WO2014053687A1 - Procedimiento de fermentación para la producción de polihidroxialcanoatos y derivados que comprende la utilización de predadores bacterianos - Google Patents

Procedimiento de fermentación para la producción de polihidroxialcanoatos y derivados que comprende la utilización de predadores bacterianos Download PDF

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WO2014053687A1
WO2014053687A1 PCT/ES2013/070674 ES2013070674W WO2014053687A1 WO 2014053687 A1 WO2014053687 A1 WO 2014053687A1 ES 2013070674 W ES2013070674 W ES 2013070674W WO 2014053687 A1 WO2014053687 A1 WO 2014053687A1
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pha
bioproduct
bacteria
prey
hydrolyzate
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Virginia MARTÍNEZ LÓPEZ
María Auxiliadora PRIETO JIMÉNEZ
José Luis GARCÍA LÓPEZ
Edouard JURKEVITCH
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • One of the objects of the present invention is a method of producing polyhydroxyalkanoates and derivatives by bacterial fermentation in which the extraction of the product is facilitated by lysis of the producing bacterium with a predatory bacterium, and therefore, is included in the area Industrial Biotechnology in the Chemical Industry sector, and in particular the so-called Sustainable Chemistry or Green Chemistry, being able to affect both the subsector of primary chemical substances and the subsector of specialized chemical substances.
  • bioplastics are biodegradable polymers produced by certain bacteria, which accumulate inside the cell in the form of carbon-source granules when culture conditions are not optimal for growth (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates.In Pseudomonas: a Model System in Biology.Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, JL and Filloux, A. Springer, 397-428).
  • biodegradable biopolymers are synthesized by bacteria from renewable sources such as glucose, fructose or fatty acids that are part of vegetable oils (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, JL and Filloux, A. Springer. 397-428). Therefore, the term bioplastic can be defined as a biopolymer synthesized from renewable sources, which can be degraded under controlled conditions of biodegradation and that presents physicochemical characteristics similar to plastics derived from the petrochemical industry (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol.
  • PHA granules are composed of a polyester comprising 93-97% of the dry weight of the granule (PSG), surrounded by 1-6% of the phospholipid PSG and between 1-2% of the protein associated PSG. granule (called GAPs), which form a thin layer on the surface of the granule (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol. 41: 94-105).
  • PHAs are classified into two main types according to their chemical structure: short chain PHAs (scl-PHAs) obtained from monomers with 4 or 5 carbon atoms and medium chain (mcl-PHAs) monomers from monomers with 6 to 14 carbon atoms.
  • the different PHAs identified to date are linear polymers composed of fatty 3-hydroxy acids exclusively of the R configuration. The molecular weight of these polymers can vary between 50,000-1,000,000 and their diversity lies in the substitutions in the asymmetric carbon in position 3 , which gives the polymer the chiral character.
  • These polymers, biopolyesters are formed solely by the enantiomeric form R of hydroxyalkanoates (RHA) (Prieto et al. 1999. J. Bacteriol. 181: 858-868; Chen et al. 2005. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67: 592-599; Ren et al. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol. 87: 41-52).
  • PHB poly- (3-hydroxybutyrate)
  • RhbA poly- (3-hydroxybutyrate)
  • acetoacetyl-CoA is stereoselectively reduced by giving ⁇ R) -3-hydroxybutyryl-CoA in a reaction catalyzed by NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhbB).
  • the monomers of ⁇ R) -3-hydroxybutyryl-CoA are polymerized by the action of a PHB polymerase (PhbC) (Peoples and Sinskey, 1989. J. Biol. Chem. 264: 15298-15303).
  • the mcl-PHA produced by the genus Pseudomonas are mainly composed of hydroxyoctanoic acid monomers, but a great diversity of monomers containing as substituents aromatic, aliphatic, unsaturated, saturated, branched, etc. groups can also be found to a lesser extent. (Garc ⁇ a et al. 1999. J. Biol. Chem. 274: 29228-29241). This is mainly due to the great metabolic diversity that characterizes these microorganisms since they can transform a wide variety of substrates into 3-hydroxyalkanoic intermediates through the ⁇ -oxidation and de novo synthesis pathway of fatty acids (Prieto et al. 2007.
  • the composition of the PHA depends on the carbon source present in the culture medium used during the fermentation of the producing bacteria (Durner et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72: 278-288; Jung et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72: 19-24).
  • the present invention provides a process by which a bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, can be extracted competitively and ecologically, from prey producing bacteria grown in a means of production of the bioproduct.
  • the extraction of the bioproduct is achieved by the action of a predatory bacterium that causes a controlled lysis of the producing bacterium and the release of the bioproduct to the extracellular environment.
  • the prey producing bacterium is a Gram-negative bacterium.
  • Predation is a type of biological interaction in which one individual (the predator) feeds on another (the prey) to survive. It is a type of interspecific relationship, that is, that occurs between organisms of different species, very common in nature, including also the microbial world. Within the latter, bacterial predation is a mode of interaction according to which a predatory organism attacks and consumes a prey bacterium.
  • Predatory bacteria of other bacteria have a wide distribution in nature, both in terrestrial and aquatic habitats, including extreme or anaerobic environments. These types of bacteria show different phenotypes and metabolic adaptations, being able to be mandatory predators if they are unable to replicate in the absence of prey, or optional if they are not dependent on the presence of a prey. In addition, these predatory bacteria use various predation strategies. Among these is the periplasmic predation, in which predators invade the periplasmic space of the dam, where the intracellular content is established and degraded as they grow and divide.
  • BALOs Bdellov ⁇ br ⁇ o and similar organisms generally referred to as BALOs (Bdellov ⁇ br ⁇ o and l ⁇ ke organ ⁇ sms), which constitutes the group of predatory bacteria best studied to date (Jurkevitch and Davidov, 2007. Phylogenetic diversity and evolution of predatory prokaryotes. In Jurkevitch, E. (ed.) r Predatory Prokaryotes, vol. IV. Springer-Verlag. 11- 56).
  • the present invention also provides a method of obtaining a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, characterized in that it comprises:
  • step b) extracting the bioproduct obtained in step a) by the extraction procedure described in the first aspect of this invention
  • step a) of fermentation the bioproduct accumulates inside the producing bacterium in the form of PHA granules. Subsequently, in stage b) these granules are released to the extracellular medium when the predatory bacteria lysate the cell wall of the prey producing bacteria.
  • step c) the bioproduct is isolated from the extracted granules. This isolation step may comprise one or more purification procedures. Additionally, if the bioproduct obtained in step a) is a mixture, this isolation step may also comprise the separation of the different components of said mixture.
  • bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), PHA hydrolyzate and a Any of its mixtures obtained by the method as described in this patent application can be chemically modified to obtain a different PHA derivative.
  • This chemical modification may comprise one or more stages selected from the group consisting of cross-linking, hydrolysis or addition of one or more functional groups.
  • the present invention provides a method of extracting a bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, and obtained by fermentation of a prey producing bacterium, characterized in said process. Extraction because it involves mixing the prey producing bacteria that contains the bioproduct inside with a predatory bacterium in a medium that comprises a source of Ca and Mg. Preferably, in a medium comprising CaCl 2 and MgCl 2 .
  • the predatory bacterium causes the rupture of the cell envelope of the prey producing bacterium, resulting in the release of the bioproduct granules accumulated in the cell cytoplasm.
  • the present invention provides a solution to the extraction of compounds produced by bacteria, in particular to the extraction of a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, thereby decreasing the use of contaminating chemicals used to lyse the producing cells.
  • PHA hydrolyzate means monomer, dimer, oligomer or mixture thereof.
  • This PHA hydrolyzate also called RHA, can be obtained by the action of depolymerase enzymes present in predatory bacteria and / or in the prey producing bacteria themselves.
  • the "prey producing bacterium” referred to in this patent application is a bacterium producing one or more compounds of interest, preferably producing a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, which can be lysed by the predatory bacteria used in the extraction process of the invention.
  • the "predatory bacterium” as used in the present invention refers to a bacterium capable of lysing bacterial cells producing one or more compounds of interest, preferably producing a bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), hydrolyzed from PHA and any one of its mixtures.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • the present invention relates to the extraction process as described in this patent application, where the predatory bacteria is capable of lysing Gram-negative prey bacteria. More preferably, the predatory bacterium of the extraction process of the present invention belongs to the group of BALOs (Bdellov ⁇ br ⁇ o and licé organisms). To date, the following species of BALOs have been defined: M ⁇ cav ⁇ br ⁇ o spp (alpha proteobacteria), Bdellov ⁇ br ⁇ o spp., Bacter ⁇ ovorax spp. and Per ⁇ d ⁇ bacter spp. (proteobacteria delta) (Jurkevitch, 2007. M ⁇ crobe, 2: 67-73).
  • the group of BALOs is formed by small Gram-negative curved bacilli, aerobic and highly mobile, bound predators of other Gram-negative bacteria.
  • the dams used to isolate and characterize Bdellov ⁇ br ⁇ o belong exclusively to the Proteobacteria, being mainly Escher ⁇ ch ⁇ a col ⁇ , Pseudomonas spp. , and Erw ⁇ n ⁇ a spp. for terrestrial and freshwater habitats, and Vibrio parahaemolyticus for marine habitats (Jurkevitch and Davidov, 2007. Phylogenetic diversity and evolution of predatory prokaryotes. In Jurkevitch, E. (ed.), Predatory Prokaryotes, vol. IV. Springer-Verlag.
  • BALOs belong to the class of delta proteobacteria, within the order Bdellov ⁇ br ⁇ onales, which includes two different families: Bdellov ⁇ br ⁇ onaceae and Bacteriovoracaceae (Davidov and Jurkevitch, 2004. Int. J. Syst. Evol. M ⁇ crob ⁇ ol. 54: 1439- 1452).
  • An exception is a member of the BALO group called M ⁇ cav ⁇ br ⁇ o spp., which has been classified as alpha proteobacteria (Davidov et al. 2006. Env ⁇ ron. M ⁇ crob ⁇ ol. 8: 2179-2188).
  • the present invention relates to the method of extracting a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, and obtained by fermentation of a prey producing bacterium, wherein said process Extraction includes mixing the prey producing bacteria that contains the bioproduct inside with Bdellov ⁇ br ⁇ o bacteriovorus HD100 in a medium comprising a source of Ca and Mg.
  • Bdellov ⁇ br ⁇ o bacteriovorus HD100 is a small predator found in the soil, which belongs to the proteobacterial delta and feeds on a wide range of other Gram-negative bacteria, including human pathogens (Sockett, 2009. Annu. Rev. Microbiol. 63: 523-539).
  • the life cycle of B. bacteriovorus is unique in the sense that it is biphasic, alternating a non-replicative free phase of attack and a dependent phase of prey with intraperiplasmic growth (Stolp and Starr, 1963. Antonie Van Leeuwenhoek 29: 217-248) .
  • Bdellov ⁇ br ⁇ o replicates its DNA and grows with the prey as a source of nutrients, forming the bdelloplast, a rounded prey cell due to changes in the cell wall and containing the cell predator
  • the Bdellov ⁇ br ⁇ o is divided and the progeny is released to invade fresh dams Using the dam (Lambert et al. 2006. Curr. Op ⁇ n. Microbiol. 9: 639-644; Sockett, 2009. Annu Rev. Microbiol. 63: 523-539).
  • the bacterium producing prey in the extraction process of the bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, and obtained by fermentation as described in this patent application is a Gram-negative bacteria.
  • the prey producing bacterium that results in obtaining the bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures as described in this invention is a susceptible Gram-negative bacterium.
  • BALOs belonging exclusively to the kingdom of Proteobacteria, being mainly of the genus Escherichia, Pseudomonas, Burkholderia, Cupr ⁇ av ⁇ dus, Erw ⁇ n ⁇ a, Vibrio, Alcaligenes, Ralstonia, Rhodospirillum or Wautersia.
  • this Gram-negative bacterium is selected from the group consisting of Pseudomonas putida KT2440 and Cupriavidus necator H16.
  • the scientific classification of one of the especially preferred prey bacteria of the present invention is: Kingdom: Bacteria / Division: Proteobacteria / Order: Pseudomonadales / Family: Pseudomonadaceae / Genus: Pseudomonas / Species: put ⁇ da.
  • the scientific classification of another of the especially preferred prey bacteria of the present invention is: Kingdom: Bacteria / Division: Proteobacteria / Order: Burkholder ⁇ ales / Family: Burkholder ⁇ aceae / Genus: Cupr ⁇ av ⁇ dus / Species: necator.
  • the present invention provides a method of extracting a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, and obtained by fermentation of a prey producing bacterium, where said extraction procedure comprises mixing the prey producing bacterium containing the bioproduct inside it selected from the group consisting of Pseudomonas putida KT2440 and Cupriavidus necator H16, with Bdellovibrio bacteriovorus HD100 in a medium comprising a source of Ca and Mg.
  • the present invention relates to the method of extracting a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, obtained by fermentation of a prey producing bacterium as described in this application.
  • patent which includes the addition of the predatory bacteria to a culture medium that comprises a source of Ca and Mg where the prey producing bacterium containing the bioproduct inside is located.
  • the predatory bacterium belongs to the BALO group and the prey producing bacterium is Gram-negative.
  • the predatory bacterium is Bdellovibrio bacteriovorus HD100 and the prey producing bacterium is selected from the group consisting of Pseudomonas putida KT2440 and Cupriavidus necator H16.
  • the culture medium comprising a source of Ca and Mg where the prey producing bacterium containing the bioproduct is located inside is a physiological buffer comprising a source of Ca and Mg, preferably HEPES to which CaCl 2 and MgCl 2 have been added.
  • the present invention also relates to the use of a predatory bacterium to extract at least one compound synthesized by a prey bacterium.
  • This additional aspect of the present invention is based on the ability of the predatory bacteria to produce lysis of the producing cells capable of being predated, resulting in the release in the extracellular medium of the compound synthesized by the cells.
  • prey bacteria and predatory bacteria are defined as indicated in the first aspect of this invention.
  • the present invention relates to a method of obtaining a bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), PHA hydrolyzate and any one of its mixtures by fermentation of a prey producing bacterium, characterized by said method of Obtaining because it includes:
  • step b) extracting the bioproduct obtained in step a) by the extraction procedure described in the first aspect of this invention
  • Step c) of isolating the bioproduct as described in this patent application can be carried out by one or more techniques that are part of the common general knowledge and, therefore, are available to a person skilled in the art.
  • Isolation of the bioproduct can be carried out, for example, but not limited, by precipitation of said product with saline fractionation, heat precipitation, isoelectric precipitation, with organic solvents or with polymers, with cold acetone or by chromatography.
  • the method of obtaining the bioproduct as described in this patent application may comprise one or more purification steps. If so, these can take place by conventional procedures widely known to those skilled in the art.
  • step c) may comprise the separation of said mixture to obtain a bioproduct that is one of the components of the mixture initially obtained.
  • separation procedures can also take place by techniques that are part of common general knowledge, for example, by centrifugation.
  • step a) of the method of obtaining the bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures as described in this patent application may comprise culturing the prey producing bacteria, preferably Pseudomonas put ⁇ da KT2440 or Cupr ⁇ av ⁇ dus necator H16, in a culture medium comprising as carbon source any compound capable of being transformed into hydroxyalkanoyl-CoA by bacterial metabolism.
  • the carbon source is selected from the group consisting of glucose, fructose and fatty acid from essential oil.
  • the present invention relates to a method of obtaining a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, where step a) takes place in a minimum culture medium.
  • minimum medium refers to a culture medium comprising mineral salts of phosphorus, sulfur, iron, magnesium, potassium and nitrogen, and a compound that prey bacteria can use as a source of carbon.
  • the minimum culture medium of step a) as described in this patent application comprises KH 2 P0 4 , (NH 4 ) 2 S0 4 and S0 4 Fe, being especially preferable that the minimum medium of culture comprise 13.6 g KH 2 P0 4 ; 0.2 g (NH 4 ) 2 S0 4 ; 0.5 mg S0 4 Fe x 7 H 2 0 per liter, buffered to pH 7, culture medium called 0.1 N M63, supplemented with 1 mM MgS0 4 and a trace element solution (Moldes et al., 2004. Appl. Environ Microbiol., 70: 3205-3212).
  • step a) comprises cultivating Pseudomonas putida KT2440 in a minimum culture medium, preferably the medium called 0.1 N M63 supplemented with octanoic acid as the sole carbon source, to produce a mixture of PHA and PHA hydrolyzate .
  • the present invention relates to a method of obtaining PHA by fermentation of a prey producing bacterium, wherein said method comprises:
  • step b) extracting the mixture obtained in step a) by the extraction procedure described in the first aspect of this invention, preferably adding Bdellovibrio bacteriovorus HD100 to a suspension of Pseudomonas putida KT2440 cells cultured in step a) in HEPES to which has added CaCl 2 and MgCl 2 , and
  • This preferred embodiment step c) comprises the PHA isolation of the granules and the separation of the mixture comprising PHA and PHA hydrolyzate obtained in the previous steps of the method of the present invention.
  • This step c) may comprise a centrifugation process.
  • this isolation stage c) comprises: centrifuging the co-culture comprising lysed Pseudomonas putida KT2440 and the predatory bacteria obtained after stage b), separating the sediment comprising mostly PHA and purifying said sediment by dissolution and precipitation in suitable solvents .
  • ethyl acetate is used to dissolve the sediment and methanol to precipitate purified PHA.
  • the present invention relates to a method of obtaining PHA hydrolyzate by fermentation of a prey producing bacterium, wherein said method comprises:
  • step b) extracting the mixture obtained in step a) by the extraction procedure described in the first aspect of this invention, preferably by adding Bacteriovorus HD100 Bdellov ⁇ br ⁇ o to a suspension of KT2440 putse Pseudomonas cells grown in stage a) in HEPES to which has added CaCl 2 and MgCl 2 , and
  • This step c) of isolation 3 comprises the separation and purification of the PHA hydrolyzate extracted in step b).
  • separation and purification processes of PHA hydrolysates have been widely described. The most common is to separate them by chromatographic methods, such as HPLC with CIE3 reverse phase columns. (Ruth et al., 2007. Biomacromolecules, 8: 279-2186).
  • the present invention relates to a method of obtaining a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures as described in this patent application, where step a) It takes place in a rich culture medium.
  • the term "rich medium” as used in the present invention refers to a medium containing substances of complex and poorly defined composition that can serve as a source of nutrients and energy for the growth of the microorganism.
  • the rich culture medium of step a) of the method of obtaining the bioproduct as described in this patent application is constituted by a nutrient medium, known as nutritive medium (NB, Nutrient Broth) (Difco ) composed of 3 g / 1 meat extract and 5 g / 1 peptone, or Lysogeny Broth (LB) medium (Sambrook and Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York ).
  • NB Nutrient Broth
  • LB Lysogeny Broth
  • the present invention relates to the method of obtaining a bioproduct selected from the group consisting of PHA, PHA hydrolyzate and any one of its mixtures, by fermentation of Cupriav ⁇ dus necator, characterized in that method comprising:
  • step a) cultivate Cupr ⁇ avidus necator in a rich culture medium (NB) supplemented with sodium gluconate to produce the bioproduct
  • step b) extract the bioproduct obtained in step a) by the extraction procedure described in the first aspect of the present invention, preferably adding Bdellov ⁇ br ⁇ o bacter ⁇ ovorus HD100 to a suspension of Cupriav ⁇ dus necator cells cultured in stage a) in HEPES to which CaCl 2 and MgCl 2 have been added, and
  • step c) comprises the isolation of PHA or PHA hydrolyzate.
  • this isolation stage may comprise one or more stages and techniques widely known to those skilled in the art can be used.
  • the bioproduct isolated in step c) is polyhydroxybutyrate (PHB).
  • the bioproduct selected from the group consisting of polyhydroxyalkanoate (PHA), PHA hydrolyzate and any of its mixtures obtained by the method as described in this patent application can be chemically modified to obtain a different PHA derivative.
  • This Chemical modification can be hydrolysis of PHA to obtain RHA, cross-linking or functionalization of PHA to obtain a biopolymer with properties other than PHA obtained by fermentation as detailed in Hazer et al., 2007.
  • the PHA obtained by the method as described in this patent application can be used in the manufacture of a packaging material such as, for example, a film.
  • Said packaging material can be used, among others, in the food or pharmaceutical industry.
  • the PHA obtained by the method of obtaining as described in this patent application can also be hydrolyzed to obtain 3-hydroxy acid (RHA), a compound that can be used as a precursor in the synthesis of pharmaceutical products.
  • RHA 3-hydroxy acid
  • PHA monomers and oligomers are important components with considerable biotechnological applications.
  • Some RHAs have been shown to be compounds with antimicrobial, insecticidal, antiviral activity, and RHAs have even been described as antitumor agents such as hapalosin and ONO-4007 (de Roo et al., 2002. Biotechnol. Bioeng., 77: 717 - 722).
  • RHAs are syntones for the manufacture of vitamins, flavorings, antibiotics and pheromones.
  • (R) -3-hydroxybutyrate is used for the synthesis of Thienamycin and Captopril (Ohashi and Hasegawa, 1992. In: Sheldrake G.., AN Collins, J. Crosby, editors. Chirality in industry. New York: John Wiley & Sons. 1992, p. 269-278) and (R) -4-cyano-3- hydroxybutyrate is a very important intermediary in the manufacture of the Lipid, one of the drugs of choice for the control of cholesterol levels (Roth, 2002. Prog. Meo !. Chem., 40: 1-22).
  • Examples of other compounds synthesizable from RHAs are the precursor of L-659,699 which is an inhibitor of cholesterol synthesis, depsipeptides with antimicrobial or fungicidal activity, ( ⁇ ) _ tetrahydrolipstatin, a drug for the treatment of Obesity, immunosuppressants such as stevastelins B and B3, the antibiotic globomycin, and pravastatin, for the treatment of hypercholesterolemia (reviewed in Ren et al. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol. 87: 41-52).
  • the rich medium used to grow the cells was the nutrient medium (NB, Nutrient Broth) (Difco) or the Lysogeny Broth medium (LB) (Sambrook and Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • the minimum medium used to grow the cells was the medium called 0.1 N M63 (13.6 g KH 2 P0 4 ; 0.2 g (NH 4 ) 2 S0 4 ; 0.5 mg FeS0 4 x 7 H 2 0 per liter, pH 7) supplemented with 1 mM of MgS0 4 and a trace element solution (Moldes et al., 2004. Env. Env. Microbiol., 70: 3205-3212).
  • the cultures in liquid medium were carried out in flasks in an orbital shaker (New Stammswick scientific) with stirring (200-250 rpm) and 30 ° C.
  • Bdellovibrio bacteriovorus HD100 bacterium was routinely grown in co-cultures in HEPES buffer (25 mM HEPES modified with 2 mM CaCl 2 ⁇ 2H 2 0 and 3 mM MgCl 2 ⁇ 3H 2 0, pH 7.8) with P. put ⁇ da KT2440 grown in NB as a dam for 48 hours at 30 ° C and 250 rpm.
  • the growth in liquid medium was determined by turbidimetry at 600 nm (D0 60 o) using a Beckman DU-520 spectrophotometer.
  • the strains were stored at 4 ° C in LB plates.
  • the bacteria were frozen in the corresponding culture medium with 15% (v / v) glycerol and kept at -80 ° C.
  • serial dilutions of the cultures of 10 _1 to 10 ⁇ 7 were made in diluted nutrient broth consisting of 0.8 g / 1 of NB supplemented with 2 ⁇ CaCl 2 and 3 mM MgCl 2 . Then 0.1 ml of the appropriate cell dilution was mixed with 0.5 ml of P. putida KT2440 prey bacteria prepared to be predated.
  • the prey bacterium was precultured in NB, centrifuged and the cell pellet was resuspended in HEPES buffer at 10 D0 60 o- The mixtures of the different dilutions were stirred and seeded in solid DNB medium by the method of superposition of two layers (Lambert et al. 2003. Environ. Microbiol. 5: 127-132). Predators are counted as plate-forming units (pfu) under development in the turf of P. putida KT2440 after 48 h of incubation at 30 ° C.
  • DNB 10-fold diluted NB medium
  • the cell densities expressed in grams of dry cell weight (CDW) per liter, were determined gravimetrically using 50 ml calibrated Falcon tubes. Thirty milliliters of culture medium was centrifuged for 45 min at 3800 x g and 4 ° C. The cell pellets were lyophilized for 24 h in a lyophilizer and weighed.
  • CDW dry cell weight
  • the bacterium was cultured in a single fermentative phase in a minimal medium as described in Example 1.
  • the growth in plastic production conditions in a single fermentation phase allows it to grow from a single source of carbon (octanoic acid) and achieve a high biomass / PHA yield.
  • Table 2 Shows the optical density value (D0 60 or nm); the intracellular content of PHA; the viable cell count (cfu / ml) and the biomass (g / 1) corresponding to cells grown in a fermentative phase at 23 h of culture of the strain Pseudomonas putida KT2440.
  • the Utico system of the present example consists of the growth of B. bacteriovorus HD100 over P. putida KT2440 previously grown under the PHA production conditions described in Example 2.
  • the viability of the dam decreases 4 orders of magnitude (from 3 ⁇ 10 8 to 4 ⁇ 10 4 cfu / ml) while the progeny of B. bacteriovorus HD100 increases more than two orders of magnitude (from 3 ⁇ 10 7 to 1.5-10 9 pfu / ml) (Table 3).
  • PHA content PHA hydrolysis products Viability of the dam Viability of Bdellovibrio in the sediment in the supernatant 24 h (g ⁇ 1 ) 24h (10 8 cfumr 1 ) 24h (10 8 pfumr 1 )
  • the viability of the dams is 3-10 8 cfu / ml
  • RHAs were purified according to a method described above (Ruth et al., 2007. B ⁇ omacromolecules, 8: 279-286). Briefly, the RHAs can be separated by a reverse phase C18 chromatographic column and the resulting fractions are acidified, liquid-liquid extractions are performed and the solvent is evaporated, thus obtaining the pure RHA. The yield of this method is greater than 75%.
  • the bacteria were cultured in a single fermentative phase in a rich medium as described in Example 1.
  • the strain is capable of growing and accumulating 0.9 g / 1 PHB under those conditions. fermentative
  • the lithic system of the present example consists of the growth of B. bacterlovorus HD100 on C. necator H16 grown under conditions of PHB production (see Example 4).

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Description

PROCEDIMIENTO DE FERMENTACION PARA LA PRODUCCION DE
POLIHIDROXIALCANOATOS Y DERIVADOS QUE COMPRENDE LA UTILIZACIÓN
DE PREDADORES BACTERIANOS
DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TÉCNICA
Uno de los objetos de la presente invención es un procedimiento de producción de polihidroxialcanoatos y derivados por fermentación bacteriana en el que se facilita la extracción del producto mediante la lisis de la bacteria productora con una bacteria predadora, y por tanto, se incluye en el área de la Biotecnología Industrial en el sector de la Industria Química, y en particular de la denominada Química Sostenible o Química Verde, pudiendo afectar tanto al subsector de las sustancias químicas primarias como al subsector de las sustancias químicas especializadas .
ESTADO DE LA TÉCNICA
La biotecnología de los bioprocesos industriales está experimentado en los últimos años avances considerables para mejorar y adaptar las modernas técnicas de la biología molecular y de la microbiología a las tecnologías clásicas de fermentación. En este sentido, la tecnología del DNA recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular, han sido determinantes para que podamos explotar y manipular un gran número de organismos para la producción de sustancias de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas para expresión de genes en organismos heterólogos más fáciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estudiar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, además, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como son los bioplásticos . Sin embargo, el uso de este tipo de biopolímeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la síntesis de los polímeros plásticos derivados del petróleo (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates . In Pseudomonas : a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397-428).
Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energía y la producción de materiales de alto consumo como son los polímeros plásticos.
Los polihidroxialcanoatos , conocidos comúnmente como
"bioplásticos", son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397-428) .
Estos biopolímeros biodegradables son sintetizados por bacterias a partir de fuentes renovables como la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428) . Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser degradado en condiciones controladas de biodegradacion y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la industria petroleoquímica (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764-3768) . En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster que comprende 93-97% del peso seco del gránulo (PSG), rodeado por entre 1-6 % del PSG de fosfolipidos y entre 1-2 % del PSG de proteínas asociadas al gránulo (denominadas GAPs según sus siglas en inglés), las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol. 41: 94-105) .
Los PHAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PHAs de cadena corta (scl-PHAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R. El peso molecular de estos polímeros puede variar entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quiral . Estos polímeros, biopoliésteres , están formados únicamente por la forma enantiómérica R de los hidroxialcanoatos (RHA) (Prieto et al. 1999. J. Bacteriol. 181: 858-868; Chen et al. 2005. Appl . Microbiol. Biotechnol. 67:592-599; Ren et al. 2010. Appl. Microbiol. Biotechnol. 87:41-52).
El scl-PHA más abundante en bacterias y más estudiado hasta la fecha es el poli- ( 3-hidroxibutirato ) (PHB), cuya ruta específica de síntesis ha sido ampliamente investigada en la cepa bacteriana Ralstonia eutropha H16, recientemente reclasificada como Cupriavidus necator H16 (Poehlein et al. 2011. J. Bacteriol . 193: 5017) . Este polímero se sintetiza a partir de acetil-CoA en una serie de tres reacciones consecutivas. En primer lugar se acoplan dos moléculas de acetil-CoA, generando acetoacetil-CoA en una reacción de condensación catalizada por una β-cetoacil-CoA tiolasa (PhbA) . A continuación, el acetoacetil-CoA generado es reducido estereoselectivamente dando {R) -3-hidroxibutiril-CoA en una reacción catalizada por la acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADPH (PhbB) . Finalmente, los monómeros de {R) -3-hidroxibutiril-CoA son polimerizados por la acción de una polimerasa de PHB (PhbC) (Peoples y Sinskey, 1989. J. Biol. Chem. 264: 15298-15303).
Los mcl-PHA producidos por el género Pseudomonas están compuestos mayoritariamente por monómeros de ácido hidroxioctanoico, pero también se pueden encontrar en menor porcentaje una gran diversidad de monómeros que contienen como sustituyentes grupos aromáticos, alifáticos, insaturados, saturados, con ramificaciones, etc. (García et al. 1999. J. Biol. Chem. 274: 29228-29241). Esto es debido principalmente a la gran diversidad metabólica que caracteriza a estos microorganismos ya que pueden transformar una gran variedad de sustratos en intermediarios 3-hidroxialcanoicos mediante la ruta de β-oxidación y de síntesis de novo de ácidos grasos (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428).
Se sabe que la composición del PHA depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72: 278-288; Jung et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 72:19-24) . Por otra parte, es importante resaltar que las características físico-químicas de estos polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 21-53) . Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes en PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol. 41: 94-105), y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Hazer et al., 2007. Appl . Microbiol. Biotechnol. 74: 1-12), es fácil imaginar la gran diversidad de PHAs y RHAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PHAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn et al. 2001. Adv. Drug. Deliv. Rev. 53: 5-21) . Además, el PHA puede ser considerado como una fuente de RHAs, nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales .
Dentro de los costes de producción de los polihidroxialcanoatos (PHA), el proceso de extracción es probablemente el paso más importante a la hora de reducir costes y resolver el proceso de forma respetuosa con el medio ambiente. Hasta ahora se han desarrollado diferentes métodos para extraer PHA, pero en su mayoría requieren el uso de disolventes orgánicos que son poco respetuosos con el medio ambiente, o cócteles enzimáticos o detergentes, que siendo más respetuosos con el medio ambiente tienen algunos inconvenientes a la hora de escalar el proceso a nivel industrial (Jacquel et al. 2008. Bíochem. Eng. J. 39: 15- 27; Elbahloul y Steinbüchel, 2009. Appl. Environ. Microbiol . 75: 643-651; Kunasundari y Sudesh, 2011. Express Polymer Letters 5: 620-634). Más recientemente se han propuesto métodos de lisis para la extracción del PHA basados en el uso de bacterias modificadas genéticamente que tienen alteradas las propiedades de la superficie celular y que por lo tanto se lisan más fácilmente (Martínez et al. 2011. Mícrob. Biotechnol. 4: 533- 547; "Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putida KT2440"; solicitud de patente
PCT/ES2010/070858 Martínez et al. publicada como WO 2011/086211 Al) . Sin embargo, este método tiene el inconveniente de que al utilizar células parcialmente debilitadas en sus estructuras celulares su manipulación es más delicada y el proceso industrial es más complicado.
Por todo ello, el desarrollo de nuevos métodos o procesos para la producción y extracción de PHAs de forma competitiva y ecológica, se ha convertido en un objetivo fundamental dentro de la biotecnología medioambiental.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento mediante el cual se puede extraer, de forma competitiva y ecológica, un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, a partir de bacterias productoras presa cultivadas en un medio de producción del bioproducto. La extracción del bioproducto se consigue mediante la acción de una bacteria predadora que provoca una lisis controlada de la bacteria productora y la liberación del bioproducto al medio extracelular . Preferiblemente, la bacteria productora presa es una bacteria Gram-negativa .
La predación es un tipo de interacción biológica en la que un individuo (el predador) se alimenta de otro (la presa) para subsistir. Se trata de un tipo de relación interespecifica, es decir, que se da entre organismos de distintas especies, muy común en la naturaleza, incluyendo también el mundo microbiano. Dentro de este último, la predación bacteriana es un modo de interacción según el cual un organismo predador ataca y consume a una bacteria presa.
Las bacterias predadoras de otras bacterias poseen una amplia distribución en la naturaleza, tanto en hábitats terrestres como acuáticos, incluyendo ambientes extremos o anaerobios. Este tipo de bacterias muestran diferentes fenotipos y adaptaciones metabólicas, pudiendo ser predadores obligados si son incapaces de replicar en ausencia de presa, o facultativos si no son dependientes de la presencia de una presa. Además, estas bacterias predadoras utilizan diversas estrategias de predación. Entre éstas se encuentra la predación periplásmica, en la que los predadores invaden el espacio periplásmico de la presa, donde se establecen y degradan el contenido intracelular mientras crecen y se dividen. Esta estrategia de invasión periplásmica es característica del grupo de predadores obligados denominado Bdellovíbrío y organismos similares denominados en general como BALOs (del inglés Bdellovíbrío and líke organísms) , que constituye el grupo de bacterias predadoras mejor estudiado hasta la fecha (Jurkevitch y Davidov, 2007. Phylogenetic diversity and evolution of predatory prokaryotes. In Jurkevitch, E. (ed.)r Predatory Prokaryotes, vol. IV. Springer-Verlag . 11- 56) .
Los resultados obtenidos por los investigadores y que sirven de base para esta solicitud de patente son sorprendentes ya que un experto en la materia no esperaría que una bacteria predadora fuera capaz de predar bacterias presa conteniendo en su citoplasma gránulos de bioproducto, es decir, gránulos de PHA, hidrolizado de PHA o una mezcla de ambos.
Adicionalmente, la presente invención también proporciona un método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, caracterizado porque comprende:
a) cultivar la bacteria productora presa en un medio de cultivo en el que se produce el bioproducto,
b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en el primer aspecto de esta invención, y
c) aislar el bioproducto.
Durante la etapa a) de fermentación, el bioproducto se acumula en el interior de la bacteria productora en forma de gránulos de PHA. Posteriormente, en la etapa b) estos gránulos son liberados al medio extracelular al lisar la bacteria predadora la pared celular de la bacteria productora presa. En la etapa c) se aisla el bioproducto de los gránulos extraídos. Esta etapa de aislamiento puede comprender uno o más procedimientos de purificación. Adicionalmente, si el bioproducto obtenido en la etapa a) es una mezcla, esta etapa de aislamiento también puede comprender la separación de los diferentes componentes de dicha mezcla .
Adicionalmente, el bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas obtenido por el método tal como se describe en esta solicitud de patente, puede modificarse químicamente para obtener un derivado de PHA diferente. Esta modificación química puede comprender una o más etapas seleccionadas del grupo que consiste en entrecruzamiento, hidrólisis o adición de uno o más grupos funcionales. Estas etapas adicionales pueden realizarse siguiendo metodologías conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, tal como se describen Hazer et al., 2007. Appl . Microbiol. Biotechnol. 74: 1-12.
Los resultados obtenidos por los investigadores y que sirven de base para esta solicitud de patente son sorprendentes ya que un experto en la materia esperaría que la bacteria predadora, de ser capaz de predar la bacteria productora presa, consumiera los bioproductos acumulados en el interior de dicha bacteria y, en consecuencia, el rendimiento del método de obtención de PHA, un hidrolizado de PHA o una mezcla de estos sería muy bajo.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho procedimiento de extracción porque comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior con una bacteria predadora en un medio que comprende una fuente de Ca y Mg. Preferiblemente, en un medio que comprende CaCl2 y MgCl2.
De esta manera, la bacteria predadora origina la ruptura de la envoltura celular de la bacteria productora presa, dando lugar a la liberación de los gránulos del bioproducto acumulados en el citoplasma celular. Así, la presente invención proporciona una solución a la extracción de compuestos producidos por bacterias, en particular a la extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, disminuyendo con ello el uso de productos químicos contaminantes utilizados para lisar las células productoras .
En esta solicitud de patente, se entiende por "hidrolizado de PHA" monómero, dimero, oligómero o mezcla de los anteriores. Este hidrolizado de PHA, también llamado RHA, puede obtenerse por acción de enzimas depolimerasa presentes en las bacterias predadoras y/o en las propias bacterias productoras presa.
La "bacteria productora presa" a la que se hace referencia en esta solicitud de patente es una bacteria productora de uno o varios compuestos de interés, preferiblemente productora de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, que puede ser lisada por la bacteria predadora utilizada en el procedimiento de extracción de la invención.
La "bacteria predadora" tal como se emplea en la presente invención se refiere a una bacteria capaz de lisar células bacterianas productoras de uno o varios compuestos de interés, preferiblemente productora de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de extracción tal como se describe en esta solicitud de patente, donde la bacteria predadora es capaz de lisar bacterias presa Gram-negativas . Más preferiblemente, la bacteria predadora del procedimiento de extracción de la presente invención pertenece al grupo de los BALOs (del inglés Bdellovíbrío and líke organisms) . Hasta la fecha se han definido las siguientes especies de BALOs: Mícavíbrío spp (alfa proteobacteria) , Bdellovíbrío spp., Bacteríovorax spp. y Perídíbacter spp. (delta proteobacterias ) (Jurkevitch, 2007. Mícrobe, 2 : 67-73) . El grupo de los BALOs está formado por bacilos curvados Gram- negativos de pequeño tamaño, aeróbicos y altamente móviles, predadores obligados de otras bacterias Gram-negativas . Hasta la fecha, las presas empleadas para aislar y caracterizar Bdellovíbrío pertenecen exclusivamente al filo Proteobacteria, siendo principalmente Escheríchía colí , Pseudomonas spp . , y Erwínía spp. para hábitats terrestres y de agua dulce, y Vibrio parahaemolyticus para hábitats marinos (Jurkevitch y Davidov, 2007. Phylogenetic diversity and evolution of predatory prokaryotes. In Jurkevitch, E. (ed. ) , Predatory Prokaryotes , vol . IV. Springer-Verlag . 11-56). Dependiendo de la cepa empleada como presa, la eficiencia de la depredación es diferente; de hecho, se ha determinado que en poblaciones de presas heterogéneas, Bdellovíbrío infecta unas presas más eficientemente que otras (Rogosky et al. 2006. Curr. Mícrobíol. 52: 81-85) .
La mayoría de los BALOs pertenecen a la clase de las delta proteobacterias , dentro del orden Bdellovíbríonales, el cual comprende dos familias diferentes: Bdellovíbríonaceae y Bacteriovoracaceae (Davidov y Jurkevitch, 2004. Int. J. Syst. Evol. Mícrobíol. 54: 1439-1452). Una excepción es un miembro del grupo de los BALOs denominado Mícavíbrío spp., que ha sido clasificado como alfa proteobacteria (Davidov et al. 2006. Envíron. Mícrobíol. 8: 2179-2188).
Se conoce el rango de presas de distintos Bdellovibrios aislados de suelo y rizosfera, y de la cepa B. bacteríovorus 109J (Jurkevitch et al. 2000. Appl Envíron. Mícrobíol. 66: 2365- 2371) .
En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, donde dicho procedimiento de extracción comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior con Bdellovíbrío bacteriovorus HD100 en un medio que comprende una fuente de Ca y Mg .
La clasificación científica de esta bacteria predadora es : Reino: Bacteria / División: Proteobactería / Orden: Bdellovíbríonales / Familia: Bdellovíbríonaceae / Género: Bdellovíbrío / Especie: bacteriovorus.
La bacteria Bdellovíbrío bacteriovorus HD100 es un predador pequeño que se encuentra en el suelo, que pertenece a las delta proteobacterias y que se alimenta de una amplia gama de otras bacterias Gram-negativas , incluyendo los patógenos humanos (Sockett, 2009. Annu. Rev. Microbiol. 63: 523-539). El ciclo de vida de B. bacteriovorus es único en el sentido que es bifásico, alternando una fase libre no replicativa de ataque y una fase dependiente de presa con crecimiento intraperiplásmico (Stolp y Starr, 1963. Antonie Van Leeuwenhoek 29: 217-248). Durante la fase de crecimiento en el interior del periplasma de la célula hospedadora, Bdellovíbrío replica su ADN y crece con la presa como fuente de nutrientes, formando el bdelloplasto, célula de la presa redondeada debido a las modificaciones de la pared celular y que contiene el predador. Cuando los recursos energéticos de la presa se agotan, el Bdellovíbrío se divide y la progenie se libera para invadir presas frescas Usando la presa (Lambert et al. 2006. Curr. Opín. Microbiol. 9: 639-644; Sockett, 2009. Annu. Rev. Microbiol. 63: 523-539) .
El análisis genómico de B. bacteriovorus HD100 ha revelado el complejo repertorio de enzimas hidrolíticas de esta bacteria (Rendulic et al. 2004. Science 303: 689-692) . Bdellovíbrío constituye, por tanto, un amplio reservorio de enzimas diferentes y de interés industrial por sus potenciales aplicaciones biotecnológicas (Jurkevitch y Davidov, 2007. Phylogenetic diversity and evolution of predatory prokaryotes . In Jurkevitch, E. (ed. ) , Predatory Prokaryotes, vol. IV. Springer-Verlag . 11-56), entre las que cabe destacar las despolimerasas de PHAs, que hidrolizan el polímero dando lugar a sus derivados RHAs (Martínez, V., et al., 2012. Appl. Environ. Mícrobíol.lQ: 6017-6026) .
En otra realización preferida, la bacteria productora presa en el procedimiento de extracción del bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación tal como se describe en esta solicitud de patente, es una bacteria Gram-negativa.
En una realización más preferida, la bacteria productora presa que da lugar a la obtención del bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas tal como se describe en esta invención, es una bacteria Gram-negativa susceptible de ser predada por BALOs, perteneciente exclusivamente al reino de las Proteobactería, siendo principalmente del género Escherichia , Pseudomonas, Burkholderia , Cupríavídus, Erwínía , Vibrio, Alcaligenes, Ralstonia, Rhodospirillum o Wautersia .
Preferiblemente, esta bacteria Gram-negativa se selecciona del grupo que consiste en Pseudomonas putida KT2440 y Cupríavídus necator H16.
La clasificación científica de una de las bacterias presa especialmente preferidas de la presente invención es: Reino: Bacteria / División: Proteobactería / Orden: Pseudomonadales / Familia: Pseudomonadaceae / Género: Pseudomonas / Especie: putída .
La clasificación científica de otra de las bacterias presa especialmente preferidas de la presente invención es: Reino: Bacteria / División: Proteobactería / Orden: Burkholderíales / Familia: Burkholderíaceae / Género: Cupríavídus / Especie: necator.
En una realización aún más preferida, la presente invención proporciona un procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, donde dicho procedimiento de extracción comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior seleccionada del grupo que consiste en Pseudomonas putida KT2440 y Cupriavidus necator H16, con Bdellovibrio bacteriovorus HD100 en un medio que comprende una fuente de Ca y Mg.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, obtenido por fermentación de una bacteria productora presa tal como se describe en esta solicitud de patente, que comprende la adición de la bacteria predadora a un medio de cultivo que comprende una fuente de Ca y Mg donde se encuentra la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior. Preferiblemente, la bacteria predadora pertenece al grupo de los BALOs y la bacteria productora presa es Gram-negativa . Más preferiblemente, la bacteria predadora es Bdellovibrio bacteriovorus HD100 y la bacteria productora presa se selecciona del grupo que consiste en Pseudomonas putida KT2440 y Cupriavidus necator H16.
En una realización más preferida, el medio de cultivo que comprende una fuente de Ca y Mg donde se encuentra la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior es un tampón fisiológico que comprende una fuente de Ca y Mg, preferiblemente es HEPES al que se ha adicionado CaCl2 y MgCl2.
Adicionalmente, la presente invención también se refiere al uso de una bacteria predadora para extraer al menos un compuesto sintetizado por una bacteria presa. Este aspecto adicional de la presente invención se basa en la capacidad de la bacteria predadora para producir la lisis de las células productoras con capacidad de ser predadas, dando lugar a la liberación en el medio extracelular del compuesto sintetizado por las células. En realizaciones preferidas de este aspecto adicional de la presente invención, la bacteria presa y la bacteria predadora se definen tal como se indica en el primer aspecto de esta invención .
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho método de obtención porque comprende :
a) cultivar la bacteria productora presa en un medio de cultivo para producir el bioproducto,
b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en el primer aspecto de esta invención, y
c) aislar el bioproducto.
La etapa c) de aislamiento del bioproducto tal como se describe en esta solicitud de patente puede realizarse mediante una o más técnicas que forman parte del conocimiento general común y, por tanto, están disponibles a un experto en la materia. El aislamiento del bioproducto se puede llevar a cabo por ejemplo, pero sin limitarse, mediante precipitación de dicho producto con fraccionamiento salino, precipitación por calor, precipitación isoeléctrica, con disolventes orgánicos o con polímeros, con acetona fría o mediante cromatografía.
Adicionalmente, el método de obtención del bioproducto tal como se describe en esta solicitud de patente puede comprender una o más etapas de purificación. De ser así, estas pueden tener lugar mediante procedimientos convencionales ampliamente conocidos por el experto en la materia.
Si el bioproducto obtenido en 1a etapa a) es una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA, la etapa c) puede comprende la separación de dicha mezcla para obtener un bioproducto que es uno de los componentes de la mezcla obtenida inicialmente . Estos procedimientos de separación también pueden tener lugar por técnicas que forman parte del conocimiento general común, por ejemplo, por centrifugación.
En una realización preferida, la etapa a) del método de obtención del bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas tal como se describe en esta solicitud de patente, puede comprender cultivar la bacteria productora presa, preferiblemente Pseudomonas putída KT2440 o Cupríavídus necator H16, en un medio de cultivo que comprende como fuente de carbono cualquier compuesto susceptible de ser transformado en hidroxialcanoil-CoA mediante el metabolismo bacteriano. Preferiblemente, la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en glucosa, fructosa y ácido graso procedente de aceite esencial.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, donde la etapa a) tiene lugar en un medio mínimo de cultivo.
El término "medio mínimo" tal como se emplea en la presente invención se refiere a un medio de cultivo que comprende sales minerales de fósforo, azufre, hierro, magnesio, potasio y nitrógeno, y un compuesto que las bacterias presa puedan utilizar como fuente de carbono.
En una realización más preferida, el medio mínimo de cultivo de la etapa a) tal como se describe en esta solicitud de patente comprende KH2P04, (NH4)2S04 y S04Fe, siendo especialmente preferible que el medio mínimo de cultivo comprenda 13.6 g KH2P04; 0.2 g (NH4)2S04; 0.5 mg S04Fe x 7 H20 por litro, tamponado a pH 7, medio de cultivo denominado 0.1 N M63, suplementado con 1 mM de MgS04 y una solución de elementos traza (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3205-3212).
En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al método de obtención tal como se describe en esta solicitud de patente, donde la etapa a) comprende cultivar Pseudomonas putida KT2440 en un medio mínimo de cultivo, preferiblemente el medio denominado 0,1 N M63 suplementado con ácido octanoico como única fuente de carbono, para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA.
En una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a un método de obtención de PHA por fermentación de una bacteria productora presa, donde dicho método comprende :
a) cultivar Pseudomonas putida KT2440 en un medio mínimo de cultivo, preferiblemente el medio denominado 0,1 N M63 suplementado con ácido octanoico como única fuente de carbono, para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA,
b) extraer la mezcla obtenida en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en el primer aspecto de esta invención, preferiblemente añadiendo Bdellovibrio bacteriovorus HD100 a una suspensión de células de Pseudomonas putida KT2440 cultivadas en la etapa a) en HEPES al que se ha adicionado CaCl2 y MgCl2, y
c) aislar PHA.
Esta realización preferida la etapa c) comprende el aislamiento de PHA de los gránulos y la separación de la mezcla que comprende PHA e hidrolizado de PHA obtenida en las etapas previas del método de la presente invención. Esta etapa c) puede comprender un procedimiento de centrifugación. Preferiblemente, esta etapa c) de aislamiento comprende: centrifugar el co- cultivo que comprende Pseudomonas putida KT2440 lisada y la bacteria predadora obtenido tras la etapa b) , separar el sedimento que comprende mayoritariamente PHA y purificar dicho sedimento por disolución y precipitación en disolventes adecuados. Aún más preferiblemente, en la purificación se utiliza acetato de etilo para disolver el sedimento y metanol para precipitar PHA purificado. En otra realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a un método de obtención de hidrolizado de PHA por fermentación de una bacteria productora presa, donde dicho método comprende :
a) cultivar Pseudomonas putída KT2440 en un medio mínimo de cultivo, preferiblemente el medio denominado 0,1 N M63 suplementado con ácido octanoico como única fuente de carbono, para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA,
b) extraer la mezcla obtenida en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en el primer aspecto de esta invención, preferiblemente añadiendo Bdellovíbrío bacteríovorus HD100 a una suspensión de células de Pseudomonas putída KT2440 cultivadas en la etapa a) en HEPES al que se ha adicionado CaCl2 y MgCl2, y
c) aislar el hidrolizado de PHA.
Esta etapa c) de aislamientc 3 comprende la separación y purificación del hidrolizado de PHA extraído en la etapa b) . En la literatura se han descrito ampliamente procedimientos de separación y purificación de hidrolizados de PHA. Lo más habitual es separarlos mediante métodos cromatográficos , como por ejemplo HPLC con columnas CIE3 de fase reversa. (Ruth et al., 2007. Biomacromolecules, 8: 279-2186) .
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas tal como se describe en esta solicitud de patente, donde la etapa a) tiene lugar en un medio rico de cultivo .
El término "medio rico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a un medio que contiene sustancias de composición compleja y poco definida que puedan servir como fuente de nutrientes y energía para el crecimiento del microorganismo . En una realización más preferida, el medio rico de cultivo de la etapa a) del método de obtención del bioproducto tal como se describe en esta solicitud de patente está constituido por un medio nutritivo, conocido como medio nutritivo (NB, Nutrient Broth) (Difco) compuesto de 3 g/1 de extracto de carne y 5 g/1 de peptona, o el medio Lysogeny Broth (LB) (Sambrook y Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) .
En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en PHA, hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, por fermentación de Cupríavídus necator, caracterizado dicho método porque comprende:
a) cultivar Cupríavídus necator en un medio rico de cultivo (NB) suplementado con gluconato sódico para producir el bioproducto, b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en el primer aspecto de la presente invención, preferiblemente añadiendo Bdellovíbrío bacteríovorus HD100 a una suspensión de células de Cupríavídus necator cultivadas en la etapa a) en HEPES al que se ha adicionado CaCl2 y MgCl2, y
c) aislar el bioproducto.
En una realización especialmente preferida, la etapa c) comprende el aislamiento de PHA o de hidrolizado de PHA. Tal como se ha mencionado anteriormente, esta etapa de aislamiento puede comprender una o más etapas y pueden utilizarse técnicas ampliamente conocidos por el experto en la materia.
En otra realización especialmente preferida, el bioproducto aislado en la etapa c) es polihidroxibutirato (PHB) .
Adicionalmente, el bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas obtenido por el método tal como se describe en esta solicitud de patente, puede modificarse químicamente para obtener un derivado de PHA diferente. Esta modificación química puede ser hidrólisis de PHA para obtener RHA, entrecruzamiento o funcionalización de PHA para obtener un biopolímero con propiedades diferentes al PHA obtenido por fermentación como las detalladas en Hazer et al., 2007. Appl . Microbiol. Biotechnol. 74: 1-12: copolimerización o funcionalización de cadena lateral basadas en esterificación, entrecruzamiento, cloración, epoxidación etc.
El PHA obtenido por el método tal como se describe en esta solicitud de patente, se puede utilizar en la fabricación de un material de envasado tal como, por ejemplo, una película. Dicho material de envasado puede utilizarse, entre otras, en la industria alimentaria o farmacéutica.
Adicionalmente, el PHA obtenido por el método de obtención tal como se describe en esta solicitud de patente también se puede hidrolizar para obtener 3-hidroxiácido (RHA) , compuesto que puede utilizarse como precursor en la síntesis de productos farmacéuticos . Los monómeros y oligómeros de PHA son importantes componentes con considerables aplicaciones biotecnológicas . Se ha demostrado que algunos RHAs son compuestos con actividad antimicrobiana, insecticida, antiviral, e incluso se han descrito RHAs como agentes antitumorales como la hapalosína y el ONO-4007 (de Roo et al., 2002. Biotechnol. Bioeng. , 77: 717- 722) . Los RHAs son sintones para la fabricación de vitaminas, aromatizantes, antibióticos y feromonas . Así, por ejemplo, el (R) -3-hidroxibutirato se utiliza para la síntesis de Tíenamícína y Captopril (Ohashi y Hasegawa, 1992. In: Sheldrake G. . , A. N. Collins, J. Crosby, editors . Chirality in industry. New York: John Wiley & Sons. 1992, p. 269-278) y el (R) -4-ciano-3- hidroxibutirato es un intermediario muy importante en la fabricación del Lípítor, uno de los medicamentos de elección para el control de los niveles de colesterol (Roth, 2002. Prog. Meo!. Chem. , 40: 1-22). Ejemplos de otros compuestos sintetizables a partir de RHAs son el precursor de L-659,699 que es un inhibitor de la síntesis de colesterol, depsipeptidos con actividad antimicrobiana o fungicida, (~)_ tetrahidrolipstatina, una droga para el tratamiento de la obesidad, inmunosupresores como las estevastelins B y B3, el antibiótico globomicina, y pravastatina, para el tratamiento de la hipercolesterolemia (revisado en Ren et al. 2010. Appl . Microbiol. Biotechnol. 87:41-52) .
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el uso de las cepas de la invención para la extracción de cualquier compuesto sintetizado por la cepa de Pseudomonas putída KT2442, y Cupríavídus necator H16.
EJEMPLO 1. Materiales y métodos
1.1. Descripción de los microorganismos empleados.
Las cepas utilizadas se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1. Cepas empleadas.
Figure imgf000021_0001
1.2. Medios y condiciones de cultivo empleados.
El medio rico utilizado para cultivar las células fue el medio nutritivo (NB, Nutrient Broth) (Difco) o el medio Lysogeny Broth (LB) (Sambrook y Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
El medio mínimo utilizado para cultivar las células fue el medio denominado 0,1 N M63 (13,6 g KH2P04; 0,2 g (NH4)2S04; 0,5 mg FeS04 x 7 H20 por litro, pH 7) suplementado con 1 mM de MgS04 y una solución de elementos traza (Moldes et al., 2004. Appl . Envíron. Microbiol., 70: 3205-3212).
Los cultivos en medio liquido se realizaron en matraces en un agitador orbital (New brunswick scientific) con agitación (200- 250 rpm) y 30°C.
La bacteria Bdellovibrio bacteriovorus HD100 fue rutinariamente crecida en co-cultivos en tampón HEPES (25 mM de HEPES modificado con 2 mM CaCl2 · 2H20 y 3 mM MgCl2 · 3H20, pH 7,8) con P. putída KT2440 crecida en NB como presa durante 48 h a 30 °C y 250 rpm .
El crecimiento en medio liquido se determinó por turbidimetria a 600 nm (D060o) empleando un espectrofotómetro Beckman DU-520.
Durante periodos inferiores a un mes las cepas se conservaron a 4°C en placas de LB. Para la conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (v/v) y se mantuvieron a -80°C.
Para producir PHA en Pseudomonas putida KT2440 se cultivaron las células durante 24 h en medio M63 0, 1 N cuya composición es similar a la del M63 pero con 0,2 g/1 de (NH4)2S04 en lugar de 2 g/1, utilizando 15 mM de octanoato como única fuente de carbono (Moldes et al. 2004. Appl. Envíron. Microbiol. 70: 3205-3212) .
Para producir PHB en Cupriavidus necator H16 se cultivaron las células durante 24 h a 30°C en medio NB suplementado con gluconato sódico 0,2% (Pfeiffer et al. 2011. Molec. Microbiol. 82 : 936-951) .
1.3. Cálculo de la viabilidad de los microorganismos.
Para calcular la viabilidad de la bacteria predadora se hicieron diluciones seriadas de los cultivos de 10_1 a 10~7 en caldo nutritivo diluido que consiste en 0,8 g/1 de NB suplementado con 2 πιΜ CaCl2 y 3 mM MgCl2. A continuación 0,1 mi de la dilución apropiada de células se mezcló con 0,5 mi de bacteria presa P. putida KT2440 preparada para ser predada. Para ello la bacteria presa se precultivó en NB, se centrifugo y se resuspendio el sedimento celular en tampón HEPES a 10 de D060o- La mezclas de las distintas diluciones se agitaron y se sembraron en medio sólido DNB mediante el método de superposición de dos capas (Lambert et al. 2003. Environ. Microbiol. 5: 127-132) . Los predadores se cuentan como unidades formadoras de placas (ufp) en desarrollo en el césped de P. putida KT2440 después de 48 h de incubación a 30 ° C.
Para llevar a cabo este procedimiento se pueden utilizar en lugar de HEPES otro medio o tampón fisiológico como por ejemplo medio NB diluido 10 veces (DNB) .
Para calcular la viabilidad de las cepas presa, 10 μΐ de cada dilución del cultivo se plaqueó en medio LB sólido y se contaron las unidades formadoras de colonias (ufe) .
1.4. Cálculo de biomasa.
Las densidades celulares, expresadas en gramos de peso de célula seca (CDW) por litro, se determinaron gravimétricamente utilizando tubos Falcon tarados de 50 mi. Treinta mililitros de medio de cultivo se centrifugaron durante 45 min a 3800 x g y 4 °C. Los sedimentos celulares se liofilizaron durante 24 h en un liofilizador y se pesaron.
1.5. Crecimiento de B. bacteriovorus HD100 sobre cepas presa acumulando PHA.
30 mi de las cepas presa crecidas en medio de producción de PHA, se centrifugaron y se resuspendieron en 30 mi de tampón HEPES, siendo la viabilidad de 3·108 ufc/ml. Posteriormente, se infectaron con 3·107 ufp/ml de B. bacteriovorus HD100. Los co- cultivos se desarrollaron en matraces de 250 mi en un volumen final de 30 mi con tampón HEPES. 1.6. Recuperación del PHA liberado al medio extracelular .
Con el objetivo de purificar el PHA liberado al medio de cultivo se centrifugaron 30 mi de co-cultivo de B. bacteríovorus HD100 predando sobre P. putída KT2440 durante 24 horas, y el sedimento resultante se resuspendió directamente en 1 mi del solvente orgánico etil-acetato . Después de la incubación con el solvente orgánico a temperatura ambiente y con agitación suave, se centrifugó y se precipitó el sobrenadante con 10 volúmenes de metanol. Tras la evaporación del alcohol, se cuantificó el contenido de PHA extraído .
1.7. Cuantificación de PHA.
Para cuantificar el PHA presente en los sedimentos celulares se tomaron de 5 a 10 mg de muestra liofilizada que se metanolizaron durante 4 h a 100°C en presencia de 2 mi de cloroformo y 2 mi de metanol: ácido sulfúrico (85:15, v:v) con 0,5 mg/ml de ácido metil benzoico como estándar interno. Tras enfriar los tubos, se añadió 1 mi de agua, se mezcló por agitación vigorosa (vórtex) y se separaron las fases centrifugando suavemente. La fase orgánica obtenida se analizó en un sistema cromatográfico compuesto por un cromatógrafo de gases Agilent (Waldbronn, Alemania) serie 7890 A acoplado a un detector de masas 5975. 1 μΐ de la fase orgánica fue inyectada en el cromatógrafo con un split 50:1. La separación de los compuestos se llevó a cabo en una columna capilar HP5 MS (5% fenil-95% metil siloxano, 30 m x 0,25 mm i.d. x 0,25 mm) . Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 0,9 ml/min. Las temperaturas del inyector y la línea de transferencia fueron de 275 y 300°C, respectivamente. El programa de temperatura de la columna fue el siguiente: temperatura inicial 80°C durante 2 min tras lo cual se aplicó una rampa de 10°C/min hasta alcanzar los 200°C. El espectro de masas se recogió en modo full sean (m/z 40-550) . El análisis cuantitativo se llevó a cabo calculando los factores de respuesta de los monómeros con respecto al estándar interno 3- metilbenzoato . Para el cálculo de los factores se utilizaron mezclas de concentraciones conocidas de PHA, obteniéndose para cada uno de los monómeros cuantificados un factor de respuesta cuyo coeficiente de variación no superó el 5%. EJEMPLO 2. Producción de PHA en Pseudomonas putida. KT2440.
Para estudiar la producción de PHA en la cepa de Pseudomonas putida KT2440 se cultivó la bacteria en una sola fase fermentativa en un medio mínimo según se describe en el Ejemplo 1.
El crecimiento en condiciones de producción de plástico en una sola fase fermentativa permite crecer a partir de una única fuente de carbono (ácido octanoico) y alcanzar un alto rendimiento biomasa/PHA.
Se comprobó la capacidad de P. putida KT2440 para crecer y producir PHA en un medio mínimo limitado en nitrógeno, con ácido octanoico como única fuente de carbono. La cepa es capaz de crecer y acumular PHA en esas condiciones fermentativas (Tabla 2). Este resultado fue confirmado mediante la cuantificación por GC-MS del contenido intracelular de PHA. Esto demostró que la cepa acumula PHA en las condiciones de crecimiento probadas (Tabla 2 ) .
Tabla 2. Muestra el valor de densidad óptica (D060o nm) ; el contenido intracelular de PHA; el recuento de células viables (ufc/ml) y la biomasa (g/1) correspondientes a células crecidas en una fase fermentativa a las 23 h de cultivo de la cepa Pseudomonas putida KT2440.
P. putida KT2440
D060o 7 ± 0.5
Contenido intracelular
0.84 ± 0.1
de PHA (g/1)
Biomasa (g/1) 1.3 ± 0.11
Viabilidad (ufc/ml) 3-108 ufc/ml EJEMPLO 3. Lisis de P. putida. KT2440 mediada por B . bacteriovorus HD100
El sistema Utico del presente ejemplo consiste en el crecimiento de B. bacteriovorus HD100 sobre P. putida KT2440 previamente crecida en las condiciones de producción de PHA descritas en el Ejemplo 2.
A lo largo de la incubación del co-cultivo se observa el crecimiento de la bacteria predadora provocando la lisis celular de la bacteria presa. A las 24 h de infección, la viabilidad de la presa disminuye 4 órdenes de magnitud (de 3·108 a 4·104 ufc/ml) mientras que la progenie de B. bacteriovorus HD100 aumenta más de dos órdenes de magnitud (de 3·107 a 1.5-109 ufp/ml) (Tabla 3) .
La cuantificación del PHA liberado al medio extracelular como consecuencia de la lisis de P. putida KT2440 tras 24 h de infección resultó ser similar al contenido de PHA al inicio de la infección con el predador (0,45 g/1 y 0,84 g/1, respectivamente), es decir, un 50 % del PHA acumulado por la presa (Tabla 3 ) .
A las 24 h de cocultivo también se liberan 0.2 + 0.02 g/1 de RHAs : monómeros, dimeros y trímeros (Tabla 3) .
Con el objetivo de purificar el PHA liberado al medio de cultivo se centrifugaron 30 mi del co-cultivo de B. bacteriovorus HD100 sobre P. putida KT2440 y se resuspendieron directamente en etil- acetato. Tras la precipitación del polímero con metanol, se cuantificó el contenido de PHA extraído, siendo de 0.4 g/1 con una pureza del 99%. Este resultado indica que el proceso aquí descrito permite la recuperación de casi el 100% del PHA previamente liberado al sobrenadante del cultivo, lo que corresponde a un 50% del PHA producido por P. putida KT2440. O Cn O Cn Cn
TABLA 3.
Contenido PHA Productos de hidrólisis del PHA Viabilidad de la presa Viabilidad de Bdellovibrio en el sedimento en el sobrenadante 24 h (g Γ1) 24h(108cfumr1) 24h(108pfumr1)
24 h (g Γ1) (RHAs)
Pseudomonas pulida
KT2442(Bd-)a 1.33 ±0.11 0.84 ±0.1 0.75 ±0.0 < 0.05 3.6 ±1.5 0
KT2442 + Bd 1.33 ± 0.11 0.84± 0.1 0.45±0.1c 0.2± 0.03 0.001 ± 0.0 15.4 ± 3 Cultivos control de las presas sin depredador
A tiempo cero, la viabilidad de las presas es de 3-108 ufc/ml
Los RHAs se purificaron según un método descrito anteriormente (Ruth et al., 2007. Bíomacromolecules, 8: 279-286) . Brevemente, los RHAs se pueden separar mediante una columna cromatográfica de C18 de fase reversa y las fracciones resultantes se acidifican, se realizan extracciones liquido-líquido y se evapora el sovente, obteniendo así el RHA puro. El rendimiento de este método es superior al 75%.
EJEMPLO 4. Producción de PHB en Cuprla.vld.us necator H16
Para estudiar la producción de PHB en la cepa de Cupriavidus necator H16 se cultivó la bacteria en una sola fase fermentativa en un medio rico según se describe en el Ejemplo 1. La cepa es capaz de crecer y acumular 0.9 g/1 PHB en esas condiciones fermentativas .
EJEMPLO 5. Lisis de Cupriavidus necator H16 mediada por B. bacterlovorus HD100
El sistema lítico del presente ejemplo consiste en el crecimiento de B. bacterlovorus HD100 sobre C. necator H16 crecida en condiciones de producción de PHB (ver Ejemplo 4) .
La cuantificación del PHB liberado al medio extracelular como consecuencia de la lisis de C. necator H16 tras 24 h de infección con el predador resultó ser igual o superior al 50% del total del PHB previamente acumulado por la presa (0.5 y 0.9 g/1 PHB, respectivamente).
Con el objetivo de purificar el PHB liberado al medio de cultivo se centrifugaron 30 mi del co-cultivo de B. bacterlovorus HD100 sobre C. necator H16 y se resuspendieron directamente en 1 mi de cloroformo. Tras la precipitación del polímero con metanol, se cuantificó el contenido de PHB extraído, siendo de 0.15 g/1 con una pureza del 99%.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de extracción de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y obtenido por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho procedimiento de extracción porque comprende mezclar la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior con una bacteria predadora en un medio que comprende una fuente de Ca y Mg .
2. Procedimiento de extracción según la reivindicación anterior, donde la bacteria predadora pertenece al grupo de los BALOs .
Procedimiento de extracción según la reivindicación 2, dond' bacteria predadora es Bdellovíbrío bacteríovorus HD100.
4. Procedimiento de extracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la bacteria productora presa es una bacteria Gram-negativa .
Procedimiento de extracción según la reivindicación
bacteria Gram-negativa es Pseudomonas putída KT2440.
Procedimiento de extracción según la reivindicación
bacteria Gram-negativa es Cupríavídus necator H16.
7. Procedimiento de extracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionar la bacteria predadora a un medio de cultivo que comprende una fuente de Ca y Mg donde se encuentra la bacteria productora presa que contiene el bioproducto en su interior.
8. Método de obtención de un bioproducto seleccionado del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA), hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas por fermentación de una bacteria productora presa, caracterizado dicho método porque comprende: a) cultivar la bacteria productora presa en un medio de cultivo para producir el bioproducto,
b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
c) aislar el bioproducto.
9. Método de obtención según la reivindicación 8, donde la etapa a) comprende cultivar Pseudomonas putída KT2440 en un medio mínimo de cultivo para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA.
10. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde la etapa c) comprende aislar PHA.
11. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, donde la etapa c) comprende aislar el hidrolizado de PHA.
12. Método de obtención según la reivindicación 8, donde el bioproducto se selecciona del grupo que consiste en polihidroxialcanoato (PHA) , hidrolizado de PHA y una cualquiera de sus mezclas, y el método comprende:
a) cultivar la bacteria productora presa en un medio rico de cultivo en el que se produce el bioproducto,
b) extraer el bioproducto obtenido en la etapa a) mediante el procedimiento de extracción descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
c) aislar el bioproducto.
13. Método de obtención según la reivindicación 12, donde la etapa a) comprende cultivar Cupríavídus necator en un medio rico de cultivo (NB) suplementado con gluconato sódico para producir una mezcla de PHA e hidrolizado de PHA.
14. Método de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, donde la etapa c) comprende aislar PHA o el hidrolizado de PHA.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2370947A1 (es) * 2009-12-23 2011-12-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la produccion de polihidroxialcanoatos en pseudomonas putida kt2440.

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANASUNDARI, B. ET AL.: "Isolation and recovery of microbial polyhydroxyalkanoates.", POLYMER LETTERS, vol. 5, no. 7, 2011, pages 620 - 634 *
MARTINEZ VIRGINIA ET AL.: "Identification and Biochemical Evidence of a Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoate Depolymerase in the Bdellovibrio bacteriovorus. Predatory Hydrolytic Arsenal.", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY SEP, vol. 78, 2012, pages 6017 - 6026. *
MARTINEZ VIRGINIA ET AL.: "Reward for Bdellovibrio bacteriovorus for preying on a polyhydroxyalkanoate producer.", ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 15, no. 4, 2013, pages 1204 - 1215. *

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