WO2014102432A1 - Compuestos útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas, composiciones farmacéuticas que los contienen, procedimiento de identificación de los mismos y sus aplicaciones - Google Patents

Compuestos útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas, composiciones farmacéuticas que los contienen, procedimiento de identificación de los mismos y sus aplicaciones Download PDF

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cells
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Mehdi RAHIMPOUR
Manuel Montero Macarro
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention is part of the field of development of new compounds for the treatment of infectious diseases, the cleaning of aseptic materials, preventing bacterial proliferation on surfaces and pipes and therefore is directed to the field of biomedicine and pharmaceutical and agri-food development. It is also framed in the field of development of compounds that promote the interaction of beneficial rhizobacteria with plant cells and therefore is directed to the field of agriculture and agronomy.
  • Glycogen is a highly branched homopolysaccharide formed by glucose units linked by a-1, 4 and a-1, 6 bonds at the branching points. In bacteria, the function of this reserve polysaccharide is not well defined yet, but several studies have linked glycogen metabolism with survival, and in the case of pathogens with colonization and virulence [Jones, SA, Jorgensen, M., Chowdhury, FZ, Rodgers, R., Hartline, J., Leatham, MP, Struve, C, Krogfelt, KA, Cohen, PS, Conway, T. (2008) Glycogen and maltose utilization by Escherichia coli 0157: 1-17 in The mouse intestine.
  • the regulation of glycogen synthesis in enterobacteria encompasses a complex assembly of factors that are adjusted to the nutritional status of the cell [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Rahimpour, M., Sesma, MT, Baroja- Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg 2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem J.
  • glgBXCAP is part of the PhoP-PhoQ region [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Rahimpour, M., Sesma, MT, Baroja-Fernández, E., Pozueta- Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg 2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem J. 424, 129-141], so that its expression responds positively to the extracellular concentration of Mg 2+ .
  • ADPG-pyrophosphorylase also called GlgC in bacteria
  • GlgC glucose-1-phosphate
  • Allosteric regulators that increase their activity have been widely described and include: NADH, NADPH, pyridoxal phosphate, pyruvic acid, fructose-6-phosphate, fructose-1, 6-bisphosphate (F1.6P2), fructose-2 , 6-bisphosphate (F2.6P2), 3-phosphoglycerate (3PGA), sedoheptulose 1, 7- diphosphate, D-arabinitol 1, 5-diphosphate, glucose 1, 6-diphosphate, glyceraldehyde 3-P, 2-phosphoglycerate, magnesium (Mg 2+ ), erythrose-4-phosphate, phosphoenolpyruvate and phosphoketodeoxygluconate [Preiss, J.
  • Bacteria also have other AGPs that are not recognized by specific antibodies against GlgC [Martin, M.C., Scheneider, D., Bruton, C.J., Chater, K.F. and Hardisson, C. (1997) A glgC gene essential only for the first two spatially distinct phases of glycogen synthesis in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol 179, 7784-7789; Morán-Zorzano, MT, Alonso-Casaj ⁇ s, N., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Baroja-Fernández, E., Eydallin, G., Pozueta-Romero, J.
  • bacteria can express active AGP of plant origin and vice versa [Churches AA, Barry GF, Meyer C, Bloksberg L., Nakata PA, Greene T, Laughlin MJ, Okita TW, Kishore GM, Preiss, J. (1993) Expression of the potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268, 1081-1086; Crevéen P., Ballicora M.A., Mérida A., Preiss J., Romero J.M.
  • Glycogen accumulation is also positively affected by the expression of the glgS gene, which codes for a 7.9 kDa, hydrophilic, highly charged protein of unknown function and lacks sequence homology with other proteins outside the enterobacteria [Hengge -Aronis, R., Fischer, D. (1992) Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth-phase-regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: 1877-1886; Beglova, N., Fisher, D., Hengge-Aronis, R., Gehring, K.
  • glgS has a strong induction in the stationary phase [Hengge-Aronis, R., Fischer, D. (1992) Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth-phase-regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: 1877-1886; Selinger, DW, Cheung, KJ, Mei, R., Johansson, EM, Richmond, CS, Blattner, FR, Lockhart, DJ, Church, GM (2000) RNA expression analysis using a 30 base pair resolution Escherichia coli genome array. Nat. Biotechnol.
  • RNA-binding protein HF- 1 plays a global regulatory role which is largely, but not extensively, due to its role in expression of the sigmaS subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179, 297-300], whose translation is in turn inhibited by CsrA [Baker, CS, Morozov, I., Suzuki, K., Romeo, T., Babitzke, P. (2002) CsrA regulates glycogen biosynthesis by preventing translation of glgC in Escherichia coli. Mol. Microbiol 44, 1599-1610].
  • GlgS could constitute the binding site of the first glucose molecule during the initiation process of the glycogen granule in E. coli [Beglova, N., Fisher, D., Hengge-Aronis, R., Gehring , K. (1997) ' ⁇ , 15N and 13C NMR assignments, secondary structure and overall topology of the Escherichia coli GlgS protein. Eur J Biochem. 246: 301-310].
  • glgS null mutants accumulated high levels of AMP [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Rahimpour, M., Sesma, MT, Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg 2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem J.
  • GlgS and GlgC proteins exert a negative effect on the production of type 1 fimbriae, flagella, exopolysaccharides and bacterial biofilms that act as major determinants of both the pathogenicity and virulence of the bacterial as well as the adhesion of the bacteria to inert surfaces and cells.
  • the inhibitor compound of the invention which positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production through the stimulation of GlgC, GlgA and / or GlgS or any other function that entails an expense of ATP and G1 P for the production of ADPG necessary for glycogen synthesis.
  • a compound useful for increasing bacterial adhesion determining processes to inert surfaces and / or to plant root cells such as motility and the formation of bacterial EPSs and biofilms hereinafter the activating compound of the invention, which negatively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production through the inhibition of GlgC or any other function that it entails an expense of ATP and G1 P for the production of ADPG necessary for glycogen synthesis.
  • a particular object of the present invention is the inhibitor compound of the invention wherein said compound is a protein that positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production by promoting the consumption of intracellular ATP and / or G1 P.
  • a particular embodiment of the invention is the inhibitor compound of the invention where the protein is a protein with AGP activity comprising a sequence belonging, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group: the amino acid sequence SEQ ID NO 2 (AGP of bacterial origin or GlgC) and the amino acid sequence SEQ ID NO 6 (AGP of plant origin).
  • Another particular embodiment of the invention is the inhibitor compound of the invention where the protein is a GlgS protein, and preferably, a GlgS protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO 4.
  • nucleotide sequence is an agp sequence encoding a protein or peptide with AGP activity, and preferably, a sequence comprising a sequence belonging, by way of illustration and not limiting to the following group: the nucleotide sequence SEQ ID NO 1 (bacterial origin) and the nucleotide sequence SEQ ID NO 5 (plant origin).
  • nucleotide sequence is a glgS sequence encoding a GlgS protein or peptide, and preferably, a sequence comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO 3.
  • Another object of the invention is the inhibitor compound of the invention for use in the prevention and treatment of bacterial contamination.
  • Another particular object of the invention is the inhibitor compound of the invention where bacterial contamination refers to a bacterial infection in preferably mammals, preferably humans, or the presence of bacteria in different aseptic materials, surfaces or equipment.
  • Another object of the invention is a pharmaceutical composition useful for the treatment of infectious diseases or as an antiseptic, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, comprising at least one inhibitor compound of the invention, in pharmaceutically effective amount together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles.
  • Another object of the invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention, hereinafter use of the pharmaceutical composition of the invention, in a method of treatment or prophylaxis of a mammal, preferably a human being, affected by a bacterial infection. consisting of the administration of said therapeutic composition in a suitable dose that allows the reduction or elimination of said infection.
  • Another object of the invention is the inhibitor compound of the invention for use in promoting interaction between beneficial rhizobacteria and plant root cells.
  • Another object of the invention is a process for the identification of a compound that inhibits motility, formation of EPSs and biofilms that determine the pathogenicity and bacterial virulence, as well as the ability of bacteria to adhere to inert surfaces or cells, preferably by setting up a high throughput screening, hereinafter, the method of the invention, which comprises the following steps:
  • the present invention is based on the fact that the inventors have observed that, in enterobacteria, GlgS exerts a negative effect on the production of type 1 fimbriae, flagella, exopolysaccharides (EPSs) and bacterial biofilms that act as major determinants of both pathogenicity and virulence. of the bacterial ones as of the adhesion of the bacteria to surfaces.
  • GlgC exerts a negative effect on flagellar motility, on the production of EPSs and on the production of bacterial biofilms in bacteria that accumulate glycogen.
  • glycogen-free AglgC cells have “high motility” phenotypes (Example 1.5), “high biofilm content” (Example 1.6) and “high EPS content” (Example 1.6), while that low-motility AglgSAflhC cells accumulate more glycogen than AglgS cells (Example 1.5).
  • this invention it is shown that the ectopic expression of glgC (Example 1.7) reverses the "low glycogen", “high motility”, “high biofilm” and “high EPSs” phenotypes of the AglgS cells ( Example 1.5 and Example 1.6).
  • any strategy of direct or indirect inhibition of GlgS (in the case of enterobacteiras) and / or GlgC (in the case of any type of bacteria that accumulates glycogen) increases the formation of flagella (with the consequent increase in motility flagellar), type 1 fimbriae, EPSs and biofilms determining both the adhesion of the bacteria to surfaces and the virulence and bacterial pathogenicity.
  • biotechnological elements - vectors, expressed proteins - and the cells developed in the present invention allow the development of tests for the identification of compounds that increase the expression / activity of these two targets in vivo, GlgS and / or GlgC, for example, through the use of "high-throughput" technology.
  • a first object of the present invention is a compound useful for reducing or canceling processes determining bacterial pathogenicity and virulence and bacterial adhesion to inert surfaces or cells such as the production of type 1 fimbriae, flagellar motility and the formation of bacterial EPSs and biofilms, hereinafter inhibitor compound of the invention, which positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production through the stimulation of GlgC and / or GlgS or any other function that involves an expense of ATP and G1 P for the production of ADPG necessary for glycogen synthesis.
  • a particular object of the present invention is the inhibitor compound of the invention wherein said compound is a protein that positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production by promoting the consumption of intracellular ATP and / or G1 P.
  • a particular embodiment of the invention is the inhibitor compound of the invention where the protein is a protein with AGP activity comprising a sequence belonging, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group: the amino acid sequence SEQ ID NO 2 (AGP of bacterial origin or GlgC) and the amino acid sequence SEQ ID NO 6 (AGP of plant origin).
  • protein with AGP activity refers to a protein or peptide, either of eukaryotic or prokaryotic origin, and having at least 40% homology with SEQ ID NO 2 or with SEQ ID NO 6.
  • Another particular embodiment of the invention is the inhibitor compound of the invention where the protein is a GlgS protein, and preferably, a GlgS protein. comprising the amino acid sequence SEQ ID NO 4.
  • GgS protein refers to a protein or peptide that has at least 80% homology with SEQ ID NO 4.
  • Another particular object of the invention is the inhibitor compound of the invention wherein said compound is a nucleotide sequence encoding a protein that positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production by promoting the consumption of intracellular ATP and / or G1 P.
  • nucleotide sequence is an agp sequence that encodes a protein or peptide with AGP activity, and preferably, a sequence comprising a sequence belonging, by way of illustration and not limiting to the following group: the nucleotide sequence SEQ ID NOn 1 (bacterial origin) and the nucleotide sequence SEQ ID NO 5 (plant origin).
  • nucleotide sequence is a glgS sequence encoding a GIgS protein or peptide, and preferably, a sequence comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO 3.
  • Another particular object of the invention is the inhibitor compound of the invention where the compound is an allosteric regulator capable of activating a protein or peptide with AGP activity, or any other type of substance capable of activating the expression of nucleotide sequences encoding AGP. or GIgS.
  • Another particular object of the invention is the inhibitor compound of the invention where the compound belongs, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group: sedoheptulose 1, 7-diphosphate, D-arabinitol 1, 5-diphosphate , glucose 1,6-diphosphate, glyceraldehyde 3-P, 2-phosphoglycerate, erythrose-4-phosphate, phosphoenolpyruvate, phosphokethodeoxygluconate, magnesium ion (Mg 2+ ), NADH, NADPH, pyridoxal phosphate, pyruvic acid, fructose-6- phosphate, fructose-1, 6-bisphosphate (F1.6P2), fructose-2,6-bisphosphate (F2.6P2) or 3-phosphoglycerate (3PGA).
  • the compound belongs, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group: sedoheptulose 1, 7-diphosphate, D-arabin
  • Another object of the invention is the inhibitor compound of the invention for use in the prevention and treatment of bacterial contamination.
  • Another particular object of the invention is the inhibitor compound of the invention where bacterial contamination refers to a bacterial infection in mammals, preferably humans, or the presence of bacteria in different aseptic materials, surfaces or equipment.
  • Another object of the invention is the use of the inhibitor compound of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of an infectious disease or for antiseptic cleaning (for example, surfaces such as catheters, pipes, biomedical material, systems of air conditioning, etc.), produced by a bacterium belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group:
  • Gram positive preferably, Listeria, Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Actinomyces, and more preferably, L monocytogenes, C. difficile and S. pyogenes.
  • Another object of the invention is a pharmaceutical composition useful for the treatment of infectious diseases or as an antiseptic, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, comprising at least one inhibitor compound of the invention, in pharmaceutically effective amount together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic or antiseptic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of eliminating the pathogenic microorganisms, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, to the case of a therapeutic composition, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route, form and frequency of administration; and in the case of an antiseptic composition, the environmental conditions, the form of application, among others.
  • said pharmaceutical composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the administration of the therapeutic composition provided by this invention is carried out parenterally, orally, intraperitoneally, subcutaneously, etc.
  • Another particular object of the invention is the pharmaceutical composition of the invention where the inhibitor compound is a protein that positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production by promoting the consumption of intracellular ATP and / or G1 P.
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention where the inhibitor compound is a protein with AGP activity comprising a sequence belonging, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group: the amino acid sequence SEQ ID NO 2 (bacterial origin) and the amino acid sequence SEQ ID NO 6 (plant origin).
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention wherein the inhibitor compound is a GIgS protein, and preferably, a GIgS protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO 4.
  • Another particular object of the invention is the pharmaceutical composition of the invention where the inhibitor compound is a nucleotide sequence encoding a protein that positively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production by promoting the consumption of intracellular ATP and / or G1 P.
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention wherein the inhibitor compound is an agp nucleotide sequence encoding a protein or peptide with AGP activity, and preferably, a nucleotide sequence comprising a sequence belonging, by way of title.
  • sequence SEQ ID NO 1 nucleotide sequence encoding an AGP of bacterial origin, GlgC
  • sequence SEQ ID NO 5 nucleotide sequence encoding an AGP of plant origin
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention wherein the inhibitor compound is a glgS nucleotide sequence encoding a GIgS protein or peptide, and preferably, a sequence comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO 3.
  • the inhibitor compound is an allosteric regulator capable of activating a protein or peptide with AGP activity, or any other type of substance that activates the expression of nucleotide sequences encoding for GlgC or GlgS.
  • Another particular object of the invention is the pharmaceutical composition of the invention where the inhibitor compound belongs, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group of substances: sedoheptulose 1, 7-diphosphate, D-arabinitol 1, 5-diphosphate, glucose 1, 6-diphosphate, glyceraldehyde 3-P, 2-phosphoglycerate, erythrose-4-phosphate, phosphoenolpyruvate, phosphokethodeoxygluconate, magnesium (Mg 2+ ), NADH, NADPH, pyridoxal phosphate, pyruvic acid, fructose 6-phosphate, fructose-1, 6-bisphosphate (F1.6P2), fructose-2,6-bisphosphate (F2.6P2) or 3-phosphoglycerate (3PGA).
  • the inhibitor compound belongs, by way of illustration and not limiting the scope of the invention, to the following group of substances: sedoheptulose 1, 7-diphosphate, D-arabini
  • Another object of the invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention, hereinafter use of the pharmaceutical composition of the invention, in a method of treatment or prophylaxis of a mammal, preferably a human being, affected by a bacterial infection. consisting of the administration of said therapeutic composition in a suitable dose that allows the reduction or elimination of said infection.
  • composition of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • Another particular object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention for the antiseptic cleaning of environments or materials contaminated by bacteria.
  • Another object of the invention is a process for the identification of a compound that inhibits motility, formation of EPSs and biofilms that determine the pathogenicity and bacterial virulence, as well as the ability of bacteria to adhere to inert surfaces or cells, preferably by setting up a high throughput screening, hereinafter, the method of the invention, which comprises the following steps:
  • Another object of the present invention is a compound useful for increasing processes determining the binding of beneficial rhizobacteria to plant roots such as the production of adhesins, motility, the formation of EPSs and / or bacterial biofilms, hereinafter stimulating agent of the invention, characterized in that it negatively regulates the metabolic pathway of bacterial glycogen production through the inhibition of GIgC or any other function that entails an expense of ATP and G1 P for the production of ADPG necessary for glycogen synthesis.
  • Another object of the present invention is the stimulating agent of the invention where said agent is an allosteric regulator capable of inhibiting GIgC or other AGP of microbial origin whose sequence is different from GIgC.
  • Another particular object of the invention is the stimulating agent of the invention characterized in that it is an allosteric regulator of GIgC belonging to the following group: AMP, ADP, orthophosphate and pyrophosphate.
  • Figure 1 Functional classification of genes whose expression levels are different in AglgS cells and in wild cells (WT). Black bars correspond to genes whose expression is higher in AglgS cells than in WT cells, while white bars correspond to genes whose expression is lower in AglgS cells than in WT cells.
  • the genes were classified into COG categories [Keseler, IM, Collado-Vides, J., Gama-Castro, S., Ingraham, J., Paley, S., Paulsen, I., Peralta-Gil, M., Karp, P.S. (2005) EcoCyc: a comprehensive data base for Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 33 (Datábase issue), D334-D337, doi: 10.1093 / nar / gk ⁇ 108].
  • FIG. 2 - ⁇ -galactosidase activity in wild cells (WT, white bars) and in AglgS cells (gray bars) expressing the indicated lacZY transcriptional fusion.
  • the cells were cultured in liquid Kornberg medium supplemented with glucose and collected at the entrance of the stationary phase for measurement of ⁇ -galactosidase activity.
  • the results are the mean ⁇ ES of 5 independent experiments.
  • FIG 3 Wild cell electron microscopy (WT) images belonging to strain BW25113 and AglgS negatively stained with 2% phosphotungstic acid.
  • the bars in the upper and lower panels are 2 and 0.5 ⁇ , respectively.
  • the arrows indicate the position of type I fimbriae.
  • GlgS negatively affects the production of flagella (upper panels) and fimbriae type I (lower panels).
  • the cells were grown in liquid Kornberg medium supplemented with glucose and collected at the entrance of the stationary phase.
  • FIG. 4 - GIgS has a negative effect on "swarming" motility.
  • WT Wild cell swarming
  • AglgS AglgSAflhC
  • AglgSAfliA AglgS that overexpractice
  • SE overexpractice
  • AglgS cells have a "high swarming" phenotype that is reversed with the ectopic expression of glgS.
  • AglgSAflhC and AglgSAfliA cells do not exhibit "swarming" motility, thus confirming that flagella are a determining factor in the "high swarming" phenotype of AglgS cells.
  • B Swarming type motility phenotype of E. coli W cells and W cells that overexpress glgS.
  • C "Swarming" type motility phenotype of Salmonella strain 3934 cells and 3934 cells that overexpress glgS.
  • D "Swarming" motility phenotype of Salmonella LT2 cells and LT2 cells that overexpress glgS.
  • FIG. 5 GlgS exerts a negative effect on the accumulation of biofilm
  • A Total biofilm content (normalized with respect to bacterial growth) of wild E. coli (WT) cells of strain BW251 13, AglgS, AglgSAflhC, AglgSAfimA , AgIgSAwzc and AglgS that overexpress (SE) glgS.
  • B Biofilm content in cells of strains LT2, 1334, 3934 and 14028 of Salmonella and of cells of strains LT2, 1334, 3934 and 14028 that overexpress glgS.
  • the cells were cultured in 96-well polystyrene plates at 28 ° C for 48 h in Kornberg medium supplemented with 50 mM glucose. The results are the mean ⁇ ES of 5 independent experiments.
  • FIG. 6 Metabolic route of de novo biosynthesis of purines. Enzymes are indicated in bold whose reduction, disappearance or inhibition promotes the accumulation of glycogen in AglgS cells.
  • FIG. 7 Glycogen content and "swarming" motility in AglgS, AglgSApurM and AglgSApurL bacteria.
  • A Glycogen content and
  • B wild cell swarming (WT) type of E. coli BW251 13, AglgS, AglgSApurM and AglgSApurL.
  • WT wild cell swarming
  • the results in “A” are the mean ⁇ ES of 3 independent experiments.
  • the Cells were grown in liquid Kornberg medium supplemented with glucose and collected at the entrance of the stationary phase.
  • FIG. 8 Glycogen content and "swarming" motility in wild cells (WT) of E. coli BW25113, AglgS, AgIgSAflhC, AgIgSAfliA, AglgA, AglgC, WT cells that overexpress glgC and AglgS cells that overexpress glgC, and "swarming" motility in Salmonella cells that overexpress glgC.
  • WT wild cells
  • WT wild cells that overexpress glgC
  • WT cells that overexpress glgC and AglgS cells that overexpress glgC and "swarming" motility in Salmonella cells that overexpress glgC.
  • A Glycogen content in wild cells (WT) of E.
  • FIG. 9 Biofilm content in wild cells (WT) of E. coli BW25113, AglgS, AglgA, AglgC, WT cells that overexpress glgC, AglgS cells that overexpress glgC, AglgSApurL, AglgCAgalU and AgIgSAgalU and in different strains of Salmonella with and without glgC overexpression.
  • WT wild cells
  • WT wild cells
  • Figure 10- Metabolic pathway of synthesis of cholanic acid from G1 P.
  • Figure 11 - Content of cholanic acid in wild cells (WT) from E. coli BW25113, AglgS, AglgC, AgalU, Awzc, AgIgSAgalU, AglgCAgalU, AglgS Awzc, AglgCAwzc, AglgS cells that overexpress glgC, AglgC cells that ectopically express glgC.
  • WT wild cells
  • FIG. 12 Metabolic route of de novo biosynthesis of pyrimidines. Enzymes are indicated in bold whose reduction, disappearance or inhibition promotes the accumulation of glycogen in AglgS cells.
  • Figure 13 Proposal for an integrative model of the synthesis of type I fimbriae, flagella, biofilm polysaccharides and GIgS-controlled glycogen (ScoR, from Surface Composition Regulator) in enterobacteria.
  • ScoR Surface Composition Regulator
  • the expression of glgS (scoR) would be highly determined by RpoS, whose levels in turn would be determined by the intracellular levels of (p) ppGpp produced by RelA and by SpoT that increase when bacteria face nutritional stress. or other environmental stress.
  • ppGpp exerts a positive effect on glycogen accumulation because (a) transcriptionally positively regulates the expression of the glgBXCAP operon and csrC (a small non-coding RNA), which at its once the post-transcriptional repressor of the glycogen biosynthesis CsrA is inactive, and (b) strongly inhibits PurA, which catalyzes the first committed step of de novo biosynthesis of the main GlgC inhibitor, AMP.
  • glgBXCAP operon and csrC a small non-coding RNA
  • (p) ppGpp exerts a negative effect on the synthesis of flagella and EPSs since it represses the expression of flagellar genes and de novo synthesis genes of UMP (carAB, pyrBI, pyrC, pyrD and pyrF) that act as determinants of the production of EPSs.
  • GIgS GIgS
  • the "surplus” or “surplus” ATP will be used by GIgC for the production of glycogen from G1 P, which will be used to a lesser extent for the production of EPS.
  • an increase in GIgC activity will mean a higher consumption of ATP and G1 P, preventing the flagellar motility dependent on ATP and the production of EPSs dependent on G1 P.
  • FIG. 14 Effect of Mg 2+ ion on biofilm content and "swarming" motility in wild cells (WT) of E. coli W.
  • A Biofilm content in the control, in culture medium prepared with water stream and in culture medium supplemented with increasing concentrations (5-100 mM) of MgCI 2 (gray bars) or MgS0 4 (striped bars). The results are the mean ⁇ ES of 5 independent experiments.
  • B Swarming type motility under control conditions and in culture medium supplemented with 20 mM of MgCI 2 or 20 mM of MgS0 4 . The growth front of the crop in each condition is marked with dashed points.
  • the control refers to a culture medium without supplementation.
  • Figure 15 Effect of EDTA, PLP, DTT and DTE on growth, biofilm content and "swarming" motility in wild cells (WT) of E. coli W. Growth (A), biofilm content (B) and “swarming" motility (C, D and E) in the control and in culture medium supplemented with 10 mM EDTA, 10 mM PLP, 10 mM DTT or 1 mM DTE.
  • WT wild cells
  • B biofilm content
  • C, D and E “swarming" motility
  • results are the mean ⁇ ES of 5 independent experiments.
  • Example 1 Reduction of the production of flagella, fimbriae and biofilm by stimulating the activity of GlgS and GIgC.
  • transcriptomic analysis revealed that 122 genes showed statistically significant changes in transcript levels in AglgS cells with respect to WT cells. Among this population 87 genes had higher levels of expression in AglgS than in WT (Table 1) and 35 genes had lower levels of expression in AglgS than in WT (Table 2).
  • Table 1 Genes whose expression is higher in AglgS cells than in WT. Variations in expression levels are presented in log 2 scale (AglgS vs WT).
  • carA 1.63 Carbamoyl-phosphate synthetase, glutamine [b0032] carB 1.77 Carbamoyl-phosphate synthase large subunit [b0033] or pe ron codBA
  • fimA 2.83 Major type 1 subunit fimbrin [b4314]
  • Flagellar biosynthesis alternative sigma factor 28 fliA 6.07
  • Flagellar biosynthesis component of motor switching fliG 3.46
  • Flagellar biosynthesis export of flagellar proteins? fliH 3.07
  • Flagellin export apparatus integral membrane protein fliR 1.50
  • Chemotaxis regulator transmits chemoreceptor means cheY 2.52
  • Glycinamide ribonucleotide transformylase (GART) 1, purN 1.55
  • Flagellar biosynthesis flagellin, filament structural fliC 3.20
  • Pleiotrophic regulation of anaerobic respiration narL 1.66
  • Methyl-accepting chemotaxis protein I serine sensor tsr 1.85
  • Table 2 Genes whose expression is lower in AglgS cells than in WT. Variations in expression levels are presented in log 2 scale (AglgS vs WT).
  • RNA polymerase sigma-E factor; heat shock and rpoE 1.53
  • fimbriae type I fimAICDFGH showed higher levels of expression in AglgS cells than in WT cells (Table 1).
  • flhDC the Type I master operon
  • the Type II operons controlled by FlhD4C2 necessary for the structural assembly of both the anchorage and the basal body of the flagellum flgAMN, flgBCDEFGHIJ, fliAZY, fliFGHIJK, fliLMNOPQR
  • Type operons III controlled by FliA required for flagellar motility and chemotaxis flgKL, fliC, fliDST, tar-tap-cheRBYZ and motAB-cheAW
  • the yhjH and ycgR genes that control FlhD4C2 showed higher levels of expression in AglgS cells than in WT cells ( Table 1).
  • RNA profile The analysis of the RNA profile described above indicated that the GlgS protein exerts a negative effect on processes involved in the production of flagella and fimbriae of type 1 determinants of host colonization, virulence and bacterial pathogenicity and surface adhesion.
  • the GlgS protein exerts a negative effect on processes involved in the production of flagella and fimbriae of type 1 determinants of host colonization, virulence and bacterial pathogenicity and surface adhesion.
  • Swarming is a type of bacterial motility dependent on the scourge that facilitates the migration of bacteria on viscous substrates, such as semi-solid agar surfaces.
  • cells For "swarming" motility to take place, cells must first differentiate into a specialized type of cell called “swarmer” that is characterized by an increase in the number of flagella and by elongation of the cells [Harshey, RM, Matsuyama, T. (1994) Dimorphic transition in Escherichia coli and Salmonella differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proc. Nati Acad. Sci. USA 91, 8631-8635; Fraser, GM, Hughes, C. (1999) Swarming motility. Curr. Opin.
  • Microbiol 2, 630-635 The synthesis of the scourge and components related to the scourge is controlled by 14 operons and more than 50 genes (mostly included in Table 1) whose expression is under a hierarchical control system where flhDC acts as a master operon [Kalir, S. , McCIure, J., Pabbaraju, K., Southward, C, Ronern, M., Leibler, S., Surette, MG, Alón, U. (2001) Ordering genes in a flagella pathway by analysis of expression kinetics from living bacteria . Science 292, 2080-2083]. Recently, Inoue et to the.
  • enterica serovar Typhimurium [Morán-Zorzano, MT, Alonso-Casaj ⁇ s, N., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Baroja-Fernández, E., Eydallin, G ., Pozueta- Romero, J. (2007) Occurrence of more than one important source of ADPglucose linked to glycogen biosynthesis in Escherichica coli and Salmonella enterica. FEBS Lett.
  • Chemotaxis is a process by which cells move towards high concentrations of an attractant or separate from high concentrations of a repellent.
  • the present transcriptomic analysis indicated that the expression levels of the tar-tap-cheRBYZ and motAB-cheAW chemotaxis operons were higher in AglgS cells than in WT cells (Table 1), which suggested that the GlgS protein exerts a negative effect on Chemotaxis Confirming this assumption, chemotaxis analysis using aspartate chemotaxis plates revealed a high-motility phenotype of W cells, which was nullified with the ectopic expression of glgS ( Figure 4E).
  • Biofilms are microbial communities adhered to a surface that are embedded in an EPS matrix produced by the same community. Such communities have phenotypic and biochemical properties different from those of cells that live in planktonic state.
  • flagella and type I fimbriae are involved in the formation and structural differentiation of biofilm [Prigent-Combaret, C, Prensier, G., Le Thi, TT, Vidal, O., Lejeune, P., Dorel , C. (2000) Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ.
  • Biofilm formation was also measured in AglgSAflhC, AglgSAfimA and AglgSAwzc cells prevented in the synthesis of flagella, fimbriae type I, and of cholanic acid of EPS, respectively.
  • AglgS cells accumulated a lot of biofilm compared to WT cells. This phenotype was largely reversed with the ectopic expression of glgS.
  • AgIgSAflhC, AgIgSAfimA and AgIgSAwzc cells accumulated little biofilm compared to AglgS cells. Therefore, all data indicated that GlgS exerts a negative effect on biofilm formation. Such an effect occurs not only in E. coli since, as shown in Figure 5B, the increase in glgS expression leads to a reduction in biofilm levels in different strains of Salmonella such as LT2, 1334 , 3934 and 14028.
  • serA ⁇ -ketoglutarate reduce / D-3-phosphoglycerate dehydrogenase
  • serB Phosphoserine phosphatase
  • dksA RNA-polymerase-binding protein modulating ppGpp and iNTP regulation dsrA Sulfite reduce, dissimilatory-fype alpha subunit
  • glgB 1 4-alpha-glucan branching enzyme gigc Glucose-1-phosphate adenylyltransferase
  • EPSs are fundamental components of most biofilm matrices whose synthesis depends on the conversion of G1 P and UTP into UDPglucose (UDPG) by the action of the UDPG pyrophosphorylase (GalU) enzyme.
  • UDPG UDPglucose
  • GalU UDPG pyrophosphorylase
  • the low glycogen content of AglgS cells is due to the low GlgC activity as a result of high levels of AMP and / or competition for ATP with the active mechanisms of flagellar motility and purine synthesis, so that the "excess" of G1 P (not used for glycogen production) is diverted to the production of EPSs.
  • glycogen deficiency indirectly promotes the high biofilm phenotype of AglgS and AglgC cells.
  • AglgA cells accumulate almost the same biofilm as the wild strain. This result is consistent with those obtained by Niba et al. (2007) who also did not observe a reduction in biofilm in AglgA cells and differ from the results obtained in a previous study (Jackson et al. 2002) in which the authors propose that glycogen serves as a source of carbon and energy for the formation of biofilm in Enterobacteriaceae. According to Jackson et al.
  • glycogen biosynthesis and its subsequent formation of G1 P GlgP-dependent are absolutely necessary for biofilm formation since (a) glycogen-free AglgA cells have a "low biofilm” phenotype, and (b) cells Ectopically expressing glgA and glgP have a "high biofilm” phenotype.
  • glycogen-free AglgC cells show a "high biofilm” phenotype, ruling out the possibility that glycogen degradation products (G1 P produced by GlgP) are necessary for biofilm formation .
  • UMP is the precursor for the synthesis of UTP [Turnbough, CL, Switzer, RL (2008) Regulation of pyrimidine biosynthetic gene expression in bacteria: repression without repressors. Microbiol Mol. Biol.
  • GlgS exerts a negative effect on the production of bacterial biofilms since it represses the expression of genes involved in the production of flagella, fimbriae and EPSs.
  • High levels of GlgS (existing during the steady state) lead to a reduction in the consumption of ATP necessary for bacterial motility and the synthesis of purines and pyrimidines.
  • the excess ATP and G1 P (not used for flagellar propulsion or for the production of EPSs, respectively) are used by GlgC to produce ADPG necessary for glycogen biosynthesis.
  • Mg 2+ is the most abundant divalent cation in living cells, being a stabilizing factor of membranes, tRNA, ribosomes, etc., which also strongly determines the metabolic and energetic state of cells [Smith, RL and Maguire, ME ( 1998) Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity. Mol. Microbiol 28, 217-226].
  • Mg 2+ has been described as an important determinant of glycogen accumulation due to its impact on intracellular levels of Mg 2+ bound to ATP necessary for GlgC activity [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Mu ⁇ oz, FJ, V ⁇ ale, AM, Rahimpour, M., Sesma, MT, Baroja-Fernández, E. , Pozueta- Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg 2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem J. 424, 129-141].
  • MgS0 4 has the same effect on both biofilm production and "swarming" motility as MgCl 2 and biofilm levels in The preparation with running water does not vary with respect to the levels in the preparation with deionized water.Therefore, all the data indicate that the Mg 2+ ion has a negative effect on both the formation of biofilm com or in bacterial motility.
  • bacteria During nutrient starvation, bacteria trigger the so-called strict response that changes cells from a growth state to a maintenance / survival state [Dennis, PP., Ehrenberg, M., Bremer, H. (2004) Control of rRNA synthesis in Escherichia coli: a systems biology approach. Microbiol Mol Biol R. 68, 639-668; Potrykus, K., Cashel, M. (2008) (p) ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol. 62, 35-51].
  • This physiological response is characterized by an increase in the intracellular levels of alarmone (p) ppGpp [Potrykus, K. and Cashel, M. (2008) (p) ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol.
  • Pyridoxal phosphate is the most versatile organic cofactor in biology and is used by a wide variety of enzymes in all organisms [Helmreich, EJ, Klein, HW (1980) The role of pyridoxal phosphate in the catalysis of glycogen phosphorylases Angew Chem Int Ed Engl. 19, 441-445; John, RA (1995) Pyridoxal phosphate-dependent enzymes. Biochim Biophys Acta, 1248, 81-96; Jansonius, JN (1998) Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 759-769; Mehta, PK, Christen, P.
  • AGPs are regulated at the level of their redox state, being more active in a reduced state
  • ADP -glucose pyrophosphorylase is activated by posttranslational redox-modification in response to light and to sugars in leaves of Arabidopsis and other plant species.
  • the present invention is characterized by preventing the appearance of de novo de biofilm by adding DTT in the culture medium.
  • Bacterial strains, plasmids and culture conditions Bacterial strains, plasmids and culture conditions:
  • the bacterial strains, mutants, and plasmids used in this work are shown in Table 5.
  • Table 5 Bacterial strains and plasmids used in this invention. Amp R , ampicillin resistance; Km R , kanamycin resistance; Cm R , chloramphenicol resistance
  • Plasmid used for glgS overexpression Plasmid used for glgS overexpression
  • Simple deletion mutants of strain BW251 13 derived from E. coli K-12 were obtained from the Keio collection [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL, Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst Biol. 2: 2006.0008].
  • the double deletion mutants were constructed from the simple mutants of the Keio collection, which possess a kanamycin resistance cassette at the gene deletion site.
  • the kanamycin cassette of the recipient cell was removed by using the thermosensitive plasmid pCP20, which causes FLP recombinase expression in E. coli.
  • thermosensitive plasmid pCP20 which causes FLP recombinase expression in E. coli.
  • phage P1 the deletion present in the donor strain was transduced to the recipient strain using phage P1 [Miller, JH (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].
  • LB plates supplemented with kanamycin were used for the selection of the double mutants, whose deletions were subsequently checked by PCR.
  • the expression of glgC and glgS in trans was performed by transforming the cells with the vectors pCA24N-g / gC and pCA24N-g / gS obtained from the ASKA collection [Kitagawa, M., Ara., T, Arifuzzaman, M., Ilka- Nakamichi, T., Inamoto, E., Toyonaga, H., Mori, H. (2005) Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research DNA Res.
  • the cells were grown at 37 ° C in orbital shaker with strong agitation (200 rpm) and in Kornberg liquid medium (1.1% K 2 HP0 4 , 0.85% KH 2 P0 4 , 0.6% Difco yeast extract) supplemented with 50 mM glucose and if necessary, the appropriate selection antibiotic, inoculating with 1 volume of preculture grown for 16 hours per 50 volumes of fresh medium.
  • Kanamycin cassette inserted at the site of the deleted gene from the Keio collection mutants [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko , KA, Tomita, M., Wanner, BL, Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst Biol. 2: 2006.0008] was eliminated using the thermosensitive plasmid pCP20, which expresses the FLP recombinase [Cherepanov, PP and Wackernagel, W.
  • the scar left after eliminating the kanamycin resistance cassette includes a FRT site of 34 nucleotides [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko , KA, Tomita, M., Wanner, BL, Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst Biol.
  • Bacterial growth was followed spectrophotometrically by measuring the absorbance of the cultures at 600 nm.
  • the cultures were collected at the entrance of the stationary phase, centrifuged at 4400 g for 15 min, washed with fresh Kornberg medium, resuspended in 40mM Tris / HCI pH 7.5 and sonicated before carrying out the protein content measurements. and glycogen.
  • the ⁇ -galactosidase activity was measured and represented as described in [Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor].
  • the total protein of the crude extracts was measured by the Bradford method using a Bio-Rad commercial reagent.
  • Total RNA was extracted using the TRIzol reagent according to the protocol described in [Toledo-Arana, A., Dussurget, O., Nikitas, G., Sesto, N., Guet-Revillet, H., Balestrino, D., Loh , E., Gripenland, J., Tiensuu, T., Vaitkevicius, K., Barthelemy, M., Vergassola, M., Nahori, MA, Soubigou, G., Régnault, B., Cop conclusions, JY, Lecuit, M ., Johansson, J., Cossart, P.
  • the fluorescence-labeled cDNA for microarray hybridizations was obtained using the cDNA Labelling System kit (Invitrogen), following the manufacturer's instructions. Briefly, 20 ⁇ g of total RNA was converted into cDNA with the Superscript III reverse transcriptase using random hexamers as primers, and including modified nucleotides in the reaction mixture. After purifying the cDNA, the Cy3 or Hyper5 fluorescent markers (GE Healthcare) were attached to the cDNA using the modified nucleotides. The efficiency of the marking was analyzed using a NanoDrop ND1000 spectrophotometer (NanoDropTechnologies).
  • the minimum medium used for "swarming" motility tests included 10 mM K + -phosphate (pH 7.0), 1 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 mM MgS0 4 , 0.3% Bacto agar (Difco), 20 ⁇ g mi "1 of L-threonine, L-leucine, L-histidine, L-methionine and 1 [beta] mi " 1 of thiamine.
  • the plates were also supplemented with 100 mM aspartate, 0.5% NaCI and 1 mM glycerol.
  • mutants thus obtained was subjected to a screening in solid Kornberg medium supplemented with glucose to identify those with altered glycogen levels, using the iodine vapors staining technique [Govons, S., Vinopal, R., Ingraham, J., Preiss, J. (1969) Isolation of mutants of Escherichia coli B altered in their ability to synthesize glycogen. J. Bacteriol. 97, 970-972]. In the presence of iodine vapors mutants with high glycogen content stain darker brown than their parental mutant, while mutants with low glycogen content stain yellow.

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Abstract

La presente invención describe una serie de compuestos útiles para reducir o anular procesos determinantes de la patogenicidad y virulencia bacterianas y de la adherencia bacteriana a superficies inertes o células tales como la producción de adhesinas, la motilidad flagelar y la formación de EPSs y biofilms bacterianos. Estos compuestos pueden usarse para la elaboración de composiciones farmacéuticas antibacterianas o de composiciones antisépticas para el tratamiento de un amplio abanico de infecciones bacterianas, como por ejemplo, E. coli, S. typhi, S. dysenteteriae, V. chlolerae, P. aeruginosa, H. pylori, L. monocytogenes, C. difficile y S. pyogenes. También describe una serie de compuestos que favorecen la uníon entre rhizobacterias beneficiosas y células de las raíces de las plantas. Además, se describe un procedimiento para la identificación de dichos compuestos.

Description

COMPUESTOS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES BACTERIANAS, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN, PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE LOS MISMOS Y SUS APLICACIONES DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se enmarca en el campo de desarrollo de nuevos compuestos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, la limpieza de materiales asépticos, evitar la proliferación bacteriana en superficies y canalizaciones y por tanto está dirigida al campo de la biomedicina y el desarrollo farmacéutico y agroalimentario. También se enmarca en el campo de desarrollo de compuestos que fomenten la interacción de rhizobacterias beneficiosas con células vegetales y por tanto está dirigida al campo de la agricultura y la agronomía.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El glucógeno es un homopolisacárido altamente ramificado formado por unidades de glucosa unidas por enlaces a-1 ,4 y a-1 ,6 en los puntos de ramificación. En bacterias, la función de este polisacárido de reserva no está bien definida todavía, pero diversos trabajos han vinculado el metabolismo del glucógeno con la supervivencia, y en el caso de patógenos con la colonización y virulencia [Jones, S. A., Jorgensen, M., Chowdhury, F. Z., Rodgers, R., Hartline, J., Leatham, M. P., Struve, C, Krogfelt, K. A., Cohén, P. S., Conway, T. (2008) Glycogen and maltose utilization by Escherichia coli 0157:1-17 in the mouse intestine. Infect. Immun. 76, 2531-2540; Sambou, T., Dinadayala, P., Stadthagen, G., Barilone, N., Bordat, Y., Constant, P., Levillain, F., Neyrolles, O., Gicquel, B., Lemassu, A., Daffe, M., Jackson, M. (2008) Capsular glucan and intracellular glycogen of Mycobacterium tuberculosis: biosynthesis and impact on the persistence in mice. Mol. Microbiol. 70, 762- 774; Bourassa, L, Camilli, A. (2009) Glycogen contributes to the environmental persistence and transmission of Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 72, 124-138; Wang, L., Wise, M. J. (201 1) Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98, 719-729]. Sintetizado por la glucógeno sintasa (GlgA) utilizando ADP-glucosa (ADPG) como molécula donadora del grupo glucosilo, la acumulación de glucógeno bacteriano es un proceso que requiere energía (ATP) y que ocurre cuando en presencia de una fuente de carbono en exceso, existe una deficiencia de otro(s) nutriente(s). La regulación de la síntesis de glucógeno en enterobacterias abarca un complejo ensamblaje de factores que están ajustados al estado nutricional de la célula [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja- Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141 ; Wilson, W. A., Roach, P. J., Montero, M., Baroja-Fernández, E., Muñoz, F. J., Eydallin, G., Víale, A. M., Pozueta-Romero, J. (2010) Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 952-985]. A nivel transcripcional, estudios recientes han mostrado que el metabolismo del glucógeno está sujeto a la regulación del operón glgBXCAP perteneciente al reguión a través de RelA [Montero, M., Almagro G., Eydallin G., Víale, A. M., Muñoz, F. J., Bahaji, A., Li, J., Rahimpour, M., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (201 1) Escherichia coli glycogen genes are organized in a single glgBXCAP transcriptional unit possessing an alternative suboperonic promoter within glgC that directs glgAP expression. Biochem. J. 433, 107-1 17]. glgBXCAP forma parte del reguión PhoP-PhoQ [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141], de modo que su expresión responde positivamente a la concentración extracelular de Mg2+. A nivel de actividad enzimática, la biosíntesis de glucógeno está sometida a la regulación alostérica de la ADPG-pirofosforilasa (AGP, también llamada GlgC en bacterias), la cual produce ADPG desde ATP y glucosa-1 -fosfato (G1 P) [Ballicora, M. A., Iglesias, A. A., Preiss, J. (2003) ADP-glucose pyrophosphorylase, a regulatory enzyme for bacterial glycogen synthesis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 213-225]. Los reguladores alostéricos que incrementan su actividad han sido ampliamente descritos y entre ellos se encuentran: NADH, NADPH, piridoxal-fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6-bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6-bifosfato (F2.6P2), 3-fosfoglicerato (3PGA), sedoheptulosa 1 ,7- difosfato, D-arabinitol 1 ,5-difosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2- fosfoglicerato, magnesio (Mg2+), eritrosa-4-fosfato, fosfoenolpiruvato y fosfoketodeoxigluconato [Preiss, J. (1984) Bacterial glycogen synthesis and its regulation. Annu. Rev. Microbiol. 38, 419-458; Preiss, J., Shen, L, Greenberg, E., Gentner, N. (1966) Biosíntesis of bacterial glycogen. IV. Activation and inhibition of adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase of Escherichia coli B. Biochemistry. 5, 1833-1845]. Por otro lado, el AMP actúa como regulador alostérico negativo de GlgC.
Las bacterias poseen además otras AGPs que no son reconocidas por anticuerpos específicos contra GlgC [Martin, M.C., Scheneider, D., Bruton, C.J., Chater, K.F. and Hardisson, C. (1997) A glgC gene essential only for the first two spatially distinct phases of glycogen synthesis in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol 179, 7784-7789; Morán-Zorzano, M.T., Alonso-Casajús, N., Muñoz, F.J., Víale, A.M., Baroja-Fernández, E., Eydallin, G., Pozueta-Romero, J. (2007) Occurrence of more than one important source of ADPglucose linked to glycogen biosynthesis in Escherichia coli and Salmonella entérica. FEBS Lett 581 , 4423-4429; Eydallin, G., Morán-Zorzano, M.T., Muñoz, F.J., Baroja-Fernández, E., Montero, M., Alonso-Casajús, N., Víale, A.M. and Pozueta-Romero, J. (2007) An Escherichia coli mutant producing a truncated inactive form of GlgC synthesizes glycogen: further evidences for the occurrence of various important sources of ADPglucose in enterobacteria. FEBS Lett 581 , 4417-4422]. Las plantas también poseen AGP y aunque su homología con las AGPs bacterianas (como por ejemplo, la GlgC de E. coli) es muy baja [Li J., Almagro G., Muñoz F.J., Baroja-Fernández E., Bahaji A., Montero M., Hidalgo M., Sánchez-López A.M., Ezquer I., Sesma M.T., Pozueta-Romero J. (2012) Post-translational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase in response to light is not a major determinant of fine regulation of transitory starch accumulation in Arabidopsis leaves. Plant Cell Physiol. 53:433-44], su actividad es idéntica. De hecho, las bacterias puede expresar AGP activa de origen vegetal y viceversa [Iglesias A. A., Barry G.F., Meyer C, Bloksberg L., Nakata P.A., Greene T, Laughlin M.J., Okita T.W., Kishore G.M., Preiss, J. (1993) Expression of the potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268, 1081-1086; Crevillén P., Ballicora M.A., Mérida A., Preiss J., Romero J.M. (2003) The different large subunit isoforms of Arabidopsis thaliana ADP-glucose pyrophosphorylase confer distinct kinetic and regulatory properties to the heterotetrameric enzyme. J. Biol. Chem. 278, 28508-28515; Li J., Almagro G., Muñoz F.J., Baroja- Fernández E., Bahaji A., Montero M., Hidalgo M., Sánchez-López A.M., Ezquer I., Sesma M.T., Pozueta-Romero J. (2012) Post-translational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase in response to light is not a major determinant of fine regulation of transitory starch accumulation in Arabidopsis leaves. Plant Cell Physiol. 53: 433-44]
La acumulación de glucógeno además se ve afectada positivamente por la expresión del gen glgS, el cual codifica para una proteína de 7.9 kDa, hidrofílica, altamente cargada, de función desconocida y que carece de homología de secuencia con otras proteínas fuera de las enterobacterias [Hengge-Aronis, R., Fischer, D. (1992) Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth-phase-regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: 1877-1886; Beglova, N., Fisher, D., Hengge-Aronis, R., Gehring, K. (1997) Ή, 15N and 13C NMR assignments, secondary structure and overall topology of the Escherichia coli GlgS protein. Eur J Biochem. 246: 301-310; Kozlov, G., Elias, D., Cygler, M., Gehring, K. (2004) Structure of GlgS from Escherichia coli suggests a role in protein-protein interactions. BMC Biology 2: 10-17]. En Escherichia coli la expresión de glgS está negativamente regulada por el regulador post-transcripcional global CsrA [Yang, H., Liu, M.Y., Romeo, T. (1996) Coordínate genetic regulation of glycogen catabolism and biosynthesis in Escherichia coli via the csrA gene product. J Bacteriol 178: 1012-1017]. Además, la expresión de glgS presenta una fuerte inducción en la fase estacionaria [Hengge-Aronis, R., Fischer, D. (1992) Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth-phase-regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: 1877-1886; Selinger, D.W., Cheung, K.J., Mei, R., Johansson, E.M., Richmond, C.S., Blattner, F.R., Lockhart, D.J., Church, G.M. (2000) RNA expression analysis using a 30 base pair resolution Escherichia coli genome array. Nat. Biotechnol. 18, 1262-1268], y está regulada positivamente por el regulador general del estrés RpoS [Hengge-Aronis, R., Fischer, D. (1992) Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth-phase- regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: 1877-1886], por el regulador de la respuesta estricta ppGpp [Durfee, T., Hansen, A-M., Zhi, H., Blattner, F.R., Lin, D.J. (2008) Transcription profiling of the stringent response in Escherichia coli. J. Bacteriol. 190, 1084-1096; Traxler, M.F., Summers, S.M., Nguyen, H-T., Zacharia, V.M., Hightower, G.A., Smith, J.T., Conway, T. (2008) The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 68, 1128-1 148] y por la chaperona de RNA Hfq [Muffler, A., Traulsen, D.D., Fischer, D., Lange, R., Hengge-Aronis, R. (1997) The RNA-binding protein HF-1 plays a global regulatory role which is largely, but not extensively, due to its role in expression of the sigmaS subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179, 297-300], cuya traducción está a su vez inhibida por CsrA [Baker, C.S., Morozov, I., Suzuki, K., Romeo, T., Babitzke, P. (2002) CsrA regulates glycogen biosynthesis by preventing translation of glgC in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 44, 1599-1610].
Hasta el momento se desconoce la función exacta de GlgS. Un trabajo anterior sugirió que GlgS podría constituir el sitio de unión de la primera molécula de glucosa durante el proceso de iniciación del gránulo de glucógeno en E. coli [Beglova, N., Fisher, D., Hengge-Aronis, R., Gehring, K. (1997) 'Η, 15N and 13C NMR assignments, secondary structure and overall topology of the Escherichia coli GlgS protein. Eur J Biochem. 246: 301-310]. Sin embargo, esta hipótesis quedó en entredicho tras la demostración de que GlgA de Agrobacterium tumefaciens no requiere de proteínas adicionales para la iniciación del gránulo de glucógeno [Ugalde, J.E., Parodi, A.J., Ugalde, R.A. (2003) De novo synthesis of bacterial glycogen: Agrobacterium tumefaciens glycogen synthase is involved in glucan initiation and elongation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 100: 10659-10663]. Recientemente, inventores de la presente invención mostraron que mutantes nulos de glgS (AglgS) acumulaban altos niveles de AMP [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141], el regulador alostérico natural y negativo de GlgC [Ballicora, M. A., Iglesias, A. A., Preiss, J. (2003) ADP-glucose pyrophosphorylase, a regulatory enzyme for bacterial glycogen synthesis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 213-225]. Para comprender la función de la proteína GlgS, en esta invención se han llevado a cabo análisis transcriptómicos en células AglgS de E. coli y estudios de actividad biológica y bioquímicos que han revelado que las funciones de las proteínas GlgS y GlgC ejercen un efecto negativo en la producción de fimbrias de tipo 1 , flagelos, exopolisacáridos y biofilms bacterianos que actúan como determinantes mayoritarios tanto de la patogenicidad y virulencia de las bacterianas como de la adhesión de las bacterias a superficies inertes y a células.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe un compuesto útil para reducir o anular procesos determinantes de la patogenicidad y virulencia bacterianas y de la adherencia bacteriana a superficies tales como la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad flagelar y la formación de EPSs y biofilms bacterianos, en adelante compuesto inhibidor de la invención, que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la estimulación de GlgC, GlgA y/o GlgS o cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno. También se describe un compuesto útil para aumentar procesos determinantes de la adherencia bacteriana a superficies inertes y/o a células de raíces de plantas tales como la motilidad y la formación de EPSs y biofilms bacterianos, en adelante compuesto activador de la invención, que regula negativamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la inhibición de GlgC o cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde dicho compuesto es una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular.
Una realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la proteína es una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 (AGP de origen bacteriano o GlgC) y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6 (AGP de origen vegetal).
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la proteína es una proteína GlgS, y preferentemente, una proteína GlgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4.
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia agp que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y preferentemente, una secuencia que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo, al siguiente grupo: la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 1 (origen bacteriano) y la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 (origen vegetal).
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia glgS que codifica para una proteína o péptido GlgS, y preferentemente, una secuencia que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 3.
Otro objeto de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención para uso en la prevención y tratamiento de una contaminación bacteriana.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la contaminación bacteriana se refiere a una infección bacteriana en preferiblemente mamíferos, preferentemente humanos, o a la presencia de bacterias en distintos materiales, superficies o equipos asépticos.
Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende al menos un compuesto inhibidor de la invención, en cantidad farmacéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente, un ser humano, afectado por una infección bacteriana consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que permita la reducción o eliminación de dicha infección.
Otro objeto de la invención lo constituye el compuesto inhbidor de la invención para uso en el fomento de la interacción entre rhizobacterias beneficiosas y células de raíces de las plantas.
Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la identificación de un compuesto inhibidor de la motilidad, formación de EPSs y biofilms determinantes de la patogenicidad y virulencia bacteriana, así como de la capacidad de adherencia de las bacterias a superficies inertes o células, preferentemente mediante la puesta a punto de un ensayo de alta capacidad ("high throughput screening"), en adelante procedimiento de la invención, que comprende los siguientes pasos:
a) crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo suplementado con el compuesto candidato,
b) análisis cualitativo-visual de los niveles de glucógeno bacteriano producidos en las bacterias de a), preferentemente, mediante tinción del glucógeno con vapores de iodo, y
c) selección de un compuesto inhibidor cuando dicho compuesto incrementa la cantidad de glucógeno bacteriano detectado según el método de b) con respecto a sus niveles básales. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en que los inventores han observado que, en enterobacterias, GlgS ejerce un efecto negativo en la producción de fimbrias de tipo 1 , flagelos, exopolisacáridos (EPSs) y biofilms bacterianos que actúan como determinantes mayoritarios tanto de la patogenicidad y virulencia de las bacterianas como de la adherencia de las bacterias a superficies. Además, los inventores han observado que GlgC ejerce en bacterias que acumulan glucógeno un efecto negativo en la motilidad flagelar, en la producción de EPSs y en la producción de biofilmes bacterianos.
En esta invención se muestra que la expresión de glgS ejerce un efecto negativo en la expresión a nivel transcripcional de genes implicados en la producción de flagelos, fimbrias de tipo 1 , purinas y pirimidinas de enterobacterias (Ejemplo 1.1). También se muestra que las células AglgS son hiperflageladas e hiperfimbriadas (Ejemplo 1.2), hipermóviles (Ejemplo 1.3) y acumulan grandes cantidades de biofilm (Ejemplo 1.4) y EPSs (Ejemplo 1.6). Estos fenotipos revirtieron mediante la expresión ectópica de glgS (Ejemplo 1.3, Ejemplo 1.4 y Ejemplo 1.6). Además, en esta invención se muestra que la expresión ectópica de glgS y de glgC en diferentes cepas de E. coli y de Salmonella conlleva a una reducción de la motilidad y del contenido de biofilm (Ejemplo 1.3 y Ejemplo 1.4).
Análisis a gran escala de la interacción de glgS con todos los genes no esenciales de E. coli mostraron que las alteraciones en la síntesis de novo de AMP revierten los fenotipos de "bajo glucógeno", "elevada motilidad" y "elevado contenido de biofilm" de las células AglgS (Ejemplo 1.5). Estos resultados indicaron que el déficit de glucógeno en las células AglgS se debe a la inhibición de GlgC por un exceso de AMP, de modo que el ATP y G1 P no utilizado por GlgC es re-dirigido hacia la propulsión flagelar y hacia la síntesis de EPSs, respectivamente. Confirmando esta hipótesis, en esta invención se muestra que células AglgC carentes de glucógeno presentan fenotipos de "elevada motilidad" (Ejemplo 1.5), "elevado contenido de biofilm" (Ejemplo 1.6) y "elevado contenido de EPSs" (Ejemplo 1.6), mientras que las células AglgSAflhC, de motilidad baja, acumulan más glucógeno que las células AglgS (Ejemplo 1.5). Por otra parte, en esta invención se muestra que la expresión ectópica de glgC (Ejemplo 1.7) revierte los fenotipos "bajo glucógeno", "elevada motilidad", "elevado contenido de biofilm" y "elevado contenido de EPSs" de las células AglgS (Ejemplo 1.5 y Ejemplo 1.6). Es más, se muestra que un incremento de la expresión de glgC en diferentes cepas de E. coli y Salmonella conlleva a una reducción de la motilidad y del contenido de biofilm (Ejemplo 1.5 y Ejemplo 1.6). Tras demostrar que glgS ejerce un efecto negativo en procesos de propulsión flagelar y de síntesis de EPSs de biofilmes que compiten con GlgC por el mismo pool de ATP y de G1 P, en esta invención se demuestra que cualquier estrategia de estimulación directa o indirecta de GlgS (para el caso de enterobacterias) y/o GlgC (para cualquier tipo de bacteria que acumule glucógeno) reduce la formación de biofilmes y la motilidad bacteriana que determinan tanto la patogenicidad y virulencia bacteriana como la capacidad de adherirse las bacterias a superficies. Por el contrario, cualquier estrategia de inhibición directa o indirecta de GlgS (para el caso de enterobacteiras) y/o GlgC (para el caso de cualquier tipo de bacteria que acumule glucógeno) incrementa la formación de flagelos (con el consiguiente incremento de la motilidad flagelar), fimbrias de tipo 1 , EPSs y biofilmes determinantes tanto de la adherencia de las bacterias a superficies como de la virulencia y patogenicidad bacteriana.
Se identifica así que la alteración directa o indirecta de la expresión de los genes bacterianos glgS y glgC o de las proteínas expresadas por los mismos, GlgS y GlgC, ya sea de forma simultánea o independiente, como vías terapéuticas para alterar la virulencia y patogenicidad bacteriana, o bien para alterar la capacidad de adherencia de bacterias a superficies inertes tales como catéteres, tuberías, etc., evitando así la contaminación bacteriana de los mismos, concretamente utilizando estos elementos biotecnológicos para reproducir e incrementar el nivel de expresión y actividad de sus funciones biológicas para reducir la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad y la formación de polisacáridos de biofilms bacterianos, por ejemplo, mediante composiciones farmacéuticas que contengan estos vectores génicos que permitan la expresión de dichos genes en bacterias patógenas o el uso de dichas proteínas como fármacos o antisépticos antibacterianos. Por otro lado, los elementos biotecnológicos - vectores, proteínas expresadas - y las células desarrolladas en la presente invención permiten el desarrollo de ensayos para la identificación de compuestos que incrementen la expresión/actividad de estas dos dianas in vivo, GlgS y/o GlgC, por ejemplo, mediante el uso de tecnología "high-throughput".
Así, un primer objeto de la presente invención lo constituye un compuesto útil para reducir o anular procesos determinantes de la patogenicidad y virulencia bacterianas y de la adherencia bacteriana a superficies inertes o células tales como la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad flagelar y la formación de EPSs y biofilms bacterianos, en adelante compuesto inhibidor de la invención, que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la estimulación de GlgC y/o GlgS o cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde dicho compuesto es una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular.
Una realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la proteína es una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 (AGP de origen bacteriano o GlgC) y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6 (AGP de origen vegetal).
Tal como se usa en la presente invención el término "proteína con actividad AGP" se refiere a una proteína o péptido, ya sea de origen eucariota o procariota, y que presente al menos un 40% de homología con la SEQ ID NO 2 o con SEQ ID NO 6.
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la proteína es una proteína GlgS, y preferentemente, una proteína GlgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4.
Tal como se usa en la presente invención el término "proteína GIgS" se refiere a una proteína o péptido que presente al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO 4.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde dicho compuesto es una secuencia de nucleotidos codificante de una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular.
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la secuencia de nucleotidos es una secuencia agp que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y preferentemente, una secuencia que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo, al siguiente grupo: la secuencia de nucleotidos SEQ ID NOn 1 (origen bacteriano) y la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO 5 (origen vegetal).
Otra realización particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la secuencia de nucleotidos es una secuencia glgS que codifica para una proteína o péptido GIgS, y preferentemente, una secuencia que comprende la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO 3.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde el compuesto es un regulador alostérico capaz de activar a una proteína o péptido con actividad AGP, o cualquier otro tipo de sustancia capaz de activar la expresión de secuencias nucleotídicas codificantes para AGP o GIgS.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde el compuesto pertenece, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: sedoheptulosa 1 ,7-difosfato, D-arabinitol 1 ,5-difosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2-fosfoglicerato, eritrosa-4-fosfato, fosfoenolpiruvato, fosfoketodeoxigluconato, ión magnesio (Mg2+), NADH, NADPH, piridoxal- fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6-bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6- bifosfato (F2.6P2) o 3-fosfoglicerato (3PGA).
Otro objeto de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención para uso en la prevención y tratamiento de una contaminación bacteriana.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el compuesto inhibidor de la invención donde la contaminación bacteriana se refiere a una infección bacteriana en mamíferos, preferentemente humanos, o a la presencia de bacterias en distintos materiales, superficies o equipos asépticos. Otro objeto de la invención lo constituye el uso del compuesto inhibidor de la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o para la limpieza antiséptica (por ejemplo, superficies tales como catéteres, tuberías, material biomédico, sistemas de aire acondicionado, etc.), producida por una bacteria perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:
a) Gram negativas, preferentemente, Escherichia, Salmonella, Campilobacter, Shigella, Yersinia, Vibrio, Pseudomonas, Helicobacter, Bartonella, Neisseria y Bordetella, y más preferentemente, E. coli, S. typhi, S. typhimurium, C. jejuni, S. dysenteteriae, Y. pestis, V. chlolerae, P. aeruginosa, H. pylori, B. bacilliformis, N. gonorrhoeae, B. pertusis; y
b) Gram positivas, preferentemente, Listeria, Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Actinomyces, y más preferentemente, L monocytogenes, C. difficile y S. pyogenes.
Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende al menos un compuesto inhibidor de la invención, en cantidad farmacéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas o antisépticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de eliminar los microorganismos patógenos, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, para el caso de una composición terapéutica, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta, forma y frecuencia de administración; y para el caso de una composición antiséptica, las condiciones del entorno, la forma de aplicación, entre otras.
En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
Otro objeto particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 (origen bacteriano) y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6 (origen vegetal).
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una proteína GIgS, y preferentemente, una proteína GIgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4.
Otro objeto particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una secuencia de nucleótidos agp que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y preferentemente, una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: secuencia SEQ ID NO 1 (secuencia nucleotídica que codifica para una AGP de origen bacteriano, GlgC) y secuencia SEQ ID NO 5 (secuencia nucleotídica que codifica para un AGP de origen vegetal).
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es una secuencia nucleotídica glgS que codifica para una proteína o péptido GIgS, y preferentemente, una secuencia que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 3. Otro objeto particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor es un regulador alostérico capaz de activar a una proteína o péptido con actividad AGP, o cualquier otro tipo de sustancia que active la expresión de secuencias nucleotídicas que codifiquen para GlgC o GlgS.
Otro objeto particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde el compuesto inhibidor pertenece, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo de sustancias: sedoheptulosa 1 ,7-difosfato, D- arabinitol 1 ,5-difosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2-fosfoglicerato, eritrosa- 4-fosfato, fosfoenolpiruvato, fosfoketodeoxigluconato, magnesio (Mg2+), NADH, NADPH, piridoxal-fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6-bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6-bifosfato (F2.6P2) o 3-fosfoglicerato (3PGA).
Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente, un ser humano, afectado por una infección bacteriana consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que permita la reducción o eliminación de dicha infección.
La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención para la limpieza antiséptica de entornos o materiales contaminados por bacterias.
Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la identificación de un compuesto inhibidor de la motilidad, formación de EPSs y biofilms determinantes de la patogenicidad y virulencia bacteriana, así como de la capacidad de adherencia de las bacterias a superficies inertes o células, preferentemente mediante la puesta a punto de un ensayo de alta capacidad ("high throughput screening"), en adelante procedimiento de la invención, que comprende los siguientes pasos:
a) crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo suplementado con el compuesto candidato,
b) análisis cualitativo-visual de los niveles de glucógeno bacteriano producidos en las bacterias de a), preferentemente, mediante tinción del glucógeno con vapores de iodo, y c) selección de un compuesto inhibidor cuando dicho compuesto incrementa la cantidad de glucógeno bacteriano detectado según el método de b) con respecto a sus niveles básales.
Otro objeto de la presente invención es un compuesto útil para incrementar procesos determinantes de la unión de rhizobacterias beneficiosas a las raíces de las plantas tales como la producción de adhesinas, la motilidad, la formación de EPSs y/o biofilms bacterianos, en adelante agente estimulador de la invención, caracterizado porque regula negativamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la inhibición de GIgC o de cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno.
Otro objeto de la presente invención lo constituye el agente estimulador de la invención donde dicho agente es un regulador alostérico capaz de inhibir a GIgC u otra AGP de origen microbiano cuya secuencia es diferente a GIgC.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el agente estimulador de la invención caracterizado porque es un regulador alostérico de GIgC perteneciente al siguiente grupo: AMP, ADP, ortofosfato y pirofosfato.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 - Clasificación funcional de los genes cuyos niveles de expresión son diferentes en células AglgS y en células silvestres (WT). Las barras negras corresponden a los genes cuya expresión es mayor en células AglgS que en células WT, mientras que las barras blancas corresponden a los genes cuya expresión es inferior en células AglgS que en células WT. Los genes se clasificaron en categorías COG [Keseler, I.M., Collado-Vides, J., Gama-Castro, S., Ingraham, J., Paley, S., Paulsen, I ., Peralta-Gil, M., Karp, P.D. (2005) EcoCyc: a comprehensive datábase resourve for Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 33 (Datábase issue), D334-D337, doi: 10.1093/nar/gk¡108].
Figura 2 - Actividad β-galactosidasa en células silvestres (WT, barras blancas) y en células AglgS (barras grises) que expresan la fusión transcripcional lacZY indicada. Las células fueron cultivadas en medio Kornberg líquido suplementado con glucosa y recolectadas a la entrada de la fase estacionaria para la medida de la actividad β-galactosidasa. Los resultados son la media ± ES de 5 experimentos independientes.
Figura 3 - Imágenes de microscopía eléctronica de células silvestres (WT) pertenecientes a la cepa BW25113 y AglgS teñidas negativamente con ácido fosfotungstico al 2%. Las barras en los paneles superiores e inferiores son de 2 y 0.5 μηι, respectivamente. Las flechas indican la posición de las fimbrias de tipo I. Nótese que GlgS afecta negativamente a la producción de flagelos (paneles superiores) y fimbrias de tipo I (paneles inferiores). Las células fueron cultivadas en medio Kornberg líquido suplementado con glucosa y recolectadas a la entrada de la fase estacionaria.
Figura 4 - GIgS ejerce un efecto negativo en la motilidad tipo "swarming". (A) Fenotipo de motilidad tipo "swarming" de células silvestres (WT) de la cepa BW25113, AglgS, AglgSAflhC, AglgSAfliA y AglgS que sobreexprenan (SE) glgS. Nótese que las células AglgS presentan un fenotipo "high swarming" que se revierte con la expresión ectópica de glgS. Como era esperado, las células AglgSAflhC y AglgSAfliA no presentan motilidad tipo "swarming", confirmando así que los flagelos constituyen un factor determinante del fenotipo "high swarming" de las células AglgS. (B) Fenotipo de motilidad tipo "swarming" de células de E. coli W y células W que sobreexpresan glgS. (C) Fenotipo de motilidad tipo "swarming" de células de la cepa 3934 de Salmonella y de células 3934 que sobreexpresan glgS. (D) Fenotipo de motilidad tipo "swarming" de células LT2 de Salmonella y células LT2 que sobreexpresan glgS. (E) Fenotipo de quimiotaxis de células W y células W que sobreexpresan glgS. Nótese en "B" y en "E" que la expresión ectópica de glgS ejerce un efecto negativo en la motilidad tipo "swarming" y en la quimiotaxis de células W, respectivamente.
Figura 5.- GlgS ejerce un efecto negativo en la acumulación de biofilm (A) Contenido total de biofilm (normalizado con respecto al crecimiento bacteriano) de células de E. coli silvestres (WT) de la cepa BW251 13, AglgS, AglgSAflhC, AglgSAfimA, AgIgSAwzc y AglgS que sobre-expresan (SE) glgS. (B) Contenido de biofilm en células de las cepas LT2, 1334, 3934 y 14028 de Salmonella y de las células de las cepas LT2, 1334, 3934 y 14028 que sobre-expresan glgS. Las células fueron cultivadas en placas de poliestireno de 96 pocilios a 28°C durante 48 h en medio Kornberg suplementado con 50 mM de glucosa. Los resultados son la media ± ES de 5 experimentos independientes.
Figura 6 - Ruta metabólica de la biosíntesis de novo de purinas. En negrita están indicadas las enzimas cuya reducción, desaparición o inhibición promueve la acumulación de glucógeno en células AglgS.
Figura 7.- Contenido de glucógeno y motilidad tipo "swarming" en bacterias AglgS, AglgSApurM y AglgSApurL. (A) Contenido de glucógeno y (B) motilidad tipo "swarming" de células silvestres (WT) de E. coli BW251 13, AglgS, AglgSApurM y AglgSApurL. Nótese que el impedimento de la síntesis de novo de AMP conlleva a un aumento del contenido de glucógeno y revierte el fenotipo hipermótil de las células AglgS. Los resultados en "A" son la media ± ES de 3 experimentos independientes. En "A", las células fueron cultivadas en medio Kornberg líquido suplementado con glucosa y recolectadas a la entrada de la fase estacionaria.
Figura 8 - Contenido de glucógeno y motilidad tipo "swarming" en células silvestres (WT) de E. coli BW25113, AglgS, AgIgSAflhC, AgIgSAfliA, AglgA, AglgC, células WT que sobre-expresan glgC y células AglgS que sobre-expresan glgC, y motilidad tipo "swarming" en células de Salmonella que sobre-expresan glgC. (A) Contenido de glucógeno en células silvestres (WT) de E. coli BW25113, AglgS, AgIgSAflhC, AgIgSAfliA, AglgA, AglgC, células WT que sobre-expresan glgC, y células AglgS que sobre-expresan (SE) glgC. (B) Motilidad tipo "swarming" de células WT de E. coli BW25113, AglgS, AglgA, AglgC, y células AglgS que sobre-expresan glgC. (C) Motilidad tipo "swarming" de células de la cepa 3934 de Salmonella y de células 3934 que sobre-expresan glgC. (D) Motilidad tipo "swarming" de células de la cepa 14028 de Salmonella y de células 14028 que sobre-expresan glgC. Los resultados en "A" son la media ± ES de 3 experimentos independientes. En "A", las células fueron cultivadas en medio Kornberg líquido suplementado con glucosa y recolectadas a la entrada de la fase estacionaria.
Figura 9 - Contenido de biofilm en células silvestres (WT) de E. coli BW25113, AglgS, AglgA, AglgC, células WT que sobre-expresan glgC, células AglgS que sobre- expresan glgC, AglgSApurL, AglgCAgalU y AgIgSAgalU y en diferentes cepas de Salmonella con y sin sobre-expresión de glgC. (A) Contenido de biofilm en células silvestres (WT) de E. coli BW25113, AglgS, AglgA, AglgC, células WT que sobre-expresan (SE) glgC, células AglgS que sobre-expresan glgC, AglgSApurL, AglgCAgalU y AgIgSAgalU. (B) Contenido de biofilm en células de las cepas LT2, 1334, 3934 y 14028 de Salmonella y de las células de las cepas LT2, 1334, 3934 y 14028 que sobre-expresan glgC. Nótese que la (a) la sobre-expresión de glgC conlleva a una reducción del contenido de biofilm y (b) la eliminación de GalU revierte el fenotipo "alto contenido de biofilm" de las células AglgC y AglgS demostrando así que el alto contenido de biofilm de las células deficientes en glucógeno AglgS y las células carentes de glucógeno AglgC es debido, al menos en parte, a la conversión por GalU de la G1 P no utilizada por GlgC en EPSs. Las células fueron cultivadas en placas de poliestireno de 96 pocilios a 28°C durante 48 h en medio Kornberg suplementado con 50 mM de glucosa. Los resultados son la media ± ES de 5 experimentos independientes.
Figura 10-: Ruta metabólica de síntesis de ácido colánico a partir de G1 P. Figura 11 -. Contenido de ácido colanico en células silvestres (WT) de E. coli BW25113, AglgS, AglgC, AgalU, Awzc, AgIgSAgalU, AglgCAgalU, AglgS Awzc, AglgCAwzc, células AglgS que sobre-expresan glgC, células AglgC que expresan ectópicamente glgC.
Figura 12.- Ruta metabolica de la biosíntesis de novo de pirimidinas. En negrita están indicadas las enzimas cuya reducción, desaparición o inhibición promueve la acumulación de glucógeno en células AglgS.
Figura 13 - Propuesta de un modelo integrativo de la síntesis de fimbrias de tipo I, flagelos, polisacáridos de biofilm y glucógeno controlado por GIgS (ScoR, de Surface Composition Regulator) en enterobacterias. Según este modelo, la expresión de glgS (scoR) estaría altamente determinada por RpoS, cuyos niveles a su vez estarían determinados por los niveles intracelulares de (p)ppGpp producidos por RelA y por SpoT que aumentan cuando las bacterias se enfrentan a un estrés nutricional o a otro tipo de estrés ambiental. En E. coli y en Salmonella el (p)ppGpp ejerce un efecto positivo sobre la acumulación de glucógeno debido a que (a) transcripcionalmente regula positivamente la expresión del operón glgBXCAP y de csrC (un pequeño RNA no codificante), el cual a su vez inactiva al represor post-transcripcional de la biosíntesis de glucógeno CsrA, y (b) inhibe fuertemente a PurA, el cual cataliza el primer paso comprometido de la biosíntesis de novo del inhibidor principal de GlgC, el AMP. Por el contrario, (p)ppGpp ejerce un efecto negativo sobre la síntesis de flagelos y EPSs ya que reprime la expresión de los genes flagelares y de los genes de la síntesis de novo de UMP (carAB, pyrBI, pyrC, pyrD and pyrF) que actúan como determinantes de la producción de EPSs. Según este modelo, cuando existe un exceso de nutrientes (fase exponencial del crecimiento), la expresión glgBXCAP y scoR será baja como consecuencia de los bajos niveles de (p)ppGpp y RpoS, y de los altos niveles de CsrA activa, una situación que (a) no favorecerá la acumulación de glucógeno, y (b) permitirá la expresión de los operones negativamente regulados por ScoR tales como los implicados en la producción de fimbrias de tipo I y flagelos, y de los operones involucrados en la biosíntesis de EPSs. Por el contrario, en condiciones estrictas debidas a la ausencia de algún nutriente (estado estacionario) el aumento de los niveles de (p)ppGpp y de RpoS así como la inactivación de CsrA por csrC incrementarán la expresión de glgBXCAP (lo cual acarreará un incremento del contenido de glucógeno) y de scoR (lo cual conllevará a una reducción de la expresión de los operones implicados en la producción de flagelos y en la síntesis de UTP necesario para la síntesis de EPS). Según este modelo, la falta de ScoR promoverá la producción constitutiva de flagelos y EPSs que competirán con GlgC por el mismo pool de ATP y de G1 P, respectivamente, dando lugar a bacterias con bajo contenido de glucógeno y con alta motilidad. Por el contrario, un incremento de la expresión de GIgS supondrá una inhibición de la producción de flagelos y una reducción de la utilización de ATP para la motilidad flagelar. El ATP "excedente" o "sobrante" será utilizado por GIgC para la producción de glucógeno a partir de G1 P, que será utilizado en menor medida para la producción de EPS. Según este modelo, un incremento de la actividad GIgC supondrá un mayor consumo de ATP y G1 P, impidiendo la motilidad flagelar dependiente de ATP y la producción de EPSs dependiente de G1 P.
Figura 14: Efecto del ión Mg2+ sobre el contenido de biofilm y la motilidad tipo "swarming" en células silvestres (WT) de E. coli W. (A) Contenido de biofilm en el control, en medio de cultivo preparado con agua corriente y en medio de cultivo suplementado con concentraciones crecientes (5-100 mM) de MgCI2 (barras grises) o MgS04 (barras rayadas). Los resultados son la media ± ES de 5 experimentos independientes. (B) Motilidad tipo "swarming" en condiciones control y en medio de cultivo suplementado con 20 mM de MgCI2 o 20 mM de MgS04. El frente de crecimiento del cultivo en cada condición está señalada con puntos discontinuos. El control se refiere a un medio de cultivo sin suplementar.
Figura 15: Efecto del EDTA, PLP, DTT y DTE sobre el crecimiento, contenido de biofilm y la motilidad tipo "swarming" en células silvestres (WT) de E. coli W. Crecimiento (A), contenido de biofilm (B) y motilidad tipo "swarming" (C, D y E) en el control y en medio de cultivo suplementado con 10 mM EDTA, 10 mM PLP, 10 mM DTT o 1 mM DTE. En (A) y (B) los resultados son la media ± ES de 5 experimentos independientes.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1.- Reducción de la producción de flagelos, fimbrias y biofilm mediante el estímulo de la actividad de GlgS y GIgC.
1.1. -Perfil transcriptómico de las células AglgS
Para investigar los mecanismos celulares relacionados con la reducción del contenido de glucógeno en células AglgS se examinaron los perfiles de expresión de células silvestres (WT) de E. coli BW251 13 y AglgS entrando en la fase estacionaria, utilizando "microarrays" (microarreglos) del genoma de E. coli Los genes con expresión diferencial se clasificaron de acuerdo a los sitios web Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (http://www.genome.jp/kegg) y RegulonDB
(http://regulondb.ccg.unam.mx). Brevemente, el análisis transcriptómico reveló que 122 genes mostraban cambios estadísticamente significativos en los niveles de transcrito en células AglgS respecto a células WT. Entre esta población 87 genes tenían mayores niveles de expresión en AglgS que en WT (Tabla 1) y 35 genes tenían menores niveles de expresión en AglgS que en WT (Tabla 2).
Tabla 1 : Genes cuya expresión es más elevada en células AglgS que en WT. Las variaciones en los niveles de expresión se presentan en escala log 2 (AglgS vs WT).
r r . . Función en E. coli (http://www.genome.jp/) [KEGG entry]
OPERONES
POLYCISTRONICOS
o pe ron carAB
carA 1.63 Carbamoyl-phosphate synthetase, glutamine [b0032] carB 1.77 Carbamoyl-phosphate synthase large subunit [b0033] o pe ron codBA
codB 1.54 Cytosine permease/transport [b0336]
codA 2.14 Cytosine deaminase [b0337]
operon cusCFBA
Probable outer membrane lipoprotein cusC precursor cusC 33.35
[c_0658]
cusF 22.12 Orf, hypothetical protein [b0573]
cusB 42.06 Putative resistance protein [b0574]
cusA 10.46 Putative catión efflux system protein cusA [c_0661] operon cusRS
cusR 6.64 Putative 2-component transcriptional regulator [b0571] cusS 5.18 Putative 2-component sensor protein [b0570]
operon cvpA-purF
Membrane protein required for colicin V production cvpA 1.59
[b2313]
Amidophosphoribosyltransferase, purine synthesis purF 1.55
[b2312]
operon fimAICDFGH
fimA 2.83 Major type 1 subunit fimbrin [b4314]
fiml 1.96 Fimbrial protein [b4315]
Periplasmic chaperone, required for type 1 fimbriae fimC 3.13
[b4316]
Outer membrane protein; export and assembly of type fimD 2.05
1 fimbriae [b4317]
fimF 2.05 Fimbrial morphology [b4318]
fimG 2.60 Fimbrial morphology [b4319]
Minor fimbrial subunit, D-mannose specific adhesin fimH 1.61
[b4320]
operon flgAMN
Flagellar biosynthesis; assembly of basal-body figA 3.76
periplasmic P ring [b1072]
flgM 2.62 Anti-FliA [b1071]
figN 2.03 Protein of flagellar biosynthesis [b1070]
operon
flgBCDEFGHIJ
figB 10.83 Flagellar biosynthesis, cell-proximal portion of basal- body rod [b1073]
Flagellar biosynthesis, cell-proximal portion of basal- fígC 10.91
body rod [b1074]
Flagellar biosynthesis, initiation of hook assembly figD 8.92
[b1075]
figE 8.67 Flagellar biosynthesis, hook protein [b1076]
Flagellar biosynthesis, cell-proximal portion of basal- figF 8.42
body rod [b1077]
Flagellar biosynthesis, cell-distal portion of basal-body figG 3.79
rod [b1078]
Flagellar biosynthesis, basal-body outer-membrane L figH 2.37
[b1079]
Homolog of Salmonella P-ring of flagella basal body figi 2.55
[b1080]
figJ 2.56 Flagellar biosynthesis [b1081]
operon flgKL
Flagellar biosynthesis, hook-filament junction protein 1 figK 3.07
[b1082]
Flagellar biosynthesis; hook-filament junction protein figL 2.29
[b1083]
operon flhBAE
Putative part of export apparatus for flagellar proteins flhB 1.77
[b1880]
flhA 1.51 Flagellar export pore protein [b1879]
flhE 1.68 Flagellar protein [b1878]
operon flhDC
Regulator of flagellar biosynthesis; transcriptional flhD 1.64
initiation factor [b1892]
Regulator of flagellar biosynthesis; transcription flhC 1.68
initiation factor [b1891]
operon fliAZY
Flagellar biosynthesis; alternative sigma factor 28 fliA 6.07
[b1922]
fliZ 2.67 Orf, hypothetical protein [b1921]
operon fliDST
Flagellar biosynthesis; filament capping protein; fliD 3.73
enables filament assembly [b1924]
fliS 1.95 Flagellar protein fliS [c_2340]
fliT 1.50 Flagellar synthesis, predicted chaperone [b1926] operon fliFGHIJK
fliF 3.23 Flagellar biosynthesis; basal-body MS [b1938]
Flagellar biosynthesis, component of motor switching fliG 3.46
and energizing [b1939]
Flagellar biosynthesis; export of flagellar proteins? fliH 3.07
[b1940]
fliJ 3.12 Flagellar fliJ protein [b1942]
fliK 1.91 Flagellar hook-length control protein [b1943]
operon fliLMNOPQR
fliL 7.95 Flagellar biosynthesis [b1944]
Flagellar biosynthesis, component of motor switch and fliM 7.35
energizing [b1945]
fliN 4.59 Flagellar biosynthesis, component of motor switch and energizing [b1946]
fliO 2.38 Flagellar biosynthesis [b1947]
fliP 1.90 Flagellar biosynthesis [b1948]
fliQ 2.36 Flagellar biosynthesis [b1949]
Flagellin export apparatus, integral membrane protein fliR 1.50
[b1950]
insJK
insJ 4.29 IS150 hypothetical protein [b3557]
insK 2.30 IS150 putative transposase [b3558]
operon motAB-cheAW
Protón conductor component of motor; no effect on motA 1.67
switching [b1890]
Enables flagellar motor rotation, linking torque motB 2.40
machinery to cell wall [b1889]
Sensory transducer kinase between chemo- signal cheA 2.76
receptors and CheB and CheY [b1888]
cheW 2.94 Positive regulator of CheA protein activity [b1887] operon tar-tap- cheRBYZ
Methyl-accepting chemotaxis protein II, aspartate tar 4.21
sensor receptor [b1886]
Methyl-accepting chemotaxis protein IV, peptide tap 2.01
sensor receptor [b1885]
Chemotaxis regulator transmits chemoreceptor signáis cheY 2.52
to flagelllar motor components [b1882]
Chemotactic response CheY protein phophatase; cheZ 2.01
antagonist of [Z2935]
operon purHD
Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide
purH 1.55
formyltransferase; purine synthesis [b4006]
Phosphoribosylamine-glycine ligase, purine synthesis purD 1.50
[b4005]
operon purMN
Phosphoribosyl-aminoimidazole (AIR) synthase purM 1.56
[b2499]
Glycinamide ribonucleotide transformylase (GART) 1 , purN 1.55
purine synthesis [b2500]
operon pyrLBI
Aspartate carbamoyltransferase, catalytic subunit pyrB 2.30
[b4245]
Aspartate carbamoyltransferase, regulatory subunit pyrl 1.86
[b4244]
PyrF-yciH
Orotidine-5'-phosphate decarboxylase; OMP pyr F 1.52
decarboxylase [b1281]
yciH 1.51 Orf, hypothetical protein [b1282]
YjdA-yjcZ
yjdA 2.49 Putative vimentin [b4109]
yjcZ 1.51 Orf, hypothetical protein [b4110]
OPERONES MONOCISTRONICOS atoE 1.76 Hypothetical protein [c_2368]
betl 1.51 Probably transcriptional repressor of bet genes [b0313] cusX 10.49 Hypothetical protein cusX precursor [c_0659]
Flagellar biosynthesis; flagellin, filament structural fliC 3.20
protein [b1923]
Outer membrane fluffing protein, similar to adhesin flu 1.62
[b2000]
flxA 1.92 Orf, hypothetical protein [b1566]
guaB 1.76 IMP dehydrogenase [ECs3370]
insJ 4.29 IS150 hypothetical protein [b3557]
insK 2.30 IS150 putative transposase [b3558]
Pleiotrophic regulation of anaerobio respiration: narL 1.66
response regulator [Z1996]
ompT 1.88 Outer membrane protein 3b [b0565]
pheT 1.69 Phenylalanine specific transport system
Dihydroorotase, the third step in pyrimidine pyrC 1.53
biosynthesis [b1062]
pyrD 2.02 Dihydro-orotate dehydrogenase [b0945]
Orotidine-5'-phosphate decarboxylase; OMP pyr F 1.52
decarboxylase [b1281]
ridA 1.73 Protein YjgF [c_5342]
Methyl-accepting chemotaxis protein I, serine sensor tsr 1.85
receptor [b4355]
upp 1.58 Uracil phosphoribosyltransferase [b2498]
ycgR 4.29 Orf, hypothetical protein [b1194]
yciH 1.51 Orf, hypothetical protein [b1282]
yecR 1.66 Orf, hypothetical protein [b1904]
yedW 1.62 Putative 2-component transcriptional regulator [b1969] yhjH 1.72 Orf, hypothetical protein [b3525]
yjcZ 1.51 Orf, hypothetical protein [b4110]
yjdA 2.49 Putative vimentin [b4109]
yjgF 1.73 Protein YjgF [c_5342]
ylcB 4.56 Putative resistance protein [Z071 1]
Tabla 2: Genes cuya expresión es inferior en células AglgS que en WT. Las variaciones en los niveles de expresión se presentan en escala log 2 (AglgS vs WT).
Cambio Funcion en E- coli (http://www.genome.jp/) [KEGG iüiiii
entry]
OPERONES POLICISTRONICOS
operon cysPUWAA
cysP -1.55 Thiosulfate-binding protein precursor [c_2959]
Sulfate transport system permease W protein cysW -1.59
[b2423]
operon trpLEDCBA
trpA -7.69 Tryptophan synthase, alpha protein [b1260] trpB -10.78 Tryptophan synthase, beta protein [b1261]
Fused indole-3-glycerolphosphate synthetase/N- trpC -7.18
anthranilate isomerase [b1262]
trpD -4.57 Anthranilate synthase component II [b1263] trpE Anthranilate synthase component I [b1264] rpoE-rseABC
^ ^2 RNA polymerase, sigma-E factor; heat shock and rpoE
oxidative stress [b2573]
rseA 1.51 sigma-E factor, negative regulatory protein [b2572] rseB 1.51 regulates activity of sigma-E factor [b2571] yqjCDEK
yqjD 1.67 Orf, hypothetical protein [b3099]
yqjE 1.61 Orf, hypothetical protein [b3099]
yqjK 1.51 Orf, hypothetical protein [b3100]
OPERONES MONOCISTRONICOS
b1005 1.53 Orf, hypothetical protein [b1005]
Bacteriophage lambda Bor protein homolog borD 2.05
[b0557]
cysK 2.18 Cysteine synthase A [c_2948]
dicC 1.51 Protein ydhR precursor [c_2059]
katG 1.58 Catalase; hydroperoxidase HPI [b3942]
Ipp 1.91 Murein lipoprotein [b1677]
. NADH dehydrogenase transcriptional regulator,
IrhA
LysR family [b2289]
. fifi Lysine tRNA synthetase, inducible; heat shock lysU
protein [b4129]
mokB 1.68 Orf, hypothetical protein [b1420]
osmE 1.69 Activator of ntrL gene [b1739]
Hyperosmotically inducible periplasmic protein osmY
[b4376]
D-ribose high-affinity transport system; membrane- rbsD 1.82
associated protein [b3748]
rmf 1.80 Ribosome modulation factor [b0953]
RNA polymerase, sigma-E factor; heat shock and rpoE 1.53
oxidative stress [b2573]
sodB 1.58 Superoxide dismutase [c_2050]
uspB 1.52 Orf, hypothetical protein [b3494]
^ Trp repressor binding protein; affects association wrbA
of trp repressor and operator [b1004]
ybaY 1.55 Glycoprotein/polysaccharide metabolism [b0453] ydhR 1.55 Orf, hypothetical protein [b1667]
yebV 1.54 Orf, hypothetical protein [b1836]
ygaM 1.65 Orf, hypothetical protein [b2672]
ygdl 1.58 Orf, hypothetical protein [b2809]
yiaG 1.60 Orf, hypothetical protein [b3555]
yjbJ 1.67 Orf, hypothetical protein [b4045]
yjiY 2.14 Putative carbón starvation protein [b4354] yqjE 1.61 Orf, hypothetical protein [b3099]
yqjK 1.51 Orf, hypothetical protein [b3100]
Z2547 3.84 Anthranilate synthase component I [Z2547] Para examinar más a fondo la distribución de los genes en base a su función, los genes con niveles de transcrito alterados fueron clasificados en racimos de grupos ortólogos [Keseler, I.M., Collado-Vides, J., Gama-Castro, S., Ingraham, J., Paley, S., Paulsen, I ., Peralta-Gil, M., Karp, P.D. (2005) EcoCyc: a comprehensive datábase resourve for Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 33 (Datábase issue), D334-D337, doi: 10.1093/nar/gk¡108] (Figura 1). Hay que destacar que el operón de las fimbrias tipo I fimAICDFGH mostraba mayores niveles de expresión en células AglgS que en células WT (Tabla 1). Además, flhDC (el operón master Tipo I), los operones de Tipo II controlados por FlhD4C2 necesarios para el ensamblaje estructural tanto del anclaje como del cuerpo basal del flagelo (flgAMN, flgBCDEFGHIJ, fliAZY, fliFGHIJK, fliLMNOPQR), y los operones de Tipo III controlados por FliA necesarios para la motilidad flagelar y quemotaxis (flgKL, fliC, fliDST, tar-tap-cheRBYZ y motAB-cheAW) y los genes yhjH e ycgR controladores de FlhD4C2 mostraban mayores niveles de expresión en células AglgS que en células WT (Tabla 1). En conjunto estos genes suponen casi el 60% de los genes cuya expresión es superior en células AglgS que en células WT. Análisis de la expresión de fusiones transcripcionales cromosomicas lacZY en células WT y AglgS de algunos de los genes identificados en el análisis transcriptómico corroboraron los resultados obtenidos en el citado análisis (Figura 2). Los resultados del análisis transcriptómico también revelaron que los niveles de expresión de glgBXCAP en células AglgS eran normales con respecto a las células WT, como posteriormente se confirmó por análisis de la expresión de fusiones transcripcionales cromosomicas glgB .lacZY tanto en células WT como en células AglgS (Figura 2), lo cual indica que el efecto positivo de GlgS sobre la acumulación de glucógeno no se debe a cambios en los niveles de expresión de glgBXCAP en E. coli 1.2.- GlgS ejerce un efecto negativo sobre la fimbriación de tipo I y sobre la síntesis de flagelos en E. coli.
El análisis del perfil de RNA descrito anteriormente indicó que la proteína GlgS ejerce un efecto negativo sobre procesos implicados en la producción de flagelos y fimbrias de tipo 1 determinantes de la colonización de huéspedes, virulencia y patogenicidad bacteriana y adhesión a superficies. [Langermann, S., Palaszynski, S., Barnhart, M., Auguste, G., Pinkner, J.S., Burlein, J., Barren, P., Koenig, S., Leath, S., Jones, C.H., Hultgren, S.J. (1997) Prevention of mucosal Escherichia coli infection by FimH-adhesin- based systemic vaccination. Science 276, 607-611 ; Prigent-Combaret, C, Prensier, G., Le Thi, T.T., Vidal, O., Lejeune, P., Dorel, C. (2000) Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464; Turnbull, G.A., Morgan, J.A.W., Whipps, J.M. Saunders, J.R. (2001) The role of motility in the in vitro attachment of Pseudomonas putida PaW8 to wheat roots. FEMS Microbiol. Ecol. 35, 57-65; Bahranin-Mougeot, F.K., Buckles, E.L., Lockatell, C.V., Hebel, J.R., Johnson, D.E., Tang, C.M., Donnenberg, M.S. (2002) Type 1 fimbriae and extracellular polysaccharides are pre-eminent uropathogenic Escherichia coli virulence determinants in the murine urinary tract. Mol. Microbiol. 45, 1079-1093; Albareda, M., Dardanelli, M.S., Sousa, C, Megías, M., Temprano, F, Rodríguez-Navarro, D.N. (2006) Factors affecting the attachment of rhizospheric bacteria to bean and soybean roots. FEMS Microbiol. Lett. 259, 67-73; Domka, J., Lee, J., Bansal, T., Wood, T.K. (2007) Temporal gene-expression in Escherichia coli K-12 biofilms. Environm. Microbiol. 9, 332-346; Wright, K.J., Seed, P.C., Hultgren, S.J. (2007) Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9, 2230-2241]. Para explorar el posible efecto negativo de GlgS sobre la formación de flagelos y fimbrias de tipo 1 se analizaron por microscopía electrónico células de E. coli BW25113 y AglgS entrando en la fase estacionaria. Como se muestra en la Figura 3, estos análisis revelaron que las células AglgS eran hiperflageladas e hiperfimbriadas con respecto a células WT. Por lo tanto, todos los datos confirman que la proteína GlgS ejerce un efecto negativo sobre la producción de fimbrias de tipo I y de flagelos. 1.3.- GlgS ejerce un efecto negativo sobre la motilidad tipo "swarming" y la quimiotaxis en E. coli.
El "swarming" es un tipo de motilidad bacteriana dependiente del flagelo que facilita la migración de las bacterias en sustratos viscosos, como por ejemplo, superficies de agar semisólidas. Para que tenga lugar la motilidad tipo "swarming", primero las células han de diferenciarse en un tipo especializado de célula llamada "swarmer" que se caracteriza por un incremento en el número de flagelos y por la elongación de las células [Harshey, R.M., Matsuyama, T. (1994) Dimorphic transition in Escherichia coli and Salmonella
Figure imgf000026_0001
differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 , 8631-8635; Fraser, G.M., Hughes, C. (1999) Swarming motility. Curr. Opin. Microbiol. 2, 630-635]. La síntesis del flagelo y de componentes relacionados con el flagelo está controlada por 14 operones y más de 50 genes (la mayoría inluidos en la Tabla 1) cuya expresión está bajo un sistema de control jerárquico donde flhDC actúa como operón maestro [Kalir, S., McCIure, J., Pabbaraju, K., Southward, C, Ronern, M., Leibler, S., Surette, M.G., Alón, U. (2001) Ordering genes in a flagella pathway by analysis of expression kinetics from living bacteria. Science 292, 2080-2083]. Recientemente, Inoue et al. (2007) [Inoue, T., Shingaki, R., Hirose, S., Waki, K., Morí, H., Fukui, K. (2007) Genome- wide screening of genes required for swarming motility in Escherichica coli K-12. J. Bacteriol. 189, 950-957] han mostrado evidencias de que la expresión de los genes de las fimbrias tipo I también es necesaria para la motilidad tipo "swarming" en E. coli.
Los análisis transcriptómicos (Tabla 1) y de microscopía electrónica (Figura 3) indican que la proteína GIgS ejerce un efecto negativo sobre la motilidad tipo "swarming" en enterobacterias. Para confirmar este extremo, se cultivaron células WT (BW25113) y AglgS en placas de agar blando suplementado con Tween y se analizó su motilidad tipo "swarming". También se analizó la motilidad tipo swarming de células AglgSAflhC y AgIgSAfliA que tienen impedida la formación de flagelos debido a la ausencia de las funciones FlhC y FUA. Como se muestra en la Figura 4A, las células WT apenas mostraron motilidad tipo "swarming", lo cual es consistente con el fenotipo "low-swarming motility" previamente descrito de las células BW25113 [Wood, T.K., González Barrios, A.F., Herzberg, M., Lee, J. (2006) Motility influences biofilm architecture in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 72: 361-367]. Hay que destacar que las células AglgS mostraron un fenotipo de alta motilidad tipo swarming que se revertía con la expresión ectópica de glgS (Figura 4A). Además, las células AglgSAflhC y AgIgSAfliA no mostraron motilidad tipo "swarming". Por lo tanto, todos los datos obtenidos aportaban evidencias concluyentes de que GIgS ejerce un efecto negativo sobre la motilidad tipo "swarming". El efecto negativo de GIgS sobre la motilidad tipo "swarming" en enterobacterias se confirmó aún más analizando el efecto de la sobreexpresión de glgS en la motilidad de células con fenotipo de elevada motilidad tipo swarming tales como las E. coli W [Wood, T.K., González Barrios, A.F., Herzberg, M., Lee, J. (2006) Motility influences biofilm architecture in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 72: 361-367], diferentes cepas virulentas de Salmonella enteritidis tales como las 3934 y 1344 [Solano, C, Sesma, B, Alvarez, M., Humphrey, T.J., Thorns, C.J, Gamazo, C. (1998) Discrimination of strains of Salmonella enteritidis with differing levéis of virulence by an in vitro glass adherence test. J. Clinical Microbiol. 36, 674- 678] y las cepas LT2 y 14028 de S. entérica serovar Typhimurium [Morán-Zorzano, M.T., Alonso-Casajús, N., Muñoz, F.J., Víale, A.M., Baroja-Fernández, E., Eydallin, G., Pozueta- Romero, J. (2007) Occurrence of more than one important source of ADPglucose linked to glycogen biosynthesis in Escherichica coli and Salmonella entérica. FEBS Lett. 581 , 4423- 4429; Baugh, S, Ekanayaka, A.S., Piddock, L.J.V., Webber, M.A. (2012) Loss of or inhibition of all multidrug resistance efflux pumps of Salmonella entérica serovar Typhimurium results in impaired ability to form a biofilm. J. Antimicrob Chemother 67, 2409- 2417; Patterson, S.K., Borewicz, K., Johnson, T., Xu, W, Isaacson, R.E. (2012) Characterization and differential gene expression between two phenotypic phase variants in Salmonella entérica serovar Typhimurium. PLOS ONE 7, e43592] ya que, tal y como se muestra en las Figuras 4B-D, estos análisis revelaron que la la sobreexpresion de glgS ejercía un efecto negativo sobre la motilidad tipo "swarming" en las células.
La quimiotaxis es un proceso por el cual las células se mueven hacia altas concentraciones de un atractante o se separan de altas concentraciones de un repelente. El presente análisis transcriptomico indicó que los niveles de expresión de los operones de quimiotaxis tar-tap-cheRBYZ y motAB-cheAW eran superiores en células AglgS que en células WT (Tabla 1), lo cual sugería que la proteína GlgS ejerce un efecto negativo sobre la quimiotaxis. Confirmando esta suposición, análisis de la quimiotaxis utilizando placas de quimiotaxis con aspartato revelaron un fenotipo de alta motilidad de células W, que era anulado con la expresión ectópica de glgS (Figura 4E).
1.4.- GlgS ejerce un efecto negativo sobre la formación de biofilm en E. coli.
Los biofilmes son comunidades microbianas adheridas a una superficie que se encuentran embebidas en una matriz de EPS producido por la misma comunidad. Tales comunidades poseen propiedades fenotípicas y bioquímicas distintas a las de células que viven en estado planctónico. En E. coli, los flagelos y las fimbrias tipo I están implicados en la formación y diferenciación estructural del biofilm [Prigent-Combaret, C, Prensier, G., Le Thi, T.T., Vidal, O., Lejeune, P., Dorel, C. (2000) Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464; Van Houdt, R., Michiels, C.W. (2002) Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation. Res. Microbiol. 156: 626-633; Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D.G., Costerton, J.W. (2002) Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56: 187-209; Schembri, M.A., Kjaergaard, K., Klemm, P. (2003) Global gene expression in Escherichia coli biofilms. Mol. Microbiol. 48, 253-267; Fujishige, N , Kapadia, N.N., de Hoff, P.L, Hirsch, A.M. (2006) Investigations of Rhizobium biofilm formation. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 195-206; Niba, E.T.E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitagawa, M. (2007) A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Res. 14, 237-246]. Teniendo en cuenta que las células AglgS poseen muchos flagelos y muchas fimbrias, se razonó que este tipo de células tendrían una mayor capacidad para formar biofilm que células WT. Para explorar esta hipótesis se comparó la producción de biofilm en células WT (BW251 13) y en células AglgS. También se midió la formación de biofilm en células AglgSAflhC, AglgSAfimA y AglgSAwzc impedidas en la síntesis de flagelos, fimbrias de tipo I, y de ácido colánico del EPS, respectivamente. Como se muestra en la Figura 5A, las células AglgS acumularon mucho biofilm en comparación con células WT. Este fenotipo se revertía en gran medida con la expresión ectópica de glgS. Además, las células AgIgSAflhC, AgIgSAfimA y AgIgSAwzc acumularon poco biofilm en comparación con células AglgS. Por lo tanto, todos los datos indicaban que GlgS ejerce un efecto negativo sobre la formación de biofilm. Tal efecto tiene lugar no solamente en E. coli ya que, tal y como se muestra en la Figura 5B, el incremento de la expresión de glgS conlleva a una reducción de los niveles de biofilm en diferentes cepas de Salmonella tales como la LT2, 1334, 3934 y la 14028.
1.5.- La biosíntesis de glucógeno y la motilidad tipo "swarming" compiten por el mismo pool de ATP en mutantes AglgS.
Los estudios genéticos a gran escala generan el conocimiento necesario para definir las funciones génicas y la arquitectura de las rutas metabólicas. En esta invención se investigó cómo GlgS afecta a la acumulación de glucógeno llevando a cabo estudios genéticos a gran escala de interacción basados en la conjugación mediada por plásmido F. Para ello se cruzaron células de E. coli AglgS con todos los mutantes de genes no- esenciales de la colección Keio; los dobles mutantes así obtenidos fueron objeto de un screening para determinar su contenido en glucógeno. El análisis de nuestra colección de mutantes mostró 32 dobles mutantes con fenotipo "alto-glucógeno" comparado con el fenotipo de las células AglgS (Tabla 3), mientras que 36 dobles mutantes mostraron un fenotipo "bajo/sin glucógeno" comparados con las células AglgS (Tabla 4).
Tabla 3: Genes cuya delección incrementa el contenido de glucógeno en células AglgS Gen Función en E. coli (http://www.genome.jp)
clpX ATPase subunit of the two-component CIpXP protease
cpxA CpxA periplasmic stress sensor histidine kinase
fliA Transcription factor sigma 28 for class III flagellar operons
flhC Transcriptional activator of flagellar class II operons; forms heterotetramer with FlhD
flhD Transcriptional activator of flagellar class II operons; forms heterotetramer with FlhC
fruR Catabolite repressor-activator Cra
gcvR Required for repression of gcv operon by GcvA
glgP Glycogen phosphorylase
glgX Glycogen phosphorylase-limit dextrin a-1 ,6-glucohydrolase
lysS Lysyl-tRNA synthetase, constitutive metL Aspartate kinase / homoserine dehydrogenase
pdxH Pyridoxine 5'-phosphate oxidase / pyridoxamine 5'-phosphate oxidase purA Adenylosuccinate synthetase
purC Phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase
purD phosphoribosylamine-glycine ligase
purE N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide mutase
purF amidophosphoribosyl transferase
purH AICAR transformylase / IMP cyclohydrolase
purK N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase
purl Phosphoribosylformylglycinamide synthetase
purM Phosphoribosylformylglycinamide cyclo-ligase
serA α-ketoglutarate reducíase / D-3-phosphoglycerate dehydrogenase serB Phosphoserine phosphatase
serC Phosphohydroxythreonine aminotransferase / 3-phosphoserine aminotransferase
wzxE O-antigen translocase; involved in the cross-membrane translocation of the UDP-linked ECA trisaccharide repeat unit of cyclic enterobacterial common antigen ECA(CYC)
ycfR Protein involved in stress resistance and biofilm formation
ydaF Rae prophage; predicted protein
yehQ Predicted protein
yfdG Bactoprenol-linked glucose translocase
ynfB Predicted protein
yqiJ Inner membrane protein, function unknown
yqiK PHB family inner membrane protein, function unknown
Tabla 4: Genes cuya delección conlleva a una reducción de los niveles de glucógeno en células AglgS
Gene Function in E. coli (http://www.genome.jp)
aspC Aspartate aminotransferase
Dam DNA adenine methyltransferase
ddlB D-alanine:D-alanine ligase
dksA RNA-polymerase-binding protein modulating ppGpp and iNTP regulation dsrA Sulfite reducíase, dissimilatory-fype alpha subunit
essQ Qin prophage; predicted S lysis protein
fis Transcriptional activator for rRNA operons
gcvA Transcriptional repressor for the gcv operon
gidA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme
glgA Glycogen synthase
glgB 1 ,4-alpha-glucan branching enzyme gigc Glucose-1-phosphate adenylyltransferase
glnP Glutamine transport system permease
gnd 6-phosphogluconate dehydrogenase
had Regulator of DnaA that prevenís premature reinitiation of DNA replication hdhA 7-a-hydroxysteroid dehydrogenase
hfq Host factor-l protein
mhpT 3-hydroxyphenylpropionic acid transporter
miaA tRNA dimethylallyltransferase
minC Inhibition of FtsZ ring polymerization
moaE Molybdopterin synthase catalytic subunit
pgm Phosphoglucomutase
prfC Peptide chain reléase factor RF-3
prmB Putative adenine-specific DNA-methyltransferase
puuP Putrescine importer
relA (p)ppGpp synthase
rpoS General stress response sigma factor
sufC Fe-S cluster assembly ATP-binding protein
trmE tRNA modification GTPase
trmU tRNA-specific 2-thiouridylase
ydaT Required for swarming phenotype, function unknown
ydcQ Mutational suppressor of nuil rpoE lethality
yeaD Glucose-6-phosphate 1-epimerase
ymfT Cro-like repressor
ymgA Connector protein for RcsB regulation of biofilm formation
ynjA Function unknown
Consistente con estudios previos de identificación de genes que afectan a la acumulación del glucógeno [Eydallin, G., Víale, A. M., Moran-Zorzano, M. T., Muñoz, F. J., Montero, M., Baroja-Fernandez, E., Pozueta-Romero, J. (2007) Genome-wide screening of genes affecting glycogen metabolism in Escherichia coli K-12. FEBS Lett. 581 , 2947-2953; Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141] la pérdida de las funciones codificadas por pgm, glgA, glgC, glgB, gcvA, hfq, rpoS, prfC, relA, dksA, fis, trmE, trmU o ydcQ remarcó aún más el fenotipo "bajo glucógeno" de las células AglgS (Tabla 4). Además, la eliminación de genes involucrados en la degradación del glucógeno, tales como glgX y glgP, o en la síntesis de aminoácidos tales como serA, serB y serC, o la eliminación de genes cuya delección provoca una fuerte represión de la motilidad tipo swarming tales como cpxA, metL, flhC, flhD, fliA and wzxE [Inoue, T., Shingaki, R., Hirose, S., Waki, K., Mori, H., Fukui, K. (2007) Genome-wide screening of genes required for swarming motility in Escherichica coli K-12. J. Bacteriol. 189, 950-957] revirtieron el fenotipo "bajo glucógeno" de las células AglgS (Tabla 3). Hay que destacar que nueve de los dobles mutantes "alto glucógeno" presentaban delecciones en genes que codifican para enzimas implicados en la síntesis de novo de purinas tales como purL, purH, purA, purM, purD, purF, purK, purE y purC (Figura 6) (Tabla 3) (Figura 7A).
Las delecciones de los genes pur no solo dieron lugar a un incremento de los niveles de glucógeno en las células AglgS, sino que además revirtieron el fenotipo de hipermotilidad tipo "swarming" de las células AglgS (Figura 7B). Debido a que la motilidad tipo "swarming" y la producción de purinas son procesos que consumen elevadas cantidades de ATP [Macnab, R.M. (1996) Flagella and motility. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, Vol. 1 , 2nd edn. Neidhardt, F.C., Curtiss, R., III, Ingraham, J.L., Lin, E.C.C., Low, K.L., Magasanik, B., et al. (eds). Washington, DC: American Society for Microbiology Press, pp. 123-145.; ΡΓϋβ, B.M. (2000) FlhD, a transcriptional regulator in bacteria. Recent Res. Dev. Microbiol. 4, 31-42; Terashima, H., Kojima, S., Homma, M. (2008) Flagellar motility in bacteria structure and function of flagellar motor. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270: 39-85; Cho, B.K., Federowicz, S.A., Embree, M., Park, Y.S., Kim, D. and Palsson. B.0. (201 1) The PurR regulon in Escherichia coli K-12 MG1655. Nucí. Acids Res. 39: 6456-6464], se razonó que la deficiencia de glucógeno en las células hipermótiles AglgS y el contenido elevado de glucógeno en las células de baja movilidad AgIgSApur (Tabla 4, Figura 7A) sugerían la existencia de una fuerte competencia por el mismo pool de ATP entre los mecanismos que definen la motilidad tipo "swarming" y la producción de purinas controlados por GlgS y la ruta de biosíntesis de glucógeno controlada por GIgC. Así, cuando el consumo de ATP para la motilidad flagelar es elevado (algo que ocurre en las células hipermótiles AglgS) la producción de glucógeno se verá reducida como consecuencia de la baja actividad GIgC resultante tanto del acceso restringido al ATP como del incremento del AMP procedente del metabolismo del ATP. Por el contrario, cuando la síntesis de novo de purinas es reducida (algo que ocurre en células AglgSApuή GIgC será muy activa y competirá con los mecanismos de motilidad flagelar por el mismo pool de ATP. Para comprobar esta hipótesis se analizó la motilidad tipo "swarming" de las células AglgC no acumuladoras de glucógeno. También se analizó el efecto de la sobreexpresion de glgC sobre el contenido de glucógeno y sobre la motiliad tipo "swarming" tanto en las células silvestres como en las hipermótiles BW25113 AglgS. Además, se comparó los niveles de glucógeno de las células hipermótiles AglgS con los niveles de las células de baja motilidad AglgSAflhC y AglgSAfliA. Estos análisis revelaron que las células AglgC no acumulan glucógeno, mientras que las células silvestres sobreexpresantes de glgC o las células AglgS sobreexpresantes de glgC mostraron un fenotipo de "alto glucógeno" cuando se las compara con la células silvestres y AglgS respectivamente (Figura 8A). Además, el contenido de glucógeno de las células de baja motilidad AglgSAflhC y AglgSAfliA fue mayor que el presentado por las células hipermótiles AglgS (Figura 8A). Es importante destacar que las células no acumuladoras de glucógeno AglgC presentaron alta motilidad tipo "swarming" y que el fenotipo de alta movilidad tipo "swarming" de las células AglgS fue revertido por la expresión ectópica de glgC (Figura 8B). El incremento de la expresión de glgC no solo ejerce un efecto negativo en la motilidad de E. coli sino también en otras enterobacterias tales como las cepas 3934 y 14028 de Salmonella (Figura 8C y Figura 8D, respectivamente). Por tanto, el conjunto de los resultados indica que los mecanimos implicados en la biosíntesis del glucógeno y en la motilidad tipo "swarming" compiten por el mismo pool de ATP en las células AglgS, pudiendo achacar (al menos en parte) el bajo contenido en glucógeno de estas células hipermótiles a (a) bajos niveles de actividad GlgC, consumidora de ATP, como consecuencia del elevado contenido intracelular de AMP, y (b) elevado consumo de ATP asociado a la síntesis de flagelos, la propulsión celular y la síntesis de purinas. Alternativamente, sería possible que los niveles bajos de glucógeno pudiesen provocar de forma indirecta el fenotipo hipermótil de las células AglgS y AglgC. Para investigar esta hipótesis se analizó la motilidad de las células AglgA. Estas células no acumulan glucógeno debido a la ausencia total de glucógeno sintasa [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141] (Figura 8A), pero todavía poseen GlgC, que consume ATP. Como se muestra en la Figura 8B las células AglgA mostraron un fenotipo de motilidad tipo "swaming" muy similar al de las células silvestres, descartando la posibilidad de que la alta motilidad tipo "swarming" presentada por células AglgC y AglgS sea debido a sus bajos niveles de glucógeno.
1.6.- La biosíntesis de glucógeno y la biosíntesis de EPSs de biofilmes compiten por el mismo pool de G1 P en mutantes AglgS. Los EPSs son componentes fundamentales de la mayoría de las matrices de biofilms cuya síntesis depende de la conversión de la G1 P y el UTP en UDPglucosa (UDPG) por acción del enzima UDPG pirofosforilasa (GalU). La delección de los genes pur no solo revirtió los fenotipos de hipermotilidad y bajo glucógeno de las células AglgS (ver Figura 7), sino que también revirtió el fenotipo de elevada producción de biofilm (Figura 9). Puesto que tanto la síntesis de glucógeno (dependiente de GIgC) como la síntesis de los EPSs del biofilm (dependiente de GalU) necesitan G1 P, se razonó que el bajo contenido de glucógeno de las células AglgS (productoras de gran cantidad de biofilm), y el alto contenido de glucógeno de las células AglgSApur (poco productoras de biofilm) (Figura 7A) apuntaban a la existencia en células AglgS de una fuerte competencia por el mismo pool de G1 P entre los mecanismos "GlgS-dependientes" "GalU-dependientes" implicados en la biosíntesis de los EPSs y los mecanismos "GlgC-dependientes" implicados en la biosínteis de glucógeno. Asi, en condiciones de baja actividad GIgC debidas al elevado contenido de AMP y al elevado consumo de ATP para la motilidad flagelar que ocurren en las células AglgS con elevado contenido de biofilm la producción de glucógeno se verá reducida como consecuencia de la baja actividad GIgC, de modo que la G1 P "sobrante" o "excedente" se usará para la síntesis de los EPSs tales como el ácido colánico. Para comprobar esta hipótesis se comparó el contenido de biofilm de células silvestres (WT) de E. coli BW25113 con el de las células no acumuladoras de glucógeno AglgC. También se analizó el efecto de la sobreexpresión de glgC sobre la producción de biofilm en las células silvestres (WT) de E. coli BW25113, en células AglgS acumuladoras de biofilm y en diferentes cepas de Salmonella. Finalmente, se analizó el contenido de ácido colánico en células silvestres, células Awzc y células AgalU impedidas en la ruta de síntesis de ácido colánico (Figura 10), células AglgS, células AglgC, células AglgS que sobre-expresan glgC, células AglgC que expresan ectópicamente glgC, células AglgSAwzc y células AglgCAwzc. Tal y como se muestra en la Figura 9A las células AglgC y AglgS de E. coli mostraron un fenotipo de alta producción de biofilm que fue revertido mediante la expresión ectópica de glgC y mediante eliminación de la función galU en las células AglgSAgalU y AglgCAgalU (Figura 9A). Finalmente, el incremento de la expresión de glgC conllevó a una reducción del contenido de biofilm en las cepas LT2, 1334, 3934 y 14028 de Salmonella (Figura 9B). Tal y como se muestra en la Figura 1 1 , las células Awzc y AgalU de E. coli acumularon muy poco (o nulo) ácido colánico, mientras que las células AglgS y AglgC mostraron un fenotipo de alto contenido de ácido colánico que fue revertido mediante expresión ectópica de glgC y mediante eliminación de la función galU en las células AglgSAgalU y AglgCAgalU. Además, las células AglgSAwzc y AglgCAwzc acumularon poco ácido colánico. Por tanto, el conjunto de los resultados muestra que los mecanismos implicados en la síntesis de glucógeno y de los EPSs de biofilm compiten por el mismo pool de G1 P en células AglgS. Aparentemente, por tanto, el bajo contenido de glucógeno de las células AglgS es debido a la baja actividad GlgC como consecuencia de los elevados niveles de AMP y/o a la competencia por el ATP con los activos mecanismos de motilidad flagelar y de síntesis de purinas, de modo que el "exceso" de G1 P (no utilizado para la producción de glucógeno) se desvía hacia la producción de EPSs.
Alternativamente, es posible que la deficiencia de glucógeno promueva indirectamente el fenotipo de alto biofilm de las células AglgS y AglgC. Para comprobar esta hipótesis analizamos el contenido de biofilm en células carentes de glucógeno AglgA las cuales conservan la GlgC consumidora de G1 P. Como se muestra en la Figura 9 las células AglgA acumulan casi el mismo biofilm que la cepa silvestre. Este resultado es consistente con los obtenidos por Niba et al. (2007) quienes tampoco observaron una reducción de biofilm en células AglgA y difieren de los resultados obtenidos en un estudio anterior (Jackson et al. 2002) en el cual los autores proponen que el glucógeno sirve como fuente de carbono y energía para la formación de biofilm en Enterobacteriaceae. De acuerdo a Jackson et al. (2002), la biosíntesis de glucógeno y su posterior formación de G1 P GlgP-dependiente, son absolutamente necesarias para la fomación de biofilm dado que (a) células AglgA carentes de glucógeno presentan un fenotipo "bajo biofilm", y (b) células que expresan ectópicamente glgA y glgP presentan un fenotipo "alto biofilm". Sin embargo, como se muestra en la Figura 8, células AglgC carentes de glucógeno muestran un fenotipo "alto biofilm", descartando la posibilidad de que los productos de la degradación de glucógeno (G1 P producida por GlgP) sean necesarios para la formación de biofilm.
Tal y como se muestra en la Tabla 1 , los niveles de expresión de cinco de los seis operones implicados en la síntesis de novo de UMP (carAB, pyrBI, pyrC, pyrD, pyrE and pyrF) (Figura 12), y de los dos operones (codBA y upp) implicados en la ruta de rescate de síntesis de UMP a partir de bases pirimidínicas y nucleósidos, son elevados en células AglgS. El UMP es el precursor para la síntesis de UTP [Turnbough, C.L., Switzer, R.L. (2008) Regulation of pyrimidine biosynthetic gene expression in bacteria: repression without repressors. Microbiol. Mol. Biol. Reviews 72, 266-300], que a su vez es el sustrato para la producción de UDPG, el cual a su vez está implicado en la biosíntesis de EPSs. Hay que destacar que la inactivación de los genes pertenecientes a la ruta de biosíntesis de novo de UMP impide la producción de polisacáridos de biofilm [Garavaglia, M., Rossi, E., Landini, P. (2012) The pyrimidine nucleotide biosynthetic pathway modulates production of biofilm determinants in Escherichia coli. Píos one 7: e31252]. Por lo tanto, los resultados son globalemente consistentes con la visión de que, tal y como se ilustra en el modelo metabólico de la Figura 13, GlgS ejerce un efecto negativo sobre la producción de biofilmes bacterianos ya que reprime la expresión de genes implicados en la producción de flagelos, fimbrias y EPSs. Altos niveles de GlgS (existentes durante el estado estacionario) conllevan a una reducción del consumo de ATP necesario para la motilidad bacteriana y la síntesis de purinas y pirimidinas. En este estado, el ATP y la G1 P excedentes (no utilizados para la propulsión flagelar ni para la producción de EPSs, respectivamente) son utilizados por GlgC para producir ADPG necesario para la biosíntesis de glucógeno. Bajos niveles de GlgS (existentes durante la fase exponencial de crecimiento) conllevan a un elevado consumo de ATP necesario para la motilidad bacteriana y para la síntesis de purinas y pirimidinas, y a un elevado consumo de G1 P necesario para la producción de EPSs. En ese estado, la disponibilidad de ATP y G1 P para la producción de glucógeno es reducida. Hay que destacar que, si bien los resultados muestran que el efecto de GlgS sobre la motilidad y la producción de biofilmes es directo (control transcripcional), su efecto sobre el metabolismo del glucógeno es indirecto. Debido a que GlgS es un determinante principal de la composición de la superficie de E. coli, y que su efecto en el metabolismo del glucógeno parece ser solo indirecto, la proteína ha sido renombrada como Regulador de la Composición de Superficie (ScoR: Surface COmposition Regulator). Los resultados presentados en la presente invención son también consistentes con la idea de que GlgC regula fuertemente la motilidad y la producción de EPSs. Una actividad GlgC elevada conlleva a un elevado consumo de ATP y G1 P para la producción de glucógeno. Esta situación conlleva a su vez una reducción de los niveles de ATP necesarios para la motilidad flagelar y una reducción de G1 P necesarios para la producción de EPSs.
Ejemplo 2.- Reducción de la producción de biofilm y de la motilidad mediante sustancias que incrementan la actividad GlgC
2.1. - lón Mg2+
El Mg2+ es el catión divalente más abundante en las células vivas, siendo un factor estabilizador de membranas, tRNA, ribosomas, etc., que además determina fuertemente el estado metabólico y energético de las células [Smith, R. L. and Maguire, M. E. (1998) Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity. Mol. Microbiol. 28, 217-226]. Además, el Mg2+ ha sido descrito como un importante determinante de la acumulación de glucógeno debido al impacto que éste tiene en los niveles intracelulares de Mg2+ unido a ATP necesario para la actividad GlgC [Montero, M., Eydallin, G., Almagro, G., Muñoz, F. J., Víale, A. M., Rahimpour, M., Sesma, M.T., Baroja-Fernández, E., Pozueta- Romero, J. (2009) Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulatory system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes. Biochem. J. 424, 129-141]. El incremento de la actividad GlgC inducida por Mg2+ conllevaría por tanto a una reducción de G1 P necesaria para la producción de EPSs necesarios para la formación de biofilm y una menor disponibilidad de ATP para la motilidad bacteriana. Para explorar esta hipótesis, se midió la producción de biofilm en células silvestres (£. coli W) suplementando el medio de cultivo con concentraciones crecientes (5-100 mM) de MgCI2. Como se muestra en la Figura 14A, el MgCI2 ejerce un efecto negativo en la producción de biofilm en E. coli, reduciéndose hasta un 80% al suplementar el medio de cultivo con concentraciones de MgCI2 superiores a 25 mM. Además, la adición de MgCI2 al medio de cultivo ejerce un efecto negativo en la motilidad de tipo "swarming" en E. coli (Figura 14B). Para comprobar que el efecto observado era debido al ión Mg2+ y no al ión CI" se midió la producción de biofilm en un medio de cultivo suplementado con concentraciones crecientes (5-100 mM) de MgS04. Además, se analizó la motilidad tipo "swarming" en un medio suplementado con 20 mM de MgS04. También se midió la producción de biofilm en un medio preparado con agua corriente, la cual contiene hiplocloritos y sustancias necesarias para los tratamientos de potabilización, en lugar de agua desionizada, utilizada rutinariamente para la elaboración de los medio de cultivo. Tal y como se muestra en la Figura 14A el MgS04 tiene el mismo efecto tanto en la producción de biofilm como en la motilidad tipo "swarming" que el MgCI2 y los niveles de biofilm en la preparación con agua corriente no varían respecto a los niveles en la preparación con agua desionizada. Por tanto, todos los datos indican que el ión Mg2+ tiene un efecto negativo tanto en la formación de biofilm como en la motilidad bacteriana.
2.2- Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
Durante el hambreado de nutrientes las bacterias desencadenan la denominada respuesta estricta que cambia a las células de un estado de crecimiento a un estado de mantenimiento/superviviencia [Dennis, PP., Ehrenberg, M., Bremer, H. (2004) Control of rRNA synthesis in Escherichia coli: a systems biology approach. Microbiol Mol Biol R. 68, 639-668; Potrykus, K., Cashel, M. (2008) (p)ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol. 62, 35-51]. Esta respuesta fisiológica se caracteriza por un incremento en los niveles intracelulares de la alarmona (p)ppGpp [Potrykus, K. and Cashel, M. (2008) (p)ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol. 62, 35-51]. Diferentes evidencias in vivo e in vitro han demostrado la relación entre la acumulación de ppGpp en E. coli y la estimulación tanto de la acumulación de glucógeno [Wilson, W. A., Roach, P. J., Montero, M., Baroja-Fernández, E., Muñoz, F. J., Eydallin, G., Víale, A. M., Pozueta-Romero, J. (2010) Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 952-985] como de la expresión del operón glgBXCAP [Montero, M., Almagro G., Eydallin G., Víale, A. M., Muñoz, F. J., Bahaji, A., Li, J., Rahimpour, M., Baroja-Fernández, E., Pozueta-Romero, J. (201 1) Escherichia coli glycogen genes are organized in a single glgBXCAP transcriptional unit possessing an alternative suboperonic promoter within glgC that directs glgAP expression. Biochem. J. 433, 107-1 17]. Esta estimulación de la síntesis de glucógeno durante la respuesta estricta conllevaría a un mayor gasto de G1 P y ATP por la GlgC y por tanto una menor disponibilidad de esas sustratos para la producción de EPSs y para la motilidad bacteriana. Para comprobar esta hipótesis simulamos un hambreado del ión Mg2+ añadiendo al medio de cultivo 10 mM del agente quelante EDTA y medimos tanto la producción de biofilm como la motilidad tipo "swarming" en células WT de E. coli W. En estas condiciones las bacterias crecieron normalmente (Figura 15A). Aunque trabajos previos han mostrado que la reducción del Mg2+ extracelular mediante la adición de 5 mM EDTA conlleva un incremento del biofilm en Pseudomonas aeruginosa [Mulcahy, H., Lewenza, S. (2011) Magnesium limitation is an environmental trigger of the Pseudomonas aeruginosa biofilm lifestyle. PLoS One. 6, e23307], nuestros resultados mostraron que la adición de 10 mM EDTA claramente reduce la producción de novo de biofilm (Figura 15B). También se observa un efecto inhibidor del EDTA en la motilidad tipo "swarming" (Figura 15C). Este resultado es consistente con la idea de que la estimulación de la actividad GlgC durante la respuesta estricta tiene un efecto negativo en la producción de biofilm y en la motilidad. Hay que destacar que aunque se ha descrito que el EDTA causa una dispersión de los biofilmes de Pseudomonas aeruginosa previamente formados [Banin, E., Brady, K.M., Greenberg, E.P. (2006) Chelator-induced dispersal and killing of Pseudomonas aeruginosa cells in a biofilm. Appl. Environ. Microbiol.; 72, 2064-2069], la presente invención se caracteriza por evitar la aparición de novo de biofilm suplementando el medio de cultivo con EDTA.
2.3.- Piridoxal fosfato (PLP)
El piridoxal fosfato (PLP) es el cofactor orgánico más versátil en la biología y es utilizado por una gran variedad de enzimas en todos los organismos [Helmreich, E.J., Klein, H.W. (1980) The role of pyridoxal phosphate in the catalysis of glycogen phosphorylases. Angew Chem Int Ed Engl. 19, 441-445; John, R.A. (1995) Pyridoxal phosphate-dependent enzymes. Biochim. Biophys. Acta, 1248, 81-96; Jansonius, J.N. (1998) Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 759-769; Mehta, P.K., Christen, P. (2000) The molecular evolution of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Adv. Enzymol. 74, 129-184; Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. (2000) The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure Fold. Des. 8, R1-R6; Christen, P., Mehta, P.K. (2001) From cofactor to enzymes. The molecular evolution of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Chem. Rec. 1 , 436- 447]. Además, el PLP es un activador secundario de GIgC de E. coli [Parsons, T.F., Preiss, J. (1978) Biosynthesis of bacterial glycogen. Isolation and characterization of the pyridoxal- P allosteric activator site and the ADP-glucose-protected pyridoxal-P binding site of Escherichia coli B ADP-glucose synthase. J. Biol. Chem. 253, 7638-7645; Preiss, J. (1996) ADPglucose pyrophosphorylase: Basic science and applications in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 2, 259-279]. Para investigar si la estimulación de la actividad GIgC mediante la adición de PLP conllevaría a una reducción de G1 P y ATP necesarios para la formación de biofilm y la motilidad bacteriana, se midió tanto la producción de biofilm como la motilidad tipo "swarming" de células silvestres de E. coli W en un medio de cultivo suplementado con 10 mM PLP. En estas condiciones las bacterias crecieron normalmente (Figura 15A). Como se muestra en las Figuras 15B y D el PLP provoca una reducción tanto en la producción de biofilm como en la motilidad tipo "swarming". Este resultado sugiere que la estimulación de la actividad GIgC mediante la adición de un activador provoca una menor disponibilidad de G1 P y ATP para la producción biofilm y la motilidad respectivamente. 2.4- Ditiotreitol (DTT) y ditioeritritol (DTE)
Diferentes trabajos han demostrado que las AGP están reguladas a nivel de su estado redox, siendo más activas en estado reducido [Hendriks, J.H.M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. (2003) ADP-glucose pyrophosphorylase is activated by posttranslational redox-modification in response to light and to sugars in leaves of Arabidopsis and other plant species. Plant Physiol. 133, 838-849; Michalska, J., Zauber, H., Buchanan, B.B., Cejudo, F.J., Geigenberger, P. (2009) NTRC links built-in thioredoxin to lightand sucrose in regulating starch synthesis in chloroplasts. Proc. Nati Acad. Sci. USA. 106, 9908-9913; Kótting, O., Kossmann, J., Zeeman, S.C. and Lloyd, J.R. (2010) Regulation of starch metabolism: the age of enlightenment? Curr. Opin. Plant Biol. 13, 321- 329; Geigenberger, P. (2011) Regulation of starch biosynthesis in response to a fluctuating environment. Plant Physiol. 155, 1566-1577]. La adición en el medio de cultivo de 10 mM ditiotreitol (DTT) o 1 mM ditioeritritol (DTE), ambos agentes muy reductores, provoca un descenso tanto en la producción de biofilm (Figura 15B) como en la motilidad tipo "swarming" (Figura 15E) en células silvestres (£. coli W). En estas condiciones las bacterias crecieron normalmente (Figura 15A). El resultado obtenido sugiere que la estimulación de la actividad GIgC (AGP bacteriana) como consecuencia del incremento de su estado reducido provoca una menor disponibilidad de G1 P y ATP para la producción de biofilm y la motilidad respectivamente. Hay que destacar que aunque trabajos previos han mostrado que el DTT causa una disrupción del biofilm previamente formado en P. aeruginosa, Staphyloccocus aureus, Staphyloccocus epidermidis y E. coli [Drago, L, Romanó, C.L., Martina, R., Signori, V., De Vecchi, E. (2012) Does dithiothreitol improve bacterial detection from infected prostheses? A pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 470, 2915-25], la presente invención se caracteriza por evitar la aparición de novo de biofilm mediante la adición de DTT en el medio de cultivo.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo:
Las cepas bacterianas, mutantes, y plásmidos usadas en este trabajo se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en esta invención. AmpR, ampicillin resistance; KmR, kanamycin resistance; CmR, chloramphenicol resistance
Bacteria Descripción Fuente/referencia
W ATCC 9637 Lee et al. (1997)
lacP rrnBj AlacZw^6 hsdR514 AaraBAD mz Keio collection (Baba
BW251 13
ArhaBADLD78 et al. 2006)
BW25113 Complete glgS replaced by a KmR Keio collection (Baba
AgigS
cassette et al. 2006)
BW25113 Completeg/g A replaced by a KmR Keio collection (Baba AgigA
cassette et al. 2006)
BW25113 Complete glgC reemplazado por un Keio collection (Baba AgigC
cásete de resistencia a kanamicina (KmR) et al. 2006) glgB::lacZY BW25113 fusión transcripcional glgB::lacZY Montero et al. (2009) lrhA::lacZY BW25113 fusión transcripcional lrhA::lacZY Este trabajo
fliA::lacZY BW25113 fusión transcripcional fliAv.lacZY Este trabajo
flhC::lacZY BW25113 fusión transcripcional flhC/.lacZY Este trabajo
fimA::lacZY BW25113 fusión transcripcional fimA::lacZY Este trabajo ycgR::lacZY BW25113 fusión transcripcional ycgRv.lacZY Este trabajo trpE::lacZY BW25113 fusión transcripcional trpE::lacZY Este trabajo flgB::lacZY BW25113 fusión transcripcional flgB::lacZY Este trabajo motA::lacZY BW25113 fusión transcripcional motA::lacZY Este trabajo
AglgS BW25113 fusión transcripcional glgB::lacZY en
Este trabajo glgB::lacZY AglgS
AgigS BW25113 fusión transcripcional lrhA::lacZY en
Este trabajo lrhA::lacZY AglgS
AgigS BW25113 fusión transcripcional fliA::lacZY en
Este trabajo fliA::lacZY AglgS
AgigS BW25113 fusión transcripcional flhC.:lacZY en
Este trabajo flhC::lacZY AglgS
AgigS BW25113 fusión transcripcional fimA::lacZY en
Este trabajo fimA::lacZY AglgS
AgigS BW25113 fusión transcripcional ycgRv.lacZY en
Este trabajo ycgR::lacZY AglgS
AglgS BW25113 fusión transcripcional trpEv.lacZY en
Este trabajo trpE::lacZY AglgS
AglgS BW25113 fusión transcripcional flgB::lacZY en
Este trabajo flgB::lacZY AglgS
AglgS BW25113 fusión transcripcional motA::lacZY en
Este trabajo motA::lacZY AglgS
Tabla 6:
Plásmido Descripción Fuente
Plásmido que expresa la FLP recombinasa, AmpR, Datsenko and pCP20
usado para eliminar cassettes KmR Wanner (2000)
Plasmido que incluye el gen lacZY y el cásete KmR,
pKG137 usado para la construcción de fusions Montero et al. (2011) transcripcionales
ASKA collection pCA24Ng/g Plásmido usado para la sobre-expresión de glgC,
(Kitagawa et al. C CmR
2005)
ASKA collection
Plásmido usado para la sobre-expresión de glgS,
pCA24Ng/gS (Kitagawa et al.
CmR
2005)
Los mutantes por delección sencillos de la cepa BW251 13 derivada de E. coli K-12 se obtuvieron de la colección Keio [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K.A., Tomita, M., Wanner, B.L., Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2: 2006.0008]. Los mutantes por delección dobles se construyeron a partir de los mutantes sencillos de la colección Keio, los cuales poseen un cásete de resistencia a kanamicina en el sitio de la delección génica. El cásete de kanamicina de la célula receptora fue eliminado mediante el uso del plásmido termosensible pCP20, que provoca la expresión de la recombinasa FLP en E. coli. [Cherepanov, P.P., Wackernagel, W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalized excisión of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9-14]. A continuación, la delección presente en la cepa donadora fue transducida a la cepa receptora usando el fago P1 [Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Se usaron placas de LB suplementadas con kanamicina para la selección de los doble mutantes, cuyas delecciones fueron posteriormente comprobadas mediante PCR. La expresión de glgC y glgS en trans se realizó transformando la células con los vectores pCA24N-g/gC y pCA24N-g/gS obtenidos de la colección ASKA [Kitagawa, M., Ara., T, Arifuzzaman, M., Ilka-Nakamichi, T., Inamoto, E., Toyonaga, H., Mori, H. (2005) Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA Res. 12: 291-299]. Las células fueron crecidas a 37° C en agitador orbital con fuerte agitación (200 rpm) y en medio líquido Kornberg (1.1 % K2HP04, 0.85% KH2P04, 0.6% extracto de levadura Difco) suplementado con glucosa 50 mM y en caso necesario el antibiótico de selección apropiado, inoculando con 1 volumen de precultivo crecido durante 16 horas por cada 50 volúmenes de medio fresco.
Fusiones transcripcionales lacZY
El cásete de kanamicina insertado en el lugar del gen deleccionado de los mutantes de la colección Keio [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K.A., Tomita, M., Wanner, B.L., Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2: 2006.0008] fue eliminado utilizando el plásmido termosensible pCP20, que expresa la recombinasa FLP [Cherepanov, P.P. and Wackernagel, W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalized excisión of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9-14]. La cicatriz dejada tras eliminar el cásete de resistencia a kanamicina incluye un sitio FRT de 34 nucleótidos [Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K.A., Tomita, M., Wanner, B.L., Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2: 2006.0008], el cual fue utilizado para construir las fusiones transcripcionales lacZY tal y como detalla en Ellermeier et al. [Ellermeier, C.D., Janakiraman, A., Slauch, J.M. (2002) Construction of targeted single copy lac fusions using lambda Red and FLP-mediated site-specific recombination in bacteria. Gene 290, 153-161]. Brevemente, los mutantes de la colección Keio transformados con el plásmido pCP20 fueron nuevamente transformados con el plásmido pKG137, el cual tiene un cásete lacZY y KmR funcional que se integró en la orientación correcta en el sitio FRT por acción de la recombinasa FLP dando lugar a fusiones transcripcionales lacZY donde previamente se encontraba localizado el cásete de resitencia a kanamicina.
Seguimiento del crecimiento, medición de la actividad β-galactosidasa y medición de los niveles de proteína, glucógeno y ácido colánico
El crecimiento bacteriano fue seguido espectrofotométricamente midiendo la absorbancia de los cultivos a 600 nm. Los cultivos se recogieron a la entrada de la fase estacionaria, fueron centrifugados a 4400 g durante 15 min, lavados con medio Kornberg fresco, resuspendidos en Tris/HCI 40mM pH 7,5 y sonicados antes de llevar a cabo las medidas de contenido en proteína y glucógeno. La actividad β-galactosidasa fue medida y representada tal y como se describe en [Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor]. La proteína total de los extractos crudos fue medida mediante el método de Bradford usando un reactivo comericial de Bio-Rad. El análisis cualitativo de la presencia de glucógeno fue llevadoa cabo usando la técnica de la tinción bajo vapores de iodina [Govons, S., Vinopal, R., Ingraham, J., Preiss, J. (1969) Isolation of mutants of Escherichia coli B altered in their ability to synthesize glycogen. J. Bacteriol. 97, 970-972]. Las medidas cuantitativas de glucógeno fueron realizadas usando un kit (Boheringer Manheim) basado en la degradación del glucógeno por amiloglucosidasa. La medición del contenido de ácido colánico se llevó a cabo según el método descrito en [Obadia, B., Lacour, S., Doublet, P., Baubichon-Cortay, H., Cozzone, A.J., Grangeasse, C. (2007) Influence of tyrosine-kinase Wzc activity on colanic acid production in Escherichia coli K12 cells. J. Mol. BioL 367, 42- 53].
Microscopía electrónica para el análisis de flagelos y fimbrias tipo I
Se recogieron los cultivos bacterianos a la entrada de la fase estacionaria mediante centrifugación a 4400 g durante 15 minutos. Las células fueron lavadas dos veces utilizando tampon fosfato salino y fueron fijadas durante 15 minutos en tetróxido de osmio al 1 % antes de ser colocadas sobre unas rejillas de cobre recubiertas de Formvar. Estas preparaciones fueron teñidas negativamente con ácido fosfotúngstico al 2% (p/v) antes de ser analizadas en un microscopio de transmisión de electrones EFTEM Zeiss Libra 120. Microarrays
Se crecieron los cultivos de células AglgS y de la cepa silvestre en 20 ml_ de medio Kornberg suplementado con glucosa al 1 % bajo fuerte agitación y a 37°C. Los cultivos fueron recogidos a la entrada del estado estacionario mediante centrifugación. Las células fueron congeladas en nitrógeno líquido y mantenidas a -80 °C hasta su uso. El RNA total fue extraído usando el reactivo TRIzol según el protocolo descrito en [Toledo-Arana, A., Dussurget, O., Nikitas, G., Sesto, N., Guet-Revillet, H., Balestrino, D., Loh, E., Gripenland, J., Tiensuu, T., Vaitkevicius, K., Barthelemy, M., Vergassola, M., Nahori, M.A., Soubigou, G., Régnault, B., Coppée, J.Y., Lecuit, M., Johansson, J., Cossart, P. (2009) The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature 459: 950-956]. El cDNA marcado por fluorescencia para las hibridaciones de los microarray fue obtenido utilizando el kit cDNA Labelling System (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 20 βg de RNA total fue convertido en cDNA con la transcriptasa reversa Superscript III usando hexámeros aleatorios como cebadores, e incluyendo nucleótidos modificados en la mezcla de reacción. Después de purificar el cDNA, se unieron los marcadores fluorescentes Cy3 o Hyper5 (GE Healthcare) al cDNA usando los nucleótidos modificados. La eficiencia del mareaje se analizó utilizando un espectrofotómetroNanoDrop ND1000 (NanoDropTechnologies). Se mezclaron y secaron en Speed-Vac cantidades iguales de cDNA marcado con Cy3 o Hyper5, uno de ellos correspondiente al control y el otro a la muestra a ser analizada. La hibridación se realizó con el E. coli microarray 8χ 15K (G4813A-020097, Agilent). Las condiciones concretas para el mareaje e hibridación son los descritos en el manual de instrucciones "The manual two color microarray based gene expression Analysis" de Agilent Technologies. Se realizaron tres réplicas independientes para las células AglgS y para la cepa silvestre. Las imágenes de los canales Cy3 e Hyper5 fueron capturadas con un escáner GenePix 4000B (Axon, Union City, CA, EEUU). Cada uno de los puntos fue cuantificado con el programa GenPix (Axon) y normalizado por el método Lowess. La media de las intensidades log-ratio de las tres replicas y su desviación estándar fueron calculadas y los valores de expresión fueron analizados estadísticamente usando el programa LIMMA Package [Smyth, G.K., Speed, T. (2003) Normalization of cDNA microarray data. Methods 31 : 265-273]. Se realizó la selección de los genes que estadísticamente se expresaban de manera diferencial en base a su valor p (<0.05, t de Studenf) y al número de veces que se expresaban en células AglgS comparadas con la cepa silvestre. La caracterización funcional de los genes que se expresaban diferencialmente se llevó a cabo usando los sitios web KEGG y regulonDB. Análisis de motilidad y quimiotaxis en E.coli:
Las placas para los ensayos de motilidad tipo "swarming" se prepararon como se describe en [Niu, C, Graves, J.D., Mokuolu, F.O., Gilbert, S.E., Gilbert, E.S. (2005) Enhanced swarming of bacteria on agar plates containing the surfactant Tween 80. J. Microbiol. Methods 62: 129-132]. Los ensayos de quimiotaxis se llevaron a cabo tal y como se describe en [Lehnen, D., Blumer, C, Polen, T., Wackwithz, B., Wendisch, V.F., Unden, G. (2002) LrhA as a new transcriptional key regulator of flagella, motility and chemotaxis genes in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 45: 521-532]. El medio mínimo utilizado para los ensayos de motilidad tipo "swarming" incluía 10 mM K+-fosfato (pH 7.0), 1 mM (NH4)2S04, 1 mM MgS04, 0.3% Bacto agar (Difco), 20 βg mi"1 de L-treonina, L-leucina, L-histidina, L- metionina y 1 βg mi"1 de tiamina. Para el ensayo de quimiotaxis para aspartato, las placas fueron además suplementadas con 100 mM aspartato, 0.5% NaCI y 1 mM glicerol.
Ensayo de biofilm con cristal violeta
Este ensayo es una modificación del descrito originalmente en [Pratt, L.A., Kolter,
R. (1998) Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. 30: 285-93]. Los cultivos se llevaron a cabo en medio Kornberg-glucosa en microplacas de 96 pocilios de poliestireno (No 82.1581.001 , SARSTEDT) a 28°C y durante 48 h sin agitación. Las placas multipocillo fueron lavadas cuidadosamente con agua, teñidas con 1 % cristal violeta durante 20 min, lavadas de nuevo con agua, y finalmente se añadió a cada uno de los pocilios 100 βΙ de una solución 70% etanol y 30% acetona. La tinción por cristal violeta fue cuantificada por espectrofotometría a una longitud de onda de 595 nm. Generación de colecciones a gran escala de dobles mutantes para la identificación de genes cuya delección afecta al contenido de glucógeno de las células AglgS
La generación de una colección de dobles mutantes AglgS cruzados con los mutantes sencillos de genes no esenciales presentes en la colección Keio se llevó a cabo esencialmente como se describe en [Typas, A., Nichols, R.J., Siegele, D.A., Shales, M., Collins, S., Lim, B., Braberg, H., Yamamoto, N., Takeuchi, R., Wanner, B.L., Mori, H., Weissman, J.S., Krogan, N.J. Gross, C.A. (2008) A tool-kit for high-throughput, quantitative analyses of genetic interaction in E. coli. Nat. Methods 5, 781-787]. Este método permite la generación sistemática y la ordenación de dobles mutantes directamente sobre medio sólido, en arrays de alta densidad. La colección de mutantes así obtenida fue sometida a un screening en medio Kornberg sólido suplementado con glucosa para identificar aquéllos con niveles de glucógeno alterados, usando la técnica de tinción bajo vapores de iodina [Govons, S., Vinopal, R., Ingraham, J., Preiss, J. (1969) Isolation of mutants of Escherichia coli B altered in their ability to synthesize glycogen. J. Bacteriol. 97, 970-972]. En presencia de vapores de iodina los mutantes con contenido elevado de glucógeno se tiñen de color marrón más oscuro que su muíante parental, mientras que los mutantes con bajo contenido en glucógeno tiñen de color amarillo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Compuesto útil para reducir o anular procesos determinantes de la patogenicidad y virulencia bacterianas y de la adherencia bacteriana a superficies tales como la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad flagelar y la formación de EPSs y biofilms bacterianos, caracterizado porque regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la estimulación de GlgS y/o GlgC o cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno, y porque se selecciona del grupo que consiste en:
- una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular, o una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína, donde la proteína se selecciona entre una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6; o una proteína GlgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4, y donde la secuencia de nucleótidos se selecciona entre una secuencia agp, que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y que comprende SEQ ID NO 1 ó SEQ ID N05; o una secuencia glgS, que codifica para una proteína o péptido GlgS, y comprende la secuencia SEQ ID NO 3;
- un regulador alostérico o una sustancia capaz de activar a una proteína o péptido con actividad AGP, o la expresión de secuencias nucleotídicas codificantes para AGP o GlgS, perteneciente al siguiente grupo: sedoheptulosa 1 ,7-difosfato, D- arabinitol 1 ,5-d ¡fosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2-fosfoglicerato, eritrosa-4-fosfato, fosfoenolpiruvato, fosfoketodeoxigluconato, magnesio (Mg2+), NADH, NADPH, piridoxal-fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6- bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6-bifosfato (F2.6P2), 3-fosfoglicerato (3PGA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), piridoxal fosfato (PLP), ditiotreitol (DTT) y ditioeritritol (DTE).
2. - Compuesto útil para reducir o anular procesos determinantes de la patogenicidad y virulencia bacterianas y de la adherencia bacteriana a superficies tales como la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad flagelar y la formación de EPSs y biofilms bacterianos, caracterizado porque regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano a través de la estimulación de GlgS y/o GlgC o cualquier otra función que conlleve un gasto de ATP y G1 P para la producción de ADPG necesario para la síntesis de glucógeno, y porque se selecciona del grupo que consiste en:
- una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular seleccionada entre una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6; o una proteína GlgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4;
- una secuencia de nucleótidos codificante de dicha proteína, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona entre una secuencia agp, que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y que comprende SEQ ID NO 1 ó SEQ ID N05; o una secuencia glgS, que codifica para una proteína o péptido GlgS, y comprende la secuencia SEQ ID NO 3;
- un regulador alostérico capaz de activar a una proteína o péptido con actividad AGP perteneciente al siguiente grupo: sedoheptulosa 1 ,7-difosfato, D-arabinitol 1 ,5- difosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2-fosfoglicerato, eritrosa-4- fosfato, fosfoenolpiruvato, fosfoketodeoxigluconato, magnesio (Mg2+), NADH, NADPH, piridoxal-fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6-bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6-bifosfato (F2.6P2) o 3-fosfoglicerato (3PGA).
3. - Compuesto según la reivindicación 1 ó 2 para uso en la prevención y tratamiento de una contaminación bacteriana.
4. - Compuesto según la reivindicación 3 caracterizado porque la contaminación bacteriana se refiere a una infección bacteriana en mamíferos, preferentemente humanos, o a la presencia de bacterias en distintos materiales, superficies o equipos asépticos.
5. - Uso del compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o para la limpieza antiséptica.
6. - Uso del compuesto según la reivindicación 5 caracterizado porque la bacteria pertenece al siguiente grupo:
a) Gram negativas, preferentemente, Escherichia, Salmonella, Campilobacter, Shigella, Yersinia, Vibrio, Pseudomonas, Helicobacter, Bartonella, Neisseria y Bordetella, y más preferentemente, E. coli, S. typhi, S. typhimurium, C. jejuni, S. dysenteteriae, Y. pestis, V. chlolerae, P. aeruginosa, H. pylori, B. bacilliformis, N.gonorrhoeae, B. pertusis; y
b) Gram positivas, preferentemente, Listeria, Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Actinomyces, y más preferentemente, L monocytogenes, C. difficile y S. pyogenes.
7. - Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico caracterizada porque comprende al menos un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4 en cantidad farmacéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
8. - Composición farmacéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque el compuesto es una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular, dicha proteína seleccionada entre una proteína con actividad AGP que comprende una secuencia perteneciente al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 6; o una proteína GlgS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 4.
9. - Composición farmacéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque el compuesto es una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína que regula positivamente la ruta metabólica de producción de glucógeno bacteriano fomentando el consumo de ATP y/o G1 P intracelular, dicha secuencia seleccionada entre una secuencia agp, que codifica para una proteína o péptido con actividad AGP, y que comprende SEQ ID NO 1 ó SEQ ID N05; o una secuencia glgS, que codifica para una proteína o péptido GlgS, y comprende la secuencia SEQ ID NO 3.
10. - Composición farmacéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque el compuesto inhibidor es un regulador alostérico capaz de activar a una proteína o péptido con actividad AGP seleccionado del siguiente grupo: sedoheptulosa 1 ,7-d ¡fosfato, D- arabinitol 1 ,5-difosfato, glucosa 1 ,6-difosfato, gliceraldehido 3-P, 2-fosfoglicerato, eritrosa- 4-fosfato, fosfoenolpiruvato, fosfoketodeoxigluconato, ión magnesio (Mg2+), NADH, NADPH, piridoxal-fosfato, ácido pirúvico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1 ,6-bifosfato (F1.6P2), fructosa-2,6-bifosfato (F2.6P2) o 3-fosfoglicerato (3PGA).
1 1. - Uso de la composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 7 a la 10 para la limpieza antiséptica de entornos o materiales contaminados por bacterias.
12. - Procedimiento para la identificación de un compuesto inhibidor de la motilidad, formación de EPSs y biofilms determinantes de la patogenicidad y virulencia bacteriana, así como de la capacidad de adherencia de las bacterias a superficies, preferentemente, mediante un ensayo de alta capacidad caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo suplementado con el compuesto candidato,
b) análisis cualitativo-visual de los niveles de glucógeno bacteriano producidos en las bacterias de a), preferentemente, mediante tinción del glucógeno con vapores de iodo, y
c) selección de un compuesto inhibidor cuando dicho compuesto incrementa la cantidad de glucógeno bacteriano detectado según el método de b) con respecto a sus niveles básales.
13. - Compuesto útil para incrementar la producción de fimbrias de tipo 1 , la motilidad, la formación de EPSs y/o biofilms bacterianos caracterizado porque regula negativamente la ruta metabolica de producción de glucógeno bacteriano a través de la inhibición de GIgC y/o GlgS, es un regulador alostérico capaz de inhibir a GIgC u otra AGP de origen microbiano cuya secuencia es diferente a GIgC, y se selecciona del siguiente grupo: AMP, ADP, ortofosfato y pirofosfato.
14. - Uso de un compuesto definido en la reivindicación 13 para favorecer la unión de rhizobacterias beneficiosas a las raíces de las plantas.
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