WO2015004305A1 - Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones - Google Patents

Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones Download PDF

Info

Publication number
WO2015004305A1
WO2015004305A1 PCT/ES2014/070569 ES2014070569W WO2015004305A1 WO 2015004305 A1 WO2015004305 A1 WO 2015004305A1 ES 2014070569 W ES2014070569 W ES 2014070569W WO 2015004305 A1 WO2015004305 A1 WO 2015004305A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hsl
peptide
ahl
polynucleotide
bacterium
Prior art date
Application number
PCT/ES2014/070569
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ana María OTERO CASAL
Manuel ROMERO BERNÁRDEZ
Celia MAYER MAYER
Original Assignee
Universidade De Santiago De Compostela
Fundación Pedro Barrié De La Maza, Conde De Fenosa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidade De Santiago De Compostela, Fundación Pedro Barrié De La Maza, Conde De Fenosa filed Critical Universidade De Santiago De Compostela
Priority to US14/904,278 priority Critical patent/US10316302B2/en
Priority to EP14822500.6A priority patent/EP3020814B1/en
Priority to ES14822500T priority patent/ES2742307T3/es
Publication of WO2015004305A1 publication Critical patent/WO2015004305A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates, in general, to a peptide with quorum sensing (QS) signal inhibitory activity and its applications.
  • the invention also relates to the polynucleotide encoding said transgenic non-human peptide, vectors, cells and organisms comprising said polynucleotide.
  • QQ Quorum Quenching
  • Quorum Sensing (Otero Casal et al., 2004). These processes consist of the release into the medium of small signal molecules that allow bacteria to quantify the presence of other bacteria by means of specific sensors, acting in a coordinated manner once the threshold concentration of the signal indicating the existence of quorum has been reached.
  • the QS controls the production of virulence factors, such as exoenzymes or pigments, of numerous pathogens, both human and animal and plant (Whitehead et al., 2001; Fuqua and Greenberg, 2002; Bassler and Losick, 2006; Williams et al., 2007), including important nosocomial pathogens such as Pseudomonas aeruginosa.
  • QQ Quorum Quenching
  • the mechanisms of QQ are considered the new antipathogenic agents placing them as an important object of study, since one of its possible applications is the control of pathogens of both plants and animals, including humans, that act through QS processes.
  • the QQ process has a lower probability of resistance selection and greater specificity, affecting only the recipient bacteria.
  • the use of QQ strategies accompanied by antibiotics could lead to the control of multidrug-resistant pathogens such as P. aeruginosa.
  • aquaculture its application as antibiotic substitutes is an alternative with a wide potential, due to legislative restrictions on the use of antibiotics in this field, as well as in other animal health fields.
  • the QS and QQ processes gain real importance in the marine environment because of their ecological implications, and especially in the field of aquaculture since the QS processes mediated by N-acyl-homoserin lactones ( AHLs) or type 2 autoinductors (AI-2) are abundantly widespread in marine pathogens such as Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. salmonicida, V. vulnificus, Aeromonas salmonicida, A.
  • AHLs N-acyl-homoserin lactones
  • AI-2 type 2 autoinductors
  • biofilms A process controlled by QS phenomena to highlight is the formation of biofilms, of great economic and clinical impact. It is known that many of these biofilms are closely related to human infectious processes. The mechanisms by which biofilm produces the symptoms of the disease are not yet fully established, although it has been suggested that biofilm bacteria can produce endotoxins, groups of bacteria can be released into the bloodstream, they become resistant to the phagocytic action of Immune system cells, and, on the other hand, constitute a niche for the emergence of bacteria resistant to antibiotic treatments. This last aspect can be especially relevant since resistant bacteria originating in a biofilm could spread from patient to patient through the hands of healthcare personnel.
  • Biofilm-forming pathogens are very resistant to antibiotics and can adhere to food or substances in contact with them, causing hygiene problems as well as possible food toxinfections and ultimately, great economic losses.
  • they are often found on the surface of medical implants or in devices inserted in the body. They can also form in areas of the body that are exposed to air; in particular, in wounds and pleura.
  • Pseudomonas aeruginosa is one of the most infectious and problematic bacteria by forming biofilms difficult to treat with conventional antibiotics.
  • cystic fibrosis it colonizes the lungs causing infections that are difficult to treat, and, often, ultimately fatal. It is also especially interesting in patients with chronic wounds or burns.
  • Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are currently classified as the main causes of nosocomial infections. This situation is favored by the fact that these species inhabit both the mucous membranes and the skin of human beings, which allows, through surgical wounds, to penetrate the patient's bloodstream through contact. Directly or indirectly with health personnel, with a contaminated object or even with another patient. These species form biofilms that colonize catheters, drains and implants, favoring contamination and antibiotic resistance. In addition, one of the biological biofilms that presents greater complexity and of greater clinical relevance is dental plaque, whose formation is responsible, among other pathogens of the oral cavity, Streptococcus mutans, which also forms biofilms.
  • biofilms contribute to biological contamination of surfaces, mechanical blockage in ducts, drinking water distribution systems, air conditioning systems, fire systems, etc. Finally, it should be added that they favor the formation of "biofouling" by being the basis for the growth of other higher organisms on submerged surfaces, constituting a serious economic problem in the aquaculture and maritime transport sector.
  • the marine bacteria Tenacibaculum sp. strain 20J presents a high capacity of QQ.
  • Tenacibaculum sp. 20J (CECT 7426): a strain with high QQ capacity
  • the marine bacteria Tenacibaculum sp. strain 20J (CECT 7426) is characterized by a high degradation capacity of AHL signals, much higher than other bacteria with QQ activity that have been isolated from soil (Romero et al., 2012). This is the isolate obtained from a sediment sample from a marine fish culture tank, in TSA-I medium (Romero, 2010).
  • the partial sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the strain has a 99% identity percentage with the type of pathogenic marine bacterial strain Tenacibaculum discolor DSM 18842 / NCIMB 14278, belonging to the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) phylum, which causes the bacterial infection known as tenacibatitis / flexibacteriosis or "gliding bacterial disease" (Pi ⁇ eiro-Vidal et al., 2008). A distinctive feature of Tenacibaculum sp.
  • CFB Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides
  • strain 20J (CECT 7426) is that it is capable of growing in media devoid of sea salts (TSA-1), so if strictly applied taxonomic characters set for the genus Tenacibaculum would exclude strain 20J of species 7 discolor (Pi ⁇ eiro Vidal et al., 2008). Therefore, throughout this text the terminology Tenacibaculum sp. strain 20J or simply "strain 20J".
  • the living cells and cell extracts of strain 20J degrade the entire size range of known AHLs, with or without oxo-substitutions, so that their activity is highly nonspecific (Romero, 2010). It is a fast growing strain, cultivable in both marine and terrestrial environments.
  • strain 20J is a promising candidate for the control of pathogens related to human health, aquaculture, animals and plants or in the inhibition of biofilm formation (Romero, 2010) and therefore these applications have been protected by patent (ES 2342807 B2).
  • the invention relates to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a variant thereof having an identity degree of at least 76% with respect to said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with Quorum Sensing (QS) inhibitory activity.
  • QS Quorum Sensing
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising said polynucleotide.
  • the invention relates to a cell comprising said polynucleotide, or said vector, or the peptide encoded by said polynucleotide, with the proviso that said cell is not a bacterium of the genus Tenacibaculum.
  • the invention relates to a transgenic non-human organism comprising, inserted in its genome, said polynucleotide or said vector, with the proviso that said organism is not a bacterium of the genus Tenacibaculum.
  • the invention relates to a peptide encoded by the nucleotide sequence of said polynucleotide.
  • the invention relates to a composition comprising said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide.
  • said composition further comprises a vehicle selected from a vehicle suitable for food, a pharmaceutically acceptable vehicle and an agriculturally acceptable vehicle.
  • the invention in another aspect, relates to a food product comprising said composition and a vehicle suitable for food.
  • the invention relates to the use of said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, in the preparation of a food product.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising said composition and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention relates to the use of said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a bacterial infection.
  • the invention in another aspect, relates to an agricultural composition comprising said composition and an agriculturally acceptable vehicle.
  • the invention in another aspect, relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises contacting said plant with said peptide, wherein said bacterial disease is caused by a bacterium producing QS signals, under conditions that allow to control said bacterial disease.
  • the invention relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises transforming said plant with said polynucleotide or vector, wherein said bacterial disease is caused by a bacterium producing QS signals.
  • the invention relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises the use of a bacterium transformed with said polynucleotide or vector, wherein said bacterial disease is caused by a bacterium producing QS signals, under conditions that allow controlling said bacterial disease.
  • the invention relates to the use of said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, to cause a quorum quenching process (QQ) in response to a QS process, wherein said QS process It is caused by a bacterium producing QS signals.
  • QQ quorum quenching process
  • the invention in another aspect, relates to a method for provoking a QQ process in response to a QS process, wherein said QS process is caused by a QS signal producing bacterium, which comprises contacting said bacterium with said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, under conditions that allow to cause said QQ process.
  • the invention relates to the use of said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, to inhibit a QS process, wherein said QS process is caused by a bacterium producing QS signals.
  • the invention in another aspect, relates to a method for inhibiting a QS process, wherein said QS process is caused by a bacterium producing QS signals, which comprises contacting said bacterium with said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, under conditions that allow to inhibit said QS process.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method for degrading a QS signal, which comprises contacting said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, with said QS signal, under conditions that allow degrading said QS signal.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method for modulating the signaling activity of an N-acyl-homoserin lactone (AHL), which comprises putting in contact said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, with said AHL, under conditions that allow modulating the signaling activity of said AHL.
  • AHL N-acyl-homoserin lactone
  • the invention relates to the use of said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, to inhibit the formation of a bacterial biofilm ex vivo or in vitro.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro or ex vivo method for inhibiting the formation of a bacterial biofilm, wherein said bacterial biofilm is produced by a bacterium producing a QS signal, which comprises contacting said polynucleotide, vector, cell, transgenic non-human organism or peptide, with said bacterium producing QS signals, under conditions that inhibit the formation of said bacterial biofilm.
  • said QS signals produced by the bacterium comprise an AHL, wherein said AHL is (i) an unsubstituted AHL, wherein said unsubstituted AHL is selected from the group consisting of C4-HSL, C6- HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL and their combinations; (ii) an oxo- or hydroxy substituted AHL, wherein said oxo- or hydroxy substituted AHL is selected from the group consisting of OC6-HSL, OC12-HSL and combinations thereof; or (iii) combinations of (i) and (ii).
  • Figure 1 Photograph of the positive clone 13-E2 obtained in the screening of the genomic library of strain 20J. It is observed that the well appears without violacein pigment, unlike the rest of the wells of the microtiter plate, due to the degradation of the exogenously added AHL.
  • FIG. 2 HPLC-MS analysis of C6-HSL degradation after 24 hours by cellular extracts of positive clone 13-E2 (ECC 13E2). Controls: PBS and E. coli ⁇ 10 ⁇ without the phosphide (ECC ⁇ 10 ⁇ ). It was acidified to pH 2 to recover the lactone ring (shaded bars).
  • Figure 3 HPLC-MS analysis of C10-HSL degradation after 24 hours by cellular extracts of positive clone 13-E2 (ECC 13E2). Controls: PBS and E. coli DI- ⁇ ⁇ without the phosphide (ECC DH 10 ⁇ ). It was acidified to pH 2 to recover the lactone ring (shaded bars).
  • FIG. 4 Photograph of the solid medium bioassay of 3 of the positive clones of the second library constructed from the randomly selected clone 13-E2 insert (1-E6, 1-G7 and 4-A9) and 1 negative clone ( 1 E9) with the AHLs biosensors C. violaceum CV026 (A) and C. violaceum VIR07 (B). All the clones tested were able to degrade C6-HSL and C10-HSL after 24 hours preventing the formation of the halo of violacein in the biosensors. The well with violacein corresponds to a confirmed negative clone (1-E9) used as a control.
  • FIG. 7 Results of the bioassay for degradation of C6-HSL (above) and C10-HSL (below) by living cells of different species of the Tenacibaculum genus.
  • the bacteria were grown in Marine Broth for 24 hours and then resuspended in PBS pH 6.5 to which the AHL was added at a concentration of 10 ⁇ .
  • Degradation was visualized by the Violacein production activation test in the C. violaceum CV026 and VIR07 biosensors that produce this pigment only in the presence of AHL (Romero et al., 2011).
  • Figure 8 Alignment of the lactonases of Tenacibaculum sp. 20J (AN20J), T. discolor (AiiTD), T. gallaicum (AiiTG), T. lutimaris (AiiTL), T. aestuarii (ANTA) and T. soleae (AiiTS) obtained by amplification with primers designed for the ends of AN20J .
  • AN20J T. discolor
  • AiiTD T. gallaicum
  • AiiTL T. lutimaris
  • AiiTL T. aestuarii
  • AiiTS T. soleae
  • FIG. 10 Nucleic acid electrophoresis in 1% agarose gene. M Street: molecular weight marker (bp). 1: miniprep of an XLI blue culture transformed with pET28c (+) with the AN20J insert. 2: double digestion of this miniprep with EcoRI and Ncol, the insert of the AN20J gene (861 bp) appears in the corresponding size.
  • FIG. 11 1% agarose gel nucleic acid electrophoresis.
  • M Molecular weight marker (bp). 1: PCR of one of the recombinant colonies obtained by electroporation in BL21 (DE3) with primers TEN1 F and TEN 1 R, the fragment appears between the internal homologous domains (237 bp) in the corresponding size.
  • FIG. 13 Denaturing polyacrylamide electrophoresis gel (SDS-PAGE) with coomass blue staining of purified AN20J protein from the extract of a 24 h culture of E. coli BL21 DE3 pET28c + AN20J.
  • a histidine affinity column was used for protein purification (His GraviTrap TM affinity columns, GE Healthcare).
  • the band obtained from protein (-34.9 kDa) in the gel lane belongs to the fraction collected from the purification.
  • FIG. 14 Bioassay to determine the Minimum Active Concentration (CMA) of AN20J versus C6-HSL (CV026) and C10-HSL (VIR07). Different dilutions were incubated. of an ANA solution of 0.2 mg / mL with the AHLs at a concentration of 10 ⁇ for 3 hours (upper panel) and 24 hours (lower panel). The concentration of the highest dilution that completely eliminated the signal (absence of halo of violacein) in the stipulated time was considered as CMA.
  • CMA Minimum Active Concentration
  • Figure 15 Degradation kinetics of C6-HSL and C10-HSL 50 ⁇ by purified AN20J (20 ⁇ g / mL) of Tenacibaculum sp. 20J or by purified ANA (40 ⁇ g / mL) of Bacillus sp. and thermostability of AN20J at 60 ° C with C6-HSL (50 ⁇ ) determined by HPLC-MS analysis.
  • the controls were established with the signals in PBS.
  • the data are the average of 3 independent reactions, showing the mean and standard deviation.
  • FIG. 17 Photograph of the bioassay in solid medium of pH resistance of purified AN20J at a final concentration of 20 ⁇ g / mL at 22 ° C with different buffers (values of 3-9 pH) for the two C6-HSL signals (left plate ) and C10-HSL (right plate). The AHLs were incubated for 3 hours with the enzyme previously treated at the indicated pH.
  • FIG. 18 Effect of Chymotrypsin (Lower Panel) and Proteinase K (Upper Panel) on the enzymatic activity of AN20J.
  • AN20J (20 ⁇ g / mL) was incubated with solutions of both enzymes (proteinase K / AN20J 1: 10 and chymotrypsin / AN20J 1: 60) for 30 or 60 minutes and then C6-HSL or C10-HSL was added to evaluate activity of the enzyme.
  • the central wells correspond to the negative control of PBS plus the corresponding AHL and with violacein halo the negative controls of the proteinase K and chymotrypsin treated appear under the same conditions as the samples but without the enzyme AN20J.
  • Figure 19 HPLC-MS analysis of the degradation capacity of C6-HSL by purified AN20J after treatment with different temperatures (22, 60, 80 and 90 ° C) for 10 minutes.
  • the protein concentration was 20 ⁇ g / mL.
  • the control (dotted bar) was performed in PBS.
  • Figure 20 Photograph of the solid medium bioassay of the E. coli BL21 DE3 CCE with plasmid pET28c (+) and AN20J for C6-HSL.
  • the activity of 20J within the extract resisted treatment at all temperatures by degrading the C6-HSL signal at 3 hours preventing the formation of the halo of violacein in the biosensor.
  • the central wells correspond to the negative controls of PBS with the same concentration of AHL (10 ⁇ ).
  • Figure 21 The absence of AN20J interference with the action of some ⁇ -lactam antibiotics is shown.
  • An antibiogram of wells of different antibiotics of the cephalosporin group against Staphylococcus aureus is shown.
  • the untreated antibiotics are shown on the left plate.
  • the antibiotics treated with AN20J (20 ⁇ g / mL for 24 hours) are shown on the right plate.
  • the diameter of the inhibition halos was not affected by the enzyme treatment for any of the antibiotics and ⁇ -lactamase inhibitors tested.
  • FIG 22 The acid resistance of E. coli K12 MG1655 is shown.
  • the cells were cultured in LB glucose (0.4%) with the different conditions: E. coli K-12 (Control), E. coli with OC6-HSL 5 ⁇ (Control AHL), E. coli with AN20J at 20 ⁇ g / mL (AN20J) and E. coli with OC6-HSL and AN20J (AN20J AHL) at 30 ° C and then subcultured in MEM at pH 2.0 with glucose (0.4%) and glutamate (1.6 mM) at the same temperature
  • the survival of E. coli was determined by quantifying CFU / mL at 0, 1, 5 and 3 hours and was expressed as a percentage (%) of viable cells with respect to 0 hours. Each condition was tested in triplicate and the error bars represent the standard deviation.
  • the invention relates to a polynucleotide, hereinafter "polynucleotide of the invention", which comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a variant thereof having an identity degree of at least 76% with respect to said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with Quorum Sensing (QS) inhibitory activity.
  • QS Quorum Sensing
  • the term "Quorum Sensing” or “QS”, also known as “quorum detection” refers to the ability of a microorganism to perceive and respond to population density by regulating the expression genetics, thus being able to develop a coordinated social behavior.
  • QS signals small chemical signaling molecules
  • the detection of said QS signals allows the bacteria to distinguish between a high population density and a low population density, so that, as the bacterial population grows, the extracellular level of the signal molecule increases, until a threshold concentration equivalent to a minimum census or quorum that triggers a variation of bacterial gene expression in response to changes in cell numbers.
  • N-acyl-homoserine lactones (AHLs), based on a lactone ring (HSL) to which, by means of an amide bond, a fatty acid constituting the side chain is attached; said side chain is normally between 4 and 18 carbon atoms in length, may be saturated or unsaturated and may or may not have oxo- or hydroxy- substitutions in the third carbon atom;
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL), N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL), N-octanoyl -L-homoserine lactone (C8-HSL), N-decanoyl-L-homoserine lactone (C10-HSL), N-dodecanoyl-L-homoserine lactone (C10-HSL), N-d
  • AHL signals are quite common in Gram-negative bacteria although they have also been discovered in other phyla (eg, in some cyanobacteria, in members of Citofaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), also known as Bacteroidetes); b) Self-inducing peptides (AIPs), correspond to low molecular weight peptides (usually have between 5 and 34 amino acid residues), which suffer post-translational modifications; different families of AIPs are known.
  • AIPs include nisin, staphylococcus AIP-1 as well as isoprenylated tryptophan peptides.
  • Type autoinductors ⁇ ( ⁇ -2), whose structure is a furanosyl borate diester, found in both Gram-positive and Gram-negative bacteria.
  • Illustrative, non-limiting examples of this AI-2 include (2S, 4S) -2-methyl-2,3,3,4-tetrahydroxytetrahydrofuran-borate, (2R, 4S) -2-methyl-2,3,3, 4-tetrahydroxy tetrahydrofuran-borate, etc.
  • AI-3 whose structure is not known and believed to be related to communication between prokaryotes and eukaryotes, which establishes cross-signaling mechanisms with eukaryotic hormones epinephrine and norepinephrine, and which has been described in enterohemorrhagic strains of Escherichia coli and others Enterobacteria
  • a peptide with "Quorum Sensing (QS) inhibitory activity” refers, in general, to a peptide that inhibits a QS process mediated by QS signals, wherein said QS signals are select between AHLs, APIs, AI-2, AI-3 and combinations thereof.
  • said peptide with QS inhibitory activity is a peptide that inhibits signals mediated by AHLs by hydrolyzing the lactone ring present in said AHLs, such as a peptide with lactone activity, that is, a peptide that hydrolyzes lactone (ring HSL) generating the corresponding hydroxy carboxylic acid.
  • the lactonase activity of the peptide of the invention can be determined by various enzymatic assays known to those skilled in the art. In general, all enzyme assays suitable for this purpose measure the substrate consumed or the product generated in the reaction for a certain period of time.
  • the enzymatic activity can be determined by measuring the initial reaction rate, method by which measurements are made in a very short period of time and in saturating concentrations of substrate, so that the concentration of free substrate is considered equal to the initial substrate and the measured speed is the maximum reached under the given reaction conditions.
  • the enzymatic activity can be determined by measuring the progress of the curve during the reaction, where the concentration of the substrate consumed or the product obtained is determined as a function of time.
  • the enzymatic activity can be determined by measuring the concentration of substrate or product in the rapid initial transient phase of the enzymatic reaction in which the intermediate molecular complex reaches a constant kinetic period.
  • the enzymatic activity can be determined in the equilibrium phase of the reaction, which consists in altering the equilibrium of the enzymatic reaction by modifying the reaction conditions such as temperature, pH, pressure, etc. and the study of how the enzyme, substrate and product mixture returns to equilibrium conditions again.
  • the lactonase activity of a peptide can be determined by any suitable conventional method known to those skilled in the art. Said method may be based on the determination of the amount of substrate consumed or of the product generated in the reaction for a certain period of time. For this, the appropriate substrate for the lactonase activity to be tested will be used. In the experimental part that accompanies this description, various suitable assays for determining the lactonase activity of a peptide are described (see, for example, Example 3, section 3.3).
  • the lactonase activity of a peptide is determined by hydrolysis of a lactone, preferably, an AHL, such as an unsubstituted AHL, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL , C12-HSL or C14-HSL, or an oxo- or hydroxy-substituted AHL, for example, OC6-HSL or OC12-HSL.
  • an AHL such as an unsubstituted AHL, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL , C12-HSL or C14-HSL, or an oxo- or hydroxy-substituted AHL, for example, OC6-HSL or OC12-HSL.
  • the lactonase activity of a peptide can be carried out by means of an assay comprising contacting said peptide with the corresponding substrate, for example, C6-HSL, C10-HSL, OC6-HSL, etc., under appropriate conditions and, subsequently, evaluate the presence of non-degraded substrate by means of a plate bioassay with the bioindicating strains Chromobacterium violaceum CV026 and C.
  • an assay comprising contacting said peptide with the corresponding substrate, for example, C6-HSL, C10-HSL, OC6-HSL, etc.
  • said peptide with QS inhibitory activity is a peptide that degrades or inhibits AIP type signals, such as a peptide with hydrolase activity, that is, a peptide that hydrolyzes the AIP peptide or that inhibits the activity of the AIP peptide. signal mediated by said AIP.
  • the inhibitory activity of signals mediated by AIPs can be determined by conventional methods known to those skilled in the art, such as those described in Boles and Horswill, 2008.
  • said peptide with QS inhibitory activity is a peptide that degrades or inhibits signals of type AI-2, such as a peptide with hydrolase activity, that is, a peptide that hydrolyzes AI-2 or inhibits the signal activity mediated by said AI-2.
  • the inhibitory activity of signals mediated by AI-2 can be determined by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the degradation activity of Al-2 is determined using cultures of different strains of the bioluminescent marine species Vibrio harveyi with specific mutations in the QS systems that control the production of light, to which the peptide is added with QS inhibitory activity, and the amount of light produced is evaluated.
  • strain JMH597 of this species only the AI-2 channel is active (AHL-, AI-2 +, CAI-1-), so that in case the peptide added to the culture has QQ activity against AI-2, there would be no light in this particular strain.
  • said peptide with QS inhibitory activity is a peptide that degrades or inhibits AI-3 mediated signals, such as a peptide with hydrolase activity, that is, a peptide that hydrolyzes the AI-3 peptide or that inhibits the activity of the signal mediated by said AI-3.
  • AI-3 mediated signals can be determined by conventional methods known to those skilled in the art, such as those described in Hughes et al, 2009.
  • SEQ ID NO: 1 has been identified from Tenacibaculum sp. strain 20J (CECT 7426), a marine bacterium with high degradation capacity of AHL signals, as mentioned in Spanish patent ES2342807, by means of an assay based on the construction of a genomic library of Tenacibaculum sp. strain 20J in phosphide and functional screening, as described in Example 1.
  • Said SEQ ID NO: 1 encodes a peptide with QS inhibitory activity.
  • the polynucleotide of the invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 includes both the start codon (ATG) and the termination codon (TAA).
  • nucleotide sequence of the polynucleotide consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • polynucleotide of the invention is a substantially homologous and functionally equivalent variant of the polynucleotide whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide is "substantially homologous" to the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 when its nucleotide sequence has a degree of identity with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of, at less, 76%, advantageously at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97% or 98%, and, even more preferably, of at least 99%.
  • the degree of identity between two nucleotide sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as, for example, BLAST (Altschul SF et al.
  • a polynucleotide substantially homologous to the polynucleotide whose nucleotide sequence comprises, or consists of, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be constructed based on the nucleotide sequence shown in said SEQ ID NO: 1 by the introduction of, for example, nucleotides or codons encoding amino acids that constitute conservative or non-conservative substitutions with respect to the amino acids encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide is "functionally equivalent" to the polynucleotide whose nucleotide sequence comprises, or consists of, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 when it encodes a peptide that has QS inhibitory activity.
  • the inhibitory activity of the polynucleotide-encoded peptide functionally equivalent to the polynucleotide whose nucleotide sequence comprises, or consists of, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be determined by conventional methods of determining said QS inhibitory activity (eg, signal inhibitory activity mediated by AHLs, AIPs, AI-2 and / or AI-3), such as those mentioned previously.
  • QS inhibitory activity eg, signal inhibitory activity mediated by AHLs, AIPs, AI-2 and / or AI-3
  • the polynucleotide of the invention is a substantially homologous and functionally equivalent variant thereof, that is, it is a polynucleotide whose nucleotide sequence has an identity degree of at least 76%, advantageously of at least 85 %, preferably of at least 90%, more preferably of at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% or 98%, and, still more preferably of , at least 99%, with respect to the nucleotide sequence shown in said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with QS inhibitory activity.
  • the polynucleotide of the invention is a polynucleotide whose nucleotide sequence has an identity degree of at least 76% with respect to the nucleotide sequence shown in said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with inhibitory activity of QS.
  • the polynucleotide of the invention is a polynucleotide whose nucleotide sequence has an identity degree of at least 90% with respect to the nucleotide sequence shown in said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with inhibitory activity of QS.
  • the polynucleotide of the invention is a polynucleotide whose nucleotide sequence has an identity degree of at least 99% with respect to the nucleotide sequence shown in said SEQ ID NO: 1 and encodes a peptide with inhibitory activity of QS.
  • the polynucleotide of the invention can be found as such or as part of a gene construct, hereinafter referred to as a gene construct of the invention, comprising said polynucleotide of the invention.
  • the gene construct of the invention may, operably linked, incorporate a sequence regulating the expression of the polynucleotide of the invention, thereby constituting an expression cassette.
  • operably linked means that the peptide of the invention, encoded by the polynucleotide of the invention, is expressed in the correct reading frame under the control of the control or regulatory expression sequences. .
  • Control sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, translation of the peptide of the invention, and include promoter sequences, coding sequences for transcriptional regulators, ribosome binding sequences (RBS) and / or terminator sequences of transcription.
  • said expression control sequence is functional in prokaryotic cells and organisms, for example, bacteria, etc.
  • said expression control sequence is functional in eukaryotic cells and organisms, for example. , insect cells, plant cells, mammalian cells, etc.
  • the construction of the invention further comprises a marker or gene that codes for a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said construction.
  • the gene construct of the invention can be obtained by employing techniques widely known in the state of the art (Sambrook et al., 2001).
  • the invention relates to a vector, such as a recombinant vector, hereinafter vector of the invention, comprising the polynucleotide of the invention or the gene construct of the invention.
  • a vector such as a recombinant vector, hereinafter vector of the invention
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector of the invention is an expression vector.
  • the vector where the polynucleotide of the invention is introduced can be a plasmid which, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • vectors into which the polynucleotide of the invention or the gene construct of the invention can be inserted include plasmid pET28c (+).
  • the vector of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • said vector is a vector useful for transforming competent Escherichia coli cells (Example 3).
  • the vector of the invention can be used to transform cells capable of being transformed by said vector. Said cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the vector of the invention can be used to transform eukaryotic cells, such as yeasts, for example, Pichia pastoris, etc., or microalgae, for example, Chlamydomonas reinhardtii, etc., or prokaryotic cells, such as bacteria, for example, E coli, etc.
  • eukaryotic cells such as yeasts, for example, Pichia pastoris, etc.
  • microalgae for example, Chlamydomonas reinhardtii, etc.
  • prokaryotic cells such as bacteria, for example, E coli, etc.
  • the invention relates to a host cell, hereinafter cell of the invention, comprising a polynucleotide of the invention, a gene construct of the invention, an expression cassette provided by this invention, or a vector of the invention, and is capable of expressing the protein of the invention, or a peptide of the invention (defined below), with the proviso that said cell of the invention is not a bacterium of the genus Tenacibaculum.
  • cell refers to the smallest unit that maintains the fundamental properties of life, and includes prokaryotic, eukaryotic and mesocariotic cells, as well as cells of single-celled organisms (eg, bacteria) and multicellular (eg, animals, plants).
  • the cell of the invention can be a eukaryotic cell, such as, for example, a plant tissue cell, a yeast, a microalgae, etc., a prokaryotic cell, such as a bacterium, for example, E coli, etc.
  • a eukaryotic cell such as, for example, a plant tissue cell, a yeast, a microalgae, etc.
  • a prokaryotic cell such as a bacterium, for example, E coli, etc.
  • the production of plant tissue cells comprising a polynucleotide of the invention, a gene construct of the invention, an expression cassette provided by this invention, a vector of the invention, or a peptide of the invention (defined below) may be very interesting from various points of view, for example, to increase resistance to pathogenic bacteria, in particular, bacteria producing QS signals.
  • the cells of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the invention relates to a transgenic non-human organism, hereinafter "transgenic organism of the invention", comprising, inserted into its genome, a polynucleotide of the invention, a gene construct of the invention, an expression cassette provided by this invention or a vector of the invention, with the proviso that said non-human organism is not a bacterium of the Genus Tenacibaculum.
  • the transgenic organism of the invention can be a plant, for example, of tobacco, potato, tomato, onion, cotton, flax, coffee, chocolate, rubber, oak, chestnut, cherry, etc., a cereal, for example, corn, wheat, rice, barley, oats, etc., or an animal, for example, zebrafish, salmon, rabbit, mouse, etc.
  • the transgenic organism of the invention will be resistant, or substantially more resistant than the corresponding non-transgenic organism that does not contain the polynucleotide of the invention inserted into its genome, a Infections caused by organisms, for example, bacteria, that produce QS signals and / or may cause a Quorum Quenching (QQ) process in response to a QS process.
  • the transgenic organism of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001); Such methods include the use of gene guns or the use of bacteria or viruses as vectors to transfer the polynucleotide of the invention.
  • Dong et al (2001) describe the production of tobacco and potato plants transformed with the sequence corresponding to a lactonase of Bacillus sp. with activity on AHLs, whereby the transgenic organism of the invention can be obtained, for example, by the methods described in said publication.
  • the invention relates to a peptide, hereinafter "peptide of the invention", whose amino acid sequence corresponds to the amino acid sequence encoded by the polynucleotide of the invention.
  • peptide refers to a chain of amino acids linked by peptide bonds, regardless of their length, and includes both amino acid chains of 10 or less amino acids (in some publications identified as “oligopeptides”) as amino acid chains of more than 10 amino acids, for example, more than 100 amino acids.
  • the peptide of the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the sequence encoded by the polynucleotide whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Said peptide has QS inhibitory activity.
  • the characteristics of said QS inhibitory activity have been previously mentioned in relation to the polypeptide of the invention as well as tests to identify whether or not a particular peptide has said QS inhibitory activity.
  • Tests carried out by the inventors have shown that the peptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2, inhibits QS, such as signals mediated by AHLs, so that at least it has lactonase activity and hydrolyzes AHLs (Example 3).
  • amino acid sequence of the peptide of the invention consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Occasionally, said peptide has been designated "AN20J" in this description.
  • the peptide of the invention is a substantially homologous and functionally equivalent variant of the peptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a peptide is "substantially homologous" to the peptide of SEQ ID NO: 2 when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of, at less, 76%, advantageously at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97% or 98%, and, even more preferably, of at least 99%.
  • the degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as, for example, BLAST (Altschul SF et al. 1990).
  • a peptide substantially homologous to the peptide whose nucleotide sequence comprises, or consists of, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be constructed based on the amino acid sequence shown in said SEQ ID NO: 2 by the introduction of, for example, amino acids that constitute conservative or non-conservative substitutions with respect to the amino acids present in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Other illustrative examples of possible modifications include the addition of one or more amino acids in any of the ends (amino or carboxyl), the insertion of one or more amino acids in the sequence, or the deletion of one or more nucleotides at any end or inside the sequence.
  • a peptide is "functionally equivalent" to the peptide whose amino acid sequence comprises, or consists of, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 when it has QS inhibitory activity.
  • the peptide inhibitory activity functionally equivalent to the peptide whose amino acid sequence comprises, or consists of, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be determined by conventional methods of determining said QS inhibitory activity (eg, inhibitory activity of signals mediated by AHLs, AIPs, AI-2 and / or AI-3), such as those mentioned previously.
  • the peptide of the invention is a substantially homologous and functionally equivalent variant thereof, that is, it is a peptide whose amino acid sequence has an identity degree of at least 76%, advantageously of at least 85 %, preferably of at least 90%, more preferably of at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% or 98%, and, still more preferably of , at least 99%, with respect to the amino acid sequence shown in said SEQ ID NO: 2 and has QS inhibitory activity.
  • the peptide of the invention is a peptide whose amino acid sequence has an identity degree of at least 76% with respect to the amino acid sequence shown in said SEQ ID NO: 2 and has QS inhibitory activity.
  • the peptide of the invention is a peptide whose amino acid sequence has an identity degree of at least 93% with respect to the amino acid sequence shown in said SEQ ID NO: 2 and has QS inhibitory activity.
  • the peptide of the invention is a peptide whose amino acid sequence has an identity degree of at least 99% with respect to the amino acid sequence shown in said SEQ ID NO: 2 and has QS inhibitory activity.
  • amino acid sequences referred to in this description can be chemically modified, for example, by chemical modifications that are physiologically relevant, such as phosphorylations, acetylations, etc.
  • chemical modifications that are physiologically relevant, such as phosphorylations, acetylations, etc.
  • the person skilled in the art will understand that within said substantially homologous and functionally equivalent variants of the peptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 are the peptide fragments that satisfy such conditions.
  • the peptide of the invention can be found as such or as part of a fusion protein, which constitutes an additional aspect of the present invention.
  • Said fusion protein thus comprises a polypeptide A comprising a peptide of the invention, and a polypeptide B, wherein said polypeptide B is a different polypeptide than said polypeptide A.
  • Polypeptide B may be attached to any end of polypeptide A
  • the amino terminal end of polypeptide B is attached to the carboxyl terminal end of polypeptide A
  • the carboxyl terminal end of polypeptide B is attached to the amino terminal end of polypeptide A.
  • Both polypeptides A and B can be linked directly to each other, or through a spacer peptide (linker) between said polypeptides A and B.
  • the fusion protein can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example, by expressing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding said fusion protein in cé Appropriate host cells.
  • Polypeptide A comprises a peptide of the invention, the characteristics of which have already been mentioned and are incorporated herein by reference.
  • the fusion protein of the invention has QS inhibitory activity, in particular, inhibitor of QS signals mediated by AHLs, more specifically, lactonase activity for hydrolyzing AHLs.
  • Polypeptide B is a "different" polypeptide than polypeptide A, that is, it is a polypeptide other than polypeptide A; in this sense, in a particular embodiment, polypeptide B is a peptide different from a peptide of the invention, while, in another particular embodiment, polypeptide B is a peptide of the invention but different from the peptide of the specific invention comprised in polypeptide A in a fusion protein of the given invention. Virtually any polypeptide can be used as polypeptide B in the fusion protein of the invention, provided it meets the condition that it is different from polypeptide A. Illustrative, non-limiting examples of peptides that can be used as polypeptide B herein.
  • said B polypeptide is a peptide useful for isolating and / or purifying proteins.
  • said peptide useful for isolating and / or purifying proteins will be located in a region of the fusion protein of the invention that does not adversely affect the functionality of the peptide of the invention.
  • Virtually any peptide that can be used to isolate and / or purify a fusion protein (generically referred to as "tag peptides" or "tag”) may be present in said fusion protein of the invention.
  • said peptide useful for isolating and / or purifying a protein can be, for example, an arginine tail (Arg-tag), a histidine tail (His-tag ), FLAG-tag, Strep-tag, an epitope capable of being recognized by an antibody, such as c-myc-tag, etc.
  • said polypeptide B comprises a polyhistidine tail.
  • the peptide of the invention in particular, the peptide whose amino acid sequence comprises, or consists of, the sequence shown in SEQ ID NO: 2, is stable under certain conditions.
  • stable refers to the ability of the peptide of the invention to maintain its QS inhibitory activity under certain conditions, for example, pH, proteinases, among others, and which also lacks activity against ⁇ -lactam antibiotics and ⁇ -lactamase inhibitors.
  • said peptide of the invention in addition to having broad spectrum lactonase activity, degrading AHLs with side chains comprised between 4 and 14 carbon atoms, both oxo- or hydroxy-substituted and unsubstituted, is resistant to pH in the range between 3 and 9, is resistant to proteinase K and chymotrypsin, and does not interact with ⁇ -lactam antibiotics (eg, Penicillin G, Meticillin, Amoxicillin, Ampicillin, Cephalothin, Cefaclor, Cefoxitin, Ceftriaxone, Cefoperazone, Imipenem and Meropenem) or with ⁇ -lactamase inhibitors (eg, Sulbactam and clavulanic acid), as seen in Example 3.
  • ⁇ -lactam antibiotics eg, Penicillin G, Meticillin, Amoxicillin, Ampicillin, Cephalothin, Cefaclor, Cefoxitin, Ceftriaxone, Cefoperazone,
  • the stability of a peptide can be determined using various assays known to those skilled in the art. Some of these tests are based on determining the conservation (or loss) of the peptide activity under certain conditions. By way of illustration, not limitation, the stability of a peptide can be determined by the tests mentioned in Example 3.
  • the peptide of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art. Although said peptide of the invention can be isolated at from an organism producing it, eg, Tenacibaculum sp. strain 20J (CECT 7426), in a particular and preferred embodiment, said peptide of the invention can be obtained by methods based on recombinant DNA technology.
  • the invention relates to a process for obtaining a peptide of the invention, which comprises culturing a cell of the invention under conditions that allow the production of said peptide and, if desired, recovering said peptide of the culture medium.
  • the conditions for optimizing the culture of said cell will depend on the cell used. The person skilled in the art knows such conditions.
  • the process for producing the peptide of the invention optionally includes the isolation and purification of said peptide of the invention.
  • the polynucleotide of the invention Due to the QS inhibitory activity of the peptide of the invention, the polynucleotide of the invention, the vector of the invention, the cell of the invention, the transgenic organism of the invention, or the peptide of the invention have many potential applications in different sectors of the technique, among which are the food, pharmaceutical and agricultural sectors.
  • the peptide of the invention, or the polynucleotide of the invention, or the vector of the invention, or the cell of the invention, or the transgenic organism of the invention will be combined with a adequate vehicle
  • the invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, comprising a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention, or a peptide of the invention.
  • polynucleotide of the invention vector of the invention, cell of the invention, transgenic organism of the invention, or peptide of the invention
  • component asset of the invention The characteristics of the active component (polynucleotide, vector, cell, transgenic organism, or peptide of the invention) in the composition of the invention have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the active component of the invention is selected from the group consisting of a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention and a peptide of the invention, preferably, a polynucleotide of the invention or a peptide of the invention.
  • the active component of the invention may be present in a vehicle suitable for administration and / or use.
  • vehicle will be chosen depending on the application to which the active component of the invention is intended and its form of administration.
  • vehicle in which the active component of the composition of the invention may be present is a vehicle selected from:
  • composition of the invention comprises an active component of the invention together with a vehicle suitable for feeding.
  • the composition of the invention is a food product.
  • food product includes any substance or product of any nature, solid or liquid, natural or processed, which due to its characteristics, applications, components, preparation and state of preservation, is likely to be customarily or suitably used for any of the following purposes: a) for normal human or animal nutrition or as fruitive; or b) as additives or dietary products, in special cases of human or animal feed.
  • this term also includes feed or natural materials and processed products, of any origin, which, separately or conveniently mixed together, are suitable for animal feed.
  • food product also includes nutraceutical compositions, that is, compositions suitable for use in humans or animals that comprise one or more natural products with therapeutic action or that provide a health benefit or that have been associated with the prevention or reduction of diseases, for example, bacteria probiotics, etc., and includes dietary supplements presented in a non-food matrix (eg, capsules, powder, etc.) of a concentrated natural bioactive product usually present (or not) in food and which, taken in doses higher than the existing one in those foods it exerts a favorable effect on the health, greater than the one that the normal food could have.
  • a ready-to-eat food is one that does not need to be diluted by, for example, an aqueous solution suitable for consumption.
  • a concentrated food is one in which one or more ingredients are present in greater concentration than in a ready-to-eat food, so for use, it is necessary to dilute it by, for example, an aqueous solution suitable for consumption.
  • Illustrative, non-limiting examples of foods provided by this invention include both food products intended for human consumption, such as feed and concentrates for animal feed, such as feed and feed concentrates intended for use in aquaculture or in any animal, whether animal of production, domestic or wild, such as dogs, cats, bovids, eggs, swine, equidae, etc.
  • a polynucleotide of the invention in the preparation of a food product, constitutes a further aspect of this invention.
  • said food product is a substance or product that can be used in food, feed, food additives, dietary supplements, nutraceutical compositions, etc., for both human and animal feed.
  • the composition of the invention is a pharmaceutical composition comprising, in addition to the active component present in the Composition of the invention, a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is suitable for administration to a subject of the active component present in the composition of the invention.
  • said pharmaceutically acceptable carrier will be chosen based on the nature of the active component (eg, polynucleotide of the invention, vector of the invention, cell of the invention or peptide of the invention), of the chosen form of presentation, for example , solid (eg, tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, etc.) or liquid (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) and of the route of administration chosen, for example, oral, parenteral (eg, intramuscular , subcutaneous, intravenous, etc.), rectal, etc.
  • the pharmaceutically acceptable excipients appropriate for the pharmaceutical form of administration and route of administration chosen will be chosen.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention, or a peptide of the invention, in the manufacture of a medicament. for the prevention and / or treatment of a bacterial infection.
  • the invention relates to an active component of the invention (i.e., a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention, or a peptide of the invention) for use in the prevention and / or treatment of a bacterial infection.
  • the bacterium causing said bacterial infection is a bacterium producing QS signals.
  • said QS signals produced by the bacteria causing the infection comprise at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • the bacterium causing said bacterial infection is a bacterium producing QS signals, wherein said QS signal does not comprise an AHL but said QS signal comprises an AIP, an AI-2 and / or an AI-3, for example, a Gram-positive bacteria or Gram-negative
  • said bacterium is Escherichia coli, an important human pathogen [see Example 4 in which the potential use of AN20J in the control of E. coli expression is revealed].
  • the infections caused by bacteria producing the QS signals are due to the formation of bioflms.
  • the bacteria that form biofilm can be, but not limited to, bacteria from the oral cavity such as those that cause tooth decay and periodontal disease, or bacteria that colonize the surfaces of medical implants or devices inserted into the body, such as catheters, prostheses, etc. Therefore, in a particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is a dentifrice composition. In another particular embodiment, the pharmaceutical composition is intended to prevent the formation of biolfims or to eliminate biofilms already formed on medical devices or implants such as catheters, prostheses, etc.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may also contain, if desired, one or more antibacterial agents, as long as they are not incompatible with the active component of the invention present in the composition of the invention.
  • the combination of the active component of the invention with antibiotics can be a very interesting strategy in the treatment of bacterial diseases caused by multi-resistant bacteria.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be applied or administered to a subject in need of prevention and / or treatment.
  • subject refers to a member of an animal species, preferably a mammal, and includes, but is not limited to, pets, primates and humans; preferably, the subject is a human being, male or female, of any age or race.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the prevention and / or treatment of a bacterial infection in a subject, which comprises administering to an individual in need of treatment, an effective amount of a pharmaceutical composition provided by this invention, or of an active component of the invention.
  • said bacterial infection is caused by a bacterium producing QS signals.
  • said QS signals produced by the bacteria causing the infection comprise at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-substituted AHLs, such as, for example, OC6-HSL, OC12- HSL, etc.
  • the bacterium causing said bacterial infection is a bacterium producing QS signals, wherein said QS signal does not comprise an AHL but said QS signal comprises an AIP, an AI-2 and / or an AI-3, for example, a Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • said bacterium is Escherichia coli, an important human pathogen [see Example 4 in which the potential use of AN20J in the control of E. coli expression is revealed].
  • the infections caused by bacteria producing the QS signals are due to the formation of bioflms (eg, bacteria of the oral cavity such as those causing caries and periodontal disease, bacteria that colonize the surfaces of medical implants or of the devices inserted in the organism, such as catheters, prostheses, etc.).
  • the composition of the invention is an agricultural composition that comprises, in addition to the active component present in the composition of the invention, an agriculturally acceptable carrier.
  • This type of compositions is suitable for administration to plants of the active component present in the composition of the invention.
  • said agriculturally acceptable vehicle will be chosen based on the nature of the active component, the form of presentation chosen, for example, solid or liquid, etc.
  • the appropriate agncolaly acceptable ingredients will be chosen for the chosen form of administration.
  • Virtually any agriculturally acceptable vehicle can be used in the elaboration of the agricultural composition provided by this invention; however, in a particular embodiment, said agncolaly acceptable vehicle comprises a fertilizer, such as, for example, a fertilizer, solid or liquid.
  • solid fertilizers include solid NPK type fertilizers, etc.
  • any liquid fertilizer with a pH between 3 and 9 can be used, where the peptide of the invention maintains its QS inhibitory activity;
  • Illustrative, non-limiting examples of said liquid fertilizers include fertilizers based on fulvic acids, liquid fertilizers with different NPK composition, such as mixtures 16: 2: 4, 20: 5: 0, etc., or various types of drop fertilizers with NPK composition of 8: 9: 9, 16: 4: 4, etc.
  • the agricultural composition provided by this invention can be obtained by conventional methods by mixing the active component with the agriculturally acceptable vehicle.
  • the agricultural composition provided by this invention can be used in the prevention and / or treatment of a bacterial infection in plants.
  • the bacterium causing said bacterial infection is a bacterium producing QS signals.
  • said QS signals produced by the bacteria causing the infection comprise at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • the agricultural composition provided by this invention may also contain, if desired, one or more antibacterial agents, as long as they are not incompatible with the active component of the invention present in the composition of the invention.
  • the agricultural composition provided by this invention can be presented in any form of presentation suitable for administration or application to the plant or soil surrounding the plants, for example, in solid or liquid form. Liquid forms of presentation are suitable for spraying on soil, plant or plant material, in general, or to create a bath in which plants or plant material are submerged.
  • the agricultural composition provided by this invention can be applied by any conventional method. In a particular embodiment, the composition of the invention is applied by spraying to the soil, plant or plant material, or by immersion of the plant or plant material in a bath containing the composition of the invention. Alternatively, plant seeds may undergo a pill treatment with the agricultural composition provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises contacting said plant with a peptide of the invention, wherein said bacterial disease is caused by a bacterium producing QS signals, under conditions that allow controlling said bacterial disease.
  • the peptide of the invention is formulated in an agricultural composition provided by this invention and this is applied to the plant to be treated.
  • the peptide of the invention is contacted with the bacterium producing QS signals under conditions that allow contact and interaction between the peptide of the invention and the QS signals produced by the bacteria causing the infection .
  • the peptide of the invention must be added in an amount sufficient to obtain beneficial or desired results, that is, in the appropriate amount to alleviate, improve, stabilize, reverse, retard or delay the progression of stages of diseases caused by bacteria in plants. This amount can be administered in a single application or in several applications. Likewise, the person skilled in the art knows, or can identify, the administration conditions of the peptide of the invention that allow controlling said bacterial disease.
  • the invention in another aspect, relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises transforming said plant with a polynucleotide of the invention, or with a vector of the invention, wherein said bacterial disease is caused by a bacterium.
  • QS signal producer Obtaining plants transformed with the polynucleotide or vector of the invention is carried out by conventional methods of plant transformation, based, for example, on the use of appropriate vectors, as well as on the methods described in, for example, Left 1993 or Dong et al.
  • the invention relates to a method for controlling a bacterial disease in a plant, which comprises the use of a bacterium transformed with a polynucleotide of the invention, or with a vector of the invention, wherein said bacterial disease is caused. by a bacterium producing QS signals.
  • the bacterial disease is caused by a bacterium producing QS signals.
  • said QS signals produced by the bacteria causing the infection comprise at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • phytopathogenic bacteria include Gram-positive bacteria such as, for example, bacteria belonging to the genera Clavibacter, Curtobacterium, Streptomyces, etc., as well as Gram-negative bacteria such as, for example, bacteria belonging to the Agrobacterium genera, Brenneria, Burkholderia, Erwinia, Gluconacetobacter, Pantoea, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Xylella, etc.
  • Gram-positive bacteria such as, for example, bacteria belonging to the genera Clavibacter, Curtobacterium, Streptomyces, etc.
  • Gram-negative bacteria such as, for example, bacteria belonging to the Agrobacterium genera, Brenneria, Burkholderia, Erwinia, Gluconacetobacter, Pantoea, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Xylella, etc.
  • said phytopathogenic bacterium is a pathogenic Gram-negative bacterium of plants with QS and producer of some AHL such as, for example, Brenneria sp., Burkholderia glumae, Erwinia amyiovora, Erwinia carotovora, Gluconacetobacter diazotrophicus (in sugarcane ), Pantoea ananatis, Pectobacterium atrosepticum, Pseudomonas syringae, etc.
  • some AHL such as, for example, Brenneria sp., Burkholderia glumae, Erwinia amyiovora, Erwinia carotovora, Gluconacetobacter diazotrophicus (in sugarcane ), Pantoea ananatis, Pectobacterium atrosepticum, Pseudomonas syringae, etc.
  • control a bacterial disease in a plant refers to preventing and / or treating bacterial disease as well as maintaining control over a bacterial population at levels that do not cause damage to the plant or harmful effects on the subjects that feed of these plants.
  • plant as used herein, includes any photosynthetic living being.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, to cause a quorum quenching process. (QQ) in response to a QS process.
  • QQ in response to a QS process.
  • said use does not consist of a method of surgical or therapeutic treatment of the human or animal body.
  • this inventive aspect relates to a method for provoking a QQ process in response to a QS process, wherein said QS process is caused by a bacterium producing QS signals, which comprises contacting said bacterium with a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, under conditions that allow to cause said QQ process in response to said QS process.
  • said method does not consist of a method of surgical or therapeutic treatment of the human or animal body.
  • the expression provoke a "quorum quenching process (QQ)" in response to a QS process refers to the development of a strategy to inactivate the QS process.
  • QQ quorum quenching process
  • the characteristics of the active components of the invention (polynucleotide, vector, cell, transgenic organism or peptide of the invention) have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the person skilled in the art knows the conditions that allow the QS signal producing bacterium to be contacted with the active component of the invention to cause said QQ process in response to said QS process; in general, said conditions include those in which the active component of the invention remains stable and maintains its activity.
  • the QS signal producing bacterium is a bacterium that produces at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • the polynucleotide of the invention can be used to intercept communication between bacteria producing QS signals, causing in this way a QQ process, and, thus, control infections caused by said bacteria.
  • QQ processes for the treatment of diseases caused by bacteria in particular, bacteria that produce QS signals, not directly affecting the survival of the pathogenic bacteria, but the expression of virulence factors, do not seem to exert pressure selective on the bacteria, thus avoiding the emergence of resistance, which constitutes an important advantage.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, to inhibit a QS process, wherein said QS process is caused by a bacterium producing QS signals.
  • said use does not consist of a method of surgical or therapeutic treatment of the human or animal body.
  • this inventive aspect relates to a method for inhibiting a QS process, wherein said QS process is caused by a bacterium producing QS signals, which comprises contacting said bacterium with a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, under conditions that allow to inhibit said QS process.
  • said method does not consist of a method of surgical or therapeutic treatment of the human or animal body.
  • the expression "inhibit a QS process” includes inactivating the QS process as well as intercepting bacterial communication mediated by QS signals (eg, AHLs, APIs, AI-2 and AI-3).
  • QS signals eg, AHLs, APIs, AI-2 and AI-3.
  • This method is therefore a promising method to control bacteria, in particular, pathogenic bacteria (eg, from plants and animals, including humans) that use a QS process based on different types of QS signals to regulate the synthesis of factors. of virulence or to form biofilms.
  • the characteristics of the active components of the invention have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the person skilled in the art knows the conditions that allow the QS signal producing bacteria to be contacted with the active component of the invention to inhibit said QS process; in general, said conditions include those in which the active component of the invention remains stable and maintains its activity.
  • the QS signal producing bacterium is a bacterium that produces at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • polynucleotide of the invention can be used to inhibit a QS process caused by bacteria producing signal signals. QS and, thus, control infections caused by these bacteria.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method for degrading a QS signal, wherein said QS signal is produced by a QS signal producing bacterium, which comprises contacting a polynucleotide of the invention, a vector. of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, with said QS signal under conditions that allow degrading said QS signal.
  • the expression "degrade a QS signal” includes hydrolyzing a QS signal, such as an AHL, an APIs, an AI-2 or an AI-3, such that said degraded QS signal I can no longer exercise the function of communication between bacteria for which it was intended; in this way, a bacterial population can be controlled by intercepting communication between its members by degrading the signals responsible for said communication. Therefore, this method constitutes an alternative method to control bacteria, in particular, pathogenic bacteria (eg, from plants and animals, including humans) that employ a QS process based on different types of QS signals to regulate the synthesis of factor factors. virulence or to form biofilms.
  • pathogenic bacteria eg, from plants and animals, including humans
  • the characteristics of the active components of the invention have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the person skilled in the art knows the conditions that allow the QS signal to be contacted with the active component of the invention to degrade said QS signal; in general, said conditions include those in which the active component of the invention remains stable and maintains its activity.
  • the QS signal producing bacterium is a bacterium that produces at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • the polynucleotide of the invention can be used to degrade a QS signal, produced by a bacterium producing QS signals and, thus, control infections caused by these bacteria.
  • the invention relates to an in vitro method for modulating the signaling activity of an AHL, which comprises contacting a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, with said AHL, under conditions that allow modulating the signaling activity of said AHL.
  • the expression "modulate the signaling activity of an AHL” includes degrading or hydrolyzing, totally or partially, an AHL, so that said total or partially degraded or hydrolyzed AHL can no longer perform the communication function between bacteria for which it was intended; in this way, a bacterial population producing QS signals can be controlled, wherein said QS signals comprise one or more AHLs, intercepting communication between their members by degradation or hydrolysis of the signals (AHLs) responsible for said communication. Therefore, this method constitutes an alternative method to control bacteria, in particular, pathogenic bacteria (eg, from plants and animals, including humans) that employ a QS process based on the production of AHLs to regulate the synthesis of virulence factors or to form biofilms.
  • pathogenic bacteria eg, from plants and animals, including humans
  • the characteristics of the active components of the invention have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the person skilled in the art knows the conditions that allow the active component of the invention to be contacted with the AHL; In general, these conditions include those in which the active component of the invention remains stable and maintains its activity.
  • said AHL is an unsubstituted AHL, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, or a mixture thereof.
  • said AHL is an oxo- or hydroxy-substituted AHL, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc., or mixtures thereof.
  • the polynucleotide of the invention can be used to modulate the signaling activity of an AHL, produced by a bacterium. producer of QS signals, wherein said QS signals they comprise one or more AHLs, and thus control infections caused by said bacteria.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a cell of the invention, a transgenic organism of the invention or a peptide of the invention, to inhibit the formation of a biofilm.
  • bacterial ex vivo or in vitro wherein said bacterial biofilm is produced by a bacterium producing a QS signal.
  • this inventive aspect relates to an in vitro or ex vivo method for inhibiting the formation of a bacterial biofilm, wherein said bacterial biofilm is produced by a bacterium producing a QS signal, which comprises contacting said polynucleotide of the invention, vector of the invention, cell of the invention, transgenic organism of the invention or peptide of the invention, with said bacterium, under conditions that allow to inhibit the formation of said bacterial biofilm.
  • the term "inhibit the formation of a bacterial biofilm” refers to preventing or preventing bacteria producing QS signals from forming a biofilm.
  • biofilm formation is a process controlled by QS phenomena, mediated by QS signals such as AHLs, APIs, AI-2 and / or AI-3, and has a significant economic and clinical impact.
  • QS signals such as AHLs, APIs, AI-2 and / or AI-3
  • Many of these biofilms are closely related to infectious bacterial processes, both in plants and in animals, including humans.
  • biofilm-forming bacteria are very resistant to antibiotics and can adhere to food or substances in contact with them, causing problems of both hygiene and possible food toxinfections and ultimately, large economic losses.
  • they are often found on the surface of medical implants or in devices inserted in the body.
  • biofilms can also form in areas of the body that are exposed to air; particularly in wounds and pleura.
  • One of the biological biofilms that presents greater complexity and of greater clinical relevance is dental plaque.
  • the characteristics of the active components of the invention have already been previously defined and are incorporated herein by reference.
  • the person skilled in the art knows the conditions that allow the biofilm-forming bacterium to be contacted by a process controlled by QS signals with the active component of the invention to inhibit the formation of said bacterial biofilms; in general, said conditions include those in which the active component of the invention remains stable and maintains its activity.
  • the biofilm-forming bacterium is a bacterium producing QS signals, such as a bacterium producing at least one AHL.
  • AHLs include unsubstituted AHLs, such as, for example, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL or C14-HSL, as well as oxo- or hydroxy-AHLs substituted, such as, for example, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
  • the polynucleotide of the invention can be used to inhibit the formation of bacterial biofilms controlled by QS signals caused. by bacteria producing QS signals and, thus, controlling infections caused by said bacteria.
  • the DNA (2.5 ⁇ g) was randomly fragmented by pipetting (50-100 times) with a 200 ⁇ _ pipette tip.
  • the fragmented DNA was treated enzymatically to repair and generate blunt ends and phosphorylated ends, then 40 kb fragments were selected by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and ligated to the linearized and dephosphorylated pCC2FOS phosphide.
  • PFGE pulsed field gel electrophoresis
  • Escherichia coli DH 0 ⁇ cells were then transformed by lambda phage.
  • the bacterial cells were plated with Luria-Bertani medium (LB) in the presence of the chloramphenicol antibiotic at a concentration of 12.5 ⁇ g / mL and incubated at 37 ° C. for 24 hours
  • E. coli DH 10 ⁇ colonies transfected with the fossid were collected robotically (Genetix Q-bof) and distributed in 96-well microtiter plates containing 150 LB plus chloramphenicol and glycerol which was added for its correct freezing
  • the genomic library consisted of 6,912 clones distributed in 72 microtiter plates of 96 wells each and was preserved until its use. ilization in a freezer at -80 ° C.
  • Each plate 96-well microtiter from the genomic library was copied to a new plate with 50 ⁇ _ of liquid LB supplemented with chloramphenicol (12.5 ⁇ g / mL), 2 ⁇ _ / ⁇ _ of the self-induction solution (“Autoinduction Solution '), contained in the CopyControl TM Fosmid Library Production Kit (Epicenter, Madison, Wl), and C6-HSL at a concentration of 12 ⁇ g / mL
  • the self-induction solution induces the high copy of the fossid in each cell, which increases the expression of the genes of the insert
  • the plates were incubated at 37 ° C to allow degradation of the signal by the possible positive clones After 10 h aliquots of each well were taken to new microtiter plates, which were irradiated with UV light during 1 hour to kill E.
  • the activity of the only positive clone identified in the functional screening (clone 13-E2, Figure 1) of the genomic library was checked, once transferred to petri dish culture with chloramphenicol to check the purity of the clone, by performing a bioassay plaque by wells equal to that used for the identification of bacteria with QQ activity against AHLs in previous works (Romero et al., 201 1).
  • the positive clone was inoculated in Eppendorf tubes with 500 ⁇ of liquid LB supplemented with chloramphenicol (12.5 ⁇ g / mL) and Autoinduction Solution (2 ⁇ _ ⁇ ). It was incubated with stirring at 200 rpm and 37 ° C.
  • HPLC-MS high performance liquid chromatography-mass spectroscopy
  • the pellet was washed with 15 mL of phosphate buffered saline (PBS) pH 6.5, resuspended in another 5 mL of the same buffer, sonicated by pulses of 30 s, for 5 min on ice and centrifuged at 12,000 rpm for 30 min at 4 ° C. The supernatant was filtered (0.22 ⁇ ) and the obtained ECC was stored at 4 ° C for later use.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the phosphide of the positive clone 13-E2 of E. coli whose QQ activity for the two sizes of AHLs tested was confirmed in both bioassay and HPLC-MS, contained a genome insert of Tenacibaculum sp. strain 20J of approximately 40kb in length, a detailed genetic analysis of this insert was necessary to identify the sequence responsible for the QQ activity of the clone. For this, two complementary strategies were followed:
  • the positive clone insert 13-E2 obtained in the genomic library screening was sequenced using Roche's GS-FUX sequencer. To do this, the fossid (150 ng ⁇ L) was extracted from the positive clone following the protocol of the Fosmid Max TM DNA Purification Kit (Epicenter, Madison, Wl). The sequences obtained were analyzed using the computer tools: BLASTX and CD-Seach (Search for conserved domains) of the NCBI. The sequences were aligned and assembled with the Phrap program, obtaining a sequence of 39,828 base pairs (bp).
  • the available 'nr' database was searched in the NCBI, not being able to identify any gene with significant homology with known genes with QQ activity. It was possible, however, to identify 4 ORFs with high homology (greater than 70%) with genes from Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) cluster species, confirming that the insert of clone 13-E2 comes from Tenacibaculum sp. strain 20J (CECT 7426), member of the Bacteroidetes group. In the search of all domains conserved in the database 'cdd' a ⁇ -lactonase domain was detected at the end of the analyzed sequence of the positive clone 13-E2.
  • the subcloning of the 40 kb insert of the positive clone 13-E2 was proceeded for the functional analysis of the fragments.
  • a new genomic library was constructed, from the phosphide insert of the positive clone 13-E2 purified by means of the Fosmid Max TM DNA Purification kit (Epicenter, Madison, Wl). The extracted DNA was randomly fragmented by hydrolysis ("hydroshearing '), the fragments between 3 and 5 kb were selected by electrophoresis and enzymatically treated to generate blunt and phosphorylated ends.
  • the bioindicator strain C. violaceum VIR07 was used for the degradation analysis of C10-HSL, with a concentration of 12 ⁇ g / mL of the signal.
  • the procedure was the same as in the first genomic library, but in this subcloned library the antibiotic ampicillin was used at a concentration of 200 ⁇ g / mL and IPTG at 1 mM to induce expression of the insert genes.
  • inserts of these 10 positive clones obtained in the randomly selected subcloned genomic library analysis were sequenced. Inserts between 3 and 5 kb of the plasmids of 10 clones confirmed as positive after screening of the subcloned genomic library were sequenced by standard techniques using the primers of the pBluescript II KS (+) vector. For the analysis of the sequences, the BLASTX and CD-Search tools of the NCBI were used and the sequences were aligned and assembled with the Phrap program.
  • amino acid sequence in the sequence of AN20J is the conserved zinc binding domain characteristic of the metallo- ⁇ -lactamases superfamily, (HXHXDH), in addition to other histidine and aspartate residues, for its correct activity (Dong et al., 2000).
  • HXHXDH metallo- ⁇ -lactamases superfamily
  • Table 1 shows the percentages of identity of this sequence with other lactonases described in the literature.
  • PCR amplification of genes homologous to aii20J in the species with QQ activity confirmed in the bioassay was carried out.
  • the DNA of the strains was extracted from 24 h cultures with the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the aii20J homologous genes of these strains presumably responsible for their degrading activity of AHLs, were named as a / ' / TD (from Tenacibaculum discolor), a / ' / TG (from T. gallaicum), a / ' / TL ( from T. lutimar ⁇ s), a / ' / ⁇ (from T. aestuarii) and / ' / TS (from T. soleae) producing the proteins, AiiTD, AiiTG, AiiTL, ANTA and AiiTS, respectively.
  • SEQ ID NO: 4 (a / ' / TD), SEQ ID NO: 5 (a / ' / TG), SEQ ID NO: 6 (a / ITS), SEQ ID NO: 7 (a / ' / TA) and SEQ ID NO: 8 (a / ' / TL).
  • the sequences shown include the start (ATG) and end (TAA) codons.
  • the a / 720J sequence was amplified by PCR with specific primers that allowed insertion of the restriction targets compatible with the expression plasmid pET28c (+) (Novagen).
  • This vector was chosen because it presents the possibility of conducting directional cloning and adds a fusion protein, in our case a poly-histidine tail (6 consecutive histidine residues) in the N-terminal, which facilitates protein purification.
  • the digestions were carried out with the enzymes FastDigest Ncol, EcoRI, and Sal ⁇ (Fermentas, Thermo Scientific) according to the conditions recommended by the manufacturer After the digestions were inserted the PCR products already cut inside the linearized plasmid, by enzymatic ligation using Thermo Scientific T4 DNA ligase for 15 min at 22 ° C as indicated in the product instructions. To see if the ligation occurred as expected and the plasmid had been digested correctly, ligation was performed with the plasmid without the DNA insert.
  • competent E. coli XLI blue cells were transformed for cloning of the sequences of interest by electroporation using the ECM® 399 Electroporation System, BTX TM at 1000 V, 4 ms.
  • the electroporated cells were plated 100 in LB plates supplemented with the antibiotic kanamycin (30 ⁇ g / mL) and incubated for 24 h at 37 ° C.
  • the control ligation of the plasmid without the insert was also electroporporated as an electroporation control, thus, if the plasmid was well digested, no colonies would grow on the plates.
  • the recombinant colonies obtained were transferred to new plates and in parallel they were frozen in Cryoinstant Mixed (VWR®) freezing vials at -80 ° C for storage.
  • VWR® Cryoinstant Mixed
  • a 1% agarose gel electrophoresis was performed from a miniprep extracted with the Qiagen kit from a 15 mL culture of fresh LB in E. coli XLI blue flask transformed with pET28c (+) with the insert and double digestion of the plasmid with the corresponding enzymes to verify that the recombinant colonies grown on the plates after electroporation contained the plasmid with the insert ( Figure 10).
  • a control PCR of the recombinant colonies was also performed with primers complementary to the internal homologous domains of the lactonases, the sequences of said primers are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively.
  • the fragment obtained by PCR confirmed the identity of the inserted sequence ( Figure 1 1).
  • the PCR conditions applied were: 30 cycles of denaturation at 94 ° C for 45 s, hybridization at 58 ° C for 45 s, extension at 72 ° C, 45 s, preceded by 5 minutes of denaturation at 94 ° C and followed by 10 min extension at 72 ° C. This check was observed by electrophoresis of the PCR product on a 1% agarose gel.
  • the chosen recombinant colonies were transferred to new plates of LB with kanamycin (30 ⁇ g / mL) to routinely cultivate them at 37 ° C in the laboratory and in parallel they were frozen in Cryoinstant Mixed (VWR®) freezing vials at -80 ° C for storage.
  • VWR® Cryoinstant Mixed
  • plasmid DNA extractions with the insert of interest were sequenced by classical techniques using the specific sequencing primers of the vector (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14).
  • Extractions were performed by 24-hour culture minipreps in 15 mL of LB medium supplemented with kanamycin (30 ⁇ g / mL) at 37 ° C, 170 rpm.
  • the sequences obtained were analyzed with the Editseq and SeqMan Pro programs of Lasergene and MEGA 5.1 Beta3 (Tamura et al., 2008) to properly assemble the sequences.
  • the ExPAS Protein trans ⁇ ate computer tool was used, choosing the appropriate open reading frame (ORF).
  • ORF open reading frame
  • the final sequence of the modified a / 720J gene for its overexpression and purification is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the gene of interest was cloned into E. coli BL21 overexpression strain (DE3).
  • E. coli BL21 (DE3) cells with the plasmid pET28c (+) with the DNA insert on the one hand a miniprep was made with the Quiagen kit, from a 24-hour culture of 15 mL of E.
  • competent cells were made from a 24-hour BL21 (DE3) culture in LB medium.
  • the recombinant colonies obtained with activity were transferred to new plates of LB with kanamycin (30 ⁇ g / mL) for routine cultivation at 37 ° C in the laboratory and in parallel they were frozen in Cryoinstant Mixed (VWR®) freezing vials at -80 ° C for storage.
  • VWR® Cryoinstant Mixed
  • Denaturing polyacrylamide electrophoresis was performed to verify that the protein band was present in the overexpression strain ( Figure 12).
  • a 50 mL culture of LB supplemented with kanamycin (30 ⁇ g / mL) was prepared at 170 rpm, 37 ° C of a colony of E. coli BL21 (DE3) with the plasmid pET28c (+) and the insert of AN20J , of a colony of E. coli BL21 (DE3) with the plasmid without the insert as a control and of a colony of the same E.
  • the culture was centrifuged at 9,000 rpm, 10 min, the pellet was resuspended with vortex in 20 ml_ of PBS pH 6.7.
  • the cells were then broken by sonication with the Branson Sonifier 250 apparatus with constant pulses of 30-40% at medium power for half an hour and on ice so as not to overheat the sample in the process. It was centrifuged to lower the cells for 10 min, at 9,000 rpm. Two washes were performed by resuspend the pellet by vortexing in 10 mL of PBS pH 6.7 with 1% Triton, sonicating continuously at medium power for 1 min.
  • binding buffer binding buffer
  • elution buffef His Health GraviTrap TM affinity column affinity column from GE Healthcare with elution buffer
  • the binding buffer and elution buffer were prepared using the GE Healthcare His Buffer Kit with 6 M urea. To remove excess urea, the eluate obtained from the column containing the protein was dialyzed.
  • CMA Minimum Active Concentration
  • C6-HSL and C10-HSL were evaluated by means of a plate bioassay with the bioindicating strains C. violaceum CV026 and C. violaceum VIR07, establishing that the CMA of AN20J for both C6-HSL and C10- HSL are 2 ⁇ g / mL for incubation times of 3 hours and ten times less, 0.2 ⁇ g / mL for incubation times of 24 hours ( Figure 14). On this basis, a concentration of 20 ⁇ g / mL was used in all characterization tests, corresponding to 10 times the 3-hour CMA on C6-HSL and C10-HSL.
  • HPLC-MS was used to evaluate the degradation kinetics of 2 AHLs (C6-HSL and C10-HSL) of the purified AN20J enzyme. For this, it was incubated at a concentration of 20 ⁇ g / mL in PBS pH 6.7 with C6-HSL and with C10-HSL at a final concentration of 50 ⁇ at 22 ° C, 200 rpm. At different incubation times (0, 10, 20, 30, 60 and 90 min) 200 ⁇ _ aliquots were taken in triplicate of all tubes to perform an organic extraction of the reaction mixtures, extracting three times with the same volume of ethyl acetate (200 ⁇ _).
  • the analysis was carried out with an HPLC 1 100 series (Agilent USA) equipped with a C8 pre-column (2, 1 x 12.5 mm, 5 ⁇ particle size) and a ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1 x column 150 mm (with 5 ⁇ particle size), maintained at 45 ° C.
  • the mobile phase consisted of 0.1% formic acid in water (A) and 0.1% formic acid in acetonitrile (B) with a flow rate of 0.22 mL / min. Elution conditions: 0 min 35% B, linear gradient up to 60% B for 10 min, a linear gradient 60 to 95% B for 5 min, 95% B for 5 min and one minute to return to the initial conditions that were maintained for 9 min.
  • MS mass spectrometer
  • API 4000 triple quadrupole Applied Biosystem, CA, USA
  • Turbolon source used in positive ion electrospray mode and multiple reaction monitoring (MRM).
  • MRM signals were used to obtain relative quantification information by comparison with a calibration curve constructed by abundance of molecular ions obtained from standard synthetic AHLs (Milton et al., 2001).
  • Tests equal to those described in section 3.3.1 were performed for the unsubstituted AHLs C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL and for oxo- or hydroxy-AHLs OC6-HSL and OC12-HSL substituted with an AHL concentration of 10 ⁇ and an enzyme concentration of 20 ⁇ g / mL.
  • Initial and final concentrations were measured in triplicate in extracts made in PBS pH 6.7 and quantified by HPLC-MS (Romero et al., 2011).
  • AN20J has the lowest degree of affinity against C4-HSL, followed by oxo-AHL OC6-HSL.
  • the stability of the enzyme was checked after being exposed to different pH controlled solutions in the range 3-9.
  • a solution of AÜ20J of 20 ⁇ g / mL was incubated in different sterile buffers with different pH for 30 min at 22 ° C.
  • the pH was then adjusted with 1 M HCI or 1 M NaOH to reach pH 6.7 (standard conditions for measuring activity) and the AHL (C6-HSL and C10-HSL with final concentration of 10 ⁇ ) was added, allowing to incubate for 3 h, 22 ° C.
  • the presence of AHLs was revealed by bioassay with the indicator strains of C.
  • C6-HSL and C10-HSL were added at a final concentration of 10 ⁇ and left another 24 h at 22 ° C and 200 rpm.
  • C. violaceum CV026 and VIR07 the resistance of the activity of AN20J to proteolysis was determined. They were made Negative controls of proteinase K and chymotrypsin in PBS pH 6.7 without the enzyme with the same added concentration of AHLs and negative control of PBS with the AHLs at the same concentrations.
  • thermostability of AN20J was evaluated by subjecting a solution of the enzyme of concentration 20 ⁇ g / mL in triplicate at different temperatures for 10 minutes, measuring the activity of the enzyme thus treated on C6-HSL (10 ⁇ ) for 1 h, 22 ° C, 200 rpm, which was quantified by HPLC-MS techniques.
  • the results demonstrate a limited thermostability of AN20J, since it loses its catalytic activity above 60 ° C ( Figure 19). This result contrasts strongly with the thermostability of the enzymatic activity in the crude cell extracts, in which the activity resists treatments of up to 100 ° C for 10 minutes (the results are not shown).
  • thermostability of AN20J was also checked by HPLC-MS by subjecting a solution of 20 ⁇ g / mL of AN20J at 60 ° C for 10 minutes after which it was incubated with a 50 ⁇ concentration of C6-HSL at 22 ° C. At different incubation times (0, 30 and 90 minutes), triplicate aliquots were extracted to quantify their residual activity by HPLC-MS analysis in the same way as in section 3.3.1 ( Figure 15). As a control, PBS supplemented with the same amount of C6-HSL signal was used, processed and organically extracted in the same way.
  • thermo-resistance between the purified enzyme and the cellular extract of Tenacibaculum sp. strain 20J could be due to the presence in the strain of a second thermo-resistant enzyme
  • the heat resistance of the activity in cell extracts of E. coli BL21 DE3 was tested with the plasmid pET28c (+).
  • the diluted crude cell extract at a concentration 10 times higher than the minimum active concentration (46.8 ⁇ g of extract protein / mL at both 3 and 24 h) was incubated in Eppendorf® tubes with PBS pH 6.7 a 22 ° C, 60 ° C, 80 ° C and 100 ° C for 10 min.
  • lactams belonging to 5 families of the group (Penicillin G, Methicillin, Amoxicillin, Ampicillin, Cephalothin, Cefaclor, Cefoxitin, Ceftriaxone, Cefoperazone, Imipenem and Meropenem) and two inhibitors of ⁇ -lactamases (Sulbactam and clavulanic acid).
  • Antibiotics were incubated for 24 hours with a solution of 20 ⁇ g / mL of AN20J, checking their activity compared to the same solution of antibiotic not enzymatically treated by well antibiogram with Staphylococcus aureus ATCC 25923 bacteria. Halos of identical diameter were obtained in the plaques corresponding to the antibiotic alone and the antibiotic treated with AÜ20J, which indicates that there is no interaction between AN20J and the action of these ⁇ -lactam antibiotics and also with the inhibitors of the ⁇ -lactamases tested (Figure 21).
  • E. coli strains were grown in LB medium for 48 h at 30 ° C and under stirring (170 rpm). After that time the cultures were inoculated in LB medium preheated with 0.4% glucose to suppress the acid resistance system (AR-1), with the different conditions and in continuous agitation to the same temperature: E. coli, E. coli plus OC6-HSL at a final concentration of 5 ⁇ , E. coli plus AN20J at 20 ⁇ g / mL and E. coli plus OC6-HSL and AN20J at the same concentrations.
  • AR-1 acid resistance system
  • the MEM medium was prepared from a 50X solution with 670 mL of distilled water, 10 g of MgS0 4 -7H 2 0, 100 g of citric acid-H 2 0, 500 g of K 2 HP0 4 and 175 g of NaNH 4 HPCy4H 2 0.
  • the final approximate volume was 1 L, of which a 1X dilution was made in distilled water and adjusted to pH 2.0 before autoclaving.
  • Glucose (0.4%) and glutamate (1.6 mM) were added sterilized independently.
  • E. coli resistance to an acidic environment is controlled by the presence of QS signals of type AHL. E. coli does not produce those signals, but it can feel the signals produced by other bacteria in the rumen or intestines of animals due to the presence of a specific sensor called SdiA. It has been shown that inactivation of the SdiA sensor reduces fecal dissemination of E. coli 0157: 1-17 in weaned calves, probably reducing colonization capacity (Sharma & Bearson, 2013). The effect of the addition of the AÜ20J enzyme on acid resistance in E. coli strain K-12 MG1655 is demonstrated in Figure 22.
  • Quorum sensing signal molecules (acylated homoserine lactones) in gram-negative fish pathogenic bacteria. Dis. Aquat Org. 65: 43-52.
  • thermostable N-acyl homoserine lactonase from Bacillus sp. Strain
  • AI96 attenuates Aeromonas hydrophila infection in fish. Applied and Environmental
  • Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens harbors an attM-paralogous gene, aiiB, also encoding N-Acyl homoserine lactonase activity. Appl. Environ. Microbiol 69:
  • Quorum sensing the language of bacteria. Ed. Acribia, Zaragoza, Spain. 120 pp.
  • AhID an N-acylhomoserin lactonase in Arthrobacter sp., And predicted homologues in other bacteria.
  • QSI quorum-sensing inhibitors
  • Tenacibaculum maritimum a member of the Cytophaga-Flavobacterium-
  • CFB Bacteroides

Abstract

Se describe la clonación, secuenciación y caracterización del gen responsable de la actividad Quorum Quenching (QQ) frente a señales de Quorum Sensing (QS) de la cepa Tenacibaculumsp. 20J (CECT7426). Dicho gen codifica un péptido que presenta al menos actividad lactonasa con un porcentaje de identidad inferior al 38% con las lactonasas descritas hasta el momento para otras especies, así como las secuencias de los genes homólogos presentes en otras especies del género Tenacibaculum. Dicho péptido muestra unamplio espectro de actividad degradando N-acil-homoserín lactonas (AHLs) de 4-14 átomos de carbono en su cadena lateral, opcionalmente sustituidas, es activo a pH comprendido entre 3 y 9, resistente a proteinasa K y quimiotripsina y no interactúa con antibióticos β- lactámicos.

Description

PÉPTIDO CON ACTIVIDAD INHIBIDORA DE QUORUM SENSING,
POLINUCLEÓTIDO QUE CODIFICA DICHO PÉPTIDO Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere, en general, a un péptido con actividad inhibidora de señales de quorum sensing (QS) y a sus aplicaciones. La invención también se refiere al polinucleótido que codifica dicho péptido, vectores, células y organismos no humanos transgénicos que comprenden dicho polinucleótido.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El uso de metodologías de Quorum Quenching (QQ) para el tratamiento de infecciones bacterianas
Numerosas bacterias patógenas coordinan su actividad infecciosa mediante procesos de comunicación intercelular denominados Quorum Sensing (QS) (Otero Casal et al., 2004). Estos procesos consisten en la liberación al medio de pequeñas moléculas señal que permiten a las bacterias cuantificar la presencia de otras bacterias mediante sensores específicos, actuando de forma coordinada una vez alcanzada la concentración umbral de señal indicadora de la existencia de quorum. El QS controla la producción de factores de virulencia, como exoenzimas o pigmentos, de numerosos patógenos, tanto humanos como animales y vegetales (Whitehead et al., 2001 ; Fuqua y Greenberg, 2002; Bassler y Losick, 2006; Williams et al., 2007), incluyendo importantes patógenos nosocomiales como Pseudomonas aeruginosa.
Debido a que la virulencia de numerosos patógenos bacterianos depende de los procesos de QS, la inactivación o interceptación de la comunicación mediada por señales de quorum, una estrategia denominada de forma genérica inhibición de quorum sensing o Quorum Quenching (QQ), constituye una alternativa al uso de antibióticos para el tratamiento y prevención de infecciones bacterianas. Los procesos de QQ presentan un enorme potencial en el campo farmacéutico y biotecnológico, al tratarse de un mecanismo de bio-control de virulencia que evita que las bacterias lancen su ataque, haciéndolas más sensibles a las defensas del hospedador y facilitando que puedan ser eliminadas con mayor eficacia. Un punto clave de las estrategias de QQ es que no afectan a la viabilidad de las bacterias, sino que sólo interfieren en la expresión de los factores de virulencia, evitando una presión selectiva sobre ellas, y por lo tanto, no generando resistencias.
Los mecanismos de QQ son considerados los nuevos agentes antipatogénicos situándolos como un objeto importante de estudio, pues una de sus posibles aplicaciones es el control de patógenos tanto de plantas como de animales, incluyendo humanos, que actúan a través de procesos de QS. El proceso de QQ tiene una menor probabilidad de selección de resistencias y una mayor especificidad, afectando solo a las bacterias receptoras. Además el uso de las estrategias de QQ acompañado de antibióticos podría dar lugar al control de patógenos multirresistentes tales como P. aeruginosa. En acuicultura, su aplicación como sustitutos a antibióticos es una alternativa con un amplio potencial, debido a las restricciones legislativas del uso de antibióticos en este campo, así como en otros campos de sanidad animal. Por otra parte, los procesos de QS y QQ cobran real importancia en el medio marino por sus implicaciones ecológicas en el mismo, y en especial, en el campo de la acuicultura ya que los procesos de QS mediados por N-acil-homoserín lactonas (AHLs) o autoinductores de tipo 2 (AI-2) están abundantemente extendidos en patógenos marinos como el caso de Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. salmonicida, V. vulnificus, Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Yersinia ruckeri, Edwarsiella tarda y Tenacibaculum maritimum (Freeman y Bassler, 1999; Swift et al., 1999; Croxatto et al., 2002; Buch et al., 2003; Morohoshi et al., 2004; Bruhn et al., 2005; Romero et al., 2010).
Un proceso controlado por fenómenos de QS a destacar es la formación de biopelículas ("biofilms"), de gran impacto económico y clínico. Se sabe que muchas de estas biopelículas están íntimamente relacionadas con procesos infecciosos humanos. Los mecanismos por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, aunque se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir endotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a la acción fagocitaria de las células del sistema inmune, y, por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos antibióticos. Este último aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrían extenderse de paciente a paciente a través de las manos del personal sanitario. Los patógenos formadores de biopeliculas son muy resistentes a antibióticos y pueden adherirse a los alimentos o a sustancias en contacto con ellos, provocando problemas tanto de higiene como posibles toxinfecciones alimentarias y en último término, grandes pérdidas económicas. Además, a menudo se encuentran en la superficie de los implantes médicos o en los dispositivos insertados en el organismo. También se pueden formar en áreas del cuerpo que están expuestas al aire; en particular, en heridas y en la pleura. En este sentido, Pseudomonas aeruginosa es una de las bacterias más infectivas y problemáticas al formar biofilms difícilmente tratables con antibióticos convencionales. En pacientes con fibrosis quística coloniza los pulmones causando infecciones que son difíciles de tratar, y, a menudo, finalmente fatales. También es especialmente interesante en pacientes con heridas crónicas o con quemaduras. Por otra parte, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis están actualmente clasificados como los principales causantes de las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que estas especies habitan tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que, a través de las heridas quirúrgicas, puedan penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente. Estas especies forma biopeliculas que colonizan catéteres, drenajes e implantes, favoreciendo la contaminación y la resistencia a antibióticos. Además, uno de los biofilms biológicos que presenta mayor complejidad y de mayor relevancia clínica es la placa dental, de cuya formación es responsable, entre otros patógenos de la cavidad oral, Streptococcus mutans, que también forma biopeliculas. Adicionalmente, los biofilms contribuyen a la contaminación biológica de superficies, al bloqueo mecánico en conductos, sistemas de distribución de agua potable, sistemas de aire acondicionado, sistemas antiincendios, etc. Por último hay que añadir que favorecen la formación del "biofouling" al constituir la base del crecimiento de otros organismos superiores en superficies sumergidas, constituyendo un grave problema económico en el sector de la acuicultura y transporte marítimo.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar nuevos agentes antibacterianos que incrementen el arsenal de remedios para combatir infecciones bacterianas.
La bacteria marina Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426) presenta una alta capacidad de QQ.
Tenacibaculum sp. 20J (CECT 7426): una cepa con elevada capacidad QQ
La bacteria marina Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426) se caracteriza por una alta capacidad de degradación de señales AHL, mucho mayor que otras bacterias con actividad QQ que han sido aisladas de suelo (Romero et al., 2012). Se trata del aislado obtenido a partir de una muestra de sedimento de un tanque de cultivo de peces marinos, en medio TSA-I (Romero, 2010). La secuencia parcial del gen del RNA ribosómico 16S de la cepa presenta porcentaje de identidad del 99% con la cepa tipo de la bacteria marina patógena Tenacibaculum discolor DSM 18842/NCIMB 14278 , perteneciente al filo Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), que causa la infección bacteriana conocida como tenacibaculosis/flexibacteriosis o "gliding bacterial disease" (Piñeiro-Vidal et al., 2008). Una característica distintiva de Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426) es que es capaz de crecer en medios carentes de sales marinas (TSA-1), por lo que si se aplican de forma estricta los caracteres taxonómicos fijados para el género Tenacibaculum excluiría a la cepa 20J de la especie 7. discolor (Piñeiro Vidal et al. , 2008). Por ello, a lo largo de este texto se utilizará para describir esta especie la terminología Tenacibaculum sp. cepa 20J o simplemente "cepa 20J". Las células vivas y extractos celulares de la cepa 20J degradan todo el intervalo de tamaños de AHLs conocido, con o sin oxo- sustituciones, por lo que su actividad es altamente inespecífica (Romero, 2010). Es una cepa de rápido crecimiento, cultivable tanto en medios marinos como en medios terrestres.
Estudios preliminares llevados a cabo con la cepa 20J indican que la localización principal de su actividad QQ está ligada a las células aunque también se observa en sobrenadantes filtrados (ES 2342807 B2). Además, su actividad es constitutiva, pues no requiere la exposición previa a señales para su expresión. Al presentar actividad interceptora de QS tanto en la célula viva como en extractos celulares purificados (designados como ECCs en ES2342807 B2), permite el uso de ambos tipos de presentaciones para su aplicación biotecnológica. Además de haberse demostrado su alto espectro de actividad QQ, la comparación de su actividad con los datos disponibles en la bibliografía confirman su potencial ya que esta cepa degrada las AHLs con una velocidad hasta 24 veces mayor que los consorcios bacterianos marinos seleccionados por su actividad QQ (Cam et al., 2009). La comparación de la actividad de extractos celulares purificados de la cepa 20J con los mismos extractos de la cepa de Bacillus thuringiensis CECT 197, puso de manifiesto la mayor actividad de los extractos celulares purificados de la cepa 20J, sobre todo en el caso de la degradación de la N-hexanoil-L-homoserín lactona (C6-HSL): mientras que la concentración mínima activa (CMA) para la degradación total de una disolución 10 μΜ de C6-HSL en 24 horas es de 10 μg de proteína de extracto por mL para la cepa 20J, es necesaria una concentración 3 órdenes de magnitud mayor de extracto celular de Bacillus thuringiensis ATCC10792, 10.820 μg de proteína/mL, para llevar a cabo la misma degradación (datos no publicados). Por todas sus características, la cepa 20J es un candidato prometedor para el control de patógenos relacionados con la salud humana, acuicultura, animales y plantas o en la inhibición de la formación de biofilms (Romero, 2010) y por ello estas aplicaciones ha sido protegidas mediante patente (ES 2342807 B2).
No obstante, no se ha podido identificar hasta la fecha el gen responsable de su actividad QQ o de su actividad degradadora de señales de QS, en particular, señales AHLs. La identificación y caracterización de dicho gen permitiría disponer fácilmente de cantidades importantes del producto responsable de dicha actividad, lo que facilitaría y generalizaría su empleo en todo tipo de aplicaciones en las que resulta necesario el control de poblaciones bacterianas que producen señales de QS.
Los esfuerzos realizados hasta la fecha para intentar clonar el gen o genes responsables de la actividad QQ sobre señales de QS, en particular AHLs, mediante técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados, diseñados para las secuencias conservadas de las lactonasas y acilasas descritas en la bibliografía o mediante la construcción de una biblioteca genómica en plásmido con la que se transformó la cepa productora de AHLs P. aeruginosa PAOI, portadora del plásmido QSIS pMH655 (Rasmussen et al., 2005), que fue diseñada para la detección de QQ, ya que la cepa no puede sobrevivir en presencia de sacarosa y AHL, resultaron infructuosos. En concreto, ninguna de dichas metodologías resultó en la detección de los genes responsables de actividad QQ de la cepa 20J (datos no publicados), lo que es indicativo de la existencia de diferencias importantes entre la enzima con actividad QQ de la cepa 20J y las enzimas con actividad QQ descritas hasta la fecha.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Se describe la clonación, secuenciacion y caracterización del gen responsable de la actividad QQ de Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426) que codifica un péptido con actividad inhibidora de señales de QS, en particular, con actividad lactonasa, en ocasiones denominado "AN20J" en esta descripción, que presenta un porcentaje de identidad inferior al 38% con respecto a las secuencias de otras lactonasas descritas hasta la fecha para otras especies, así como frente a las secuencias de los genes homólogos presentes en otras especies del género Tenacibaculum cuya actividad QQ ya ha sido descrita con anterioridad (ES2342807 B2).
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ I D NO: 1 , o una variante del mismo que tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de Quorum Sensing (QS).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicho polinucleótido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende dicho polinucleótido, o dicho vector, o el péptido codificado por dicho polinucleótido, con la condición de que dicha célula no es una bacteria del género Tenacibaculum.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un organismo no humano transgénico que comprende, insertado en su genoma, dicho polinucleótido o dicho vector, con la condición de que dicho organismo no es una bacteria del género Tenacibaculum.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un péptido codificado por la secuencia nucleotídica de dicho polinucleótido. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido. En una realización particular, dicha composición comprende, además, un vehículo seleccionado entre un vehículo apto para alimentación, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un vehículo agrícolamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un producto alimenticio que comprende dicha composición y un vehículo apto para alimentación.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, en la elaboración de un producto alimenticio.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dicha composición y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición agrícola que comprende dicha composición y un vehículo agrícolamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta con dicho péptido, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS, bajo condiciones que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende transformar dicha planta con dicho polinucleótido o vector, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende el empleo de una bacteria transformada con dicho polinucleótido o vector, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS, bajo condiciones que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, para provocar un proceso de quorum quenching (QQ) en respuesta a un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para provocar un proceso de QQ en respuesta a un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, bajo condiciones que permiten provocar dicho proceso de QQ.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, para inhibir un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inhibir un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, bajo condiciones que permiten inhibir dicho proceso de QS.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para degradar una señal de QS, que comprende poner en contacto dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, con dicha señal de QS, bajo condiciones que permiten degradar dicha señal de QS.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para modular la actividad señalizadora de una N-acil-homoserin lactona (AHL), que comprende poner en contacto dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, con dicha AHL, bajo condiciones que permiten modular la actividad señalizadora de dicha AHL.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, para inhibir la formación de un biofilm bacteriano ex vivo o in vitro.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro o ex vivo para inhibir la formación de un biofilm bacteriano, en donde dicho biofilm bacteriano es producido por una bacteria productora de una señal de QS, que comprede poner en contacto dicho polinucleótido, vector, célula, organismo no humano transgénico o péptido, con dicha bacteria productora de señales de QS, bajo condiciones que permiten inhibir la formación de dicho biofilm bacteriano.
En realizaciones particulares de la invención, dichas señales de QS producidas por la bacteria comprenden una AHL, en donde dicha AHL es (i) una AHL no sustituida, en donde dicha AHL no sustituida se selecciona del grupo formado por C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL y sus combinaciones; (ii) una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, en donde dicha AHL oxo- o hidroxi- sustituida se selecciona del grupo formado por OC6-HSL, OC12-HSL y sus combinaciones; o (iii) combinaciones de (i) y (ii).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Fotografía del clon positivo 13-E2 obtenido en el cribado de la biblioteca genómica de la cepa 20J. Se observa que el pocilio aparece sin pigmento violaceína, a diferencia del resto de pocilios de la placa microtiter, por la degradación de la AHL añadida exógenamente.
Figura 2: Análisis HPLC-MS de degradación de C6-HSL tras 24 horas por extractos celulares del clon positivo 13-E2 (ECC 13E2). Controles: PBS y E. coli ϋΗ10β sin el fósmido (ECC ϋΗ10β). Se acidificó a pH 2 para recuperar el anillo lactona (barras sombreadas). Figura 3. Análisis HPLC-MS de degradación de C10-HSL tras 24 horas por extractos celulares del clon positivo 13-E2 (ECC 13E2). Controles: PBS y E. coli DI-ΙΙ Οβ sin el fósmido (ECC DH 10β). Se acidificó a pH 2 para recuperar el anillo lactona (barras sombreadas).
Figura 4. Fotografía del bioensayo en medio sólido de 3 de los clones positivos de la segunda genoteca construida a partir del inserto del clon 13-E2 seleccionados al azar (1-E6, 1-G7 y 4-A9) y 1 clon negativo (1 E9) con los biosensores de AHLs C. violaceum CV026 (A) y C. violaceum VIR07 (B). Todos los clones ensayados fueron capaces de degradar C6-HSL y C10-HSL tras 24 horas impidiendo la formación del halo de violaceína en los biosensores. El pocilio con violaceína se corresponde con un clon negativo confirmado (1-E9) usado como control.
Figura 5. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de a/720J con la lactonasa a/VA de Bacillus sp. 240B1 (Dong et al., 2000, número de acceso AF196486).
Figura 6. Alineamiento de la secuencia aminoácidica de lactonasa de 20J (AN20J) y las lactonasas de distintas especies del género Bacillus. El motivo conservado característico de las metalo^-lactamasas (HXHXDH), aparece entre los aminoácidos 138 y 143 de la figura.
Figura 7. Resultados del bioensayo para degradación de C6-HSL (arriba) y C10-HSL (abajo) por células vivas de distintas especies del género Tenacibaculum. Las bacterias se cultivaron en Caldo Marino durante 24 horas y a continuación se resuspendieron en PBS pH 6,5 al que se añadió la AHL a una concentración de 10 μΜ. La degradación se visualizó mediante el ensayo de activación de la producción de violaceína en los biosensores C. violaceum CV026 y VIR07 que producen este pigmento sólo en presencia de AHL (Romero et al., 2011).
Figura 8. Alineamiento de las lactonasas de Tenacibaculum sp. 20J (AN20J), T. discolor (AiiTD), T. gallaicum (AiiTG), T. lutimaris (AiiTL), T. aestuarii (ANTA) y T. soleae (AiiTS) obtenidas mediante amplificación con primers diseñados para los extremos de AN20J. Para alinear las secuencias de las distintas lactonasas y de sus respectivas secuencias nucleotídicas se usaron las herramientas informáticas de BLAST del NCBI. Figura 9. Árbol filogenético mediante el método neighbor-joining de las secuencias aminoacídicas de AN20J de Tenacibaculum sp. 20J, AiiTD de T. discolor, AiiTG de T. gallaicum, AiiTS de T. soleae, AiiTL de T. lutimaris, ANTA de T. aestuarii, ANA de B. subtilis (número de acceso AAY5161 1.1), ANA de B. cereus (AAY22194.1), ANA de B. thurigiensis (AA043435.1), ANA de uncultured Bacillus sp. (CAD44268.1), ANA AI96 de Bacillus sp. AI96 (ADK91097.1), AttM/ANB de A. tumefaciens (AAL13075.1), AhIK de K. pneumoniae (AAO47340.1) y AhID de Arthrobacter sp. (AAP57766.1). Barra de escala: 0,2 sustituciones de aminoácidos por sitio.
Figura 10. Electroforesis de ácidos nucleicos en gen de agarosa al 1 %. Calle M: marcador de peso molecular (pb). 1 : miniprep de un cultivo de XLI blue transformado con pET28c(+) con el inserto de AN20J. 2: doble digestión de esta miniprep con EcoRI y Ncol, el inserto del gen AN20J (861 pb) aparece en el tamaño correspondiente.
Figura 11. Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa al 1 %. M: Marcador de peso molecular (pb). 1 : PCR de una de las colonias recombinantes obtenidas por electroporación en BL21 (DE3) con los primers TEN1 F y TEN 1 R, aparece el fragmento entre los dominios homólogos internos (237 pb) en el tamaño correspondiente.
Figura 12. Gel de electroforesis desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) con tinción de azul de coomasie del extracto celular de cultivos de 24 h de E. coli BL21 (DE3) pET28c+, E. coli BL21 (DE3) pET28c+ AN20J y E. coli BL21 (DE3) pET28c+ AN20J inducido con IPTG. Marcador molecular (en kDa) en la calle de la izquierda.
Figura 13. Gel de electroforesis desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) con tinción de azul de coomasie de la proteína AN20J purificada a partir del extracto de un cultivo de 24 h de E. coli BL21 DE3 pET28c+ AN20J. Se utilizó una columna de afinidad por histidina para la purificación de proteínas (His GraviTrap™ affinity columns, GE Healthcare). La banda obtenida de proteína (-34,9 kDa) en la calle del gel pertenece a la fracción recogida de la purificación. Marcador molecular (en kDa) en la calle de la izquierda.
Figura 14: Bioensayo para determinar la Concentración Mínima Activa (CMA) de AN20J frente a C6-HSL (CV026) y C10-HSL (VIR07). Se incubaron distintas diluciones de una solución de ANA de 0,2 mg/mL con las AHLs a una concentración 10 μΜ durante 3 horas (panel superior) y 24 horas (panel inferior). Se consideró como CMA la concentración de la mayor dilución que logró eliminar completamente la señal (ausencia de halo de violaceina) en el tiempo estipulado.
Figura 15: Cinética de degradación de C6-HSL y C10-HSL 50 μΜ mediante AN20J purificada (20 μg/mL) de Tenacibaculum sp. 20J o mediante ANA purificada (40 μg/mL) de Bacillus sp. y termoestabilidad de AN20J a 60°C con C6-HSL (50 μΜ) determinados mediante análisis de HPLC-MS. Los controles se establecieron con las señales en PBS. Los datos son la media de 3 reacciones independientes, mostrándose la media y la desviación estándar.
Figura 16. Degradación de distintas AHLs por una solución de 20 μg/mL de AN20J en el periodo de 1 hora a una temperatura de 22°C. Se representa el porcentaje de AHL no degradado, medido por HPLC-MS.
Figura 17. Fotografía del bioensayo en medio sólido de resistencia a pH de AN20J purificada a una concentración final de 20 μg/mL a 22°C con distintos buffers (valores de 3-9 pH) para las dos señales C6-HSL (placa izquierda) y C10-HSL (placa derecha). Las AHLs se incubaron durante 3 horas con el enzima previamente tratado al pH que se indica.
Figura 18. Efecto de la Quimiotripsina (Panel inferior) y la Proteinasa K (panel superior) sobre la actividad enzimática de AN20J. AN20J (20 μg/mL) se incubó con soluciones de ambos enzimas (proteinasa K/AN20J 1 : 10 y quimiotripsina/AN20J 1 :60) durante 30 ó 60 minutos y a continuación se añadió C6-HSL o C10-HSL para evaluar la actividad del enzima. Los pocilios centrales se corresponden con el control negativo de PBS más la AHL correspondiente y con halo de violaceina aparecen los controles negativos de la proteinasa K y quimiotripsina tratada en las mismas condiciones que las muestras pero sin la enzima AN20J.
Figura 19: Análisis HPLC-MS de la capacidad de degradación de C6-HSL por AN20J purificada previo tratamiento con distintas temperaturas (22, 60, 80 y 90°C) durante 10 minutos. La concentración de la proteína fue de 20 μg/mL. El control (barra con puntos) se realizó en PBS. Figura 20. Fotografía del bioensayo en medio sólido del CCE de E. coli BL21 DE3 con el plásmido pET28c(+) y AN20J para C6-HSL. La actividad de 20J dentro del extracto resistió al tratamiento con todas las temperaturas degradando la señal C6-HSL a las 3 horas impidiendo la formación del halo de violaceína en el biosensor. Los pocilios centrales se corresponden con los controles negativos de PBS con la misma concentración de AHL (10 μΜ).
Figura 21. Se muestra la ausencia de interferencia de AN20J con la acción de algunos antibióticos β-lactámicos. Se muestra un antibiograma de pocilios de diferentes antibióticos del grupo de las cefalosporinas frente a Staphylococcus aureus. En la placa de la izquierda se muestran los antibióticos no tratados. En la placa de la derecha se muestran los antibióticos tratados con AN20J (20 μg/mL durante 24 horas). El diámetro de los halos de inhibición no se vio afectado por el tratamiento con el enzima para ninguno de los antibióticos e inhibidores de la β-lactamasa probados.
Figura 22. Se muestra la resistencia al ácido de E. coli K12 MG1655. Las células se cultivaron en LB glucosa (0,4 %) con las distintas condiciones: E. coli K-12 (Control), E. coli con OC6-HSL 5 μΜ (Control AHL), E. coli con AN20J a 20 μg/mL (AN20J) y E. coli con OC6-HSL y AN20J (AN20J AHL) a 30°C y a continuación fueron subcultivadas en MEM a pH 2,0 con glucosa (0,4 %) y glutamato (1 ,6 mM) a la misma temperatura. La superviviencia de E. coli se determinó mediante la cuantificación de las CFU/mL a las 0, 1 ,5 y 3 horas y se expresó como porcentaje (%) de células viables con respecto a las 0 horas. Cada condición fue ensayada por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
1. Polinucleótido de la invención
En un aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido, en adelante "polinucleótido de la invención", que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 , o una variante del mismo que tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de Quorum Sensing (QS). En el sentido utilizado en esta descripción, el término "Quorum Sensing" o "QS", también conocido como "detección de quorum", se refiere a la capacidad de un microorganismo para percibir y responder a la densidad poblacional mediante la regulación de la expresión genética, siendo así capaz de desarrollar un comportamiento social coordinado. Así, las bacterias comunican su presencia a las demás usando pequeñas moléculas de señalización química, conocidas como "señales de QS", que liberan, detectan y responden a la acumulación en el medio de tales señales. La detección de dichas señales QS permite a la bacteria distinguir entre una alta densidad de población y una baja densidad de población, de modo que, a medida que crece la población bacteriana se incrementa el nivel extracelular de la molécula señal, hasta que se alcanza una concentración umbral que equivale a un censo mínimo o quorum que desencadena una variación de la expresión génica bacteriana en respuesta a cambios en el número de células. Se conocen 4 tipos principales de señales QS: a) N-acil-homoserín lactonas (AHLs), basadas en un anillo lactona (HSL) al que se une, mediante enlace amida, un ácido graso que constituye la cadena lateral; dicha cadena lateral tiene, normalmente, una longitud de entre 4 y 18 átomos de carbono, puede estar saturada o insaturada y puede presentar o no sustituciones oxo- o hidroxi- en el tercer átomo de carbono; ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como, por ejemplo, N-hexanoil-L-homoserín lactona (C4-HSL), N-hexanoil-L- homoserín lactona (C6-HSL), N-octanoil-L-homoserín lactona (C8-HSL), N- decanoil-L-homoserín lactona (C10-HSL), N-dodecanoil-L-homoserín lactona (C12-HSL), N-tetradecanoil-L-homoserín lactona (C14-HSL), etc., así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como, por ejemplo, N-oxohexanoil-L- homoserín lactona (OC6-HSL), N-oxododecanoil-L-homoserín lactona (OC12- HSL), etc. Este tipo de señales AHLs son bastante habituales en bacterias Gram-negativas aunque también se han descubierto en otros phyla (e.g., en algunas cianobacterias, en miembros de Citofaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), también conocidos como Bacteroidetes); b) Péptidos autoinductores (AIPs), corresponden a péptidos de bajo peso molecular (presentan habitualmente entre 5 y 34 restos de aminoácidos), que sufren modificaciones post-traduccionales; se conocen diferentes familias de AIPs. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos AIPs incluyen la nisina, el AIP-1 de estafilococos así como unos péptidos de triptófano isoprenilado. Este tipo de señales AIPs son bastante habituales en bacterias Gram-positivas; y c) Autoinductores de tipo μ(ΑΙ-2), cuya estructura es un diéster furanosil borato, que se encuentran tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de este AI-2 incluyen (2S,4S)-2-metil- 2,3,3,4-tetrahidroxitetrahidrofurano-borato, (2R,4S)-2-metil-2,3,3,4-tetrahidroxi- tetrahidrofurano-borato, etc. d) AI-3, cuya estructura no se conoce y se cree relacionada con la comunicación entre procariotas y eucariotas, que establece mecanismos de señalización cruzada con las hormonas eucariotas epinefrina y norepinefrina, y que se ha descrito en cepas enterohemorrágicas de Escherichia coli y otras enterobacterias.
En el sentido utilizado en esta descripción, un péptido con "actividad inhibidora de Quorum Sensing (QS)", se refiere, en general, a un péptido que inhibe un proceso de QS mediado por señales de QS, en donde dichas señales de QS se seleccionan entre AHLs, APIs, AI-2, AI-3 y combinaciones de las mismas.
En una realización particular, dicho péptido con actividad inhibidora de QS es un péptido que inhibe las señales mediadas por AHLs hidrolizando el anillo lactona presente en dichas AHLs, tal como un péptido con actividad lactonasa, es decir, un péptido que hidroliza la lactona (anillo HSL) generando el correspondiente ácido hidroxi-carboxílico. La actividad lactonasa del péptido de la invención (definido más adelante) puede determinarse mediante diversos ensayos enzimáticos conocidos por el técnico en la materia. En general, todos los ensayos enzimáticos adecuados para tal fin miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un periodo de tiempo determinado. En un caso particular, la actividad enzimática puede determinarse midiendo la velocidad inicial de reacción, método mediante el cual las mediciones se realizan en un periodo muy corto de tiempo y en concentraciones saturantes de sustrato, por lo que la concentración de sustrato libre se considera igual al sustrato inicial y la velocidad medida es la máxima alcanzada en las condiciones de reacción dadas. En otro caso particular, la actividad enzimática puede determinarse mediante la medida del progreso de la curva durante la reacción, en donde se determina la concentración del sustrato consumido o del producto obtenido como una función del tiempo. En otro caso particular, la actividad enzimática puede determinarse mediante la medida de la concentración de sustrato o de producto en la rápida fase inicial transitoria de la reacción enzimática en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cinético constante. En otra realización particular, la actividad enzimática puede determinarse en la fase de equilibrio de la reacción, que consiste en la alteración del equilibrio de la reacción enzimática modificando las condiciones de reacción tales como temperatura, pH, presión, etc. y el estudio de cómo regresa de nuevo a las condiciones de equilibrio la mezcla de enzima, sustrato y producto.
La actividad lactonasa de un péptido puede ser determinada por cualquier método convencional adecuado conocido por los expertos en la materia. Dicho método puede basarse en la determinación de la cantidad de sustrato consumido o de producto generado en la reacción durante un periodo de tiempo determinado. Para ello, se utilizará el sustrato adecuado para la actividad lactonasa a ensayar. En la parte experimental que acompaña a esta descripción, se describen distintos ensayos adecuados para determinar la actividad lactonasa de un péptido (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3, apartado 3.3).
En una realización particular, la actividad lactonasa de un péptido se determina mediante la hidrólisis de una lactona, preferentemente, una AHL, tal como una AHL no sustituida, por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, o una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, por ejemplo, OC6-HSL u OC12-HSL. A modo ilustrativo, no limitativo, la actividad lactonasa de un péptido puede llevarse a cabo mediante un ensayo que comprende poner en contacto dicho péptido con el sustrato correspondiente, por ejemplo, C6-HSL, C10-HSL, OC6-HSL, etc., bajo condiciones apropiadas y, posteriormente, evalur la presencia de sustrato no degradado mediante un bioensayo en placa con las cepas bioindicadoras Chromobacterium violaceum CV026 y C. violaceum VIR07, o bien mediante análisis de la cinética de degradación de sustrato (e.g, una AHL tal como C6-HSL, C10-HSL u OC6-HSL) por el péptido en estudio y valoración de la concentración de AHL mediante HPLC-MS de acuerdo con la metodología especificada en Romero et al. 2011. En otra realización particular, dicho péptido con actividad inhibidora de QS es un péptido que degrada o inhibe las señales del tipo AIPs, tal como un péptido con actividad hidrolasa, es decir, un péptido que hidroliza el péptido AIP o que inhibe la actividad de la señal mediada por dicho AIP. La actividad inhibidora de las señales mediadas por AIPs puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, tales como los descritos en Boles and Horswill, 2008.
En otra realización particular, dicho péptido con actividad inhibidora de QS es un péptido que degrada o inhibe las señales del tipo AI-2, tal como un péptido con actividad hidrolasa, es decir, un péptido que hidroliza el AI-2 o que inhibe la actividad de la señal mediada por dicho AI-2. La actividad inhibidora de las señales mediadas por AI-2 puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. En una realización particular, la actividad de degradación de Al- 2 se determina empleando cultivos de diferentes cepas de la especie marina bioluminiscente Vibrio harveyi con mutaciones específicas en los sistemas de QS que controlan la producción de luz, a los que se añade el péptido con actividad inhibidora de QS, y se evalúa la cantidad de luz producida. En concreto, en la cepa JMH597 de esta especie, sólo el canal de AI-2 está activo (AHL-, AI-2 +, CAI-1-), por lo que en caso de que el péptido añadido al cultivo tenga actividad QQ contra AI-2, no se produciría luz en esta cepa en concreto.
En otra realización particular, dicho péptido con actividad inhibidora de QS es un péptido que degrada o inhibe las señales mediadas por AI-3, tal como un péptido con actividad hidrolasa, es decir, un péptido que hidroliza el péptido AI-3 o que inhibe la actividad de la señal mediada por dicho AI-3. La actividad inhibidora de las señales mediadas por AI-3 puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, tales como los descritos en Hughes et al, 2009.
La SEQ ID NO: 1 ha sido identificada a partir de Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426), una bacteria marina con alta capacidad de degradación de señales AHL, tal como se menciona en la patente española ES2342807, mediante un ensayo basado en la construcción de una librería genómica de Tenacibaculum sp. cepa 20J en fósmido y screening funcional, tal como se describe en el Ejemplo 1. Dicha SEQ ID NO: 1 codifica un péptido con actividad inhibidora de QS. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2 (definido más adelante), codificado por dicha SEQ ID NO: 1 , inhibe las señales de QS mediadas por AHLs ya que tiene, al menos, actividad lactonasa e hidroliza AHLs (Ejemplo 3).
Por tanto, en una realización particular, el polinculeótido de la invención comprende la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 incluye tanto el codón de inicio (ATG) como el de terminación (TAA).
En otra realización particular, la secuencia de nucleotidos del polinucleótido consiste en la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En otra realización particular, el polinucleótido de la invención es una variante sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente del polinucleótido cuya secuencia de nucleotidos se muestra en la SEQ ID NO: 1.
En el sentido utilizado en esta descripción, un polinucleótido es "sustancialmente homólogo" al polinucleótido de SEQ ID NO: 1 cuando su secuencia de nucleotidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 de, al menos, un 76%, ventajosamente de, al menos un 85%, preferentemente de, al menos, un 90%, más preferentemente de, al menos, un 91 %, 92%, 93%, 95%, 96%, 97% ó 98%, y, todavía más preferentemente de, al menos un 99%. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. 1990). A modo ilustrativo, un polinucleótido sustancialmente homólogo al polinucleótido cuya secuencia de nucleotidos comprende, o consiste en, la secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NO: 1 se puede construir en base a la secuencia de nucleotidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 mediante la introducción de, por ejemplo, nucleotidos o codones que codifican aminoácidos que constituyen sustituciones conservativas o no conservativas con respecto a los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos ilustrativos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleotidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleotidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleotidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En el sentido utilizado en esta descripción, un polinucleótido es "funcionalmente equivalente" al polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos comprende, o consiste en, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 cuando codifica un péptido que tiene actividad inhibidora de QS. La actividad inhibidora del péptido codificado por polinucleótido funcionalmente equivalente al polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos comprende, o consiste en, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 puede ser determinada por métodos convencionales de determinación de dicha actividad inhibidora de QS (e.g., actividad inhibidora de señales mediadas por AHLs, AIPs, AI-2 y/o AI-3), tales como los mencionados previamente.
En una realización particular, el polinucleótido de la invención es una variante sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente del mismo, es decir, es un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 76%, ventajosamente de, al menos un 85%, preferentemente de, al menos, un 90%, más preferentemente de, al menos, un 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ó 98%, y, todavía más preferentemente de, al menos un 99%, con respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS. En una realización concreta, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS. En otra realización concreta, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 90% con respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS. En otra realización concreta, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 99% con respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS.
El polinucleótido de la invención puede encontrarse como tal o formando parte de una construcción génica, en adelante construcción génica de la invención, que comprende dicho polinucleótido de la invención. La construcción génica de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión del polinucleótido de la invención, constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el péptido de la invención, codificado por el polinucleótido de la invención, es expresado en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamífero, etc. Ventajosamente, la construcción de la invención comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción. La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al., 2001).
La construcción génica de la invención puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector recombinante, en adelante vector de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. En una realización particular, el vector de la invención es un vector de expresión. A modo ilustrativo, no limitativo, el vector donde se introduce el polinucleótido de la invención puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de vectores en los que puede insertarse el polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención incluyen el plásmido pET28c(+). La obtención del vector de la invención puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al., 2001). En una realización particular, dicho vector es un vector útil para transformar células competentes de Escherichia coli (Ejemplo 3). El vector de la invención puede ser utilizado para transformar células susceptibles de ser transformadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. El vector de la invención puede ser utilizado para transformar células eucariotas, tales como levaduras, por ejemplo, Pichia pastoris, etc., o microalgas, por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii, etc., o células procariotas, tales como bacterias, por ejemplo, E. coli, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, en adelante célula de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un cassette de expresión proporcionado por esta invención, o un vector de la invención, y es capaz de expresar la proteína de la invención, o bien un péptido de la invención (definido más adelante), con la condición de que dicha célula de la invención no es una bacteria del género Tenacibaculum. El término "célula", tal como aquí se utiliza, se refiere a la unidad más pequeña que mantiene las propiedades fundamentales de la vida, y, comprende células procari óticas, eucarióticas y mesocarióticas, así como células de organismos unicelulares (e.g., bacterias) y multicelulares (e.g., animales, plantas). Así, a modo ilustrativo, la célula de la invención puede ser una célula eucariota, tal como por ejemplo, una célula de tejido vegetal, una levadura, una microalga, etc., una célula procariota, tal como una bacteria, por ejemplo, E. coli, etc. La obtención de células de tejidos vegetales que comprenden un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un cassette de expresión proporcionado por esta invención, un vector de la invención, o un péptido de la invención (definido más adelante) puede ser muy interesante desde diversos puntos de vista, por ejemplo, para aumentar la resistencia a bacterias patógenas, en particular, bacterias productoras de señales de QS. Las células de la invención pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al., 2001). En una realización particular, dicha célula de la invención es una célula hospedadora transformada con un vector de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un organismo no humano transgénico, en adelante "organismo transgénico de la invención", que comprende, insertado en su genoma, un polinucleótido de la invención, una construcción génica de la invención, un cassette de expresión proporcionado por esta invención o bien un vector de la invención, con la condición de que dicho organismo no humano no es una bacteria del género Tenacibaculum. El organismo transgénico de la invención puede ser una planta, por ejemplo, de tabaco, patata, tomate, cebolla, algodón, lino, café, chocolate, caucho, roble, castaño, cerezo, etc., un cereal, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, etc., o bien un animal, por ejemplo, pez cebra, salmón, conejo, ratón, etc. Debido a que el polinucleotido de la invención codifica un péptido con actividad inhibidora de QS, el organismo transgénico de la invención será resistente, o sustancialmente más resistente que el correspondiente organismo no transgénico que no contiene insertado en su genoma el polinucleotido de la invención, a las infecciones causadas por organismos, por ejemplo, bacterias, que producen señales QS y/o podrá provocar un proceso de Quorum Quenching (QQ) en respuesta a un proceso de QS. El organismo transgénico de la invención puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al., 2001); dichos métodos incluyen el empleo de pistolas de genes o el uso de bacterias o virus como vectores para transferir el polinucleotido de la invención. Dong et al (2001) describen la obtención de plantas de tabaco y de patata transformadas con la secuencia correspondiente a una lactonasa de Bacillus sp. con actividad sobre AHLs, por lo que el organismo transgénico de la invención puede ser obtenido, por ejemplo, mediante los métodos descritos en dicha publicación.
2. Péptido de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante "péptido de la invención", cuya secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleotido de la invención.
El término "péptido", tal como aquí se utiliza, se refiere a una cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, independientemente de su longitud, e incluye tanto cadenas de aminoácidos de 10 o menos aminoácidos (en algunas publicaciones identificados como "oligopéptidos") como cadenas de aminoácidos de más de 10 aminoácidos, por ejemplo, más de 100 aminoácidos.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia codificada por el polinucleotido cuya secuencia de nucleótidos se muestra en la SEQ ID NO: 1. Dicho péptido tiene actividad inhibidora de QS. Las características de dicha actividad inhibidora de QS han sido mencionadas previamente en relación con el polipéptido de la invención así como los ensayos para identificar si un determinado péptido tiene o no dicha actividad inhibidora de QS. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2, inhibe QS, tales como las señales mediadas por AHLs, por lo que, al menos, tiene actividad lactonasa e hidroliza AHLs (Ejemplo 3).
En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos del péptido de la invención consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. En ocasiones, dicho péptido ha sido denominado "AN20J" en esta descripción.
En otra realización particular, el péptido de la invención es una variante sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente del péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.
En el sentido utilizado en esta descripción, un péptido es "sustancialmente homólogo" al péptido de SEQ ID NO: 2 cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 de, al menos, un 76%, ventajosamente de, al menos un 85%, preferentemente de, al menos, un 90%, más preferentemente de, al menos, un 91 %, 92%, 93%, 95%, 96%, 97% ó 98%, y, todavía más preferentemente de, al menos un 99%. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. 1990). A modo ilustrativo, un péptido sustancialmente homólogo al péptido cuya secuencia de nucleótidos comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 se puede construir en base a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 2 mediante la introducción de, por ejemplo, aminoácidos que constituyen sustituciones conservativas o no conservativas con respecto a los aminoácidos presentes en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2. Otros ejemplos ilustrativos de posibles modificaciones incluyen la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos (amino o carboxilo), la inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En el sentido utilizado en esta descripción, un péptido es "funcionalmente equivalente" al péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 cuando tiene actividad inhibidora de QS. La actividad inhibidora del péptido funcionalmente equivalente al péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 puede ser determinada por métodos convencionales de determinación de dicha actividad inhibidora de QS (e.g., actividad inhibidora de señales mediadas por AHLs, AIPs, AI-2 y/o AI-3), tales como los mencionados previamente.
En una realización particular, el péptido de la invención es una variante sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente del mismo, es decir, es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de al menos un 76%, ventajosamente de, al menos un 85%, preferentemente de, al menos, un 90%, más preferentemente de, al menos, un 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ó 98%, y, todavía más preferentemente de, al menos un 99%, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 2 y tiene actividad inhibidora de QS. En una realización concreta, el péptido de la invención es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 2 y tiene actividad inhibidora de QS. En otra realización concreta, el péptido de la invención es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de al menos un 93% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 2 y tiene actividad inhibidora de QS. En otra realización concreta, el péptido de la invención es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 2 y tiene actividad inhibidora de QS.
El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc. Asimismo, el experto en la materia entenderá que dentro de dichas variantes sustancialmente homologas y funcionalmente equivalentes del péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2 se encuentran los fragmentos peptídicos que satisfacen tales condiciones.
El péptido de la invención puede encontrarse como tal o formando parte de una proteína de fusión, la cual constituye un aspecto adicional de la presente invención. Dicha proteína de fusión comprende, por tanto, un polipéptido A que comprende un péptido de la invención, y un polipéptido B, donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A. El polipéptido B puede estar unido a cualquier extremo del polipéptido A. Así, en una realización particular, el extremo amino terminal del polipéptido B está unido al extremo carboxilo terminal del polipéptido A, mientras que, en otra realización particular, el extremo carboxilo terminal del polipéptido B está unido al extremo amino terminal del polipéptido A. Ambos polipéptidos A y B pueden estar unidos directamente entre sí, o bien a través de un péptido espaciador (linker) entre dichos polipéptidos A y B. La proteína de fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas. El polipéptido A comprende un péptido de la invención, cuyas características ya han sido mencionadas y se incorporan aquí por referencia. En una realización particular, la proteína de fusión de la invención tiene actividad inhibidora de QS, en particular, inhibidora de señales de QS mediadas por AHLs, más concretamente, actividad lactonasa para hidrolizar AHLs. El polipéptido B es un polipéptido "diferente" al polipéptido A, es decir, es un polipéptido distinto al polipéptido A; en este sentido, en una realización particular, el polipéptido B es un péptido diferente a un péptido de la invención, mientras que, en otra realización particular, el polipéptido B es un péptido de la invención pero diferente al péptido de la invención concreto comprendido en el polipéptido A en una proteína de fusión de la invención determinada. Prácticamente cualquier polipéptido puede ser utilizado como polipéptido B en la proteína de fusión de la invención, siempre y cuando cumpla la condición de que es diferente del polipéptido A. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de péptidos que pueden ser utilizados como polipéptido B en la presente invención incluyen péptidos útiles para aislar y/o purificar proteínas, etc. Así, en una realización particular, dicho polipéptido B es un péptido útil para aislar y/o purificar proteínas. En general, dicho péptido útil para aislar y/o purificar proteínas estará situado en una región de la proteína de fusión de la invención que no afecte adversamente a la funcionalidad del péptido de la invención. Prácticamente cualquier péptido que pueda ser utilizado para aislar y/o purificar una proteína de fusión (denominados genéricamente "péptidos etiqueta" o "tag") puede estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho péptido útil para aislar y/o purificar una proteína, tal como una proteína de fusión, puede ser, por ejemplo, una cola de argininas (Arg-tag), una cola de histidinas (His-tag), FLAG- tag, Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo, tal como c- myc-tag, etc. En una realización particular y preferida de dicha proteína de fusión, dicho polipéptido B comprende una cola de polihistidinas.
Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el péptido de la invención, en particular, el péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en, la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, es estable bajo determinadas condiciones. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "estable" se refiere a la capacidad del péptido de la invención de mantener su actividad inhibidora de QS bajo determinadas condiciones, por ejemplo, pH, proteinasas, entre otras, y que además carece de actividad frente a antibióticos β-lactámicos e inhibidores de β- lactamasas. Así, se ha observado, que dicho péptido de la invención, además de tener actividad lactonasa de amplio espectro, degradando AHLs con cadenas laterales comprendidas entre 4 y 14 átomos de carbono, tanto oxo- o hidroxi- sustituidas como no sustituidas, es resistente a pH en el intervalo comprendido entre 3 y 9, es resistente a proteinasa K y quimiotripsina, y no interactúa con antibióticos β-lactámicos (e.g., Penicilina G, Meticilina, Amoxicilina, Ampicilina, Cefalotina, Cefaclor, Cefoxitina, Ceftriaxona, Cefoperazona, Imipenem y Meropenem) ni con inhibidores de las β- lactamasas (e.g., Sulbactam y ácido clavulánico), tal como se aprecia en el Ejemplo 3.
La estabilidad de un péptido puede ser determinada empleando diversos ensayos conocidos por los técnicos en la materia. Algunos de dichos ensayos se basan en determinar la conservación (o pérdida) de la actividad del péptido bajo determinadas condiciones. A modo ilustrativo, no limitativo, la estabilidad de un péptido puede determinarse mediante los ensayos mencionados en el Ejemplo 3.
El péptido de la invención puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Aunque dicho péptido de la invención puede aislarse a partir de un organismo productor del mismo, e.g., Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426), en una realización particular y preferida, dicho péptido de la invención puede obtenerse por métodos basados en la tecnología del ADN recombinante.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de un péptido de la invención, que comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido y, si se desea, recuperar dicho péptido del medio de cultivo. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula dependerán de la célula utilizada. El experto en la materia conoce tales condiciones. El procedimiento para producir el péptido de la invención incluye, opcionalmente, el aislamiento y purificación de dicho péptido de la invención.
3. Aplicaciones
Debido a la actividad inhibidora de QS del péptido de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención, o el péptido de la invención presentan multitud de potenciales aplicaciones en diferentes sectores de la técnica, entre los que se encuentran el sector alimentario, el farmacéutico y el agrícola.
En general, para su administración y/o empleo, el péptido de la invención, o el polinucleótido de la invención, o el vector de la invención, o la célula de la invención, o el organismo transgénico de la invención, se combinará con un vehículo adecuado.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición, en adelante composición de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención, o un péptido de la invención.
Por razones de simplicidad, en esta descripción, se hará referencia, en ocasiones, al polinucleótido de la invención, vector de la invención, célula de la invención, organismo transgénico de la invención, o péptido de la invención, con la denominación genérica "componente activo de la invención". Las características del componente activo (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico, o péptido de la invención) en la composición de la invención ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. En una realización particular, el componente activo de la invención, presente en la composición de la invención, se selecciona del grupo formado por un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención y un péptido de la invención, preferentemente, un polinucleótido de la invención o un péptido de la invención.
Como se ha mencionado previamente, el componente activo de la invención puede estar presente en un vehículo adecuado para su administración y/o empleo. En general, dicho vehículo se elegirá dependiendo de la aplicación a la que vaya destinado el componente activo de la invención y de su forma de administración. No obstante, en una realización particular, el vehículo en el que puede estar presente el componente activo de la composición de la invención es un vehículo seleccionado entre:
un vehículo apto para alimentación;
un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
un vehículo agrícolamente aceptable.
3.1 Aplicaciones en el sector alimentario
En una realización particular, la composición de la invención comprende un componente activo de la invención junto con un un vehículo apto para alimentación.
Así, de acuerdo con esta realización particular, la composición de la invención es un producto alimenticio. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "producto alimenticio" incluye cualquier sustancia o producto de cualquier naturaleza, sólido o líquido, natural o transformado, que por sus características, aplicaciones, componentes, preparación y estado de conservación, sea susceptible de ser habitual o idóneamente utilizado en alguno de los fines siguientes: a) para la normal nutrición humana o animal o como fruitivos; o b) como aditivos o productos dietéticos, en casos especiales de alimentación humana o animal. Asimismo, dicho término también incluye los piensos o materias naturales y productos elaborados, de cualquier origen, que, por separado o convenientemente mezclados entre sí, resulten aptos para la alimentación animal. El término "producto alimenticio", tal como aquí se utiliza también incluye composiciones nutracéuticas, es decir, composiciones adecuadas para su empleo en humanos o animales que comprenden uno o más productos naturales con acción terapéutica o que proporcionan un beneficio para la salud o que han sido asociados con la prevención o disminución de enfermedades, por ejemplo, bacterias probióticas, etc., e incluye suplementos dietéticos presentados en una matriz no alimenticia (e.g., cápsulas, polvo, etc.) de un producto natural bioactivo concentrado presente usualmente (o no) en los alimentos y que, tomado en dosis superior a la existente en esos alimentos ejerce un efecto favorable sobre la salud, mayor que el que podría tener el alimento normal. Un alimento listo para consumir es aquel que no necesita ser diluido mediante, por ejemplo, una solución acuosa adecuada para el consumo. En principio, los ingredientes presentes en un alimento listo para consumir están equilibrados y no se necesita añadir ingredientes adicionales al alimento para volverlo listo para el consumo, tal como es considerado por un experto en la materia. Un alimento concentrado es aquel en el que uno o más ingredientes están presentes en mayor concentración que en un alimento listo para consumir, por lo que para su empleo, es necesario diluirlo mediante, por ejemplo, una solución acuosa adecuada para el consumo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de alimentos proporcionados por esta invención incluyen tanto productos alimenticios destinados a consumo humano, como piensos y concentrados para alimentación animal, tales como piensos y concentrados alimenticios destinados a su uso en acuicultura o en cualquier animal, ya sea animal de producción, doméstico o silvestre, tales como perros, gatos, bóvidos, óvidos, suidos, équidos, etc.
El empleo de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención, o un péptido de la invención, en la elaboración de un producto alimenticio, constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho producto alimenticio es una sustancia o producto susceptible de ser utilizado en alimentos, piensos, aditivos alimentarios, suplementos dietéticos, composiciones nutracéuticas, etc., tanto para alimentación humana como animal.
3.2 Aplicaciones en el sector farmacéutico
En otra realización particular, la composición de la invención es una composición farmacéutica que comprende, además del componente activo presente en la composición de la invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Este tipo de composiciones resulta adecuado para la administración a un sujeto del componente activo presente en la composición de la invención. En general, dicho vehículo farmacéuticamente aceptable se elegirá en función de la naturaleza del componente activo (e.g., polinucleótido de la invención, vector de la invención, célula de la invención o péptido de la invención), de la forma de presentación elegida, por ejemplo, sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) y de la vía de administración elegida, por ejemplo, oral, parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), rectal, etc. En cada caso se elegirán los excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida. Información sobre excipientes adecuados para la formulación de composiciones farmacéuticas destinadas a su administración por vía oral, parenteral o rectal, así como sobre la producción de dichas composiciones farmacéuticas puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención, o un péptido de la invención, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana. Expresado de otra manera, según este aspecto, la invención se relaciona con un componente activo de la invención (es decir, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención, o un péptido de la invención) para su empleo en la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana. En una realización particular, la bacteria causante de dicha infección bacteriana es una bacteria productora de señales QS. En una realización concreta, dichas señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección comprenden, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc. En otra realización particular, la bacteria causante de dicha infección bacteriana es una bacteria productora de señales QS, en donde dicha señal QS no comprende una AHL sino que dicha señal QS comprende una AIP, un AI-2 y/o un AI-3, por ejemplo, una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa. En una realización particular dicha bacteria es Escherichia coli, un importante patógeno humano [véase el Ejemplo 4 en el que se pone de manifiesto el potencial uso de AN20J en el control de la expresión de E. coli]. En otra realización particular, las infecciones causadas por bacterias productoras de las señales de QS son debidas a la formación de bioflms. Las bacterias que forman biofilm pueden ser, pero sin limitarse, bacterias de la cavidad oral tales como las causantes de caries y enfermedad periodontal, o bacterias que colonizan las superficies de los implantes médicos o de los dispositivos insertados en el organismo, tales como catéteres, prótesis, etc. Por tanto, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es una composición dentífrica. En otra realización particular, la composición farmacéutica está destinada a prevenir la formación de biolfims o a eliminar los biofilms ya formados sobre dispositivos o implantes médicos tales como catéteres, prótesis, etc.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención también puede contener, si se desea, uno o más agentes antibacterianos, siempre y cuando no sean incompatibles con el componente activo de la invención presente en la composición de la invención. La combinación del componente activo de la invención con antibióticos puede ser una estrategia muy interesante en el tratamiento de enfermedades bacterianas causadas por bacterias multirresistentes.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser aplicada o administrada a un sujeto en necesidad de prevención y/o tratamiento. El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie animal, preferentemente, un mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica proporcionada por esta invención, o de un componente activo de la invención. En una realización particular, dicha infección bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS. En una realización concreta, dichas señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección comprenden, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12- HSL, etc. En otra realización particular, la bacteria causante de dicha infección bacteriana es una bacteria productora de señales QS, en donde dicha señal QS no comprende una AHL sino que dicha señal QS comprende una AIP, un AI-2 y/o un AI-3, por ejemplo, una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa. En una realización particular dicha bacteria es Escherichia coli, un importante patógeno humano [véase el Ejemplo 4 en el que se pone de manifiesto el potencial uso de AN20J en el control de la expresión de E. coli]. En otra realización particular, las infecciones causadas por bacterias productoras de las señales de QS son debidas a la formación de bioflms (e.g., bacterias de la cavidad oral tales como las causantes de caries y enfermedad periodontal, bacterias que colonizan las superficies de los implantes médicos o de los dispositivos insertados en el organismo, tales como catéteres, prótesis, etc.).
Las características de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención así como de los componentes activos de la invención ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. Asimismo, las características de la forma de presentación y administración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, así como de los componentes activos de la invención ya han sido mencionadas previamente y se incorporan por referencia.
3.3 Aplicaciones en el sector agrícola
En otra realización particular, la composición de la invención es una composición agrícola que comprende, además del componente activo presente en la composición de la invención, un vehículo agncolamente aceptable. Este tipo de composiciones resulta adecuado para la administración a las plantas del componente activo presente en la composición de la invención. En general, dicho vehículo agncolamente aceptable se elegirá en función de la naturaleza del componente activo, de la forma de presentación elegida, por ejemplo, sólida o líquida, etc. En cada caso se elegirán los ingredientes agncolamente aceptables apropiados para la forma de administración elegida. Prácticamente cualquier vehículo agncolamente aceptable puede ser utilizado en la elaboración de la composición agrícola proporcionada por esta invención; no obstante, en una realización particular, dicho vehículo agncolamente aceptable comprende un fertilizante, tal como, por ejemplo, un fertilizante, sólido o líquido. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos fertilizantes sólidos incluyen fertilizantes sólidos de tipo NPK, etc. Alternativamente, puede utilizarse cualquier fertilizante líquido con un pH comprendido entre 3 y 9, donde el péptido de la invención mantiene su actividad inhibidora de QS; ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos fetilizantes líquidos incluyen fertilizantes a base de ácidos fúlvicos, fertilizantes líquidos con distinta composición NPK, tales como las mezclas 16:2:4, 20:5:0, etc., o diversos tipos de fertilizantes en gotas con composición NPK de 8:9:9, 16:4:4, etc.
La composición agrícola proporcionada por esta invención puede obtenerse por métodos convencionales mediante la mezcla del componente activo con el vehículo agrícolamente aceptable.
La composición agrícola proporcionada por esta invención puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana en plantas. En una realización particular, la bacteria causante de dicha infección bacteriana es una bacteria productora de señales QS. En una realización concreta, dichas señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección comprenden, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
La composición agrícola proporcionada por esta invención también puede contener, si se desea, uno o más agentes antibacterianos, siempre y cuando no sean incompatibles con el componente activo de la invención presente en la composición de la invención.
La composición agrícola proporcionada por esta invención puede presentarse en cualquier forma de presentación adecuada para su administración o aplicación a las planta o al suelo que rodea a las plantas, por ejemplo, en forma sólida o líquida. Las formas de presentación líquidas son adecuadas para su pulverización sobre el suelo, la planta o el material vegetal, en general, o bien para crear un baño en el que se sumergen las plantas o el material vegetal. La composición agrícola proporcionada por esta invención puede aplicarse por cualquier método convencional. En una realización particular, la composición de la invención se aplica mediante pulverización al suelo, a la planta o al material vegetal, o bien mediante inmersión de la planta o el material vegetal en un baño que contiene la composición de la invención. Alternativamente, las semillas de las plantas pueden someterse a un tratamiento de pildoración con la composición agrícola proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta con un péptido de la invención, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS, bajo condiciones que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana. En una realización particular, el péptido de la invención se formula en una composición agrícola proporcionada por esta invención y esta se aplica sobre la planta a tratar. En otra realización particular, el péptido de la invención se pone en contacto con la bacteria productora de señales de QS bajo condiciones que permiten el contacto y la interacción entre el péptido de la invención y las señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección. El experto en la materia entenderá que el péptido de la invención debe añadirse en una cantidad suficiente como para obtener resultados beneficiosos o deseados, es decir, en la cantidad apropiada para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, retardar o retrasar la progresión de estadios de enfermedades causadas por bacterias en plantas. Dicha cantidad puede administrarse en una sola aplicación o en varias aplicaciones. Asimismo, el experto en la materia conoce, o puede identificar, las condiciones de administración del péptido de la invención que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende transformar dicha planta con un polinucleótido de la invención, o con un vector de la invención, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS. La obtención de plantas transformadas con el polinucleótido o vector de la invención se lleva a cabo por métodos convencionales de transformación de plantas, basados, por ejemplo, en el empleo de vectores apropiados, así como en los métodos descritos en, por ejemplo, Izquierdo 1993 o Dong et al. 2011. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende el empleo de una bacteria transformada con un polinucleótido de la invención, o con un vector de la invención, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS.
En cualquiera de los 3 métodos previamente mencionados para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, la enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de QS. En una realización concreta, dichas señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección comprenden, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12- HSL, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos de bacterias fitopatógenas incluyen bacterias Gram-positivas como, por ejemplo, bacterias pertenecientes a los géneros Clavibacter, Curtobacterium, Streptomyces, etc., así como bacterias Gram-negativas como, por ejemplo, bacterias pertenecientes a los géneros Agrobacterium, Brenneria, Burkholderia, Erwinia, Gluconacetobacter, Pantoea, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Xylella, etc. En una realización particular, dicha bacteria fitopatogena es una bacteria Gram-negativa patógena de plantas con QS y productora de alguna AHL tal como, por ejemplo, Brenneria sp., Burkholderia glumae, Erwinia amyiovora, Erwinia carotovora, Gluconacetobacter diazotrophicus (en caña de azúcar), Pantoea ananatis, Pectobacterium atrosepticum, Pseudomonas syringae, etc.
La composición agrícola proporcionada por esta invención puede ser aplicada o administrada a una planta en necesidad de controlar una enfermedad bacteriana. La expresión "controlar una enfermedad bacteriana" en una planta hace referencia a prevenir y/o tratar la enfermedad bacteriana así como a mantener el control sobre una población bacteriana en niveles que no ocasionan daño para la planta ni efectos nocivos para los sujetos que se alimentan de dichas plantas. El término "planta", tal como aquí se utiliza, incluye a cualquier ser vivo fotosintético.
3.4 Quorum quenching En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, para provocar un proceso de quorum quenching (QQ) en respuesta a un proceso de QS. En una realización particular, dicho empleo no consiste en un método de tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal.
Expresado alternativamente, este aspecto inventivo se relaciona con un método para provocar un proceso de QQ en respuesta a un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, bajo condiciones que permiten provocar dicho proceso de QQ en respuesta a dicho proceso de QS. En una realización particular, dicho método no consiste en un método de tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión provocar un "proceso de quorum quenching (QQ)" en respuesta a un proceso de QS hace referencia al desarrollo de una estrategia de inactivación del proceso de QS. Las características de los componentes activos de la invención (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico o péptido de la invención) ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. El experto en la materia conoce las condiciones que permiten poner en contacto la bacteria productora de señales de QS con el componente activo de la invención para provocar dicho proceso de QQ en respuesta a dicho proceso de QS; en general, dichas condiciones incluyen aquellas en las que el componente activo de la invención permanece estable y mantiene su actividad.
En una realización particular, la bacteria productora de señales de QS, es una bacteria que produce, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc. Numerosas bacterias patógenas de plantas y animales, incluyendo humanos, emplean un proceso de QS basado en distintos tipos de señales de QS (e.g., AHLs, APIs, AI-2 y AI-3) para regular la síntesis de factores de virulencia o para formar biofilms (biopelículas). Por tanto, la interceptación de la comunicación bacteriana mediada por dichas señales de QS constituye un prometedor método para el control de bacterias, en particular, bacterias patógenas productoras de señales de QS.
En consecuencia, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención y el péptido de la invención, pueden ser utilizados para interceptar la comunicación entre bacterias productoras de señales de QS, provocando de este modo un proceso de QQ, y, de este modo, controlar infecciones causadas por dichas bacterias. Los procesos de QQ para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias, en particular, bacterias productoras de señales de QS, al no afectar directamente a la supervivencia de la bacteria patógena, sino a la expresión de los factores de virulencia, no parecen ejercer una presión selectiva sobre la bacteria, evitando de este modo la aparición de resistencias, lo que constituye una importante ventaja.
3.5 Inhibición de un proceso de QS
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, para inhibir un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS. En una realización particular, dicho empleo no consiste en un método de tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal.
Expresado alternativamente, este aspecto inventivo se relaciona con un método para inhibir un proceso de QS, en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, bajo condiciones que permiten inhibir dicho proceso de QS. En una realización particular, dicho método no consiste en un método de tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "inhibir un proceso de QS" incluye inactivar el proceso de QS así como interceptar la comunicación bacteriana mediada por señales de QS (e.g., AHLs, APIs, AI-2 y AI-3). Este método constituye, por tanto, un prometedor método para controlar bacterias, en particular, bacterias patógenas (e.g., de plantas y animales, incluyendo humanos) que emplean un proceso de QS basado en distintos tipos de señales de QS para regular la síntesis de factores de virulencia o para formar biofilms.
Las características de los componentes activos de la invención (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico o péptido de la invención) ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. El experto en la materia conoce las condiciones que permiten poner en contacto la bacteria productora de señales de QS con el componente activo de la invención para inhibir dicho proceso de QS; en general, dichas condiciones incluyen aquellas en las que el componente activo de la invención permanece estable y mantiene su actividad. En una realización particular, la bacteria productora de señales de QS, es una bacteria que produce, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12- HSL, etc.
Por tanto, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención y el péptido de la invención, pueden ser utilizados para inhibir un proceso de QS causado por bacterias productoras de señales de QS y, de este modo, controlar infecciones causadas por dichas bacterias.
3.6 Degradación de señales de QS
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para degradar una señal de QS, en donde dicha señal de QS es producida por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, con dicha señal de QS bajo condiciones que permiten degradar dicha señal de QS.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "degradar una señal de QS" incluye hidrolizar una señal de QS, tal como una AHL, un APIs, un AI-2 o un AI-3, de manera que dicha señal de QS degradada ya no pueda ejercer la función de comunicación entre bacterias para la que estaba destinada; de este modo, se puede controlar una población bacteriana interceptando la comunicación entre sus miembros mediante la degradación de las señales responsables de dicha comunicación. Por tanto, este método constituye un método alternatvo para controlar bacterias, en particular, bacterias patógenas (e.g., de plantas y animales, incluyendo humanos) que emplean un proceso de QS basado en distintos tipos de señales de QS para regular la síntesis de factores de virulencia o para formar biofilms.
Las características de los componentes activos de la invención (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico o péptido de la invención) ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. El experto en la materia conoce las condiciones que permiten poner en contacto la señal de QS con el componente activo de la invención para degradar dicha señal de QS; en general, dichas condiciones incluyen aquellas en las que el componente activo de la invención permanece estable y mantiene su actividad. En una realización particular, la bacteria productora de señales de QS, es una bacteria que produce, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
Por tanto, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención y el péptido de la invención, pueden ser utilizados para degradar una señal de QS, producida por una bacteria productora de señales de QS y, de este modo, controlar infecciones causadas por dichas bacterias.
3.7 Modulación de la actividad señalizadora de AHLs En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para modular la actividad señalizadora de una AHL, que comprende poner en contacto un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, con dicha AHL, bajo condiciones que permiten modular la actividad señalizadora de dicha AHL.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "modular la actividad señalizadora de una AHL" incluye degradar o hidrolizar, total o parcialmente, una AHL, de manera que dicha AHL total o parcialmente degradada o hidrolizada ya no pueda ejercer la función de comunicación entre bacterias para la que estaba destinada; de este modo, se puede controlar una población bacteriana productora de señales de QS, en donde dichas señales de QS comprenden una o más AHLs, interceptando la comunicación entre sus miembros mediante la degradación o hidrólisis de las señales (AHLs) responsables de dicha comunicación. Por tanto, este método constituye un método alternatvo para controlar bacterias, en particular, bacterias patógenas (e.g., de plantas y animales, incluyendo humanos) que emplean un proceso de QS basado en la producción de AHLs para regular la síntesis de factores de virulencia o para formar biofilms.
Las características de los componentes activos de la invención (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico o péptido de la invención) ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. El experto en la materia conoce las condiciones que permiten poner en contacto el componente activo de la invención con la AHL; en general, estas condiciones incluyen aquellas en las que el componente activo de la invención permanece estable y mantiene su actividad.
En una realización particular, dicha AHL es una AHL no sustituida, tal como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, o una mezcla de las mismas. En otra realización particular, dicha AHL es una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, tal como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc., o sus mezclas.
Por tanto, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención y el péptido de la invención, pueden ser utilizados para modular la actividad señalizadora de una AHL, producida por una bacteria productora de señales de QS, en donde dichas señales de QS comprenden una o más AHLs, y, de este modo, controlar infecciones causadas por dichas bacterias.
3.8 Inhibición de la formación de un biofilm bacteriano
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una célula de la invención, un organismo transgénico de la invención o un péptido de la invención, para inhibir la formación de un biofilm bacteriano ex vivo o in vitro, en donde dicho biofilm bacteriano es producido por una bacteria productora de una señal de QS. Expresado alternativamente, este aspecto inventivo se relaciona con un método in vitro o ex vivo para inhibir la formación de un biofilm bacteriano, en donde dicho biofilm bacteriano es producido por una bacteria productora de una señal de QS, que comprede poner en contacto dicho polinucleótido de la invención, vector de la invención, célula de la invención, organismo transgénico de la invención o péptido de la invención, con dicha bacteria, bajo condiciones que permiten inhibir la formación de dicho biofilm bacteriano.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "inhibir la formación de un biofilm bacteriano" se refiere a evitar o impedir que bacterias productoras de señales de QS puedan formar un biofilm. Como es conocido, la formación de biofilms es un proceso controlado por fenómenos de QS, mediados por señales de QS tales como AHLs, APIs, AI-2 y/o AI-3, y tiene un importante impacto económico y clínico. Muchos de dichos biofilms están íntimamente relacionados con procesos bacterianos infecciosos, tanto en plantas como en animales, incluyendo humanos. En general, las bacterias formadoras de biofilms son muy resistentes a antibióticos y pueden adherirse a los alimentos o a sustancias en contacto con ellos, provocando problemas tanto de higiene como posibles toxinfecciones alimentarias y en último término, grandes pérdidas económicas. Además, a menudo se encuentran en la superficie de los implantes médicos o en los dispositivos insertados en el organismo. También se pueden formar en áreas del cuerpo que están expuestas al aire; en particular en heridas y en la pleura. Uno de los biofilms biológicos que presenta mayor complejidad y de mayor relevancia clínica es la placa dental. Se ha demostrado el papel de la molécula de QS AI-2 en la formación de biopelículas de los patógenos oportunistas Staphylococcus aureus, S. epidermidis y de distintas especies de Streptococcus, incluyendo la cepa involucrada en la formación de la placa dental S. mutans. Además, estos biofilms contribuyen a la contaminación biológica de superficies, al bloqueo mecánico en conductos, sistemas de distribución de agua potable, sistemas de aire acondicionado, sistemas antiincendios, etc. Finalmente, merece la pena destacar que favorecen la formación del "biofouling" al constituir la base del crecimiento de otros organismos superiores en superficies sumergidas, constituyendo un grave problema económico en el sector de la acuicultura y transporte marítimo. Este método, por tanto, constituye un prometedor método para controlar tanto la formación de biofilms como para controlar bacterias productoras de biofilms mediante un proceso controlado por señales de QS, en particular, bacterias patógenas (e.g., de plantas y animales, incluyendo humanos) que emplean un proceso de QS basado en distintos tipos de señales de QS para formar biofilms.
Las características de los componentes activos de la invención (polinucleótido, vector, célula, organismo transgénico o péptido de la invención) ya han sido definidas previamente y se incorporan aquí por referencia. El experto en la materia conoce las condiciones que permiten poner en contacto la bacteria formadora de biofilms mediante un proceso controlado por señales de QS con el componente activo de la invención para inhibir la formación de dichos biofilms bacterianos; en general, dichas condiciones incluyen aquellas en las que el componente activo de la invención permanece estable y mantiene su actividad. En una realización particular, la bacteria formadora de biofilms es una bacteria productora de señales de QS, tal como una bacteria productora de, al menos, una AHL. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas AHLs incluyen AHLs no sustituidas, tales como por ejemplo, C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL o C14-HSL, así como AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas, tales como por ejemplo, OC6-HSL, OC12-HSL, etc.
Por tanto, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención, el organismo transgénico de la invención y el péptido de la invención, pueden ser utilizados para inhibir la formación de biofilms bacterianos controlada mediante señales de QS causado por bacterias productoras de señales de QS y, de este modo, controlar infecciones causadas por dichas bacterias.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma. EJEMPLO 1
Identificación de AM20J, gen responsable de la actividad QQ en Tenacibacullum sp. cepa 20J
1.1 Construcción de una librería genómica en fósmido y screening funcional
Con el objetivo de identificar y clonar el gen o genes responsables de la actividad degradadora de AHLs de Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426), se construyó una biblioteca genómica usando el kit CopyControl™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre, Madison, Wl) con el vector pCC2FOS conforme el protocolo del fabricante.
Se extrajo el ADN de Tenacibaculum sp. cepa 20J mediante el kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega, Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante. El ADN (2,5 μg) se fragmentó aleatoriamente mediante pipeteo (50-100 veces) con punta de pipeta de 200 μΙ_. El ADN fragmentado fue tratado enzimáticamente para reparar y generar extremos romos ("blunt ends') y fosforilados. A continuación, se seleccionaron fragmentos de 40 kb mediante electroforesis de gel de campos pulsantes (PFGE) y se ligaron al fósmido pCC2FOS linearizado y defosforilado. A continuación se transformaron células de Escherichia coli DH 0β mediante fago lambda. Las células bacterianas se sembraron en placas con medio Luria-Bertani (LB) en presencia del antibiótico cloranfenicol a una concentración de 12,5 μg/mL y se incubaron a 37°C durante 24 h. Las colonias de E. coli DH 10β transfectadas con el fósmido se recogieron robóticamente (Genetix Q-bof) y fueron distribuidas en placas de microtitulación (microtiter) de 96 pocilios conteniendo 150 de LB más cloranfenicol y glicerol que se añadió para su correcta congelación. La biblioteca genómica constaba de 6.912 clones distribuidos en 72 placas microtiter de 96 pocilios cada una y fue conservada hasta su utilización en un congelador a -80°C.
Se realizó un cribado funcional de la librería genómica de Tenacibaculum sp. cepa 20J para la detección del gen o de los genes responsables de la actividad degradadora de AHLs de esa cepa. El cribado funcional se realizó de forma simultánea para una señal corta (N-hexanoil-L-homoserín lactona, C6-HSL) y una larga (N-decanoil-L-homoserín lactona, C10-HSL) con el objetivo de incrementar las posibilidades de identificar el enzima o enzimas responsables de la actividad QQ, utilizando una modificación de la técnica de cribado en placa de agar descrita en Romero et al., 2011. Cada placa microtiter de 96 pocilios de la biblioteca genómica se copió a una nueva placa con 50 μΙ_ de LB líquido suplementado con cloranfenicol (12,5 μg/mL), 2 μΙ_/ηιΙ_ de la solución de autoinducción ("Autoinduction Solution'), contenida en el kit CopyControl™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre, Madison, Wl), y C6-HSL en concentración 12 μg/mL. La solución de autoinducción induce la alta copia del fósmido en cada célula lo que permite aumentar la expresión de los genes del inserto. Las placas se incubaron a 37°C para permitir la degradación de la señal por parte de los posibles clones positivos. Tras 24 h se tomaron alícuotas de 10 μί de cada pocilio a nuevas placas microtiter, las cuales fueron irradiadas con luz UV durante 1 hora para matar las células de E. coli DH 10β. A continuación, se añadieron 50 μί de una dilución 1/5 (v/v) de un cultivo de 24 h de C. violaceum CV026 para detectar la degradación de C6-HSL y de C. violaceum VIR07 para detectar la degradación de C10-HSL, en LB blando al 0,2% de agar suplementado con el antibiótico kanamicina a una concentración de 25 μg/mL y se incubaron a 30°C durante 24 h para observar la producción de violaceína. Las placas aparecen con los pocilios de color violeta por la producción del pigmento violaceína, excepto en los pocilios donde se encuentre el gen o los genes capaces de degradar las AHLs, que serán los clones positivos.
Fue posible identificar un solo clon positivo que inhibiese la actividad AHL evitando la formación de violaceína en el pocilio (Figura 1). Este clon positivo, se encontraba en la placa 13, coordenada E2, por lo que fue denominado clon 13-E2, presentando actividad inhibitoria en el bioensayo tanto contra C6-HSL como contra C10-HSL.
La actividad del único clon positivo identificado en el cribado funcional (clon 13-E2, Figura 1) de la biblioteca genómica se comprobó, una vez transferido a cultivo en placa Petri con cloranfenicol para comprobar la pureza del clon, mediante la realización de un bioensayo en placa mediante pocilios igual al utilizado para la identificación de bacterias con actividad QQ contra AHLs en anteriores trabajos (Romero et al., 201 1). El clon positivo se inoculó en tubos Eppendorf con 500 μί de LB líquido suplementado con cloranfenicol (12,5 μg/mL) y Autoinduction Solution (2 μΙ_Ληί). Se incubó en agitación a 200 rpm y 37°C. Tras 24 horas se añadieron 20 μί de una solución stock de cada AHL (C6 y C10-HSL) para que quedase una concentración final de 2 μg/mL y se incubaron de nuevo durante 24 h a 37°C y a 200 rpm. Para detectar la actividad QQ se tomaron 100 μί del sobrenadante tras centrifugar el cultivo durante 5 min a 10.000 rpm y se añadieron a pocilios practicados en placas de LB cubiertas con 5 ml_ de una dilución 1/100 de un cultivo de 24 horas de las cepas biosensoras C. violaceum CV026 y C. violaceum VIR07 correspondientes en LB semi-sólido (0,8% de agar). Como controles negativos se usaron tubos Eppendorf de LB sin inocular o inoculados con clones negativos sin actividad QQ en el cribado de la biblioteca genómica. Las placas se incubaron 24 h a 30°C para la posterior observación de la producción de violaceína.
A continuación, se usó HPLC-MS (cromatografía de líquidos de alta resolución- espectroscopia de masas) para comprobar si el clon positivo de la librería genómica en fósmido activo contra las AHL, clon 13-E2, presentaba actividad de degradación de señales. Para ello se obtuvo el extracto celular crudo (ECC) del clon con actividad QQ de E. coli DH 0β a partir de un cultivo de 24 h en 15 mL de LB suplementado con cloranfenicol y Autoinduction Solution. El cultivo se centrifugó durante 5 min a 10.000 rpm para separar la biomasa del medio de cultivo. El pellet se lavó con 15 mL de tampón fosfato salino (PBS) pH 6,5, se resuspendió en otros 5 mL del mismo tampón, se sónico mediante pulsos de 30 s, durante 5 min en hielo y se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 min a 4°C. El sobrenadante se filtró (0,22 μηι) y el ECC obtenido se almacenó a 4°C para su uso posterior.
Se utilizaron alícuotas de 500 de ECC para la interceptación de las señales C6- HSL o C10-HSL que se añadieron a una concentración de 2 μg/mL y se incubaron durante 24 h a 22°C y 200 rpm. Una alícuota de la reacción se acidificó para comprobar la recuperación del anillo lactona. Posteriormente se realizó una extracción orgánica de las mezclas de reacción, para lo cual se extrajo tres veces con el mismo volumen de acetato de etilo (500 μί). El solvente se recuperó y evaporó mediante flujo de nitrógeno en baño a 50°C y el extracto seco obtenido se resuspendió en 400 μί de acetonitrilo para su posterior análisis y cuantificación de la concentración de la señal restante por HPLC-MS según la metodología descrita con anterioridad (Romero et al., 201 1). Como controles se utilizaron PBS y un ECC de E. coli DH 0β sin fósmido suplementados con la misma cantidad de señales C6-HSL o C10-HSL y procesados y extraídos orgánicamente del mismo modo.
El clon positivo de 13-E2, seleccionado de la biblioteca genómica de Tenacibaculum sp. cepa 20J fue capaz de reducir significativamente la concentración de ambas AHLs cuantificada por HPLC-MS en comparación con los controles (Figuras 2 y 3) lo que confirma la presencia de un gen codificante de una enzima capaz de degradar las AHL en este clon, que presenta al igual que Tenacibaculum sp. cepa 20J, una mayor actividad frente a C10-HSL. En ambos casos fue posible recuperar una parte de la actividad AHL después de la acidificación del medio, sugiriendo que el gen responsable de la actividad degradadora de AHL del clon 13-E2 podría tener actividad lactonasa.
1.2 Identificación de la secuencia de AÜ20J en el clon positivo 13-E2
Debido a que el fósmido del clon positivo 13-E2 de E. coli, cuya actividad de QQ para los dos tamaños de AHLs ensayados fue confirmada tanto en bioensayo como por HPLC-MS, contenía un inserto del genoma de Tenacibaculum sp. cepa 20J de aproximadamente 40kb de longitud, fue necesario un análisis genético detallado de este inserto para identificar la secuencia responsable de la actividad QQ del clon. Para ello se siguieron dos estrategias complementarias:
1. Pirosecuenciación del inserto del fósmido del clon positivo 13-E2 para obtener la secuencia completa del mismo y la búsqueda de secuencias homologas a las enzimas degradadoras de AHL conocidas hasta el momento; y
2. Construcción de una segunda biblioteca genómica en la que se fragmentó y subclonó en plásmido el inserto del fósmido del clon positivo 13-E2, para permitir la identificación funcional inequívoca de la secuencia responsable de la actividad QQ.
1.2.1 Pirosecuenciación del inserto del fósmido del clon activo 13-E2
Como primera aproximación a la identificación del gen responsable de la actividad QQ, el inserto del clon positivo 13-E2 obtenido en el cribado de la biblioteca genómica se secuenció usando el secuenciador GS-FUX de Roche. Para ello se extrajo el fósmido (150 ng^L) del clon positivo siguiendo el protocolo del Fosmid Max™ DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, Wl). Las secuencias obtenidas se analizaron mediante las herramientas informáticas: BLASTX y CD-Seach (Búsqueda de dominios conservados) del NCBI. Las secuencias se alinearon y se ensamblaron con el programa Phrap, obteniéndose una secuencia de 39.828 pares de bases (pb). Para la identificación de los ORFs del fragmento se procedió a la búsqueda en la base de datos 'nr' disponible en el NCBI, no pudiéndose identificar ningún gen con homología significativa con genes conocidos con actividad QQ. Fue posible, sin embargo, identificar 4 ORFs con elevada homología (superior al 70%) con genes de especies del cluster Cytophaga- Flavobacterium-Bacteroides (CFB), lo que confirma que el inserto del clon 13-E2 proviene de Tenacibaculum sp. cepa 20J (CECT 7426), miembro del grupo Bacteroidetes. En la búsqueda de todos los dominios conservados en la base de datos 'cdd' se detectó un dominio β-lactonasa al final de la secuencia analizada del clon positivo 13-E2. Se tradujo toda esa zona de la secuencia y se identificaron los codones de inicio (ATG) y de terminación (TAA) de la enzima obteniéndose una secuencia de 861 nucleótidos (SEQ ID NO: 1) que codifica un péptido de 286 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), que presenta una identidad del 31 % a nivel de aminoácidos con la lactonasa ANA de Bacillus sp. (Tabla 1 , Dong et al. 2000). Esta nueva secuencia de lactonasa se ha denominado a/720J (Auto Inductor Inhibitor de 20J).
1.2.2 Construcción y análisis de una biblioteca genómica del inserto del clon activo 13-E2
Simultáneamente y con el objetivo de identificar inequívocamente en base a su actividad el gen responsable de la actividad QQ, se procedió a la subclonación del inserto de 40 kb del clon positivo 13-E2 para el análisis funcional de los fragmentos. Para ello se construyó una nueva biblioteca genómica, a partir del inserto del fósmido del clon positivo 13-E2 purificado mediante el kit Fosmid Max™ DNA Purification (Epicentre, Madison, Wl). El ADN extraído se fragmentó aleatoriamente mediante hidrólisis ("hydroshearing'), se seleccionaron los fragmentos entre 3 y 5 kb mediante electroforesis y se trataron enzimáticamente para generar extremos romos y fosforilados. Estos fragmentos se ligaron en el plásmido de alta copia pBluescript II KS (+) y luego se transformó E. coli DH 0β mediante electroporación. Los transformantes se sembraron en placa de LB con 200 μg/mL de ampicilina, 80 μg/mL de X-Gal y 1 mM de isopropil^-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 37°C. Tras 24 h las colonias recombinantes blancas se recogieron robóticamente (Genetix Q-bot) y se sembraron en 10 placas microtiter de 96 pocilios con 150 μΙ_ de LB sólido (1 ,2% de agar) más ampicilina.
De forma similar al análisis de la primera biblioteca genómica, se realizó un cribado funcional de las placas microtiter de la genoteca para detectar los clones capaces de degradar AHLs. Se utilizó la cepa bioindicadora C. violaceum VIR07 para el análisis de degradación de C10-HSL, con una concentración de 12 μg/mL de la señal. El procedimiento fue el mismo que en la primera biblioteca genómica, pero en esta librería subclonada se usó el antibiótico ampicilina a una concentración de 200 μg/mL e IPTG a 1 mM para inducir la expresión de los genes del inserto.
En el cribado funcional de esta biblioteca genómica para la señal C10-HSL, aparecieron aproximadamente 6 o más positivos por cada placa microtiter. De todos los positivos conseguidos en el cribado de la nueva biblioteca genómica subclonada, se eligieron 10 al azar para realizar un nuevo bioensayo de inhibición en medio sólido para C6-HSL y C10-HSL tal y como se describió con anterioridad, para confirmar que se trataba de actividad QQ. Como resultado, todos los clones probados fueron positivos (Figura 4), evitando la producción de un halo de violaceína en la placa.
Se secuenciaron los insertos de estos 10 clones positivos obtenidos en el análisis de la biblioteca genómica subclonada seleccionados al azar. Los insertos de entre 3 y 5 kb de los plásmidos de 10 clones confirmados como positivos tras el cribado de la biblioteca genómica subclonada fueron secuenciados por técnicas estándar utilizando los cebadores del vector pBluescript II KS (+). Para el análisis de las secuencias se utilizaron las herramientas BLASTX y CD-Search (Búsqueda de dominios conservados) del NCBI y las secuencias se alinearon y se ensamblaron con el programa Phrap. Debido al tamaño de los insertos (3-5 Kb) no fue posible obtener la secuencia completa de ninguno de ellos en 1 sola ronda de secuenciación, pero en todos los casos las secuencias obtenidas presentaban un 100% de identidad con la secuencia del inserto del clon 13-E2 obtenida por pirosecuenciación y todos ellos contenían el gen aii20J, confirmando esta secuencia como la responsable de la actividad QQ en el clon 13-E2. Esta secuencia presenta una bajísima homología a nivel nucleotídico con la secuencia de a/7A de Bacillus, de forma que no puede ser detectada mediante el software de alineación estándar (Figura 5). En cuanto a la secuencia aminoacídica, en la secuencia de AN20J se encuentra el dominio conservado de unión a zinc característico de la superfamilia de las metalo-β- lactamasas, (HXHXDH), además de otros residuos de histidina y aspartato, para su correcta actividad (Dong et al., 2000). Al alinear la secuencia consenso de AN20J con otras lactonasas del género Bacillus ya descritas en la bibliografía (Figura 6), se observó que, a pesar de la baja homología, coinciden en las regiones características conservadas de esta superfamilia. En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de identidad de esta secuencia con otras lactonasas descritas en la bibliografía. Para alinear las secuencias nucleótidas y aminoacídicas y obtener las homologías se usaron las herramientas informáticas de BLAST del NCBI.
Tabla 1. Porcentajes de identidad de la secuencia de aminoácidos de AN20J con otras lactonasas descritas en la bibliografía. Para ello se usaron las herramientas informáticas de BLAST del NCBI.
Figure imgf000050_0001
EJEMPLO 2
Secuenciación de los genes homólogos al gen de QQ de Tenacibaculum sp.
cepa 20J en otras cepas del género Tenacibaculum
Se comprobó la presencia de genes homólogos a AN20J en otras especies del genero Tenacibaculum que se muestran en la Tabla 2. En primer lugar se realizó un bioensayo en medio sólido para comprobar que las células vivas de estas cepas eran capaces de degradar C6-HSL y C10-HSL. Solamente las 2 cepas de T. maritimum no presentaron actividad degradadora, en contraste con análisis anteriores, que habían descrito que T. maritimum NCBI 2154T presentaba actividad frente a C10-HSL. Esta diferencia se debe probablemente a que en este caso el ensayo de actividad se realizó en condiciones de pH controlado (células vivas re-suspendidas en PBS, pH 6,5) mientras que con anterioridad este ensayo se realizó directamente en el medio de cultivo, y, por lo tanto, la degradación podría derivarse de valores de pH elevados derivados de la actividad metabólica de la bacteria. Dos de las especies probadas T. aestuarii y T. lutimaris presentaron actividad solamente frente a C10-HSL (Tabla 2 y Figura 7).
Tabla 2. Cepas de distintas especies del género Tenacibaculum y actividad de células vivas contra C6-HSL y C10-HSL medida mediante bioensayo con cepas bioindicadoras de C. violaceum CV026 y VIR07
Figure imgf000051_0001
Se procedió a la amplificación mediante PCR de los genes homólogos a aii20J en las especies con actividad QQ confirmada en el bioensayo. El ADN de las cepas se extrajo a partir de cultivos de 24 h con el kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los primers (oligonucleótidos cebadores) utilizados en las PCR para amplificar las secuencias de los genes de las lactonasas de cada una de las cepas de Tenacibaculum (Tabla 2), fueron diseñados a partir de las secuencias conocidas del plásmido y del inicio y final del gen aii20J de la lactonasa de Tenacibaculum sp. 20J, suponiendo que el resto de las cepas del género Tenacibaculum tendrían alguna similitud a nivel nucleotídico con Tenacibaculum sp. 20J. Con el objetivo de preparar las secuencias amplificadas para una posterior clonación y sobre-expresión, se incluyeron en las secuencias de los primers sitios de restricción para las enzimas Ncol, EcoRI y manteniendo en pauta la secuencia del plásmido para que la cola de poli-histidina que el vector permite añadir se expresase correctamente. Las secuencias de estos primers, denominados Lact20Jf y Lact20JR, se muestran en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente.
Todos los primers diseñados en el laboratorio fueron subministrados por Sigma. Las reacciones de PCR se realizaron con el termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf) en las siguientes condiciones: 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 45 s, hibridación a 55°C durante 45 s, extensión a 72°C durante 45 s, precedidos de 5 minutos de desnaturalización a 94°C y seguidos de 10 min de extensión a 72°C. En el caso de T. soleae sin embargo, no funcionaron en un inicio estas condiciones de reacción por lo que se realizó de nuevo una PCR con gradiente de temperatura con las siguientes condiciones: 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 15 s, hibridación a 45°C, 50°C y 55°C durante 30 s, extensión a 72°C, 1 min, precedidos de 5 minutos de desnaturalización a 94°C y seguidos de 10 min de extensión a 72°C. Los fragmentos así obtenidos se purificaron a partir del gel y se secuenciaron por técnicas estándar, obteniéndose en todos los casos una secuencia con elevada homología a la secuencia de a/7'20J tanto a nivel de nucleótidos como de secuencia de aminoácidos (Figura 8, Tabla 3). La secuencia que presentó un menor grado de homología fue la de T. soleae, con un porcentaje de identidad igual al 76% (Tabla 3). Los genes homólogos a aii20J de estas cepas, presumiblemente responsables de su actividad degradadora de AHLs, fueron nombrados como a/'/TD (de Tenacibaculum discolor), a/'/TG (de T. gallaicum), a/'/TL (de T. lutimarís), a/'/ΤΑ (de T. aestuarii) y a/'/TS (de T. soleae) productores de las proteínas, AiiTD, AiiTG, AiiTL, ANTA y AiiTS, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas de estos genes se muestran en SEQ ID NO: 4 (a/'/TD), SEQ ID NO: 5 (a/'/TG), SEQ ID NO: 6 (a/ITS), SEQ ID NO: 7 (a/'/TA) y SEQ ID NO: 8 (a/'/TL). Las secuencias mostradas incluyen los codones de inicio (ATG) y terminación (TAA).
Tabla 3. Porcentajes de identidad de la secuencia de nucleótidos del gen aii20J (SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos de la proteína AN20J (SEQ ID NO: 2) con las secuencias obtenidas para otras especies del género Tenacibaculum. Los porcentajes de identidad se calcularon usando las herramientas informáticas de BLAST del NCBI.
Identidad a nivel Identidad a nivel de nucleotídico aminoácidos
T. discolor 99% 99 %
T. gallaicum 90 % 93% T. soleae 76 % 76 %
T. aestuarii 99 % 99 %
T. lutimaris 99 % 99 %
Se construyó un árbol filogenético de las lactonasas del grupo de AN20J y los representantes más importantes de la familia de lactonasas de AHLs descritas en la bibliografía (Figura 9), utilizando el software MEGA 5.1 que se obtuvo mediante el método "neighbor-joining" (Saitou y Nei, 1987) y los valores de "bootstrap" se calcularon mediante el software MEGA 5.1 (Tamura et al., 2008). En el árbol se aprecia claramente que las lactonasas del género Tenacibaculum forman una rama claramente diferenciada del resto de las lactonasas descritas.
EJEMPLO 3
Sobre-expresión, purificación y caracterización de la actividad enzimática de
AM20J
3.1 Clonación y sobreexpresión
Tal y como se describe en el apartado anterior, se amplificó mediante PCR la secuencia de a/720J con primers específicos que permitieron insertar las dianas de restricción compatibles con el plásmido de expresión pET28c(+) (Novagen). Este vector fue elegido porque presenta la posibilidad de realizar un clonaje direccional y añade una proteína de fusión, en nuestro caso una cola de poli-histidina (6 restos de histidina consecutivos) en el N-terminal, que facilita la purificación de proteínas.
El resultado de la amplificación de la PCR se corrió en un gel de electroforesis de agarosa al 1 % y se extrajeron las bandas de ADN correspondientes mediante el Gel Extraction Kit (Omega) siguiendo el protocolo del fabricante. De forma paralela se extrajo el plásmido pET28c(+) de la cepa donde estaba cultivado de forma rutinaria (£. coli XLI blue) mediante una miniprep con el QIAprep® Spin Miniprep Kit de Quiagen siguiendo el protocolo del fabricante. A continuación se realizó una doble digestión tanto de los fragmentos obtenidos de ADN como del plásmido para obtener los extremos cohesivos ("sticky-ends') compatibles. Las digestiones se llevaron a cabo con las enzimas FastDigest Ncol, EcoRI, y Salí (Fermentas, Thermo Scientific) según las condiciones recomendadas por el fabricante. Tras las digestiones se insertaron los productos de las PCR ya cortados en el interior del plásmido linearizado, mediante una ligación enzimática utilizando la T4 ADN ligasa de Thermo Scientific durante 15 min a 22°C como se indica en las instrucciones del producto. Para observar si la ligación ocurría como se esperaba y el plásmido se había digerido correctamente, se realizó un control de la ligación con el plásmido sin el inserto de ADN.
Una vez obtenido el plásmido con el inserto de ADN, se transformaron células competentes de E. coli XLI blue para la clonación de las secuencias de interés mediante electroporación utilizando el ECM® 399 Electroporation System, BTX™ a 1.000 V, 4 ms. Las células electroporadas se plaquearon 100 en placas de LB suplementadas con el antibiótico kanamicina (30 μg/mL) y se incubaron durante 24 h a 37°C. La ligación control del plásmido sin el inserto se electroporó también como control de la electroporación, de este modo, si el plásmido estaba bien digerido no crecerían colonias en las placas. Las colonias recombinantes obtenidas se pasaron a placas nuevas y paralelamente se congelaron en viales de congelación Cryoinstant Mixed (VWR®) a -80°C para su almacenamiento.
Se realizó una electroforesis en gel de 1 % de agarosa de una miniprep extraída con el kit de Qiagen de un cultivo de 15 mL de LB fresco en matraz de E. coli XLI blue transformado con pET28c(+) con el inserto y de la doble digestión del plásmido con las enzimas correspondientes para comprobar que las colonias recombinantes crecidas en las placas tras la electroporación contenían el plásmido con el inserto (Figura 10).
También se realizó una PCR control de las colonias recombinantes con primers complementarios a los dominios homólogos internos de las lactonasas, las secuencias de dichos primers se muestran en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.
El fragmento obtenido por PCR confirmó la identidad de la secuencia insertada (Figura 1 1). Las condiciones de PCR aplicadas fueron: 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 45 s, hibridación a 58°C durante 45 s, extensión a 72°C, 45 s, precedidos de 5 minutos de desnaturalización a 94°C y seguidos de 10 min de extensión a 72°C. Esta comprobación se observó mediante la electroforesis del producto de las PCR en un gel de 1 % de agarosa. Las colonias recombinantes obtenidas elegidas se pasaron a placas nuevas de LB con kanamicina (30 μg/mL) para cultivarlas de forma rutinaria a 37°C en el laboratorio y paralelamente se congelaron en viales de congelación Cryoinstant Mixed (VWR®) a -80°C para su almacenamiento.
Con el inserto de ADN introducido en el plásmido y transformado en células de E. coli XLI blue, las extracciones de ADN plasmídico con el inserto de interés se secuenciaron por técnicas clásicas utilizando los primers de secuencación específicos del vector (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14).
Las extracciones se realizaron mediante minipreps de cultivos de 24 h en 15 mL de medio LB suplementado con kanamicina (30 μg/mL) a 37°C, 170 rpm. Las secuencias obtenidas fueron analizadas con los programas Editseq y SeqMan Pro de Lasergene y MEGA 5.1 Beta3 (Tamura et al., 2008) para ensamblar adecuadamente las secuencias. Para traducir las secuencias se utilizó la herramienta informática Protein transíate de ExPASy eligiendo el marco abierto de lectura (ORF) adecuado. La secuencia definitiva del gen a/720J modificado para su sobre-expresión y purificación se muestra en la SEQ ID NO: 3.
Una vez obtenida la secuencia del plásmido con el inserto y comprobado que la secuencia se encontraba en pauta (fase) para la correcta producción de la cola de poli- histidina que tiene el plásmido pET28c(+) se procedió a clonar el gen de interés en la cepa de sobreexpresion E. coli BL21 (DE3). Para transformar las células de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET28c(+) con el inserto de ADN, por un lado se realizó una miniprep con el kit de Quiagen, de un cultivo de 24 h de 15 mL de E. coli XLI blue con pET28c(+) y el inserto, en medio fresco LB suplementado con kanamicina (30 μg/mL) a 37°C, 170 rpm. Por otra parte, se hicieron las células competentes de un cultivo de BL21 (DE3) de 24 horas en medio LB. Para ello se centrifugaron 1 ,5 mL del cultivo a 14.000 rpm durante 2 min, se lavaron dos veces las células con 1 mL de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 1 mM-Glicerol 10% pH 7,3, se resuspendieron con el volumen de enrase en MOPS-Glicerol, se vertieron en una cubeta de electroporación estéril de 90 ί y 1 mm Gap de VWR® enfriada anteriormente en hielo y se añadieron 5 del plásmido con el inserto. Se electroporaron las células en el ECM® 399 Electroporation System, BTX™ a 1.000 V, 4 ms. Luego se añadió a la cubeta 1 mL de medio fresco LB y se dejó incubar durante 1 hora a 37°C, tras la que se plaquearon con 100 placas de LB suplementadas con el antibiótico kanamicina (30 μg/mL) y se incubaron 24 h a 37°C. Se realizó como control una electroporación del plásmido sin el inserto para comprobar que el plásmido estaba bien digerido, en este caso observando que no crecían colonias en las placas. Por último se realizó un bioensayo de actividad en placas con los biosensores de Chromobacterium violaceum para asegurarse de que la construcción del inserto en el plásmido transformado en la cepa de sobreexpresion presentaba actividad QQ. Para ello se sembraron al azar algunas de las colonias recombinantes obtenidas en nuevas placas de LB suplementado con kanamicina (30 μg/mL). Con estas colonias y con un control negativo del E. coli BL21 (DE3) con el plásmido se realizaron cultivos en 15 mL de LB líquido suplementado con el antibiótico de 24 h a 37°C y 200 rpm. Tras 24 horas se realizaron bioensayos con las cepas biosensoras C. violaceum CV026 para comprobar la degradación de C6-HSL tal y como se describió con anterioridad. Como control negativo también se usó PBS pH 6,7 con la misma concentración de la AHL añadida. Las colonias recombinantes obtenidas con actividad se pasaron a placas nuevas de LB con kanamicina (30 μg/mL) para cultivarlas de forma rutinaria a 37°C en el laboratorio y paralelamente se congelaron en viales de congelación Cryoinstant Mixed (VWR®) a -80°C para su almacenamiento.
Se realizó una electroforesis desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) para comprobar que la banda de la proteína estaba presente en la cepa de sobreexpresion (Figura 12). Para ello se preparó un cultivo de 50 mL de LB suplementado con kanamicina (30 μg/mL) a 170 rpm, 37°C de una colonia de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET28c(+) y el inserto de AN20J, de una colonia de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido sin el inserto como control y de una colonia del mismo E. coli BL21 (DE3) con el plásmido y el inserto al que se le añadió el inductor IPTG a una concentración 1 mM al alcanzar una densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD6oo) de entre 0,4-1 (0,6 la recomendada) para inducir la sobreexpresion de la proteína y dejándolo incubar durante 3 horas más en las mismas condiciones. Los cultivos se centrifugaron a 9.000 rpm, 10 min, los pellets obtenidos se resuspendieron con vórtex en 3 mL de PBS pH 6,7. Luego se rompieron las células mediante sonicación con el aparato Branson Sonifier 250 con pulsos constantes de 30-40% a potencia media durante media hora y en hielo para no sobrecalentar las muestras en el proceso. Por último, se filtraron con filtros Minisart® estériles de 1 ,20 μηι (Sartorius Stedim Biotech). Tras la electroforesis el gel se tiñó con azul de coomasie y la imagen fue obtenida con el Gel Doc™ XR+ system de Bio Rad. 3.2 Purificación de Ai i 20 J
Se preparó un cultivo de 50 ml_ de LB suplementado con kanamicina (30 μς/Γηί.) de una colonia de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET28c(+) y el inserto correspondiente al gen de la lactonasa de la cepa de Tenacibaculum sp. determinada a purificar, incubándolo a 170 rpm, 37°C hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD6oo) del cultivo de entre 0,4-1 (0,6 la más recomendada). Se le añadió IPTG a una concentración 1 mM para inducir la sobreexpresion de la proteína y se dejó incubar durante 3 horas más en las mismas condiciones. El cultivo se centrifugó a 9.000 rpm, 10 min, el pellet se resuspendió con vórtex en 20 ml_ de PBS pH 6,7. Luego se rompieron las células mediante sonicación con el aparato Branson Sonifier 250 con pulsos constantes de 30-40% a potencia media durante media hora y en hielo para no sobrecalentar la muestra en el proceso. Se centrifugó para bajar las células durante 10 min, a 9.000 rpm. Se realizaron dos lavados resuspendiendo el pellet mediante vórtex en 10 mL de PBS pH 6,7 con Tritón al 1 %, sonicando de forma continuada a potencia media durante 1 min. Después se resuspendió el pellet en 5 mL de tampón de unión ("binding buffer') de la columna de purificación, se ajustó el lisado a pH 7,4 y se dejó reposar durante 1 hora en hielo. Se procedió a purificar a través de la columna de afinidad por histidina His GraviTrap™ affinity column de GE Healthcare con tampón de elución ("elution buffef) según las instrucciones indicadas por el fabricante. El "binding buffer" y el "elution buffer" se prepararon mediante el kit His Buffer Kit de GE Healthcare con urea 6 M. Para eliminar el exceso de urea, se dializaó el eluído obtenido de la columna que contenía la proteína. Se utilizaron para ello membranas Seamless Tubing de Sigma introducidas en agua destilada anteriormente, y rebajando la molaridad de la urea con PBS pH 6,7 a la mitad cada hora para evitar que precipite la proteína y hasta eliminarla por completo. Para comprobar que se obtenía la enzima purificada de forma correcta se realizó una SDS-PAGE de la proteína purificada y dializada (Figura 13). El gel se tiñó con azul de coomasie y la imagen fue obtenida con el Gel Doc™ XR+ system de Bio Rad. El resultado de la diálisis se repartió en tubos Eppendorf® y se conservó a 4°C en la nevera. Para su conservación a larga duración se congeló en alícuotas de 100 a -80°C, evitando ciclos de congelación/descongelación para asegurar que la enzima no perdía la actividad. La concentración de proteína obtenida en cada purificación fue cuantificada con el UV-Vis Spectrophotometer Q500 de Quawell. 3.3 Caracterización de la actividad de AÜ20J
Se caracterizó la actividad de la enzima AN20J purificada obtenida mediante las técnicas descritas en el apartado 3.2. Para ello se estableció la Concentración Mínima Activa (CMA), definida como la cantidad mínima de enzima necesaria para eliminar completamente una concentración de AHL de 10 μΜ en un periodo de tiempo determinado. Para ello se realizaron diluciones seriadas (1 :10, 1 :100, 1 : 1.000 y 1 :10.000) en PBS pH 6,7 de una solución de enzima de concentración 0,2 mg/mL. A estas soluciones se añadieron C6-HSL y C10-HSL para obtener una concentración final de 10 μΜ, incubándose durante 3 y 24 horas a 22°C en agitación, 200 rpm. Una vez finalizada la incubación se evaluó la presencia de C6-HSL y C10-HSL mediante bioensayo en placa con las cepas bioindicadoras C. violaceum CV026 y C. violaceum VIR07, estableciéndose que las CMA de AN20J tanto para C6-HSL como para C10- HSL son 2 μg/mL para tiempos de incubación de 3 horas y diez veces menos, 0,2 μg/mL para tiempos de incubación de 24 horas (Figura 14). Sobre esta base, en todos los ensayos de caracterización se utilizó una concentración de 20 μg/mL, correspondiente a 10 veces la CMA de 3 horas sobre C6-HSL y C10-HSL.
3.3.1 Cinética de degradación de C6-HSL y C10-HSL
Se usó HPLC-MS para evaluar la cinética de degradación de 2 AHLs (C6-HSL y C10- HSL) de la enzima AN20J purificada. Para ello se incubó a una concentración de 20 μg/mL en PBS pH 6,7 con C6-HSL y con C10-HSL a una concentración final de 50 μΜ a 22°C, 200 rpm. A distintos tiempos de incubación (0, 10, 20, 30, 60 y 90 min) se tomaron alícuotas de 200 μΙ_ por triplicado de todos los tubos para realizar una extracción orgánica de las mezclas de reacción, extrayendo tres veces con el mismo volumen de acetato de etilo (200 μΙ_). El disolvente se recuperó y evaporó mediante flujo de nitrógeno en baño a 50°C y el extracto seco obtenido se resuspendió en 400 μΙ_ de acetonitrilo para su posterior análisis y cuantificación de la concentración de la señal restante por HPLC-MS. Del mismo modo se realizó la misma cinética con ANA purificada para las dos señales a una concentración final de 40 μg/mL para comparar con la actividad de AN20J extrayendo a tiempos 0, 30 y 90 de incubación. Los controles se realizaron con el PBS suplementado con la misma cantidad de señal C6- HSL o C10-HSL y se procesaron y extrajeron orgánicamente del mismo modo. El análisis se llevó a cabo con un HPLC 1 100 series (Agilent EEUU) equipado con una precolumna C8 (2, 1 x 12,5 mm, 5 μηι de tamaño de partícula) y una columna ZORBAX Eclipse XDB-C18 2,1 x 150 mm (con 5 μηι de tamaño de partícula), mantenidas a 45°C. La fase móvil consistió en 0, 1 % de ácido fórmico en agua (A) y 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo (B) con una tasa de flujo de 0,22 mL/min. Las condiciones de elución: 0 min 35% de B, gradiente lineal hasta 60% de B durante 10 min, un gradiente lineal del 60 al 95% de B durante 5 min, 95% de B durante 5 min y un minuto para volver a las condiciones iniciales que se mantuvieron durante 9 min. Se diluyeron alícuotas de 20 de cada muestra en acetonitrilo con 0, 1 % de ácido fórmico antes de su inyección en la columna. El espectrómetro de masas (MS) usado fue un API 4000 triplecuadrupolo (Applied Biosystem, CA, EEUU) equipado con una fuente Turbolon utilizada en modo electrospray de iones positivos y monitorización de múltiples reacciones (MRM). Las señales MRM fueron usadas para obtener información de cuantificación relativa por comparación con una curva de calibración construida por abundancia de iones moleculares obtenidos a partir de AHLs sintéticas estándar (Milton et al., 2001).
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 15, donde puede apreciarse, entre otras cosas, que AN20J degrada completamente C10-HSL en 20 minutos, mientras que tarda más de 80 minutos en degradar completamente C6-HSL. Sin embargo, en el tiempo considerado, no se observa una degradación completa de C6-HSL ni de C10- HSL por acción de ANA.
3.3.2 Especificidad de AÜ20J
Se realizaron ensayos iguales a los descritos en el apartado 3.3.1 para las AHLs no sustituidas C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL y para las AHLs oxo- o hidroxi- sustituidas OC6-HSL y OC12-HSL con una concentración de AHL de 10 μΜ y una concentración de enzima de 20 μg/mL. Las concentraciones iniciales y finales se midieron por triplicado en extractos realizados en PBS pH 6,7 y cuantificados mediante HPLC-MS (Romero et al., 2011). AN20J presenta el menor grado de afinidad contra C4-HSL, seguido de la oxo-AHL OC6-HSL. El resto de las AHLs probadas son degradadas completamente en 1 hora por una concentración de 20 μg/mL del enzima (Figura 16). Este amplio espectro de actividad convierte a AN20J en una de las enzimas de QQ más activas descritas, ya que en otros casos el rango de AHLs que puede ser eliminado es menor. En el caso de AiiAAi96 la mayor actividad se encuentra frente a C6, C7, C8 y C10-HSL, pero no se encontró actividad frente a C12-HSL (Cao et al., 2012).
3.3.3 Resistencia a pH
Con el objetivo de medir el efecto del pH del medio sobre la estabilidad de AN20J y establecer por lo tanto la viabilidad de su inclusión en piensos u medicamentos de deban ser ingeridos por via oral, se comprobó la estabilidad de la enzima después de ser expuesta a distintas soluciones de pH controlado en el intervalo 3-9. Una solución de AÜ20J de 20 μg/mL se incubó en distintos tampones estériles con diferentes pH durante 30 min a 22°C. Luego se ajustó el pH con HCI 1 M o NaOH 1 M hasta alcanzar pH 6,7 (condiciones estándar para medir la actividad) y se añadió la AHL (C6-HSL y C10-HSL con concentración final de 10 μΜ) dejando incubar durante 3 h, 22°C. La presencia de AHLs se reveló mediante bioensayo con las cepas indicadoras de C. violaceum, CV026 y VIR07 (Figura 17). Los pocilios del centro se corresponden con los controles negativos de PBS pH 6,7 pH con la AHL correspondiente. Los buffers utilizados fueron el Mcllvaine buffer (para pH 3, 4 y 5), tampón PBS (pH 6 y 7) y 0,05 M Tris-HCI (pH 8 y 9). Estos resultados ponen de manifiesto la existencia de un intervalo de estabilidad de AN20J, mucho mayor que el descrito para AiiAAi96, que pierde significativamente su actividad cuando se expone a soluciones de pH inferior a 6 (Cao et al., 2012).
3.3.4 Resistencia a la acción de Proteinasa K y quimiotripsina
Con el mismo objetivo que la evaluación de la resistencia al pH, se probó la resistencia de AÜ20J a la acción de la proteinasa K y la quimiotripsina (Figura 18). Se incubó individualmente AN20J a una concentración de 20 μg/mL durante 30 min y 1 h a 30°C en PBS pH 6,7 con proteinasa K en proporción proteasa-proteína 1 : 10 (p/p) añadida desde una solución stock de 50 μg/mL en H20 destilada y α-quimiotripsina en proporción proteasa-proteína 1 :60 desde una solución stock de 25 μg/mL en 100 mM Tris-HCI, pH 7,4. Después de los tiempos de incubación se añadieron C6-HSL y C10- HSL a una concentración final de 10 μΜ y se dejaron otras 24 h a 22°C y 200 rpm. Por medio de bioensayo de inhibición con los biosensores C. violaceum CV026 y VIR07 se determinó la resistencia de la actividad de AN20J a la proteólisis. Se realizaron controles negativos de proteinasa K y quimiotripsina en PBS pH 6,7 sin la enzima con la misma concentración añadida de AHLs y control negativo de PBS con las AHLs a las mismas concentraciones.
3.3.5 Resistencia a temperatura
Se evaluó la termoestabilidad de AN20J sometiendo una solución del enzima de concentración 20 μg/mL por triplicado a distintas temperaturas durante 10 minutos, midiéndose la actividad del enzima así tratado sobre C6-HSL (10 μΜ) durante 1 h, 22°C, 200 rpm, que fue cuantificada mediante técnicas de HPLC-MS. Los resultados demuestran una termoestabilidad limitada de AN20J, ya que pierde su actividad catalítica por encima de los 60°C (Figura 19). Este resultado contrasta fuertemente con la termoestabilidad de la actividad enzimática en los extractos celulares crudos, en los que la actividad resiste tratamientos de hasta 100°C durante 10 minutos (no se muestran los resultados). Además la termoestabilidad de AN20J también se comprobó HPLC-MS sometiendo una solución de 20 μg/mL de AN20J a 60°C durante 10 minutos tras los que se incubó con una concentración 50 μΜ de C6-HSL a 22°C. A distintos tiempos de incubación (0, 30 y 90 minutos) se extrajeron alícuotas por triplicado para cuantificar su actividad residual mediante análisis de HPLC-MS del mismo modo que en el apartado 3.3.1 (Figura 15). Como control se utilizó PBS suplementado con la misma cantidad de señal C6-HSL, procesado y extraído orgánicamente del mismo modo. AÜ20J degradó a lo largo de los 90 minutos casi por completo toda la señal en comparación con el control, aunque la enzima tratada a 60°C presentó una cinética algo más lenta que la enzima no tratada como se observa en la Figura 15. En comparación con los resultados de termoestabilidad limitada (Figura 19), AN20J no pierde la capacidad de degradación de AHLs a 60°C (Figura 15).
Para comprobar si la diferencia de termo-resistencia entre el enzima purificado y el extracto celular de la Tenacibaculum sp. cepa 20J se pudiera deber a la presencia en la cepa de un segundo enzima termo-resistente se probó la termorresistencia de la actividad en extractos celulares de E. coli BL21 DE3 con el plásmido pET28c(+). EL extracto celular crudo diluido a una concentración 10 veces mayor que la concentración mínima activa (46,8 μg de proteína del extracto/mL tanto a las 3 como a las 24 h) se incubó en tubos Eppendorf® con PBS pH 6,7 a 22°C, 60°C, 80°C y 100°C durante 10 min. Luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se les añadió la molécula señal C6-HSL a una concentración final de 10 μΜ y se dejaron en agitación a 200 rpm durante 3 h a 22°C, tras la cual se realizó el bioensayo de inhibición de violaceína. Como control se usó el PBS con la misma cantidad de señal C6-HSL. Los resultados ponen de manifiesto que el extracto de E. coli en el que se expresa AN20J presenta el mismo perfil de termorresistencia que la cepa original 20J (Figura 20), lo que indica que la baja termorresistencia de AN20J purificada podría deberse a la falta de algún co-factor que incrementa su sensibilidad y que está presente en los extractos celulares.
3.3.6 Interacción de AÜ20J con antibióticos de la famila de los β-lactámicos
Debido a la homología de AN20J y el resto de las lactonasas de AHLs con las β- lactamasas responsables de la resistencia de numerosas bacterias a estos antibióticos (Bebrone, 2007), se comprobó la posible actividad de AN20J sobre un total de 11 antibióticos β-lactámicos pertenecientes a 5 familias del grupo (Penicilina G, Meticilina, Amoxicilina, Ampicilina, Cefalotina, Cefaclor, Cefoxitina, Ceftriaxona, Cefoperazona, Imipenem y Meropenem) y dos inhibidores de las β-lactamasas (Sulbactam y ácido clavulánico). Los antibióticos se incubaron durante 24 horas con una solución de 20 μg/mL de AN20J comprobándose su actividad en comparación con la misma solución de antibiótico no tratado enzimáticamente mediante antibiograma en pocilio con la bacteria Staphylococcus aureus ATCC 25923. Se obtuvieron halos de diámetro idéntico en las placas correspondientes al antibiótico solo y al antibiótico tratado con AÜ20J, lo que indica que no existe interacción ente AN20J y la acción de estos antibióticos β-lactámicos y tampoco con los inhibidores de las β-lactamasas probados (Figura 21).
EJEMPLO 4
Resistencia al ácido en E. coli K-12 MG1655 y E. coli EHEC EDL 933
Con el objetivo de observar si la lactonasa AN20J podría revertir el efecto protector de las AHLs en cultivos de E. coli cuando son expuestos a pHs bajos, se llevó a cabo un ensayo de resistencia al ácido. Las cepas de E. coli fueron cultivadas en medio LB durante 48 h a 30°C y en agitación (170 rpm). Tras ese tiempo los cultivos se inocularon en medio LB precalentado con glucosa al 0,4% para reprimir el sistema de resistencia al ácido (AR-1), con las distintas condiciones y en continua agitación a la misma temperatura: E. coli, E. coli más OC6-HSL a una concentración final de 5 μΜ, E. coli más AN20J a 20 μg/mL y E. coli más OC6-HSL y AN20J a las mismas concentraciones. Después de 14-15 horas de incubación se realizó una dilución 1 :1000 de cada cultivo en medio ácido (MEM) pH 2,0, suplementado con glucosa al 0,4% y glutamato 1 ,6 mM precalentado. A las 0, 1 ,5 y 3 horas (30°C, 170 rpm) se vertieron 100 μΙ_ de cada reacción en placas de LB. Las placas se incubaron 24 horas a 30°C para determinar la supervivencia de E. coli mediante el contaje de CFUs (unidades formadoras de colonias). El medio MEM fue preparado a partir de una disolución al 50X con 670 mL de agua destilada, 10 g de MgS04-7H20, 100 g de ácido cítrico- H20, 500 g de K2HP04 y 175 g de NaNH4HPCy4H20. El volumen aproximado final fue de 1 L, del cual se realizó una dilución a 1X en agua destilada y se ajustó a pH 2,0 antes de autoclavar. La glucosa (0,4%) y el glutamato (1 ,6 mM) fueron añadidos esterilizados de forma independiente.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 22.
Discusión
En E. coli la Resistencia a un entorno ácido se controla mediante la presencia de señalas QS de tipo AHL. E. coli no produce esas señales, pero puede sentir las señales producidas por otras bacterias en el rumen o en el intestino de los animales debido a la presencia de un sensor específico llamado SdiA. Se ha demostrado que la inactivación del sensor SdiA reduce la diseminación fecal de E. coli 0157:1-17 en terneras destetadas, probablemente reduciendo la capacidad de colonización (Sharma & Bearson, 2013). En la Figura 22 se demuestra el efecto de la adición de la enzima AÜ20J sobre la resistencia al ácido en E. coli cepa K-12 MG1655. En este experimento se ha comprobado el efecto de la adición de AHLs externas y la acción de la lactonasa AÜ20J sobre la viabilidad de células E. coli expuestas a pH 2,0. Los resultados han demostrado que la presencia de AHLs externas confiere a E. coli completa resistencia al ácido en comparación con los cultivos de control. La adición de AN20J a cultivos de control no tiene un efecto significativo sobre la resistencia de E. coli a un entorno ácido mientras que la adición de AN20J a cultivos a los que se les añadieron AHLs resultó en una reducción significativa (alrededor del 50%) en la viabilidad celular en comparación con cultivos que eran resistentes al ácido debido a la presencia de AHLs. La resistencia al ácido es una característica de virulencia importante de patógenos gastrointestinales tales como E. coli y el gen sdiA juega un papel clave en la regulación del sistema de resistencia al ácido dependiente de glutamato así como en el control de la producción de factores de virulencia de manera dependiente de QS en E. coli K-12 y EHEC. Los resultados aquí aportados confirman el potencial uso de AN20J en el control de la expresión de importantes patógenos humanos como E. coli.
TRADUCCIÓN AL CASTELLANO DE LAS LEYENDAS EN INGLÉS CONTENIDAS EN LA LISTA DE SECUENCIAS
Figure imgf000064_0001
BIBLIOGRAFÍA
Altschul S.F., Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ.1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol; 215(3):403-10.
Bassler, B.L., Losick, R. 2006. Bacterially Speaking. Cell 125: 237-246.
Bebrone, C. 2007. Metallo^-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily. Biochemical Pharmacology
74: 1686-1701.
Boles B.R., Horswill A.R. 2008. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog.;4:e1000052
Bruhn, J. B., Dalsgaard, I., Nielsen, K. F., Buch, C, Larsen, J. L, Gram, L. 2005.
Quorum sensing signal molecules (acylated homoserine lactones) in gram- negative fish pathogenic bacteria. Dis. Aquat. Org. 65: 43-52.
Buch, C, Sigh, J., Nielsen, J., Larsen, J. L., Gram, L. 2003. Production of acylated homoserine lactones by different serotypes of Vibrio anguillarum both in culture and during infection of rainbow trout. Syst. Appl. Microbiol. 26: 338-349.
Cam, D. T. V., Hao, N. V., Dierckens, K., Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Bossier,
P. 2009. Novel approach of using homoserine lactone degrading and poly-β- hydroxybutyrate accumulating bacteria to protect Artemia from the pathogenic effects of Vibrio harveyi. Aquaculture 291 :23-30.
Cao, Y., He, S., Zhou, Zhigang, Zhang, M., Mao, W. , Zhang, H., Yao, B. 2012. Orally administered thermostable N-acyl homoserine lactonase from Bacillus sp. Strain
AI96 attenuates Aeromonas hydrophila infection in fish. Applied and Environmental
Microbiology 78:1899-1908.
Carlier, A., Faure, D., Latour, X., Uroz, S., Fray, R., Smadja, B., Dessaux, Y. 2003. The
Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens harbors an attM-paralogous gene, aiiB, also encoding N-Acyl homoserine lactonase activity. Appl. Environ. Microbiol. 69:
4989-4993.
Croxatto, A., Chalker, V. J., Lauritz, J., Jass, J., Hardman, A., Williams, P., Cámara,
M., Milton, D. L. 2002. VanT, a homologue of Vibrio harveyi LuxR, regulates serine, metalloprotease, pigment, and biofilm production in Vibrio anguillarum. J.
Bacteriol. 184: 1617-1629.
Dong, Y. H., Xu, J. L, Li, X. Z., Zhang, L. H. 2000. ANA, an enzyme inactivates acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 3526-3531.
Dong Y. H., Wang L. H., Xu J. L, Zhang H. B., Zhang X. F., and Zhang L. H. 2001 :
Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature 41 1 :813-817.
Freeman, J. A., Bassler, B. L. 1999. A genetic analysis of the function of LuxO, a two component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi. Mol.
Microbiol. 31 : 665-677.
Fuqua, C, Greenberg, E. P. 2002. Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signaling. Nature Rev. 3: 685-695.
Hughes DT, Clarke MB, Yamamoto K, Rasko DA, Sperandio V. 2009. The QseC adrenergic signaling cascade in Enterohemorrhagic E. coli (EHEC). PLoS
Pathog.;5(8):e1000553.
Izquierdo Rojo, M., Ingeniería Genética, Ediciones Pirámide, S.A., 1993. Capítulo 9. Morohoshi, T., Inaba, T., Kato, N., Kanai, K., Ikeda, T. 2004. Identification of quorum sensing signal molecules and the LuxRI homologs in fish pathogen Edwarsiella tarda. J. Biosci. Bioeng. 98: 274-281.
Milton, D., Chalker, V., Kirke, D., Hardman, A., Cámara, M., Williams, P. 2001. The
LuxM homologue, VanM from Vibrio anguillarum directs the systhesis of Λ/-(3- hydroxyhexanoyl) homoserine lactone and /V-hexanoylhomoserine lactone. J.Bacteriol. 183:3537-3547.
Otero Casal, A., Muñoz Crego, A., Benárdez Hermida, M. I., Fábregas, J. 2004.
Quorum sensing: el lenguaje de las bacterias. Ed. Acribia, Zaragoza, España. 120 pp.
Park, S. Y., Lee, S. J., Oh, T. K., Oh, J. W., Koo, B. T., Yum, D. Y., Lee, J. K. 2003.
AhID, an N-acylhomoserin lactonase in Arthrobacter sp., and predicted homologues in other bacteria. Microbiology 149: 1541-1550.
Piñeiro-Vidal, M., Riaza, A., Santos, Y. 2008. Tenacibaculum discolor sp. nov. and
Tenacibaculum galaicum sp. nov. Isolated from solé (Solea senegalensis) and turbot (Psetta máxima) culture systems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 21-25. Rasmussen, T. B., Bjarnsholt, T., Skindersoe, M. E., Hentzer, M., Kristoffersen, P.,
Kote, M., Nielsen, J., Eberl, L., Givskov, M. 2005. Screening for quorum-sensing inhibitors (QSI) by use of a novel genetic system, the QSI selector. J. Bacteriol.
187: 1799-1814.
Riaz, K., Elmerich, C, Raffoux, A., Moreira, D., Dessaux, Y., Faure, D. 2008.
Metagenomics revelead a quorum quenching lactonase QlcA from yet unculturable soil bacteria. Commun. Agrie. Appl. Biol. Sci. 73: 3-6.
Romero, M. 2010. Interceptación de señales de comunicación bacteriana tipo N- acilhomoserín lactona (AHL) en bacterias marinas aisladas del medio marino.
Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela.
Romero, M., Avendaño-Herrera, R., Magariños, B., Cámara, M., Otero, A. 2010.
Acylhomoserine lactone production and degradation by the fish pathogen
Tenacibaculum maritimum, a member of the Cytophaga-Flavobacterium-
Bacteroides (CFB) group. FEMS Microbiol. Lett. 304: 131-139.
Romero, M. , Martin-Cuadrado, A. B. , Roca-Rivada, A., Cabello, A. M., Otero, A. 2011.
Quorum quenching in cultivable bacteria from dense marine coastal microbial communities. FEMS Microb. Ecol. 75: 205-217.
Romero, M., Martin-Cuadrado, A. B., Otero, A. 2012. Determination of whether quorum quenching is a common activity in marine bacteria by analysis of cultivable bacteria and metagenomic sequences. Appl. Environ. Microbiol. 78:6345-6348. Sambrook, J., et al., 2001 Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, N.Y. Sharma, V.K., Bearson, S.M.D. 2013. Evaluation of the impact of the quorum sensing transcriptional regulator SdiA on long-term persistence and fecal shedding of Escherichia coli 0157:1-17 in weaned calves. Microb. Pathog. 57: 21-26.
Swift, S., Williams, P., Stewart, G. S. A. B. 1999. /V-acylhomoserine lactones and quorum sensing in proteobacteria. En Cell-cell signaling in Bacteria. Dunny, G. M., Winans, S. C. (eds). Washington D.C.: American Society for Microbiology., pp.
Whitehead, N. A., Barnard, A. M., Slater, H., Simpson, N. J., Salmond, G. P. 2001.
Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 25: 365-404.
Wlliams, P., Winzer, K., Chan, W. C, Cámara, M. 2007. Look who's talking: communication and quorum sensing in the bacterial world. Phil. Trans. R. Soc. B. 362: 1 119-1 134.
Zhang, H. B., Wang, L. H., Zhang, L. H. 2002. Genetic control of quorum-sensing
signal turnover in Agrobacterium tumefaciens. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:
4638-4643.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 , o una variante del mismo que tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 y codifica un péptido con actividad inhibidora de Quorum Sensing (QS).
2. Polinucleótido según la reivindicación 1 , cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad con respecto a la SEQ ID NO: 1 de, al menos, 90% y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad con respecto a la SEQ ID NO: 1 de, al menos, 99% y codifica un péptido con actividad inhibidora de QS.
4. Polinucleótido según la reivindicación 1 , cuya secuencia de nucleótidos consiste en la SEQ ID NO: 1.
5. Un vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vector según la reivindicación 5, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, con la condición de que dicha célula no es una bacteria del género Tenacibaculum.
7. Un organismo no humano transgénico que comprende, insertado en su genoma, un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vector según la reivindicación 5, con la condición de que dicho organismo no es una bacteria del género Tenacibaculum.
8. Un péptido codificado por la secuencia nucleotídica de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo que tiene un grado de identidad de al menos un 76% con respecto a dicha SEQ ID NO: 2 y mantiene la actividad inhibidora de Quorum Sensing (QS).
10. Péptido según la reivindicación 8 ó 9, cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de, al menos 76%, con respecto a dicha SEQ ID NO: 2 y mantiene la actividad inhibidora de QS.
1 1. Péptido según la reivindicación 8, 9 ó 10, cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de, al menos 93%, con respecto a dicha SEQ ID NO: 2 y mantiene la actividad inhibidora de QS.
12. Péptido según la reivindicación 8, 9, 10 ú 11 , cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de, al menos 99%, con respecto a dicha SEQ ID NO: 2 y mantiene la actividad inhibidora de QS.
13. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, cuya secuencia de aminoácidos consiste en la SEQ ID NO: 2.
14. Una composición que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.
15. Composición según la reivindicación 14, que comprende, además, un vehículo seleccionado entre:
un vehículo apto para alimentación;
un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
un vehículo agrícolamente aceptable.
16. Un producto alimenticio que comprende una composición según la reivindicación 15 y un vehículo apto para alimentación.
17. Empleo de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la elaboración de un producto alimenticio.
18. Una composición farmacéutica que comprende una composición según la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Empleo de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana.
20. Empleo según la reivindicación 19, en el que la bacteria causante de la infección bacteriana es una bacteria productora de señales de quorum sensing (QS).
21. Empleo según la reivindicación 19 ó 20, en el que la bacteria causante de la infección bacteriana es una bacteria formadora de biofilms.
22. Empleo según la reivindicación 20, en el que dichas señales de QS producidas por la bacteria causante de la infección comprenden una N-acil-homoserin lactona (AHL), en donde dicha AHL es (i) una AHL no sustituida, en donde dicha AHL no sustituida se selecciona del grupo formado por C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10- HSL, C12-HSL, C14-HSL y sus combinaciones; (ii) una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, en donde dicha AHL oxo- o hidroxi- sustituida se selecciona del grupo formado por OC6-HSL, OC12-HSL y sus combinaciones; o (iii) combinaciones de (i) Y (ü).
23. Una composición agrícola que comprende una composición según la reivindicación 15 y un vehículo agrícolamente aceptable.
24. Un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de quorum sensing (QS), bajo condiciones que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana.
25. Un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende transformar dicha planta con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con un vector según la reivindicación 5, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de quorum sensing (QS).
26. Un método para controlar una enfermedad bacteriana en una planta, que comprende el empleo de una bacteria transformada con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con un vector según la reivindicación 5, en donde dicha enfermedad bacteriana es causada por una bacteria productora de señales de quorum sensing (QS), bajo condiciones que permiten controlar dicha enfermedad bacteriana.
27. Empleo de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para provocar un proceso de quorum quenching (QQ) en respuesta a un proceso de quorum sensing (QS), en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS.
28. Un método para provocar un proceso de quorum quenching (QQ) en respuesta a un proceso de quorum sensing (QS), en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, bajo condiciones que permiten provocar dicho proceso de QQ.
29. Empleo de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para inhibir un proceso de quorum sensing (QS), en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS.
30. Un método para inhibir un proceso de quorum sensing (QS), en donde dicho proceso de QS es causado por una bacteria productora de señales de QS, que comprende poner en contacto dicha bacteria con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, bajo condiciones que permiten inhibir dicho proceso de QS.
31. Un método in vitro para degradar una señal de quorum sensing (QS), que comprende poner en contacto un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, con dicha señal de QS, bajo condiciones que permiten degradar dicha señal de QS.
32. Un método in vitro para modular la actividad señalizadora de una N-acil-homoserin lactona (AHL), que comprende poner en contacto un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, con dicha AHL, bajo condiciones que permiten modular la actividad señalizadora de dicha AHL.
33. Empleo de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para inhibir la formación de un biofilm bacteriano ex vivo o in vitro.
34. Empleo según la reivindicación 33, en el que dicha bacteria causante de la formación de biofilm es una bacteria productora de señales de quorum sensing (QS).
35. Un método in vitro o ex vivo para inhibir la formación de un biofilm bacteriano, en donde dicho biofilm bacteriano es producido por una bacteria productora de una señal de quorum sensing (QS), que comprede poner en contacto un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 5, una célula según la reivindicación 6, un organismo no humano transgénico según la reivindicación 7, o un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, con dicha bacteria productora de señales de QS, bajo condiciones que permiten inhibir la formación de dicho biofilm bacteriano.
36. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 27, 29, ó 34, en el que dichas señales de QS producidas por la bacteria comprenden una N-acil-homoserin lactona (AHL), en donde dicha AHL es (i) una AHL no sustituida, en donde dicha AHL no sustituida se selecciona del grupo formado por C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL y sus combinaciones; (ii) una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, en donde dicha AHL oxo- o hidroxi- sustituida se selecciona del grupo formado por OC6-HSL, OC12-HSL y sus combinaciones; o (iii) combinaciones de (i) Y (ü).
37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, 28, 30, 31 , 32 ó 35, en el que dichas señales de QS producidas por la bacteria comprenden una N-acil- homoserin lactona (AHL), en donde dicha AHL es (i) una AHL no sustituida, en donde dicha AHL no sustituida se selecciona del grupo formado por C4-HSL, C6- HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL y sus combinaciones; (ii) una AHL oxo- o hidroxi- sustituida, en donde dicha AHL oxo- o hidroxi- sustituida se selecciona del grupo formado por OC6-HSL, OC12-HSL y sus combinaciones; o (iii) combinaciones de (i) y (ii).
PCT/ES2014/070569 2013-07-11 2014-07-10 Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones WO2015004305A1 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/904,278 US10316302B2 (en) 2013-07-11 2014-07-10 Peptide with quorum-sensing inhibitory activity, polynucleotide that encodes said peptide, and the uses thereof
EP14822500.6A EP3020814B1 (en) 2013-07-11 2014-07-10 Peptide with quorum-sensing inhibitory activity, polynucleotide that encodes said peptide, and the uses thereof
ES14822500T ES2742307T3 (es) 2013-07-11 2014-07-10 Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y los usos de los mismos

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201331060 2013-07-11
ES201331060A ES2528673B1 (es) 2013-07-11 2013-07-11 Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015004305A1 true WO2015004305A1 (es) 2015-01-15

Family

ID=52279385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2014/070569 WO2015004305A1 (es) 2013-07-11 2014-07-10 Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10316302B2 (es)
EP (1) EP3020814B1 (es)
ES (2) ES2528673B1 (es)
WO (1) WO2015004305A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022238627A1 (fr) 2021-05-12 2022-11-17 Museum National D'histoire Naturelle Inhibiteurs de quorum sensing et composition les contenant

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10081800B1 (en) * 2017-08-03 2018-09-25 Fornia Biosolutions, Inc. Lactonase enzymes and methods of using same
BR112021025474A2 (pt) * 2019-06-17 2022-02-01 Migal Galilee Res Institute Ltd Mutantes estabilizados de lactonase de quorum quenching e uso seu em tratamento de patógenos
CN112481236B (zh) * 2020-11-25 2023-06-06 武汉理工大学 一种重组蛋白INP-AidH及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003068951A1 (en) * 2002-01-23 2003-08-21 Agency For Science, Technology And Research Ralstonia ahl-acylase gene
WO2010012852A1 (es) * 2008-08-01 2010-02-04 Universidade De Santiago De Compostela Uso de bacterias del género tenacibaculum para quorum quenching

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003068951A1 (en) * 2002-01-23 2003-08-21 Agency For Science, Technology And Research Ralstonia ahl-acylase gene
WO2010012852A1 (es) * 2008-08-01 2010-02-04 Universidade De Santiago De Compostela Uso de bacterias del género tenacibaculum para quorum quenching
ES2342807B2 (es) 2008-08-01 2011-03-18 Universidade De Santiago De Compostela Uso de bacterias del genero tenacibaculum para quorum quenching.

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUL S.F.; GISH W; MILLER W; MYERS EW; LIPMAN DJ: "Basic local alignment search tool", J MOL BIOL, vol. 215, no. 3, 1990, pages 403 - 10
BASSLER, B.L; LOSICK, R: "Bacterially Speaking", CELL, vol. 125, 2006, pages 237 - 246
BEBRONE, C: "Metallo-p-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily", BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 74, 2007, pages 1686 - 1701
BOLES B.R.; HORSWILL A.R: "Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms", PLOS PATHOG., vol. 4, 2008, pages E1000052
BRUHN, J. B.; DALSGAARD, I.; NIELSEN, K. F.; BUCH, C.; LARSEN, J. L.; GRAM, L: "Quorum sensing signal molecules (acylated homoserine lactones) in gram-negative fish pathogenic bacteria", DIS. AQUAT. ORG., vol. 65, 2005, pages 43 - 52
BUCH, C.; SIGH, J.; NIELSEN, J.; LARSEN, J. L.; GRAM, L.: "Production of acylated homoserine lactones by different serotypes of Vibrio anguillarum both in culture and during infection of rainbow trout", SYST. APPL. MICROBIOL., vol. 26, 2003, pages 338 - 349
CAM, D. T. V.; HAO, N. V.; DIERCKENS, K.; DEFOIRDT, T.; BOON, N.; SORGELOOS, P.; BOSSIER, P.: "Novel approach of using homoserine lactone degrading and poly-§-hydroxybutyrate accumulating bacteria to protect Artemia from the pathogenic effects of Vibrio harveyi", AQUACULTURE, vol. 291, 2009, pages 23 - 30
CAO, Y.; HE, S.; ZHOU, ZHIGANG; ZHANG, M.; MAO, W.; ZHANG, H.; YAO, B.: "Orally administered thermostable N-acyl homoserine lactonase from Bacillus sp. Strain AI96 attenuates Aeromonas hydrophila infection in fish", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 78, 2012, pages 1899 - 1908
CARLIER, A.; FAURE, D.; LATOUR, X.; UROZ, S.; FRAY, R.; SMADJA, B.; DESSAUX, Y: "The Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens harbors an attM-paralogous gene, aiiB, also encoding N-Acyl homoserine lactonase activity", APPL. ENVIRON. MICROBIOL, vol. 69, 2003, pages 4989 - 4993
CROXATTO, A.; CHALKER, V. J.; LAURITZ, J.; JASS, J.; HARDMAN, A.; WILLIAMS, P.; CAMARA, M.; MILTON, D. L.: "VanT, a homologue of Vibrio harveyi LuxR, regulates serine, metalloprotease, pigment, and biofilm production in Vibrio anguillarum", J. BACTERIOL., vol. 184, 2002, pages 1617 - 1629
DONG Y. H.; WANG L. H.; XU J. L.; ZHANG H. B.; ZHANG X. F; ZHANG L. H: "Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase", NATURE, vol. 411, 2001, pages 813 - 817
DONG, Y. H.; XU, J. L.; LI, X. Z.; ZHANG, L. H: "AiiA, an enzyme inactivates acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 3526 - 3531
FREEMAN, J. A.; BASSLER, B. L.: "A genetic analysis of the function of LuxO, a two component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi", MOL. MICROBIOL., vol. 31, 1999, pages 665 - 677
FUQUA, C.; GREENBERG, E. P: "Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signaling.", NATURE REV, vol. 3, 2002, pages 685 - 695
HUGHES DT; CLARKE MB; YAMAMOTO K; RASKO DA; SPERANDIO V: "The QseC adrenergic signaling cascade in Enterohemorrhagic E. coli (EHEC", PLOS PATHOG., vol. 5, no. 8, 2009, pages E1000553
IZQUIERDO ROJO, M.: "Ingenieria Genetica", 1993
MILTON, D.; CHALKER, V.; KIRKE, D.; HARDMAN, A.; CAMARA, M.; WILLIAMS, P: "The LuxM homologue, VanM from Vibrio anguillarum directs the synthesis of N-(3-hydroxyhexanoyl) homoserine lactone and N-hexanoylhomoserine lactone", J.BACTERIOL., vol. 183, 2001, pages 3537 - 3547
MOROHOSHI, T.; INABA, T.; KATO, N.; KANAI, K.; IKEDA, T: "Identification of quorum sensing signal molecules and the LuxRI homologs in fish pathogen Edwarsiella tarda", J. BIOSCI. BIOENG., vol. 98, 2004, pages 274 - 281
OTERO CASAL, A.; MUNOZ CREGO, A.; BENARDEZ HERMIDA, M. I.; FABREGAS, J.: "Quorum sensing: el lenguaje de las bacterias", 2004, pages: 120
PARK, S. Y.; LEE, S. J.; OH, T. K.; OH, J. W.; KOO, B. T.; YUM, D. Y.; LEE, J. K: "AhlD, an N-acylhomoserin lactonase in Arthrobacter sp., and predicted homologues in other bacteria", MICROBIOLOGY, vol. 149, 2003, pages 1541 - 1550
PINEIRO-VIDAL, M.; RIAZA, A.; SANTOS, Y: "Tenacibaculum discolor sp. nov. and Tenacibaculum galaicum sp. nov. Isolated from sole (Solea senegalensis) and turbot (Psetta maxima) culture systems", INT. J. SYST. EVOL. MICROBIOL., vol. 58, 2008, pages 21 - 25
RASMUSSEN, T. B.; BJARNSHOLT, T.; SKINDERSOE, M. E.; HENTZER, M.; KRISTOFFERSEN, P.; KOTE, M.; NIELSEN, J.; EBERL, L.; GIVSKOV, M: "Screening for quorum-sensing inhibitors (QSI) by use of a novel genetic system, the QSI selector", J. BACTERIOL., vol. 187, 2005, pages 1799 - 1814
RIAZ, K.; ELMERICH, C.; RAFFOUX, A.; MOREIRA, D.; DESSAUX, Y.; FAURE, D.: "Metagenomics revelead a quorum quenching lactonase QlcA from yet unculturable soil bacteria", COMMUN. AGRIC. APPL. BIOL. SCI., vol. 73, 2008, pages 3 - 6
ROMERO, M. ET AL.: "Acylhomoserine lactone production and degradation by the fish pathogen Tenacibaculum maritimum, a member of the Cytophaga-Flavobacterium- Bacteroides (CFB) group''.", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 304, no. 2, March 2010 (2010-03-01), pages 131 - 139, XP009163765 *
ROMERO, M. ET AL.: "Quorum quenching in cultivable bacteria from dense marine coastal microbial communities''.", FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY., vol. 75, no. 2, February 2011 (2011-02-01), pages 205 - 217, XP002685402 *
ROMERO, M.: "Interceptacion de senales de comunicacion bacteriana tipo N-acilhomoserin lactona (AHL) en bacterias marinas aisladas del medio marino", DOCTORAL THESIS, 2010
ROMERO, M.: "Interceptacion of señales of comunicación bacteriana tipo N-acilhomoserín lactonas (AHLs) in bacterias aisladas del medio marino''.", THESIS., May 2010 (2010-05-01), XP055307628, Retrieved from the Internet <URL:http://dspace.usc.es/bitstream/10347/2852/1/9788498874501_content.pdf> [retrieved on 20140923] *
ROMERO, M.; AVENDANO-HERRERA, R.; MAGARINOS, B.; CAMARA, M.; OTERO, A: "Acylhomoserine lactone production and degradation by the fish pathogen Tenacibaculum maritimum, a member of the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) group", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 304, 2010, pages 131 - 139
ROMERO, M.; MARTIN-CUADRADO, A. B.; OTERO, A.: "Determination of whether quorum quenching is a common activity in marine bacteria by analysis of cultivable bacteria and metagenomic sequences", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 78, 2012, pages 6345 - 6348
ROMERO, M.; MARTIN-CUADRADO, A. B.; ROCA-RIVADA, A.; CABELLO, A. M.; OTERO, A.: "Quorum quenching in cultivable bacteria from dense marine coastal microbial communities", FEMS MICROB. ECOL., vol. 75, 2011, pages 205 - 217
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP3020814A4
SHARMA, V.K.; BEARSON, S.M.D.: "Evaluation of the impact of the quorum sensing transcriptional regulator SdiA on long-term persistence and fecal shedding of Escherichia coli 0157:H7 in weaned calves", MICROB. PATHOG., vol. 57, 2013, pages 21 - 26
SWIFT, S; WILLIAMS, P.; STEWART, G. S. A. B.: "Cell-cell signaling in Bacteria", 1999, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, article "N-acylhomoserine lactones and quorum sensing in proteobacteria"
WHITEHEAD, N. A.; BARNARD, A. M.; SLATER, H.; SIMPSON, N. J.; SALMOND, G. P: "Quorum-sensing in Gram-negative bacteria", FEMS MICROBIOL. REV., vol. 25, 2001, pages 365 - 404
WILLIAMS, P.; WINZER, K.; CHAN, W. C.; CAMARA, M: "Look who's talking: communication and quorum sensing in the bacterial world", PHIL. TRANS. R. SOC. B., vol. 362, 2007, pages 1119 - 1134
ZHANG, H. B.; WANG, L. H.; ZHANG, L. H: "Genetic control of quorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefaciens", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 4638 - 4643

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022238627A1 (fr) 2021-05-12 2022-11-17 Museum National D'histoire Naturelle Inhibiteurs de quorum sensing et composition les contenant

Also Published As

Publication number Publication date
US10316302B2 (en) 2019-06-11
ES2742307T3 (es) 2020-02-13
ES2528673A1 (es) 2015-02-11
EP3020814B1 (en) 2019-05-22
US20160244735A1 (en) 2016-08-25
EP3020814A1 (en) 2016-05-18
EP3020814A4 (en) 2016-11-30
ES2528673B1 (es) 2015-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2625144T3 (es) Polinucleótidos y polipéptidos del fargo MRU y usos de éstos
Wang et al. Biofilm formation and inhibition mediated by bacterial quorum sensing
Romero et al. Patents on quorum quenching: interfering with bacterial communication as a strategy to fight infections
Paulo et al. Anti-Helicobacter pylori and urease inhibitory activities of resveratrol and red wine
CN106659748B (zh) 不动杆菌属溶素
ES2742307T3 (es) Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y los usos de los mismos
KR20200023521A (ko) 박테리오파지 리신을 이용한 생물막의 예방, 붕괴 및 치료
Subhadra et al. Quorum sensing in Acinetobacter: with special emphasis on antibiotic resistance, biofilm formation and quorum quenching
Khan et al. Diversity of bacteria and bacterial products as antibiofilm and antiquorum sensing drugs against pathogenic bacteria
Kundra et al. Survival of the fittest: the relationship of (p) ppGpp with bacterial virulence
Duraisamy et al. Bacteriocin—a potential antimicrobial peptide towards disrupting and preventing biofilm formation in the clinical and environmental locales
Rajesh et al. Inhibition of QS-regulated virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1 and Pectobacterium carotovorum by AHL-lactonase of endophytic bacterium Bacillus cereus VT96
ES2342807B2 (es) Uso de bacterias del genero tenacibaculum para quorum quenching.
Khan et al. Surface adherence and vacuolar internalization of bacterial pathogens to the Candida spp. cells: Mechanism of persistence and propagation
Huang et al. Quorum-sensing molecules N-acyl homoserine lactones inhibit Trueperella pyogenes infection in mouse model
Sun et al. Analysis of the antibacterial effect of an Edwardsiella tarda LuxS inhibitor
Abdulrazaq et al. Biological Study of protease produced by clinical isolates of Staphylococcus aureus
Ponprateep et al. Recombinant anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 and the prevention of vibriosis in the black tiger shrimp, Penaeus monodon
Muras et al. Breaking bad: Understanding how bacterial communication regulates biofilm-related oral diseases
Kim et al. Characterization of a catalase from red-lip mullet (Liza haematocheila): demonstration of antioxidative activity and mRNA upregulation in response to immunostimulants
Makky et al. Phage ZCSS1 from isolation to application against Staphylococcus sciuri and biofilm: a prospect of utilizing temperate phage and its products
Narendrakumar et al. Quorum quenching and biofilm inhibition: Alternative imminent strategies to control the disease cholera
Okolie Characterization of antimicrobial resistance genes of Aeromonas spp. isolated from fish and investigation of phytochemical treatment efficacy against resistant isolates.
ES2372247B2 (es) Uso de una nueva a-proteobacteria para quorum quenching.
US20230225332A1 (en) Compositions comprising aromatic dipeptides-based structures encapsulating an esterase and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14822500

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14904278

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014822500

Country of ref document: EP