WO2015025815A1 - ポリロタキサン、及び医薬組成物 - Google Patents

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WO2015025815A1
WO2015025815A1 PCT/JP2014/071553 JP2014071553W WO2015025815A1 WO 2015025815 A1 WO2015025815 A1 WO 2015025815A1 JP 2014071553 W JP2014071553 W JP 2014071553W WO 2015025815 A1 WO2015025815 A1 WO 2015025815A1
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WO
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polyrotaxane
bond
prx
added
disease
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PCT/JP2014/071553
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French (fr)
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篤志 田村
由井　伸彦
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for a disease caused by at least one of abnormal lipid metabolism and abnormal autophagy containing polyrotaxane, and a novel polyrotaxane.
  • lysosomal disease Diseases in which accumulation of lipids, carbohydrates, cholesterol, etc. in lysosomes due to genetic defects or mutations in lysosomes or degrading enzymes of membrane transport proteins are collectively referred to as lysosomal disease.
  • lysosomal diseases In Japan, about 30 types of lysosomal diseases are designated as specific diseases, and it is known that there are few effective treatments.
  • NPC disease which is one of the lysosomal diseases, accumulates cholesterol and lipids in lysosomes due to mutations in NPC1, which is a membrane protein.
  • the NPC disease is an intractable metabolic disease that begins in early childhood, exhibits symptoms such as progressive neuropathy and hepatosplenomegaly, and often dies around 10 years of age.
  • Cyclodextrins are cyclic saccharides and are named ⁇ -cyclodextrin (repetition number 6), ⁇ -cyclodextrin (repetition number 7), and ⁇ -cyclodextrin (repetition number 8) according to the number of sugar repetitions. .
  • Each cyclodextrin is known to include various compounds in the cavity, and in particular, ⁇ -cyclodextrin is known to have an excellent ability to include cholesterol (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • HP- ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin modified with hydroxypropyl group
  • NPC disease-derived cells acts on NPC disease-derived cells to reduce the amount of intracellular cholesterol.
  • HP- ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin modified with hydroxypropyl group
  • Npc1 ⁇ / ⁇ mice administration of HP- ⁇ -CD to Npc1-deficient mice (Npc1 ⁇ / ⁇ mice) has been found to reduce cholesterol accumulation in each tissue and prolong survival (eg, Non-patent document 2).
  • ⁇ -cyclodextrin is attracting attention as a new therapeutic agent for NPC disease because it can reduce cholesterol accumulated in cells.
  • humanitarian use is permitted in the United States, and since the phase I trial for the treatment of NPC disease has been started in 2012, it is considered to be a highly promising drug.
  • cyclodextrin (hereinafter sometimes referred to as “CD”) is a low molecular weight molecule having a molecular weight of about 1,000. Therefore, the half-life in blood is as short as several tens of minutes, resulting in rapid renal excretion after administration. There is a problem that the cell membrane permeability is low, and the cell membrane permeability is low (for example, see Non-Patent Document 3). For this reason, in order to obtain a sufficient therapeutic effect, it is necessary to frequently administer a high concentration of CD (the dose to the Npc1-deficient mouse is 4,000 mg / kg) (for example, see Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 4 since a high concentration of CD shows hemolytic activity and tissue damage, there is a concern that use at a high concentration may cause side effects such as damage to normal tissues (see, for example, Non-Patent Document 4). Therefore, it is considered difficult to obtain a sufficient therapeutic effect non-invasively on humans.
  • lysosomal disease is not only abnormal in metabolism such as lipids but also in autophagy, which is a proteolytic function of cells (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • Autophagy breaks down proteins that are no longer needed in cells or organelles such as mitochondria with lysosomes, but dysfunction of autophagy leads to accumulation of unwanted proteins in the cells.
  • autophagy dysfunction is associated with the pathophysiology of lysosomal disease.
  • NPC disease has been shown to cause autophagosome accumulation in the cytoplasm (see, for example, Non-Patent Document 6).
  • Such autophagosome accumulation suggests that unwanted proteins and organelles that are originally degraded by autolysosomes accumulate in the cytoplasm.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease are known (see, for example, Non-Patent Document 7).
  • the present invention makes it a subject to solve the said various problems and to achieve the following objectives. That is, the present invention is highly safe, has an excellent cholesterol removal action and an excellent autolysosome formation enhancement action, and is a disease caused by at least one of abnormal lipid metabolism and abnormal autophagy. It aims at providing the pharmaceutical composition which has the high therapeutic effect or preventive effect with respect to the above, and the polyrotaxane which can be used suitably for the said pharmaceutical composition.
  • Means for solving the above-described problems are as follows. That is, ⁇ 1> Abnormal lipid metabolism and functional abnormality of autophagy characterized by containing polyrotaxane having bulky substituents via intracellular degradable bonds at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules A pharmaceutical composition for a disease caused by at least one of the above.
  • a polyrotaxane having a bulky substituent via an intracellular degradable bond at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules The linear molecule is a copolymer obtained by polymerizing polyethylene glycol and polypropylene glycol in the order of polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol, and the plurality of cyclic molecules is ⁇ -cyclodextrin, It is.
  • the conventional problems can be solved, the object can be achieved, and there is at least one of high safety, excellent cholesterol removing action and excellent autolysosome formation enhancing action. Further, it is possible to provide a pharmaceutical composition having a high therapeutic effect or preventive effect on a disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction, and a polyrotaxane that can be suitably used for the pharmaceutical composition. .
  • FIG. 1 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Production Example 1.
  • Horizontal axis: ppm unit. 2 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Production Example 2.
  • FIG. Horizontal axis: ppm unit. 3 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Comparative Production Example 1.
  • FIG. 4 is a chart of proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Production Example 3.
  • Horizontal axis ppm unit.
  • FIG. 5 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Production Example 4.
  • Horizontal axis ppm unit.
  • FIG. 6 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane obtained in Production Example 5.
  • Horizontal axis ppm unit.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the hemolysis test of Test Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the hemolysis test of Test Example 1.
  • FIG. 8A is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and no sample was added in Test Example 2.
  • FIG. 8B is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and HP- ⁇ -CD was added as a sample in Test Example 2.
  • FIG. 8C is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and DM- ⁇ -CD was added as a sample in Test Example 2.
  • FIG. 8D is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts are used as cells and HE-SS-PRX is added as a sample in Test Example 2.
  • FIG. 8A is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and no sample was added in Test Example 2.
  • FIG. 8B is a diagram showing the results when Niemann-
  • FIG. 8E is a graph showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and HE-ace-PRX was added as a sample in Test Example 2.
  • FIG. 8F is a diagram showing the results when Niemann-Pick disease type C patient-derived skin fibroblasts were used as cells and HE-PRX was added as a sample in Test Example 2.
  • FIG. 8G is a diagram showing a result in a case where healthy subject-derived skin fibroblasts were used as cells and no sample was added in Test Example 2.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of quantification of the amount of accumulated cholesterol in the cells of Test Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of cytotoxicity evaluation of Test Example 3.
  • FIG. 11A is a fluorescence microscope image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HP- ⁇ -CD, right side: anti-EEA1 antibody).
  • FIG. 11B is a diagram showing a fluorescence microscope image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HE-SS-PRX, right side: anti-EEA1 antibody).
  • FIG. 11C is a view showing a fluorescence microscopic image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HP- ⁇ -CD, right side: anti-CD63 antibody).
  • FIG. 11D is a diagram showing a fluorescent microscope image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HE-SS-PRX, right side: anti-CD63 antibody).
  • FIG. 11E shows a fluorescence microscopic image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HP- ⁇ -CD, right side: anti-LAMP1 antibody).
  • FIG. 11F shows a fluorescence microscopic image of Test Example 4 (left side: FITC-labeled HE-SS-PRX, right side: anti-LAMP1 antibody).
  • FIG. 12 is a graph showing the results of determining the colocalization rate of FITC-labeled HP- ⁇ -CD and FITC-labeled HE-PRX for EEA1, CD63, or LAMP1-positive vesicles of Test Example 4.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of the cholesterol removing action of Test Example 5.
  • FIG. 14 is a graph showing the result of the cholesterol removing action of Test Example 6.
  • FIG. 15A is a graph showing the results of the cholesterol removing action of Test Example 7-1.
  • FIG. 15B is a graph showing the results of flow cytometry in Test Example 7-2.
  • FIG. 16A is a diagram showing an LC3-stained image of NHDF (no sample added) in Test Example 8.
  • FIG. 16B is a diagram showing an LC3-stained image of NPC1 (no sample added) in Test Example 8.
  • FIG. 16C is a diagram showing an LC3-stained image of NPC1 (with HP- ⁇ -CD added) in Test Example 8.
  • FIG. 16D is a diagram showing an LC3-stained image of NPC1 (with HEE-SS-PRX added) in Test Example 8.
  • FIG. 16E is a graph showing the results of quantifying the number of LC3-positive vesicles in cells of Test Example 8.
  • FIG. 17A is a diagram showing the results of Western blotting of NHDF and NPC1 in Test Example 9.
  • FIG. 17B is a graph showing the relative expression level of LC3-II in NHDF and NPC1 of Test Example 9.
  • FIG. 17C is a graph showing the relative expression level of p62 in NHDF and NPC1 of Test Example 9.
  • FIG. 17D shows the results of Western blotting of NHDF, NPC2 mutant NPC disease-derived skin fibroblasts, Fabry disease patient-derived skin fibroblasts, and GM1 gangliosidosis patient-derived skin fibroblasts of Test Example 9 It is.
  • FIG. 17E shows the relative expression level of LC3-II in NHDF, NPC2 mutant NPC disease patient skin fibroblasts, Fabry disease patient skin fibroblasts, and GM1 gangliosidosis patient skin fibroblasts of Test Example 9 It is a graph which shows. 18A is a diagram showing a fluorescence microscopic image of each cell in Test Example 10.
  • FIG. 10 is a diagram showing a fluorescence microscopic image of each cell in Test Example 10.
  • FIG. 18B is a graph showing the results of analyzing the number of autophagosomes and the number of autolysosomes in each cell of Test Example 10.
  • FIG. 19A is a diagram showing a microscopic image of each cell in Test Example 11.
  • FIG. 19B is a graph showing the results of determining the colocalization rate between mRFP-LC3 and anti-LAMP1 antibody in each cell of Test Example 11.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition for a disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains at least a polyrotaxane, and further contains other components as necessary.
  • the polyrotaxane is not particularly limited as long as it has bulky substituents via intracellular degradable bonds at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules, and is appropriately selected according to the purpose. be able to.
  • the said polyrotaxane may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the number average molecular weight of the polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably about 20,000 to 100,000.
  • the linear molecule penetrates a plurality of cyclic molecules, has an intracellular degradable bond at both ends, and binds to a bulky substituent through the intracellular degradable bond.
  • the linear molecule is not particularly limited as long as it penetrates the cavity of a plurality of cyclic molecules and can maintain the state, and has an intracellular degradable bond at both ends. It can be appropriately selected depending on the case.
  • a constitution of a known polyrotaxane can be appropriately selected.
  • polyethylene glycol, polypropylene glycol, a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, polymethyl vinyl ether, polyethylene Examples include imines and polyamino acids.
  • imines and polyamino acids There is no restriction
  • the configuration other than both ends of the linear molecule is preferably selected as appropriate according to the combination with the cyclic molecule described later.
  • the cyclic molecule when it is ⁇ -cyclodextrin, it may be polyethylene glycol.
  • the cyclic molecule when it is ⁇ -cyclodextrin, it is preferable to use polypropylene glycol or a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol.
  • the copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol is preferably a copolymer obtained by polymerizing polyethylene glycol and polypropylene glycol in the order of polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the number average molecular weight of the polyethylene glycol moiety in the copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the number average molecular weight may be 500 to 10,000.
  • the number average molecular weight of the polypropylene glycol moiety in the polyethylene glycol / polypropylene glycol copolymer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it may be 500 to 5,000. Can do.
  • Specific examples of the copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol include Pluronic.
  • the intracellular degradable bond is not particularly limited as long as it is a bond that is degraded intracellularly, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • an acetal bond, a ketal bond, a disulfide bond, an ester bond examples thereof include an ortho ester bond, a vinyl ether bond, a hydrazide bond, and an amide bond.
  • an acetal bond, a ketal bond, a disulfide bond, an ester bond, an orthoester bond, a vinyl ether bond, and a hydrazide bond are preferable, and a disulfide bond is more preferable because it is excellent in selective degradation in cells.
  • These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the method for forming the intracellular degradable bond to the linear molecule is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • a known method can be appropriately selected.
  • cyclic molecule There is no restriction
  • the cyclodextrin is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin. Among these, ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin are preferable, and ⁇ -cyclodextrin is more preferable from the viewpoint of excellent cholesterol inclusion ability.
  • the number of the cyclic molecules per molecule of the polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5 to 200 on average.
  • the cyclic molecule may or may not be modified with a substituent, but is preferably modified with a substituent in order to increase the water solubility of the polyrotaxane.
  • the position to be modified is not particularly limited as long as the water solubility of the polyrotaxane can be increased, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the hydroxyl group is modified. It is preferable.
  • the substituent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include hydroxyethyl group, hydroxypropyl group, hydroxybutyl group, hydroxyethoxyethyl group, methyl group, N, N-dimethylamino. Examples thereof include water-soluble polymers such as ethyl groups (sometimes referred to as “DMAE” groups), carboxyl groups, primary amino groups, or polyethylene glycol, and peptide molecules. Among these, a DMAE group is preferable in that the efficiency of polyrotaxane incorporation into cells can be increased.
  • the modification of the hydroxyl group may be directly modified with the substituent or may be modified through a linker.
  • the linker is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a carbamate ester bond (—O—CO—NH—), an ester bond (—O—CO—), a carbonate bond ( -O-CO-O-), ether bond (-O-) and the like.
  • the number of modifications of the substituent per molecule of the polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 10 to 400 on average.
  • the bulky substituent is not particularly limited as long as it can prevent the elimination of the plurality of cyclic molecules by capping both ends of the linear molecule, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • amino acids or derivatives thereof, oligopeptides, fluorescent molecules and the like can be mentioned.
  • N-tritylglycine is preferable from the viewpoint of hydrolysis resistance under physiological conditions.
  • the method for bonding the bulky substituent to the linear molecule is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • the polyrotaxane in the pharmaceutical composition is preferably the polyrotaxane of the present invention.
  • the polyrotaxane according to the present invention is a polyrotaxane having bulky substituents via intracellular degradable bonds at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules, and the linear molecule includes polyethylene glycol and polypropylene.
  • Glycol is a copolymer obtained by polymerizing polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol in this order, and the plurality of cyclic molecules are ⁇ -cyclodextrin.
  • the cyclic molecule, the linear molecule, the intracellular degradable bond and the bulky substituent in the linear molecule can be the same as those described in the item of polyrotaxane in the pharmaceutical composition, and the preferred embodiments are also included. It is the same.
  • a polyrotaxane represented by the following structural formula (1) As a more preferable aspect of the polyrotaxane of the present invention, a polyrotaxane represented by the following structural formula (1), a polyrotaxane represented by the following structural formula (2), a polyrotaxane represented by the following structural formula (4), and the following structural formula Examples include polyrotaxane represented by (5) and polyrotaxane represented by the following structural formula (6).
  • the polyrotaxane linear molecule represented by the structural formula (1), (2), (4), (5), or (6) includes polyethylene glycol and polypropylene glycol, polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the cyclic molecule is ⁇ -cyclodextrin, and the bulky substituent is N-tritylglycine.
  • the intracellular degradable bond in the linear molecule of the polyrotaxane represented by the structural formulas (1), (5), and (6) is a disulfide bond
  • the polyrotaxane line represented by the structural formula (2) The intracellular degradable bond in the molecular molecule is an acetal bond
  • the intracellular degradable bond in the linear molecule of the polyrotaxane represented by the structural formula (4) is an ester bond.
  • m represents the number of repeating units of polypropylene glycol (hereinafter sometimes referred to as “monomer”).
  • monomer polypropylene glycol
  • ⁇ -CD is represented by the following formula (A), and in the structural formulas (1), (2), and (4), 1 Only one is listed.
  • ⁇ -CD is represented by the following formula (B), and only one is shown in the structural formula (5).
  • ⁇ -CD is represented by the following formula (C), and only one is shown in the structural formula (6).
  • the primary hydroxyl group of ⁇ -cyclodextrin is modified with a hydroxyethyl group via a carbamate (—O—CO—NH—)
  • the primary hydroxyl group of ⁇ -cyclodextrin is modified with an N, N-dimethylaminoethyl group via a carbamate (—O—CO—NH—).
  • ⁇ -cyclodextrin Primary hydroxyl group is modified with a hydroxyethoxyethyl group via a carbamate (—O—CO—NH—).
  • the number average molecular weights of the linear molecules in the polyrotaxane represented by the structural formulas (1), (2), (4), (5), and (6) are 1,100 for the polyethylene glycol moiety,
  • the polypropylene glycol moiety is 4,200.
  • the number of penetrating cyclic molecules in the polyrotaxane represented by the structural formula (1) is 12.9 on average per polyrotaxane molecule.
  • the number of penetrating cyclic molecules in the polyrotaxane represented by the structural formula (2) is 12.9 on average per polyrotaxane molecule.
  • the number of penetrating cyclic molecules in the polyrotaxane represented by the structural formula (4) is 11.7 on average per polyrotaxane molecule.
  • the number of penetrating cyclic molecules in the polyrotaxane represented by the structural formula (5) is 12.9 on average per polyrotaxane molecule.
  • the number of penetrating cyclic molecules in the polyrotaxane represented by the structural formula (6) is 16.1 on average per polyrotaxane molecule.
  • the number of modifications of the hydroxyethyl group in the polyrotaxane represented by the structural formula (1) is an average of 53.4 per molecule of polyrotaxane.
  • the number of modifications of the hydroxyethyl group in the polyrotaxane represented by the structural formula (2) is an average of 66.9 per molecule of polyrotaxane.
  • the number of modifications of the hydroxyethyl group in the polyrotaxane represented by the structural formula (4) is an average of 65.9 per molecule of polyrotaxane.
  • the number of modifications of the N, N-dimethylaminoethyl group in the polyrotaxane represented by the structural formula (5) is an average of 65.3 per molecule of polyrotaxane.
  • the number of modifications of the hydroxyethoxyethyl group in the polyrotaxane represented by the structural formula (6) is an average of 64.7 per molecule of polyrotaxane.
  • the polyrotaxane represented by the structural formula (1) can be preferably produced by the method of Production Example 1 described later, and the polyrotaxane represented by the structural formula (2) is produced by the method of Production Example 2 described later.
  • the polyrotaxane represented by the structural formula (4) can be suitably produced by the method of Production Example 3 described later, and the polyrotaxane represented by the structural formula (5) is It can be suitably produced by the method of Production Example 4 to be described later, and the polyrotaxane represented by the structural formula (6) can be suitably produced by the method of Production Example 5 to be described later.
  • the produced polyrotaxane has a structure represented by the structural formula (1), (2), (4), (5), or (6) is confirmed by various analytical methods selected as appropriate. For example, it can be confirmed by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy.
  • the proton nuclear magnetic resonance spectrum chart at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane represented by the structural formula (1) is as shown in FIG. 1 and represented by the structural formula (2).
  • the proton nuclear magnetic resonance spectrum chart at 500 MHz, measured in polyrotaxane deuterated dimethyl sulfoxide, is as shown in FIG. 2 and measured in polyrotaxane deuterated dimethyl sulfoxide represented by the structural formula (4).
  • the chart of the proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz is as shown in FIG. 4.
  • the chart of the proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in deuterated dimethyl sulfoxide of the polyrotaxane represented by the structural formula (5) is As shown in FIG. Ri, heavy dimethylsulfoxide was measured in de, proton nuclear magnetic resonance spectrum of 500MHz chart polyrotaxane represented by the structural formula (6) is as shown in FIG.
  • the measurement value obtained by the analysis method may have some errors.
  • the polyrotaxane is represented by the structural formula (1), (2), (4), (5), or Having the structure represented by (6) can be easily identified.
  • the content of the polyrotaxane in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the pharmaceutical composition may be the polyrotaxane itself.
  • the disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction may be a disease caused solely by lipid metabolism dysfunction, or may be a disease caused solely by autophagy dysfunction, It may be a disease caused by both.
  • ⁇ Diseases caused by abnormal lipid metabolism Examples of the disease caused by abnormal lipid metabolism include lysosomal disease.
  • the lysosomal disease is also a disease caused by autophagy dysfunction causing autophagosome accumulation.
  • lysosomal disease Specific examples include Gaucher disease (Gaucher disease), Niemann-Pick disease type A (Niemann-Pick disease type A), Niemann-Pick disease type B (Niemann-Pick disease type B), and Niemann-Pick disease.
  • Type C (Niemann-Pick disease type C), GM1 gangliosidosis, GM2 gangliosidosis (sometimes referred to as “Tay-Sachs Sandhoff type AB”), Krabbe disease (Krabe's disease), metachromatic leukodystrophy Multiple sulphafase deficiency (Multisulfatese deficiency), Farber disease (Farber disease), mucopolysaccharidosis type I, mucopolysaccharidosis type II (sometimes referred to as “Hunter's disease”), mucopolysaccharidosis type III (Sometimes referred to as "Sanfiliposis”), mucopolysaccharide Type IV, mucopolysaccharidosis type VI (sometimes referred to as “Maloto Lamy's disease”), mucopolysaccharidosis type VII (sometimes referred to as “Sly disease”), mucopolysaccharidosis type IX (“Hy
  • diseases caused by abnormal autophagy function include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease. These are diseases that cause autophagosome accumulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be suitably used for lysosomal disease.
  • Gaucher disease Neiman-Pick disease type A, Neiman-Pick disease type B, Neiman-Pick disease type C, GM1 gangliosidosis, GM2 It can be suitably used for gangliosidosis, Faber disease, Wolman disease, and Fabry disease, and can be suitably used for Niemann-Pick disease type C.
  • the other components are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples thereof include pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically acceptable carriers There is no restriction
  • content of the said other component in the pharmaceutical composition of this invention According to the objective, it can select suitably.
  • ⁇ Dosage form> There is no restriction
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, an isotonic agent, a local anesthetic, etc. are added to the polyrotaxane, and subcutaneous, intramuscular, intravenous, etc. are added by a conventional method.
  • Injectables can be produced.
  • the pH adjusting agent and the buffering agent include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • administering There is no restriction
  • local administration includes intracerebroventricular administration.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include humans, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs and cats.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the dosage form, the age and weight of the administration subject, the degree of desired effect, and the like.
  • the frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, and the like of the administration target.
  • the polyrotaxane contained in the pharmaceutical composition of the present invention occupies the cavity of the cyclic molecule until it is broken down in the cell, nonspecific inclusion of hemolysis and hydrophobic biomolecules is not It is thought that it is not shown and is considered safer. Further, when the polyrotaxane reaches the inside of the cell, the terminal intracellular degradable bond is cleaved, and a large number of cyclic molecules are gradually released to act as a cholesterol removing agent. Therefore, it is expected that cholesterol is removed and the action is sustained.
  • the polyrotaxane skeleton has a high molecular weight with a number average molecular weight of about 20,000 to 100,000, for example, it is difficult to receive renal excretion after intravenous administration, and the blood half-life is considered to be longer than that of cyclodextrin alone. . Therefore, it is thought that it leads to reduction of dosage and the frequency
  • the polyrotaxane contained in the pharmaceutical composition of the present invention has low cytotoxicity and can remove cholesterol at a low concentration.
  • the polyrotaxane contained in the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent autolysosome formation enhancing action.
  • the polyrotaxane contained in the pharmaceutical composition of the present invention and the polyrotaxane of the present invention can also be used as an intracellular cholesterol remover and an autolysosome formation enhancer.
  • the pharmaceutical composition When administered to an individual, the pharmaceutical composition enhances the removal of cholesterol in the cell or the formation of autolysosomes, and prevents or treats a disease caused by at least one of abnormal lipid metabolism and abnormal autophagy. be able to. Therefore, the present invention also relates to a method for preventing or treating a disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction characterized by administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • Pluronic P123 (manufactured by Sigma-Aldrich; polyethylene glycol (hereinafter sometimes referred to as “PEG”) and polypropylene glycol (hereinafter sometimes referred to as “PPG”) are linear molecules.
  • 20 g of Pluronic P123 and 10.2 g of 1,1′-carbonyldiimidazole (manufactured by Sigma-Aldrich) were weighed and added to the eggplant type flask.
  • a pseudopolyrotaxane was prepared as follows. 12 g of the ⁇ -CD was weighed and added to a wide-mouth bottle, and dissolved in 600 mL of a phosphate buffer solution. 1 g of P123-SS-NH 2 was weighed and dissolved in a small amount of ultrapure water. P123-SS-NH 2 aqueous solution was added to the ⁇ -CD solution and stirred at room temperature for 24 hours. After the reaction, the resulting precipitate was collected by centrifugation. The recovered solid was freeze-dried to obtain a pseudopolyrotaxane.
  • HE Hydroxyethyl
  • HE-SS-PRX water-soluble polyrotaxane-1
  • FIG. 1 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart measured at 500 MHz for HE-SS-PRX measured in deuterated dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich). From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that HE-SS-PRX had a structure represented by the following structural formula (1).
  • “m” represents the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (1), three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses, and therefore “m” / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • the P123-CI solution was added dropwise to the eggplant-shaped flask and stirred at room temperature for 24 hours. After the reaction, it was added to a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 1,000 and dialyzed against methanol to remove unreacted substances. By concentrating with a rotary evaporator, 7.0 g of P123 having a cyclic acetal bond at both ends (hereinafter sometimes referred to as “P123-ace-NH 2 ”) was obtained.
  • a pseudopolyrotaxane was prepared in the same manner as in Production Example 1 except that P123-ace-NH 2 was used. By capping both ends of the pseudopolyrotaxane with N-tritylglycine in the same manner as in Production Example 1, acetal bonds that are degraded intracellularly are formed at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of ⁇ -CDs. Thus, a polyrotaxane having a bulky substituent was obtained.
  • HE-ace-PRX water-soluble polyrotaxane-2
  • FIG. 2 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart measured at 500 MHz for the HE-ace-PRX in heavy dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich). From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that HE-ace-PRX has a structure represented by the following structural formula (2).
  • “m” indicates the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (2), since three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses, “m” / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • ⁇ -CD is represented by the above formula (A), and only one is shown in the structural formula (2).
  • P123-NH 2 P123 having a primary amino group at both ends
  • a pseudopolyrotaxane was prepared in the same manner as in Production Example 1 except that P123-NH 2 was used. By capping both ends of the pseudopolyrotaxane with N-tritylglycine in the same manner as in Production Example 1, both ends of a linear molecule having no intracellular degradable bond penetrating a plurality of ⁇ -CDs are used. A polyrotaxane having a bulky substituent was obtained. An HE group was introduced into ⁇ -CD of the polyrotaxane in the same manner as in Production Example 1 to obtain a water-soluble polyrotaxane-3 (hereinafter sometimes referred to as “HE-PRX”) (per polyrotaxane molecule). The average number of penetrating ⁇ -CDs was 11.3, and the average number of HE group modifications was 65.3.)
  • FIG. 3 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart at 500 MHz measured for HE-PRX in deuterated dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich). From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that HE-PRX had a structure represented by the following structural formula (3).
  • “m” indicates the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (3), three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses, and therefore “m” / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • ⁇ -CD is represented by the above formula (A), and only one is shown in the structural formula (3).
  • a pseudopolyrotaxane was prepared in the same manner as in Production Example 1 except that P123-COO-NH 2 was used. By capping both ends of the pseudopolyrotaxane with N-tritylglycine in the same manner as in Production Example 1, ester bonds that are degraded intracellularly are formed at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of ⁇ -CDs. Thus, a polyrotaxane having a bulky substituent was obtained.
  • HE-COO-PRX water-soluble polyrotaxane-2
  • FIG. 4 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of HE-COO-PRX measured in deuterated dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich) at 500 MHz. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that HE-COO-PRX had a structure represented by the following structural formula (4).
  • “m” indicates the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (4), since three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses, “m” / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • ⁇ -CD is represented by the formula (A), and only one is shown in the structural formula (4).
  • the recovered aqueous solution was freeze-dried to obtain 104.7 mg of polyrotaxane (DMAE-SS-PRX) having a disulfide bond introduced at the end, into which an N, N-dimethylaminoethyl group was introduced.
  • DMAE-SS-PRX polyrotaxane
  • FIG. 5 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of DMAE-SS-PRX measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich). From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that DMAE-SS-PRX had a structure represented by the following structural formula (5).
  • “m” indicates the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (5), three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses. / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • the recovered aqueous solution was lyophilized to obtain 237.6 mg of polyrotaxane (HEE-SS-PRX) having a disulfide bond introduced at the end, into which a hydroxyethoxyethyl group was introduced.
  • FIG. 6 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart measured at 500 MHz for the HEE-SS-PRX measured in deuterated dimethyl sulfoxide (manufactured by Sigma-Aldrich). From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that HEE-SS-PRX has a structure represented by the following structural formula (6).
  • “m” represents the number of repeating units of polypropylene glycol (in the structural formula (6), three repeating units of polypropylene glycol are described in parentheses. / 3 "),” n "indicates the number of polyethylene glycol repeating units.
  • Test Example 1 Hemolysis test
  • PBS phosphate buffered saline
  • rat erythrocytes obtained from Kojin Bio, 1 ⁇ 10 8 cells
  • each concentration as the concentration of cyclodextrin
  • the following samples were contacted at 37 ° C. for 2 hours. Red blood cells were precipitated by centrifugation, and 100 ⁇ L of the supernatant was collected and added to a 96-well plate (BD Falcon). The absorbance of the supernatant at 544 nm was measured with a microplate reader ARVO-MX (Perkin Elmer).
  • ⁇ indicates the result of “DM- ⁇ -CD”
  • ⁇ indicates the result of “HP- ⁇ -CD”
  • ⁇ indicates the result of “HE-PRX”
  • ⁇ indicates the result of “HE-ace-PRX”
  • ⁇ indicates the result of “HE-SS-PRX”.
  • polyrotaxane does not exhibit membrane damage due to the hydrophobic cavity because the polymer chain occupies the cavity of cyclodextrin. From this result, it is considered that polyrotaxane is safer than cyclodextrin from the viewpoint of hemolysis.
  • NPC1 Neiman-Pick disease type C skin fibroblasts
  • NPC1 cells obtained from Coriell Institute, No. GM03123
  • intracellular cholesterol accumulation was examined as follows.
  • the NPC1 was seeded in a 24-well plate (number of cells: 2.5 ⁇ 10 4 cells / well), cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then the following sample was added at 100 ⁇ M in terms of cyclodextrin concentration, and further at 37 ° C. Cultured for 24 hours.
  • the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution, a PBS solution of Philippines (manufactured by Polysciences) prepared to 100 ⁇ g / mL was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 45 minutes. After washing with PBS three times, the localization of cholesterol was observed with a confocal laser scanning microscope FluoView FV10i (Olympus). In addition, the amount of intracellular cholesterol accumulation was quantified. The amount of accumulated cholesterol in the cells was quantified as follows.
  • a cell lysate prepared by lysing the cultured cells is prepared, and cholesterol is quantified using Amplex Red Cholesterol Assay Kit (manufactured by Invitrogen). Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) The total protein amount was quantified. The total amount of cholesterol in the cells was expressed as the total cholesterol amount (nmol) / total protein amount (mg). For comparison, the same test was performed when the NHDF was used and the sample was not administered, and when the NPC1 was used and the sample was not administered.
  • FIGS. 8A to 8G The observation results of intracellular cholesterol using a confocal microscope are shown in FIGS. 8A to 8G, and the quantification results of the amount of intracellular cholesterol accumulation are shown in FIG.
  • FIG. 8A shows the results when NPC1 is used as a cell and no sample is added
  • FIG. 8B shows the results when NPC1 is used as a cell and HP- ⁇ -CD is added as a sample. Shows the results when NPC1 is used as the cell and DM- ⁇ -CD is added as the sample.
  • FIG. 8D shows the results when NPC1 is used as the cell and HE-SS-PRX is added as the sample.
  • FIG. 8E shows the results when NPC1 is used as a cell and HE-ace-PRX is added as a sample.
  • FIG. 8A shows the results when NPC1 is used as a cell and no sample is added
  • FIG. 8B shows the results when NPC1 is used as a cell and HP- ⁇ -CD is added as
  • FIG. 8F shows the results when NPC1 is used as a cell and HE-PRX is added as a sample.
  • FIG. 8G shows the results when NHDF was used as the cells and no sample was added. In each image, the portion shown in white represents cholesterol. The amount of each sample added is 100 ⁇ M in terms of cyclodextrin concentration. In FIG.
  • HP- ⁇ -CD currently in clinical trials had a low cholesterol removal rate at this test concentration, but DM- ⁇ -CD, which has the highest cholesterol inclusion ability among the existing reagents. It was revealed that cholesterol could be removed more than HP- ⁇ -CD.
  • DM- ⁇ -CD which has the highest cholesterol inclusion ability among the existing reagents.
  • cholesterol could be removed more than HP- ⁇ -CD.
  • NPC1 cells treated with HE-ace-PRX or DMAE-ace-PRX having intracellular degradable bonds cholesterol can be removed more than with HP- ⁇ -CD and DM- ⁇ -CD. It was also clarified that cholesterol was removed from the HE-PRX having no intracellular degradable bond, and that the effect was very high.
  • NPC1 cytotoxicity of polyrotaxane and cyclodextrin derivatives was examined as follows.
  • the NPC1 cells were seeded in a 96-well plate (number of cells: 1 ⁇ 10 4 cells / well) in Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Gibco) for 24 hours. Cultured at 37 ° C. After exchanging the medium with 90 ⁇ L Dulbecco's modified Eagle medium, the following samples were added to each well in a concentration range of 0.1 mM to 20 mM in terms of cyclodextrin concentration, and further cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • HE-SS-PRX produced in Production Example 1
  • HE-PRX produced in Comparative Production Example 1
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Sigma-Aldrich
  • DM- ⁇ -CD DM- ⁇ -CD
  • polyrotaxane does not show membrane damage to cells because the polymer chain occupies the cavity of cyclodextrin. From this result, it is considered that polyrotaxane is safer than cyclodextrin from the viewpoint of cytotoxicity.
  • FITC-labeled HE-SS modified with fluorescein isothiocyanate ethylenediamine (FITC-EDA) used as a sample in order to clarify the localization of polyrotaxane and cyclodextrin derivatives when contacted with NPC1 (hereinafter referred to as “FITC-labeled HE-SS”) -PRX ”) and HP- ⁇ -CD (hereinafter referred to as" FITC-labeled HP- ⁇ -CD ”) were prepared as follows.
  • FITC-EDA was removed by dialysis against ultrapure water in addition to a dialysis membrane having a molecular weight cutoff of 3,500 (manufactured by Spectra).
  • the recovered aqueous solution was freeze-dried to obtain 13.2 mg of FITC-labeled HE-SS-PRX.
  • the modification number of FITC was calculated from the absorbance at 494 nm using an ultraviolet-visible spectrophotometer, and it was confirmed that 0.04 molecule of FITC was modified with respect to one ⁇ -CD molecule in the polyrotaxane.
  • FITC-HP- ⁇ -CD FITC-modified HP- ⁇ -CD
  • the modification number of FITC was the same as described above. Unmodified HP- ⁇ -CD and FITC-HP- ⁇ -CD were mixed and adjusted so that the number of FITC modifications per molecule of HP- ⁇ -CD was 0.04.
  • NPC1 was seeded in a 35 mm glass bottom dish (manufactured by IWAKI) (cell number: 1 ⁇ 10 4 cells / dish) and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C. for 24 hours. After exchanging the medium with 900 ⁇ L Dulbecco's modified Eagle medium, 100 ⁇ L of the sample adjusted to 5 mM in terms of cyclodextrin concentration was added to each dish, and further cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the cells were washed twice with a phosphate buffer solution, 1 mL of 4% paraformaldehyde solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes to fix the cells. After the cells were washed twice with a phosphate buffer solution, 1 mL of 0.1% Triron X-100 was added, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes to permeabilize the cell membrane.
  • a mouse monoclonal anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody (BD Bioscience) diluted with a phosphate buffer solution containing 1% bovine serum albumin (mouse monoclonal anti-CD63 antibody) BioLegend) and mouse monoclonal anti-lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1) antibody (manufactured by Santa Cruz) were added to each dish and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the colocalization ratio of FITC-labeled HP- ⁇ -CD and FITC-labeled HE-PRX to EEA1, CD63, or LAMP1-positive vesicles was calculated from the images of FIGS. 11A to 11F. The results are shown in FIG. In the calculation, the colocalization rate for EEA1, CD63, or LAMP1-positive vesicles was determined for 20 cells, and the average value and standard error were calculated.
  • FITC-labeled HP- ⁇ -CD is less localized in early endosomes (EEA1-positive vesicles), late endosomes (CD63-positive vesicles), and lysosomes (LAMP1-positive vesicles), Most of them were observed to be localized near the cell membrane. This is presumably because the ⁇ -CD cavity interacts with lipids and cholesterol in the cell membrane. This result is consistent with the above-mentioned results that ⁇ -CD interacts strongly with the cell membrane and exhibits membrane damage and hemolysis.
  • FITC-labeled HE-PRX was localized in late endosomes (CD63 positive vesicles) or lysosomes (LAMP1 positive vesicles). It is considered that polyrotaxane was taken into cells by endocytosis and reached late endosomes and lysosomes. Polyrotaxane has no effect on the cell membrane because the cavity of ⁇ -CD is occupied by a polymer chain, and as a result, it is expected to be taken into cells by endocytosis. From the above results, it has been clarified that FITC-labeled HP- ⁇ -CD and FITC-labeled HE-SS-PRX have greatly different localization and action sites on cells.
  • NPC1 Cholesterol removing action
  • BD Falcon cell number: 2.5 ⁇ 10 4 cells / dish
  • Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum for 24 hours at 37 ° C. did.
  • 30 ⁇ L of the following sample adjusted to 0.01 to 100 mM in terms of cyclodextrin concentration was added to each well and further cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the cells were washed twice with a phosphate buffer solution, and a 0.25% trypsin-EDTA solution (Gibco) was added to each well to detach the cells.
  • Cells were collected in 1.5 mL tubes and washed twice with phosphate buffer solution. Thereafter, a cell lysis solution (containing 50 mM phosphate buffer solution, 500 mM sodium chloride, 25 mM cholic acid, 0.5% Triton X-100) was added to each tube to lyse the cells.
  • total cholesterol was quantified by Amplex Red Cholesterol Assay Kit (manufactured by Invitrogen), and the total protein amount was quantified by micro BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the total amount of cholesterol in the cells was expressed as the total cholesterol amount (nmol) / total protein amount (mg).
  • the same test was performed when the NHDF was used and the sample was not administered, and when the NPC1 was used and the sample was not administered.
  • HE-SS-PRX produced in Production Example 1
  • HE-PRX produced in Comparative Production Example 1
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Sigma-Aldrich
  • DM- ⁇ -CD Sigma-Aldrich
  • HE-SS-PRX having intracellular degradable bonds can remove cholesterol from NPC1 at a concentration of 1/10 to 1/100 compared with existing ⁇ -CD derivatives. Became clear.
  • non-degradable HE-PRX did not show significant cholesterol reduction in this experimental concentration range. This result is considered that the cleavage of the degradable bond in the polyrotaxane in the cell and the accompanying release of ⁇ -CD resulted in cholesterol removal at a low concentration.
  • Test Example 6 Cholesterol removing action
  • HE-PRX produced in Comparative Production Example 1
  • HE-ace-PRX produced in Production Example 2
  • HE-COO-PRX produced in Production Example 3
  • HE-SS-PRX produced in Production Example 1
  • polyrotaxane having a disulfide bond has a high cholesterol removing action. It is considered that the difference in the cholesterol removing action by the degradable binding species in the polyrotaxane is related to the degradation efficiency of the degradable binding in the cell.
  • Test Example 7-1 Cholesterol removing action
  • Test Example 5 A test was conducted in the same manner as in Test Example 5 except that the following materials were used as samples, and the effect of the type of functional group introduced into the cyclodextrin of polyrotaxane on the cholesterol removal action from NPC1 was examined.
  • HE-SS-PRX produced in Production Example 1
  • DMAE-SS-PRX produced in Production Example 4
  • FITC-labeled HE-SS-PRX used as a sample
  • DMAE-SS-PRX modified with fluorescein isothiocyanate ethylenediamine (FITC-EDA) hereinafter referred to as “FITC-labeled DMAE-SS-”
  • PRX fluorescein isothiocyanate ethylenediamine
  • the recovered aqueous solution was lyophilized to obtain 27.5 mg of FITC-labeled DMAE-SS-PRX.
  • the modification number of FITC was calculated from the absorbance at 494 nm using an ultraviolet-visible spectrophotometer. Unlabeled DMAE-SS-PRX and FITC-DMAE-SS-PRX were mixed and adjusted so that the FITC modification number for one molecule of ⁇ -CD on DMAE-SS-PRX was 0.04 molecule.
  • NPC1 was seeded on a 24-well plate (BD Falcon) (cell number: 1 ⁇ 10 5 cells / dish) and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C. for 24 hours. After exchanging the medium with 270 ⁇ L Dulbecco's modified Eagle medium, 30 ⁇ L of the following sample adjusted to 0.25 mM in terms of cyclodextrin concentration was added to each well and further cultured at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, the cells were washed twice with a phosphate buffer solution, and a 0.25% trypsin-EDTA solution (Gibco) was added to each well to detach the cells.
  • BD Falcon cell number: 1 ⁇ 10 5 cells / dish
  • Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C. for 24 hours. After exchanging the medium with 270 ⁇ L Dulbecco's modified Eagle medium, 30
  • Cells were collected in 1.5 mL tubes and washed twice with phosphate buffer solution. Thereafter, a phosphate buffer solution containing 0.1% bovine serum albumin was added, followed by filtration with a 35 ⁇ m cell strainer (manufactured by BD Falcon). The fluorescence intensity of the cells was determined by FACSCanto II (manufactured by BD Bioscience). The number of 10,000 cells was counted, and the average value is shown in FIG. 15B.
  • FITC-labeled DMAE-SS-PRX was found to be 22% of FITC-labeled HE-SS-PRX.
  • HE-SS-PRX indicates the result of FITC-labeled HE-SS-PRX
  • DMAE-SS-PRX indicates that of FITC-labeled DMAE-SS-PRX. Results are shown). From this result, it is considered that DMAE-SS-PRX is efficiently taken up by cells, so that cholesterol can be removed from NPC1 at a lower concentration than HE-SS-PRX.
  • the NPC1 was seeded on a 35 mm glass bottom dish (manufactured by IWAKI) (cell number: 1.5 ⁇ 10 4 cells / dish), cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for 1 day, and the following sample was added. The culture was further continued for 24 hours. After the culture, cells were fixed by treatment with a 4% paraformaldehyde solution (Wako) for 10 minutes, and permeabilized with a cell membrane by treatment with a 50 ⁇ g / mL digitonin solution (Tokyo Chemical Industry) for 5 minutes. Then, blocking was performed by treating with 1% BSA / PBS solution for 30 minutes.
  • Rabbit polyclonal anti-LC3 antibody (manufactured by MBL) was mixed with a 1% BSA solution at a dilution ratio of 1: 200 and treated at 4 ° C. for 1 day.
  • the cells were washed with PBS and then stained with Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (manufactured by Abcam) (diluted 1: 1,000 with 1% BSA solution) for 30 minutes.
  • the cells were washed with PBS and then observed with FluoView FV-10i (Olympus).
  • FluoView FV-10i (Olympus).
  • the same test was performed when the NHDF was used and the sample was not added, and when the NPC1 was used and the sample was not added.
  • HEE-SS-PRX prepared in Production Example 5, addition amount is 0.01 mM to 1 mM in terms of cyclodextrin concentration
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Sigma-Aldrich, addition amount is 0.1 mM to 10 mM
  • FIGS. 16A to 16D LC3 stained images of the cells are shown in FIGS. 16A to 16D, and the quantitative results of the number of intracellular LC3-positive vesicles are shown in FIG. 16E.
  • FIG. 16A shows the results when NHDF is used as the cell and no sample is added
  • FIG. 16B shows the result when NPC1 is used as the cell and no sample is added
  • FIG. FIG. 16D shows the results when NPC1 is used and HP- ⁇ -CD is added as a sample (addition amount: 10 mM)
  • FIG. 16D shows NPC1 is used as a cell and HEE-SS-PRX is added as a sample (addition amount: HEE).
  • the cells were seeded in a 12-well plate (manufactured by Nunc) (number of cells: 1 ⁇ 10 5 cells / well), cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for 1 day, and the following sample was added. Incubate for hours. After the culture, the cells were washed with PBS, and then added with 150 ⁇ L of RIPA buffer (Wako) containing 1% protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque) and 1% phosphatase inhibitor cocktail (Nacalai Tesque), 30 The cells were lysed by shaking for minutes. The cell lysate was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • anti-LC3 antibody manufactured by MBL
  • anti-p62 / SQSTM1 antibody manufactured by MBL
  • anti- ⁇ -actin antibody manufactured by Sigma-Aldrich
  • HEE-SS-PRX prepared in Production Example 5, addition amount is 0.01 mM to 1 mM in terms of ⁇ -CD concentration on HEE-SS-PRX
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Sigma-Aldrich, addition amount is 0.1 mM to 10 mM
  • FIG. 17A The results of Western blotting of NHDF and NPC1 are shown in FIG. 17A, the relative expression level of LC3-II in NHDF and NPC1 is shown in FIG. 17B, and the relative expression level of p62 in NHDF and NPC1 is shown in FIG. 17C.
  • FIG. 17D The results of Western blotting of NHDF, NPC2 mutant NPC disease patient dermal fibroblasts, Fabry patient dermatofibroblasts, and GM1 gangliosidosis patient dermal fibroblasts are shown in FIG. 17D.
  • each said relative expression level is calculated
  • FIG. 17A, FIG. 17B, and FIG. 17C sequentially from the left side, “when NHDF is used as a cell and no sample is added”, “when NHDF is used as a cell and Baf A is added instead of the sample”, “When NPC1 is used as a cell and no sample is added”, “When NPC1 is used as a cell and Baf A is added instead of the sample”, “NPC1 is used as a cell, and HP- ⁇ -CD is used as a sample.
  • FIG. 17D and FIG. 17E in order from the left, “when NHDF is used as a cell and a sample is not added”, “a skin fibroblast derived from an NPC2 mutant NPC disease patient is used as a cell, and no sample is added.
  • NPC2 mutant NPC disease patient-derived skin fibroblasts are used as cells and 10 mM HP- ⁇ -CD is added as a sample
  • NPC2 mutant NPC disease patient-derived skin fibroblasts are used as cells.
  • 10 mM HP- ⁇ -CD was added as a sample
  • Using Fabry disease patient-derived skin fibroblasts as a sample "When 1 mM HEE-SS-PRX was added", “When GM1 gangliosidosis patient-derived skin fibroblasts were used as cells and no sample was added”, "GM1 gangliosidosis patient-derived skin fibroblasts as cells Results of “when cells are used and 10 mM
  • NPC2 mutant NPC disease patient-derived skin fibroblasts Fabry disease patient-derived skin fibroblasts, and GM1 gangliosidosis patient-derived skin from which autolysosome formation failure has been observed.
  • addition of HP- ⁇ -CD resulted in an increase in LC3-II and addition of HEE-SS-PRX decreased LC3-II.
  • HP- ⁇ -CD and HEE-SS-PRX are universal regardless of the cell type, and HP- ⁇ -CD causes the accumulation of LC3-II in the cells.
  • HEE-SS-PRX eliminated the accumulation of LC3-II.
  • the NPC1 was seeded on a 35 mm glass bottom dish (manufactured by IWAKI) (cell number: 1.5 ⁇ 10 4 cells / dish), and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for 1 day.
  • 250 ng of ptfLC3 plasmid DNA (purchased from Addgene; number 21074) with mRFP-EGFP-LC3 bound in series was diluted with Opti-MEM (manufactured by Life Technologies), Lipofectamine 3000 (manufactured by Life Technologies) was added, and 5 minutes static I put it.
  • the plasmid-containing solution was added to the cell culture medium and cultured for 24 hours. After exchanging the culture solution, the following sample was added and further cultured for 24 hours.
  • FIG. 18A The results of observation of the expression of ptfLC3 in each cell with a fluorescence microscope are shown in FIG. 18A, and the image analysis results of the autophagosome number and the autolysosome number are shown in FIG. 18B.
  • FIG. 18A in order from the left, “when NHDF is used as a cell and no sample is added”, “when NPC1 is used as a cell and no sample is added”, “NPC1 is used as a cell, and HP is used as a sample. “When ⁇ -CD is added”, “When NPC1 is used as a cell and HEE-SS-PRX is added as a sample”, the upper row shows a fluorescence image derived from “GFP”, and the lower row shows “ The fluorescence image derived from "mRFP” is shown.
  • the NPC1 was seeded on a 35 mm glass bottom dish (manufactured by IWAKI) (cell number: 1.5 ⁇ 10 4 cells / dish), and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for 1 day.
  • 250 ng of mRFP-LC3 expression plasmid DNA (purchased from Addgene; number 21075) was diluted with Opti-MEM (manufactured by Life Technologies), Lipofectamine 3000 (manufactured by Life Technologies) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes.
  • the plasmid-containing solution was added to the cell culture medium and cultured for 24 hours. After exchanging the culture solution, the following sample was added and further cultured for 24 hours.
  • the cells were washed with PBS and then stained with Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (Abcam) (diluted 1: 1,000 with 1% BSA solution) for 30 minutes.
  • the cells were washed with PBS and then observed with FluoView FV-10i (Olympus) to evaluate the co-localization rate between mRFP-LC3 and LAMP1.
  • FluoView FV-10i Olympus
  • HEE-SS-PRX prepared in Production Example 5, addition amount is 1 mM in terms of cyclodextrin concentration
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Sigma-Aldrich, addition amount is 10 mM
  • FIG. 19A The results of observation of the expression of mRFP-LC3 and LAMP1 in each cell are shown in FIG. 19A, and the results of determining the colocalization rate between mRFP-LC3 and LAMP1 are shown in FIG. 19B.
  • FIG. 19B in order from the left side, “when NHDF is used as a cell and no sample is added”, “when NPC1 is used as a cell and no sample is added”, “NPC1 is used as a cell, and HP is used as a sample.
  • the results of “when ⁇ -CD is added” and “when NPC1 is used as a cell and HEE-SS-PRX is added as a sample” are shown.
  • the vertical axis in FIG. 19B shows the colocalization rate between mRFP-LC3 and LAMP1 in the cells.
  • a polyrotaxane having a bulky substituent at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules via an intracellular degradable bond has an effect of enhancing the formation of autolysosomes. It was found to show. Therefore, the polyrotaxane of the present invention is expected to be applied as a pharmaceutical for diseases in which the autophagy function is inhibited due to autolysosome formation failure.
  • Examples of the aspect of the present invention include the following.
  • ⁇ 1> Abnormal lipid metabolism and functional abnormality of autophagy characterized by containing polyrotaxane having bulky substituents via intracellular degradable bonds at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules A pharmaceutical composition for a disease caused by at least one of the above.
  • ⁇ 2> The pharmaceutical composition according to ⁇ 1>, wherein the disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction is lysosomal disease.
  • ⁇ 3> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the cyclic molecule is cyclodextrin.
  • ⁇ 4> Any of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the intracellular degradable bond is any one selected from an acetal bond, a ketal bond, a disulfide bond, an ester bond, an orthoester bond, a vinyl ether bond, and a hydrazide bond
  • ⁇ 5> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the linear molecule is any one of a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol.
  • Lysosomal disease is Gaucher disease, Neiman-Pick disease type A, Neiman-Pick disease type B, Neiman-Pick disease type C, GM1 gangliosidosis, GM2 gangliosidosis, Faber disease, Wolman disease, and Fabry disease
  • the pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 6>, wherein the lysosomal disease is any one selected from Niemann-Pick disease type C, GM1 gangliosidosis, and Fabry disease.
  • a polyrotaxane having a bulky substituent via an intracellular degradable bond at both ends of a linear molecule penetrating a plurality of cyclic molecules The linear molecule is a copolymer obtained by polymerizing polyethylene glycol and polypropylene glycol in the order of polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the polyrotaxane is characterized in that the plurality of cyclic molecules are ⁇ -cyclodextrin.
  • ⁇ 9> The polyrotaxane according to ⁇ 8>, wherein the intracellular degradable bond is any one selected from an acetal bond, a ketal bond, a disulfide bond, an ester bond, an orthoester bond, a vinyl ether bond, and a hydrazide bond. .
  • a method for preventing or treating a disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction wherein the pharmaceutical agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> A method comprising administering a composition.
  • ⁇ 12> Use of the polyrotaxane according to ⁇ 8> or ⁇ 9> for the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease caused by at least one of lipid metabolism abnormality and autophagy dysfunction.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has a polyrotaxane structure and can avoid hemolysis, it is not only safer than the conventional cyclodextrin alone, but also high by releasing cyclodextrin selectively intracellularly. Has cholesterol-removing action.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent autolysosome formation enhancing action. By these actions, it can be used as an excellent pharmaceutical composition having a high therapeutic effect or a preventive effect and having few side effects.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has a polyrotaxane structure and has a higher molecular weight than cyclodextrin, the drug efficacy can be maintained by reducing the blood half-life, and the dosage and number of administrations can be reduced. Be expected.

Abstract

　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有する脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物などである。

Description

ポリロタキサン、及び医薬組成物
　本発明は、ポリロタキサンを含有する脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物、及び新規ポリロタキサンに関する。
　リソソーム中の分解酵素、あるいは膜輸送タンパク質の遺伝的な欠損乃至変異により、リソソーム内に脂質、糖質、コレステロールなどの蓄積が起こる疾患を総称してライソゾーム病と呼ぶ。日本では約３０種類のライソゾーム病が特定疾患として指定されており、有効な治療法が少ないことが知られている。
　例えば、前記ライソゾーム病の１つであるニーマン・ピック病Ｃ型（以下、「ＮＰＣ病」と称することがある。）は、膜タンパク質であるＮＰＣ１の変異によりリソソームにコレステロール、脂質が蓄積する。前記ＮＰＣ病は、幼児期より発症し、進行性の神経障害、肝脾腫等の症状を示し、１０歳前後で死亡する症例の多い難治性代謝疾患である。
　近年、前記ＮＰＣ病に対する治療薬として、シクロデキストリンの利用が期待されている。シクロデキストリンは環状の糖類であり、糖の繰り返し数に応じてα－シクロデキストリン（繰り返し数６）、β－シクロデキストリン（繰り返し数７）、γ－シクロデキストリン（繰り返し数８）と命名されている。各シクロデキストリンは空洞部に様々な化合物を包接することが知られており、特にβ－シクロデキストリンはコレステロールの包接能に優れることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。近年、ヒドロキシプロピル基で修飾されたβ－シクロデキストリン（以下、「ＨＰ－β－ＣＤ」と称することがある）をＮＰＣ病患者由来細胞に対して作用させることで細胞内コレステロール量が減少することが明らかとなっている。さらに、Ｎｐｃ１欠損マウス（Ｎｐｃ１－／－マウス）に対しＨＰ－β－ＣＤを投与することで、各組織のコレステロール蓄積量を減少させ、生存期間を延長することが見出されている（例えば、非特許文献２参照）。以上より、β－シクロデキストリンは細胞内に蓄積したコレステロールを減少させることが可能であることから、新たなＮＰＣ病治療薬として注目されている。特に米国では人道的使用が許可されており、２０１２年より前記ＮＰＣ病治療のフェーズＩ試験が開始されていることから非常に期待度の高い薬剤であると考えられる。
　一方、シクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と称することがある）は、分子量が１，０００程度の低分子であるため、血中半減期が数十分間程度と短く、投与後速やかに腎排泄されてしまうという問題や、細胞膜透過性が低いという問題がある（例えば、非特許文献３参照）。このため、十分な治療効果を得るためには、高濃度のＣＤ（前記Ｎｐｃ１欠損マウスに対する投与量は４，０００ｍｇ／ｋｇ）を頻回投与する必要がある（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、高濃度のＣＤは、溶血活性や組織障害性を示すため、高濃度での使用は正常組織の障害といった副作用が懸念される（例えば、非特許文献４参照）。そのため、ヒトに対して非侵襲的に十分な治療効果を得ることは困難だと考えられる。
　したがって、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用を有し、ニーマン・ピック病Ｃ型を含むライソゾーム病に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物の速やかな開発が強く求められているのが現状である。
　また、前記ライソゾーム病は、脂質等の代謝異常だけではなく、細胞のタンパク質分解機能であるオートファジーに異常があることも近年明らかになりつつある（例えば、非特許文献５参照）。オートファジーは細胞内で不要となったタンパク質やミトコンドリア等のオルガネラをリソソームで分解するが、オートファジーの機能異常は細胞内への不要タンパク質の蓄積をもたらす。オートファジーの機能障害がライソゾーム病の病態と関連しているという指摘もされている。特に、ＮＰＣ病では、細胞質中にオートファゴソームの蓄積を生じることが示されている（例えば、非特許文献６参照）。このようなオートファゴソームの蓄積は、本来オートリソソームで分解される不要タンパク質やオルガネラが細胞質中に蓄積することを示唆している。
　また、オートファジーによるタンパク質分解に異常がある他の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患が知られている（例えば、非特許文献７参照）。
　したがって、ライソゾーム病を含む、オートファジー機能異常に起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物の速やかな開発も強く求められているのが現状である。
Ｍ．　Ｅ．　Ｂｒｅｗｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｄｖ.　ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．　Ｒｅｖ．　５９（７），　６４５－６６６　（２００７） Ｂ．　Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ.　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　１０６（７），　２３７７－２３８２　（２００９） Ｈ．　Ｗ．　Ｆｒｉｊｌｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　７（１２），　１２４８－１２５２　（１９９０） Ｔ．　Ｉｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ.　Ｐｈａｒｍ．　Ｓｃｉ．　８６（２），　１４７－１６２　（１９９７） Ａ．　Ｐ．　Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　８（５），　７１９－７３０　（２０１２） Ｓ．　Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１６（７），　９５４－９５９　（２００９） Ａ．　Ｍ．　Ｃｕｅｒｖｏ　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１４（２），　７０－７７　（２００４）
　本発明は、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用及び優れたオートリソソームの形成亢進作用の少なくともいずれかを有し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物、及び前記医薬組成物に好適に用いることができるポリロタキサンを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
　＜１＞　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
　＜２＞　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
　前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ－シクロデキストリンであることを特徴とするポリロタキサンである。
　本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性が高く、優れたコレステロール除去作用及び優れたオートリソソームの形成亢進作用の少なくともいずれかを有し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する高い治療効果又は予防効果を有する医薬組成物、及び前記医薬組成物に好適に用いることができるポリロタキサンを提供することができる。
図１は、製造例１で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図２は、製造例２で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図３は、比較製造例１で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図４は、製造例３で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図５は、製造例４で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図６は、製造例５で得られたポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図７は、試験例１の溶血試験の結果を示すグラフである。 図８Ａは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示す図である。 図８Ｂは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合の結果を示す図である。 図８Ｃは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＤＭ－β－ＣＤを添加した場合の結果を示す図である。 図８Ｄは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示す図である。 図８Ｅは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示す図である。 図８Ｆは、試験例２において、細胞としてニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示す図である。 図８Ｇは、試験例２において、細胞として健常者由来皮膚線維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示す図である。 図９は、試験例２の細胞内のコレステロールの集積量の定量結果を示すグラフである。 図１０は、試験例３の細胞毒性の評価の結果を示すグラフである。 図１１Ａは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－１（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、右側：抗ＥＥＡ１抗体）である。 図１１Ｂは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－２（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、右側：抗ＥＥＡ１抗体）である。 図１１Ｃは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－３（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、右側：抗ＣＤ６３抗体）である。 図１１Ｄは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－４（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、右側：抗ＣＤ６３抗体）である。 図１１Ｅは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－５（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、右側：抗ＬＡＭＰ１抗体）である。 図１１Ｆは、試験例４の蛍光顕微鏡像を示す図－６（左側：ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、右側：抗ＬＡＭＰ１抗体）である。 図１２は、試験例４のＥＥＡ１、ＣＤ６３、又はＬＡＭＰ１陽性小胞に対するＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＰＲＸの共局在率を求めた結果を示すグラフである。 図１３は、試験例５のコレステロールの除去作用の結果を示すグラフである。 図１４は、試験例６のコレステロールの除去作用の結果を示すグラフである。 図１５Ａは、試験例７－１のコレステロールの除去作用の結果を示すグラフである。 図１５Ｂは、試験例７－２のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 図１６Ａは、試験例８におけるＮＨＤＦ（試料無添加）のＬＣ３染色画像を示す図である。 図１６Ｂは、試験例８におけるＮＰＣ１（試料無添加）のＬＣ３染色画像を示す図である。 図１６Ｃは、試験例８におけるＮＰＣ１（ＨＰ－β－ＣＤ添加）のＬＣ３染色画像を示す図である。 図１６Ｄは、試験例８におけるＮＰＣ１（ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ添加）のＬＣ３染色画像を示す図である。 図１６Ｅは、試験例８の細胞内のＬＣ３陽性小胞数を定量した結果を示すグラフである。 図１７Ａは、試験例９のＮＨＤＦ及びＮＰＣ１のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図１７Ｂは、試験例９のＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるＬＣ３－ＩＩの相対発現量を示すグラフである。 図１７Ｃは、試験例９のＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるｐ６２の相対発現量を示すグラフである。 図１７Ｄは、試験例９のＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図１７Ｅは、試験例９のＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞におけるＬＣ３－ＩＩの相対発現量を示すグラフである。 図１８Ａは、試験例１０における各細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。 図１８Ｂは、試験例１０の各細胞におけるオートファゴソーム数及びオートリソソーム数を解析した結果を示すグラフである。 図１９Ａは、試験例１１における各細胞の顕微鏡像を示す図である。 図１９Ｂは、試験例１１の各細胞におけるｍＲＦＰ－ＬＣ３と抗ＬＡＭＰ１抗体との共局在率を求めた結果を示すグラフである。
（医薬組成物）
　本発明の医薬組成物は、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
　本発明の医薬組成物は、ポリロタキサンを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
＜ポリロタキサン＞
　前記ポリロタキサンは、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ポリロタキサンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記ポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２万～１０万程度とすることが好ましい。
－線状分子－
　前記線状分子は、複数の環状分子を貫通し、両端部に細胞内分解性結合を有し、該細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基と結合する。
　前記線状分子としては、複数の環状分子の空洞を貫通し、その状態を保持することができ、かつ、両端部に細胞内分解性結合を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記線状分子の両端部以外の構成としては、公知のポリロタキサンの構成を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリメチルビニルエーテル、ポリエチレンイミン、ポリアミノ酸などが挙げられる。
　前記線状分子の両端部以外の構成の分子量としては、特に制限はなく、目的とするポリロタキサンの分子量や、貫通させる環状分子の数に応じて適宜選択することができる。
　これらは、化学合成したものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。
　前記線状分子の両端部以外の構成は、後述する環状分子との組合せに応じて適宜選択することが好ましく、例えば、前記環状分子がα－シクロデキストリンの場合には、ポリエチレングリコールとすることが好ましく、前記環状分子がβ－シクロデキストリンの場合には、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体とすることが好ましい。
　前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体では、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であることが好ましい。
　前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体におけるポリエチレングリコール部分の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５００～１０，０００とすることができる。また、前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体におけるポリプロピレングリコール部分の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５００～５，０００とすることができる。
　前記ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体の具体例としては、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）などが挙げられる。
－－細胞内分解性結合－－
　前記細胞内分解性結合としては、細胞内で分解される結合であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合、アミド結合などが挙げられる。これらの中でも、細胞内での選択的な分解に優れる点で、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合が好ましく、ジスルフィド結合がより好ましい。
　これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記線状分子に前記細胞内分解性結合を形成する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、「Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　７６　（２００１）　１１－２５」、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２００３，　４，　１４２６－１４３２」、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ　２０１１，　２７（２），　６１２－６１７」、「Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　２０１３，　５２，　７３００－７３０５」、「Ｊ．　Ｍａｔｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｂ，　２０１３，　１，　３５３５－３５４４」、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，　３４，　２４８０－２４９１　（２０１３）」、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　３，　２２５２　（２０１３）」などに記載の方法と同様の方法が挙げられる。
－環状分子－
　前記環状分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シクロデキストリン、クラウンエーテル、サイクロフラクタン、カリックスアレンなどが挙げられる。これらの中でも、コレステロールの包接能に優れる点で、シクロデキストリンが好ましい。
　これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記シクロデキストリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリンが挙げられる。これらの中でも、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリンが好ましく、コレステロールの包接能により優れる点で、β－シクロデキストリンがより好ましい。
　前記ポリロタキサン１分子あたりの前記環状分子の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均５個～２００個が好ましい。
　前記環状分子は、置換基で修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよいが、前記ポリロタキサンの水溶性を高めるために、置換基で修飾されていることが好ましい。
　前記修飾される位置としては、前記ポリロタキサンの水溶性を高めることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、シクロデキストリンの場合には、ヒドロキシル基が修飾されることが好ましい。
　前記置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、メチル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基（「ＤＭＡＥ」基と称することもある）、カルボキシル基、一級アミノ基、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子やペプチド分子などが挙げられる。これらの中でも、ポリロタキサンの細胞内への取込み効率を高めることができる点で、ＤＭＡＥ基が好ましい。
　前記ヒドロキシル基の修飾は、前記置換基で直接修飾されていてもよいし、リンカーを介して修飾されていてもよい。
　前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）、エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－）、カルボネート結合（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、エーテル結合（－Ｏ－）などが挙げられる。
　前記ポリロタキサン１分子あたりの前記置換基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均１０個～４００個が好ましい。
　前記環状分子を前記線状分子により貫通させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記環状分子を修飾する方法としても、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
－嵩高い置換基－
　前記嵩高い置換基としては、前記線状分子の両末端をキャップして前記複数の環状分子の脱離を防止することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸若しくはその誘導体、オリゴペプチド、蛍光分子などが挙げられる。これらの中でも、Ｎ－トリチルグリシンが、生理条件下における加水分解耐性の点で、好ましい。
　前記嵩高い置換基を前記線状分子に結合させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記医薬組成物におけるポリロタキサンは、本発明のポリロタキサンであることが好ましい。
　本発明のポリロタキサンは、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、前記複数の環状分子がβ－シクロデキストリンである。
　本発明のポリロタキサンにおける環状分子、線状分子、該線状分子における細胞内分解性結合、嵩高い置換基は、前記医薬組成物のポリロタキサンの項目の記載と同様とすることができ、好ましい態様も同様である。
　本発明のポリロタキサンのより好ましい態様としては、下記構造式（１）で表されるポリロタキサン、下記構造式（２）で表されるポリロタキサン、下記構造式（４）で表されるポリロタキサン、下記構造式（５）で表されるポリロタキサン、下記構造式（６）で表されるポリロタキサンが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
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　前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表されるポリロタキサンの線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、環状分子は、β－シクロデキストリンであり、嵩高い置換基は、Ｎ－トリチルグリシンである。
　前記構造式（１）、（５）、及び（６）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、ジスルフィド結合であり、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、アセタール結合であり、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンの線状分子における細胞内分解性結合は、エステル結合である。
　前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位（以下、「モノマー」と称することがある）の数を示し（構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位（モノマー）の数を示す。また、前記構造式（１）、（２）、及び（４）中、β－ＣＤは下記式（Ａ）で表され、該構造式（１）、（２）、及び（４）中では１個のみ記載している。また、前記構造式（５）中、β－ＣＤは下記式（Ｂ）で表され、該構造式（５）中では１個のみ記載している。また、前記構造式（６）中、β－ＣＤは下記式（Ｃ）で表され、該構造式（６）中では１個のみ記載している。
　また、下記式（Ａ）では、β－シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）を介してヒドロキシエチル基で修飾されており、下記式（Ｂ）では、β－シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）を介してＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基で修飾されており、下記式（Ｃ）では、β－シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、カルバミン酸エステル（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）を介してヒドロキシエトキシエチル基で修飾されている。なお、下記式（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）では、前記修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、及び（６）で表されるポリロタキサンにおける線状分子の数平均分子量は、ポリエチレングリコール部分が、それぞれ１，１００であり、ポリプロピレングリコール部分が、４，２００である。
　前記構造式（１）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
　前記構造式（２）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
　前記構造式（４）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１１．７個である。
　前記構造式（５）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１２．９個である。
　前記構造式（６）で表されるポリロタキサンにおける環状分子の貫通数は、ポリロタキサン１分子あたり平均１６．１個である。
　前記構造式（１）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均５３．４個である。
　前記構造式（２）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６６．９個である。
　前記構造式（４）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６５．９個である。
　前記構造式（５）で表されるポリロタキサンにおける前記Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６５．３個である。
　前記構造式（６）で表されるポリロタキサンにおける前記ヒドロキシエトキシエチル基の修飾数は、ポリロタキサン１分子あたり平均６４．７個である。
　前記構造式（１）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例１の方法で好適に製造することができ、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例２の方法で好適に製造することができ、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例３の方法で好適に製造することができ、前記構造式（５）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例４の方法で好適に製造することができ、前記構造式（６）で表されるポリロタキサンは、後述する製造例５の方法で好適に製造することができる。
　製造されたポリロタキサンが、前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法により確認することができる。
　前記構造式（１）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図１に示されるとおりであり、前記構造式（２）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図２に示されるとおりであり、前記構造式（４）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図４に示されるとおりであり、前記構造式（５）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図５に示されるとおりであり、前記構造式（６）で表されるポリロタキサンの重ジメチルスルホキシド中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートは、図６に示されるとおりである。
　なお、前記分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、前記ポリロタキサンが前記構造式（１）、（２）、（４）、（５）、又は（６）で表される構造を有することは容易に同定することが可能である。
　本発明の医薬組成物における前記ポリロタキサンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記医薬組成物は、前記ポリロタキサンそのものであってもよい。
＜脂質代謝異常及びオートファジー機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患＞
　前記脂質代謝異常及びオートファジー機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患は、脂質代謝異常のみに起因する疾患であってもよいし、オートファジー機能異常のみに起因する疾患であってもよいし、両者に起因する疾患であってもよい。
＜＜脂質代謝異常に起因する疾患＞＞
　前記脂質代謝異常に起因する疾患としては、例えば、ライソゾーム病が挙げられる。なお、前記ライソゾーム病は、オートファゴソームの蓄積を生じる、オートファジー機能異常に起因する疾患でもある。
－ライソゾーム病－
　前記ライソゾーム病の具体例としては、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ病）、ニーマン・ピック病Ａ型（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ａ型）、ニーマン・ピック病Ｂ型（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ｂ型）、ニーマン・ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ｃ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス（「Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ　Ｓａｎｄｈｏｆｆ　ＡＢ型」と称することもある。）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ病）、異染性白質変性症、マルチプルサルタファーゼ欠損症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｌｆａｔｅｓｅ欠損症）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ病）、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型（「ハンター病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（「サンフィリポ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症ＶＩ型（「マロトー・ラミー病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（「スライ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＸ型（「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ欠損症」と称することもある。）、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ－ｃｅｌｌ病／ムコリピドーシスＩＩＩ型、α－マンノシドーシス、β－マンノシドーシス、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シンドラー／神崎病（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ／神崎病）、ウォルマン病（Ｗｏｌｍａｎ病）、ダノン病（Ｄａｎｏｎ病）、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス、ファブリー病が挙げられる。
　前記オートファジー機能異常に起因する疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などが挙げられる。これらは、オートファゴソームの蓄積を生じる疾患である。
　本発明の医薬組成物は、ライソゾーム病に好適に用いることができ、中でも、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、ファブリー病に好適に用いることができ、ニーマン・ピック病Ｃ型により好適に用いることができる。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物における前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤形＞
　本発明の医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記ポリロタキサンに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
＜投与＞
　本発明の医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬組成物の剤形、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与としては、脳室内投与などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与形態や、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
　また、本発明の医薬組成物の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、細胞内で分解されるまでは、環状分子の空洞部を線状分子が占めているため、溶血や疎水性生体分子の非特異的な包接は示さないと考えられ、より安全性が高いと考えられる。
　また、前記ポリロタキサンは、細胞内に到達すると、末端の細胞内分解性結合が切断され、多数の環状分子が徐々に放出されコレステロールの除去剤として作用する。そのため、コレステロールの除去作用と、該作用の持続化が期待される。
　さらに、前記ポリロタキサン骨格は、数平均分子量が２万～１０万程度の高分子量であるため、例えば、静脈投与後の腎排泄を受けにくく、血中半減期がシクロデキストリン単独よりも長くなると考えられる。そのため、投与量、投与回数の低減に繋がると考えられる。
　また、本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、細胞毒性が低く、また、低濃度でコレステロールを除去することができる。
　また、本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサンは、優れたオートリソソームの形成亢進作用を有する。
　本発明の医薬組成物に含まれるポリロタキサン、及び本発明のポリロタキサンは、細胞内のコレステロール除去剤、オートリソソームの形成亢進剤としても用いることができる。
（予防又は治療方法）
　前記医薬組成物は、個体に投与することにより、細胞内におけるコレステロールの除去若しくはオートリソソームの形成を亢進し、脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記医薬組成物を投与することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための方法にも関する。
　以下に製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
（製造例１：ポリロタキサン－１の製造）
　線状分子として、プルロニックＰ１２３（シグマ－アルドリッチ社製；ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と称することがある。）とポリプロピレングリコール（以下、「ＰＰＧ」と称することがある。）とが、ＰＥＧ－ＰＰＧ－ＰＥＧの順に重合した共重合体；ＰＰＧ部分の数平均分子量は、４，２００、ＰＥＧ部分の数平均分子量は、１，１００×２）を用い、以下のようにして、両末端にシスタミンを結合した。
　前記プルロニックＰ１２３を２０ｇ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（シグマ－アルドリッチ社製）を１０．２ｇ量り取り、ナス型フラスコへ加えた。テトラヒドロフラン（関東化学社製）を２６７ｍＬ加え溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、テトラヒドロフランに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にカルボニルイミダゾールを有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３－ＣＩ」と称することがある。）を２０ｇ得た。
　前記Ｐ１２３－ＣＩを９ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを８ｍＬに溶解した。脱塩したシスタミン（和光純薬社製）を２ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを７２ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノール（関東化学社製）に対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にシスタミンを有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３－ＳＳ－ＮＨ２」と称することがある。）を４．９５ｇ得た。
　前記Ｐ１２３－ＳＳ－ＮＨ２と、β－シクロデキストリン（以下、「β－ＣＤ」と称することがある。）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した。
　前記β－ＣＤを１２ｇ量り取り広口瓶に加え、リン酸緩衝溶液６００ｍＬに溶解した。前記Ｐ１２３－ＳＳ－ＮＨ２を１ｇ量り取り少量の超純水に溶解した。Ｐ１２３－ＳＳ－ＮＨ２水溶液をβ－ＣＤ溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した固体を凍結乾燥することで擬ポリロタキサンを得た。
　前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ－トリチルグリシン（シグマ－アルドリッチ社製）でキャッピングすることにより、複数のβ－ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるジスルフィド結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」と称することがある。）を得た。
　Ｎ－トリチルグリシンを１．６４ｇ、４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社製）を１．６３ｇ量り取りスクリュー管に加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド　１１．２ｍＬ、メタノール　４４．８ｍＬの混合溶媒に溶解した。得られた擬ポリロタキサンに対し、この溶液を加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、超純水の順で得られた沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。回収した固体を凍結乾燥することで末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを６９７．２ｍｇ得た。
　前記ポリロタキサンのβ－ＣＤにヒドロキシエチル（以下、「ＨＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン－１（以下、「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの平均貫通数は１２．９個；ＨＥ基の修飾数は平均５３．４個。）。
　前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを２５０ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを２３５ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液に２－アミノエタノールを４３９μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでヒドロキシエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ）を２３１．５ｍｇ得た。
　前記ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図１に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸが下記構造式（１）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（１）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（１）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（１）中、β－ＣＤは下記式（Ａ）で表され、該構造式（１）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（製造例２：ポリロタキサン－２の製造）
　線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、両末端にアセタール結合を形成させた。
　製造例１と同様に合成したＰ１２３－ＣＩを８．１４ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを１０ｍＬに溶解した。３，９－ビス（３－アミノプロピル）－２，４，８，１０－テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカンを６．８１ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを１００ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端に環状アセタール結合を有するＰ１２３（以下、「Ｐ１２３－ａｃｅ－ＮＨ２」と称することがある。）を７．０ｇ得た。
　前記Ｐ１２３－ａｃｅ－ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。
　前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ－トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ－ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるアセタール結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
　前記ポリロタキサンのβ－ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン－２（以下、「ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの貫通数は平均１２．９個、ＨＥ基の修飾数は平均６６．９個。）。
　前記ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図２に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸが下記構造式（２）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（２）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（２）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（２）中、β－ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（２）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（比較製造例１：ポリロタキサン－３の製造）
　線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、細胞内分解性結合を有さない線状分子を調製した。
　製造例１と同様に合成したＰ１２３－ＣＩを９ｇ量り取り、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを８ｍＬ加え溶解した。エチレンジアミン（和光純薬社製）を１．６５ｇ量り取りナス型フラスコへ加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを８０ｍＬ加え溶解した。Ｐ１２３―ＣＩ溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端に一級アミノ基を有するＰ１２３（以下、「Ｐ１２３－ＮＨ２」と称することがある。）を５．８５ｇ得た。
　前記Ｐ１２３－ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。
　前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ－トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ－ＣＤを貫通させた細胞内分解性結合を有さない線状分子の両端部に嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
　前記ポリロタキサンのβ－ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン－３（以下、「ＨＥ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの貫通数は平均１１．３個、ＨＥ基の修飾数は平均６５．３個。）。
　前記ＨＥ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図３に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ－ＰＲＸが下記構造式（３）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（３）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（３）では、カッコ内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（３）中、β－ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（３）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（製造例３：ポリロタキサン－４の製造）
　線状分子として、前記プルロニックＰ１２３を用い、以下のようにして、両末端にエステル結合を形成させた。
　前記プルロニックＰ１２３を１０ｇナス型フラスコに量り取り、テトラヒドロフランを１３３ｍＬ加え溶解した。前記溶液にトリエチルアミン（和光純薬社製）を３．３ｍＬ加えた。その後、氷冷下で塩化アクリロイル（和光純薬社製）を１．２８ｍＬ加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にアクリロイル基を有するプルロニックＰ１２３を６．１２ｇ得た。
　前記両末端にアクリロイル基を有するプルロニックＰ１２３を５．０ｇ、システアミン塩酸塩を１．２ｇナス型フラスコに量り取り、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを４０ｍＬ加え溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜へ加え、メタノールに対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にエステル結合を介して一級アミノ基を有するプルロニックＰ１２３（以下、「Ｐ１２３－ＣＯＯ－ＮＨ２」と称することがある。）を２．５４ｇ得た。
　前記Ｐ１２３－ＣＯＯ－ＮＨ２を用いた以外は、製造例１と同様にして、擬ポリロタキサンを調製した。
　前記擬ポリロタキサンの両端部を、製造例１と同様にしてＮ－トリチルグリシンでキャッピングすることにより、複数のβ－ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に細胞内で分解されるエステル結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを得た。
　前記ポリロタキサンのβ－ＣＤに、製造例１と同様にしてＨＥ基を導入し、水溶性のポリロタキサン－２（以下、「ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの貫通数は平均１１．７個、ＨＥ基の修飾数は平均６５．９個。）。
　前記ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図４に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸが下記構造式（４）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（４）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（４）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（４）中、β－ＣＤは前記式（Ａ）で表され、該構造式（４）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ヒドロキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（製造例４：ポリロタキサン－５の製造）
　製造例１と同様にして調製した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンのβ－ＣＤにＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（以下、「ＤＭＡＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン－５（以下、「ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの平均貫通数は１２．９個；ＤＭＡＥ基の修飾数は平均６５．３個。）。
　前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを１２５ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド５ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを１１７ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液にＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン（和光純薬社製）を２３７μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ）を１０４．７ｍｇ得た。
　前記ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図５に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸが下記構造式（５）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（５）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（５）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（５）中、β－ＣＤは下記式（Ｂ）で表され、該構造式（５）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ｂ）では、前記Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（製造例５：ポリロタキサン－６の製造）
　製造例１と同様にして調製した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンのβ－ＣＤにヒドロキシエトキシエチル（以下、「ＨＥＥ」）基を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン－６（以下、「ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子あたりのβ－ＣＤの平均貫通数は１６．１個；ＨＥＥ基の修飾数は平均６４．７個。）。
　前記末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサンを２００ｍｇ量り取り、ジメチルスルホキシド１５ｍＬに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを２０３ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液に２－（２－アミノエトキシ）エタノール（東京化成工業社製）を６２４μＬ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでヒドロキシエトキシエチル基を導入した、末端にジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ）を２３７．６ｍｇ得た。
　前記ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸについて、重ジメチルスルホキシド（シグマ－アルドリッチ社製）中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図６に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸが下記構造式（６）で表される構造を有することが確認された。なお、下記構造式（６）中、「ｍ」はポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示し（構造式（６）では、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載している）、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す。また、下記構造式（６）中、β－ＣＤは下記式（Ｃ）で表され、該構造式（６）中では１個のみ記載している。また、下記式（Ｃ）では、前記ヒドロキシエトキシエチル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（試験例１：溶血試験）
　リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称することがある。）２００μＬ中で、ラット赤血球（興人バイオより入手、細胞数１×１０８個）と各濃度（シクロデキストリンの濃度として）の以下の試料とを３７℃で２時間接触させた。遠心分離により赤血球を沈殿させ、上清を１００μＬ回収し、９６ウエルプレート（ＢＤファルコン社製）に加えた。上清の５４４ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーＡＲＶＯ－ＭＸ（パーキンエルマー社製）で測定した。０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク社製）と接触した際の上清の吸光度を溶血率１００％として、以下のようにして溶血率（％）を算出した。結果を図７に示す。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２）　ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３）　ＨＥ－ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（４）　ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（以下、「ＨＰ－β－ＣＤ」と称することがある。；下記構造式（７）で表される化合物；シグマ－アルドリッチ社製；製品番号３３２６０７；構造式（７）では、前記ヒドロキシプロピル基の修飾がｘ個（ｘ＝１～７）の場合を示している。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （５）　２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（以下、「ＤＭ－β－ＣＤ」と称することがある。；下記構造式（８）で表される化合物；シグマ－アルドリッチ社製；製品番号Ｈ０５１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ＜溶血率の算出方法＞
溶血率（％）＝｛（試料と接触した際の上清の吸光度）／（０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００と接触した際の上清の吸光度）｝×１００
　図７中、「●」は「ＤＭ－β－ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ－β－ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ－ＰＲＸ」の結果を示し、「◇」は「ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示す。
　図７の結果から、シクロデキストリンであるＨＰ－β－ＣＤ、及びＤＭ－β－ＣＤは溶血を示したのに対し、ポリロタキサンであるＨＥ－ＰＲＸ、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、及びＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸはいずれもシクロデキストリン濃度換算で２０ｍＭの高濃度でも溶血を示さないことが明らかとなった。
　これは、ポリロタキサンでは、シクロデキストリンの空洞部をポリマー鎖が占めているため、疎水性空洞部に由来した膜障害性を示さないと推測される。
　この結果から、ポリロタキサンは、溶血の観点から、シクロデキストリンよりも安全であると考えられる。
（試験例２：コレステロールの集積）
　健常者由来皮膚繊維芽細胞（以下、「ＮＨＤＦ」」、又は「ＮＨＤＦ細胞」と称する。Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０５６５９）、ニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞（以下、「ＮＰＣ１」、又は「ＮＰＣ１細胞」と称する。Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０３１２３）を用い、以下のようにして細胞内のコレステロールの集積を調べた。
　前記ＮＰＣ１を２４ウエルプレートに播種し（細胞数：２．５×１０４個／ウエル）、３７℃で２４時間培養後、下記試料をシクロデキストリン濃度に換算して１００μＭ添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
　前記培養後、４％　パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、１００μｇ／ｍＬに調製したフィリピン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のＰＢＳ溶液を加え４５分間室温で静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー走査顕微鏡ＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ１０ｉ（オリンパス社製）でコレステロールの局在を観察した。また、細胞内のコレステロールの集積量の定量を行った。
　前記細胞内のコレステロールの集積量の定量は、以下のようにして行った。
　細胞溶解液を用い、前記培養後の細胞を溶解させた細胞溶解液を調製し、Ａｍｐｌｅｘ　Ｒｅｄ　Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）でコレステロールの定量を行い、ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で総タンパク質量を定量した。細胞内の総コレステロール量は、総コレステロール量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（ｍｇ）で表記した。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を投与しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２）　ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３）　ＨＥ－ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（４）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
（５）　ＤＭ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
　共焦点顕微鏡による細胞内コレステロールの観察結果を図８Ａ～図８Ｇに示し、細胞内のコレステロールの集積量の定量結果を図９に示す。
　図８Ａは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図８Ｂは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合の結果を示し、図８Ｃは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＤＭ－β－ＣＤを添加した場合の結果を示し、図８Ｄは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｅは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｆは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ＰＲＸを添加した場合の結果を示し、図８Ｇは、細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合の結果を示す。各画像において、白色で示された部分がコレステロールを表す。各試料の添加量はシクロデキストリン濃度換算で１００μＭである。
　図９では、左側から順に、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合（試料未添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合（ＨＰ－β－ＣＤ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＤＭ－β－ＣＤを添加した場合（ＤＭ－β－ＣＤ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ－ａｓｅ－ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥ－ＰＲＸを添加した場合（ＨＥ－ＰＲＸ添加）」、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合（試料未添加）」の結果を示す。各試料の添加量はシクロデキストリン濃度換算で１００μＭである。
　図８Ａ～図８Ｇの結果から、前記ＮＨＤＦ細胞に比べ、前記ＮＰＣ１細胞では多量のコレステロールが細胞内に沈着している様子が認められた。
　前記ＮＰＣ１細胞に対し、前記ＤＭ－β－ＣＤを作用させると蛍光強度が減少し、コレステロールの排泄が促進されたと予想される。
　一方、細胞内分解性結合を有するＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、及びＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸで処理した場合には、前記ＮＨＤＦ細胞と同程度まで蛍光強度が減少し、前記ＤＭ－β－ＣＤ、及び現在臨床試験中の前記ＨＰ－β－ＣＤよりも非常に優れたコレステロール除去作用が示された。
　なお、細胞内分解性結合を有さないＨＥ－ＰＲＸを用いた場合の蛍光強度は、細胞内分解性結合を有するＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、及びＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸで処理した場合よりも高く、コレステロール除去作用が劣っていた。
　図９の結果から、現在臨床試験中のＨＰ－β－ＣＤは、本試験濃度ではコレステロールの除去率は僅かであったが、既存の試薬中で最もコレステロール包接能の高いＤＭ－β－ＣＤではＨＰ－β－ＣＤよりもコレステロールを除去できたことが明らかとなった。
　一方、細胞内分解性結合を有するＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ、又はＤＭＡＥ－ａｃｅ－ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、前記ＨＰ－β－ＣＤ、及びＤＭ－β－ＣＤよりもコレステロールを除去することができ、また、細胞内分解性結合を有さない前記ＨＥ－ＰＲＸよりもコレステロールが除去されており、非常に高い効果を示すことが明らかとなった。
　以上の結果から、細胞内分解性結合を有するＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、及びＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞ではコレステロールの蓄積が大幅に減少していることが明らかとなった。これは、細胞内でのジスルフィド結合、あるいはアセタール結合の切断によりシクロデキストリンが細胞内で放出されたことで、細胞内のコレステロールが除去されたためと考えられる。
　したがって、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンは、低侵襲的かつ疾患細胞からのコレステロールの除去効果に優れ、ニーマン・ピック病Ｃ型を含むライソゾーム病の治療薬として用いうることが示された。
（試験例３：細胞毒性の評価）
　ＮＰＣ１を用い、以下のようにしてポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体の細胞毒性を調べた。
　前記ＮＰＣ１細胞を９６ウエルプレートに播種し（細胞数：１×１０４個／ウエル）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、下記試料をシクロデキストリン濃度に換算して０．１ｍＭから２０ｍＭの濃度範囲で１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁堂社製）を１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。
　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料の代わりにリン酸緩衝溶液を添加した細胞の吸光度を細胞生存率１００％として、以下のようにして細胞生存率（％）を算出した。結果を図１０に示す。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２）　ＨＥ－ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（３）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
（４）　ＤＭ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
＜細胞生存率の算出方法＞
細胞生存率（％）＝｛（試料を添加し、培養した細胞の吸光度）／（リン酸緩衝溶液を添加し、培養した細胞の吸光度）｝×１００
　図１０中、「●」は「ＤＭ－β－ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ－β－ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ－ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示す。
　図１０の結果から、シクロデキストリン誘導体であるＨＰ－β－ＣＤ、及びＤＭ－β－ＣＤは細胞生存率の低下を示したのに対し、ポリロタキサンであるＨＥ－ＰＲＸ、及びＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸではいずれもシクロデキストリン濃度換算で２０ｍＭの高濃度でも細胞生存率の低下を示さないことが明らかとなった。
　これは、ポリロタキサンでは、シクロデキストリンの空洞部をポリマー鎖が占めているため、細胞に対する膜障害性を示さないためであると推測される。
　この結果から、ポリロタキサンは、細胞毒性の観点から、シクロデキストリンよりも安全であると考えられる。
（試験例４：共焦点顕微鏡による局在観察）
＜試料の調製＞
　ＮＰＣ１と接触した際のポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体の局在を明らかとするために、試料として用いるフルオレセインイソチオシアネートエチレンジアミン（ＦＩＴＣ―ＥＤＡ）で修飾したＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」と称する）、ＨＰ－β－ＣＤ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ」と称する）を以下のようにして調製した。
－ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸの調製－
　製造例１で調製したＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ　３０ｍｇを３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを４．８３ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ－ＥＤＡ（既報に従い合成。参考文献：Ｎ．　Ｖ．　Ｎｕｋｏｌｏｖａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　３２（２３）、５４１７－５４２６（２０１１））を２．６７ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応のＦＩＴＣ－ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸを１３．２ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は紫外－可視分光光度計を用いて４９４ｎｍの吸光度より算出し、ポリロタキサン中のβ－ＣＤ　一分子に対し、０．０４分子のＦＩＴＣが修飾されていることを確認した。
－ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤの調製－
　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）　２００ｍｇを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを６６．６ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ－ＥＤＡを６１．６ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量１，０００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し１０日間透析をすることで未反応のＦＩＴＣ－ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣを修飾したＨＰ－β－ＣＤ（ＦＩＴＣ－ＨＰ－β－ＣＤ）を１６．９ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は上記と同様に行った。未修飾ＨＰ－β－ＣＤとＦＩＴＣ－ＨＰ－β－ＣＤを混合し、ＨＰ－β－ＣＤ　一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．０４分子となるよう調整した。
＜局在観察＞
　ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１×１０４個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９００μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して５ｍＭに調整した前記試料を１００μＬずつ各ディッシュに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
　その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液を１ｍＬ加え、室温で１５分間静置し、細胞を固定した。
　リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．１％Ｔｒｉｒｏｎ　Ｘ－１００を１ｍＬ加え、室温で１０分間静置し、細胞膜の透過処理を行った。
　リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、１％　ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で希釈したマウスモノクローナル抗ｅａｒｌｙ　ｅｎｄｏｓｏｍｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　１（ＥＥＡ１）抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、マウスモノクローナル抗ＣＤ６３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、マウスモノクローナル抗ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＬＡＭＰ１）抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製）をそれぞれのディッシュに加え、室温で１時間静置した。
　その後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄し、１％　ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液で希釈したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ溶液を加え、室温で３０分静置した。その後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。
　顕微鏡観察はＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ１０ｉ（オリンパス社製）で行った。
　蛍光顕微鏡観察により、ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＰＲＸの局在位置を詳細に求めるため、初期エンドソーム、後期エンドソーム、及びリソソームをＥＥＡ１、ＣＤ６３、及びＬＡＭＰ１で免疫染色した結果を図１１Ａ～図１１Ｆに示す。
　また、ＦｌｕｏＶｉｅｗ　Ｖｉｅｗｅｒ（オリンパス社製）を用い、ＥＥＡ１、ＣＤ６３、又はＬＡＭＰ１陽性小胞に対するＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤ、ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＰＲＸの共局在率を図１１Ａ～図１１Ｆの画像より計算した結果を図１２に示す。前記計算は、細胞２０個に対し、ＥＥＡ１、ＣＤ６３、又はＬＡＭＰ１陽性小胞に対する共局在率を求め、平均値と標準誤差とを計算した。
　図１１Ａ～図１２の結果から、ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤは、初期エンドソーム（ＥＥＡ１陽性小胞）、後期エンドソーム（ＣＤ６３陽性小胞）、及びリソソーム（ＬＡＭＰ１陽性小胞）における局在は少なく、大部分は細胞膜近傍に局在している様子が観察された。これは、β－ＣＤの空洞部が細胞膜中の脂質、コレステロールと相互作用するためであると予想される。この結果は、β－ＣＤが細胞膜と強く相互作用し、膜障害性、溶血を示すといった上述の結果と一致する。
　また、ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＰＲＸは、後期エンドソーム（ＣＤ６３陽性小胞）、又はリソソーム（ＬＡＭＰ１陽性小胞）に局在していた。ポリロタキサンは、エンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれ、後期エンドソーム、リソソームに到達したと考えられる。ポリロタキサンは、β－ＣＤの空洞部が高分子鎖で占有されているため細胞膜との作用がなく、結果としてエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれると予想される。
　以上の結果より、ＦＩＴＣ標識ＨＰ－β－ＣＤとＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸとでは、細胞に対する局在、作用箇所が大きく異なることが明らかとなった。
（試験例５：コレステロール除去作用）
　ポリロタキサン、シクロデキストリン誘導体によるＮＰＣ１からのコレステロール除去作用をより詳細に検討した。
　ＮＰＣ１を２４ウエルプレート（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し（細胞数：２．５×１０４個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を２７０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して０．０１ｍＭ～１００ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
　その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。その後、細胞溶解液（５０ｍＭリン酸緩衝溶液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭコール酸、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む）を各チューブに加え細胞を溶解した。
　各細胞溶解液に対し、Ａｍｐｌｅｘ　Ｒｅｄ　Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）により総コレステロールの定量を行い、またｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により総タンパク質量を定量した。細胞内の総コレステロール量は、総コレステロール量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（ｍｇ）で表記した。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を投与しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２）　ＨＥ－ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（３）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
（４）　ＤＭ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製）
　結果を図１３に示す。図１３中、「●」は「ＤＭ－β－ＣＤ」の結果を示し、「■」は「ＨＰ－β－ＣＤ」の結果を示し、「△」は「ＨＥ－ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示す。
　コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線より半数効果濃度（ＥＤ５０）を求めた結果、ＨＰ－β－ＣＤ、ＤＭ－β－ＣＤ、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ２．５９ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．０２４ｍＭであった。
　以上の結果より、細胞内分解性結合を有するＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸは既存のβ－ＣＤ誘導体と比較して１０分の１から１００分の１の濃度でＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であることが明らかとなった。また、非分解性のＨＥ－ＰＲＸは、本実験濃度域では有意なコレステロール減少は示さなかった。
　本結果は、細胞内におけるポリロタキサン中の分解性結合の切断と、それに伴うβ－ＣＤの放出が低濃度でのコレステロール除去に結実したと考えられる。
（試験例６：コレステロール除去作用）
　試料として、下記試料を用いた以外は、試験例５と同様にして試験を行い、ポリロタキサン中の分解性結合の種類がＮＰＣ１からのコレステロール除去作用に与える影響を検討した。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＰＲＸ（比較製造例１で作製）
（２）　ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ（製造例２で作製）
（３）　ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸ（製造例３で作製）
（４）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
　結果を図１４に示す。図１４中、「△」は「ＨＥ－ＰＲＸ」の結果を示し、「□」は「ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ」の結果を示し、「○」は「ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸ」の結果を示し、「▽」は「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示す。
　コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線よりＥＤ５０を求めた結果、ＨＥ－ａｃｅ－ＰＲＸ、ＨＥ－ＣＯＯ－ＰＲＸ、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ０．１３ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．０２４ｍＭであった。
　以上の結果より、細胞内分解性結合を有するポリロタキサンはいずれもＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であることが明らかとなった。特にジスルフィド結合を有するポリロタキサンはコレステロール除去作用が高いことが明らかとなった。このようなポリロタキサン中の分解性結合種によるコレステロール除去作用の差異は、細胞内における分解性結合の分解効率に関係していると考えられる。
（試験例７－１：コレステロール除去作用）
　試料として、下記資料を用いた以外は、試験例５と同様にして試験を行い、ポリロタキサンのシクロデキストリンに導入された官能基の種類がＮＰＣ１からのコレステロール除去作用に与える影響を検討した。
＜試料＞
（１）　ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例１で作製）
（２）　ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例４で作製）
　結果を図１５Ａに示す。図１５Ａ中、「▽」は「ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示し、「●」は「ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」の結果を示す。
　コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線よりＥＤ５０を求めた結果、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸのＥＤ５０は、それぞれ０．０２６ｍＭ、０．００２８ｍＭであった。
　以上の結果より、ポリロタキサンによるＮＰＣ１からのコレステロール除去には、ポリロタキサンに修飾する官能基が影響することが明らかとなった。本結果は、細胞内へのポリロタキサンの取り込み量が変化するためであると予想される。特に静電荷を有するＤＭＡＥ基を導入したポリロタキサンは細胞膜と静電的に強く相互作用し、効率的に細胞内へと取り込まれると考えられる。
（試験例７－２：細胞への取込み量）
　各ポリロタキサンの細胞への取込み量を以下のようにして、フローサイトメトリーにより求めた。
＜試料の調製＞
　ポリロタキサンの細胞への取込み量を調べるために、試料として用いるＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸ、フルオレセインイソチオシアネートエチレンジアミン（ＦＩＴＣ―ＥＤＡ）で修飾したＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（以下、「ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ」と称する）を以下のようにして調製した。
－ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸの調製－
　試験例４と同様にして調製した。
－ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸの調製－
　製造例４で調製したＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ　３０ｍｇを５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。１，１’―カルボニルジイミダゾールを０．７６ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。ＦＩＴＣ－ＥＤＡを４．２ｍｇ加え、室温でさらに２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応のＦＩＴＣ－ＥＤＡを除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸを２７．５ｍｇ得た。ＦＩＴＣの修飾数は紫外－可視分光光度計を用いて４９４ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸとＦＩＴＣ－ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸを混合し、ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸ上のβ－ＣＤ　一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．０４分子となるよう調整した。
＜フローサイトメトリー＞
　ＮＰＣ１を２４ウエルプレート（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し（細胞数：１×１０５個／ディッシュ）、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を２７０μＬのダルベッコ改変イーグル培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して０．２５ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。
　その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
　細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により求めた。細胞１０，０００個を数え、その平均値を図１５Ｂに示す。
　フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸとＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸとの細胞内への取込み量を比較した結果、ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸは、ＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸの２２．６倍高い蛍光強度を示した（図１５Ｂ、図１５Ｂ中、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸはＦＩＴＣ標識ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸの結果を示し、ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸは、ＦＩＴＣ標識ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸの結果を示す）。本結果より、ＤＭＡＥ－ＳＳ－ＰＲＸは効率的に細胞に取り込まれるため、ＨＥ－ＳＳ－ＰＲＸよりも低濃度でＮＰＣ１からのコレステロール除去が可能であると考えられる。
（試験例８：免疫染色によるオートファゴソームの観察）
　前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％　ＣＯ２環境下で１日間培養後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
　前記培養後、４％　パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定し、５０μｇ／ｍＬ　ジギトニン溶液（東京化成工業社製）で５分間処理することで細胞膜の透過処理を行い、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で３０分間処理することでブロッキングを行った。
　次いで、Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社製）を１％　ＢＳＡ溶液で１：２００の希釈率で混合したもので、４℃で１日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）（１％　ＢＳＡ溶液で１，０００分の１に希釈）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ－１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行った。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
（２）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製、添加量は、０．１ｍＭ～１０ｍＭ）
　細胞のＬＣ３染色画像を図１６Ａ～図１６Ｄに示し、細胞内ＬＣ３陽性小胞数の定量結果を図１６Ｅに示す。
　図１６Ａは、細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図１６Ｂは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合の結果を示し、図１６Ｃは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加（添加量：１０ｍＭ）した場合の結果を示し、図１６Ｄは、細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加（添加量：ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ上のβ－ＣＤ濃度が１ｍＭとなるように添加）した場合の結果を示す。
　図１６Ｅでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加（添加量：１０ｍＭ）した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加（添加量：ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ上のβ－ＣＤ濃度が１ｍＭとなるように添加）した場合」の結果を示す。
　ＬＣ３染色画像より細胞内のＬＣ３陽性小胞数を定量した結果、図１６Ｅに示されるように、ＮＨＤＦ（正常細胞）と比較してＮＰＣ１では、基底状態のＬＣ３陽性小胞数が有意に多いことが確認された。また、ＨＰ－β－ＣＤを作用させたＮＰＣ１ではＬＣ３陽性小胞数がさらに増加した。一方、ジスルフィド結合を有するポリロタキサン（ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ）を作用させたＮＰＣ１ではＬＣ３陽性小胞数が正常細胞と同程度まで減少することが明らかとなった。
（試験例９：ＬＣ３及びｐ６２の発現評価）
　下記細胞におけるＬＣ３及びｐ６２の発現をウエスタンブロットにより、以下のようにして評価した。
＜細胞＞
（１）　ＮＰＣ１細胞
（２）　ＮＨＤＦ細胞
（３）　ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ１８４５５）
（４）　ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ００１０７）
（５）　ＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手；番号ＧＭ０３５８９）
　前記細胞を１２ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に播種し（細胞数：１×１０５個／ウエル）、３７℃、５％　ＣＯ２環境下で１日間培養後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
　前記培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、１％　プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社製）、１％　ホスファターゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社製）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｗａｋｏ社製）を１５０μＬ加え、３０分間振盪し細胞を溶解した。前記細胞溶解液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。
　前記上清１０μＬと、Ｌａｅｍｍｌｉ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ社製）　２．５μＬとを混合し、１２％アクリルアミドゲルに加えた。その後、１５０Ｖで４５分間電気泳動を行った。その後、トランスブロット　Ｔｕｒｂｏ　ブロッティングシステム（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏｒａｄ社製）に転写した。その後、５％スキムミルク溶液（Ｗａｋｏ社製）で１時間ブロッキングを行った。
　ブロッキング処理の後、オートファジーの指標である抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社製）、選択的オートファジー基質である抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体（ＭＢＬ社製）、抗β－ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１％スキムミルク溶液で希釈したもので、ＰＶＤＦ膜を４℃で１日間処理した。
　ＰＢＳで３回洗浄後、１％スキムミルク溶液で希釈したＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧでＰＶＤＦ膜を室温で１時間処理した。
　ＰＢＳで３回洗浄後、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで処理し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ　５００システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）でＰＶＤＦ膜の撮影を行った。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、前記ＮＨＤＦを用い、試料の代わりにＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１（以下、「Ｂａｆ　Ａ」と称する）を添加した場合、前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合、前記ＮＰＣ１を用い、試料の代わりにＢａｆ　Ａを添加した場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ上のβ－ＣＤ濃度に換算して０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
（２）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製、添加量は、０．１ｍＭ～１０ｍＭ）
　ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１のウエスタンブロットの結果を図１７Ａに示し、ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるＬＣ３－ＩＩの相対発現量を図１７Ｂに示し、ＮＨＤＦ及びＮＰＣ１におけるｐ６２の相対発現量を図１７Ｃに示す。
　また、ＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞のウエスタンブロットの結果を図１７Ｄに示し、ＮＨＤＦ、ＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞におけるＬＣ３－ＩＩの相対発現量を図１７Ｅに示す。
　なお、前記各相対発現量は、ウエスタンブロットのバンド強度から求めたものである。
　図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料の代わりにＢａｆ　Ａを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料の代わりにＢａｆ　Ａを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを０．１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを０．０１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを０．１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」の結果を示す。
　図１７Ｄ、及び図１７Ｅでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを１０ｍＭ添加した場合」、「細胞としてＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを１ｍＭ添加した場合」の結果を示す。
　図１７Ａ～図１７Ｃの結果から、リソソーム内の低ｐＨを中和しオートファジー形成不全を起こすことが知られているＢａｆ　Ａを添加することにより、ＬＣ３、ｐ６２の顕著な増加が認められた。また、ＨＰ－β－ＣＤを添加した場合には、濃度依存的にＬＣ３－ＩＩの発現量が顕著に増加し、１０ｍＭの濃度ではｐ６２の有意な増加も認められた。
　一方、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（細胞内分解性結合を有するポリロタキサン）を添加した場合には、ＬＣ３－ＩＩ、ｐ６２の発現量の増加は起こらなかった。また、バンド強度より相対発現量を求めると、濃度依存的にＬＣ３－ＩＩの発現量は減少した。
　また、図１７Ｄ及び図１７Ｅの結果から、オートリソソームの形成不全が認められているＮＰＣ２変異型ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、ファブリー病患者由来皮膚繊維芽細胞、及びＧＭ１ガングリオシドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞においても、ＨＰ－β－ＣＤの添加はＬＣ３－ＩＩの増加をもたらし、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸの添加はＬＣ３－ＩＩを減少させていた。
　ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸの細胞内ＬＣ３－ＩＩ量の増減に対する効果は細胞種によらず普遍的であり、ＨＰ－β－ＣＤが細胞内にＬＣ３－ＩＩの蓄積をもたらすのに対してＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸはＬＣ３－ＩＩの蓄積を解消していた。
　以上の結果より、ＨＰ－β－ＣＤはオートリソソームの形成を阻害し、反対に細胞内分解性結合を有するポリロタキサンはオートリソソームの形成を促進していることが予想された。
（試験例１０：オートリソソーム形成の観察）
　ＥＧＦＰが酸性下で消光することを利用し、酸性下でも励起－蛍光が可能なｍＲＦＰを、ＥＧＦＰを介してＬＣ３と結合することで、それぞれの蛍光画像よりオートファゴソーム、オートリソソームの形成を評価した（Ｓ．　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　３，　４５２－２６０　（２００７））。具体的には、以下のようにして行った。
　前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％　ＣＯ２環境下で１日間培養した。
　ｍＲＦＰ－ＥＧＦＰ－ＬＣ３を直列に結合したｐｔｆＬＣ３プラスミドＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入；番号２１０７４）２５０ｎｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社製）で希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（ライフテクノロジーズ社製）を加え５分間静置した。
　前記プラスミド含有溶液を前記細胞培養液中に添加し、２４時間培養した。培養液を交換後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
　前記培養後、４％　パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後。ＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ－１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行った。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して１ｍＭ）
（２）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製、添加量は、１０ｍＭ）
　各細胞中のｐｔｆＬＣ３の発現を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１８Ａに示し、オートファゴソーム数及びオートリソソーム数の画像解析結果を図１８Ｂに示す。
　図１８Ａでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、上段は「ＧＦＰ」に由来する蛍光画像を示し、下段は「ｍＲＦＰ」に由来する蛍光画像を示す。
　図１８Ｂでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、各項目における左側は、オートファゴソーム数、右側は、オートリソソーム数を解析した結果を示す。
　図１８Ａ及び図１８Ｂの結果から、未処理の正常繊維芽細胞と比較して、未処理のＮＰＣ１細胞ではオートファゴソーム数の増加とオートリソソーム数の減少が認められた。
　ＨＰ－β－ＣＤで処理したＮＰＣ１細胞では、オートリソソーム数に変化はないものの、オートファゴソーム数の増加が認められた。
　一方、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、正常細胞とほぼ同程度のオートファゴソーム、オートリソソームが観察され、細胞内分解性結合を有するポリロタキサンの添加により、ＮＰＣ１細胞におけるオートリソソームの形成不全を解消できることが明らかとなった。
（試験例１１：オートファゴソームとリソソームとの融合の観察）
　オートリソソームの形成をより詳細に調べるために、プラスミドＤＮＡにより一過的に発現させたｍＲＦＰ－ＬＣ３、及びリソソーム特異的膜タンパク質であるＬＡＭＰ１の局在を、以下のようにして観察した。
　前記ＮＰＣ１を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し（細胞数：１．５×１０４個／ディッシュ）、３７℃、５％　ＣＯ２環境下で１日間培養した。
　ｍＲＦＰ－ＬＣ３発現プラスミドＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入；番号２１０７５）２５０ｎｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社製）で希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（ライフテクノロジーズ社製）を加え５分間静置した。
　前記プラスミド含有溶液を前記細胞培養液中に添加し、２４時間培養した。培養液を交換後、下記試料を添加し、さらに２４時間培養した。
　前記培養後、４％　パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で１０分間処理することで細胞を固定し、５０μｇ／ｍＬ　ジギトニン溶液（東京化成工業社製）で５分間処理することで細胞膜の透過処理を行い、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で３０分間処理することでブロッキングを行った。
　次いで、Ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ＬＡＭＰ１抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製）を１％　ＢＳＡ溶液で１：２００の希釈率で混合したもので、４℃で１日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）（１％　ＢＳＡ溶液で１，０００分の１に希釈）で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ－１０ｉ（オリンパス社製）で観察を行い、ｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を評価した。
　なお、比較として、前記ＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合、及び前記ＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合についても同様にして試験した。
＜試料＞
（１）　ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸ（製造例５で作製、添加量は、シクロデキストリン濃度に換算して１ｍＭ）
（２）　ＨＰ－β－ＣＤ（シグマ－アルドリッチ社製、添加量は、１０ｍＭ）
　各細胞中のｍＲＦＰ－ＬＣ３及びＬＡＭＰ１の発現を観察した結果を図１９Ａに示し、ｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を求めた結果を図１９Ｂに示す。
　図１９Ａでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合」の結果を示し、上段は「ｍＲＦＰ－ＬＣ３」の発現を観察した結果を示し、下段は内在性「ＬＡＭＰ１」の局在を観察した結果を示す。
　図１９Ｂでは、左側から順に、「細胞としてＮＨＤＦを用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料を添加しなかった場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＰ－β－ＣＤを添加した場合」、「細胞としてＮＰＣ１を用い、試料としてＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸを添加した場合」の結果を示す。図１９Ｂにおける縦軸は、細胞におけるｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率を示す。
　図１９Ａ及び図１９Ｂの結果から、未処理の正常繊維芽細胞と比較して、未処理のＮＰＣ１細胞ではｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が低く、オートリソソームの形成が生じにくいことが示唆された。
　また、ＨＰ－β－ＣＤで処理したＮＰＣ１細胞では、未処理のＮＰＣ１細胞と同様にｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が低かった。
　一方、ＨＥＥ－ＳＳ－ＰＲＸで処理したＮＰＣ１細胞では、ｍＲＦＰ－ＬＣ３とＬＡＭＰ１との共局在率が正常細胞とほぼ同程度まで上昇し、オートリソソーム形成の亢進が示唆された。
　試験例８～１１の結果から、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンは、オートリソソームの形成を亢進する作用を示すことが見出された。そのため、本発明のポリロタキサンは、オートリソソームの形成不全によりオートファジー機能が阻害された疾患に対する医薬品としての応用が期待される。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物である。
　＜２＞　脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患が、ライソゾーム病である前記＜１＞に記載の医薬組成物である。
　＜３＞　環状分子が、シクロデキストリンである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜４＞　細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜５＞　線状分子が、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコールのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜６＞　ライソゾーム病が、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、及びファブリー病から選択されるいずれかである前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜７＞　ライソゾーム病が、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、及びファブリー病から選択されるいずれかである前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜８＞　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
　前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、
　前記複数の環状分子がβ－シクロデキストリンであることを特徴とするポリロタキサンである。
　＜９＞　細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである前記＜８＞に記載のポリロタキサンである。
　＜１０＞　脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
　＜１１＞　前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物の脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための使用。
　＜１２＞　脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患を予防又は治療するための医薬品製造のための前記＜８＞または＜９＞のポリロタキサンの使用。
　本発明の医薬組成物は、ポリロタキサン構造を有することにより、溶血を回避することができるため従来のシクロデキストリン単体より安全性が高いだけでなく、細胞内選択的にシクロデキストリンを放出することで高いコレステロール除去作用を有する。また、本発明の医薬組成物は、優れたオートリソソームの形成亢進作用を有する。これらの作用により、高い治療効果又は予防効果を有し、かつ副作用の少ない優れた医薬組成物として利用可能である。また、本発明の医薬組成物は、ポリロタキサン構造を有しており、シクロデキストリンよりも高分子量化されているため、血中半減期の延長による薬効の持続性、投与量や投与回数の低減も期待される。

Claims (8)

  1. 　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンを含有することを特徴とする脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患に対する医薬組成物。
  2. 　脂質代謝異常及びオートファジーの機能異常の少なくともいずれかに起因する疾患が、ライソゾーム病である請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　環状分子が、シクロデキストリンである請求項１から２のいずれかに記載の医薬組成物。
  4. 　細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  5. 　線状分子が、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコールのいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 　ライソゾーム病が、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファーバー病、ウォルマン病、及びファブリー病から選択されるいずれかである請求項２から５のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 　複数の環状分子を貫通させた線状分子の両端部に細胞内分解性結合を介して嵩高い置換基を有するポリロタキサンであって、
    　前記線状分子は、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールの順に重合した共重合体であり、
    　前記複数の環状分子がβ－シクロデキストリンであることを特徴とするポリロタキサン。
  8. 　細胞内分解性結合が、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、及びヒドラジド結合から選択されるいずれかである請求項７に記載のポリロタキサン。
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