WO2014148797A1 - 심근허혈에 의한 알부민을 측정하기 위한 신규한 알부민-구리 결합 측정법 - Google Patents

심근허혈에 의한 알부민을 측정하기 위한 신규한 알부민-구리 결합 측정법 Download PDF

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copper ions
divalent copper
reagent
detecting
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권영주
전길자
엄지은
이은영
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Ewha Womans University
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention provides a method for detecting albumin mutated from aspartic acid and alanine (Asp-Ala) residues located at the N-terminus of native human serum albumin using copper ions; Diagnostic method of ischemia; The present invention relates to a kit for detecting the mutated albumin and a kit for diagnosing myocardial ischemia.
  • MI Myocardial ischemia
  • myocardial ischemia presents a serious problem, there are no special symptoms, and most patients with myocardial ischemia do not know the pain until the irreversible damage of the body appears. Fortunately, some patients go to the emergency center because of tingling chest pain, but the problem is that not all sick patients are seriously ill.
  • Electrocardiograms are used initially to diagnose a patient's condition, even though more than 80% of patients with abnormal ECG results, such as elevated ST-segments, have myocardial ischemia. Only about half of the heartbeat curves are abnormal. Therefore, even though a large number of patients have myocardial ischemia, it is not properly diagnosed, and thus the treatment is delayed, resulting in irreversible results.
  • biomarkers such as creatine kinase-MB isoenzyme (CK-MB) and cardiac troponin have also been used to measure coronary artery disease. Cardiac troponin is mainly observed because of their organ specificity and sensitivity to myocardial ischemia.
  • IMA ischemia modified albumin
  • IMA is a structurally modified human serum albumin (HSA) that is usually produced by ischemic stress.
  • Human serum albumin is the most abundant protein (-5%) in the human body, with 585 amino acid residues and a molecular weight of 66.5 kDa.
  • One of the main functions of human serum albumin is the transport of various ligands in the body, Ca 2+ , Co 2+ , Co 3+ , Ni 2+ , Cu + , Cu 2+ , Zn 2+ , Cd 2+ It is known to bind various metal ions such as, Pt 2+ and Hg 2+ .
  • NTS N-terminal binding site
  • Cys34 binding site Cys34 binding site
  • MFS-A Cadmium site A
  • NTS has been most studied as a binding site for metal ions in human serum albumin, and is the first identified metal ion binding site.
  • the NTS is known to bind a metal ion such as Co 2+ .
  • This metal binds to the Asp-Ala-His-Lys (human) site located at the N-terminus of human serum albumin, and the front three amino acids are known to be important for strong binding capacity.
  • IMA is produced by cleaving the N-terminal Asp-Ala site.
  • IMA The level of IMA rises within a few minutes of developing myocardial ischemia, which lasts up to 6 hours. Since IMA is produced before any necrosis occurs, IMA is considered to be a good biomarker for early detection of reversible myocardial ischemia. In comparison, the level of cardiac tropin increases after irreversible cellular damage has already occurred, which can be seen as a late diagnostic marker of ischemia. Therefore, it is more advantageous to use IMA as a detection marker to detect myocardial ischemia before irreversible cell damage occurs. In addition, various literatures have reported elevated levels of IMA in other diseases, such as stroke. This means that IMA-related research is expanding to interpret various types of ischemic conditions.
  • IMA is the only clinical test method for detecting myocardial ischemia that has been approved by the US Food and Drug Administration (FDA) since 2003.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • the accurate and effective detection of IMA is very useful for the diagnosis of myocardial ischemia. Therefore, there has been a demand for the development of a reliable method for detecting IMA.
  • IMA has a lower cobalt binding capacity compared to normal human serum albumin
  • Bar-Or, et al. Conducted an albumin cobalt binding (ACB) test that can indirectly measure IMA levels in patient serum.
  • ACB albumin cobalt binding
  • the method involves mixing cobalt in serum samples and detecting free cobalt ions that do not bind human serum albumin using dithiothreitol (DTT), provided that the sample contains low levels of normal human serum albumin.
  • DTT dithiothreitol
  • cobalt ions used in the ACB method according to the conventional Bar-Or, et al mainly bind to sites A and B, not the N-terminal site of human serum albumin, so that IMA can be accurately detected using the method. It has no problem. Therefore, using other metal ions that are specific and strongly bind to Asp-Ala of human serum albumin N-terminus but not cobalt, there is a need to develop a method for detecting IMA having high sensitivity and specificity.
  • One object of the present invention is to (a) divalent copper ions (Cu 2+ ) capable of binding to the N-terminal metal binding site of natural albumin, an isolated sample comprising albumin, and free divalent binding to albumin. Contacting reagents that detect copper ions with each other; And (b) measuring the amount of free divalent copper ions that do not bind to the N-terminal metal binding site of albumin in the sample, aspartic acid and alanine located at the N-terminus of native human serum albumin. It provides a method for detecting albumin mutated (Asp-Ala) residues.
  • Another object of the present invention is (i) a copper salt solution containing copper ions capable of binding to the N-terminal metal binding site of the natural albumin; And (ii) a kit for detecting albumin in which aspartic acid and alanine (Asp-Ala) residues are located at the N-terminus of native human serum albumin, including a reagent for detecting divalent copper ions not bound to albumin.
  • Still another object of the present invention is to (a) divalent copper ions (Cu 2+ ) capable of binding to the N-terminal metal binding site of natural albumin, an isolated sample containing albumin, and free divalent binding to albumin. Contacting reagents that detect copper ions with each other; And (b) measuring the amount of free divalent copper ions that do not bind to the N-terminal metal binding site of albumin in the sample.
  • Cu 2+ divalent copper ions
  • Another object of the present invention is (i) a copper salt solution containing a copper ion capable of binding to the N-terminal metal binding site of the natural albumin; And (ii) to provide a kit for diagnosing myocardial ischemia comprising a reagent for detecting a divalent copper ion not bound to albumin.
  • the method of the present invention is a method of using copper ions having a high binding force to the N-terminal metal binding site of human serum albumin, and can effectively detect human serum albumin in which the N-terminal Asp-Ala site is mutated, thereby detecting IMA. And it can be usefully used for the diagnosis of ischemia.
  • FIG. 1 is a diagram showing the chromatogram of HPLC analysis for peptide-metal interaction.
  • Tetrapeptide was an ammonium salt, detected at 487.2633 m / z.
  • the peptide-cobalt complex was a potassium salt, detected at 567.1276 m / z.
  • the peptide-copper complex was a potassium salt, detected at 571.1195 m / z.
  • the peptide-iron complex was a sodium salt, detected at 548.1519 m / z.
  • Peptide-nickel complex was potassium salt, detected at 566.1267 m / z.
  • Figure 3 shows an HPLC analysis chromatogram for metal affinity for albumin N-terminal tetrapeptide. 0.1 mM tetrapeptide and 0.1 mM CoCl 2 or CuCl 2 were mixed in the order shown in the figure, and each sample was analyzed.
  • 4A-J are HPLC analysis chromatograms for metal affinity for albumin N-terminal tetrapeptides.
  • the same method as the method of FIG. 3 was performed using the metal and other metal ions shown in FIG. 3.
  • ij) FeCl 2 and NiCl 2 All experiments were performed at least three times.
  • LY Lucinase yellow
  • ABSUmax 430 nm
  • RFUs reflatvie fluorescence unit
  • FIG. 6 is a diagram confirming the pH effect on the interaction between LY (Lucifer yellow) and LY-Cu.
  • (a) In 200 ⁇ L of 50 mM NaH 2 PO 4 with various pHs, an RFU of 0.004 ⁇ mol LY was measured at an excitation wavelength of 430 nm and an emission wavelength of 540 nm, respectively. All experiments were performed at least three times. In the graph, bar means mean ⁇ standard deviation.
  • (b) 0.004 ⁇ mol LY and 0-0.01 ⁇ mol CuCl 2 were mixed in 200 ⁇ L of 50 mM NaH 2 PO 4 at various pHs, then RFU was measured at an excitation wavelength of 430 nm and an emission wavelength of 540 nm. Dots represent mean ⁇ standard deviation, and a line represents the trend line of the point. All experiments were performed at least three times.
  • FIG. 7 is a diagram showing quenching of LY fluorescence induced by Cu.
  • FIG. 0.004 ⁇ mol LY and 0 to 0.03 ⁇ mol CuCl 2 were mixed with each other and then RFUs were detected.
  • F 0 means the original LY fluorescence without copper and F means quenched fluorescence. All experiments were performed at least three times. Dots represent mean ⁇ standard deviation, and R 2 represents the reliability of the trend line.
  • FIG. 8 is a diagram for optimization of incubation time.
  • Incubation time of LY and Cu 2+ was determined as follows. 0.004 ⁇ mol LY and 0.01 ⁇ mol CuCl 2 were mixed with each other in 200 ⁇ L of 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.4) and incubated for 0 to 60 minutes.
  • Incubation of HSA and Cu 2+ was determined as follows. 4% HSA and 0.025 ⁇ mol CuCl 2 were incubated in 200 ⁇ L of 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.4) for 0 to 60 minutes, then 0.004 ⁇ mol LY was added and RFUs were detected 10 minutes after addition. LY alone and a mixture of LY and Cu 2+ were also detected as references.
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of the addition procedure of each reagent. 0.025 ⁇ mol CuCl 2 , 4% HSA, and 0.004 ⁇ mol LY were added in the order indicated on the X axis of the bar graph. All experiments were performed at least three times. Where bar means mean ⁇ standard deviation and ns means that it is not significant for each bar graph shown above the solid line.
  • 10A to D are diagrams showing the specificity of LY with respect to copper ions.
  • 0.004 ⁇ mol LY was mixed with (a) 0 ⁇ mol, (b) 0.0005 ⁇ mol, (c) 0.001 ⁇ mol, (d) 0.002 ⁇ mol CuCl 2 , then 0-0.02 ⁇ mol CoCl 2 , FeCl 2 , and NiCl 2 were added.
  • Black bars represent the results of CoCl 2
  • gray bars represent the results of FeCl 2
  • shaded bars represent the results of NiCl 2 . All experiments were performed at least three times, with bars representing mean ⁇ standard deviations.
  • Fig. 11 shows the linearity of the ACuB assay of the present invention.
  • RFU was measured by incubating 0.025 ⁇ mol CuCl 2 with 1.5% to 5.5% HSA for 10 minutes, then adding 0.004 ⁇ mol LY. All experiments were performed at least three times.
  • Dots means mean ⁇ standard deviation
  • the solid line represents the trend line of all the points.
  • R 2 represents the reliability of the trend line.
  • Fig. 13 shows the analysis results of in vivo samples via ACB assay. 50 ⁇ L of 0.1% CoCl 2 and 200 ⁇ L of sample were mixed carefully and incubated for 10 minutes. Then, 50 ⁇ L of 1.5 mg / mL DTT was added, then 2 minutes later, 1 mL of 0.9% NaCl was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at 470 nm. All experiments were performed at least three times.
  • the invention provides (a) a divalent copper ion (Cu 2+ ) capable of binding to the N-terminal metal binding site of a native albumin, an isolated sample comprising albumin, and a free 2 bound to albumin. Contacting reagents that detect copper ions with each other; And (b) measuring the amount of free divalent copper ions that do not bind to the N-terminal metal binding site of albumin in the sample, aspartic acid and alanine located at the N-terminus of native human serum albumin.
  • albumin is one of the proteins constituting the basic substance of the cell, it is present in the blood very much, it means a protein produced in the liver.
  • the albumin has the lowest molecular weight among simple proteins present in nature. Serum albumin in the blood maintains and restores the volume of the plasma to prevent shock due to excessive bleeding and is used for surgery and burn treatment. It is also known to have oxygen transfer capacity similar to hemoglobin.
  • the albumin may be derived from plasma, or may be recombinant albumin prepared by genetic engineering, and preferably, may be derived from plasma, but is not limited thereto. Genetic information for the albumin can be obtained from a known database such as NCBI GenBank, for example, human serum albumin of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • natural albumin is one of the proteins constituting the basic substance of the cell, a very large amount in the blood, produced by the liver, refers to the most typical form of albumin that exists naturally.
  • the natural albumin may mean an albumin protein present in a normal individual or wild type, but is not limited thereto.
  • mutated albumin refers to an albumin in which aspartic acid and alanine (Asp-Ala) residues present at the N-terminus of a native albumin are mutated, and a metal binding site of the N-terminus of a native albumin.
  • albumin protein means reduced or lost binding to.
  • the mutated albumin preferably refers to albumin in which the aspartic acid and alanine residues present at the N-terminus of the native albumin are cleaved, and the residues are albumin proteins, and the remaining amino acid sequence is naturally related to albumin.
  • mutated albumin is preferably IMA (ischemia-modified albumin).
  • the term “IMA (ischemia-modified albumin)” refers to a modified albumin protein whose structural change is caused at the N-terminus of albumin, thereby inhibiting binding ability with divalent metal ions.
  • the IMA is an albumin protein in the form of Asp-Ala cleaved at the N-terminus of albumin, and when the myocardium is exposed to ischemic state, the Asp-Ala due to the generation of free radicals and acidosis due to hypoxia, etc.
  • disconnected it means the protein whose binding force with the bivalent metal ion which couple
  • IMA is produced at an early stage of ischemia and exists for about 6 hours after ischemia development.
  • IMA refers to a biomarker of ischemia, in particular a marker that can lead to early diagnosis of ischemia. Therefore, when IMA is detected using the method of the present invention, there is an advantage in that ischemia can be diagnosed early.
  • ischemia refers to a condition in which the blood flow as a source of the oxygen demand of tissues and organs is absolute or relatively insufficient.
  • myocardial ischemia refers to a disease caused by a disorder of coronary blood supply. While ischemia persists, aerobic metabolic disorders, cell dysfunction due to decreased ATP production, etc., and if not treated early, irreversible cell damage results in organ damage. Therefore, in order to properly treat ischemia, it is important to develop a method for early diagnosis of ischemia.
  • the IMA is a mutated albumin protein which is detected in the blood from the early ischemia and is cleaved from aspartic acid and alanine residues located at the N-terminus of human serum albumin, and has a low binding capacity to divalent metal ions.
  • the ions are reacted with a sample containing the mutated albumin protein, free divalent metal ions that do not bind to albumin are present in the sample.
  • the ACB test method has a limitation in that it is impossible to accurately detect IMA. Therefore, in order to detect IMA with high sensitivity and specificity, the N-terminal Asp-Ala site of human serum albumin is dissociated even though it is a major binding site and reacts with other substances such as metal ion detection reagents having a high binding capacity to the site. It is important to use ions that are not.
  • copper ions among metal ions bound to the Asp-Ala-His-Lys amino acid residue which is a metal binding site located at the N-terminus of human serum albumin, are high among various divalent transition metal ions such as cobalt, iron, and nickel. Binding to the site was confirmed with affinity.
  • the present invention has developed a method for detecting the mutated albumin protein, that is, IMA using copper ions, and named it ACuB assay.
  • Step (a) in the method of the present invention is a divalent copper ion (Cu 2+ ) capable of binding to the N-terminal metal binding site of the native albumin, an isolated sample containing albumin, and free divalent binding to albumin. Reagents that detect copper ions are contacted with each other.
  • Cu 2+ divalent copper ion
  • the divalent copper ions, the separated sample containing albumin, and the reagent for detecting free divalent copper ions may be reacted simultaneously or sequentially, preferably, but not sequentially.
  • step (a) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (a) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (a) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (a) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (a) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (i) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (i) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (i) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (i) may be performed by (i) binding to an N-terminal metal binding site of albumin.
  • step (i) may be performed by (i)
  • a sequence of LY which is a reagent for detecting a copper ion, a sample containing albumin, and free divalent copper ions; And LY fluorescence was detected by mixing in the order of the sample containing copper ions and LY and albumin which are reagents for detecting free divalent copper ions, and showed the same result irrespective of the mixing order (FIG. 9).
  • the incubation time of the sample also showed a result that does not significantly affect the reaction results (Fig. 8). Therefore, since the method of the present invention utilizes a strong bond between albumin and copper ions, the same result can be obtained regardless of the mixing order, and reliable results can be obtained even if the reagent is reacted for a short time.
  • the term "isolated sample comprising albumin” is a sample for detecting the presence or amount of mutated albumin using the method of the present invention, comprising the N-terminal Asp-Ala of the native albumin. Forms of albumin or / and mutated albumin in which the Asp-Ala is lost.
  • the isolated sample containing albumin may be a biological sample, for example, tissue, cells, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spinal cord, etc.), cell culture supernatants, ruptured eukaryotic cells, and the like. Bacterial expression systems and the like, but is not limited thereto.
  • ischemia can be diagnosed by detecting the IMA by applying the method of the present invention with or without the biological sample.
  • concentration of albumin in the separated sample containing albumin may be 1.5% to 5.5% by weight relative to the total weight of the sample, but is not limited thereto.
  • the F0 / F value in the sample containing 1.5% to 5.5% human serum albumin, by applying the method of the present invention by measuring the fluorescence of the free copper ions, it is calculated as a F0 / F value to derive a graph As a result, the F0 / F value according to the concentration showed linearity (FIG. 11). In other words, it suggests that the method of the present invention shows high reliability in detecting native human serum albumin and IMA in a sample containing albumin at a concentration of 1.5% to 5.5%. In addition, these results indicate that since the concentration of human serum albumin in the blood is about 5%, the method of the present invention can detect human serum albumin with high reliability and accuracy even when blood is used as a sample.
  • divalent copper ion (Cu 2+ ) is a divalent transition metal capable of binding to the N-terminal metal bonding site of the native albumin, that is, Asp-Ala-His-Lys. N-terminal Asp-Ala is bound to the albumin present, but the Asp-Ala site is a modified albumin, such as a metal ion that does not bind to IMA.
  • the Asp It is possible to detect mutated albumin proteins missing the -Ala site, preferably IMA.
  • the divalent copper ions are converted to the amount of albumin in the sample to the amount of natural albumin, the amount of saturation of divalent copper ions that can bind to the N-terminal metal binding site of the natural albumin or Albumin may be contacted in greater amounts.
  • bivalent copper ion When reacting a saturation amount of divalent copper ions with a sample containing albumin, free divalent copper ions that do not bind to the mutated albumin may be easily detected in the sample containing both the mutated albumin and the native albumin. Since it exists to such an extent, it is preferable to make bivalent copper ion more than saturated amount, but it is not limited to this.
  • the term "reagent for detecting free divalent copper ions” is a reagent for detecting free divalent copper ions that are not bound to albumin, and examples thereof include chlorophylilin, 2-pyridylaldehyde fluorescein hydrazone (FHP), 1,3,5-triphenylbenzene fluorophore, diethyldithiocarbamate, tetrathiomolybdate or lucifer yellow reagent, but is not limited thereto.
  • the reagent for detecting free divalent copper ions is preferably, but not limited to, lucifer yellow (LY) reagent.
  • LY was finally selected as a sample capable of detecting free divalent copper ions that the Asp-Ala residues of the native albumin N-terminus did not bind to the altered albumin, and the LY was stable and high. Sensitivity confirmed that the native albumin N-terminal Asp-Ala residue can detect mutated albumin proteins such as IMA.
  • LY fluorescent yellow
  • the reaction between the LY reagent and free divalent copper ions may be preferably performed in the range of pH 4.5 to pH 9.5, more preferably at pH 7.4, but is not limited thereto. .
  • the reaction may be performed under 50 mM NaH 2 PO 4 buffer in order to react under conditions similar to physiological conditions, but is not limited thereto.
  • step (b) is a step of measuring the amount of free divalent copper ions that do not bind to the N-terminal metal binding site of the albumin in the sample.
  • step (b) the amount of free divalent copper ions may be measured using color development or fluorescence of a reagent for detecting the free divalent copper ions reacted in step (a), but is not limited thereto.
  • the amount of free divalent copper ions in step (a) can be measured by measuring the fluorescence of LY. Since the LY has a characteristic of being quenched when combined with free divalent copper ions that are not bound to albumin, the amount of free divalent copper ions can be measured by measuring the degree of LY quenching induced by the binding with copper ions. Can be.
  • the fluorescence quenched with respect to the initial fluorescence (F0) without copper may be represented by F0 / F, which is a relative fluorescence unit (RFU), to indicate the degree of LY quenching.
  • the method may further comprise the step of (c) determining the presence of mutated albumin if the amount of free divalent copper ions of the sample is greater than the control.
  • the level of free divalent copper ions is higher than that of the control group containing natural albumin, so that the ( The amount of free divalent copper ions measured in step b) can be compared with the control to detect the presence of mutated albumin.
  • copper ions may be bonded to the N-terminal metal binding site (Asp-Ala-His-Lys) of albumin. It was confirmed that the albumin had a very high binding force to the metal-binding site of the N-terminus of albumin, and tetrapeptide to the albumin N-terminus bound to copper ions showed no dissociation even when other divalent metal ions were added. It was confirmed that the use of copper ions was useful in detecting the altered albumin in which the Asp-Ala residue of albumin was cleaved (Experimental Example 1).
  • LY reagent was selected, and optimized conditions for the LY reagent were established. Specifically, as a result of confirming the effect of pH on the binding between the LY reagent and the copper, it was confirmed that the binding occurs effectively in the range of pH 4.5 to 9.5, especially confirmed that the most effective binding occurs at pH 7.4 similar to the physiological conditions It was. Furthermore, it was confirmed that 0.025 ⁇ mol CuCl 2 could completely quench the fluorescence of 0.004 mol LY, and it was confirmed that 50 mM NaH 2 PO 4 buffer could be appropriately used as a buffer that can be used for the reaction.
  • the assay method of the present invention can show linearity at the concentration of 1.5% to 5.5% of human serum albumin including the actual blood HSA concentration ( ⁇ 5%). It was confirmed that this may be useful in the detection of IMA using blood samples.
  • the present invention (i) a copper salt solution containing a copper ion capable of binding to the N-terminal metal binding site of the natural albumin; And (ii) a kit for detecting albumin in which aspartic acid and alanine (Asp-Ala) residues are located at the N-terminus of native human serum albumin, including a reagent for detecting divalent copper ions not bound to albumin. to provide.
  • the albumin, a copper salt solution, a reagent for detecting a divalent copper ion not bound to albumin, and a modified albumin are the same as described above.
  • the kit may further comprise a transparent detection vessel comprising one or more compartments having a receiving volume of 50 ⁇ l to 500 ⁇ l capable of reacting the solution and reagent and a sample comprising albumin.
  • kit may further comprise a time for measuring the amount of albumin present in the sample to be detected.
  • the kit for detecting mutated albumin of the present invention comprises a copper salt solution capable of binding to the N-terminal metal binding site of natural albumin and a reagent for detecting divalent copper ions not bound to albumin
  • the kit comprises albumin.
  • the kit may be preferably used for detecting IMA and further for ischemia diagnosis, but is not limited thereto.
  • the present invention provides (a) a divalent copper ion (Cu 2+ ) capable of binding to the N-terminal metal binding site of a native albumin, an isolated sample containing albumin, and free binding to albumin. Contacting reagents that detect bivalent copper ions with each other; And (b) measuring the amount of free divalent copper ions that do not bind to the N-terminal metal binding site of albumin in the sample, providing a method for diagnosing myocardiac ischemia.
  • Cu 2+ divalent copper ion
  • the separated samples containing divalent copper ions, albumin, albumin, reagents for detecting free divalent copper ions, and myocardial ischemia are as described above.
  • the steps (a) and (b) are as described above.
  • the method may further comprise the step of determining myocardial ischemia if the amount of free divalent copper ions of the sample is greater than the control group.
  • IMA is a form in which Asp-Ala of the natural albumin N-terminus to which copper can bind is cleaved, and shows low binding force to copper ions. Therefore, in the case of the sample containing IMA due to myocardial ischemia, there are more free divalent copper ions that do not bind albumin than the control group containing natural albumin. By comparison, the development of myocardial ischemia can be diagnosed.
  • step (b) it is possible to determine whether myocardial ischemia is generated by comparing the amount of free divalent copper ions measured in step (b) with a known value of the standard curve.
  • a calibration curve is obtained and the measured fluorescence value of LY is substituted into the calibration curve to free 2 which is not bound to albumin in the sample.
  • the albumin samples of various known concentrations were reacted with the LY samples in the presence of copper ions, and then the F0 / F values were measured to obtain a calibration curve, and the measured F0 / F values were substituted for the concentration of copper-bound albumin. By measuring, it can be determined that myocardial ischemia has occurred if the concentration is lower than that of general blood albumin.
  • the present invention (i) a copper salt solution containing a copper ion capable of binding to the N-terminal metal binding site of the natural albumin; And (ii) provides a kit for diagnosing myocardial ischemia, comprising a reagent for detecting a divalent copper ion not bound to albumin.
  • the albumin, a copper salt solution, a reagent for detecting a divalent copper ion not bound to albumin, and a modified albumin are the same as described above.
  • the kit may further comprise a transparent detection vessel comprising one or more compartments having a receiving volume of 50 ⁇ l to 500 ⁇ l capable of reacting the solution and reagent and a sample comprising albumin.
  • the N-terminal tetrapeptide (DAHK) of human serum albumin was synthesized and purchased from Peptron Corporation (Korea). Cobalt (II) (CoCl 2 ), Copper (II) (CuCl 2 ), Nickel (II) (NiCl 2 ), Iron (II) (FeCl 2 ), Lyophilized human serum albumin, Ammonium formate formate, and lucifer yellow carbohydrazide (LY-CH or LY) dilithium salts were purchased from Sigma (USA).
  • NaH 2 PO 4 sodium dihydrogen phosphate
  • NaOH sodium hydroxide
  • NaOH sodium hydroxide
  • NaOH Samcheon Chemical
  • H 3 PO 4 phosphoric acid
  • the mobile phase was run through a column Synergi 4U Fusion-RP 80 A (C18, 250 ⁇ 4.6 mm, 4 ⁇ m) (Phenomenex, USA) at a flow rate of 1 mL / min in isocratic mode and the sample injection volume was 20 ⁇ L.
  • the sample detection wavelength was established at 220 nm.
  • Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, USA) was used for sample detection and Agilent ChemStation for LC 3D (Agilent Technologies, USA) was used for the results analysis.
  • tetrapeptide (Asp-Ala-His-Lys, DAHK) having an albumin N-terminal sequence was synthesized, which was named NTS tetrapeptide (DAHK, MW 469).
  • the tetrapeptides were then incubated with CoCl 2 , CuCl 2 , NiCl 2 , and FeCl 2 , respectively. More specifically, the final 0.1 mM tetrapeptide and 0.1 mM metal ions were mixed with each other, and then incubated for 10 minutes, analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography), and the results are shown in FIG. 1. At this time, using the retention time of the free peptide peak shown in Figure 1a, each peak corresponding to the peptide-metal complex or the remaining peptide of Figures 1b to e was marked.
  • HPLC HPLC was performed to analyze the metal affinity for albumin N-terminal tetrapeptide using competition between two metal ions. To this end, the peptide and one type of metal were incubated with each other for 10 minutes, then another type of metal was added and further incubated for 10 minutes. All reactions were carried out in a mobile phase of 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.4) to resemble the in vivo environment.
  • copper ions having the highest affinity at the N-terminus of native human serum albumin were selected as metal ions for the method for detecting IMA levels.
  • a reagent to be used for copper detection was selected as follows, and conditions optimized for this were set.
  • LY was chosen as the final candidate for copper selective detection reagents.
  • the excitation and emission wavelengths suitable for LY were investigated as follows.
  • the absorbance was measured with a multi-functional microplate reader Infinite® 200 PRO (Tecan, Switzerland) and analyzed with i-controlTM software (Tecan, Switzerland). Fluorescence was also measured with a fluorescence microplate detector Spectra MAX Gemini EM (Molecular Devices, USA) and analyzed with SoftMax Pro Software (Molecular Devices, USA). All absorbance and fluorescence values were calculated in Absorbance units (ABSU) and relative fluorescence units (RFU), respectively ( Figure 5).
  • the RFU of LY was measured with buffers of various pH conditions, with or without copper.
  • 50 mM NaH 2 PO 4 reaction buffer ranging from pH 1.5 to 12.4 was prepared using NaOH and H 3 PO 4 .
  • LY itself showed a relatively stable result in all conditions except the strong base condition, in particular showed a stable result in the range of pH 1.5 to 10.5 (Fig. 6a).
  • the LY fluorescence quenching induced by Cu occurred effectively in the range of pH 4.5 to pH 9.5, in particular showing excellent results at pH 7.4 (FIG. 6 b). Based on this result, all experiments were then conducted under buffer conditions of pH 7.4, closest to the physiological pH.
  • Stern-Volmer relationship is the method used in describing many fluorescence intensification / quenching mechanisms, but Cu-induced LY quenching of the present invention may result in inconsistent with the Stern-Bomer formula. This was calculated by the F0 / F equation.
  • LY and copper, HSA and copper, and last HSA-Cu and LY were mixed for 0 to 60 minutes.
  • Lyophilized HSA was dissolved in double distilled water (DDW) to prepare a 4% HSA sample and 40 ⁇ L was added.
  • each reagent was mixed in the following order in order to clarify the mixing order of each reagent to obtain the same result.
  • the first set was copper, LY and HSA
  • the second set was copper, HSA and LY.
  • anesthesia was performed with 3% isoflurane (Isoflurane, Hana Pharm., South Korea) and weighed 255 to 270g, followed by middle cerebral artery occlusion (MCAo). It was.
  • Common carotid artery (CCA), external carotid arteries (ECA) and internal carotid arteries (ICA) were bundled and 4-0 silicone sutures were inserted from ICA to MCA. The suture induces reperfusion after 90 minutes and then was removed.
  • NSS neurological severity score
  • blood samples were then collected from the heart under zoletil anesthesia (0.1 mL / 100 g, Virbac, France).
  • the normal model showed a high F value, but the stroke model showed a low F value, indicating that LY fluorescence was quenched by free copper ions that did not bind albumin in the stroke model.
  • the ACuB assay results of the present invention were compared with the results of the ACB test performed in the same manner as described in Bar-Or, D et al ( J. Emerg. Med. 2000, 19, 311-315.). However, the analysis of the ACB test results was analyzed using Bar-Or, D et al and other spectrophotometers UV-Vis spectrophotometer U-3000 (Hitachi, Japan) and UV Solutions Application (Hitachi, Japan). The results are shown in FIG.
  • the IMA was detected with the same sample using the ACB test, and the result was not detected properly.
  • the ACB test was known to be applicable in the rat model
  • the results of Figure 13 showed a high ABSU value (> 0.8) compared to the value reported in normal human plasma (ABSU value ⁇ 0.4) In comparison with the stroke model ( ⁇ 0.7), the values were higher. In other words, this result is judged to be based on the fact that the albumin N-terminus is not the main site where cobalt binds.
  • mammalian albumin forms a strong complex with copper, which binds mole per mole to the N-terminus of Bovine, rat, and human albumin. This fact indicates that the copper used in the method of the present invention can lead to more accurate results than cobalt in detecting albumin N-terminal modifications.
  • the F0 / F value can be converted into the amount of copper-bonded albumin by substituting the formula of FIG. 11, in the present invention, the value of FIG. .
  • the method of the present invention can detect low concentrations of human albumin in stroke-induced animal samples.
  • a stroke-induced rat model which is not a myocardial ischemia-induced model, was used, but the fact that IMA induced by myocardial ischemia or stroke has not been reported so far, and myocardial ischemia or stroke has not been reported. Since there is a similar trend in detecting, the method of the present invention, which effectively detects IMA using a stroke-induced rat model, can be usefully used for IMA detection and further diagnosis of ischemia.

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Abstract

본 발명은 구리 이온을 이용한, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민을 검출하는 방법; 허혈의 진단방법; 상기 변이된 알부민의 검출용 키트 및 심근허혈 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

심근허혈에 의한 알부민을 측정하기 위한 신규한 알부민-구리 결합 측정법
본 발명은 구리 이온을 이용한, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민을 검출하는 방법; 허혈의 진단방법; 상기 변이된 알부민의 검출용 키트 및 심근허혈 진단용 키트에 관한 것이다.
심근허혈(Myocardial ischemia, MI)은 대개 혈류의 막힘에 의하여 관상 동맥 혈액 공급의 장애로 유발되는 질환이다. 허혈 상태가 지속되는 동안, 즉, 산소 공급이 중단되는 동안, ATP 및/또는 pH 감소 및 젖산 축적과 같은 대사 변화가 일어나게 되고, 이는 전해질의 불균형을 유발하게 된다. 적절한 치료를 받지 못하고 이러한 스트레스 상황에 놓이게 되는 경우, 비가역적인 세포 손상을 가져오게 되고, 결국에는 심근 경색(infarction)을 가져오게 된다. 이와 같이 심근허혈은 심각한 문제를 가져옴에도 불구하고, 특별한 증상이 나타나지 않아, 대부분의 심근허혈 환자들은 신체의 비가역적인 손상이 나타날때까지 아픔을 알지 못하게 된다. 운 좋게도, 일부 환자들은 욱신거리는 가슴의 통증을 느껴 응급센터로 가지만, 모든 아픈 환자들이 심각하게 아프지 않다는 문제점이 있다.
심전도(Electrocardiograms, ECGs)는 환자 상태를 진단하기 위하여 초기에 사용되는 것으로, ST 부분(ST-segment) 상승과 같은 비정상적인 ECG 결과를 나타내는 환자의 80% 이상이 심근허혈을 가지고 있음에도 불구하고, 상기 환자의 절반 정도만이 심박동 곡선에서 비정상적인 모습을 보인다. 따라서, 다수의 환자가 심근허혈을 가지고 있음에도 제대로 진단되지 않고, 이에 따라 치료가 늦어지게 되면서 돌이킬 수 없는 결과를 가져오게 된다. 비정상적인 ECGs 뿐만 아니라, CK-MB(creatine kinase-MB isoenzyme), 심장 트로포닌(cardiac troponin)과 같은 바이오마커 역시 관상동맥 질환을 측정하기 위하여 사용되어 왔다. 심장 트로포닌은 이들의 기관 특이성 및 심근허혈에 대한 민감성때문에 주로 관찰된다. 다만, 관상동맥 신드롬을 조사하는 최근 트렌드에 따르면 이러한 전통적인 마커들은 조기 진단 또는 적절한 치료법의 선별에 있어 이상적이지 않다고 보고되고 있다. 대신, 하나의 마커를 분석하는 것에 비하여 다양한 마커들을 테스트하는 것이 보다 효율적이며 빠르다고 여겨지고 있으나, 이는 더 높은 사망률에 대한 위험도를 제공할 것이라고 여겨지고 있다. 또한, 다양한 종류의 허혈에 대한 메타볼로믹스 역시 제시되었으나, 이 방법은 대개 고가의 장비를 필요로 하며, 전문가의 조작이 필요한 단점을 지닌다.
한편, 지금까지 규명된 많은 허혈 바이오마커 중에서도 IMA(ischemia modified albumin)에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. IMA는 플라즈마 혈청에서 쉽게 검출되므로, 정상적인 ECG를 수반하거나 또는 통증을 호소하는 급성 관상동맥 신드롬 환자들을 조기에 진단하는 데 유용하기 때문이다.
간단히 말해서, IMA는 허혈성 스트레스에 의해 대개 생성되는 구조적으로 변형된 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)이다. 인간 혈청 알부민은 인간 신체에 가장 많이 존재하는 단백질(~5%)이며, 585개의 아미노산 잔기를 가지며 66.5 kDa의 분자량을 가진다. 인간 혈청 알부민의 가장 주된 기능 중 하나는 신체 내의 다양한 리간드를 운반하는 기능이며, Ca2+, Co2+, Co3+, Ni2+, Cu+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pt2+ 및 Hg2+와 같은 다양한 금속 이온과 결합하는 것으로 알려져 있다. 인간 혈청 알부민의 3개의 주된 금속 결합 자리는 N-말단 결합 자리(NTS), Cys34 결합 자리, 및 MBS-A(primary multimetal binding site or Cadmium site A)이다. 그 중 NTS는 인간 혈청 알부민에서 금속 이온의 결합 자리로 가장 많이 연구되었으며, 처음으로 규명된 금속 이온 결합 자리이다. 상기 NTS는 Co2+와 같은 금속이온이 결합하는 것으로 알려져 있다. 이러한 금속은 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 Asp-Ala-His-Lys(human) 부위에 결합하며, 앞쪽의 3개의 아미노산이 강한 결합력에 중요한 것으로 알려져 있다. 심근 경색이 발생하면, 상기 N-말단의 Asp-Ala 부위가 절단되면서 IMA가 생성된다.
상기 IMA의 수준은 심근허혈이 발생하고 몇 분 이내에 상승하며, 이는 6시간까지 지속된다. IMA는 어떠한 괴사(necrosis)가 일어나기 전에 생성되므로, IMA는 가역적인 상태에 있는 심근허혈을 조기에 검출할 수 있는 우수한 바이오마커로서 여겨지고 있다. 비교하면, 심장 트로핀의 수준은 비가역적인 세포 손상이 이미 발생한 후에 증가하므로, 이는 허혈의 후기 진단 마커로 볼 수 있다. 따라서, 비가역적인 세포 손상이 일어나기 전에 심근허혈을 검출하기 위해서는 IMA를 검출 마커로 하는 것이 보다 유리하다. 또한, 다양한 문헌에서 뇌졸중(stroke)과 같은 다른 질병에서 IMA 상승 수준이 보고된 바 있다. 이는 IMA 관련된 연구가 다양한 종류의 허혈 상태를 해석하는 것으로 확장되어 가는 것을 의미하는 것이다.
이와 같은, IMA는 2003년 이후로 미국 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받은, 심근허혈을 검출하기 위한 유일한 임상 테스트 방법으로서, 상기 IMA를 정확하고 효과적으로 검출하는 것은 심근허혈의 진단에 매우 유용하므로, IMA를 검출할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 요구되어 왔다.
IMA가 정상적인 인간 혈청 알부민에 비하여 낮은 코발트 결합 능력을 가진다는 사실에 기초하여, Bar-Or, et al.은 환자 혈청에서 IMA 수준을 미간접적으로 측정할 수 있는 ACB(albumin cobalt binding) 테스트를 2000년에 개발한 바 있다(Bar-Or, D.; Lau, E.; Winkler, J. V. J. Emerg. Med. 2000, 19, 311-315.). 간단히 말해서 상기 방법은, 혈청 시료에 코발트를 혼합하고, DTT(dithiothreitol)를 사용하여 인간 혈청 알부민에 결합하지 못한 자유 코발트 이온을 검출하는 방법으로서, 만약 시료가 낮은 수준의 정상 인간 혈청 알부민을 가지고 있다면, 즉, IMA 수준이 높다면, 많은 코발트가 DTT와 상호작용하게 되고, 코발트와 DTT 간의 상호작용에 의해 어두운 색으로 발색되게 된다. 이와 같은 ACB 테스트는 최근 많은 응급 센터에서 심각한 가슴 통증을 가진 환자의 허혈 여부를 빠르게 진단하기 위하여 사용되고 있다.
그러나, 흥미롭게도, 2007년에 Mothes, et al.은 코발트 이온은 인간 혈청 알부민 N-말단의 상기 부위에 주로 결합하는 것이 아니므로 코발트 이온을 이용하여 IMA를 검출하는 ACB 테스트는 허혈 진단에 적절치 못하다는 것을 관찰하였다(Mothes, E.; Faller, P. Biochemistry 2007, 46, 2267-2274.). Mothes, et al.에 따르면, 코발트 이온은 인간 혈청 알부민의 세 개의 분리된 위치에 결합하며, 주로 사이트 A (His 67) 및 사이트 B에 결합하며, Bar-Or, et al.에서 허혈 진단에 사용하고 있는 NTS 부위에는 약하게 결합한다. 따라서, 기존 Bar-Or, et al에 따른 ACB 방법에 사용되는 코발트 이온은, 인간 혈청 알부민의 N-말단 부위가 아닌 사이트 A 및 B에 주로 결합하므로, 상기 방법을 이용하는 경우 IMA를 정확하게 검출할 수 없는 문제점을 지닌다. 따라서, 코발트가 아닌, 인간 혈청 알부민 N-말단의 Asp-Ala에 특이적이며 강하게 결합하는 다른 금속 이온을 사용하여, 높은 민감도 및 특이도를 가지는 IMA의 검출 방법이 개발될 필요성이 대두되어 왔다.
이러한 배경하에 본 발명자들은, IMA를 보다 정확하게 검출하여 허혈의 진단에 이용될 수 있는 어세이 법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 수많은 2가 전이 금속 중에서도 구리 이온이 인간 혈청 알부민의 N-말단에 높은 친화도로 결합하여, 이를 이용하여 IMA 및 허혈을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 구리 이온의 검출에 루시퍼 옐로우(lucifer yellow carbohydrazide) 시약이 구리에 매우 특이적이며, 넓은 범위의 pH 범위에서도 안정함을 확인하고, 상기 시약을 구리 이온을 이용한 본 발명의 IMA 검출 및 허혈 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및 (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약을 포함하는, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 심근허혈을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및 (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약을 포함하는, 심근허혈 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 방법은 인간 혈청 알부민의 N-말단 금속 결합 자리에 높은 결합력을 가지는 구리 이온을 이용하는 방법으로서, N-말단 Asp-Ala 부위가 변이된 인간 혈청 알부민을 효과적으로 검출할 수 있으므로, IMA의 검출 및 허혈의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 펩타이드-금속 상호작용에 대한 HPLC 분석의 크로마토그램을 나타낸 도이다. (a) 0.1mM 테트라펩타이드를 분석하여 자유 펩타이드의 보존 시간(retention time)을 결정하였다 (b-e) 0.1mM 테트라펩타이드 및 동량의 CoCl2, CuCl2, NiCl2, 및 FeCl2를 서로 혼합하고 분석하였다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다.
도 2a 내지 e는, 펩타이드-금속 상호작용에 대한 MS 분석 결과를 나타낸 도이다. (a) 테트라펩타이드는 암모늄 염으로서, 487.2633 m/z에서 검출되었다. (b) 펩타이드-코발트 복합체는 포타슘 염으로서, 567.1276 m/z에서 검출되었다. (c) 펩타이드-구리 복합체는 포타슘 염으로서,571.1195 m/z에서 검출되었다. (d) 펩타이드-철 복합체는 나트륨 염으로서, 548.1519 m/z에서 검출되었다. (e) 펩타이드-니켈 복합체는 포타슘 염으로서, 566.1267 m/z에서 검출되었다.
도 3은, 알부민 N-말단 테트라펩타이드에 대한 금속 친화도에 대한 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 도이다. 0.1mM 테트라펩타이드 및 0.1mM CoCl2 또는 CuCl2는 그림에 표시된 순서대로 혼합하였으며, 각 시료를 분석하였다.
도 4a 내지 j는, 알부민 N-말단 테트라펩타이드에 대한 금속 친화도에 대한 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 도이다. 도 3에 나타낸 금속과 다른 금속 이온을 사용하여 도 3의 방법과 동일한 방법을 수행하였다. (a-b) CoCl2 및 FeCl2, (c-d) CuCl2 및 FeCl2, (e-f) CoCl2 및 NiCl2, (g-h) CuCl2 및 NiCl2, (i-j) FeCl2 및 NiCl2. 모든 실험은 최소한 3번 이상 수행되었다.
도 5는, LY(Lucifer yellow)의 특성을 분석한 도이다. (a) LY의 분광학적 스펙트럼을 관찰하여, 적절한 여기 파장을 결정하였다. 즉, ABSUmax는 430nm를 나타내었다. (b) 여기 파장은 430nm로 고정하였고, RFUs(relatvie fluorescence unit)는 450 내지 750nm의 방출 파장 범위에서 측정하였다.
도 6은, LY(Lucifer yellow) 및 LY-Cu 간의 상호작용에 대한 pH 효과를 확인한 도이다. (a) 다양한 pH를 가진 200μL의 50mM NaH2PO4에서, 0.004μmol LY의 RFU를 430㎚의 여기 파장 및 540㎚의 방출 파장에서 각각 측정하였다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다. 그래프에서, 바(bar)는 평균±표준편차를 의미한다. (b) 0.004μmol LY 및 0 내지 0.01 μmol의 CuCl2를 다양한 pH의 200μL의 50mM NaH2PO4에 혼합한 다음, RFU를 430㎚의 여기 파장 및 540㎚의 방출 파장에서 측정하였다. 점(Dots)은 평균±표준편차를 의미하며, 선(line)은 점의 추세선(trend line)을 나타낸다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다.
도 7은, Cu에 의해 유도되는 LY 형광의 소광(quenching)을 나타내는 도이다. 0.004μmol LY 및 0 내지 0.03μmol CuCl2를 서로 혼합한 다음, RFUs를 검출하였다. F0는 구리가 없는 최초 LY 형광을 의미하며, F는 소광된 형광을 의미한다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다. 점(Dots)은 평균±표준편차를 의미하며, R2는 추세선의 신뢰도를 나타낸다.
도 8은, 인큐베이션 시간의 최적화에 대한 도이다. (a) LY 및 Cu2+의 배양 시간을 하기와 같이 결정하였다. 0.004μmol LY 및 0.01μmol CuCl2를 200μL의 50mM NaH2PO4(pH 7.4)에서 서로 혼합하고, 0 내지 60분간 인큐베이션하였다. (b) HSA 및 Cu2+의 인큐베이션을 하기와 같이 결정하였다. 4% HSA 및 0.025μmol CuCl2를 200μL의 50mM NaH2PO4(pH 7.4)에서 0 내지 60분간 인큐베이션시킨 다음, 0.004μmol LY를 첨가하였으며, RFUs는 첨가 후 10분 뒤에 검출하였다. LY 단독 및 LY 및 Cu2+의 혼합액 역시 레퍼런스로서 검출하였다. (c) LY 및 HSA-Cu 복합체의 인큐베이션 시간을 하기와 같이 결정하였다. 4% HSA 및 0.025 μmol CuCl2를 10분간 인큐베이션한 다음, LY를 0 내지 60분간 인큐베이션하고, RFU를 검출하였다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행하였다. 여기서, 바(bar)는 평균±표준편차를 의미하며, ns는 실선 위에 표시된 각 바 그래프에 대해 비-유의하다는 것을 의미한다.
도 9는, 각 시약의 첨가 순서에 따른 효과를 나타낸 도이다. 0.025μmol CuCl2, 4% HSA, 및 0.004μmol LY를 바 그래프의 X 축에 표시된 순서로 첨가하였다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행하였다. 여기서, 바(bar)는 평균±표준편차를 의미하며, ns는 실선 위에 표시된 각 바 그래프에 대해 비-유의하다는 것을 의미한다.
도 10a 내지 d는, 구리 이온에 대한 LY의 특이도를 나타낸 도이다. 0.004μmol LY를 (a) 0μmol, (b) 0.0005μmol, (c) 0.001μmol, (d) 0.002μmol의 CuCl2과 혼합한 다음, 0 내지 0.02μmol CoCl2, FeCl2, 및 NiCl2를 첨가하였다. 검은색 바(bar)는 CoCl2의 결과를 나타내며, 회색 바는 FeCl2의 결과를 나타내며, 그늘진 바는 NiCl2의 결과를 나타낸다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행하였으며, 바는 평균±표준 편차를 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. LY-Cu 혼합물의 값
도 11은, 본 발명의 ACuB 어세이의 선형을 나타내는 것이다. 0.025μmol CuCl2를 1.5% 내지 5.5% HSA와 10분간 인큐베이션한 다음, 0.004μmol LY를 첨가하여 RFU를 측정하였다. 모든 실험은 3번 이상 수행하였다. 여기서, 점(Dots)은 평균±표준편차를 의미하며, 실선은 모든 점의 추세선을 나타낸다. R2는 추세선의 신뢰도를 나타낸다.
도 12는, 본 발명의 ACuB 어세이를 통한 in vivo 시료의 분석 결과를 나타내는 도이다(Normal n=4, Stroke n=3). (a) 시료를 본 발명의 ACuB 어세이로 실험한 결과를 나타낸 도이다. (b) (a)의 결과를 동물 시료 내의 정상 알부민의 비율로 환산한 도이다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다.
도 13은, ACB 어세이를 통한 in vivo 시료의 분석 결과를 나타내는 도이다. 50μL의 0.1% CoCl2 및 200μL의 시료를 조심스럽게 혼합한 다음, 10분간 인큐베이션하였다. 그 다음, 50μL의 1.5mg/mL DTT를 첨가한 다음, 2분 후, 1mL의 0.9% NaCl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 470nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성되는 단백질을 의미한다. 상기 알부민은 자연상태에 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 적다. 혈액 중의 혈청알부민은 혈장 부피를 유지하고 회복시키는 기능이 있어서 과다 출혈에 따른 쇼크를 방지하고 수술 및 화상치료 등에 사용된다. 또한 헤모글로빈과 유사한 산소전달 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 알부민은 혈장으로부터 유래한 것이거나, 유전자 조작에 의해 제조된 재조합 알부민일 수 있으며, 바람직하게는 혈장 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알부민에 대한 유전적 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 1의 인간혈청알부민일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "천연형 알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성되는 단백질로서, 자연적으로 존재하는 알부민의 가장 전형적인 형태를 의미한다. 또한, 상기 천연형 알부민은 정상적인 개체 또는 야생형에 존재하는 알부민 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "변이된 알부민"은 천연형 알부민의 N-말단에 존재하는 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 형태의 알부민으로서, 천연형 알부민의 N-말단의 금속결합자리에 대한 결합력이 감소 또는 상실한 알부민 단백질을 의미한다. 상기 변이된 알부민은 바람직하게는 천연형 알부민의 N-말단에 존재하는 아스파르트산 및 알라닌 잔기가 절단된 형태의 알부민을 의미하며, 상기 잔기가 절단된 알부민 단백질로서, 나머지 아미노산 서열이 천연형 알부민과 동일한 단백질 및 천연형 알부민의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가진 변이된 단백질도 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 변이된 알부민은 바람직하게는 IMA(ischemia-modified albumin)이다.
본 발명에서 용어, "IMA(ischemia-modified albumin)"는 알부민의 N-말단에 구조적 변화가 생김으로써 2가 금속 이온과의 결합능이 저해된 변이된 알부민 단백질을 의미한다. 바람직하게는 상기 IMA는 알부민의 N-말단에 위치한 Asp-Ala가 절단된 형태의 알부민 단백질로서, 심근이 허혈 상태에 노출되는 경우, 산화유리기의 생성, 저산소증으로 인한 산증 등으로 인하여 상기 Asp-Ala 부위가 절단됨으로써 상기 부위에 결합하는 2가 금속 이온과의 결합력이 저하된 단백질을 의미한다. 상기 IMA는 허혈 초기부터 생성되며, 허혈 발생 후 6시간 정도까지 존재한다. 이와 같은, IMA는 허혈의 바이오마커를 의미하며, 특히 허혈의 조기 진단을 가져올 수 있는 표지자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 IMA를 검출하는 경우, 허혈을 조기에 진단할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에서 용어, "허혈(ischemia)"은 조직, 장기의 산소수요에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태를 의미한다. 특히, 심근허혈은 관상 동맥 혈액 공급의 장애로 유발되는 질환을 의미한다. 허혈이 지속되는 동안, 호기성 대사장애, ATP 생산 저하에 따른 세포 기능 부전 등을 가져오며, 조기 치료를 받지 못하는 경우에는 비가역적인 세포 손상을 가져와 결국 장기 손상을 초래하게 된다. 따라서, 허혈을 적절히 치료하기 위해서는 허혈을 조기에 진단할 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
상기 IMA는 허혈 초기부터 혈중에 검출되며, 상기 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌 잔기가 절단된 변이된 알부민 단백질로서, 2가 금속 이온에 대한 낮은 결합력을 가지므로, 2가 금속 이온을 상기 변이된 알부민 단백질을 포함하는 시료와 반응시키는 경우, 알부민에 결합하지 않은, 자유 2가 금속 이온이 시료 내에 존재하게 된다. 반면, IMA와 같은 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌 잔기가 절단된 변이된 알부민 단백질을 포함하지 않는 시료의 경우, 2가 금속 이온을 반응시키게 되면, N-말단의 상기 금속결합부위에 결합하게 되므로, 알부민에 결합하지 않은, 자유 2가 금속 이온의 양이 IMA를 포함하는 시료에 비하여 적게 존재한다. 이를 토대로, 2가 코발트 이온을 이용하여 IMA를 검출하는 ACB 테스트법이 개발되었으나, 코발트 이온은 알부민의 N-말단 부위 외에도 사이트 A 및 B에 결합하며, N-말단 부위가 코발트 이온의 주된 결합 사이트가 아니므로, 상기 ACB 테스트법은 정확하게 IMA를 검출할 수 없는 한계를 가진다. 따라서, IMA를 높은 민감도 및 특이도로 검출하기 위해서는 인간 혈청 알부민의 상기 N-말단의 Asp-Ala 부위가 주된 결합 위치면서도, 상기 부위에 높은 결합력을 지녀 다른 물질, 예컨대 금속이온 검출 시약 등과 반응시켜도 해리되지 않는 이온을 사용하는 것이 중요하다.
이에 본 발명에서는, 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 금속결합부위인 Asp-Ala-His-Lys 아미노산 잔기에 결합하는 금속 이온 중 구리 이온이 코발트, 철 및 니켈 등 여러 2가 전이금속 이온 중에서도 높은 친화도를 가지고 상기 부위에 결합하는 것을 규명하였다. 이를 토대로 본 발명에서는 구리 이온을 이용하여 상기 변이된 알부민 단백질, 즉 IMA를 검출하는 방법을 개발하였으며, 이를 ACuB 어세이로 명명하였다.
본 발명의 방법에서 (a) 단계는 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계이다.
상기 2가 구리 이온, 알부민을 포함하는 분리된 시료 및 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약은 동시에 또는 순차적으로 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 순차적으로 반응시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
2가 구리 이온, 알부민을 포함하는 분리된 시료 및 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 순차적으로 반응시킬 경우, 상기 (a) 단계는 (i) 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+)과 알부민을 포함하는 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 시료에 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 첨가하는 단계를 포함하거나, (i) 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+)과 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 2가 구리 이온(Cu2+) 및 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약에 알부민을 포함하는 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 구리 이온, 알부민을 포함하는 시료 및 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약인 LY의 순서; 및 구리 이온, 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약인 LY 및 알부민을 포함하는 시료의 순서로 혼합하여, LY 형광을 검출한 결과, 혼합 순서와 관계없이 동일한 결과를 나타내었다(도 9). 또한, 상기 시료의 인큐베이션 시간 역시 반응 결과에 크게 영향을 보이지 않는 결과를 나타내었다(도 8). 따라서, 본 발명의 방법은 알부민 및 구리 이온 간의 강한 결합을 이용하므로, 혼합 순서에 관계없이 동일한 결과를 산출할 수 있으며, 상기 시약을 짧은 시간 반응시켜도 신뢰성이 있는 결과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 용어, "알부민을 포함하는 분리된 시료"는 본 발명의 방법을 이용하여 변이된 알부민의 존재 또는 양을 검출하기 위한 시료로서, 천연형 알부민의 N-말단의 Asp-Ala를 포함하는 형태의 알부민 또는/및 상기 Asp-Ala가 소실된 변이된 알부민을 포함한다. 상기 알부민을 포함하는 분리된 시료는 생물학적 시료일 수 있으며, 그 예로 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 방법을 적용하여 IMA를 검출함으로써 허혈을 진단할 수 있다.
또한, 상기 알부민을 포함하는 분리된 시료에서 알부민의 농도는 바람직하게는 시료 총 중량 대비 1.5 중량% 내지 5.5 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 1.5% 내지 5.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 시료에서, 본 발명의 방법을 적용하여 자유 구리 이온의 형광을 측정한 다음, 이를 F0/F 값으로 산출하여 그래프를 도출한 결과, 농도에 따른 F0/F 값이 직선성을 나타내었다(도 11). 즉, 본 발명의 방법이 1.5% 내지 5.5%의 농도로 알부민을 포함하는 시료에서 천연형 인간 혈청 알부민 및 IMA를 검출하는데 있어 높은 신뢰도를 나타냄을 시사하는 것이다. 또한, 이러한 결과는 혈중 인간혈청알부민의 농도는 5% 내외이므로, 본 발명의 방법은 혈액을 시료로 사용하여도 높은 신뢰도 및 정확도로 인간혈청알부민을 검출할 수 있음을 나타내는 것이다.
본 발명에서 용어, "2가 구리 이온(Cu2+)"은 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리, 즉 Asp-Ala-His-Lys에 결합 가능한 2가 전이 금속으로서, 본 발명의 목적상 N-말단의 Asp-Ala이 존재하는 알부민에는 결합하나, 상기 Asp-Ala 부위가 소실된 변이된 알부민, 예컨대 IMA에는 결합하지 않는 금속 이온을 의미한다. 상기 2가 구리 이온은 IMA에는 낮은 결합 정도를 보이므로, 2가 구리 이온을 상기 알부민을 포함하는 시료와 반응시킨 다음, 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온의 양을 검출하는 경우, 상기 Asp-Ala 부위가 소실된 변이된 알부민 단백질을 검출할 수 있고, 바람직하게는 IMA를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 2가 구리 이온은 시료 중 알부민의 양을 천연형 알부민의 양으로 환산하여, 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합할 수 있는 2가 구리 이온의 포화량 또는 그 이상의 양으로 알부민을 접촉시킬 수 있다.
포화량 이상의 2가 구리 이온을 알부민을 포함하는 시료와 반응시키는 경우, 상기 변이된 알부민 및 천연형 알부민을 모두 포함하는 시료에서, 변이된 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온이 검출이 용이할 정도로 존재하게 되므로, 포화량 이상의 2가 구리 이온을 반응시키는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약"은 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약으로서, 그 예로 클로로필린(chlorophylilin), FHP(2-pyridylaldehyde fluorescein hydrazone), 1,3,5-트리페닐벤젠(Triphenylbenzene) 형광단, 디에틸디티오카바메이트(diethyldithiocarbamate), 테트라티오몰리데이트(tetrathiomolybdate) 또는 LY(lucifer yellow) 시약일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 클로로필린을 이용하여 자유 2가 구리 이온을 검출하는 원리에 대해서는 Gao J et al(Spectrochim. Acta A 2011, 79, 849-857.)에 기술되어 있으며, 상기 FHP를 이용하여 자유 2가 구리 이온을 검출하는 원리에 대해서는 Huo FJ et al(Anal Chem. 2012 Mar 6;84(5):2219-23.)에 기술되어 있으며, 상기 1,3,5-트리페닐벤젠 형광단을 이용하여 자유 2가 구리 이온을 검출하는 원리에 대해서는 Sirilaksanapong, S et al(Chem. Commun. 2012, 48, 293-295.)에 기술되어 있다. 또한, 상기 디에틸디티오카바메이트를 이용하여 자유 2가 구리 이온을 검출하는 방법에 대해서는 Zeiner M et al(Water Environ Res. 2010 Feb;82(2):183-6.)에 기술되어 있으며, 상기 테트라티오몰리데이트를 이용하여 자유 2가 구리 이온을 검출하는 방법에 대해서는 George GN et al(J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1704-1705.)에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약은 바람직하게는 LY(lucifer yellow) 시약이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는, 상기 천연형 알부민 N-말단의 Asp-Ala 잔기가 변이된 알부민에 결합하지 못한, 자유 2가 구리 이온을 검출할 수 있는 시료로서 LY를 최종적으로 선별하였고, 상기 LY가 안정적이면서도 높은 감도로 천연형 알부민 N-말단의 Asp-Ala 잔기가 변이된 알부민 단백질, 예컨대 IMA를 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "LY(lucifer yellow)"는 형광 염료로서, 6-amino-2-(hydrazinecarbonyl)-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonate de dilithium로도 명명된다. 상기 LY는 구리 이온과 결합하면 소광되는 특성을 지니므로, 상기 LY의 형광을 측정함으로써, 다시 말해서, 구리 이온에 의해 유도된 LY 소강값을 측정함으로써 자유 2가 구리 이온을 검출할 수 있다. 즉, 상기 자유 2가 구리 이온은 2가 구리 이온, 알부민을 포함하는 시료 및 LY를 서로 접촉시킨 다음, LY의 여기 파장 및 LY의 방출 파장을 측정하여, 자유 2가 구리 이온을 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 LY의 여기 파장은 430nm일 수 있으며, 방출 파장은 540nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 LY 시약과 자유 2가 구리 이온 간의 반응은 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 9.5의 범위에서 수행될 수 있으며, 더욱 바람하게는 pH 7.4에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 생리학적 조건과 유사한 조건에서 반응하기 위하여 50mM NaH2PO4 완충액 하에서 반응시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 LY 시약과 자유 2가 구리 이온 간의 반응이 pH 4.5 내지 9.5 범위에서 Cu에 의해 LY 형광이 완전히 소광되는 결과를 나타냄을 확인하였다(도 6).
본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계는 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계이다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 반응시킨 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약의 발색 또는 형광을 이용하여 자유 2가 구리 이온의 양을 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 상기 (a) 단계의 자유 2가 구리 이온을 검출할 수 있는 시약이 LY(lucifer yellow)인 경우, LY의 형광을 측정함으로써 자유 2가 구리 이온의 양을 측정할 수 있다. 상기 LY는 알부민에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온과 결합하게 되면 소광되는 특성을 지니므로, 구리 이온과의 결합에 의해 유도되는 LY 소광 정도를 측정함으로써 자유 2가 구리 이온의 양을 측정할 수 있다. 또한, 구리가 없는 최초 형광(F0)에 대하여 소광된 형광(F)을 상대적인 형광 유닛(relative fluorescence unit, RFU)인 F0/F로 나타내어, LY 소광 정도를 나타낼 수 있다.
나아가 다양한 기지 농도의 자유 구리(Ⅱ) 이온 용액을 이용하여 LY와 반응시킨 다음, 검정곡선을 얻고 측정된 LY의 형광값을 상기 검정곡선에 대입하여 시료 중 알부민에 결합되지 않은 자유 2가 구리 이온의 양을 계산할 수 있다. 또한, 다양한 기지 농도의 알부민 시료를 구리 이온의 존재하여 LY 시료와 반응시킨 다음, F0/F 값을 측정하여 검정곡선을 얻고, 측정된 F0/F 값을 대입하여, 구리가 결합된 알부민의 농도를 산출할 수 있다. 이렇게 산출된 구리가 결합된 알부민의 농도가 일반적인 혈중 알부민의 농도 또는 대조군에 비하여 낮으면 IMA가 존재하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 방법은 (c) 상기 시료의 자유 2가 구리 이온의 양이 대조군에 비하여 많으면 변이된 알부민이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 N-말단의 Asp-Ala 잔기가 변이된 알부민 단백질은 자유 2가 구리 이온과 낮은 결합력을 지니므로, 천연형 알부민을 포함하는 대조군에 비하여, 자유 2가 구리 이온의 수준이 높으므로, 상기 (b) 단계에서 측정된 자유 2가 구리 이온의 양을 대조군과 비교하여, 변이된 알부민의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 알부민의 N-말단의 금속결합부위(Asp-Ala-His-Lys)에 결합할 수 있는, 코발트, 구리, 니켈 및 철을 포함하는 2가 전이 금속 중에서도 구리 이온이 알부민의 N-말단의 상기 금속결합부위에 매우 높은 결합력을 가짐을 확인하였고, 구리 이온과 결합한 상기 알부민 N-말단에 대한 테트라펩타이드는 다른 2가 금속 이온을 첨가하여도 해리되지 않는 결과를 나타내어, 알부민의 Asp-Ala 잔기가 절단된, 변이된 알부민을 검출함에 있어 구리 이온을 이용함이 유용함을 확인하였다(실험예 1). 또한, 상기 구리 이온을 검출할 수 있는 시약으로서, LY 시약을 선정하였고, 상기 LY 시약에 대한 최적화된 조건을 확립하였다. 구체적으로, LY 시약과 구리 간의 결합에 pH가 미치는 영향을 확인한 결과, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 상기 결합이 효과적으로 일어남을 확인하였으며, 특히 생리학적 조건과 유사한 pH 7.4에서 가장 결합이 효과적으로 일어남을 확인하였다. 나아가, 상기 0.004mol LY의 형광을 0.025μmol CuCl2가 완전히 소광시킬 수 있음을 확인하였으며, 상기 반응에 사용될 수 있는 완충액으로서, 50 mM NaH2PO4 완충액이 적절하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 LY, 구리 및 인간혈청알부민 간의 상호작용은 인큐베이션 시간과 관계없이 동일한 결과를 나타내어, 반응시간은 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였고, LY, 구리 및 인간혈청알부민의 혼합 순서 역시 본 방법의 결과에 큰 영향을 나타내지 않음을 확인하였다(실험예 2). 최종적으로, 본 발명의 어세이의 유효성을 확인한 결과, 본 발명의 어세이 방법은 실제 혈중 HSA 농도(~5%)를 포함하는 1.5% 내지 5.5%의 인간혈청알부민의 농도에서 직선성을 나타낼 수 있음을 확인하여, 혈액 시료를 이용한 IMA 검출에 있어서도 유용할 수 있음을 나타내었다. 또한, 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 이용하여 IMA를 검출한 결과, 기존에 사용된 ACB 어세이는 IMA를 유의적으로 검출하지 못한 반면, 본 발명의 구리 이온을 이용한 어세이 방법은 IMA를 유의적으로 검출할 수 있는 결과를 나타내어, 본 발명의 방법이 IMA의 검출, 나아가 허혈의 진단에 매우 높은 민감도 및 특이도를 가지는 방법임을 재확인하였다(실험예 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및 (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 포함하는, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민 검출용 키트를 제공한다.
상기 알부민, 구리염용액, 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약 및 변이된 알부민에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 키트는 상기 용액 및 시약과 알부민을 포함하는 시료를 반응시킬 수 있는, 50㎕ 내지 500㎕의 수용 부피를 갖는 하나 이상의 구획을 포함하는 투명한 검출 용기를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 검출할 시료 내에 존재하는 알부민의 양을 측정하는 시간을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 변이된 알부민 검출용 키트는, 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리염용액 및 알부민에 결합하지 않은 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 포함하므로, 이를 알부민을 포함하는 분리된 시료와 반응시켜, 천연형 알부민 N-말단의 Asp-Ala 부위가 변이된 알부민 단백질의 존재를 검출할 수 있다. 또한, 상기 키트는 바람직하게는 IMA를 검출하기 위한 용도, 나아가 허혈 진단 용도로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 심근허혈(myocardiac ischemia)을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 2가 구리 이온, 알부민, 알부민을 포함하는 분리된 시료, 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약 및 심근허혈에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 (a) 및 (b) 단계에 대해서도 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 방법은 (c) 상기 시료의 자유 2가 구리 이온의 양이 대조군에 비하여 많으면 심근허혈로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
IMA는 구리가 결합할 수 있는 천연형 알부민 N-말단의 Asp-Ala가 절단된 형태로서, 구리 이온에 낮은 결합력을 나타낸다. 따라서, 심근허혈에 의한 IMA를 포함하는 시료의 경우, 천연형 알부민을 포함하는 대조군에 비하여 알부민에 결합하지 못한 자유 2가 구리 이온이 많이 존재하게 되므로, 측정한 자유 2가 구리 이온의 양을 서로 비교하여 심근허혈의 발생 여부를 진단할 수 있다.
또한, 상기 방법 외에도 상기 (b) 단계에서 측정된 자유 2가 구리 이온의 양을 표준곡선의 기지의 값과 비교하여 심근허혈의 발생 여부를 판정할 수 있다.
구체적으로, 다양한 기지의 농도의 자유 구리(Ⅱ) 이온 용액을 이용하여 LY와 반응시킨 다음, 검정곡선을 얻고 측정된 LY의 형광값을 상기 검정곡선에 대입하여 시료 중 알부민에 결합되지 않은 자유 2가 구리 이온의 양을 계산하여, 심근허혈의 발생 여부를 판정할 수 있다. 또한, 다양한 기지 농도의 알부민 시료를 구리 이온의 존재하여 LY 시료와 반응시킨 다음, F0/F 값을 측정하여 검정곡선을 얻고, 측정된 F0/F 값을 대입하여, 구리가 결합된 알부민의 농도를 측정하여, 일반적인 혈중 알부민의 농도에 비하여 낮으면 심근허혈이 발생한 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 이용하여, 본 발명의 방법이 IMA를 효과적으로 검출하며, 허혈을 진단할 수 있음을 확인하였다(도 12).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및 (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약을 포함하는, 심근허혈 진단용 키트를 제공한다.
상기 알부민, 구리염용액, 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약 및 변이된 알부민에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 키트는 상기 용액 및 시약과 알부민을 포함하는 시료를 반응시킬 수 있는, 50㎕ 내지 500㎕의 수용 부피를 갖는 하나 이상의 구획을 포함하는 투명한 검출 용기를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료의 준비
인간 혈청 알부민의 N-말단의 테트라펩타이드(DAHK)는 펩트론 사(한국)으로부터 합성 및 구입하였다. 염화코발트(Ⅱ)(CoCl2), 염화구리(Ⅱ)(CuCl2), 염화니켈(Ⅱ)(NiCl2), 염화철(Ⅱ)(FeCl2), 동결건조된 인간혈청알부민, 포름산 암모늄(ammonium formate), 및 루시퍼 옐로우 카르바지드(lucifer yellow carbohydrazide, LY-CH 또는 LY) 다이리튬염은 시그마 사(미국)에서 구입하였다. NaH2PO4(Sodium dihydrogen phosphate)는 준세이 케미칼 사(일본)에서 구입하였으며, 수산화나트륨(NaOH)은 삼천 케미칼 사(한국)에서 구입하였고, H3PO4(phosphoric acid)는 산토쿠 케미컬 인더스트리 사(일본)에서 구입하였다.
실시예 2: HPLC 및 MS(Mass spectrometry) 분석
본 실험에서 사용한 HPLC의 가동 조건은 하기와 같았다:
이동상은 컬럼 Synergi 4U Fusion-RP 80 A(C18, 250 × 4.6 mm, 4 μm) (Phenomenex, USA)을 통하여, 등용매 모드(isocratic mode)에서 1mL/분의 유속으로 가동하였으며, 시료 주입 부피는 20μL였다. 또한, 시료 검출 파장은 220 ㎚으로 확립하였다. Agilent 1100 Series(Agilent Technologies, USA)를 시료 검출에 사용하였으며, Agilent ChemStation for LC 3D(Agilent Technologies, USA)를 결과해석에 사용하였다.
본 실험에서 사용한 MS 분석 조건은 하기와 같았다:
이동상으로서 5mM 포름산 암모늄(ammonium formate, pH measured as 6.93)을 0.4mL/분의 등용매 공급, 양전하 모드(positive mode), 가스 온도 350℃, ESI Vcap voltage 4,000V, 시료 주입 부피 2μL.
6220 Accurate-Mass TOF LC/MS(Agilent Technologies, USA)를 펩타이드-금속 복합체를 검출하는데 사용하였으며, 상기 결과는 MassHunter Workstation Software, Qualitative Analysis(Agilent Technologies, USA)로 분석하였다.
실시예 3: 통계분석
본 발명의 모든 실험은 최소 3번 이상 수행되었으며, 모든 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 통계 자료는 GraphPad Instat version 3.10(GraphPad Software, USA)와 함께 ANOVA(one-way analysis of variance)로 산출하였으며, 두 값의 차이는 p < 0.05일 때, 통계적으로 다른 것으로 판단하였다.
실험예 1: Co 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , 및 Fe 2+ 와, HSA의 NTS 펩타이드 간의 상호작용 확인
IMA 검출에 필요한 적절한 이온을 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 알부민 N-말단 서열을 가지는 테트라펩타이드(Asp-Ala-His-Lys, DAHK)를 합성하였고, 이를 NTS 테트라펩타이드(DAHK, MW 469)로 명명하였다. 그 다음, 상기 테트라펩타이드를 CoCl2, CuCl2, NiCl2, 및 FeCl2과 각각 인큐베이션하였다. 보다 구체적으로 최종 0.1mM 테트라펩타이드 및 0.1mM 금속 이온을 서로 혼합한 다음, 10분간 인큐베이션하였으며, 이를 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석한 다음, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 도 1a에 나타낸 자유 펩타이드 피크의 보존 시간을 이용하여, 도 1b 내지 e의 펩타이드-금속 복합체 또는 남은 펩타이드에 부합하는 각 피크를 표시하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 코발트, 구리, 철 및 니켈 이온은 상기 테트라펩타이드와 상호작용할 수 있음을 나타내었다.
또한, 펩타이드 및 금속 이온의 인큐베이션으로 생성된 펩타이드-금속 복합체를 추가로 확인하기 위하여, ESI-TOF-MS(electrospray ionization-time of flight-mass spectrometry)로 분석하였다. 구체적으로, 최종 5pM 농도의 테트라펩타이드 및 5pM 금속 이온을 10분간 인큐베이션한 다음, 분석하였다. 이때, 펩타이드-금속 복합체의 형성 여부는 포타슘 또는 나트륨염 형태로 분석하였으며, 그 결과는 도 2에 나타냈다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 코발트, 구리, 철 및 니켈 이온은 상기 테트라펩타이드와 상호작용할 수 있음을 나타내었다.
상기 도 1 및 2에서 확인한 결과에 기초하여, 상기 금속 이온 중에서 알부민에 가장 강하게 결합할 수 있는 금속을 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 펩타이드에 대한 각 금속의 서로 다른 친화도를 비교하기 위하여, 두 금속 이온 간의 경쟁을 이용하여 알부민 N-말단 테트라펩타이드에 대한 금속 친화도를 분석한 HPLC를 수행하였다. 이를 위하여, 상기 펩타이드와 한 종류의 금속을 서로 10분간 인큐베이션한 다음, 다른 종류의 금속을 첨가하였고, 추가로 10분간 더 인큐베이션하였다. 모든 반응은 in vivo 환경과 유사하도록 50mM NaH2PO4(pH 7.4)의 이동상에서 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 코발트 및 펩타이드를 먼저 혼합한다음, 구리를 첨가하였을 때, 펩타이드-코발트 및 펩타이드-구리 피크 모두 관찰된 반면(도 3a), 구리 및 펩타이드를 먼저 혼합한 다음, 코발트를 첨가하였을 때에는 펩타이드-구리 피크만이 관찰되었다(도 3b). 즉, 이러한 결과는, 구리 이온이 이미 펩타이드에 결합된 상태에서는 코발트 이온은 구리 이온을 대체하지 못함을 나타내는 것으로 구리 이온이 인간 알부민 N-말단의 테트라펩타이드에 대하여 코발트에 비하여 매우 높은 친화도를 가지고 있음을 시사하는 결과이다.
또한, 상기 도 3과 같은 방식으로, 다른 금속 이온에 대해서도 친화도를 HPLC를 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 알부민 N-말단의 테트라펩타이드에 대한 금속 이온의 친화도는 Cu2+>Ni2+>Co2+>Fe2+순으로 나타났다.
상기 결과를 바탕으로, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 가장 높은 친화도를 가지는 구리 이온을 IMA 수준을 검출할 수 있는 방법에 대한 금속 이온으로 선정하였다.
실험예 2: 본 발명의 알부민-구리 결합(ACuB) 어세이의 확립
상기 구리 이온을 이용하여 IMA를 효과적으로 검출하기 위하여, 구리 검출에 사용할 시약을 하기와 같이 선정하고, 이에 최적화된 조건을 설정하였다.
우선, 구리에 결합하는 것으로 기존에 보고된 많은 시약 중에서, LY를 구리 선택적인 검출 시약에 대한 최종 후보로 선정하였다. 그 다음, LY에 적합한 여기 및 방출 파장을 선택하기 위하여, 하기와 같이 LY에 적합한 여기 및 방출 파장을 조사하였다.
구체적으로, 흡광도는 multi-functional microplate reader Infinite® 200 PRO(Tecan, Switzerland)로 측정하였고, i-controlTM software(Tecan, Switzerland)로 분석하였다. 또한, 형광은 형광 마이크로플레이트 검출기 Spectra MAX Gemini EM(Molecular Devices, USA)로 측정하였으며, SoftMax Pro Software(Molecular Devices, USA)로 분석하였다. 모든 흡광도 및 형광값은 각각 ABSU(Absorbance units) 및 RFU(relative fluorescence units)으로 산출하였다(도 5).
도 5에 나타낸 결과를 기초로 본 발명에서는, 430 nm를 LY의 여기 파장으로, 540 nm를 LY의 방출 파장으로 설정하였다.
그 다음, LY 형광 및 LY와 구리 간의 결합에 pH가 미치는 영향을 관찰하여, 본 발명의 방법에서 LY 및 구리 간의 반응 시 사용할 수 있는 적절한 pH 범위를 설정하였다.
구체적으로, 구리를 포함하거나 포함하지 않는, 다양한 pH 조건의 완충액으로 LY의 RFU를 측정하였다. pH 1.5 내지 12.4 범위의 50mM NaH2PO4 반응 완충액은 NaOH 및 H3PO4을 사용하여 제조하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, LY 자체는 강염기 조건을 제외하고는 모든 조건에서 상대적으로 안정한 결과를 나타내었으며, 특히 pH 1.5 내지 10.5 범위에서 안정한 결과를 나타내었다(도 6 a). 또한, Cu에 의해 유도된 LY 형광 소광은 pH 4.5 내지 pH 9.5의 범위에서 효과적으로 일어났으며, 특히 pH 7.4에서 우수한 결과를 나타내었다(도 6 b). 본 결과를 기초로, 그 뒤 모든 실험들은 생리학적인 pH에 가장 가까운, pH 7.4의 완충액 조건 하에서 실시하였다.
또한, Cu-유도된 LY 소광값을 식으로 하기와 같이 산출하였다.
스턴-보머 연관성(Stern-Volmer relationship)은 많은 형광 강화/소광 메커니즘을 설명함에 있어 기존에 사용된 방법이나, 본 발명의 Cu-유도된 LY 소광은 상기 스턴-보머식에 부합하지 않는 결과를 나타내어, 이를 F0/F식으로 산출하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 Cu-유도된 LY 소광값을 F0/F식으로 산출하였을 때, S자 커브(sigmoidal curve)를 나타내는 결과를 보였다. 아울러, 구리 이온을 처리하여 LY의 형광이 완전히 소광되는 농도를 확인한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 0.025μmol의 구리가 LY 형광을 완전히 소광시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
최종 확립 과정으로서, 0.004μmol LY 및 0.025μmol CuCl2을 최종 200μL 부피 및 최종 농도 50 mM NaH2PO4(pH 7.4)를 가지는 완충액에 혼합하였다. 그 다음, 각 시약 간의 인큐베이션 시간의 효과를 확인하였다.
구체적으로, LY 및 구리, HSA 및 구리, 및 마지막 HSA-Cu 및 LY를 0 내지 60분간 혼합하였다. 동결건조된 HSA는 DDW(double distilled water)에 녹여, 4% HSA 시료를 제조하였고, 40μL가 첨가되었다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, LY 및 구리 간의 상호작용, HSA 및 구리 간의 상호작용 및; LY 및 HSA-Cu 혼합물 간의 상호작용은 0 내지 60분의 인큐베이션 시간에 영향을 받지 않는 결과를 나타내었다.
따라서, 알부민을 포함하는 시료 및 구리를 혼합하고, 이를 10분간 인큐베이션하여도 알부민 및 구리 간의 상호작용이 일어나기에 충분한 시간이며, LY를 첨가한 즉시 형광을 측정하여도 신뢰도 있는 결과를 얻을 수 있음을 시사하였다.
또한, 동일한 결과를 얻을 수 있는 각 시약의 혼합 순서를 규명하기 위하여 각 시약을 하기와 같은 순서로 혼합하였다.
구체적으로, 첫 번째 세트는 구리, LY 및 HSA의 순서였으며, 두 번째 셋트는 구리, HSA 및 LY의 순서였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 각 시약의 혼합 순서에 관계없이 동일한 결과를 나타내는 결과를 보였으며, 알부민-결합된 구리는 LY에 영향을 주지 않는 결과를 나타내었다.
실험예 3: 본 발명의 ACuB 어세이의 유효성 확인
상기 실험예 2를 통하여 최종적으로 최적화된 ACuB 어세이는 하기와 같았다:
40μL 시료 및 10mM CuCl2 2.5μL를 10분간 인큐베이션한 다음, 1mM LY 4μL의 첨가하고, 430nm의 여기 파장 및 540nm 방출 파장에서 형광을 측정하는 단계로 구성된다.
상기와 같이 확립된 어세이의 유효성을 입증하기 위하여, 구리에 대한 LY 특이성을 먼저 관찰하였다.
구체적으로, 구리에 대한 LY의 특이성은 서로 다른 금속 이온을 구리 및 LY와 혼합하여 확인하였다. 0 내지 0.02μmol Co2+, Fe2+, 및 Ni2+의 존재 하에, 0 내지 0.002μmol Cu2+를 0.004μmol LY와 서로 혼합하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 추가적인 금속 이온(코발트, 철, 또는 니켈)은 LY 형광에 일부 영향을 주나, 구리 역시 과도한 양으로 본 발명의 어세이에 첨가되므로, 상기 영향을 주는 정도는 무시할 수 있을 정도인 것으로 판단되었다.
그 다음, 최종적으로 확립된 본 발명의 ACuB 어세이의 직선성을 입증하였다. 구체적으로, 0.025μmol CuCl2 및 1.5 내지 5.5% HSA를 10분간 인큐베이션한 다음, 0.004μmol LY를 첨가하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 높은 신뢰성을 나타내었다. 정상 상태에서 혈중 HSA 수준은 약 5% 정도이므로, 상기 결과는 본 발명의 결과가 실제 생물학적인 혈액 시료 등을 이용하여 검출하는 데 있어 유효하다는 것을 나타내는 것이다.
마지막으로, 정상 및 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 희생시켜, 본 발명의 ACuB 어세이가 in vivo 시료를 분석할 수 있는지 확인하였다. 최근 IMA가 초기 심근허혈을 진단하는데 사용되고 있지만, 뇌졸중 역시 IMA 수준을 높이는 것으로 알려져 있으므로, 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 이용하였다.
구체적으로, 255 내지 270g 무게의 SD-랫트(Sprague Dawley rat)를 3% 아이소플루레인(isoflurane, Hana Pharm., South Korea)으로 마취시킨 다음, 중대뇌동맥결찰(middle cerebral artery occlusion, MCAo)을 수행하였다. 총경동맥(common carotid artery, CCA), 바깥경동맥(external carotid arteries, ECA) 및 안쪽경동맥(internal carotid arteries, ICA)을 묶고, ICA에서 MCA까지 4-0 실리콘 봉합을 삽입하였다. 상기 봉합은 90분 후 재관류(reperfusion)를 유도한 다음, 제거하였다. 24시간 후, 상기 동물은 뇌졸중 유발 확인의 위한 NSS(neurological severity score)로 기록하였고, 그 다음 혈액 시료는 졸레틸 마취(0.1 mL/100 g, Virbac, France)하에 심장으로부터 수집하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 정상 모델은 높은 F 값을 나타내었지만, 뇌졸중 모델에서는 낮은 F 값을 나타내어, 뇌졸중 모델에서는 알부민에 결합하지 못한 자유 구리 이온에 의하여 LY 형광이 소광되었음을 나타내었다.
본 발명의 ACuB 어세이 결과를 Bar-Or, D et al(J. Emerg. Med. 2000, 19, 311-315.)에 기술된 방법과 동일한 방법으로 ACB 테스트를 수행한 결과와 서로 비교하였다. 다만, 상기 ACB 테스트 결과의 분석은 Bar-Or, D et al과 다른 분광광도계인 UV/Vis 분광광도계 U-3000(Hitachi, Japan) 및 UV Solutions Application (Hitachi, Japan)를 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, ACB 테스트를 이용하여 동일한 시료로 IMA를 검출한 결과, IMA를 제대로 검출하지 못하는 결과를 나타내었다. 또한, 기존 보고에 따르면, ACB 테스트는 랫트 모델에서 적용 가능하다고 알려져 있었으나, 상기 도 13의 결과는 정상 인간 혈장에서 보고된 값(ABSU 값 < 0.4)에 비하여 높은 ABSU 값(>0.8)을 나타내었고, 뇌졸중 모델 값(~0.7)에 비해서도 높은 값을 나타내었다. 즉, 이러한 결과는 알부민 N-말단이 코발트가 결합하는 주요 위치가 아니라는 사실에 기초한 것으로 판단된다.
또한, 포유류의 알부민은 구리와 강한 복합체를 형성하며, 구리는 소(Bovine), 랫트, 및 인간 알부민의 N-말단에 몰 당 몰(mole per mole)로 결합한다. 이러한 사실은, 본 발명의 방법에 사용되는 구리는 알부민 N-말단 변형을 검출하는 데 있어, 코발트에 비하여 보다 정확한 결과를 가져올 수 있음을 나타낸다. 또한, F0/F 값은 도 11의 식에 대입하여 구리-결합된 알부민의 양으로 환산될 수 있으므로, 본 발명에서는 도 12A 값을 구리-결합된 알부민의 양으로 환산하여, 도 12B에 나타내었다.
그 결과, 도 12B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 뇌졸중 유도된 동물 시료에서 낮은 농도의 인간 알부민을 검출할 수 있음을 시사하였다. 또한, 본 발명에서는, 심근허혈 유도된 모델이 아닌, 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 사용하였으나, 심근허혈 또는 뇌졸중에 의해 유도된 IMA가 서로 다르다는 사실이 현재까지 보고된바 없으며, 심근허혈 또는 뇌졸중은 IMA를 검출함에 있어 유사한 동향을 나타내므로, 뇌졸중 유도된 랫트 모델을 이용하여 IMA를 효과적으로 검출한 본 발명의 방법은 IMA 검출, 나아가 허혈의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
종합하면, 상기와 같은 결과는 본 발명의 ACuB 어세이 방법은 허혈 상태를 검출할 수 있는 매우 신뢰도가 높으면서도 민감도가 높은 방법으로서, IMA 검출 및 허혈 진단에 적용될 수 있음을 시사하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (23)

  1. (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는,
    천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이된 알부민은 천연형 알부민 N-말단의 아스파르트산-알라닌(Asp-Ala) 아미노산 잔기가 절단된, IMA(ischemia-modified albumin)인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 시료의 자유 2가 구리 이온의 양이 천연형 알부민을 포함하는 대조군에 비하여 많으면 변이된 알부민이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 시료 중 알부민의 양을 천연형 알부민 양으로 환산하여, 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합할 수 있는 2가 구리 이온의 포화량 또는 그 이상의 양으로 상기 시료에 2가 구리 이온(Cu2+)을 접촉시키는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 시료 중 알부민의 농도는 시료 총 중량 대비 1.5 중량% 내지 5.5 중량%인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약은 클로로필린(chlorophylilin), FHP(2-pyridylaldehyde fluorescein hydrazone), 1,3,5-트리페닐벤젠(Triphenylbenzene) 형광단, 디에틸디티오카바메이트(diethyldithiocarbamate), 테트라티오몰리데이트(tetrathiomolybdate) 및 LY(lucifer yellow) 시약으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약은 LY(lucifer yellow) 시약인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 LY 시약과 자유 2가 구리 이온 간의 반응은 pH 4.5 내지 pH 9.5의 범위에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계는 LY(lucifer yellow)의 방출 형광을 측정함으로써 수행되는 것인 방법.
  10. (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및
    (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약을 포함하는, 천연형 인간 혈청 알부민의 N-말단에 위치한 아스파르트산 및 알라닌(Asp-Ala) 잔기가 변이된 알부민 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 변이된 알부민은 천연형 알부민 N-말단의 아스파르트산-알라닌(Asp-Ala) 아미노산 잔기가 절단된, IMA(ischemia-modified albumin)인 키트.
  12. 제10항에 있어서, 상기 2가 구리이온을 검출하는 시약은 LY(lucifier yellow)인 것인 키트.
  13. 제10항에 있어서, 상기 키트는 50㎕ 내지 500㎕의 수용 부피를 갖는 하나 이상의 구획을 포함하는 투명한 검출 용기를 추가로 포함하는 것인 키트.
  14. (a) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 2가 구리 이온(Cu2+), 알부민을 포함하는 분리된 시료, 및 알부민에 결합하지 않은 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약을 서로 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료 중 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합하지 않은, 자유 2가 구리 이온의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 심근허혈(myocardiac ischemia)을 진단하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 시료의 자유 2가 구리 이온의 양이 천연형 알부민을 포함하는 대조군에 비하여 많으면 심근허혈로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 자유 2가 구리 이온의 양을 표준곡선의 기지의 값과 비교하여 심근허혈의 발생 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 (a) 단계는 시료 중 알부민의 양을 천연형 알부민의 양으로 환산하여, 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합할 수 있는 2가 구리 이온의 포화량 또는 그 이상의 양으로 상기 시료에 2가 구리 이온(Cu2+)을 접촉시키는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 자유 2가 구리 이온을 특이적으로 검출하는 시약은 클로로필린(chlorophylilin), FHP(2-pyridylaldehyde fluorescein hydrazone), 1,3,5-트리페닐벤젠(Triphenylbenzene) 형광단, 디에틸디티오카바메이트(diethyldithiocarbamate), 테트라티오몰리데이트(tetrathiomolybdate) 및 LY(lucifer yellow) 시약으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 자유 2가 구리 이온을 검출하는 시약은 LY(lucifer yellow) 시약인 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 (b) 단계는 LY(lucifer yellow)의 방출 형광을 측정함으로써 수행되는 것인 방법.
  21. (i) 천연형 알부민의 N-말단 금속결합자리에 결합 가능한 구리 이온을 함유하는 구리염용액; 및
    (ii) 알부민에 결합하지 않은 2가 구리이온을 검출하는 시약을 포함하는, 심근허혈 진단용 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 키트는 시료의 알부민 양을 측정하는 시약을 추가로 포함하는 것인 키트.
  23. 제21항에 있어서, 상기 2가 구리이온을 검출하는 시약은 LY(lucifier yellow)인 것인 키트.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003046538A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-05 Ischemia Technologies, Inc. Electrochemical detection of ischemia
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
EP1857818A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-21 DIGILAB BioVisioN GmbH Diagnostic and therapeutic uses of peptides for pre-forms of type 2 diabetes and conditions associated therewith
US20080305550A1 (en) * 2005-01-21 2008-12-11 Hollie Huff Targets for Detection of Ischemia

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
WO2003046538A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-05 Ischemia Technologies, Inc. Electrochemical detection of ischemia
US20080305550A1 (en) * 2005-01-21 2008-12-11 Hollie Huff Targets for Detection of Ischemia
EP1857818A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-21 DIGILAB BioVisioN GmbH Diagnostic and therapeutic uses of peptides for pre-forms of type 2 diabetes and conditions associated therewith

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, MYUNG HO ET AL.: "The Usefulness of Heart-type Fatty Acid binding Protein and Ischemia Modified Albumin to Diagnose the Cardiac cause of Arrest and the Difference of the Two Biomarkers between the R", JOURNAL OF THE KOREAN SOCIETY OF EMERGENCY MEDICINE, vol. 20, no. 1, 2009, pages 50 - 57 *

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