感染はなかった。ワクチン接種前後におけるBリンパ球からそれぞれ巨大ライブラリーを作製し、パンデミックH1N1ワクチン株(A/California/2009pdm)と季節性H1N1ワクチン株でスクリーニングを行った。2回または3回パニングを行った段階で120クローンをそれぞれ単離し、スクリーニングに使ったH1N1株に結合するクローンの解析をさらに行った。H1N1とH3N2両株に同じ強さで結合するクローンは抗NP抗体である可能性が高いため、解析からは除外した（参考文献８）。それぞれのスクリーニングで単離された240クローンのうち、抗HA抗体であると判断したクローンは次のようであった。スクリーニング1 (ワクチン接種後のBリンパ球より作製したライブラリーをパンデミック株でスクリーニング), 105クローン; スクリーニング2 (ワクチン接種前のBリンパ球より作製したライブラリーをパンデミック株でスクリーニング), 3クローン; スクリーニング3 (ワクチン接種後のBリンパ球より作製したライブラリーを季節性株でスクリーニング), 58クローン; スクリーニング1 (ワクチン接種前のBリンパ球より作製したライブラリーを季節性株でスクリーニング), 16クローン。これらクローン全てのVHの塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列を比較した結果、182クローンは96種類のモノクローナル抗体からなることが判明した。さらにアミノ酸配列の類似性、特にCDR3領域の同一性から、96種類は63グループに分類できた。VHのアミノ酸配列を図５に示した。
　63グループの代表クローンのHAに対する結合活性、赤血球凝集阻害反応、ウイルス中和活性を測定した（参考文献９）。図１に示したように、これらクローンの全てが例外なく2タイプに分類された。タイプ1に属するクローンは、パンデミックH1N1株には結合するが、季節性のH1N1株には結合活性は示さない。全てのクローンがHI活性を示し、スクリーニング1から単離されたクローンのみが属している。タイプ2はパンデミックH1N1株だけでなく、全ての季節性H1N1株にも結合する。HI活性はなく、ほとんどのクローンはH1N1株だけでなくH5N1株ウイルスも中和する。0%から5%という低い変異導入率から判断して、タイプ1のクローンの大半が、ワクチン接種により新しく誘導されたB細胞の産物であると考えられる。一方、10%から15%という高い変異導入率から判断して、数クローンを除いて、タイプ2に属するクローンの全ては、ワクチン接種前にすでに作られていた長寿命メモリーB細胞の産物であると考えられる。さらに、3クローンを除いて全てのクローンがVH1-69のgermline遺伝子を使用している。
　スクリーニング1から単離された105個のクローンのうち98個がタイプ1で7クローンがタイプ2である。タイプ2のクローンは季節性株だけでなくパンデミックウイルスのHAにも結合するので、この単離数の少なさは、血中のタイプ2の抗体を作る細胞の数が、タイプ1の抗体を作る細胞の数よりずっと少ないことを意味している。タイプ1では、98クローンが単離され、31グループに分類できた。31グループのうち、1クローンしか単離されていないのが19グループ、2クローン単離されているのが7グループであった。同じように、タイプ2の抗体では85クローンが単離され、32グループに分類できた。32グループのうち1クローンしか単離されていないのは14グループで、2クローンが単離されているのは8グループである。ポアソン分布から考えると、このスクリーニングでは単離できていないクローンがまだあるだろうと思われる。しかし、図１で示したクローンと大きく異なる特徴を持つクローンを見落としてはいないと考えている。
（２）ワクチン接種後に新しく出現した抗体
　実質的にタイプ1の抗体はすべてHI活性を示すので、それらのエピトープはシアル酸結合ポケットの周辺領域であると考えられる。これら抗体が認識するエピトープの相対的な位置を体系的に確かめるために、以前の研究で使った競合実験を行った（参考文献１０）。ライブラリーのスクリーニング後は、それぞれの抗体はFab-cp3型であるが、それらは簡単にFab-pp型に変換できるようにベクター内で設計されている（参考文献１１）。もし、クローンAが認識するエピトープがクローンBの認識するエピトープと重複しているならば、Fab-cp3型のクローンBが過剰量存在する時には、Fab-pp型のクローンAのHAに対する結合活性は大きく妨げられることになる。この原理を基にして、図１で示したタイプ1の抗体から選ばれた17クローンを使って、競合実験を行った。図２で示したように、17クローンのうち14クローンは、HAの結合に関しては互いによく競合した。F082-317、F082-254、F082-022の3クローンは、結合阻害の程度が低かった。この結果は、他のデータと一致する。F082-022はHI活性が非常に低い(タイター：160 μg/ml)。F082－254はパンデミックウイルスだけでなく季節性ウイルスにも結合し、両ウイルス株を中和する。さらに、高い変異導入率を示している(18%)。F082-317は、HAに対する結合活性は高いが、中和活性は相対的には低い。
　これらの結果から、HA上のシアル酸結合ポケットとその周辺領域は、免疫原性という点では非常に強い影響力を持ち、ワクチンの接種により新たに成長が誘導されて増殖したB細胞は実質上全てこれらの領域を認識する抗体を作り出すと結論付けた。また、ホルマリンで処理され、生きてはいないウイルスの精製産物をワクチンとして接種したときには、HAには結合するがウイルスを中和しない抗体を作り出すB細胞は十分量誘導されないと考えている。このことから、HA上の中和に関与しないエピトープは、たとえそれが存在していたとしても免疫原性という点では大きな影響力はないことが示唆される。
（３）長寿命メモリーB細胞から作られる抗体
　タイプ2のクローンは32グループに分類されるが、3クローンを除いて全てVH1-69遺伝子を使っていた。さらに、これら抗体の大半がH1N1ウイルスだけでなくH5N1ウイルスも中和できた。このことから、いくつかのグループが示してきたように、C179抗体が認識するエピトープの近くにこれら抗体のエピトープがあると考えられた（参考文献１２、１３）。そこで、C179抗体のHAに対する結合が、これらクローンのFab-cp3型が過剰量存在することで妨げられるかどうかを検討した。図３に示したように、VH1-69遺伝子を使っていない3クローンを含むクローンの全てが、C179のHAへの結合を阻害した。このようにタイプ２のクローンは、すでに他グループが報告しているCR6261やF10のようなVH1-69遺伝子を使っているほかの抗体と同じかよく似た方法でHAの膜近傍の軸索（stem）に結合していると考えられる（参考文献１２、１３）。図３では、F081-268、F082-243、F082-237、F083-373の4クローンは他のクローンよりも阻害活性が低いことを示している。図１で示したデータで、F081-268はHA結合活性は強いが中和活性は弱いことを示している。他の3クローンは結合活性も中和活性も相対的に弱い。このように、タイプ2の抗体が認識するエピトープは、C179が認識するエピトープと正確には同じではないが、C179のエピトープと全く異なる場所をエピトープとするクローンはなかった。このことは、このエピトープがグループ1ウイルス間で共有されており、安定に保たれていることを示唆している。このエピトープの免疫原性がたとえ弱かったとしても、一度ヒトがこのエピトープを認識する抗体を産生するB細胞を獲得してしまえば、そのB細胞は体内でメモリー細胞として長期間残り、グループ1ウイルスに対し主要な働きをするだろう。興味深いことに、F083-115はVH1-69遺伝子を使っているが、H3ウイルスも中和できる。
　タイプ2の抗体として単離された84クローンは、49種類のクローンから構成され、32グループに分類できる。それぞれのグループは、B細胞が分化しているときには、それぞれが独立して成熟したB細胞から作られた抗体群であると考えられるが、図１で異なったグループに分類されたクローンのいくつかは同じB細胞から誘導されているのかもしれない。たとえそうだったとしても、図１で要約したクローンのリストでは、VH1-69遺伝子を使う10個以上のB細胞が、おそらくドナーが若かったときにドナーの体内にそれぞれ独立して作られたことを示している。16個の抗HA抗体がスクリーニング4 (ワクチン接種前のライブラリーを季節性株でスクリーニング)から単離されているが、季節性のH1N1ウイルスには結合するがパンデミックウイルス株には結合しないというクローンはなく、全てタイプ2の抗体であった。このスクリーニングで使われたライブラリーは、ワクチンを接種する前のB細胞から作られているので、スクリーニング4から単離されたクローンの特徴に、ワクチン接種によるタイプ1のB細胞の増殖の影響はない。もし、季節性H1N1ウイルスのHA頭部に結合する抗体を産生するB細胞が十分なレベルで存在しているのであれば、そのようなクローンが単離できているはずである。この研究で使われた方法は、以前の研究で、3人の血液ドナーでのH3N2ウイルスに対する中和抗体のレパートリー解析に使われた（参考文献８、１０）。ワクチン接種のステップは含まれておらず、単離された抗体の多くはHA頭部に結合した（参考文献１０、１４）。これらのことから、グループ1ウイルス全てを中和する1-69抗体は、ドナーの体内で長期にわたりインフルエンザAグループ1に対し、主要な役割を果たしていると結論付けた。
（４）血清中に分泌された抗体の存在
　3種類のウイルス（H1N1パンデミック株、季節性H1N1株とH5N1株）に対する2種類の生物活性、HI活性とウイルス中和活性を図４で示したように、異なった日にドナーから採取した8種類の血清サンプルに対して測定した。
　図６で示したように、HI活性の場合は、季節性H1N1およびH5N1ウイルスに対する活性はどの血清でも検出できなかった。H1N1パンデミックウイルスに対するHI活性は1回目のワクチン接種後2週間で現れ始めた。一般的なフォーカス減少法により測定されたウイルス中和試験の場合では、パンデミックH1N1ウイルスに対する活性はワクチン接種後1週間ですでに上昇し始め、2週間後には安定な状態に達した。季節性H1N1ウイルスに対しては、ウイルス中和活性はワクチンを接種する前からすでに検出されており、ワクチン接種後1週間で上昇した。H5N1ウイルスに対しては、一般的なフォーカス減少法では検出できなかったが（参考文献９）、方法の欄で述べたように、より感度の高い方法では検出できた（参考文献１５）。
　H5N1ウイルスに対する中和活性は、ドナーの体内でH1N1とおそらくH2N2に対しもともと作られた一連の抗体から誘導されたと考えられる。それゆえ、季節性H1N1ウイルスとH5N1ウイルス間で観察された違いは活性の強さの違い、つまり、季節性H1N1ウイルスに対する活性はH5N1ウイルスに対するよりも数倍強いことによるのかもしれない。季節性ウイルスに対する中和活性がワクチン接種前でさえ検出可能であることは、注目すべきことである。
　1-69抗体が実際にH1N1パンデミックウイルスの中和に役割を果たしているかを証明するため、1-69抗体に特異的に結合する抗体、即ち抗イディオタイプ抗体を作製した。ヒトの1-69抗体のVHドメインでは、2個の疎水性アミノ酸(53番目のイソロイシンと54番目のフェニルアラニン)がCDR2領域に存在することが非常に特徴的であり（参考文献１６）、そのためこのアミノ酸を含む領域がマウスでは免疫原性が高いであろうことを期待した。さらに、これら2個のアミノ酸はHAと抗体の結合に直接関与しているため（参考文献１２、１３）、抗イディオタイプ抗体が1-69抗体のHAへの結合を阻害するかもしれないと予想した。作製の結果、図１で示した1-69抗体の80%以上に結合し、その半数の1-69抗体のHAへの結合を阻害することができるモノクローナル抗体K1-18を単離した(詳細は方法の欄と図８)。
　K1-18抗体をプローブに使って、血清中の1-69抗体のIgG量を測定した。その結果、ワクチン接種前の10月30日に採取した血清中には1-69抗体が4.58μg/mlの濃度で存在していたが、ワクチン接種後の12月14日に採取した血清中では1-69抗体の濃度が11.24μg/mlまで上昇した。パンデミックウイルスと季節性ウイルスに対する中和活性をK1-18抗体存在下で測定した。図７で示したように、H1N1パンデミックウイルスについては、K1-18は明らかに中和活性を阻害した。季節性H1N1については、明らかに阻害しているが、完全阻害ではなかった。このように、1-69抗体が実際に血清中に存在し、H1N1ウイルスの中和に機能していることが示された。さらに、図７のデータより、機能的に異なる2タイプの抗体、即ち、HA/レセプターとの結合を阻害するタイプ1と、低pHによって誘導されるHAのコンフォメーションの変化を阻害するタイプ2が共存するときにはウイルス中和活性が相乗効果的に上昇することが示唆された。
３．展望
　以前に報告した研究において本発明者らの研究グループは、1968年から2004年の間に単離された12種類の異なるH3株に対する抗HA抗体の多量の単離を通して、3人のヒトの中和抗体レパートリーを解析した（参考文献８、１０、１４）。1960年と1944年に生まれた二人のドナーから単離された抗体の大半は、異なる株特異性を持つ3つのグループ（1968～1973の株特異的、1977～1993の株特異的、1997～2003の株特異的）に分類された。HA頭部に位置するA、B、C、D、Eといった5つのサイトが中和エピトープとして単離されているが、1977～1993年の株を中和するクローンの多くはサイトCに結合した。1974年に生まれた3番目のドナーから単離されたクローンは4タイプに分類できた。タイプ1は1973年株に強く結合し、株特異性も狭かった。タイプ2は1997年～2003年の株のHAに結合した。他の2タイプは幅広く株を中和する抗体であった。ひとつはH3N2全てを中和する抗体であり、もうひとつはH3だけでなくH1、H2、H5を含むグループ1のウイルスも中和する抗体であった。ウイルスを中和することのできる抗体を作る一連のB細胞が感染やワクチン接種によって免疫されることにより作られた後、更なる抗原刺激により、異なるコースをたどるだろう。あるB細胞は消えてなくなり、他のB細胞はメモリー細胞として残る。さらに、それらは長寿命のメモリー細胞と短寿命のメモリー細胞になるはずである。ほぼ毎年インフルエンザを経験しているヒトは、以前のウイルスから変化した新しいインフルエンザウイルスに感染する機会があるはずである。あるメモリー細胞は新しいウイルスを中和できる抗体を産生し、ある細胞は中和できない抗体を作る。それらは、抗原刺激があるかないかで選択されているはずである。この仮説に従えば、エピトープの安定性はメモリーB細胞の運命に大きな影響を与えていると考えられる。今回の研究では、グループ1ウイルスを中和することのできる1-69抗体を産生する細胞のみが、ドナーの体内にメモリー細胞として残っていたことを示していた。この実験では、若い頃にはインフルエンザを経験したが、その後全くかかっていないヒトを解析の対象とした。ドナーはインフルエンザワクチンをこれまで接種していないため、ドナーの体内で作られた抗体レパートリーは、生きているウイルス感染の影響のみで作られたと考えられる。ホルマリン処理されたウイルスで何回もワクチンを受けているヒトの体内で形成された抗体レパートリーは、この研究で示されたようにシンプルな傾向は示さないだろう。さらに、この研究では一人のヒトを対象としている。しかし、全てのヒトでグループ1ウイルスを幅広く中和することのできる1-69抗体を作ることができると思われる。なぜなら、VH1-69遺伝子のみが、VLドメインがなくても抗原結合サイトを形成して幅広く中和活性を示す抗体を作ることができ、さらに、VHのCDR3領域の、HAの軸索部分への結合への関与は限られているようである。タイプ2の抗体が病原性鳥インフルエンザ(HPAI)H5N1ウイルスによって将来引き起こされると考えられているパンデミックでの感染を防ぐのに十分に強力であるかどうかは更なる検証が必要であるが、タイプ2抗体を産生するクローンがメモリー細胞として存在していることは、その体内でパンデミックウイルスが増殖するのを防ぐのに役立つといえる。H5N1パンデミックへの対処法は、それぞれの個人の免疫プロフィールによって構築されたほうが良いと考えられる。VH1-69遺伝子を使っている抗HA抗体（1-69抗体）の存在は、インフルエンザウイルスを幅広く中和する抗体が体内に存在していることを示すのに役立つ指標となる。また、1-69抗体に対する抗イディオタイプ抗体は、インフルエンザウイルスを幅広く中和する抗体の検出に有用な試薬となるであろう。
　本発明はA型インフルエンザウイルスのパンデミック対策に有用である。本発明を利用することにより、合理的且つ効率的なパンデミック対策を講じることが可能になる。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
＜参考文献＞
　1. Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Ann. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000).
　2. Knossow, M. et al. Mechanism of neutralization of onfluenza virus infectivity by antibodies. Virology 302, 294-298 (2002).
　3. Okuno, Y., Isegawa, Y., Sasao, F. & Ueda, S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus H1 and H2 strains. J. Virol. 67, 2552-2558 (1993).
　4. Fraser, C. et al. Pandemic potential of a strain of influenza A (H1N1): early findings. Science 324, 1557-1561 (2009).
　5. Hancock, K. et al. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus. N. Engl. J. Med. 361, 1945-1952 (2009).
　6. Wrammert, J. et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
　7. Li, G.M. et al. Pandemic H1N1 influenza vaccine induces a recall response in humans that favors broadly cross-reactive memory B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 9047-9052 (2012). 
　8. Okada, J. et al. Monoclonal antibodies in man that neutralized H3N2 influenza viruses were classified in to three groups with distinct strain specificity: 1968-1973, 1977-1993 and 1997-2003. Virology 397, 322-330 (2010).
　9. Okuno, Y. et al. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J. Clin. Microbiol. 28, 1308-13131 (1990).
　10. Ohshima, N. et al. Naturally occurring antibodies in humans can neutralize a variety of influenza virus strains, including H3, H1, H2, and H5. J. Virol. 85, 11048-11057 (2011).
　11. Ito, W. & Kurosawa, Y. Development of an artificial antibody system with multiple valency using an Fv fragment fused to a fragment of protein A. J. Biol. Chem. 268, 20668-20675 (1993).
　12. Sui, J. et al. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat. Struc. Mol. Biol. 16, 265-273 (2009).
　13. Ekiert, D.C. et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 324, 246-251 (2009).
　14. Okada, J. et al. Localization of epitopes recognized by monoclonal antibodies that neutralized the H3N2 influenza viruses in man. J. Gen. Virol. 92, 326-335 (2011).
　配列番号１２９：人工配列の説明：primer T7ETZ

Claims (8)

  1. 　被検者由来の生体サンプル中における、VH1-69遺伝子を用いた抗体の存否を指標として、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力を判定する方法。
  2. 　以下のステップ（１）～（３）を含む、請求項１に記載の方法：
    （１）インフルエンザワクチン接種後の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させるステップ；
    （２）生成する免疫複合体を検出するステップ；
    （３）ステップ（２）の検出結果に基づきA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さを判定するステップであって、検出された免疫複合体の量がA型インフルエンザウイルスに対する抵抗力の強さの指標となるステップ。
  3. 　以下のステップを更に含む、請求項２に記載の方法：
    （４）インフルエンザワクチン接種前の被検者の生体サンプルと、VH1-69遺伝子を用いた抗体を認識する抗イディオタイプ抗体とを接触させることにより生成する免疫複合体を検出し、該免疫複合体の量と、ステップ（２）で検出された免疫複合体の量を比較し、比較結果に基づき、抵抗力の強さを判定するステップ。
  4. 　生体サンプルが血液サンプルである、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H3N2型、H5N1型、H5N2型、H6N1型、H7N2型、H7N3型、H7N7型、H7N9型、H9N2型及びH9N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H2N2型、H3N2型及びH5N1型からなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　A型インフルエンザウイルスが、H1N1型、H1N2型、H2N2型、H5N1型及びH5N2型らなる群より選択される一又は二以上のウイルスである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　VH1-69遺伝子を用いた抗体を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体を含む、A型インフルエンザウイルスに対する抵抗力判定用キット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016160620A3 (en) * 2015-03-27 2016-11-10 University Of Southern California Car t-cells for the treatment of b7-h4 expressing solid tumors
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023250415A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against integrin alpha 11 beta 1 and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010502207A (ja) * 2006-09-07 2010-01-28 クルセル ホランド ベー ヴェー インフルエンザウイルスｈ５ｎ１を中和しうるヒト結合性分子およびその使用
WO2012029997A1 (ja) * 2010-09-03 2012-03-08 学校法人藤田学園 抗インフルエンザウイルス中和抗体およびそのスクリーニング方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010502207A (ja) * 2006-09-07 2010-01-28 クルセル ホランド ベー ヴェー インフルエンザウイルスｈ５ｎ１を中和しうるヒト結合性分子およびその使用
WO2012029997A1 (ja) * 2010-09-03 2012-03-08 学校法人藤田学園 抗インフルエンザウイルス中和抗体およびそのスクリーニング方法

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL LINGWOOD ET AL.: "Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies", NATURE, vol. 489, no. 7417, 27 September 2012 (2012-09-27), pages 566 - 570, XP055087997 *
EKIERT, D.C. ET AL.: "Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope", SCIENCE, vol. 324, 2009, pages 246 - 251
FRASER, C. ET AL.: "Pandemic potential of a strain of influenza A (H1N1): early findings", SCIENCE, vol. 324, 2009, pages 1557 - 1561
HANCOCK, K. ET AL.: "Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus", N. ENGL. J. MED., vol. 361, 2009, pages 1945 - 1952
HANCOCK, K. ET AL.: "Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus", N. ENGL.. . MED., vol. 361, 2009, pages 1945 - 1952
ITO, W.; KUROSAWA, Y.: "Development of an artificial antibody system with multiple valency using an Fv fragment fused to a fragment of protein A", J. BIOL. CHEM., vol. 268, 1993, pages 20668 - 20675
JIANHUA SUI ET AL.: "Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses", NAT. STRUC. MOL. BIOL., vol. 16, 2009, pages 265 - 273, XP002538005 *
KNOSSOW, M. ET AL.: "Mechanism of neutralization of onfluenza virus infectivity by antibodies", VIROLOGY, vol. 302, 2002, pages 294 - 298
KYOSUKE NAGATA: "Analysis of the Cellular Gene Product that Confers Resistance to the Virus Infection", THE ASAHI GLASS FOUNDATION JOSEI KENKYU SEIKA HOKOKU, vol. 1995, December 1995 (1995-12-01), pages 283 - 290, XP008182891 *
LI, G.M. ET AL.: "Pandemic H1N1 influenza vaccine induces a recall response in humans that favors broadly cross-reactive memory B cells", PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 109, 2012, pages 9047 - 9052
NOBUKO OHSHIMA ET AL.: "Naturally Occurring Antibodies in Humans Can Neutralize a Variety of Influenza Virus Strains, Including H3, H1, H2, and H5", J. VIROL., vol. 85, no. 21, August 2011 (2011-08-01), pages 11048 - 11057, XP055014225 *
OHSHIMA, N. ET AL.: "Naturally occurring antibodies in humans can neutralize a variety of influenza viral strains, including H3, H1, H2, and H5", J. VIROL., vol. 85, 2011, pages 11048 - 11057
OKADA, J. ET AL.: "Localization of epitopes recognized by monoclonal antibodies that neutralized the H3N2 influenza viruses in man", J. GEN. VIROL., vol. 92, 2011, pages 326 - 335
OKADA, J. ET AL.: "Monoclonal antibodies in man that neutralized H3N2 influenza viruses were classified in to three groups with distinct strain specificity", VIROLOGY, vol. 397, no. 2, 1968, pages 322 - 330 D 1997-2003, XP026888068 *
OKADA, J. ET AL.: "Monoclonal antibodies in man that neutralized H3N2 influenza viruses were classified in to three groups with distinct strain specificity: 1968-1973, 1977-1993 and 1997-2003", VIROLOGY, vol. 397, 2010, pages 322 - 330
OKUNO, Y. ET AL.: "Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 28, 1990, pages 1308 - 13131
OKUNO, Y.; ISEGAWA, Y.; SASAO, F.; UEDA, S. A: "common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus HI and H2 strains", J. VIROL., vol. 67, 1993, pages 2552 - 2558
OKUNO, Y.; ISEGAWA, Y.; SASAO, F.; UEDA, S.: "A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus H1 and H2 strains", J. VIROL., vol. 67, 1993, pages 2552 - 2558
See also references of EP3037819A4 *
SKEHEL, J.J.; WILEY, D.C.: "Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin", ANN. REV. BIOCHEM., vol. 69, 2000, pages 531 - 569
SUI, J. ET AL.: "Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses", NAT. STRUC. MOL. BIOL., vol. 16, 2009, pages 265 - 273
TAIA T. WANG ET AL.: "Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?", NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY, vol. 16, no. 3, March 2009 (2009-03-01), pages 233 - 234, XP009137026 *
WRAMMERT, J. ET AL.: "Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection", J. EXP. MED., vol. 208, 2011, pages 181 - 193

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016160620A3 (en) * 2015-03-27 2016-11-10 University Of Southern California Car t-cells for the treatment of b7-h4 expressing solid tumors
US11136401B2 (en) 2015-03-27 2021-10-05 University Of Southern California Car t-cell therapy directed to LHR for the treatment of solid tumors

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