WO2014198986A1 - Procedimiento para la estimación de la concentración de fosfatos en células vivas, colorante xanténico y síntesis del mismo - Google Patents

Procedimiento para la estimación de la concentración de fosfatos en células vivas, colorante xanténico y síntesis del mismo Download PDF

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María José Ruedas Rama
Rafael SALTO GONZÁLEZ
Eva María TALAVERA RODRÍGUEZ
Ángela MARTÍNEZ PERAGÓN
José Manuel PAREDES MARTÍNEZ
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Definitions

  • the present invention is within the biomedicine sector, within the techniques related to sensors and fluorescence microscopy.
  • it is a procedure for quantifying soluble phosphate in the cytoplasm of living cells by measuring fluorescence life times and fluorescence imaging microscopy.
  • the invention is also framed in the chemical sector.
  • the synthesis of a new fluorescent probe derived from xanthene which is used in the aforementioned phosphate quantification procedure is described.
  • Fluorescein and its derivatives constitute a family of dyes widely used as fluorescent probes, due to their high quantum yields, solubility, easy bio-conjugation and excitation with an argon ion laser (488 nm).
  • Fluorescein, in aqueous solution is presented in four different prototropic forms depending on the pH, namely; cation, neutral, monoanion and dianion. In turn, the neutral form is presented in three tautomeric forms; lactone, ketone and züiterión. Extinction coefficients and quantum fluorescence yields are very different for different prototropic species.
  • Dianion has a higher extinction coefficient than monoanion, each measured at its corresponding maximum absorption.
  • the dianion has a higher quantum fluorescence yield, although the monoanion also fluoresces with relative intensity and with a maximum emission almost coincident in wavelength with that of the dianion (Yguerabide, J .; Talavera, EM; Alvarez, JM; Quintero, B., Photochem. Photobiol. 1994, 60, 435-441).
  • the presence of the proton transfer reaction in the excited state mediated by a phosphate buffer modulates the fluorescence decays of fluorescein and its derivatives.
  • the values of the two decay times can be very different, being able to tune by conveniently varying the aforementioned external factors.
  • the bi-exponential nature of fluorescein fluorescence decays makes it difficult to apply as a sensor using the fluorescence life-time image microscopy (FLIM) technique.
  • derivatives 2-OMe-5-Me TG and 2-Me-4-OMe TG can be considered as fluorescent probes ⁇ / OFF ". Indeed, when the xanthene half of the derivatives is protonated (at acidic pH) he Quantum fluorescence yield is equal to or very close to zero, while, at alkaline pH, the quantum yield of the anionic form is similar to that of fluorescein.
  • This characteristic of "ON / OFF" fluorescent probes accompanied by a low fluorescence life time for the neutral species indicated the possibility of achieving a monoexponential decay when the ESPT reaction between the neutral and anionic species is promoted, by adding of a sufficient concentration of phosphate buffer, at pH values close to the physiological one.
  • the sensitivity of the decay time against phosphate is specified in that an increase in phosphate concentration from 0 to 0.3 M decreases the decay time from 3.7 ns to 3.0 ns, at pH 6.5 . This sensitivity of the decay time to environmental conditions makes these dyes serious candidates for probing phosphate concentration in real time in living cells.
  • the selective recognition of anions of biological interest has received great attention from chemists and biologists.
  • the phosphate ion plays an important role, not only in the control of blood pH, but also in the energy and metabolism of cells. In this sense, the regulation and control of phosphate uptake in osteoblasts is particularly important.
  • phosphate anions play an important role in signal transduction and energy storage in biological systems and many of the common enzymes, such as kinases and phosphatases, produce or consume inorganic phosphate that is also related to protein phosphorylation. Accordingly, the detection of the increase or decrease of the phosphate concentration in the surroundings of these enzymes is a common way of monitoring the enzymatic activity or the process of protein phosphorylation.
  • the first object of the present invention is a method for estimating the concentration of phosphate present in cells, preferably in the cytoplasm of permeabilized cells, by obtaining the fluorescence decay times of xanthenic dyes by fluorescence microscopy with pulsed excitation (FLIM) and the conversion into microscopic images of these fluorescence decay times.
  • FLIM pulsed excitation
  • the penetration of soluble phosphate into the cytoplasm of osteoblasts in the cell differentiation phase can be followed in real time.
  • a second object of the invention is the use of the new xanthenic dye derived from fluorescein, 9- (4-tert-butyl-2-methoxyphenyl) -6-hydroxy-3H-xanthen-3-one, called (2-OMe- 4-fBu GG), which has better spectral properties than those already known and is therefore very suitable for carrying out the aforementioned procedure.
  • a third object of the invention is a method of synthesis of the aforementioned dye.
  • Figure 1 Shows the changes in the decay time of 2-Me-4-OMe TG (1 x 10 "7 mol x L “ 1 ) in the cytoplasm of osteoblasts treated with ⁇ -toxin in PBS added of different phosphate concentrations .
  • the solid line represents the change in decay time calculated using the speed constants estimated by GCA.
  • Figure 2. Shows the FLIM images in the cytoplasm of osteoblasts permeabilized with a-toxin.
  • Figure 3. Shows the changes in the decay time of 2-Me-4-OMe TG (1 x10 "7 mol x L " 1 ) in the osteoblast cytoplasm collected during the differentiation period of MC3T3-E1 pre-osteoblasts. (triangles), together with the time of fluorescence decay inside non-permeabilized CHO cells collected in the same time period as pre-osteoblasts (circles). Extracellular levels of alkaline phosphatase (ALP) during differentiation of MC3T3-E1 cells (squares) are also represented. Continuous lines are included as a visual reference.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Figure 4.- Shows the FLIM images of the CHO cells of Figure 3.
  • Figure 5. Shows the FLIM images of the MC3T3-E1 cells of Figure 3.
  • Figure 6. Shows the changes in the decay time of 2-OMe-4-fBu GG (1 x10 "7 mol x L " 1 ) in the osteoblast cytoplasm collected during the differentiation period of MC3T3-E1 pre-osteoblasts. Continuous lines are included as a visual reference.
  • the process object of the present invention estimates, in real time, the concentration of phosphates present in living cells through the measurement of the fluorescence decay time of an xanthenic dye added to the cells and subjected to excitation by pulsed laser light.
  • the process comprises the following steps: 1 .- Add a xanthenic dye in solution to the cell sample.
  • an arbitrary color scale can be associated with the values contained in the previous matrix and generate an image so that each pixel is colored according to the long time value of the fluorescence decay, ⁇ 2 , calculated in step 6. Obtaining this image facilitates the selection, in stage 7, of the regions of interest for the analysis
  • the variations in ⁇ 2 allow to establish variations in the ion concentration of phosphate species.
  • aqueous solution of the xanthenic dye is added to the cell sample, preferably until reaching a concentration between 10 ⁇ 5 mol ⁇ L "1 and 10 ⁇ 9 mol ⁇ L " 1 , more preferably with a concentration of 10 ⁇ 7 mol ⁇ L 1 . Since the xanthenic dye has an apolar character, it spontaneously crosses the cell membrane, remaining inside the cells for the duration of the collection of the fluorescence decays.
  • the process uses the dye called 2-Me-4-OMe TG (Uranus, Y .; Kamiya, M .; Kanda, K .; Ueno, T .; Hirose, K .; Nagano, T., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4888-4894).
  • the process uses the dye 9- (4-tert-butyl-2- methoxyphenyl) -6-hydroxy-3H-xanthen-3-one (called 2-OMe-4-fBu GG), which also It is an object of the invention, and it has a structure suitable for providing greater sensitivity than 2-Me-4-OMe TG.
  • the excitation of the dye added to the sample will be carried out with a pulsed light source, whose radiation is preferably monochromatic with a wavelength between 400 and 500 nanometers, with a controllable repetition frequency in the range of 1 to 20 MHz and a width temporal pulse preferably less than 500 picoseconds.
  • a pulsed light source whose radiation is preferably monochromatic with a wavelength between 400 and 500 nanometers, with a controllable repetition frequency in the range of 1 to 20 MHz and a width temporal pulse preferably less than 500 picoseconds.
  • any pulsed light source can be used, preferably a laser source will be used as an excitation source, since they usually meet the characteristics of monochromaticity and narrow pulse width.
  • the average power of the light pulsed at the entrance of the microscope should be greater than 5 nano-watts, and less than 1 mW to avoid causing deterioration of the dye.
  • Flash lamps, filled with hydrogen or nitrogen gas, can also be used by selecting the wavelength using a monochromator. However, the high temporal width of these pulses does not make them preferred for application.
  • a suitable dichroic mirror which reflects the excitation light into the microscope and transmits the fluorescence emission wavelengths of the dye.
  • a confocal microscope with an objective of at least 6 magnification and high numerical aperture, in which the specimen under study is placed, together with a mechanical system for scanning regions with resolution in the micrometer range.
  • a fluorescence radiation targeting lens that focuses this towards a confocal aperture of diameter less than 150 ⁇ .
  • a detection system with sufficient sensitivity to detect individual photons may be avalanche photodiodes or docking devices (CCD).
  • An electronic system of temporal correlation capable of measuring the time elapsed on the nanosecond scale, between the launch of the excitatory laser pulse and the photon detection event (time-counting mode of individual photons, or TCSPC, and preferred form using the methodology "Time-Tagged-Time-f ⁇ esolvecf ', TTTR).
  • Additional elements may be considered, which may improve the performance of the procedure. These elements can be:
  • a dichroic mirror after confocal opening to direct the emitted photons to more than one detection system With these elements the image collection is done by placing the sample of cells to be analyzed, with the xanthenic dye, in the microscope. Pulsed excitation light is directed by the optical systems to the sample, focusing it on a region with cells present in the glass. Through the mechanical system, an area between 20—10000 ⁇ 2 is scanned, accompanying the detection system to construct a matrix with a resolution between 10 and 50 pixels per ⁇ 2 . The exposure time must be that necessary to collect at least 100 photons per pixel. 4.- Generate a matrix of dimensions (X, Y), where each element (x, y) contains the histoqrama of distribution of detection times of the collected photons, which represents the fluorescence decay.
  • histoqrama (associated with a pixel) refers to the distribution of the arrival times of all photons collected in a pixel. That is, a set of T two-dimensional values (t, n t ), where t indicates an instant, and n, represents dimensionally the number of photons emitted at that moment by the region of the sample represented, in the image obtained in step 3 , for a pixel. "Number of photons per pixel” means the total number of photons that are collected for each pixel.
  • each pixel must be correlated over time with respect to the excitation pulse, using the TCSPC electronic system.
  • a matrix of dimensions (X, Y) is constructed in which each element (x, y) stores the temporal histogram of fluorescence decay associated with the pixel with coordinates (x, y).
  • the resolution of the TCSPC histogram must be a maximum of 400 picoseconds per division of the histogram (or channel).
  • the individual histograms associated with each pixel of the image are preferably adjusted by non-linear methods to decay models that include among their parameters the decay time, ⁇ 2 , of the xanthenic dye, which is sensitive to phosphate concentration by virtue of the proton transfer reaction in the excited state.
  • models representing the fluorescence decay, w will be used in the form of multi-exponential functions (sum of several exponential terms) as a function of time, t.
  • xi is a parameter that represents the short time contributions to the fluorescence decay (for example, the autofluorescence of the cell interior)
  • x 2 the adjustable parameter representing the decay time of the xanthenic dye that is sensitive to phosphate concentration by virtue of the proton transfer reaction in the excited state
  • Ai and A 2 the adjustable parameters that represent the relative abundances of each decay time
  • w 0 an adjustable parameter that represents the background noise.
  • xi is between 0.5 and 2 ns, preferably equal to 1 .5 ns.
  • Non-linear adjustment can be carried out fundamentally by two methodologies: 1) without taking into account the influence of the excitation light response function (IRF) by applying a time window; and 2) by means of iterative deconvolution methods, well established for the analysis of fluorescence emission decays, where the convolution of the function of the exponential fluorescence decay with the IRF is taken into account.
  • IRF excitation light response function
  • the optimization of the adjustable parameters can be carried out by minimization of least squares, or by estimation by maximum likelihood (Maximum Likehood Estimator, MLE), the latter being preferred when the number of photons per pixel is low.
  • MLE Maximum Likehood Estimator
  • the SymPhoTime (PicoQuant) software can be used for this analysis.
  • the parameter of interest, sensitive to phosphate concentration is the decay time defined as ⁇ 2 .
  • a new matrix, ( ⁇ ', ⁇ ') will be constructed, in which each element (x ', y') contains the value of the decay time ⁇ 2 obtained in the previous stage.
  • the regions of the image corresponding to the cell cytoplasm will be selected, where the xanthenic dyes are mainly accumulated. This selection can be made manually or through appropriate mathematical algorithms.
  • the region of interest can be selected from individual cells, or simultaneously from several cells if they appear in the image.
  • an arbitrary color scale can optionally be associated with the values contained in the matrix obtained in step 6 and generate an image so that Each pixel is colored according to the value of the lifetime of the fluorophore, ⁇ 2, calculated in step 5.
  • the image generated at this stage will be called FLIM image, by "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy".
  • FLIM image For a more realistic visualization of the image of the matrix ( ⁇ ', ⁇ '), the image will be modulated in intensity according to the number of photons detected in each pixel.
  • a colored FLIM image is shown in Figure 2 where, in an arbitrary color scale, the decay time ⁇ 2 of the xanthenic dye 2-Me-4-OMe TG inside pre cells is shown - ostoblasts permeabilized with ⁇ -toxin, so that the extracellular and intracellular concentrations are equal, and immersed in a medium consisting of PBS buffer at pH 7.35 and different phosphate concentrations added.
  • This total fluorescence decay can be adjusted by means of the nonlinear analysis and iterative deconvolution methods described above, to obtain the final average value of ⁇ 2 of the xanthenic dye in the region of interest.
  • the presence of the short decay time of the dye, Ti, as well as the possible autofluorescence contribution of the cell cytoplasm, which usually has components with short life times, can be minimized through a time-delayed analysis (between 1 and 2 nanoseconds ) of the collected fluorescent signal. 10.
  • the proton transfer reaction in the excited state between the phosphate buffer species and the xanthenic dyes can be suitably described with a kinetic reaction model in two excited states.
  • the resolution of these models allows predicting the variation of the fluorescence decay time of the mentioned probes and relating them to the equations that are derived from the model to obtain in a precise and exact way the concentration of phosphate present in the medium, at each value pH
  • the parameter of interest for the estimation of the phosphate concentration will be the increase in the long decay time, with respect to its value in the absence of phosphate in the cellular interior, ⁇ 0 . This increase in decay time will be noted as ⁇ .
  • the values of the kinetic constants of each dye are obtained by means of the global compartmental analysis (GCA) of a decay surface of fluorescence.
  • GCA global compartmental analysis
  • the values of the kinetic constants for the 2-Me-4-OMe TG are shown.
  • the described procedure can be implemented by means of computers and processes executed in such equipment that in turn control the different devices necessary to carry out the procedure, whereby the invention also extends to computer programs, particularly computer programs.
  • computer arranged on or inside a carrier, adapted to implement the invention.
  • the program may have the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention .
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier could include a storage medium, for example, a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, or a Magnetic recording media, for example, a flexible disk or a hard disk.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the carrier can be a transmissible carrier, for example, an electrical or optical signal that could be transported through electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the carrier may be constituted by said cable or other device or means. Synthesis of the new xanthenic compound
  • lithium derived from compound IV is obtained by reaction thereof with butyl lithium (BuLi, 2.5 M in hexane) using THF as solvent.
  • a Grignard VI reagent is obtained, treating compound IV with Mg using THF or diethyl ether as solvent.
  • This compound II was selectively protected by its two hydroxyl groups in the form of derived TBDMS (t-butyldimethylsilyl), by treatment with tert-butyldimethylsilane chloride (4.08 mmol) and imidazole (6.8 mmol) in dimethylformamide (DMF), to give the derivative III (0.67 mmol, 99%).
  • Compound III was subsequently treated with lithium derived from compound IV, which was prepared by reacting IV (1.31 mmol) with butyl lithium (BuLi, 2.5 M in hexane) using THF as solvent.
  • This compound IV had previously been synthesized by treatment of compound V (1.27 mmol) with NBS (0.635 mmol), to give compound IV.
  • the cells are cultured with their corresponding culture medium on glass microscope slides, and prior to the measurements are washed several times with phosphate buffered saline (PBS). They are then incubated with the xanthenic dye, Staphylococcus aureus ⁇ -toxin and a pH regulating solution at a fixed pH value. This ⁇ -toxin permeabilizes the cells, which generates the formation of pores of 1.5 nm in the cell membrane, allowing the diffusion of low molecular weight molecules, such as the dye itself and the ions of the regulatory solution, inwards mobile. Subsequently, the process of the invention, explained above, is performed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the method requires a reference experiment to calculate the fluorescence lifetime of the xanthenic dye inside the cell in the absence of added phosphate (only with the phosphate containing the PBS solution).
  • the non-permeabilized cells are incubated with PBS and the dye, obtaining, under these conditions, the reference lifetime value (x 0 ).
  • This x 0 is the one used for the calculation of the life time increments ( ⁇ ) which, by means of the equation described above, allows the calculation of the phosphate concentration:
  • ⁇ life time increments
  • the cells (CHO-K1 and MC3T3-E1) were cultured with their corresponding culture media in microscopic glass slides.
  • the culture medium of the CHO-K1 cells was composed of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mmolxL -1 glutamine, 100 UxmL -1 penicillin and 0.1 ⁇ "1 streptomycin ; and the medium of the MC3T3-E1 cells was formed by the aMEM (alpha Minimum Essential Medium) culture medium supplemented with 10% FBS, and 1% penicillin-streptomycin. Both cells were cultured in an incubator at 37 e C and 5 % of C0 2 .
  • the cells Prior to microscopy measurements, the cells were washed twice with PBS and incubation was performed for 15 minutes at 37 e C 2 ⁇ "1 ⁇ -toxin into a permeabilization buffer composed of 20 mmolxL potassium MOPS pH -1 7.0, 250 mmolxL -1 mannitol, 1 mmolxL -1 potassium salt of ATP, 3 mmolxL -1 MgCI 2 and 5 mmolxL -1 potassium salt of glutathione
  • a permeabilization buffer composed of 20 mmolxL potassium MOPS pH -1 7.0, 250 mmolxL -1 mannitol, 1 mmolxL -1 potassium salt of ATP, 3 mmolxL -1 MgCI 2 and 5 mmolxL -1 potassium salt of glutathione
  • the MicroTime200 fluorescence life time microscopy system (PicoQuant GmbH) was used to obtain the fluorescence life time images.
  • the excitation source was an LDH pulsed laser with a wavelength of 470 nm excitation.
  • the light After passing through a ⁇ / 4 sheet, the light is directed from a dichroic mirror (510dcxr) towards the immersion objective (AN: 1 .4; 100x) of an inverted microscope IX-71 (Olympus) that focuses the light towards the sample and collect the fluorescence that subsequently passes through an HP500LP filter (AHF / Chroma) and focuses on the confocal opening of 75 ⁇ .
  • AN 1 .4; 100x
  • IX-71 inverted microscope IX-71
  • HP500LP filter AHF / Chroma
  • it crosses a 50/50 splitter that divides the signal into two beams of light that are focused on two SPCM-AQR-14 photomultiplier detectors (Perkin Elmer).
  • the data collection was performed with the time-correlated individual photon counting module (TCSPC) TimeHarp 200 (PicoQuant), using the "Time-Tagged-Time-Resolved" (TTTR) methodology that allows to reconstruct the time histograms of lifetime.
  • TCSPC time-correlated individual photon counting module
  • TTTR time-Tagged-Time-Resolved
  • the Symphotime software PulicoQuant
  • FLIM fluorescence life time images
  • MLE maximum likelihood estimation
  • the pixels located in the cell cytoplasm were selected to recover the decays.
  • the adjustment of the decay curves was carried out by means of a tailfit analysis (leaving out the first 1 .5 ns) using a biexponential model with a fixed time at 1 .5 ns and the second time, depending on the soluble phosphate concentration in the cytoplasm, variable.
  • This variable life time is that, knowing the value of the reference dye's life time ( ⁇ 0 ), and using the equation described above, provides the phosphate concentration in the cell cytoplasm.
  • these dyes can also be used to monitor, in real time, phosphate uptake by osteoblasts in their differentiation phase.
  • the pre-osteoblasts are incubated for 15 minutes with the xanthenic dye in PBS at different times of their cell differentiation, and after the completion of the process of this invention the changes in the fluorescent life time of the dye are measured in the cytoplasm, and therefore the increase in the concentration of phosphate ion in the cellular interior is detected after its capture during the differentiation phase.
  • This methodology was performed by removing the MC3T3-E1 cells from their corresponding differentiation medium (composed of aMEM medium supplemented with 10% FBS, 3 mmolxL -1 phosphate, 50 ⁇ gx ⁇ L "1 AA and 10 mmolxL -1 ⁇ -glycerophosphate ( ⁇ ) for induce rapid mineralization), from a time of 0 to 60 hours of differentiation, and washing them with PBS prior to incubation with the dye and microscopy measurements.
  • aMEM medium composed of aMEM medium supplemented with 10% FBS, 3 mmolxL -1 phosphate, 50 ⁇ gx ⁇ L "1 AA and 10 mmolxL -1 ⁇ -glycerophosphate ( ⁇ ) for induce rapid mineralization
  • the alkaline phosphatase (ALP) activity test was used in the extracellular culture medium. The results of this test showed an increase in the level of ALP in the extracellular medium (squares in Figure 3), parallel and in accordance with the increase in phosphate uptake in the cytoplasm of osteoblast cells.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the set of recovered results shows that the probes used and the procedure proposed in this invention allow the detection of the solubilized phosphate ion inside living cells, so it allows analyzing, on the one hand the alterations in phosphate homeostasis, that is to say , the effect produced by different cellular conditions to the phosphate flow and, on the other hand, the effect that different active ingredients may cause on the phosphate uptake by specialized cells (osteoblasts).
  • 2-Me-4-OMe TG can be substituted with other dyes with the appropriate characteristics.

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Abstract

La presente invención describe un procedimiento de estimación de la concentración de fosfatos presente en células vivas a través de la medición del tiempo de decaimiento de fluorescencia de un colorante xanténico añadido a las células y sometido a una excitación mediante luz láser pulsada. También se describe un nuevo colorante xanténico derivado de la fluoresceína que posee mejores propiedades espectrales que los ya conocidos y un procedimiento de síntesis de dicho colorante.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE FOSFATOS EN CÉLULAS VIVAS, COLORANTE XANTÉNICO Y SÍNTESIS DEL
MISMO
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuentra dentro del sector de la biomedicina, dentro de las técnicas relacionadas con sensores y microscopía de fluorescencia. En particular, se trata de un procedimiento para cuantificar el fosfato soluble en el citoplasma de células vivas mediante la medida de tiempos de vida de fluorescencia y microscopía de imagen de fluorescencia.
Asimismo, la invención se enmarca también en el sector químico. En particular se describe la síntesis de una nueva sonda fluorescente derivada del xanteno que se utiliza en el procedimiento de cuantificación de fosfato mencionado.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La fluoresceína y sus derivados constituyen una familia de colorantes muy empleada como sondas fluorescentes, por sus altos rendimientos cuánticos, solubilidad, fácil bio- conjugación y excitación con un láser de ión de argón (488 nm). La fluoresceína, en disolución acuosa se presenta bajo cuatro diferentes formas prototrópicas en función del pH, a saber; catión, neutro, monoanión y dianión. A su vez, la forma neutra se presenta bajo tres formas tautoméricas; lactona, cetona y züiterión. Los coeficientes de extinción y los rendimientos cuánticos de fluorescencia, son muy distintos para las diferentes especies prototrópicas. A pH cercano al fisiológico solo tiene lugar el equilibrio monoanión/dianión y ambas especies presentan espectros de absorción y de fluorescencia ligeramente diferentes. El dianión posee mayor coeficiente de extinción que el monoanión, medidos cada uno en su correspondiente máximo de absorción. Asimismo, el dianión tiene mayor rendimiento cuántico de fluorescencia, aunque el monoanión también fluoresce con relativa intensidad y con máximo de emisión casi coincidente en longitud de onda con el del dianión (Yguerabide, J.; Talavera, E.M.; Alvarez, J.M.; Quintero, B., Photochem. Photobiol. 1994, 60, 435-441 ). Debido a las favorables características espectrales de la fluoresceína, se ha sintetizado un número importante de derivados de esta, que replican aproximadamente sus espectros y presentan características fotofísicas favorables para ciertos fines concretos. Hace unos años, algunos de los inventores de esta patente, pusieron de manifiesto la existencia de una reacción de transferencia protónica en el estado excitado (ESPT) entre el monoanión y dianión de fluoresceína (Alvarez-Pez, J.M.; Ballesteros, L; Talavera, E.M.; Yguerabide, J., J. Phys. Chem. A 2001 , 105, 6320-6332), que modifica las características de emisión de fluorescencia de ambas especies. Propusieron un modelo en dos estados en presencia de un dador/aceptor protónico y dedujeron las expresiones teóricas derivadas del modelo que permitieron recuperar los parámetros cinéticos y espectrales del sistema estudiado. Además, se demostró la dependencia de estos dos tiempos de decaimiento con la concentración de fosfato, a distintos valores de pH. También se establecieron las ecuaciones teóricas y el software necesario para aplicar el análisis global compartimental (GCA), una herramienta de cálculo muy potente, a la obtención de los parámetros cinéticos y espectrales correspondientes a la citada reacción ESPT (Crovetto, L; Orte, A.; Talavera, E.M.; Alvarez-Pez, J.M.; Cotlet, M.; Thielemans, J.; De Schryver, F.C.; Boens, N., J. Phys. Chem. B 2004, 108, 6082-6092).
En resumen, la presencia de la reacción de transferencia protónica en el estado excitado mediada por un buffer de fosfatos, modula los decaimientos de fluorescencia de la fluoresceína y de sus derivados. Dependiendo de factores experimentales como el pH y la longitud de onda de excitación, los valores de los dos tiempos de decaimiento pueden ser muy diferentes, pudiéndose tunear variando convenientemente los citados factores externos. Sin embargo, la naturaleza biexponencial de los decaimientos de fluorescencia de la fluoresceína, hace difícil su aplicación como sensor mediante la técnica de microscopía de imágenes de tiempos de vida de fluorescencia (FLIM).
En el año 2005 un grupo japonés sintetizó una serie de derivados de la fluoresceína, que denominaron como Tokyo Green (Urano, Y.; Kamiya, M.; Kanda, K.; Ueno, T.; Hirose, K.; Nagano, T., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4888-4894). Dos de los derivados en cuestión, el 9-[1 -(2-Metoxi-5-metilfenil)]-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (2- OMe-5-Me TG) y el 9-[1 -(2-Metil-4-metoxifenil)]-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (2-Me-4- OMe TG) tienen interesantes propiedades espectrales. En tales derivados se reemplazó el grupo carboxilo del ácido benzoico de la molécula de fluoresceína por un grupo metilo o metoxilo, lo que implica que solo puede existir una forma aniónica de estas moléculas. Esto disminuye el número de especies prototrópicas en disolución y simplifica el número de equilibrios entre ellas. Además, los derivados 2-OMe-5-Me TG y 2-Me-4-OMe TG, se pueden considerar como sondas fluorescentes ΌΝ/OFF". En efecto, cuando la mitad xanteno de los derivados está protonada (a pH ácido) el rendimiento cuántico de fluorescencia es igual o muy cercano a cero, mientras que, a pH alcalino, el rendimiento cuántico de la forma aniónica es similar al de la fluoresceína. Esta característica de sondas fluorescentes "ON/OFF" acompañadas de un bajo tiempo de vida de fluorescencia para la especie neutra, nos indicó la posibilidad de conseguir un decaimiento monoexponencial cuando se promueva la reacción ESPT entre la especie neutra y la aniónica, mediante la adición de una concentración suficiente de buffer de fosfatos, a valores de pH cercanos al fisiológico. Por esta razón, se abordó un estudio fotofísico en profundidad de ambos compuestos. Tal como se esperaba, la reacción ESPT entre las especies neutras y los correspondientes aniones solo tiene lugar en presencia de una concentración relativamente baja de un buffer de fosfatos, a pH alrededor de la neutralidad. Los tiempos cortos de ambos decaimientos son del orden del picosegundo y prácticamente se hacen nulos a concentraciones de fosfato mayores de 0,05 M, mientras que los tiempos de decaimiento más largos (entre 2 y 4 ns) resultan dependientes de la concentración de fosfato (Crovetto, L; Paredes, J.M.; Rios, R.; Talavera, E.M.; Alvarez-Pez, J.M., J. Phys. Chem. A 2007, 1 1 1 , 1331 1 -13320 y Paredes; J.M.; Crovetto, L; Rios, R.; Orte, A.; Alvarez-Pez, J.M.; Talavera, E.M., Phys. Chem. Chem. Phys. 2009, 1 1 , 5400-5407). Además, las ventajosas características espectroscópicas del 2-Me-4-OMe TG motivó que con este colorante se extendiera el estudio fotofísico a nivel de moléculas individuales. Así, se obtuvieron los tiempos de decaimiento de fluorescencia recuperados a nivel de conjunto y de moléculas individuales, junto a los valores simulados con el modelo teórico establecido y las constantes cinéticas calculadas mediante GCA. La coincidencia de los tres conjuntos de valores fue excelente. Como resultado cuantitativo de interés se debe de destacar que la sensibilidad del tiempo de decaimiento frente al fosfato, se concreta en que un incremento de concentración de fosfatos desde 0 hasta 0.3 M decrece el tiempo de decaimiento desde 3.7 ns hasta 3.0 ns, a pH 6.5. Esta sensibilidad del tiempo de decaimiento a las condiciones ambientales hace de estos colorantes serios candidatos para sondar la concentración de fosfato a tiempo real en células vivas.
El reconocimiento selectivo de aniones de interés biológico ha recibido una gran atención por parte de químicos y biólogos. El ión fosfato juega un importante papel, no solo en el control del pH sanguíneo, sino también en la energética y metabolismo de las células. En este sentido, la regulación y control de la captación de fosfato en osteoblastos es particularmente importante. Asimismo, los aniones fosfato juegan un papel importante en la transducción de señales y almacenamiento de energía en los sistemas biológicos y muchas de las enzimas comunes, tales como quinasas y fosfatasas, producen o consumen fosfato inorgánico que está también relacionado con la fosforilación de proteínas. De acuerdo con esto, la detección del aumento o disminución de la concentración de fosfato en los alrededores de estas enzimas es una forma común de monitorizar la actividad enzimática o el proceso de fosforilación proteica. Por este motivo, varios grupos de investigación han puesto su atención en la detección y discriminación de esos aniones. Sin embargo, hasta ahora se conocen muy pocos sensores no invasivos que muestren alta selectividad y sensibilidad en medios acuosos, pero ninguno que pueda detectar cuantitativamente y a tiempo real el anión fosfato en el citoplasma de células vivas.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El primer objeto de la presente invención es un procedimiento para estimar la concentración de fosfato presente en células, preferentemente en el citoplasma de células permeabilizadas, a través de la obtención de los tiempos de decaimiento de fluorescencia de colorantes xanténicos mediante microscopía de fluorescencia con excitación pulsada (FLIM) y la conversión en imágenes microscópicas de esos tiempos de decaimiento de fluorescencia. A modo de ejemplo, se puede seguir en tiempo real la penetración de fosfato soluble en el citoplasma de osteoblastos en fase de diferenciación celular.
Un segundo objeto de la invención es el empleo del nuevo colorante xanténico derivado de la fluoresceína, 9-(4-ter-butil-2-metoxifenil)-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona, denominado (2-OMe-4-fBu GG), que posee mejores propiedades espectrales que los ya conocidos y por tanto resulta muy adecuado para llevar el cabo el procedimiento mencionado.
Un tercer objeto de la invención es un procedimiento de síntesis del colorante anteriormente citado.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Muestra los cambios en el tiempo de decaimiento del 2-Me-4-OMe TG (1 x10"7 mol x L"1) en el citoplasma de osteoblastos tratados con α-toxina en PBS adicionado de diferentes concentraciones de fosfato. El decrecimiento de τ se calculó con referencia al tiempo de decaimiento recogido en disolución de PBS ([fosfato] = 10 χ 10"3 mol χ L"1). La línea continua representa el cambio en el tiempo de decaimiento calculado usando las constante de velocidad estimadas por GCA.
Figura 2.- Muestra las imágenes FLIM en el citoplasma de osteoblastos permeabilizados con a-toxina.
Figura 3.- Muestra los cambios en el tiempo de decaimiento del 2-Me-4-OMe TG (1 x10"7 mol x L"1) en el citoplasma de osteoblastos recogido durante el periodo de diferenciación de pre-osteoblastos MC3T3-E1 (triángulos), junto al tiempo de decaimiento de fluorescencia en el interior de células CHO no permeabilizadas recogido en el mismo periodo temporal que los pre-osteoblastos (círculos). También se representan los niveles extracelulares de fosfatasa alcalina (ALP) durante la diferenciación de las células MC3T3-E1 (cuadrados). Las líneas continuas se incluyen como referencia visual.
Figura 4.- Muestra las imágenes FLIM de las células CHO de la Figura 3.
Figura 5.- Muestra las imágenes FLIM de las células MC3T3-E1 de la Figura 3. Figura 6.- Muestra los cambios en el tiempo de decaimiento del 2-OMe-4-fBu GG (1 x10"7 mol x L"1) en el citoplasma de osteoblastos recogido durante el periodo de diferenciación de pre-osteoblastos MC3T3-E1 . Las líneas continuas se incluyen como referencia visual.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El procedimiento objeto de la presente invención estima, en tiempo real, la concentración de fosfatos presente en células vivas a través de la medición del tiempo de decaimiento de fluorescencia de un colorante xanténico añadido a las células y sometido a una excitación mediante luz láser pulsada.
Utilizando este procedimiento en diferentes instantes de tiempo es posible analizar las variaciones temporales de la concentración de fosfato presente en células vivas.
De forma preferente, el procedimiento comprende las siguientes etapas: 1 .- Añadir un colorante xanténico en disolución a la muestra de células.
2. - Excitar el colorante presente en la muestra mediante luz pulsada.
3. - Obtener, mediante microscopía de tiempos de vida de fluorescencia, imágenes de la muestra de células de pixeles de ancho e /pixeles de alto.
4. - Generar una matriz de dimensiones (X, Y), donde cada elemento (x, y) contiene el histograma de distribución de tiempos de detección de los fotones recogidos, el cual representa el decaimiento de fluorescencia.
5. -Realizar el ajuste del decaimiento de fluorescencia recogido en cada elemento, (x,y), a un modelo multiexponencial, preferentemente mediante análisis de mínimos cuadrados no lineal.
6. - Generar una matriz, de dimensiones (X, Y'), en la que cada elemento contiene la estimación, a partir del modelo ajustado en la etapa anterior, del tiempo largo del decaimiento de fluorescencia, τ2, del colorante xanténico.
7. - Seleccionar, el conjunto de pixeles de interés para el análisis. En particular se seleccionarán los pixeles correspondientes al citoplasma celular, de una o varias células. 8.- Reconstruir y ajustar el decaimiento de fluorescencia global de la región de interés, en particular del citoplasma celular.
9.- Estimar la concentración total de fosfato mediante las ecuaciones procedentes de un modelo cinético de reacción entre los iones de fosfato y el colorante xanténico.
De forma opcional, para una visualización espacial de los resultados, tras la etapa 6, se puede asociar una escala de color arbitrario a los valores contenidos en la matriz anterior y generar una imagen de forma que cada pixel esté coloreado según el valor del tiempo largo del decaimiento de fluorescencia, τ2, calculado en la etapa 6. La obtención de esta imagen facilita la selección, en la etapa 7, de las regiones de interés para el análisis
Repitiendo el procedimiento en diferentes tiempos o estados celulares, las variaciones en τ2 permiten establecer variaciones en la concentración de iones de las especies de fosfato.
Descripción detallada de cada una de las etapas del procedimiento
1 .- Añadir un colorante xanténico en disolución a la muestra de células
Se añade a la muestra de células una disolución acuosa del colorante xanténico, preferentemente hasta alcanzar una concentración entre 10~5 mol χ L"1 y 10~9 mol χ L"1 , más preferentemente con una concentración de 10~7 mol χ L1. Dado que el colorante xanténico tiene carácter apolar atraviesa de manera espontánea la membrana celular, permaneciendo en el interior de las células mientras dura la recogida de los decaimientos de fluorescencia.
El colorante xanténico utilizado debe tener las siguientes características:
1 ) un único grupo protonable en la estructura xanténica; y
2) que se comporte como una sonda binaria o "ON/OFF", es decir que el tiempo de vida de la especie prototrópica protonada sea inferior a 0.2 nanosegundos. En una realización preferente, el procedimiento utiliza el colorante denominado 2-Me- 4-OMe TG (Urano, Y.; Kamiya, M.; Kanda, K.; Ueno, T.; Hirose, K.; Nagano, T., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4888-4894).
Figure imgf000009_0001
En una realización más preferida, el procedimiento utiliza el colorante 9-(4-ter-butil-2- metoxifenil)-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (denominado 2-OMe-4-fBu GG), que también es objeto de la invención, y que posee una estructura adecuada para proporcionar mayor sensibilidad que 2-Me-4-OMe TG.
Figure imgf000010_0001
(2-OMe-4-fBu GG)
2.- Excitar el colorante presente en la muestra mediante luz pulsada.
La excitación del colorante añadido a la muestra se realizará con una fuente de luz pulsada, cuya radiación sea preferentemente monocromática con una longitud de onda entre 400 y 500 nanometros, con una frecuencia de repetición controlable en el rango de 1 a 20 Mhz y una anchura temporal del pulso preferentemente inferior a 500 picosegundos.
Aunque se puede utilizar cualquier fuente de luz pulsada, de forma preferente se empleará como fuente de excitación una fuente láser, ya que suelen reunir las características de monocromaticidad y estrecha anchura de pulso. La potencia media de la luz pulsada a la entrada del microscopio deberá ser superior a 5 nano-vatios, e inferior a 1 mW para no provocar el deterioro del colorante. También pueden emplearse lámparas de flash, rellenas de gas hidrógeno o nitrógeno, seleccionando la longitud de onda mediante un monocromador. No obstante, la elevada anchura temporal de estos pulsos no los hace preferentes para su aplicación.
3.- Obtener, mediante microscopía de tiempos de vida de fluorescencia, una imagen de la muestra de células de pixeles de ancho e /pixeles de alto,
Los elementos necesarios para llevar a cabo esta etapa son los siguientes: Un espejo dicroico adecuado, que refleje la luz de excitación hacia el interior del microscopio y transmita las longitudes de onda de emisión de fluorescencia del colorante.
Un microscopio confocal, con un objetivo de al menos 6 aumentos y alta apertura numérica, en el que se coloca el espécimen a estudio, junto con un sistema mecánico de escaneo de regiones con resolución en el rango de los micrómetros.
Una lente de focalización de la radiación de fluorescencia que focaliza ésta hacia una apertura confocal de diámetro inferior a 150 μηι.
Un sistema de detección con sensibilidad suficiente para detectar fotones individuales. Ejemplos pueden ser los fotodiodos de avalancha o dispositivos de carga acoplada (CCD).
Un sistema electrónico de correlación temporal, capaz de medir el tiempo transcurrido en la escala de nanosegundos, entre el lanzamiento del pulso láser excitatriz y el evento de detección del fotón (modalidad de contaje de fotones individuales correlacionados en el tiempo, o TCSPC, y de forma preferente mediante la metodología "Time-Tagged-Time-fíesolvecf' ,TTTR).
Se pueden considerar elementos adicionales, que pueden mejorar el rendimiento del procedimiento. Estos elementos pueden ser:
- Una lámina de onda o retardador para cambiar el plano de polarización de la radiación de excitación, anteriormente a la introducción de ésta en el microscopio.
- Filtros de corte o de paso de banda tras el espejo dicroico, antes de la apertura confocal, o antes del sistema de detección, para eliminar radiación espuria no debida a la emisión de fluorescencia.
- Un espejo dicroico tras la apertura confocal para dirigir los fotones emitidos a más de un sistema de detección. Con estos elementos la recolección de la imagen se realiza colocando la muestra de células a analizar, con el colorante xanténico, en el microscopio. La luz pulsada de excitación se dirige mediante los sistemas ópticos a la muestra, enfocándola en una región con células presentes en el vidrio. Mediante el sistema mecánico se escanea un área de entre 20— 10000 μηι2, acompasando el sistema de detección para construir una matriz con una resolución entre 10 y 50 pixeles por μηι2. El tiempo de exposición debe ser el necesario para recoger al menos 100 fotones por píxel. 4.- Generar una matriz de dimensiones (X, Y), donde cada elemento (x, y) contiene el histoqrama de distribución de tiempos de detección de los fotones recogidos, el cual representa el decaimiento de fluorescencia.
En la presente invención, el término "histoqrama" (asociado a un pixel) se refiere a la distribución de los tiempos de llegada de todos los fotones recogidos en un pixel. Es decir, un conjunto de T valores bidimensioanles (t, nt), donde t indica un instante, y n, representa dimensional el número de fotones emitidos en ese instante por la región de la muestra representada, en la imagen obtenida en la etapa 3, por un pixel. Por "Número de fotones por pixel" se entiende el número total de fotones que se recogen para cada pixel.
El número total de fotones recogidos en cada pixel deben de estar correlacionados en el tiempo con respecto al pulso de excitación, mediante el sistema electrónico de TCSPC. Así, se construye una matriz de dimensiones (X, Y) en las que cada elemento (x,y) almacena el histograma temporal de decaimiento de fluorescencia asociado al pixel con coordenadas (x,y) .
La resolución del histograma TCSPC ha de ser como máximo de 400 picosegundos por división del histograma (o canal).
A modo de ejemplo, una imagen de 80 μηι x 80 μηι tomada con una resolución de 512 x 512 píxeles (41 píxeles por μηι2), con un tiempo de exposición de 0.60 ms por pixel, y una resolución de 29 ps por canal en la escala temporal TCSPC. 5.- Estimación de los tiempos de decaimiento de fluorescencia recogidos en cada elemento, (x,v)
Los histogramas individuales asociados a cada pixel de la imagen se ajustan, preferentemente, mediante métodos no lineales a modelos de decaimiento que incluyan entre sus parámetros el tiempo de decaimiento, τ2, del colorante xanténico, que es sensible a la concentración de fosfato en virtud de la reacción de transferencia protónica en el estado excitado. Preferentemente se utilizarán modelos que representen el decaimiento de fluorescencia, w, en forma de funciones multi- exponenciales (suma de varios términos exponenciales) en función del tiempo, t.
El modelo de decaimiento preferido es una función biexponencial de la forma w = Aj X e ' ' + A¿ X e ' + w0 siendo xi un parámetro que representa las contribuciones de tiempo corto al decaimiento de fluorescencia (por ejemplo, la autofluorescencia del interior celular); x2 el parámetro ajustable que representa el tiempo de decaimiento del colorante xanténico que es sensible a la concentración de fosfato en virtud de la reacción de transferencia protónica en el estado excitado; Ai y A2 los parámetros ajustables que representan las abundancias relativas de cada tiempo de decaimiento, y w0 un parámetro ajustable que representa el ruido de fondo.
Para realizar el ajuste se considerará que xi está comprendido entre 0.5 y 2 ns, preferentemente igual a 1 .5 ns.
El ajuste no lineal puede realizarse fundamentalmente por dos metodologías: 1 ) sin tener en cuenta la influencia de la función de respuesta de la luz de excitación (IRF) mediante la aplicación de una ventana temporal; y 2) mediante métodos de deconvolución iterativa, bien establecidos para el análisis de decaimientos de emisión de fluorescencia, donde se tiene en cuenta la convolución de la función del decaimiento exponencial de fluorescencia con la IRF.
La optimización de los parámetros ajustables puede realizarse mediante minimización de mínimos cuadrados, o bien por estimación por máxima verosimilitud (Máximum Likehood Estimator, MLE), siendo esta última preferida cuando el número de fotones por píxel es bajo.
Para conseguir ajustes adecuados, se debe de haber recogido al menos unos 1000 fotones por píxel. Si no se llegara a este valor, en este punto pueden llevarse a cabo dos procedimientos para aumentar el número de fotones por píxel (esto consigue mejores ajustes y por tanto mejores resultados en la estimación de los parámetros de interés): 1 ) se podrá realizar previamente un re-escalado de la imagen acumulando píxeles adyacentes, quedando la matriz en píxeles como (Χ', Υ) (reduciendo la resolución en píxeles por μιτι2, pero aumentando el número de fotones detectados por píxel); y 2) se podrá reducir la resolución de la escala temporal TCSPC, mejorando la estadística del ajuste no lineal (por ejemplo, si la imagen se ha recogido con una resolución de 29 ps/canal, pueden acumularse cuatro canales consecutivos, hasta una resolución de 1 16 ps/canal).
A modo de ejemplo, para este análisis se puede emplear el software SymPhoTime (PicoQuant).
6.- Generar una matriz, de dimensiones (Χ', Υ') en píxeles, en la que cada elemento contiene la estimación del tiempo de vida de fluorescencia largo, τ?, del colorante xanténico.
El parámetro de interés, sensible a la concentración de fosfato es el tiempo de decaimiento definido como τ2. Así, se construirá una nueva matriz, (Χ', Υ'), en la que cada elemento (x',y') contiene el valor del tiempo de decaimiento τ2 obtenido en la etapa anterior. Las dimensiones espaciales de la nueva matriz (Χ', Υ') serán las mismas que las de la matriz original (X, Y), en términos de los μηι2 escaneados. Sin embargo, si se ha procedido al re-escalado de la imagen, juntando píxeles adyacentes (descrito en la etapa anterior), las dimensiones en píxeles de (Χ', Υ') serán menores que (X, Y). Si no se ha realizado re-escalado de la imagen, entonces X' = Xe = Y. 7.- Seleccionar el conjunto de píxeles de interés para el análisis.
En particular, se seleccionarán las regiones de la imagen que correspondan al citoplasma celular, lugar donde se acumulan principalmente los colorantes xanténicos. Esta selección se podrá realizar manualmente o mediante algoritmos matemáticos adecuados. Se puede realizar la selección de la región de interés de células individuales, o simultáneamente de varias células si aparecieran en la imagen.
Para facilitar la selección de las regiones de interés de forma manual y para mejorar la visualización espacial de los resultados, opcionalmente se puede asociar una escala de color arbitrario a los valores contenidos en la matriz obtenida en la etapa 6 y generar una imagen de forma que cada pixel esté coloreado según el valor del tiempo de vida del fluoróforo, τ2, calculado en la etapa 5.
Se denominará a la imagen generada en esta etapa imagen FLIM, por "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy". Para una visualización más realista de la imagen de la matriz (Χ', Υ'), la imagen se modulará en intensidad según el número de fotones detectados en cada píxel. A modo de ejemplo, en la Figura 2 se muestra una imagen FLIM coloreada donde se representa, en una escala de colores arbitraria, el tiempo de decaimiento τ2 del colorante xanténico 2-Me-4-OMe TG en el interior de células de pre- ostoblastos permeabilizadas con α-toxina, para que las concentraciones extracelular e intracelular sean iguales, e inmersas en un medio constituido por buffer PBS a pH 7.35 y diferentes concentraciones añadidas de fosfato.
Altos valores de τ2 (representados en las figuras 2, 4 y 5 por el color blanco) indican baja concentración de fosfato, mientras que bajos valores de τ2 (representados en las figuras 2, 4 y 5 por el color gris oscuro) indica una mayor la concentración de fosfato.
9.- Reconstruir y ajustar el decaimiento de fluorescencia total de la región de interés Una vez seleccionados los píxeles que constituyen la región de interés (citoplasma celular) se reconstruye el decaimiento de fluorescencia total de los fotones detectados en esta región. Este histograma de decaimiento se obtiene mediante la suma aritmética de los histogramas TCSPC individuales asociados a cada uno de los pixeles que contiene la región en la matriz (X, Y) original.
Este decaimiento de fluorescencia total puede ajustarse mediante los métodos de análisis no lineal y deconvolución iterativa descritos anteriormente, para la obtención del valor promedio final de τ2 del colorante xanténico en la región de interés. La presencia del tiempo de decaimiento corto del colorante, Ti , así como la posible contribución de autofluorescencia del citoplasma celular, que usualmente tiene componentes con tiempos de vida cortos, puede minimizarse a través de un análisis retardado en el tiempo (entre 1 y 2 nanosegundos) de la señal fluorescente recogida. 10.- Estimar la concentración total de fosfato mediante las ecuaciones procedentes del modelo cinético de reacción entre los iones de fosfato v el colorante xanténico.
La reacción de transferencia protónica en estado excitado entre las especies del tampón fosfato y los colorantes xanténicos, puede describirse adecuadamente con un modelo cinético de reacción en dos estados excitados. Como se ha comentado previamente, la resolución de estos modelos permite predecir la variación del tiempo de decaimiento de fluorescencia de las sondas mencionadas y relacionarlos con las ecuaciones que se derivan del modelo para obtener de manera precisa y exacta la concentración de fosfato presente en el medio, a cada valor de pH.
Sin embargo, la presencia en el interior celular de un medio acuoso complejo, con diversas proteínas, orgánulos, sales, etc. produce un ligero aumento (entorno a 0.5 nanosegundos) en el tiempo de decaimiento τ2 con respecto a aquel predicho por la teoría, probablemente debido a una mayor protección del colorante al disolvente. No obstante, este efecto no afecta a la variabilidad de este tiempo largo del decaimiento con la concentración de fosfato, ya que el aumento observado es siempre de la misma magnitud (entorno a 0.5 nanosegundos). Así, el parámetro de interés para la estimación de la concentración de fosfato será el incremento del tiempo de decaimiento largo, con respecto a su valor en ausencia de fosfato en el interior celular, τ0. Este incremento del tiempo de decaimiento se notará como Δτ.
La estimación de la concentración total de fosfato en el interior celular se realizará mediante el empleo de la siguiente ecuación:
CFOSFEK
Figure imgf000016_0001
en donde la constante de velocidad para los procesos de desactivación viene dada por 01 y 02 para la especie neutra y aniónica, respectivamente. 21 representa la constante cinética de la disociación unimolecular de la especie neutra a la aniónica, mientras que 12 es la constante de segundo orden para el proceso bimolecular de fe fe
reprotonación del anión. 21 y n son las constantes cinéticas para la transferencia protónica en el estado excitado mediada por las especies del aceptor/dador protónico. Las unidades de τ y Δτ deben expresarse en segundos.
Kfosfato
Ya que el valor de la constante de acidez del fosfato, 3 , es conocida y el valor del pH se mantiene constante, queda como única variable la concentración total de fosfato.
Los valores de las constantes cinéticas de cada colorante se obtienen mediante el análisis global compartimental (GCA) de una superficie de decaimientos de fluorescencia. A modo de ejemplo se muestran los valores de las constantes cinéticas para el 2-Me-4-OMe TG.
Tabla 1. Valores estimados por GCA de las constantes cinéticas del 2-Me-4-OMe TG
Figure imgf000017_0001
Un paso interesante es seguir las variaciones de la concentración de fosfato en el citoplasma en el desarrollo temporal de procesos celulares que alteren las concentraciones intracelulares de fosfato. Para ello, se repetirá el procedimiento en diferentes tiempos o estados celulares, las variaciones en x2 permiten establecer variaciones en la concentración de las distintas especies iónicas de fosfato.
A modo de ejemplo, se ha estudiado mediante esta metodología la cinética de incorporación de fosfato inorgánico en el proceso de diferenciación celular de osteoblastos.
El procedimiento descrito puede ser implementado por medio de ordenadores y procesos ejecutados en tales equipos que a su vez controlen los distintos dispositivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento, por lo que la invención se extiende igualmente a los programas de ordenador, particularmente los programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora, adaptados para llevar a la práctica la invención. El programa puede tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención.
La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Por ejemplo, la portadora podría incluir un medio de almacenamiento, por ejemplo, una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Además, la portadora puede ser una portadora transmisible, por ejemplo, una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Síntesis del nuevo compuesto xanténico
El procedimiento de síntesis del compuesto 9-(4-tert-butil-2-metoxifenil)-6-hidroxi-3H- xanten-3-ona (2-OMe-4-fBu GG), objeto de la presente invención comprende las siguientes etapas:
i) Transformar 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona, I,
Figure imgf000018_0001
en el compuesto con esqueleto xanténico II mediante tratamiento con agua en tubo de alta presión.
Figure imgf000018_0002
II ii) Tratar el compuesto II con cloruro de tert-butildimetilsilano e imidazol en diclorometano para proteger sus dos grupos hidroxilo en forma de TBDMS (tert-butildimetilsilil) derivados y obtener el derivado III.
Figure imgf000018_0003
III iii) Tratar el compuesto V
Figure imgf000019_0001
V con NBS para obtener compuesto IV
Figure imgf000019_0002
IV
iv) Obtención de un reactivo organometálico a partir del compuesto IV.
En una realización preferente, se obtiene litio derivado del compuesto IV por reacción del mismo con butil litio (BuLi, 2.5 M en hexano) usando THF como disolvente.
En otra realización preferente alternativa se obtiene un reactivo de Grignard VI, tratando el compuesto IV con Mg usando como disolvente THF o éter dietílico.
Figure imgf000019_0003
VI v) Hacer reaccionar el compuesto III con el reactivo obtenido en la etapa anterior a partir del compuesto IV. vi) Tratar en ácido fuerte el crudo obtenido en la reacción anterior, para dar el compuesto 2-OMe-4-íBu GG. En una realización particular, la síntesis del compuesto 9-(4-tert-butil-2-metoxifenil)-6- hidroxi-3H-xanten-3-ona, (2-OMe-4-íBu GG), se realizó a partir del compuesto comercial 2,2',4,4'-tetra idroxibenzofenona (I) (0.81 mmol), que se transformó en el compuesto con esqueleto xantenico II mediante tratamiento con agua a una temperatura entre 120 y 180eC, preferentemente a 150eC, en tubo de alta presión (0.68 mmol, 84%). A este compuesto II se le protegió selectivamente sus dos grupos hidroxilo en forma de TBDMS (t-butildimetilsilil) derivados, mediante tratamiento con cloruro de tert-butdimetilsilano (4.08 mmol) e imidazol (6.8 mmol) en dimetilformamida (DMF), para dar el derivado III (0.67 mmol, 99%). El compuesto III se trató posteriormente con el litio derivado del compuesto IV, que se preparó por reacción de IV (1.31 mmol) con butil litio (BuLi, 2.5 M en hexano) usando THF como disolvente. Este compuesto IV se había sintetizado previamente mediante tratamiento del compuesto V (1.27 mmol) con NBS (0.635 mmol), para dar el compuesto IV. (1 .07 mmol, 85%). Finalmente, el crudo de la reacción entre III (0.26 mmol) y el derivado litiado de IV (1.31 mmol) se trata en medio ácido fuerte, preferentemente en HCI a una concentración superior al 1 %, más preferentemente HCI al 36%, para dar el compuesto 2-OMe-4-íBu GG (0.25 mmol, 96%).
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Estimación de la cantidad de fosfato presente en células permeabil izadas
Las células, de cualquier tipo, se cultivan con su correspondiente medio de cultivo sobre portas de microscopio de vidrio, y previamente a las medidas se lavan varias veces con tampón fosfato salino (PBS). A continuación se incuban con el colorante xanténico, α-toxina de Staphylococcus aureus y una disolución reguladora de pH a un valor de pH fijo. Esta α-toxina permeabiliza las células, lo que genera la formación de poros de 1 .5 nm en la membrana celular, permitiendo la difusión de moléculas de bajo peso molecular, como el propio colorante y los iones de la disolución reguladora, hacia el interior celular. Posteriormente se realiza el procedimiento de la invención, explicado anteriormente. El método requiere de un experimento de referencia para calcular el tiempo de vida de fluorescencia del colorante xanténico en el interior celular en ausencia de fosfato añadido (únicamente con el fosfato que contiene la disolución de PBS). Para ello, las células sin permeabilizar se incuban con PBS y el colorante, obteniéndose, en estas condiciones, el valor de tiempo de vida de referencia (x0). Este x0 es el que se emplea para el cálculo de los incrementos de tiempo de vida (Δχ) que mediante la ecuación descrita anteriormente, permite el cálculo de la concentración de fosfato: A modo de realización concreta de este aspecto se han llevado a cabo medidas en células de ovario de rata china (CHO-K1 ; ATCC No. CCL-61 ) y una línea de células de pre-osteoblastos (MC3T3-E1 ; ECACC 99072810). Las células (CHO-K1 y MC3T3-E1 ) se cultivaron con sus correspondientes medios de cultivo en portas de vidrio de microscopía. El medio de cultivo de las células CHO-K1 estaba compuesto de medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) suplementado con 10% suero de bovino fetal (FBS), 2 mmolxL-1 glutamina, 100 UxmL-1 penicilina y 0.1 μςχηιί"1 estreptomicina; y el medio de las células MC3T3-E1 lo formaba el medio de cultivo aMEM (alpha Mínimum Essential Médium) suplementado con 10 % FBS, y 1 % de penicilina-estreptomicina. Ambas células se cultivaron en un incubador a 37eC y 5% de C02.
Previamente a las medidas de microscopía, las células se lavaron dos veces con PBS y se realizó la incubación durante 15 minutos a 37eC con 2 μςχηιί"1 de α-toxina en un buffer de permeabilización compuesto de 20 mmolxL-1 MOPS potásico pH 7.0, 250 mmolxL-1 manitol, 1 mmolxL-1 sal potásica de ATP, 3 mmolxL-1 MgCI2 y 5 mmolxL-1 sal potásica de glutatión. Para demostrar la posibilidad de medir diferentes concentraciones de fosfato en el interior celular, durante la permeabilización de las células éstas se incubaron también con el colorante 2-Me-4-OMe TG 10~7 molxL-1 y con disoluciones buffer de fosfato a pH 7.35 y diferentes concentraciones de fosfato (intervalo 0-150 mmolxL-1). Antes de su uso, todas las disoluciones se pasaron a través de filtros con poros de 0.02 μηι (Whatman).
Para la obtención de las imágenes de tiempos de vida de fluorescencia se utilizó el sistema de microscopía de tiempos de vida de fluorescencia MicroTime200 (PicoQuant GmbH). La fuente de excitación fue un láser pulsado LDH con una longitud de onda de excitación de 470 nm. Se utilizó una frecuencia de 20 MHz y una intensidad (a la entrada del microscopio) entre 230 y 450 nW. Después de pasar por una lámina λ/4, la luz se dirige desde un espejo dicroico (510dcxr) hacia el objetivo de inmersión (AN: 1 .4; 100x) de un microscopio invertido IX-71 (Olympus) que enfoca la luz hacia la muestra y recoge la fluorescencia que posteriormente atraviesa un filtro HP500LP (AHF/Chroma) y se enfoca sobre la apertura confocal de 75 μηι. Finalmente atraviesa un divisor 50/50 que divide la señal en dos haces de luz que son enfocados en sendos detectores fotomultiplicadores SPCM-AQR-14 (Perkin Elmer). La recogida de datos se realizó con el módulo de contaje de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC) TimeHarp 200 (PicoQuant), usando la metodología "Time-Tagged-Time-Resolved" (TTTR) que permite reconstruir los histogramas de tiempos de vida. Las imágenes de 80 μηι x 80 μηι se adquirieron con una resolución de 512 x 512 píxeles, con un tiempo de exposición de 0.60 ms por píxel, y una resolución de 29 ps por canal en la escala temporal TCSPC.
Para el análisis de datos, se utilizó el software Symphotime (PicoQuant). Para la obtención de las imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM), se reconstruyó un IRF teórico a partir de una medida a alta concentración de fluoróforo, que fue empleado para analizar el decaimiento de la imagen completa. Todos los decaimientos fueron ajustados aplicando la estimación por máxima verosimilitud (MLE) que permite obtener parámetros correctos a pesar de una baja intensidad de señal, para lo cual se adoptó un modelo biexponencial con un tiempo fijo de 1 .5 ns y otro variable que osciló entre 3.6 y 4.5 ns. Con estos datos, y realizando uniones de 5x5 pixeles y de 4 canales temporales para obtener un número de cuentas más elevado por pixel, se obtuvieron las imágenes de tiempo de vida de fluorescencia. Una vez obtenidas estas imágenes, se seleccionaron los pixeles ubicados en el citoplasma celular para recuperar los decaimientos. El ajuste de las curvas de decaimiento se llevó a cabo mediante un análisis de cola (tailfit) (dejando fuera los primeros 1 .5 ns) utilizando un modelo biexponencial con un tiempo fijo a 1 .5 ns y el segundo tiempo, dependiente de la concentración de fosfato soluble en el citoplasma, variable. Este tiempo de vida variable es el que, conociendo el valor del tiempo de vida del colorante de referencia (τ0), y empleando la ecuación anteriormente descrita, proporciona la concentración de fosfato en el citoplasma celular. Medida de la captación de fosfato soluble durante la diferenciación de osteoblastos
Dada la capacidad de estos colorantes como sensores de la concentración de fosfato soluble intracelular, también se pueden utilizar para seguir, a tiempo real, la captación de fosfato por osteoblastos en su fase de diferenciación. En este caso, los pre- osteoblastos se incuban durante 15 minutos con el colorante xanténico en PBS a diferentes tiempos de su diferenciación celular, y tras la realización del procedimiento de esta invención se miden los cambios en el tiempo de vida de fluorescencia del colorante en el citoplasma, y por tanto se detecta el aumento de la concentración de ion fosfato en el interior celular tras su captación durante la fase de diferenciación.
Para la demostración de esta aplicación del procedimiento de esta invención se ha seguido la penetración de fosfato en una línea celular de pre-osteoblastos MC3T3-E1 , que es un modelo bien establecido de diferenciación de osteoblastos. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que la adición única de fosfato a concentraciones entre 4 y 10 mM, incluso en ausencia de ácido ascórbico (AA, un cofactor crítico requerido para la producción de colágeno), reduce el periodo de pre-mineralización a 2 días en las células MC3T3-E1 . La utilidad de estas sondas en la detección intracelular del fosfato soluble en el periodo de diferenciación de pre-osteoblastos se ha demostrado añadiendo 2-Me-4-OMe TG 10~7 M a un medio formado por tampón PBS, e incubando las células MC3T3-E1 con este medio durante 15 minutos. Esta metodología se realizó sacando las células MC3T3-E1 de su correspondiente medio de diferenciación (compuesto de medio aMEM suplementado con 10% FBS, 3 mmolxL-1 fosfato, 50 μgxμL"1 AA y 10 mmolxL-1 β-glicerofosfato (βΘΡ) para inducir una mineralización rápida), desde un tiempo 0 hasta 60 horas de diferenciación, y lavándolas con PBS previamente a la incubación con el colorante y a las medidas de microscopía.
Como control de células que no captan fosfato del medio extracelular, se llevó a cabo la misma metodología con células CHO sin permeabilizar con α-toxina, y se aplicó el mismo procedimiento de la invención. Los resultados obtenidos se exponen en la Figura 3, en donde se muestran los tiempos de decaimiento de fluorescencia de 2-Me-4-OMe TG en el interior de ambos tipos de células a diferentes tiempos de incubación en el medio de diferenciación anteriormente citado. Como se puede observar, en el interior de pre-osteoblastos MC3T3-E1 el tiempo de decaimiento de la sonda decae durante las primeras 24 horas aproximadamente, y después de ese tiempo permanece constante. Al mismo tiempo, el tiempo de decaimiento permanece constante en el interior de las células CHO ya que estas no son permeables al anión fosfato en ausencia de α-toxina. En la Figura 4 se muestran imágenes FLIM en el interior de las células CHO y en la Figura 5 imágenes FLIM en el interior de las MC3T3-E1 . En ambos casos se asignó a cada pixel, una escala arbitraria de color proporcional a los tiempos del decaimiento de fluorescencia.
Además, como indicador de la diferenciación de las células de osteoblastos, se empleó el ensayo de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en el medio extracelular de cultivo. Los resultados de este ensayo mostraron un aumento del nivel de ALP en el medio extracelular (cuadrados en la Figura 3), paralelo y en concordancia con el incremento de la captación de fosfato en el citoplasma de las células de osteoblastos.
El conjunto de resultados recuperados muestra que las sondas empleadas y el procedimiento propuesto en esta invención permiten la detección del ion fosfato solubilizado en el interior de células vivas, por lo que permite analizar, por un lado las alteraciones en la homeostasis del fosfato, es decir, el efecto que producen distintas afecciones celulares al flujo de fosfato y, por otro lado, el efecto que puedan causar distintos principios activos sobre la captación de fosfato por parte de células especializadas (osteoblastos).
Otras consideraciones
En todos los ejemplos referidos anteriormente se puede sustituir el 2-Me-4-OMe TG por otros colorantes con las características adecuadas.
En concreto, todos los experimentos descritos se han llevado a cabo también empleando el colorante 9-(4-ter-butil-2-metoxifenil)-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (2-OMe- 4-fBu GG) como sonda de fosfato.
A modo de ejemplo se muestran los resultados obtenidos con este colorante en la Figura 6.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Procedimiento de estimación de la concentración de fosfatos presente en células vivas a través de la medición del tiempo de decaimiento de fluorescencia de un colorante xanténico añadido a las células y sometido a una excitación mediante luz láser pulsada.
2. - Procedimiento según reivindicación anterior, que comprende las siguientes etapas: i) Añadir un colorante xanténico en disolución a la muestra de células.
ii) Excitar el colorante presente en la muestra mediante luz pulsada.
iii) Obtener, mediante microscopía de tiempos de vida de fluorescencia, una imagen de la muestra de células de pixeles de ancho e y pixeles de alto. iv) Generar una matriz de dimensiones (X, Y), donde cada elemento (x,y) contiene el número de fotones detectados y el histograma de distribución de tiempos de detección de cada fotón individual que representa el decaimiento de fluorescencia.
v) Realizar el ajuste a una función multiexponencial de los decaimientos de fluorescencia recogidos en cada elemento, (x,y),
vi) Generar una matriz, de dimensiones (X, Y), en la que cada elemento contiene la estimación, a partir del modelo ajustado en la etapa anterior, del tiempo de vida de fluorescencia largo, τ2, del colorante xanténico. vii) Seleccionar el conjunto de pixeles de interés para el análisis, preferentemente los pixeles correspondientes al citoplasma celular, de una o varias células.
viii) Reconstruir y ajustar el decaimiento de fluorescencia global de la región de interés, en particular del citoplasma celular,
ix) Estimar la concentración total de fosfato mediante las ecuaciones procedentes de un modelo cinético de reacción entre los iones de fosfato y el colorante xanténico.
3. - Procedimiento según reivindicación anterior, caracterizado porque el colorante xanténico se añade en disolución acuosa hasta alcanzar una concentración entre 10~5 mol x L"1 y 10~9 mol χ L"1 , preferentemente una concentración de 10~7 mol χ L~1.
4. - Procedimiento según reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque la luz pulsada utilizada en la etapa ii) tiene una radiación monocromática con una longitud de onda entre 400 y 500 nanometros, una frecuencia de repetición controlable en el rango de 1 a 20 Mhz y una anchura temporal del pulso preferentemente inferior a 500 picosegundos.
5. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque los decaimientos se ajustan, en la etapa v), a un modelo de decaimiento no lineal, preferentemente mediante la función
w = Afe→/r' + A2-e~t/T2 + w0
siendo τ un parámetro que representa las contribuciones de tiempo corto al decaimiento de fluorescencia; x2 representa el tiempo de decaimiento del colorante xanténico que es sensible a la concentración de fosfato; A y A2 los parámetros ajustables que representan las abundancias relativas de cada tiempo de decaimiento, y w0 un parámetro ajustable que representa el ruido de fondo.
6. - Procedimiento según reivindicación anterior, caracterizado porque el ajuste se realiza suponiendo que τ = 1 .5 ns.
7. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que además comprende, tras la etapa vi), una etapa en la que se asocia una escala de color arbitrario a los valores contenidos en la matriz anterior para generar una imagen de forma que cada pixel esté coloreado según el valor del tiempo de vida del colorante xanténico, x2, calculado en la etapa vi)
8. - Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el colorante xanténico utilizado es 2-Me-4-OMe TG
Figure imgf000026_0001
(2-Me-4-OMe TG)
9.- Colorante Xanténico 9-(4-ter-butil-2-metoxifenil)-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona de fórmula 2-OMe-4-íBu GG.
Figure imgf000027_0001
(2-OMe-4-fBu GG)
10.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el colorante xanténico utilizado es el colorante 2-OMe-4-íBu GG.
1 1 .- Programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 10.
12.- Programa de ordenador de acuerdo con la reivindicación 1 1 , que está incorporado en unos medios de almacenamiento.
13.- Programa de ordenador de acuerdo con la reivindicación 1 1 , que esta soportado en una señal portadora.
14.- Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG, que comprende las siguientes etapas:
i) Transformar 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona, I,
Figure imgf000027_0002
en el compuesto con esqueleto xanténico II mediante tratamiento con agua en tubo de alta presión.
Figure imgf000028_0001
Tratar el compuesto II con cloruro de tert-butildimetilsilano e imidazol en diclorometano para proteger sus dos grupos hidroxilo en forma de TBDMS (tert-butildimetilsilil) derivados y obtener el derivado III.
Figure imgf000028_0002
iii) Tratar el compuesto V
Figure imgf000028_0003
con NBS para obtener compuesto IV
Figure imgf000028_0004
IV
Obtener un reactivo organometálico a partir del compuesto IV.
Hacer reaccionar el compuesto III con el reactivo organometálico obtenido en la etapa anterior.
Tratar en ácido fuerte el crudo de la reacción entre III y reactivo
organometálico obtenido en la etapa anterior para obtener el compuesto 2- OMe-4-fBu GG.
15.- Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG según reivindicación anterior en la que el reactivo organometálico es el litio derivado del compuesto IV obtenido por reacción del mismo con butil litio y usando THF como disolvente.
16.- Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-tBu GG según reivindicación anterior en la que el reactivo organometálico es un reactivo de Grignard VI,
Figure imgf000029_0001
obtenido al tratar el compuesto IV con Mg usando como disolvente THF o éter dietílico.
17. - Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque el agua usada en la etapa i) se encuentra a una temperatura entre 120 y 180eC, preferentemente 150eC.
18. - Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 17, caracterizado porque el butil litio empleado en la etapa iv) es BuLi, en cualquier concentración y disolvente habitual de uso, preferentemente 2.5 M.
19. - Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG según reivindicación 16, caracterizado porque el disolvente empleado en la generación del reactivo de Grignard VI es THF o éter dietílico.
20. - Procedimiento de síntesis del compuesto 2-OMe-4-íBu GG según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado porque el medio ácido fuerte usado en la etapa vi) es HCI a cualquier concentración superior al 1 %, preferentemente al 36%.
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