WO2014162102A1 - Nouvelle cible de mycobacterium tuberculosis et son utilisation dans le criblage de medicaments contre la tuberculose - Google Patents

Nouvelle cible de mycobacterium tuberculosis et son utilisation dans le criblage de medicaments contre la tuberculose Download PDF

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Olivier Neyrolles
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a novel target of Mycobacterium tuberculosis and its use in the screening of drugs against tuberculosis, more specifically relates to a recombinant Mycobacterium tuberculosis asparaginase, an inhibitor of said protein, and a screening method for selecting said inhibitor.
  • the present invention also provides a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis.
  • Tuberculosis an infectious disease caused primarily by Mycobacterium tuberculosis, is responsible for nearly 1.5 million deaths each year worldwide and an estimated one-third of the world's population is infected.
  • the current treatment consists of quadritherapy (isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol) for two months, followed by dual therapy (isoniazid, rifampicin) for 4 months. This treatment is therefore long and binding.
  • it is only suitable for the treatment of tuberculosis caused by strains sensitive to antibiotics.
  • the emergence of multi-resistant and extremely resistant strains has forced the public health authorities to implement a reinforced treatment including second-line antibiotics (aminoglycosides, floroquinolones, etc.).
  • RNA polymerases Kim et al., 2011, Nucleic Acid Research, Vol 39, No.6
  • enzymes involved in the synthesis of the envelope of bacteria or the growth of bacteria such as the ESX-3 protein which is responsible for the acquisition of iron and zinc by bacteria (Serafmi et al., 2009, J. Bacteriol, 191, 6340- 6344) , or the CarD protein that controls rRNA transcription (Stallings et al., 2009, Cell, 138, 146-159).
  • An asparaginase is able to hydrolyze asparagine to aspartate and ammonium, allowing bacteria to use asparagine as a source of nitrogen and carbon.
  • the present invention is based on the finding for the first time made by the inventors that the AnsA enzyme of Mycobacterium tuberculosis is required for the colonization of the lung by these bacteria and that the inactivation of this enzyme makes it possible to attenuate these bacteria.
  • AnsA has no homologue in humans, which allows this gene and the protein encoded by this gene to become a specific target for developing new antibiotics.
  • the subject of the present invention is a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis wherein the activity of asparaginase is absent or reduced.
  • the present invention relates to a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis whose virulence is lower than that of the corresponding wild-type strain, the ansA gene represented by the sequence SEQ ID NO: 2 being inactivated or the expression of the protein encoded by the ansA gene represented by by the sequence SEQ ID NO: 2 being inactivated in said mutant strain.
  • a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis whose virulence is lower than that of the wild strain is meant a strain inducing a pulmonary bacterial load significantly lower than that induced by the wild strain in the mouse after 3 weeks of infection.
  • a value is considered significant when the P value is less than 0.05 according to Student's statistical test (t-test).
  • the expression "the ansA gene ... being inactivated” means that a mutation, deletion or insertion of one or more nucleotides is present inside the gene.
  • the inactivation of the ans A gene can be carried out by all the mutagenesis methods known in the prior art, in particular by the insertion of a transposon, by homologous recombination or by phage-based approach.
  • the ansA gene is interrupted, modified or deleted and the transcription of the A-messenger RNA does not take place or can not succeed.
  • the AnsA protein is not expressed in Mycobacterium tuberculosis, while the ansA gene is intact in the genome of said bacterium.
  • the expression of the protein ... being inactivated is meant that the messenger RNA of the ansA gene is inactivated or destabilized, by a post-transcriptional regulation of the messenger RNA, or that a truncated protein or non-functional is produced or that the correctly translated protein is destabilized by post-translational regulation, for example proteolysis.
  • Post-transcriptional regulation can be performed by the technique such as siRNA, miRNA or antisense RNA.
  • sequence SEQ ID NO: 2 encodes the natural asparaginase of Mycobacterium tuberculosis represented by the sequence SEQ ID NO: 3.
  • Ans A is not a protein essential to the life of the bacterium, it participates only in its virulence. Consequently, the inactivation of this protein makes it possible to reduce the number of resistant mutants that can appear (lower selection pressure) and to facilitate the elimination of the pathogen by the immune system.
  • the virulence of the mutant strain of Mycobacterium tuberculosis is determined by intranasal mouse infection and measurement of the pulmonary bacterial load at different times after infection.
  • the pulmonary bacterial load is measured by spreading on agar medium.
  • the ansA gene represented by the sequence SEQ ID NO: 2 is deleted from the genome of said mutant strain.
  • said deletion of the gene can be obtained, for example, by homologous recombination.
  • said mutant strain of Mycobacterium tuberculosis is the strain deposited at the CNCM on March 21, 2013 under the number: CNCM 1-4724.
  • the ans A gene represented by the sequence SEQ ID NO: 2 is present in the genome of said mutant strain, but inactivated.
  • This inactivation may be due to a modification or interruption of the gene, by way of example a transposon or a PCR-directed mutagenesis.
  • the present invention also aims to provide an immunogenic composition comprising a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis mentioned above.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active substance, a mutant strain of Mycobacterium tuberculosis mentioned above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the said pharmaceutical composition may be used in the treatment or prevention of tuberculosis, especially tuberculosis related to the infection of Mycobacterium tuberculosis.
  • said pharmaceutical composition is a vaccine composition against tuberculosis.
  • said pharmaceutical or vaccine composition comprises a mutant strain deposited on March 21, 2013 under the number CNCM I-4724.
  • Said pharmaceutical or vaccine composition may be a solution at neutral pH, especially pH 7.0 to 8.0, especially pH 7.4 to 7.6.
  • Said pharmaceutical or vaccine composition may be in freeze-dried powder.
  • the solution is prepared just before administration.
  • Said pharmaceutical or vaccine composition should be administered at a dose to cause a protective immune response against tuberculosis without development of said disease.
  • the administrable dose of said pharmaceutical or vaccine composition is a unit dose of 10 e5 to 10 e6 CFUs according to the age of the person to be vaccinated.
  • the present invention also relates to a kit containing a pharmaceutical composition mentioned above and a known antibiotic in the treatment of tuberculosis.
  • a kit according to the present invention comprises:
  • an antibiotic selected from ethambutol, isoniazid, pyrazinamide rifampicin, p-aminosalicylic acid, amikacin, kanamycin, capreomycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, ethionamide, rifabutin,
  • tuberculosis as a combination product for simultaneous, separate or time-course use for the prevention and / or treatment of tuberculosis, especially Tuberculosis associated with infection of Mycobacterium tuberculosis.
  • a kit according to the present invention comprises: a pharmaceutical or vaccine composition comprising the mutant strain deposited at the CNCM under number CNCM 1-4724 on March 21, 2013, and an antibiotic selected from ethambutol, isoniazid, pyrazinamiden rifampicin, p-aminosalicylic acid, amikacin, kanamycin, capreomycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, ethionamide, rifabutin
  • tuberculosis as a combination product for simultaneous use, separate or spread over time, for the prevention and / or treatment of tuberculosis, especially Tuberculosis associated with the infection of Mycobacterium tuberculosis.
  • the present invention also aims to provide a recombinant asparaginase of Mycobacterium tuberculosis.
  • the present invention relates to a recombinant protein represented by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • Said recombinant protein comprises a His6 tag allowing the purification of said protein by a purification column, such as a Ni-NTA column, and its micoscopic monitoring using an anti-HIS6 antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a method of screening for an inhibitor of M. tuberculosis asparaginase represented by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ -asparaginase recombinant protein of the present invention in particular the recombinant protein of the sequence SEQ ID NO: 1, makes it possible to implement the method of screening for the inhibitor of this protein in high-throughput assays.
  • the screening method of the present invention comprises: (i) bringing the recombinant protein of sequence SEQ ID NO: 1 into contact with asparagine in a reaction solution in the presence of a molecule derived from a bank of chemical molecules,
  • the activity of said recombinant protein in the presence of said molecule is less than that in the absence of said molecule.
  • the reaction solution used in said method may be the Nessler reagent.
  • inhibitor of asparaginase a biological or chemical molecule for inhibiting the hydrolysis of asparaginase to aspartate.
  • such a biological inhibitor may be a polyclonal or monoclonal antibody directed against the recombinant protein represented by the sequence SEQ ID NO: 1, a siRNA, a miRNA or an antisense oligonucleotide inhibiting the transcription of the gene encoding said protein.
  • a polyclonal or monoclonal antibody can be obtained by the methods of producing antibodies known in the prior art.
  • a polyclonal antibody can be obtained by immunization of a rabbit or a goat with the purified SEQ ID NO: 1 protein.
  • the proper immunization dose can be determined by routine experiments.
  • the protein of sequence SEQ ID NO: 1 may be administered with an immunizing adjuvant, such as Freund's adjuvant, to optimize the immune response.
  • a monoclonal antibody can be obtained by the construction of a hybridoma, which is the fusion of the secretory lymphocyte of an antibody directed against the protein of sequence SEQ ID NO: 1 having served for the immunization of the animal with a cell of myeloma.
  • said inhibitor according to the invention is an antibody and directed against the asparaginase of Mycobacterin tubercidosis.
  • a chemical inhibitor may be a molecule derived from screening in a library of molecules.
  • Another object of the present invention is a product containing an inhibitor of the protein of the sequence SEQ ID NO: 1 or the Asparaginase of Mycobacterium taberculosis and a known antibiotic for the treatment of tuberculosis as a combination product.
  • kit of the invention comprises:
  • an antibiotic selected from ethambutol, isoniazid, pyrazinamiden rifampicin, p-aminosalicylic acid, amikacin, kanamycin, capreomycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, ethionamide, rifabutin,
  • tuberculosis as a combination product for simultaneous, separate or time-course use for the prevention and / or treatment of tuberculosis, especially Tuberculosis associated with infection of Mycobacterium tuberculosis.
  • Figure 1 illustrates the construction of the mutant strain deposited at the CNCM March 21, 2013 under the number number CNCM 1-4724.
  • Figure 2 illustrates the expression of the protein sequence SEQ ID NO: 1 (Mycobacterium tuberculosis asparaginase) in Mycobacterium smegmatis (non-pathogenic) via the plasmid pVV16.
  • the expression of recombinant asparaginase is detected by the "western blot” test.
  • the empty plasmid pVV16 is used as a negative control.
  • F 40 o corresponds to the purified AnsA fraction.
  • "L” is the total bacterial lysate.
  • Figure 3 Figures 3A and 3B illustrate the activity of recombinant asparaginase in purified fractions F 40 o.
  • Figure 3A shows the disappearance of NADPH in the presence of asparagine and recombinant asparaginase (the line comprising the lozenges).
  • a sample containing the plasmid pVV16 and asparagine (the dot line), a sample containing only the recombinant asparaginase (the line containing the squares) and a sample containing only the plasmid pVV16 (the line comprising the triangles) are respectively used as a control.
  • Figure 3B confirms that recombinant asparaginase does not have glutaminase activity (dot line).
  • a sample containing asparaginase Recombinant and 50nM asparagine (the line containing the lozenges) and a sample containing asparaginase and 50nM glutamine (the line containing the triangles) are used as a control, respectively.
  • FIG. 4 shows that the M. tuberculosis mutant inactivated in the ansA (ansA Ko) gene does not develop in vitro in the presence of asparagine as sole source of nitrogen, whereas the wild-type strain (wt) is multiplies. Bacterial growth is quantified by measuring turbidity (Me Farland units) over time (in days)
  • FIG. 5 shows that at 21 days and 42 days after infection the mutant of M. tuberculosis inactivated in the gene encoding AnsA (black column) is present in an amount (measured in CFUs) 30 times less in the lungs of infected mice, relative to the wild-type (blank column) or the "complemented" mutant strain in which a copy of the gene encoding AnsA was re-introduced (column in gray).
  • Mycobacterhim smegmatis (MC2 strain 155) and Mycobacterhim tuberculosis (H37Rv) are cultured in 7H9 liquid medium (Middlebrook) + 10% ADC (albumin, dextrose, catalase, Middlebrook) supplemented with 0.05% final Tween 80 or solid on medium.
  • 7H11 (Middlebrook) + OADC 10% (oleic acid, albumin, dextrose, catalase, Middlebrook) at 37 ° C.
  • kanamycin 50 ⁇ g / ml
  • zeomycin 25 ⁇ g / ml
  • streptomycin 25 ⁇ l / ml
  • Protein extraction and purification of AnsA Products used: lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8); wash buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole pH8); elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 400mM imidazole pH8).
  • lysis buffer 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8
  • wash buffer 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole pH8
  • elution buffer 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 400mM imidazole pH8.
  • the different samples are denatured after adding an agent containing sodium dodecylsulfate and dithiothreitol (NuPAGE, LDS Sample Buffer 4X and Reducing Agent 10X) SDS) and heated for 5 min at 95 ° C.
  • the extracts are deposited on a 12% SDS-PAGE gel of acrylamide.
  • the proteins are separated by migration at 200 mV before being transferred to a nitrocellulose membrane. After saturation 1H in PBS / Tween 20 (0.1%) / milk (5%), the membrane is incubated overnight at 4 ° C. with the antibody a primary directed against Tag His6 (product in rabbits, eBioscience).
  • the membrane is incubated for 1 h with the secondary antibody (product in the donkey, GE Healthcare) directed against the primary antibody and coupled to the HRP ( Horseradish Peroxidase).
  • HRP Horseradish Peroxidase
  • the disappearance of NADHP is determined by optical measurement.
  • the enzymatic test is carried out as soon as the purification is complete, each purification experiment makes it possible to carry out 3 enzymatic tests.
  • Enzymatic kinetics are performed and the activity is given by measuring the decrease in absorbance at 340 nm corresponding to the disappearance of NADPH over time with the spectrophotometer ⁇ Safas monaco me 2 >>;"SAFAS SP 2000" software for measuring at 10 second intervals.
  • the miniaturization of asparaginase activity assays is carried out and the AnsA protein is produced in Escherichia Coli and the purified fractions of the AnsA protein are 96-well plate After the addition of 50 mM asparagine, the asparaginase activity is measured end-point by spectrocolorimetry (520 nm) after addition of Nessler's reagent, which makes it possible to form a colored complex with the liberated ammonium ions. Molecules coming from chemical libraries are then added to the reaction medium in order to identify those which make it possible to inhibit the Asparaginase activity of AnsA.
  • mice 6 to 8 weeks old were anesthetized with a ketamine cocktail (100 mg / kg, Merial) and xylasin (15 mg / kg, Bayer) and were intranasally infected with 500 CFUs (forming colonies). units) of the different strains tested with 25 ⁇ l of DPBS / 0.01% Tween 80.
  • a ketamine cocktail 100 mg / kg, Merial
  • xylasin 15 mg / kg, Bayer
  • the western blot shows that the recombinant asparaginase of the sequence SEQ ID NO: was well expressed in Mycobacterhim smegmatis (FIG. 2).
  • This recombinant asparaginase has asparaginase activity for hydrolyzing asparagine (FIG. 3A).
  • This same protein has no glutaminase activity (Figure 3B).

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle cible de Mycobacterium tuberculosis et son utilisation dans le criblage de médicaments contre la tuberculose, plus précisément concerne une asparaginase recombinante de Mycobacterium tuberculosis, un inhibiteur de ladite protéine, ainsi qu'une méthode de criblage pour sélectionner ledit inhibiteur. La présente invention propose également une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis.

Description

NOUVELLE CIBLE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ET SON UTILISATION DANS LE CRIBLAGE
DE MEDICAMENTS CONTRE LA TUBERCULOSE
La présente invention concerne une nouvelle cible de Mycobacterium tuberculosis et son utilisation dans le criblage de médicaments contre la tuberculose, plus précisément concerne une asparaginase recombinante de Mycobacterium tuberculosis, un inhibiteur de ladite protéine, ainsi qu'une méthode de criblage pour sélectionner ledit inhibiteur. La présente invention propose également une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis.
La tuberculose, maladie infectieuse causée principalement par Mycobacterium tuberculosis, est responsable de près de 1,5 millions de décès chaque année dans le monde et on estime qu'un tiers de la population mondiale est infecté. Le traitement actuel consiste en une quadrithérapie (isoniazide, rifampicine, pyrazinamide, ethambutol) pendant deux mois, suivi d'une bithérapie (isoniazide, rifampicine) pendant 4 mois. Ce traitement est donc long et contraignant. Par ailleurs, il n'est adapté qu'au traitement des tuberculoses dues à des souches sensibles aux antibiotiques. L'émergence de souches multi-résistantes et extrêmement résistantes a obligé les autorités de santé publique à implémenter un traitement renforcé incluant des antibiotiques de seconde intention (aminoglycosides, floroquinolones etc).
Cette lourdeur du traitement et l'émergence de souches résistantes obligent au développement de nouveaux antibiotiques contre la tuberculose, dirigés contre de nouvelles cibles.
Les cibles connues des molécules antituberculeuses sont nombreuses, par exemple les ribosomes, notamment les ARN polymérases (Kim et al., 2011, Nucleic Acid Research, vol. 39, No.6), ainsi que des enzymes impliquées dans la synthèse de composés de l'enveloppe des bactéries ou la croissance des bactéries, tels que la protéine ESX-3 qui est responsable de l'acquisition de fer et de zinc par des bactéries (Serafmi et al, 2009, J. Bacteriol, 191, 6340- 6344), ou la protéine CarD qui contrôle la transcription d'ARNr (Stallings et al., 2009, Cell, 138, 146-159).
Cependant, les antibiotiques visant ces cibles exigent des polythérapies très longues (6-8 mois dans le meilleur des cas).
II est nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques car des souches résistantes aux antibiotiques couramment utilisés apparaissent (mutées sur les gènes cibles de ces antibiotiques). Par conséquent, il est nécessaire et urgent d'identifier de nouvelles cibles antituberculeuses chez M. tuberculosis et de développer des antibiotiques agissant spécifiquement sur ces cibles, seuls ou en combinaison avec les antibiotiques existants.
Une asparaginase est capable d'hydrolyser l'asparagine en aspartate et ammonium, ce qui permet aux bactéries d'utiliser l'asparagine comme source d'azote et de carbone.
Bien que la séquence de l'enzyme Ans A chez Mycobacterium tuberculosis soit connue (AnsA/Rvl538c (TubercuList), Malen et al, 2010, BMC Microbiol. 10: 132) et qu'elle soit annotée comme étant une asparaginase, aucun travaux scientifique antérieur permet de montrer la présence effective d'une asparaginase chez Mycobacterium tuberculosis et l'activité enzymatique de la protéine prédictive Rvl538c.
La présente invention repose sur la constatation pour la première fois faite par les Inventeurs que l'enzyme AnsA de Mycobacterium tuberculosis est requise pour la colonisation du poumon par ces bactéries et que l'inactivation de cette enzyme permet d'atténuer ces bactéries. Par ailleurs, AnsA n'a pas d'homologue chez l'homme, ce qui permet à ce gène ainsi que la protéine codée par ce gène de devenir une cible spécifique pour développer de nouveaux antibiotiques.
La présente invention a pour objet une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis dans laquelle l'activité de l'asparaginase est absente ou réduite.
La présente invention concerne une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis dont la virulence est inférieure à celle de la souche sauvage correspondante, le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 étant inactivé ou l'expression de la protéine codée par le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 étant inactivée dans ladite souche mutante.
On entend par « une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis dont la virulence est inférieure à celle de la souche sauvage » une souche induisant une charge bactérienne pulmonaire significativement plus faible que celle induite par la souche sauvage chez la souris après 3 semaines d'infection.
Une valeur est considérée comme étant significative lorsque la valeur P est inférieure à 0.05 selon le test statistique de Student (test t).
On entend par l'expression « le gène ansA... étant inactivé » le fait qu'une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides est présente à l'intérieur du gène ansA représenté par SEQ ID NO : 2 et qu'elle inhibe la transcription de l'ARN messager dudit gène.
L'inactivation du gène ans A peut être mise en œuvre par toutes les méthodes de mutagenèse connues dans l'art antérieur, notamment par l'insertion d'un transposon, par la recombinaison homologue ou par approche utilisant des phages
Dans ce mode de réalisation, le gène ansA est interrompu, modifié ou supprimé et la transcription de l'ARN messager de ans A n'a pas lieu ou ne peut pas aboutir.
Dans un autre mode de réalisation, la protéine AnsA n'est pas exprimée chez Mycobacterium tuberculosis, alors que le gène ansA est intact dans le génome de ladite bactérie.
On entend par « l'expression de la protéine... étant inactivée » le fait que l'ARN messager du gène ansA est inactivé ou déstabilisé, par une régulation post-transcriptionnelle de l'ARN messager, ou qu'une protéine tronquée ou non fonctionnelle est produite ou que la protéine correctement traduite est déstabilisée par une régulation post-traductionnelle, par exemple la protéolyse.
Une régulation post-transcriptionnelle peut être effectuée par la technique telle que siARN, miARN ou ARN antisens.
Le gène de séquence SEQ ID NO : 2 code l'asparaginase naturelle de Mycobacterium tuberculosis représentée par la séquence SEQ ID NO : 3.
En effet, contre toute attente, Ans A n'est pas une protéine essentielle à là vie de la bactérie, elle participe seulement à sa virulence. Par conséquent, l'inactivation de cette protéine permet de diminuer le nombre de mutants résistants pouvant apparaître (pression de sélection moins forte) et faciliter l'élimination du pathogène par le système immunitaire.
Selon un mode de réalisation particulier, la virulence de la souche mutante de Mycobacterium tuberculosis est déterminée par infection de souris par voie intranasale et mesure de la charge bactérienne pulmonaire à différents temps après infection.
La charge bactérienne pulmonaire est mesurée par étalement sur milieu gélosé.
Dans un mode de réalisation particulier d'une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis selon l'invention, le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est supprimé du génome de ladite souche mutante.
La suppression du gène peut être obtenue, à titre d'exemple, par la recombinaison homologue. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite souche mutante de Mycobacterium tuberculosis est la souche déposée à la CNCM le 21 mars 2013 sous le numéro : CNCM 1-4724.
Dans un autre mode de réalisation particulier d'une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis selon l'invention, le gène ans A représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est présent dans le génome de la dite souche mutante, mais inactivé.
Cette inactivation peut être due à une modification ou interruption du gène, par à titre d'exemple un transposon ou une mutagenèse dirigée par PCR.
La présente invention a également pour objectif de fournir une composition immunogène comprenant une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis susmentionnée.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active, une souche mutante de Mycobacterium tuberculosis susmentionnée, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ladite composition pharmaceutique peut être utilisée dans le traitement ou la prévention de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis.
Dans un mode de réalisation avantageux, ladite composition pharmaceutique est une composition vaccinale contre la tuberculose.
Dans un mode de réalisation avantageux, ladite composition pharmaceutique ou vaccinale comprend une souche mutant déposée le 21 mars 2013 sous le numéro CNCM I- 4724.
Ladite composition pharmaceutique ou vaccinale peut être une solution à pH neutre, notamment de pH 7.0 à 8.0, notamment de pH 7.4 à 7.6.
Ladite composition pharmaceutique ou vaccinale peut être en poudre lyophilisée. La solution est préparée juste avant l'administration.
Ladite composition pharmaceutique ou vaccinale convient d'être administrée à une dose permettant de provoquer une réponse immunitaire protective contre la tuberculose sans développement de ladite maladie.
Dans un mode de réalisation particulier, la dose administrable de ladite composition pharmaceutique ou vaccinale est une dose unitaire de 10 e5 à 10 e6 CFUs selon l'âge de la personne à vacciner. La présente invention a également pour objet un kit contenant une composition pharmaceutique susmentionnée et un antibiotique connu dans le traitement de la tuberculose.
Un kit selon la présente invention comprend :
une composition pharmaceutique ou vaccinale susmentionnée, et
- un antibiotique choisi parmi ethambutol, isoniazide, pyrazinamiden rifampicine, acide p-aminosalicylique, amikacine, kanamycine, capreomycine, ciprofloxacirie, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, rifabutine,
comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la prévention et/ou le traitement de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis .
Dans un mode de réalisation particulier, un kit selon la présente invention comprend : une composition pharmaceutique ou vaccinale comprenant la souche mutant déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-4724 le 21 mars 2013, et un antibiotique choisi parmi ethambutol, isoniazide, pyrazinamiden rifampicine, acide p-aminosalicylique, amikacine, kanamycine, capreomycine, ciprofloxacine, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, rifabutine
comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour la prévention et/ou le traitement de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis.
La présente invention a également pour objectif de mettre à disposition une asparaginase recombinante de Mycobacterium tuberculosis.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1.
Ladite protéine recombinante comporte un tag His6 permettant la purification de ladite protéine par une colonne de purification, telle qu'une colonne Ni-NTA, et son suivi par micoscopie en utilisant un anticorps anti-HIS6.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir une méthode de criblage d'un inhibiteur de l' asparaginase de M. tuberculosis représentée par la séquence SEQ ID NO : 1.
La protéine recombinante de Γ asparaginase de la présente invention, notamment la protéine recombinante de la séquence SEQ ID NO : 1, permet de mettre en œuvre la méthode de criblage d'inhibiteur de cette protéine dans des essais à haut débit.
La méthode de criblage de la présente invention comprend : (i) la mise en contact de la protéine recombinante de séquence SEQ ID NO : 1 avec l'asparagine dans une solution réactionnelle en présence d'une molécule issue d'une banque de molécules chimiques,
(ii) la comparaison de l'activité de ladite protéine recombinante en présence de la susdite molécule avec celle de ladite protéine recombinante en absence de la susdite molécule,
(iii) l'identification d'un inhibiteur de ladite protéine recombinante lorsque
l'activité de ladite protéine recombinante en présence de la susdite molécule est inférieure à celle en absence de la susdite molécule.
La solution réactionnelle utilisée dans ladite méthode peut être le réactif Nessler.
On entend par « inhibiteur de l'asparaginase » une molécule biologique ou chimique permettant d'inhiber l'hydrolyse de l'asparaginase en aspartate.
Dans un mode de réalisation particulier, un tel inhibiteur biologique peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre la protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1 , un siARN, un miARN ou un oligonucléotide antisens inhibant la transcription du gène codant ladite protéine.
Un anticorps polyclonal ou monoclonal peut être obtenu par les méthodes de production d'anticorps connues dans l'art antérieur.
Un anticorps polyclonal peut être obtenu par immunisation d'un lapin ou d'une chèvre par la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 purifiée. La dose d'immunisation convenable peut être déterminée par les expériences routines. La protéine de séquence SEQ ID NO : 1 peut être administrée avec un adjuvant d'immunisation, tel que l'adjuvant de Freund, pour optimiser la réponse immunitaire.
Un anticorps monoclonal peut être obtenu par la construction d'un hybridome, qui est la fusion du lymphocyte sécréteur d'un anticorps dirigé contre la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 ayant servi à l'immunisation de l'animal avec une cellule de myélome.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit inhibiteur selon l'invention est un anticorps et dirigé contre l'asparaginase de Mycobacterhim tubercidosis.
Dans un autre mode de réalisation, un inhibiteur chimique peut être une molécule issue du criblage dans une banque de molécules. Un autre objet de la présente invention est un produit contenant un inhibiteur de la protéine de la séquence SEQ ID NO : 1 ou l'asparaginase de Mycobacterium taberculosis et un antibiotique connu pour le traitement de la tuberculose comme produit de combinaison.
Plus particulièrement, ledit kit de l'invention comprend :
- un inhibiteur décrit dans la présente invention, et
un antibiotique choisi parmi ethambutol, isoniazide, pyrazinamiden rifampicine, acide p-aminosalicylique, amikacine, kanamycine, capreomycine, ciprofloxacine, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, rifabutine,
comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la prévention et/ou le traitement de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis.
Les figures et les exemples ci-après illustrent à titre d'exemple la présente invention et ne limitent en aucun cas la portée de la présente invention.
Figures
Figure 1 : la figure 1 illustre la construction de la souche mutante déposée à la CNCM le 21 mars 2013 sous le numéro le numéro CNCM 1-4724.
Figure 2 : la figure 2 illustre l'expression de la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 (l'asparaginase de Mycobacterium tuberculosis) chez Mycobacterium smegmatis (non pathogène) via le plasmide pVV16. L'expression de l'asparaginase recombinante est détectée par le test « western blot ». Le plasmide pVV16 vide est utilisé en tant que contrôle négatif. « F40o » correspond à la fraction AnsA purifiée. « L » correspond au lysat bactérien total.
Figure 3 : les figures 3 A et 3B illustrent l'activité de l'asparaginase recombinante dans les fractions purifiées F40o.
La figure 3A montre la disparition du NADPH en présence de l'asparagine et l'asparaginase recombinante (la ligne comportant les losanges). Un échantillon contenant le plasmide pVV16 et l'asparagine (la ligne comportant les points), un échantillon contenant seulement l'asparaginase recombinante (la ligne comportant les carrés) et un échantillon contenant seulement le plasmide pVV16 (la ligne comportant les triangles) sont respectivement utilisés en tant que contrôle.
La figure 3B confirme que l'asparaginase recombinante ne possède pas l'activité glutaminase (la ligne comportant les points). Un échantillon contenant l'asparaginase recombinante et 50nM de l'asparagine (la ligne comportant les losanges) et un échantillon contenant l'asparaginase et 50nM de glutamine (la ligne comportant les triangles) sont respectivement utilisés en tant que contrôle.
Figure 4 : la figure 4 montre que le mutant de M. tuberculosis inactivé dans le gène ansA (ansA Ko) ne se développe pas in vitro en présence d'asparagine comme seule source d'azote, alors que la souche sauvage (wt) se multiplie. La croissance bactérienne est quantifiée par mesure de la turbidité (unités Me Farland) au cours du temps (en jours)
Figure 5 : la figure 5 montre qu'à 21 jours et 42 jours après l'infection le mutant de M. tuberculosis inactivé dans le gène codant AnsA (colonne en noir) est présent en quantité (mesurée en CFUs) 30 fois moindre dans les poumons de souris infectées, par rapport à la souche sauvage (colonne en blanc) ou la souche mutante « complémentée » dans laquelle une copie du gène codant AnsA a été ré-introduite (colonne en gris).
Exemples
Matériels et méthodes
Souches bactériennes :
Mycobacterhim smegmatis (souche MC2 155) et Mycobacterhim tuberculosis (H37Rv) sont cultivés en milieu liquide 7H9 (Middlebrook) + ADC 10% (albumine, dextrose, catalase, Middlebrook) supplémenté avec du Tween 80 à 0,05% final ou solide sur milieu 7H11 (Middlebrook) + OADC 10% (acide oléique, albumine, dextrose, catalase, Middlebrook) à 37°C. Quand ceci est nécessaire, de la kanamycine (50 μg/mL) de la zeomycine (25 μg/mL) ou de la streptomycine (25 μξ/raL) sont additionnés. Les tests de croissance (Fig4) ont été effectués en triplicat en milieu Sauton modifié dans lequel le citrate d'ammonium a été omis et où l'asparagine et le glutamate ont été additionnés à une concentration finale de 5mM + Tween 80 à 0,05%> final. La croissance bactérienne a été suivie via la lecture des Me Farland au cours du temps. La construction du mutant ansA KO s'est faite par des méthodes classiques de recombinaison génétiques permettant la détermination de l'essentialité de gènes mycobactériens (ref: voir la partie « supp material » dans Duckworth et al, 2011 Chem Biol. 23;18(11): 1432-41).
Extraction des protéines et purification d'AnsA : Produits utilisés: tampon de lyse (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, lOmM imidazole pH8) ; tampon de lavage (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 20mM imidazole pH8) ; tampon d'élution (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 400 mM imidazole pH8).
A densité optique supérieure ou à égale 1,5, 15mL de culture sont centrifugés (2952g ; 10 min), les culots bactériens sont remis en suspension avec lmL de tampon de lyse, puis les parois sont cassées par lyse mécanique avec des billes de verre (0,1 -0,25mm) pendant 10 minutes (appareil Bead Beater « Retscher, BioBrock scientific »). Les lysats sont récupérés après centrifugation (14000rpm ; 5 min).
Puis 600μΙ, des lysats sont déposés sur colonne Ni-NTA (Ni-NTA Spin column QIAGEN) équilibrée au préalable avec όθθμΐ, de tampon de lyse (890g ; 2 min), les colonnes sont centrifugées (270g ; 5 min) et les fractions F0 sont obtenues. Puis les colonnes sont lavées 2 fois avec 600μΙ, de tampon de lavage (890g ; 2min) et sont enfin éluées avec 300μΙ, de tampon d'élution et après centrifugation (890g ; 2 min) les fractions F400 sont obtenues. Détection de l'expression de AsnA par Western blot :
Les différents échantillons sont dénaturés après ajout d'un agent contenant du sodium dodecylsulfate et du dithiothreitol (NuPAGE, LDS Sample Buffer 4X et Reducing Agent 10X) SDS) et chauffés 5min à 95°C. Les extraits sont déposés sur un gel SDS-PAGE à 12% d'acrylamide. Les protéines sont séparées par migration à 200 mV avant d'être transférées sur une membrane de nitrocellulose. Après saturation 1H en PBS/Tween 20 (0.1%)/lait (5%), la membrane est incubée pendant la nuit à 4°C avec l'anticorps un primaire dirigé contre le Tag His6 (produit chez le lapin, eBioscience). Après 3 lavages de 5 minutes dans du PBS/Tween 20 (0.1%), la membrane est incubée pendant lh avec l'anticorps secondaire (Produit chez l'âne, GE Healthcare) dirigé contre l'anticorps primaire et couplé à la HRP (Horseradish Peroxidase). Après 3 nouveaux lavages, sont ajoutés pendant 5 minutes le substrat chimioluminescent (luminol) ainsi que le substrat de la peroxydase (peroxyde d'hydrogène), le produit de la réaction catalysée par la HRP est impressionné sur un film photographique permettant la détection de la protéine (AnsA-His6= 34kDa). Essai enzymatique :
L'activité de l'asparaginase est déterminée par le couplage de deux réactions ci- dessous. AiisA
L-As ragine + Η,Ο > L-Aspartate + NH+ +
GDH
+ 2-Oxoçlutarate -H NADPH L-Ghitamate + NADP+ + Η,Ο
La disparition du NADHP est déterminée par mesure optique.
L'essai enzymatique est réalisé dès la fin de la purification, chaque expérience de purification permet de faire 3 essais enzymatiques. La quantité de NADHP est mesurée par le kit Megazyme K-ASNAM (Glutamate déshydrogénase, NADPH, 2-oxoglutarate, tampon acétate de sodium = « solution A »). La solution d'Asn est à 150mM. Dans une cuve en Quartz de 1cm sont ajoutés 72μΙ, de solution A, 77μί de substrat (Asn et/ou eau de manière à avoir la concentration finale souhaitée) et 81 μί de l'échantillon à tester F400). Une cinétique enzymatique est réalisée et l'activité est donnée par la mesure de la diminution de l'absorbance à 340nm correspondant à la disparition du NADPH au cours du temps avec le spectrophotomètre << Safas monaco me2 » ; logiciel « SAFAS SP 2000 » permettant de faire des mesures à des intervalles de temps de 10 secondes.
Procédé de screening :
Afin de procéder au screening d'inhibiteurs de la protéine AnsA de Mycobacterium tuberculosis, la miniaturisation d'essais d"activité asparaginase est procédée. Pour cela, la protéine AnsA est produite chez Escherichia Coli. Les fractions purifiées de la protéine AnsA sont placées en plaque 96 puits. Après l'addition de l'asparagine 50 mM, l'activité asparaginase est mesurée en point final par spectrocolorimétrie (520 nm) après addition de réactif de Nessler, qui permet de former un complexe coloré avec les ions ammonium libérés. Des molécules provenant de chimiothèques sont ensuite ajoutées dans le milieu réactionnel afin d'identifier celles permettant d'inhiber l'activité asparaginase de AnsA.
Infection de souris :
Des souris C57BL/6 de 6 à 8 semaines ont été anesthésiées avec un coktail de kétamine (100 mg/kg ; Merial) et de xylasine (15 mg/kg ; Bayer) et ont été infectées par voie intranasale avec 500 CFUs (colonies formant unités) des différentes souches testées avec 25 μΐ de DPBS/0.01% Tween 80. A jour 21 et jour 42 post-infection, 5 souris par souches testées sont sacrifiées et les poumons et rates des animaux sont récupérés, broyés et étalés sur milieu 7H11 pour dénombrement bactérien. Résultats
Le western blot montre que Γ asparaginase recombinante de la séquence SEQ ID NO : lest bien exprimée chez Mycobacterhim smegmatis (figure 2).
Cette asparaginase recombinante présente une activité d'asparaginase permettant d'hydrolyser l'asparagine (figure 3A). Cette même protéine n'a pas d'activité de glutaminase (figure 3B).
Le mutant AnsA KO de M. tuberciilosis ne pousse pas en présence d'asparagine comme seule source d'azote (figure 4).
Les résultats de la figure 5 montrent qu'AnsA est requise pour la colonisation du poumon par M. tuberculosis, et font de cette enzyme une cible de choix pour développer de nouveaux antibiotiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche mutante de Mycobacteriiim t berculosis dont la virulence est inférieure à celle de la souche sauvage correspondante, le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 ou l'expression de la protéine codée par le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 étant inactivée dans ladite souche mutante.
2. Souche mutante de Mycobacterhim tuberculosis selon la revendication 1, dans
laquelle le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est supprimé du génome de ladite souche mutante.
3. Souche mutante de Mycobacterhim tuberculosis selon la revendication 1, dans
laquelle le gène ansA représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est inactivé du génome de ladite souche mutante.
4. Souche mutante de Mycobacterhim tuberculosis selon l'une des revendications 1 à 3, ladite souche est la souche CNCM 1-4724 déposée le 21 mars 2013.
5. Composition immunogène comprenant une souche mutante selon l'une des
revendications 1 à 4.
6. Composition pharmaceutique, notamment vaccinale, comprenant à titre de substance active, une souche selon l'une des revendications 1 à 4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
7. Composition pharmaceutique, notamment vaccinale, selon la revendication 5 ou 6, convenant pour l'administration d'une dose unitaire de 10 e5 à 10 e6 CFUs.
8. Produit contenant :
une composition selon l'une des revendications 5-7,
un antibiotique choisi parmi ethambutol, isoniazide, pyrazinamiden rifampicine, acide p-aminosalicylique, amikacine, kanamycine, capreomycine, ciprofloxacine, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, rifabutine, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la prévention et/ou le traitement de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis.
9. Protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1.
10. Méthode de criblage d'un inhibiteur de la protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1 , comprenant : un criblage colorimétrique ou fluorimétrique
(iv) la mise en contact de ladite protéine recombinante avec l'asparagine dans une solution réactionnelle en présence d'une molécule issue d'une banque de molécules chimiques,
(v) la comparaison de l'activité de ladite protéine recombinante en présence de la susdite molécule avec celle de ladite protéine recombinante en absence de la susdite molécule,
(vi) l'identification d'un inhibiteur de ladite protéine recombinante lorsque
l'activité de ladite protéine recombinante en présence de la susdite molécule est inférieure à celle en absence de la susdite molécule.
11. Inhibiteur de la protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1 , ledit inhibiteur étant choisi parmi :
- un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre la protéine recombinante représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, en particulier un anticorps dirigé contre l'asparaginase de Mycobacterium tuberculosis, ou
- un inhibiteur issu du criblage selon la revendication 10.
12. Produit contenant :
- un inhibiteur selon la revendication 11 ,
- un antibiotique choisi parmi ethambutol, isoniazide, pyrazinamiden rifampicine, acide p-aminosalicylique, amikacine, kanamycine, capreomycine, ciprofloxacine, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, rifabutine,
comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la prévention et/ou le traitement de la tuberculose, notamment la tuberculose liée à l'infection de Mycobacterium tuberculosis.
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