WO2014016504A1 - System de delivrance de principes actifs a base de lectine - Google Patents

System de delivrance de principes actifs a base de lectine Download PDF

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WO2014016504A1
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xcl
lectin
variant
agent
protein
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PCT/FR2013/051751
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Laurent Paquereau
Gregori GROSS
Caroline LADURANTIE
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Universite Paul Sabatier Toulouse Iii
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Publication date
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    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi

Definitions

  • the present invention relates generally to a delivery system and more particularly to a lectin-based delivery system.
  • the invention finds applications, in particular, in the treatment of cancer.
  • proteins have been used as a drug delivery system including ferritin / apoferritin, capsids of different viruses, albumin, gliadin etc. These protein delivery systems have various forms such as microspheres, nanoparticles, hydrogels, films and protein cages.
  • Protein-based delivery systems and especially protein-cages appear as a promising delivery system that avoids some disadvantages of polymer-based delivery systems due to their uniform size, bioavailability and biodegradability (Maham et al., 2009).
  • these delivery systems must be designed to deliver therapeutic agents specifically to the cells to be treated in order to limit treatment-related side effects.
  • the delivery systems must confine the therapeutic agents within their protein cage and release them once the target to be treated is reached.
  • the family of fungal sporocarp lectins also called group 2 fungus lectins, is a family of fungal lectins with both sequence and structure homology.
  • sequence homologies of members of this lectin family are widely described in Birck C et al. (2004), Trigueros et al. (2003) and Khan et al. (201 1).
  • XCL Xerocomus chrysenteron lectin
  • ABL Amaricus bisporus lectin
  • BEL Boletus edulis
  • This family of fungal sporocarp lectins comprises, in particular, the lectin of Agaricus bisporus (ABL), the lectin of Arthrobotrys oligospora (AOL), the lectin of Boletus edulis (BEL), the lectin of Gibberella zeae (GZL), the Xerocomus chrysenteron lectin (XCL), Pleurotus cornucopiae lectin (PCL) and Paxillus involutus lectin (PIL) (Birck et al., 2004) (Crenshaw et al., 1995).
  • ABL Agaricus bisporus
  • AOL lectin of Arthrobotrys oligospora
  • BEL Boletus edulis
  • GZL Gibberella zeae
  • XCL Xerocomus chrysenteron lectin
  • PCL Pleurotus cornucopiae lectin
  • the inventors have succeeded in confining an active agent within the cavity of a fungal sporocarp lectin multimer and have shown that the thus-contained active agent can then be delivered to a biological target.
  • fungal sporocarp lectin as a containment complex makes it possible to eliminate, or at least mitigate, all or some of the disadvantages of delivery systems of the prior art.
  • these lectins have an affinity and specificity for an epithelial tumor marker.
  • ABL lectin
  • the lectins of this family and their variants are easily produced recombinantly and thus excessively high levels of production and purification (g / liter) can be achieved.
  • lectins are particularly stable over time (several months at 4 ° C, several weeks at room temperature) and are very resistant to harsh physicochemical conditions (SDS, temperature, ionic strength).
  • a first aspect of the invention therefore relates to the use of a fungal sporocarp lectin or fungal sporocarp lectin variant for delivery of an active agent which is a therapeutic agent or an agent. from diagnosis to a biological target.
  • the invention also relates to a complex comprising an active agent which is a therapeutic agent or a diagnostic agent and a fungal sporocarp lectin or fungal sporocarp lectin variant.
  • XCL XCL
  • a lectin particularly suitable for use as a delivery system have improved containment capacity while retaining their capacity. to release the active agent once the target is reached.
  • the invention relates to this type of variant, specifically an XCL variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • Another aspect of the invention also provides:
  • composition comprising a complex according to the invention and a pharmaceutically acceptable excipient
  • a fungal sporocarp lectin, a variant thereof or a complex according to the invention for use in a method of treatment of the human or animal body and, in particular, in a method of treating cancer.
  • the inventors have succeeded in controlling the structuring of a multimer of certain fungal sporocarp lectins so that an active agent can be stably inserted into their cavity and released once the multimeric-active agent complex has reached biological target given.
  • the invention thus relates to the use of a fungal sporocarp lectin or fungal sporocarp lectin variant for delivery of an active agent which is a therapeutic agent or a diagnostic agent to a biological target.
  • therapeutic agent refers to an agent that has pharmacological activity or a health benefit when administered in a therapeutically effective amount.
  • the therapeutic agent is a chemotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent may be a chemotherapeutic cytotoxic agent such as, for example, a DNA damaging agent, an antimetabolite, an antimitotic, or a Vinca alkaloid (Cancer immunotherapy: immune suppression and tumor growth, George C. et al.) (Chemotherapy at Dorland's Medical Dictionary)).
  • a chemotherapeutic cytotoxic agent such as, for example, a DNA damaging agent, an antimetabolite, an antimitotic, or a Vinca alkaloid (Cancer immunotherapy: immune suppression and tumor growth, George C. et al.) (Chemotherapy at Dorland's Medical Dictionary)).
  • the DNA damaging agents may be alkylating agents such as cyclophosphamide, chlorambucil, chlormethine, busulfan, treosulfan and thiotepa, topoisomerase inhibitors such as camptothecin, irinotecan and topotecan or amsacrine , etoposide, etoposide phosphate and teniposide or platinum-based compounds such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin.
  • alkylating agents such as cyclophosphamide, chlorambucil, chlormethine, busulfan, treosulfan and thiotepa
  • topoisomerase inhibitors such as camptothecin, irinotecan and topotecan or amsacrine
  • etoposide, etoposide phosphate and teniposide platinum-based compounds
  • platinum-based compounds such as cisplatin, carbo
  • anti-tumor antibiotics examples include anthracyclines such as doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, valrubicin or mitomycin.
  • anti-metabolites are folate antagonists such as methotrexate, purine antagonists such as fludarabine and pyrimidine antagonists such as 5-fluorouracil.
  • antimitotics examples include taxanes such as paclitaxel, and docetaxel.
  • Vinca alkaloids examples include vincristine, vinblastine, vinorelbine and vindesine.
  • diagnosis agent refers to an agent that when administered in an effective amount can identify whether a subject is suffering or likely to develop a particular condition.
  • the diagnostic agent may be a radioactive agent or a fluorescent agent.
  • the diagnostic agent may for example comprise a radioisotope of iodine (I), such as 1231, 1251, 131 1, etc. , barium (Ba), gadolinium (Gd), technetium (Te) including 99Tc, phosphorus (P) including 31 P, iron (Fe), manganese (Mn), thallium (Tl), chromium (Cr), including 51 Cr, carbon (C) including 14C or fluorescently labeled compounds.
  • I iodine
  • barium Ba
  • gadolinium Gd
  • Te technetium
  • P including 31 P
  • iron (Fe) iron
  • Mn manganese
  • Tl thallium
  • Cr chromium
  • C carbon
  • the diagnostic agent is not or only slightly detectable when confined in the lectin multimer and only becomes significantly detectable once it is released at the biological target.
  • the active agent according to the invention is a therapeutic agent.
  • variant refers herein to a protein having an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence of the protein of which it is the variant and which has an ability to confine an agent. active substantially equal to or greater than that of the protein of which it is the variant.
  • the variant of a protein has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the amino acid sequence of the protein of which it is the variant.
  • Percent identity refers to comparisons of amino acid sequences and is determined by comparing two optimally aligned sequences on a comparison window, wherein the portion of the amino acid sequence in the comparison window may include additions or deletions (i.e. deviations) from the reference sequence (which does not include addition or deletion) for optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage can be calculated by determining the number of positions where an identical amino acid residue is found in both sequences to arrive at the total number of positions in the comparison window and multiplying the result by 100 to reach the percentage of the amino acid residue. sequence identity.
  • the percentage can be calculated by determining the number of positions where an identical amino acid residue is found in both sequences or an amino acid residue is aligned with a gap to reach the number of corresponding positions, dividing the number of corresponding positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result by 100 to reach the percentage of sequence identity.
  • An optimal alignment of sequences for comparison can be achieved, for example, by the local alignment algorithm of Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, by the algorithm of Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, by the similarity search method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad.
  • the ability to confine an active agent can be measured according to the fluorescein method described in the examples.
  • the fungal sporocarp lectin of the invention is selected from the group consisting of ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL and PIL or a variant thereof.
  • the fungal sporocarp lectin is XCL, ABL, BEL or a variant thereof.
  • XCL, Xerocomus chrysenteron lectin is a protein belonging to a family of sporocarp fungal lectins that has been isolated from an edible fungus by humans, Xerocomus chrysenteron.
  • This protein known for its insecticidal activity, has in particular been described by Wang M et al. (2002), Trigueros V et al. (2003) and Birck C et al. (2004).
  • amino acid sequence of this protein is SEQ ID NO: 1.
  • XCL has the isoform XCL2 of SEQ ID NO: 5.
  • Birck C et al. (2004) showed that XCL appears, in solution, in the form of a tetrameric structure, generating in its center a cavity whose walls are delimited by each monomer. This same structure is found for the lectin of Amaricus bisporus, ABL (Carrizo M. et al (2004)) and Boletus edulis, BEL (Michele Bovi et al. ((201 1)).
  • mutants of XCL of which threonine 12 has been replaced by cysteine and / or alanine 38 has been replaced by cysteine. These variants improve the maintenance of the tetrameric assembly of XCL in its closed form while being able to control its opening.
  • the inter-chain disulfide bridge of the variant A38C provides two types of structural constraints.
  • this covalent bond reduces the freedom of movement of the loops closing the access to the cavity of the protein cage which prevents leakage of the confined active agent.
  • the addition of the bonds between the monomers implies that the dissociation of the oxidized variant can take place only if the four interfaces are broken.
  • This variant therefore has its highly stabilized tetrameric structure.
  • the invention therefore relates to an XCL variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the invention thus relates to the use of an XCL variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for delivery of an active agent which is a therapeutic agent or a diagnostic agent to a biological target.
  • the XCL variant has the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the biological target is a cancer cell.
  • TF antigen is poorly or not expressed in normal tissues (Springer GF (1984) and Cao Y et al (1996)).
  • the specificity of the lectins of the invention for TF allows the targeting thereof to cancer cells.
  • the invention also relates to a method for delivering an active agent which is a therapeutic agent or a diagnostic agent to a biological target in which the said active agent is brought into contact with a sporocarp fungal lectin or a variant thereof. this.
  • the active agent is confined in the sporocarp fungal lectin multimer or a variant thereof.
  • the present invention also relates to a complex comprising an active agent which is a therapeutic agent or a diagnostic agent and a fungal sporocarp lectin or fungal sporocarp lectin variant.
  • the active agent is a therapeutic agent or a diagnostic agent as defined above.
  • the fungal sporocarp lectin or the lectin variant of the complex according to the invention is in the form of a multimer.
  • the lectin multimer has an internal cavity in which the active agent is located.
  • the multimer is a homomultimer.
  • the multimer may be a heteromultimer.
  • the heterodimer is composed of fungal sporocarp lectin and a variant of this lectin.
  • the multimer of the complex according to the invention is a tetramer, more preferably a homotetramer.
  • the complex of the invention comprises a fungal sporocarp lectin selected from the group consisting of ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL and PIL or a variant thereof.
  • the fungal sporocarp lectin of the complex of the invention is XCL, ABL or a variant thereof.
  • the fungal sporocarp lectin of the complex according to the invention is XCL or an XCL variant.
  • the fungal sporocarp lectin of the complex of the invention is an XCL variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ. ID NO: 4.
  • the invention also relates to a process for producing a complex according to the invention characterized in that it comprises a step of contacting fungal sporocarp lectin or sporocarp fungal lectin variant with an active agent which is a therapeutic or diagnostic agent.
  • the method of making the complex may further comprise a step of removing the active agent that has not been unconfined.
  • the method may comprise a step of reducing a fungal sporocarp lectin or a variant thereof prior to the contacting step with the active agent and an oxidation step after the step of contact with the active agent.
  • This step allows the creation of disulfide bridges to stabilize the lectin multimer, especially for modified variants with one or more cysteines, to be able to generate such bridges.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a complex according to the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients are selected according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration from the excipients usually employed.
  • composition according to the invention may for example be administered by injection, by spraying or orally.
  • composition according to the invention may for example be in liquid, solid, gel or freeze-dried form.
  • the active agent is advantageously present at physiologically effective doses.
  • these pharmaceutical compositions are intended for non-systemic administration, for example enterally.
  • the present invention also relates to a complex according to the invention for use in a method of treating the human or animal body.
  • treatment or treatment both refer to curative treatment and preventative or prophylactic measures to prevent or slow down the disease or the targeted disease state.
  • Those in need of treatment include those already affected by the disease as well as those who may have the disease or who need to be prevented from the disease.
  • the subject to be treated may have been diagnosed as having the disease or may be predisposed or susceptible to having the disease.
  • the invention also relates to a method of treating a subject comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a complex of the invention.
  • the invention also relates to the use of a complex according to the invention for the manufacture of a medicament.
  • the invention relates to a complex according to the invention for use in a method of treating cancer.
  • the cancer is selected from the group consisting of bladder cancer, colorectal cancer, gastrointestinal cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, melanoma and lung cancer.
  • the cancer is selected from the group consisting of colorectal cancer, bladder cancer, gastrointestinal cancer, and ovarian cancer.
  • the invention also relates to a method of treating cancer in a subject comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a complex of the invention.
  • the invention also relates to the use of a complex according to the invention for the manufacture of a medicament for treating cancer.
  • the invention also relates to a method of administering an active agent to a subject comprising the step of administering to said subject a complex according to the invention.
  • Administration can be done orally or by injection.
  • FIG. 1 represents the minimum and maximum distances between two e-amine groups exposed on the surface of XCL and belonging to different protein subunits
  • FIG. 2 represents the emission spectra of FITC-XCL and RITC-XCL.
  • A- Continuous curves Emission spectrum of FITC-XCL (max 520nm) and RITC-XCL
  • FIG. 3 represents the emission spectra of FITC-A38C and RITC-A38C
  • A. Continuous Curves Emission Spectrum of FITC-A38C (Xmax 520nm) and RITC-A38C (Xmax 580nm); Discontinuous curves: deconvolution of the emission spectrum obtained in (B).
  • B- Continuous curve numerical addition of the spectra obtained in (A) for FITC-A38C and RITC-A38C;
  • Discontinuous curve emission spectrum obtained by mixing FITC-A38C and RITC-A38C;
  • FIG. 4 shows the evolution of the intensity ratio 580 nm / 520 nm as a function of the XCL protein concentration.
  • FIG. 5 represents the variation of the elution volumes of the exclusion chromatography as a function of the XCL concentrations;
  • FIG. 6 represents the kinetics of the exchange by measurement of FRET at 580 nm for XCL
  • FIG. 7 represents the fluorescein confinement in XCL and the variant
  • Figure 8 shows the relative fluorescence intensities of XCL Trp at 346 and 330 nm as a function of temperature
  • All mutants were made using the Quickchange mutagenesis kit (Stratagene).
  • the A38C and T12C mutants of XCL were constructed from the cDNA of the native XCL protein. Proteins were produced and purified as described in the literature (Trigueros et al. (2003)). A further purification step was carried out on size exclusion chromatography (Sephacryl S300) equilibrated with 50mM phosphate buffer, 100mM NaCl, pH 7.2 at a flow rate of 3 ml.mn -1 .
  • Vivaspin 15R 30,000 MWCO (Sartorius stedim) column The mutant A38C was oxidized by incubation for 8 h in 50mM phosphate buffer, 100mM NaCl, pH 8.5 and 10mM oxidized glutathione (GSSG) Excess glutathione was removed on a column of PD-10 sephadex G-25M (GE Healthcare), equilibrated with 50mM phosphate buffer, 100mM NaCl, pH7.2.
  • XCL or A38C (30 ⁇ ) are incubated at 25 ⁇ for 1 h with stirring in a buffered medium consisting of phosphate buffer (50 mM, pH 9) and either FITC (1 mM) or RITC (1 m M). The reaction is stopped by addition of Tris-HCl (10 mM, pH 9). The labeled proteins are purified on PD-10 sephadex G-25M columns (GE Healthcare) previously equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 8.5). The stoichiometry of the labeling is determined spectrophotometrically at pH 8.5.
  • Fluorescence energy transfer was used to highlight the exchange of XCL monomers.
  • the exchange reaction is initiated by mixing the same volume of XCL-RITC (1 ⁇ l or buffer only as reference) and XCL-FITC (1 ⁇ l) at 25 ° C. in 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, pH 8.5. After one hour of incubation, the emission spectrum of the sample excited at 490 nm is recorded by spectrofluorimetry (Photon Technology International QM-4). The same experiments were performed with A38C-RITC and A38C-FITC.
  • the exchange rate of the subunits was measured by the same technique.
  • the reaction is initiated by mixing the same volume of XCL-RITC (1 ⁇ l) and XCL-FITC (1 ⁇ l) at 25 ° C. in 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, pH 8.5.
  • the excitation is carried out at 468 nm and the fluorescence emission at 580 nm is recorded every 0.5 seconds.
  • the fluorescence intensity is normalized using the equation:
  • a represents the proportion of slow dissociation molecules, the constant kinetics of slow dissociation and the constant kinetics of rapid dissociation.
  • Size exclusion chromatography experiments were performed on a GE-Healthcare Superose 12 PC 3.2 / 30 column. The columns are pre-balanced in the buffer tested, namely 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, pH 7.2 or pH 4.4 in the absence or in the presence of 0.003% of SDS. The flow rate is 0.5m L / min. BSA and RNase A are used as a size marker. containment
  • Confinement experiments are performed by incubating wild-type protein (XCL) or mutants (A38C) with the test molecule.
  • XCL wild-type protein
  • A38C mutants
  • an oxidation step is carried out in the presence of GSSG in a 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, pH 7.2, OVN.
  • the GSSG is then removed on a PD-Sephadex G-25M column (GE Healthcare) pre-equilibrated in 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, pH 8.5.
  • the eluate is concentrated to 1 ml on Vivaspin 15R 30,000 MWCO (Sartorius stedim).
  • a batch of A38C is reduced to TCEP (argon) with added NaOH for a final pH of 8.5.
  • the proof of concept of confinement was performed with fluorescein at a concentration of 10mM.
  • the incubation is carried out for 1 h at 25 ° C. in 50 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl.
  • For mutant A38C reduced a new oxidation step is performed at GSSG, OVN.
  • Free fluorescein is removed on a Sephadex G-25M PD-10 column (GE Healthcare). The sample is then concentrated on Vivaspin 15R 30,000 MWCO (Sartorius stedim). The measurement of the confinement is carried out by spectrophotometry.
  • XCL is organized as a tetramer with an inner cavity.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to confine a molecule in this cavity without a covalent bond between the molecule and XCL.
  • the inventors have designed XCL variants capable of remaining in tetrameric form for a long time.
  • the inventors have also shown that the confined molecule can be released under conditions similar to those encountered in target cells.
  • the inventors In order to increase the stability of the tetrameric structure of XCL, the inventors have designed XCL variants whose monomers are covalently bound. The inventors have tested a strategy consisting of the formation of disulfide bridges between the monomers by substituting amino acid residues of wild-type XCL with cysteine. To minimize the number of substitution the inventors had to determine the amino acids that were close to their counterparts in the opposite monomer. As revealed by the 3D structure of XCL, two amino acids have such a property. The distance between the beta carbons of threonine 12 and its counterpart is 3.9 angstroms and that between alanine 38 and its counterpart is 3.4 angstroms.
  • variant A38C The particularity of variant A38C is that the presence of two additional disulfide bridges results in stabilization of the entire tetramer. If we consider that the structure of XCL is a square in which each monomer is a wedge, the disulphide bridges A38C will link them diagonally. Dissociation of oxidized A38C tetramers will only be possible if all interfaces are broken. A strong stabilization of the tetramer is envisaged making its dissociation very unlikely.
  • Clone A38C was obtained by site-directed mutagenesis using the XCL plasmid as a template and the protein produced and purified using the same protocol as that used to produce XCL (Trigueros et al (2003)). A yield of 25 mg of purified protein per liter of culture was obtained. The last part of the protocol consisted of a 12-hour oxidation step in the presence of 10 mM of oxidized glutathione. This step is required to produce disulfide bridges between the monomers. The formation of these covalent bonds was verified by SDS-PAGE. Two SDS-PAGEs have been prepared. Beta- mercaptoethanol was added to the samples in the first gel so no beta-mercaptoethanol was added to the second gel.
  • These species correspond to 2 monomers covalently linked by the creation of disulfide bridges. It represents 90% of the species in the case of A38C. Another band which represents 5% of the species and has a molecular weight of 21 kDa is also observed. This band corresponds to monomers from unoxidized species. The third band, which also represents 5% of the species, has an apparent molecular mass of 60 kDa corresponding to the tetrameric species. All these results show that the strategy of rational modification of XCL by genetic engineering made it possible to obtain an oxidation rate of approximately 90%.
  • a T12C variant was produced in the same manner as A38C by site-directed mutagenesis using the XCL plasmid as a template. Using the same protocol, 10mg of protein per liter of culture was produced. The oxidation rate of the T12C variant was searched using the same method by SDS-PAGE as for A38C. These rates were compared with those obtained with the variant A38C.
  • Several oxidative conditions were tested with different concentrations of reduced glutathione. In fact, the addition of reduced glutathione prevents the formation of incorrect bonds by allowing the reduction of disulfide bridges which could be insufficiently stabilized by other interactions.
  • the oxidation rate of each sample was tested by SDS-PAGE under non-reducing conditions after heating the samples for 5 min at 95 ° C. As for A38C, 3 bands were observed for T12C. The oxidation rate obtained for T12C is therefore comparable to that obtained for A38C. However, when the reduced glutathione is added to the oxidation buffer at a concentration of 10 mM, a sharp decrease in oxidation rate was observed with respect to A38C. This result shows that the additional oxidized T12C disulfide bridge is less stable than the A38C disulfide bridge.
  • XCL is organized in solution in the form of a tetramer.
  • the inventors have determined whether there exists a spontaneous exchange between the tetrameric forms and any dimeric or monomeric minority forms.
  • the oligomerization equilibrium of the XCL protein was characterized by measuring the appearance of Forster-type resonance energy transfer (FRET) between two XCL populations labeled separately either with FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) or RITC (Rhodamine IsoThioCyanate).
  • FRET Forster-type resonance energy transfer
  • the minimum and maximum distances between two e-amine groups exposed to the surface and belonging to different protein subunits are respectively 21 and 67 angstroms and therefore both in the range of distance compatible with the appearance of FRET.
  • the mixture of FITC-XCL and RITC-XCL was diluted to different concentrations and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the fluorescence spectrum was recorded with 468 nm light excitation.
  • a I580 / I520 ratio was calculated for each concentration and read as a function of the XCL concentration ( Figure 4).
  • a transition in the intensity of energy transfer occurs at a concentration close to one micromolar. Obviously, the titration curve is not complete until saturation is reached for the points of highest concentration. Due to the solubility limit of XCL and the labeling protocol, protein concentrations can not exceed 10 ⁇ in this experiment.
  • XCL can follow two pathways of dissociation.
  • the tetramer ABCD formed by XCL can dissociate in two different ways: to AB and CD dimers or to AD and BC dimers.
  • the inventors used fluorescein to validate the confinement capacity of the XCL tetramer.
  • Fluorescein (279 to 3 ) has the advantage of being small and very soluble in aqueous solvent (it is therefore possible to place at high concentration during confinement). In addition, it absorbs visible light at 51 1 nm, which allows it to be detected. The inventors have preferred to follow the absorbance of this molecule rather than its fluorescence. Indeed, the Fluorescence of a molecule is dependent on its chemical environment, therefore, once confined, fluorescein could see its fluorescence yield significantly altered.
  • the inventors incubated the protein (15 ⁇ l) with fluorescein (10 mM) and then separated the protein from the unconfined fluorescein molecules by two successive gel filtration columns. Previously, the inventors verified that if these two columns are carried out on the fluorescein solution at 10 m, no residual free fluorescein is detected. The fluorescein detected during the confinement is necessarily bound to the protein or contained by the latter.
  • the A38C protein was also used to carry out the confinement, the protocol being identical except that the protein which is initially oxidized is reduced before being placed in the presence of the fluorescein solution, then in a second oxidized phase. overnight in the presence of an oxidizing agent, oxidized glutathione.
  • This protein is noted A38R in Figure 7.
  • Fluorescein can bind nonspecifically on the surface of the protein or in the cavity. Maintaining containment for 4 days indicates that fluorescein is not bound in a labile manner, otherwise it would dissociate after this time.
  • XCL originating from a po ⁇ kilothermal (or heterothermal) organism that is to say non thermally regulated endogenously, the behavior of the tetramer as a function of temperature and in particular its behavior below 45 ⁇ was analyzed.
  • the inventors have studied the behavior of XCL under denaturing chemical conditions close to that encountered in lysosomes.
  • the analysis was carried out by exclusion chromatography at acidic pH (pH 4.4). It appears that the peak elution of XCL in these denaturing conditions is shifting to larger elution volumes reflecting the appearance of a smaller size.
  • SDS acidic pH
  • the elution peak moves to the elution volume of RNAse A which has a molar mass close to the XCL monomer.
  • the decrease in pH thus leads to the dissociation of the tetramer to dimer, and with a very small amount of detergent these dimers are dissociated into monomers.
  • A38Cox has an elution volume comparable to that of XCL.
  • the addition of the disulfide bridge therefore increases the stability of the protein assembly.
  • the addition of 0.003% of SDS leads to the dissociation of the tetramer into dimers, consisting of monomers connected to each other by the disulfide bridge.
  • Lysosomes are subcellular organelles of degradation. Their content is acidic, reducing and contains acid hydrolases, protein-degrading proteases that are addressed to them. The results obtained show that under these reducing and acidic conditions, XCL or its mutant A38Cox are dissociated into dimers, allowing the release within the lysosomes of the active agents confined in the cavity.
  • Carrizo ME Capaldi S, Perduca M, Irazoqui FJ, GA Nores, Monaco HL.
  • the antineoplastic lectin of the common edible mushroom (Agaricus bisporus) has two binding sites, each specified for a different configuration at a single epimeric hydroxyl.J Biol Chem. 2005 Mar 18; 280 (1 1): 10614-23. Epub 2004 Dec 13. Crenshaw, R.W., S.N. Harper, M. Moyer and L. S. Privalle, 1995. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding a lectin gene from Agaricus bisporus. Plant Physiol., 107: 1465-1466.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant de celle-ci pour la délivrance d'un agent actif à une cible biologique.

Description

SYSTEM DE DELIVRANCE DE PRINCIPES ACTIFS A BASE DE LECTINE
Domaine Technique
La présente invention se rapporte de manière générale à un système de délivrance et plus particulièrement à un système de délivrance à base de lectine.
L'invention trouve des applications, en particulier, dans le traitement du cancer.
Art Antérieur
De récents développements dans le domaine pharmaceutique ont porté sur des systèmes de délivrance à base de protéines. Ces plateformes à base de protéines sont de très bons candidats pour une utilisation dans le domaine médical. En effet, ces systèmes montrent de bonnes biocompatibilité et biodégradabilité couplées à une faible toxicité.
Un grand nombre de protéines a été utilisé comme système de délivrance de médicaments dont la ferritine/apoferritine, les capsides de différents virus, l'albumine, la gliadine etc. Ces systèmes de délivrance protéiques présentent des formes diverses telles que des microsphères, des nanoparticules, des hydrogels, des films et des protéines-cages.
Les systèmes de délivrance à base de protéines et tout particulièrement les protéines-cages apparaissent comme un système de délivrance prometteur qui permet d'éviter certains inconvénients des systèmes de délivrance à base de polymère grâce à leur taille uniforme, leur biodisponibilité et leur biodégradabilité (Maham et al., 2009).
Il existe donc un besoin pour de nouveaux systèmes de délivrance à base de protéines. Outre leurs propriétés de biodisponibilité et de biodégradabilité, ces systèmes de délivrance doivent pouvoir être fabriqués de manière simple, reproductible et en grande quantité.
De plus, ces systèmes de délivrance doivent être conçus pour délivrer des agents thérapeutiques de manière spécifique à des cellules à traiter afin de limiter les effets secondaires liés au traitement.
De ce fait, les systèmes de délivrance doivent confiner les agents thérapeutiques à l'intérieur de leur cage protéique et les libérer une fois la cible à traiter atteinte.
Enfin, les systèmes de délivrance doivent aisément être caractérisés et leur innocuité doit être avérée.
Résumé de l'Invention
La famille des lectines de sporocarpe fongique, également appelés lectines de champignon de groupe 2, est une famille de lectines fongiques présentant à la fois une homologie de séquence et de structure. Les homologies de séquences des membres de cette famille de lectine sont largement décrites dans Birck C et al. (2004), Trigueros et al. (2003) et Khan et al. (201 1 ).
De plus, l'analyse des structures tridimensionnelles de certains membres a montré une similarité de structure. Ainsi, il a été montré que la lectine de Xerocomus chrysenteron (XCL) (Birck C et al. (2004)), la lectine ô'Agaricus bisporus (ABL), (Carrizo M. et al (2004)) et la lectine de Boletus edulis (BEL) (Michèle Bovi et al. ((201 1 )) forment, toutes trois, un tétramère possédant une cavité centrale.
Cette famille des lectines de sporocarpe fongique comprend, notamment, la lectine ô'Agaricus bisporus (ABL), la lectine d'Arthrobotrys oligospora (AOL), la lectine de Boletus edulis (BEL), la lectine de Gibberella zeae (GZL), la lectine de Xerocomus chrysenteron (XCL), la lectine de Pleurotus cornucopiae (PCL) et la lectine de Paxillus involutus (PIL) (Birck et al., 2004) (Crenshaw et al., 1995).
Les inventeurs ont réussi à confiner un agent actif au sein de la cavité d'un multimère de lectine de sporocarpe fongique et ont montré que T'agent actif ainsi confiné pouvait ensuite être délivré à une cible biologique.
L'utilisation de lectine de sporocarpe fongique comme complexe de confinement permet de supprimer, ou du moins atténuer, tout ou partie des inconvénients des systèmes de délivrance de l'art antérieur.
En effet, ces lectines présentent une affinité et une spécificité pour un marqueur tumoral épithélial.
Parmi les membres de cette famille on retrouve une lectine, ABL, présente dans le champignon Agaricus Bisporus, c'est-à-dire le champignon de Paris. Ce champignon est l'un des plus consommé au monde. On peut donc exclure, a priori, une toxicité ou une allergenicité de cette protéine vis à vis de l'espèce humaine.
Les lectines de cette famille et leurs variants sont aisément produits de manière recombinante et on peut donc atteindre des niveaux de production et de purification excessivement importants (g/litre).
Ces lectines sont particulièrement stables dans le temps (plusieurs mois à 4°C, plusieurs semaines à température ambiante) et résistent très bien à des conditions physico- chimiques dures (SDS, température, force ionique).
Enfin, outre leur capacité à confiner un agent actif de manière réversible et sa faible toxicité, ces lectines forment un multimère avec une cavité qui peut contenir un agent actif sans nécessité de une liaison covalente entre le multimère et l'agent actif qu'il contient. Un premier aspect de l'invention concerne, par conséquent, l'utilisation d'une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique pour la délivrance d'un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic à une cible biologique.
Dans un second aspect, l'invention concerne également un complexe comprenant un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic et une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique.
En cherchant à améliorer les performances de ces lectines dans le confinement d'agents actifs, les inventeurs ont découverts que certains variants de XCL, une lectine particulièrement adaptée pour son utilisation comme système de délivrance, présentaient une capacité de confinement améliorée tout en gardant leur capacité à libérer l'agent actif une fois la cible atteinte. L'invention concerne ce type de variant, plus précisément un variant de XCL ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe consistant en SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
Un autre aspect de l'invention prévoit également :
- une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable,
- une lectine de sporocarpe fongique, un variant de celle-ci ou un complexe selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement du corps humain ou animal et, en particulier, dans une méthode de traitement du cancer.
Description détaillée
Utilisation de lectine de sporocarpe fongique pour la déliyrance d'un agent actif
Les inventeurs ont réussi à maîtriser la structuration d'un multimère de certaines lectines de sporocarpe fongique de façon à ce qu'un agent actif puisse être inséré de manière stable dans leur cavité et libéré une fois que le complexe multimère-agent actif aura atteint une cible biologique donnée.
L'invention concerne donc l'utilisation d'une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique pour la délivrance d'un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic à une cible biologique. Le terme « agent thérapeutique » se réfère à un agent qui a une activité pharmacologique ou un bénéfice sur la santé lorsqu'il est administré dans une quantité thérapeutiquement efficace.
Dans un mode de réalisation préféré, l'agent thérapeutique est un agent chimiothérapeutique.
L'agent chimiothérapeutique peut être un agent cytotoxique chimiothérapeutique tel que, par exemple, un agent endommageant l'ADN, un antimétabolite, un antimitotique ou un alcaloïde de Vinca (Cancer immunotherapy : immune suppression and tumor growth, George C. et al.) (Chemotherapy at Dorland's Médical Dictionary)).
Les agents endommageant l'ADN peuvent être des agents alkylants tels que la cyclophosphamide, le chlorambucile, la chlorméthine, le busulfan, le tréosulfan et le thiotépa, des inhibiteurs de topoisomérase tels que la camptothécine, l'irinotecan et le topotecan ou l'amsacrine, l'étoposide, l'étoposide phosphate et le téniposide ou des composés à base de platine tels que le cisplatine, le carboplatine, l'oxaliplatine.
Des exemples d'antibiotiques anti-tumoraux sont des anthracyclines tels que la doxorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, le mitoxantrone, la valrubicine ou la mitomycine.
Des exemples d'anti-métabolites sont des antagonistes du folate tels que le méthotrexate, les antagonistes de la purine tels que la fludarabine et les antagonistes de la pyrimidine tel que le 5-fluorouracile.
Des exemples d'antimitotiques sont les taxanes tels que le paclitaxel, et le docetaxel.
Des exemples d'alcaloïdes de Vinca sont la vincristine, la vinblastine, la vinorelbine et la vindesine. Le terme « agent de diagnostic » se réfère à un agent qui lorsqu'il est administré dans une quantité efficace permet d'identifier si un sujet est atteint ou susceptible de développer une pathologie donnée.
Dans un mode de réalisation, l'agent de diagnostic peut être un agent radioactif ou un agent fluorescent.
L'agent de diagnostic peut par exemple comprendre un radioisotope d'iode (I), tel que 1231, 1251, 131 1, etc. ,de barium (Ba), de gadolinium (Gd), de technetium (Te) dont du 99Tc, de phosphore (P) dont du 31 P, de fer (Fe), de manganèse (Mn), de thallium (Tl), chromium (Cr), dont 51 Cr, de carbone (C) dont 14C ou des composés marqués de manière fluorescente.
Dans un mode de réalisation préféré, l'agent de diagnostic n'est pas ou peu détectale lorsqu'il est confiné dans le multimère de lectine et ne devient significativement détectable qu'une fois qu'il est libéré au niveau de la cible biologique. Dans un mode de réalisation préféré, l'agent actif selon l'invention est un agent thérapeutique. Le terme « variant » se réfère ici à une protéine ayant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acides aminés de la protéine dont il est le variant et qui présente une capacité à confiner un agent actif sensiblement égale ou supérieure à celle de la protéine dont il est le variant.
Typiquement, le variant d'une protéine a au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité avec la séquence d'acides aminés de la protéine dont il est le variant.
Le pourcentage d'identité se réfère à des comparaisons de séquences d'acides aminés et est déterminé par comparaison de deux séquences alignées de manière optimale sur une fenêtre de comparaison, dans laquelle la partie de la séquence d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (c'est-à-dire des écarts) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas d'addition ou de délétion) pour un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage peut être calculé en déterminant le nombre de positions où se trouve un résidu d'acide aminé identique dans les deux séquences pour parvenir au nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat par 100 pour atteindre le pourcentage d'identité de séquence. En variante, le pourcentage peut être calculé en déterminant le nombre de positions où se trouve un résidu d'acide aminé identique dans les deux séquences ou un résidu d'acide aminé est aligné avec un écart pour atteindre le nombre de positions correspondantes, en divisant le nombre de positions correspondantes par le nombre total de position dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat par 100 pour atteindre le pourcentage d'identité de séquence. L'homme du métier sait qu'il existe plusieurs algorithmes connus pour aligner deux séquences. Un alignement optimal de séquences pour une comparaison peut être réalisé, par exemple, par l'algorithme d'alignement local de Smith et Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2:482, par l'algorithme de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, par la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:2444, par des implémentations informatiques de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA, et TFASTA), ou par vérification visuelle (Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., (1995 Supplément) (Ausubel)). Des exemples d'algorithmes qui sont adaptés pour déterminer le pourcentage d'identité et de similarité de séquences sont les algorithmes BLAST et BLAST 2.0 qui sont décrits dans Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 21 5: 403-41 0 et Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402, respectivement. Le logiciel pour réaliser des analyses BLAST est disponible au National Center for Biotechnology Information website.
La capacité à confiner un agent actif peut être mesurée selon la méthode à la fluorescéine décrite dans les exemples.
Dans un mode de réalisation préféré, la lectine de sporocarpe fongique de l'invention est choisie dans le groupe consistant en ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL et PIL ou d'un variant de ceux-ci.
De préférence, la lectine de sporocarpe fongique est XCL, ABL, BEL ou un variant de ceux-ci.
XCL, la lectine de Xerocomus chrysenteron est une protéine appartenant à une famille de lectines de sporocarpe fongique qui a été isolée à partir d'un champignon comestible par l'homme, Xerocomus chrysenteron.
Cette protéine connue pour son activité insecticide a, notamment, été décrite par Wang M et al. (2002), Trigueros V et al. (2003) et Birck C et al. (2004).
La séquence d'acides aminés de cette protéine est SEQ ID NO : 1 .
XCL a pour isoforme XCL2 de SEQ ID NO : 5.
Birck C et al. (2004) ont montré que XCL apparaît, en solution, sous forme d'une structure tétramérique, générant en son centre une cavité dont les parois sont délimitées par chaque monomère. Cette même structure se retrouve pour la lectine ô'Agaricus bisporus, ABL (Carrizo M. et al (2004)) et de Boletus edulis, BEL (Michèle Bovi et al. ((201 1 )).
Les inventeurs ont découverts que certains variants de XCL présentaient des caractéristiques optimales pour une utilisation comme complexe de confinement.
Ces trois variants préférés sont des mutants de XCL dont la thréonine 12 a été remplacée par une cystéine et/ou l'alanine 38 a été remplacée par une cystéine. Ces variants améliorent le maintien de l'assemblage tétramérique de XCL sous sa forme fermée tout en étant capable de contrôler son ouverture.
Les inventeurs ont, notamment, montré que le pont disulfure inter-chaîne du variant A38C fournit deux types de contraintes structurales. D'une part, cette liaison covalente réduit la liberté de mouvement des boucles fermant l'accès à la cavité de la cage protéique ce qui empêche la fuite de l'agent actif confiné. D'autre part, l'addition des liaisons entre les monomères implique que la dissociation du variant oxydé ne peut avoir lieu que si les quatre interfaces sont rompues. Ce variant a donc sa structure tétramérique fortement stabilisée. L'invention concerne, par conséquent, un variant de XCL ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe consistant en SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
Tableau 1 : Résumé des séquences
Figure imgf000008_0001
Dans un mode de réalisation préférée, l'invention concerne donc l'utilisation d'un variant de XCL ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe consistant en SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour la délivrance d'un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic à une cible biologique.
Dans un mode de réalisation préféré, le variant de XCL a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation préféré, la cible biologique est une cellule cancéreuse.
En effet, la plupart des lectines de sporocarpe fongiques dont XCL (Damian et al. (2005)) et ABL (Milton et al. (2001 )) reconnaissent de manière spécifique l'antigène Thomsen Friedenreich (TF) (Damian L et al. (2005)). L'antigène TF (Ga^1 -3GalNAca^1 ) ou son précurseur direct Tn (Gal-NAc-O-sérine) sont exprimés dans la plupart des carcinomes et notamment dans les cancers de la vessie (Langkilde NC et al. (1 992)), colorectal (Itzkowitz SH, et al (1989)), gastro-intestinal, de la prostate, ovaire (MacLean GD, et al. (1992)), du sein (Wolf BC, et al (1989) et Carraway KL, et al. (2005)), du poumon (Stein R et al., (1989)), du mélanome (Heimburg J, et al. (2006)).
A contrario, l'antigène TF est peu ou pas exprimé dans les tissus normaux (Springer GF (1984) et Cao Y et al. (1996)).
Par conséquent, la spécificité des lectines de l'invention pour TF permet l'adressage de celle-ci à des cellules cancéreuses.
L'invention concerne également un procédé de délivrance d'un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic à une cible biologique dans lequel on met en contact le dit agent actif et une lectine de sporocarpe fongique ou un variant de celle-ci.
De préférence, dans un mode de réalisation de l'invention, on confine l'agent actif dans le multimère de lectine de sporocarpe fongique ou un variant de celle-ci.
Complexe La présente invention concerne, également, un complexe comprenant un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic et une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique.
L'agent actif est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic tel que défini plus haut.
Typiquement, la lectine de sporocarpe fongique ou le variant de lectine du complexe selon l'invention est sous la forme d'un multimère.
Typiquement, le multimère de lectine présente une cavité interne dans laquelle se situe l'agent actif.
De préférence, il n'y a pas de liaison covalente entre le multimère de lectine et l'agent actif.
Dans un mode de réalisation préféré, le multimère est un homomultimère.
Dans un autre mode de réalisation, le multimère peut être un hétéromultimère. Dans une variante préférée de ce mode réalisation, l'hétérodimère est composé de lectine de sporocarpe fongique et d'un variant de cette lectine. Dans le mode de réalisation préféré, le multimère du complexe selon l'invention est un tétramère, plus préférentiellement un homotétramère.
De préférence, le complexe selon l'invention comprend une lectine de sporocarpe fongique choisie dans le groupe consistant en ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL et PIL ou un variant de celle-ci.
Dans un mode de réalisation préféré, la lectine de sporocarpe fongique du complexe selon l'invention est XCL, ABL ou un variant de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation préféré, la lectine de sporocarpe fongique du complexe selon l'invention est XCL ou un variant de XCL.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la lectine de sporocarpe fongique du complexe selon l'invention est un variant de XCL ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe consistant en SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un complexe selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en contact de lectine de sporocarpe fongique ou de variant de lectine de sporocarpe fongique avec un agent actif qui est un agent thérapeutique ou de diagnostic.
Le procédé de fabrication du complexe peut comprendre en outre une étape d'élimination de l'agent actif qui n'a pas été non confiné.
Le procédé peut comprendre une étape de réduction d'une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant de celle-ci avant l'étape de mise en contact avec l'agent actif et une étape d'oxydation après l'étape de mise en contact avec l'agent actif.
Cette étape permet la création de ponts disulfure pour stabiliser le multimère de lectine, notamment pour des variants modifiés avec une ou plusieurs cystéines, pour pouvoir générer de tels ponts.
Composition pharmaceutique
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité parmi les excipients habituellement employés.
La composition selon l'invention peut par exemple être administrée par injection, par pulvérisation ou par voie orale.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut par exemple être sous forme liquide, solide, de gel ou de lyophilisât. Dans ces compositions, l'agent actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.
De préférence, ces compostions pharmaceutiques sont destinées à une administration par voie non systémique, par exemple par voie entérale.
Méthode de traitement
La présente invention concerne, également, un complexe selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement du corps humain ou animal.
Les termes "traitement ou traiter" font tous les deux références à un traitement curatif et des mesures préventives ou prophylactique pour prévenir ou ralentir la maladie ou l'état pathologique ciblé.
Les sujets ayant besoin du traitement incluent les sujets déjà atteints par la maladie ainsi que les sujets susceptibles d'avoir la maladie ou chez qui on doit prévenir la maladie. Ainsi, le sujet à traiter peut avoir été diagnostiqué comme ayant la maladie ou peut être prédisposé ou susceptible d'avoir la maladie.
L'invention concerne également une méthode de traitement d'un sujet comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un complexe de l'invention.
L'invention concerne, également, l'utilisation d'un complexe selon l'invention pour fabriquer un médicament.
Il est connu que certaines lectines de cette famille pénètrent efficacement dans les cellules épithéliales cancéreuses. En effet, après liaison à la surface cellulaire, la lectine est internalisée via la voie dépendante de la clathrine et est transportée dans les endosomes tardifs ou les lysosomes de ces cellules (Francis F. et al, 2003). Les conditions acides et protéasiques de ces compartiments entraînent la libération de l'agent actif contenu dans le multimère de lectine.
L'invention concerne un complexe selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement d'un cancer.
Dans un mode de réalisation, le cancer est choisi dans le groupe consistant en un cancer de la vessie, un cancer colorectal, un cancer gastro-intestinal, un cancer de la prostate, un cancer de l'ovaire, un cancer du sein, un mélanome et un cancer du poumon. De préférence, le cancer est choisi dans le groupe consistant en un cancer colorectal, un cancer de la vessie, un cancer gastrointestinal et un cancer de l'ovaire.
L'invention concerne, également, une méthode de traitement d'un cancer chez un sujet comprenant l'adm inistration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un complexe selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation d'un complexe selon l'invention pour fabriquer un médicament destiné à traiter un cancer.
L'invention concerne également un procédé d'administration d'un agent actif à un sujet comprenant l'étape d'adm inistration audit sujet d'un complexe selon l'invention.
L'adm inistration peut notamment se faire par voie orale ou par injection.
Brève Description des Dessins
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore à la lecture de la description qui va suivre. Celle-ci est purement illustrative et doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
la figure 1 représente les distances m inimales et maximales entre deux groupements e-amines exposées à la surface d'XCL et appartenant à des sous- unités protéiques différentes ;
-la figure 2 représente les spectres d'émission de FITC-XCL et de RITC-XCL. A- Courbes continues : Spectre d'ém ission du FITC-XCL ( max 520nm) et du RITC-XCL
(Xmax 580nm) ; Courbes discontinues : déconvolution du spectre d'ém ission obtenu en (B) . B- Courbe continue : addition numérique des spectres obtenus en (A) pour le FITC-XCL et le RITC-XCL ; Courbe discontinue : spectre d'émission obtenu en mélangeant FITC-XCL et R ITC-XCL ;
-la figure 3 représente les spectres d'ém ission de FITC-A38C et de RITC-A38C ;
A- Courbes continues : Spectre d'ém ission du FITC-A38C (Xmax 520nm) et du RITC- A38C (Xmax 580nm) ; Courbes discontinues : déconvolution du spectre d'émission obtenu en (B) . B- Courbe continue : addition numérique des spectres obtenus en (A) pour le FITC-A38C et le RITC-A38C ; Courbe discontinue : spectre d'émission obtenu en mélangeant FITC-A38C et RITC-A38C ;
la figure 4 présente l'évolution du rapport d'intensité 580nm/520nm en fonction de la concentration en protéine XCL. la figure 5 représente la variation des volumes d'élution de la chromatographie d'exclusion en fonction des concentrations d'XCL ;
la figure 6 représente la cinétique de l'échange par mesure du FRET à 580nm pour XCL ;
- la figure 7 représente le confinement de fluorescéine dans XCL et le variant
A38C réduit et non réduit;
la figure 8 représente les intensités relatives de fluorescence des Trp d'XCL à 346 et 330nm en fonction de la température ;
la figure 9 représente l'expérience de DOSY.
EXEMPLES
Matériel et Méthodes :
Préparation des protéines
Tous les mutants ont été réalisés en utilisant le kit Quickchange mutagenesis (Stratagene). Les mutants A38C et T12C de XCL ont été construits à partir du cDNA de la protéine XCL native. Les protéines ont été produites et purifiées comme décrit dans la littérature (Trigueros et al.. (2003)). Une étape de purification supplémentaire a été réalisée sur chromatographie d'exclusion de taille (Sephacryl S300) équilibrée avec 50mM de tampon phosphate, 1 00mM NaCI, pH7,2 à un débit de 3 ml.mn"1. Les protéines purifiées ont été finalement concentrées à 60 μΜ sur une colonne Vivaspin 15R 30 000 MWCO (Sartorius stedim). Le mutant A38C a été oxydé par une incubation de 8h dans 50mM de tampon phosphate, 1 00mM NaCI, pH 8,5 et 10mM de glutathion oxydé (GSSG). L'excès de glutathion a été éliminé sur colonne de PD-10 sephadex G-25M (GE Healthcare), équilibrée avec 50mM de tampon phosphate, 100mM NaCI, pH7,2.
Marquage des protéines XCL et A38C au FITC et au RITC
XCL ou A38C (30μΜ) sont incubées à 25 Ό pendant 1 h sous agitation dans un milieu tamponné composé de tampon phosphate (50mM, pH 9) et soit de FITC (1 mM) ou de RITC (1 m M). La réaction est arrêtée par addition de Tris-HCI (10mM, pH 9). Les protéines marquées sont purifiées sur colonnes PD-10 sephadex G-25M (GE Healthcare) préalablement équilibrées avec 50mM de tampon phosphate (pH 8.5). La stœchiométrie du marquage est déterminée par spectrophotométrie à pH 8.5. La concentration des groupements fluorescents liés aux protéines est calculée avec les coefficients d'extinction suivant : ε494 nm = 77000 cm" 1 M"1 pour le FITC et ε560 nm = 85000 cm"1 M"1 pour le RITC. Les concentrations d'XCL et d'A38C après le marquage sont calculées avec ε278 nm = 120000 cm"1 M"1 , et tenant compte de l'absorption des sondes fluorescentes à cette longueur d'onde.
Expériences de FRET
FRET à l'équilibre
Le transfert d'énergie de fluorescence a été utilisé pour mettre en évidence l'échange des monomères d'XCL. La réaction d'échange est initiée en mélangeant le même volume d'XCL-RITC (1 μΜ ou uniquement du tampon comme référence) et d'XCL-FITC (1 μΜ) à 25 °C dans 50mM de tampon phosphate, 100mM NaCI, pH 8,5. Après une heure d'incubation, le spectre d'émission de l'échantillon excité à 490nm est enregistré par spectrofluorimètrie (Photon Technology International QM-4). Les mêmes expériences ont été réalisées avec A38C-RITC et A38C-FITC.
Cinétique de FRET
La vitesse d'échange des sous-unités a été mesurée par la même technique. La réaction est initiée en mélangeant le même volume d'XCL-RITC (1 μΜ) et d'XCL-FITC (1 μΜ) à 25°C dans 50mM de tampon phosphate, 100mM NaCI, pH 8,5. L'excitation est réalisée à 468nm et l'émission de fluorescence à 580 nm est enregistrée toutes les 0.5 secondes. L'intensité de fluorescence est normalisée en utilisant l'équation :
. . fit)
ψ f - r¾
où F(t) représente la fluorescence expérimentale au temps considéré, F0 la valeur de la fluorescence initiale, et la valeur de la fluorescence finale quand l'état d'équilibre est atteint. Les données cinétiques ont été modélisées avec le logiciel GOSA (Czaplicki et al. (2006)). Le meilleur fit a été obtenu pour une double exponentielle d'équation :
F = 1 - [a x s"^ + (i - α) x e~k^1 où :
a représente la proportion de molécules à dissociation lente, k1 la constant cinétique de la dissociation lente et k2 la constant cinétique de la dissociation rapide.
Chromatographie d'exclusion de taille
Les expériences de chromatographie d'exclusion de taille ont été réalisées sur une colonne GE-Healthcare Superose 12 PC 3.2/30. Les colonnes sont pré-équilibrées dans le tampon testé, à savoir du tampon phosphate 50mM, 100mM NaCI, pH7,2 ou pH 4,4 en absence ou en présence de 0.003% de SDS. Le débit est de 0.5m L/min. La BSA et la RNase A sont utilisées comme marqueur de taille. Confinement
Les expériences de confinement sont réalisées en incubant la protéine sauvage (XCL) ou les mutants (A38C) avec la molécule à tester. Pour réaliser les expériences témoins avec le mutant A38C, une étape d'oxydation est réalisée en présence de GSSG dans un tampon phosphate 50mM, 100mM NaCI, pH 7,2, OVN. Le GSSG est ensuite éliminé sur colonne PD- 10 sephadex G-25M (GE Healthcare) pré-équilibrée dans du tampon phosphate 50mM, 100mM NaCI, pH 8,5. L'éluat est concentré à 1 ml sur Vivaspin 15R 30 000 MWCO (Sartorius stedim). Un lot d'A38C est réduit au TCEP (sous argon) additionné de NaOH pour un pH final de 8,5. La preuve de concept du confinement a été réalisée avec de la fluorescéine à une concentration de 1 0mM. L'incubation est réalisée pendant 1 h à 25 °C dans du tampon phosphate 50mM, 100mM NaCI. Pour le mutant A38C réduit une nouvelle étape d'oxydation est réalisée au GSSG, OVN. La fluorescéine libre est éliminée sur une colonne PD-10 sephadex G-25M (GE Healthcare). L'échantillon est ensuite concentré sur Vivaspin 15R 30 000 MWCO (Sartorius stedim). La mesure du confinement est réalisée par spectrophotométrie. La quantité de fluorescéine est mesurée en utilisant un coefficient d'absorption de ε51 1 nm = 75000 cm"1 M"1. Les concentrations d'XCL et d'A38C après le confinement sont calculées avec ε278 nm = 120000 cm"1. Le pourcentage de confinement est calculé en faisant le rapport des concentrations de fluorescéine/protéine.
Résultats:
Des études précédentes ont démontrées que XCL s'organisait sous forme d'un tétramère présentant une cavité intérieure. Les inventeurs ont démontré qu'il était possible de confiner une molécule dans cette cavité sans liaison covalente entre la molécule et XCL. De plus, les inventeurs ont conçus des variants de XCL capables de rester sous forme tétramérique pendant une longue période. Les inventeurs ont également montré que la molécule confinée pouvait être libérée dans les conditions similaires à celles rencontrées dans les cellulles cibles.
Conception et production de tétramères stabilisés par des ponts disulfure.
Afin d'augmenter la stabilité de la structure tétramérique de XCL, les inventeurs ont conçus des variants de XCL dont les monomères sont liés de manière covalente. Les inventeurs ont testé une stratégie consistant en la formation de ponts disulfure entre les monomères en substituant des résidus d'acides aminés de XCL sauvage par de la cystéine. Pour minimiser le nombre de substitution les inventeurs ont du déterminer les acides aminés qui étaient proches de leur homologues dans le monomère opposé. Comme révélé par la structure 3D de XCL, deux acides aminés présentent une telle propriété. La distance entre les carbones beta de la thréonine 12 et son homologue est de 3,9 angstroms et celle entre l'alanine 38 et son homologue est de 3,4 angstroms. Ces distances sont typiques de la gamme des carbones beta des cystéines impliquées dans des ponts disulfure (Galat et al. (2008)). En outre, les chaînes latérales des ces résidus sont sur la surface de la protéine et complètement accessibles à un agent oxydatif. Une analyse de la minimisation d'énergie avec le logiciel WINCOTT a montré que l'orientation de la chaîne latérale de la thréonine 12 et de l'alanine 38 et leur environnement structurel était compatible avec la formation de ponts disulfure.
En produisant ces molécules ainsi modifiées, les inventeurs souhaitent obtenir un assemblage tétramérique qui ne peut pas être dissocié. La particularité du variant A38C repose sur le fait que la présence de deux ponts disulfure supplémentaires entraînent une stabilisation du tétramère entier. Si on considère que la structure de XCL est un carré dans lequel chaque monomère est un coin, les ponts disulfure A38C les lieront en diagonale. La dissociation des tétramères A38C oxydés ne sera possible que si toutes les interfaces sont rompues. Une forte stabilisation du tétramère est envisagée rendant sa dissociation très peu probable.
Le clone A38C a été obtenu par mutagénèse dirigée en utilisant le plasmide de XCL comme matrice et la protéine produite et purifiée en utilisant le même protocole que celui utilisé pour produire XCL (Trigueros et al. (2003)). Un rendement de 25 mg de protéine purifiée par litre de culture a été obtenu. La dernière partie du protocole a consisté en une étape d'oxydation de 12 heures en présence de 10mM de glutathion oxydé. Cette étape est requise pour produire des ponts disulfure entre les monomères. La formation de ces liaisons covalentes a été vérifiée par SDS-PAGE. Deux SDS-PAGE ont été préparés. Du beta- mercaptoéthanol a été ajouté aux échantillons dans le premier gel alors il n'a pas été rajouté de beta-mercaptoéthanol au second gel. Lorsque XCL est chauffé à 95Ό 5 min avant le dépôt, on observe une seule bande avec une masse moléculaire légèrement supérieure à 20kDa sur les deux gels. Cette bande correspond aux espèces sous forme de monomère. A contrario, lorsque XCL n'a pas été chauffé avant le dépôt, on observe une seule bande de poids moléculaire d'approximativement 80kDa qui implique que XCL est resté sous forme tétramérique malgré des conditions aussi dures que 2% de SDS. Dans des conditions réductrices, A38C a montré exactement le même comportement que XCL. Dans des conditions non réductrices, lorsque les échantillons ont été chauffés, on observe 3 bandes. La bande la plus intense migre comme une protéine de 40kDa c'est-à-dire comme une espèce dimérique. Ces espèces correspondent à 2 monomères liés de manière covalente par la création de ponts disulfure. Elle représente 90% des espèces dans le cas d'A38C. Une autre bande qui représente 5% des espèces et présente une masse moléculaire de 21 kDa est également observée. Cette bande correspond aux monomères provenant des espèces non oxydées. La troisième bande qui représente également 5% des espèces, présente une masse moléculaire apparente de 60kDa correspondant aux espèces tétramériques. L'ensemble de ces résultats montre que la stratégie de modification rationnelle de XCL par génie génétique a permis d'obtenir un taux d'oxydation d'approximativement 90%.
Un variant T12C a été produit de la même manière qu'A38C par mutagénèse dirigée en utilisant le plasmide de XCL comme matrice. En utilisant le même protocole, 10mg de protéine par litre de culture ont été produits. Le taux d'oxydation du variant T12C a été recherché en utilisant la même méthode par SDS-PAGE que pour A38C. Ces taux ont été comparés à ceux obtenus avec le variant A38C. Plusieurs conditions oxydatives ont été testées avec différentes concentrations de glutathion réduit. En effet, l'ajout de glutathion réduit empêche la formation de liaisons incorrectes en permettant la réduction des ponts disulfure qui pourraient être insuffisamment stabilisés par d'autres interactions. Le taux d'oxydation de chaque échantillon a été testé par SDS-PAGE dans des conditions non réductrices après chauffage des échantillons 5 min à 95 °C. Comme pour A38C, 3 bandes ont été observées pour T12C. Le taux d'oxydation obtenu pour T12C est donc comparable à celui obtenu pour A38C. Cependant lorsque le glutathion réduit est ajouté au tampon d'oxydation à une concentration de 1 0mM une forte diminution du taux d'oxydation a été observée par rapport à A38C. Ce résultat montre que le pont disulfure supplémentaire de T12C oxydé est moins stable que le pont disulfure d'A38C.
Ouverture réversible du tétramère
Comme indiqué précédemment, XCL s'organise en solution sous forme de tétramère. Les inventeurs ont déterminé s'il existait un échange spontané entre les formes tétramériques et d'éventuelles formes dimériques ou monomériques minoritaires.
Mise en évidence de l'ouverture et de la fermeture spontanée de XCL.
L'équilibre d'oligomérisation de la protéine XCL a été caractérisé par la mesure d'apparition de transfert d'énergie par résonance de type Forster (FRET) entre deux populations de XCL marquées séparément soit au FITC (Fluorescéine IsoThioCyanate) soit au RITC (Rhodamine IsoThioCyanate).
Lorsque l'on analyse la structure de XCL (Figure 1 ) , les distances minimales et maximales entre deux groupements e-amines exposées à la surface et appartenant à des sous-unités protéiques différentes sont respectivement de 21 et 67 angstroms et donc toutes deux dans la gamme de distance compatible avec l'apparition de FRET.
Deux échantillons de XCL ont été marqués séparément avec soit du FITC soit du RITC selon la procédure décrite dans le matériel et méthodes. La stœchiométrie de marquage est de 4 mol de FTIC par mol de XCL et 0,9 mol de RITC par mol de XCL. La même stœchiométrie a été obtenue pour A38C.
Les spectres d'émission de FITC-XCL et de RITC-XCL sont présentés en Figure 2A (courbes continues). L'addition numérique de ces spectres donne la courbe continue présentée en Figure 2B. Sur cette même figure, est également présenté le spectre obtenu en mélangeant la protéine marquée, soit par le donneur soit par l'accepteur (courbe en pointillés). Ce spectre a été déconvolué, ce qui donne les spectres représentés en pointillés sur la Figure 2A.
Une diminution de l'intensité de fluorescence correspondant à l'émission de la fluorescéine et simultanément une augmentation de l'intensité d'émission de fluorescence de la rhodamine sont observées, ce qui met en évidence l'existence d'un transfert d'énergie entre les deux fluorophores.
Dans la mesure où l'efficacité de transfert dépend de la distance donneur/accepteur à la puissance six et où les dimensions de la molécule XCL sont de l'ordre de grandeur de la distance de Forster, l'apparition de ce transfert d'énergie n'est possible que si les monomères FITC-XCL et RITC-XCL se sont redistribués et appartiennent en fin d'expérience au même tétramère. Par conséquent, l'accès à la cavité est possible de manière spontanée.
A titre de comparaison, la même expérience a été réalisée avec le variant A38C. Ce variant est lié de manière covalente par deux ponts disulfures supplémentaires. Les spectres d'émission de FITC-XCL et de RITC-XCL sont présentés en Figure 3A (courbes continues). L'addition numérique de ces spectres donne la courbe continue présentée en Figure 3B. Un spectre parfaitement superposable a été obtenu après mélange des protéines marquées donneur et accepteur et incubation de ce mélange pendant 1 h à température ambiante (lignes en pointillés de la figure 3B). Lorsqu'il est déconvolué, le spectre donne un spectre représenté par les lignes en pointillés (figure 3A) et montre qu'aucun FRET n'est observé. Cette expérience montre que les monomères oxydés d'A38C ne se redistribuent pas et restent tétramériques.
Détermination de la constante d'équilibre de la réaction de dissociation du tétramère
Mesures en FRET :
Dans le paragraphe précédent, il a été démontré que la dissociation de XCL se produit et est réversible. Ainsi, cet équilibre peut être déplacé vers la dissociation et l'efficacité du transfert d'énergie devrait diminuer. Les inventeurs ont tiré avantages de ce phénomène pour le calcul d'une constante de dissociation (Kd) des tétramères de XCL.
Le mélange de FITC-XCL et RITC-XCL a été dilué jusqu'à différentes concentrations et incubé pendant 1 heure à température ambiante. Le spectre de fluorescence a été enregistré avec une excitation lumineuse à 468nm. Afin de déterminer de manière sensible la diminution du transfert d'énergie et de normaliser l'intensité de la fluorescence, un ratio I580/I520 a été calculé pour chaque concentration et relevé en fonction de la concentration en XCL (figure 4). Une transition dans l'intensité du transfert d'énergie apparaît pour une concentration proche du micromolaire. De manière évidente, la courbe de titration n'est pas complète tant que la saturation n'est pas atteinte pour les points de plus forte concentration. A cause de la limite de solubilité de XCL et du protocole de marquage, les concentrations en protéine ne peuvent pas excéder 10μΜ dans cette expérience.
Mesures en chromatoqraphie d'exclusion de taille :
Afin de confirmer les données obtenues en FRET, le déplacement de l'équilibre a été évalué par chromatographie sur gel d'exclusion. De l'albumine sérique bovine (BSA) et de la ribonucléase A ont été utilisées pour calibrer la colonne. Des volumes d'élution de 12,6 ml et de 15,5 ml ont été respectivement obtenus. A forte concentration (ici à 30μΜ), XCL a un volume d'élution de 13,2ml proche du volume d'élution de la BSA comme attendu pour les espèces tétramériques. Au premier abord, l'existence d'un équilibre entre les espèces tétramériques et dimériques (ou monomériques) laissait supposer une élution en deux pics par chromatographie d'exclusion. Néanmoins, il a été démontré par simulation numérique qu'en fonction du taux d'association, du taux de dissociation, du débit et des caractéristiques de séparation de la colonne, deux populations de molécules s'échangeant pouvaient mener à un seul pic par chromatographie d'exclusion de taille (Yu et al., (2006)). Les inventeurs ont réalisé plusieurs injections en utilisant des concentrations variables de XCL et observé qu'en effet un seul pic était obtenu. Cependant ce pic est déplacé vers des volumes d'élution plus longs au fur et à mesure que la concentration est diminuée, indiquant une masse moléculaire plus petite. Lorsque les volumes d'élution sont relevés par rapport aux concentrations d'XCL (fig. 5), on observe une transition à une concentration proche du micromolaire qui est cohérente avec les résultats précédemment obtenus en FRET.
Expériences de microcalorimétrie
Pour mesurer précisément la constante d'équilibre de tétramérisation et également déterminer la thermodynamique de la tétramérisation de XCL, les inventeurs ont utilisé la microcalorimétrie isotherme de titration (Burrows et al. ,(1 994) Lovatt et al., (1996) Barranco- Medina et al. (2009)). Dans ce procédé, une solution concentrée de XCL a été diluée dans un tampon, et la chaleur de dissociation des dimères (ou des monomères) a été mesurée. La quantité de chaleur libérée pour chaque injection est régie par l'échange d'enthalpie du tétramère au dimère et la constante d'équilibre tétramère-dimère. La modélisation de ces résultats permet d'extraire la constante d'équilibre de dissociation (Kd = 4,5μΜ) et une variation d'enthalpie de 16,6 kilocalories par mole de tétramère.
Cette variation d'enthalpie est dans la gamme de valeurs typiquement observée pour une protéine oligomérique de cette taille. Par contre la constante d'équilibre de dissociation est faible en comparaison de celles obtenues pour d'autres protéines polymériques ce qui démontre la remarquable stabilité de cet assemblage protéique.
La convergence de ces résultats démontre que XCL subit en permanence un échange entre la forme dimérique et la forme tétramérique et ce, même à haute concentration protéique.
Pour vérifier que l'ouverture et la fermeture du tétramère ont lieu à des vitesses compatibles avec les expériences de confinement nous avons déterminé les paramètres cinétiques de cet échange.
Détermination de la constante cinétique de dissociation du tétramère
La cinétique de dissociation du tétramère a été étudiée en mélangeant XCL-FITC et XCL-RITC et en mesurant l'intensité d'émission de fluorescence à 580nm en fonction du temps (Figure 6). On observe que cette intensité de fluorescence augmente jusqu'à atteindre un équilibre après plus de 300 secondes de réaction, ce qui indique que l'échange entre les sous-unités est lent. L'augmentation de l'intensité de fluorescence et donc l'efficacité de transfert entre la fluorescéine et la rhodamine sont le résultat de deux phénomènes successifs : premièrement la dissociation des tétramères en dimères et deuxièmement leur réassociation. En considérant la forme de la courbe (Figure 6), aucun temps de latence n'est observé au début de la cinétique ce qui implique que la vitesse de réassociation est beaucoup plus grande que la vitesse de dissociation. On peut donc considérer que la vitesse de réassociation est négligeable dans ce cas. Les données cinétiques obtenues ont été modélisées en utilisant le logiciel GOSA. Le modèle le plus apte à décrire le phénomène observé est une double croissance exponentielle correspondant à deux réactions de dissociation ayant des vitesses différentes:
F=1 -[a x e"k1 (1 -a) χ e"k2 t ]
avec :
a : proportion de molécules engagées dans la réaction lente,
k1 : constante cinétique de la réaction de dissociation la plus lente
k2 : constante cinétique de la réaction de dissociation la plus rapide
Les valeurs des constantes obtenues après optimisation sont :
a=0,39 ; k1 = 0,72 min-1 ; k2 = 2,52 min-1
Cette augmentation par une double exponentielle suggère que XCL peut suivre deux voies de dissociation. Le tétramère ABCD formé par XCL peut se dissocier de deux façons différentes : en dimères AB et CD ou en dimères AD et BC.
Confinement d'un agent dans la cavité
Les inventeurs ont utilisé la fluorescéine pour valider la capacité de confinement du tétramère XCL.
La fluorescéine (279 À3) présente l'avantage d'être petite et très soluble en solvant aqueux (il est donc possible de se placer à haute concentration lors du confinement). De plus, elle absorbe la lumière visible à 51 1 nm , ce qui permet de la détecter. Les inventeurs ont préféré suivre l'absorbance de cette molécule plutôt que sa fluorescence. En effet, la fluorescence d'une molécule est dépendante de son environnement chimique, par conséquent, une fois confinée, la fluorescéine pourrait voir son rendement de fluorescence modifié de manière importante.
Le confinement a été réalisé pour XCL et le variant A38C.
Dans le cas d'XCL, les inventeurs ont incubé la protéine (15 μΜ) avec de la fluorescéine (10mM) et séparé ensuite la protéine des molécules de fluorescéine non confinées par deux colonnes de gel filtration successives. Préalablement, les inventeurs ont vérifié que si l'on effectue ces deux colonnes sur la solution de fluorescéine à 10m M, aucune fluorescéine libre résiduelle n'est détectée. La fluorescéine détectée lors du confinement est donc nécessairement liée à la protéine ou contenue par cette-dernière.
La protéine A38C a été également utilisée pour réaliser le confinement, le protocole étant identique si ce n'est que la protéine qui est initialement oxydée est réduite avant d'être mise en présence de la solution de fluorescéine, puis dans un deuxième temps oxydée toute une nuit en présence d'un agent oxydant, le glutathion oxydé. Cette protéine est notée A38R sur la figure 7.
L'expérience de confinement a également été réalisée avec de la protéine A38C qui n'a pas été réduite avant d'être mise en présence de la solution de fluorescéine, puis qui dans un deuxième temps a été oxydée toute une nuit en présence d'un agent oxydant, le glutathion oxydé. Cette protéine est notée A38NR sur la figure 7.
A l'issue de ces étapes de confinement et d'élimination de la fluorescéine libre on détermine par absorbance UV à 51 1 nm et à 280 nm les concentrations respectives en fluorescéine et en protéine. Pour XCL comme pour A38C, 1 1 expériences indépendantes ont été réalisées. Des taux de confinement de 9% et de 14% de confinement sont obtenus respectivement pour XCL et A38R (figure 7).
Les échantillons ont ensuite été incubés 4 jours à température ambiante, la fluorescéine libre a été à nouveau éliminée puis la fluorescéine confinée a été dosée. Le taux de confinement est alors resté inchangé pour XCL comme pour A38C.
La fixation de la fluorescéine sur XCL peut être liée à deux types d'interactions. La fluorescéine peut se lier de manière non spécifique sur la surface de la protéine ou bien dans la cavité. Le maintien du confinement pendant 4 jours indique que la fluorescéine n'est pas liée de manière labile, elle se serait sinon dissociée au bout de ce délai.
Ces taux de confinement démontrent d'une part que l'on peut confiner un agent au sein de la cavité et d'autre part que cette cavité présente une affinité de liaison non covalente vis à vis de cette molécule test. En effet, pour un confinement par diffusion passive on attend une efficacité de confinement théorique de l'ordre de 0,3 %. L'utilisation d'A38C sous forme oxydée après confinement, a permis de multiplier le taux de confinement par deux. La stratégie d'ingénierie du tétramère proposée par les inventeurs permet donc d'augmenter le taux de confinement de façon significative.
Dissociation du complexe à pH acide correspondant à celui des lysosomes
Afin d'utiliser XCL pour transporter et délivrer un agent dans des cellules, une connaissance approfondie des conditions de dissociation est requise.
Les conditions d'utilisation d'un complexe de confinement en thérapie dans un organisme homéotherme impliquent que ces vecteurs puissent maintenir leur structure dans les conditions de température de l'organisme cible. XCL provenant d'un organisme poïkilotherme (ou hétérotherme) c'est-à-dire non régulé thermiquement de manière endogène, le comportement du tétramère en fonction de la température et en particulier son comportement en deçà de 45Ό a été analysé.
Dissociation thermique
Fluorescence du trvptophane
La dissociation thermique de XCL a été suivie en mesurant la fluorescence intrinsèque des tryptophanes. Chaque monomère d'XCL contient 3 résidus tryptophanes : un dans une cavité hydrophobe (Trp 77) et deux situés sur la même interface entre deux monomères (Trp 27 et Trp 35). Les inventeurs ont utilisé ces deux derniers Trp comme sondes de la structure quaternaire d'XCL, en tirant parti de leur position dans la structure du tétramère. Pour augmenter la sensibilité de la mesure, le rapport des intensités de fluorescence 346nm/330nm a été mesuré en fonction de la température (Figure 8). Aucune modification de ce rapport n'est observée avant 50°C ce qui indique que l'environnement des Trp n'a pas changé jusqu'à cette température et que la lectine est restée sous forme tétramérique. L'analyse visuelle des échantillons après chauffage révèle qu'XCL précipite sous forme tétramérique au-delà de 45 °C avant le démasquage des tryptophanes.
RMN - DOSY
La dissociation thermique a également été suivie par des expériences de DOSY (Diffusion Ordered SpectrometrY). Le rapport des rayons hydrodynamiques d'XCL et du dioxane ont été mesurés en fonction de la température (Figure 9).
Si le tétramère se dissocie en augmentant la température, on attend une diminution de ce rapport et donc du rayon hydrodynamique de XCL. A l'inverse, les résultats révèlent une augmentation linéaire de ce rapport quand la température augmente. Ce résultat, contre- intuitif, reflète une augmentation du rayon hydrodynamique d'XCL probablement lié à l'augmentation du mouvement de boucles non-structurées. Quoiqu'il en soit, aucune transition du rayon hydrodynamique n'est observée. Passé 50°C, l'échantillon protéique précipite comme déjà décrit dans les expériences de fluorescence du tryptophane.
Ces deux expériences démontrent que cette lectine est stable en deçà de 45°C et donc qu'elle remplit des critères de thermostabilité largement suffisants pour pouvoir être utilisée in vivo.
Dissociation chimique
Les inventeurs ont étudié le comportement d'XCL dans des conditions chimiques dénaturantes proches de celle rencontrées dans les lysosomes. L'analyse a été réalisée par chromatographie d'exclusion à pH acide (pH 4.4). Il apparaît que le pic d'élution de XCL dans ces conditions dénaturantes se déplace vers des volumes d'élutions plus grands traduisant l'apparition d'une taille plus faible. Quand 0,003% de SDS est ajouté, le pic d'élution se déplace jusqu'au volume d'élution de la RNAse A qui présente une masse molaire proche du monomère d'XCL. La diminution du pH conduit donc à la dissociation du tétramère en dimère, et avec une très faible quantité de détergent ces dimères sont dissociés en monomères.
Le comportement du mutant A38C oxydé a également été analysé. A pH neutre, A38Cox a un volume d'élution comparable à celui d'XCL. Quand le pH est descendu à 4,4, aucune modification du volume d'élution n'est observée. L'addition du pont disulfure augmente donc la stabilité de l'assemblage protéique. L'ajout de 0.003% de SDS conduit à la dissociation du tétramère en dimères, constitués de monomères reliés entre eux par le pont disulfure.
Les lysosomes constituent des organites subcellulaires de dégradation. Leur contenu est acide, réducteur et contient des hydrolases acides, protéases dégradant les protéines qui y sont adressées. Les résultats obtenus montrent que dans ces conditions réductrices et acides, XCL ou son mutant A38Cox sont dissociés en dimères, permettant la libération au sein des lysosomes des agents actifs confinés dans la cavité.
La présente invention a été décrite et illustrée dans la présente description détaillée et dans les Figures. La présente invention ne se limite pas aux formes de réalisation présentées. D'autres variantes et modes de réalisation peuvent être déduits et mis en œuvre par la personne du métier à la lecture de la présente description et des Figures annexées. REFERENCES
Au cours de cette demande, différentes références décrivent l'état de la technique de l'invention. Les descriptions de ces références sont ici incorporées par référence dans la présente description.
Barranco-Medina S, Dietz KJ. Thermodynamics of 2-Cys peroxiredoxin assembly determined by isothermal titration calorimetry. Methods Enzymol. 2009;466:409-30. Epub 2009 Nov 13.Birck C, Damian L, Marty-Detraves C, Lougarre A, Schulze-Briese C, Koehl P, Fournier D, Paquereau L, Samama JP. A new lectin family with structure similarity to actinoporins revealed by the crystal structure of Xerocomus chrysenteron lectin XCL. J Mol Biol. 2004 Dec
10;344(5) :1409-20.
Burrows SD, Doyle ML, Murphy KP, Franklin SG, White JR, Brooks I, McNulty DE, Scott MO, Knutson JR, Porter D, et al. Détermination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentrations. Biochemistry. 1994 Nov
1 ;33(43) :12741 -5.Cao Y, Stosiek P, Springer GF, Karsten U (1996) Thomsen-Friedenreich- related carbohydrate antigens in normal adult human tissues: a systematic and comparative study. Histochem Cell Biol 106: 197-207.
Carraway KL, Ramsauer VP, Carraway CA (2005) Glycoprotein contributions to mammary gland and mammary tumor structure and function: rôles of adherens junctions, ErbBs and membrane MUCs. J Cell Biochem 96: 914-926.
Carrizo ME, Capaldi S, Perduca M, Irazoqui FJ, Nores GA, Monaco HL. The antineoplastic lectin of the common edible mushroom (Agaricus bisporus) has two binding sites, each spécifie for a différent configuration at a single epimeric hydroxyl.J Biol Chem. 2005 Mar 18;280(1 1 ) :10614-23. Epub 2004 Dec 13.Crenshaw, R.W., S.N. Harper, M. Moyer and L.S. Privalle, 1995. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding a lectin gene from Agaricus bisporus. Plant Physiol., 107: 1465-1466.
Czaplicki, J., Cornelissen, G., and Halberg, F. (2006). Journal of applied biomedicine 4, 87-94 Damian L, Fournier D, Winterhalter M, Paquereau L (2005) Détermination of thermodynamic parameters of Xerocomus chrysenteron lectin interactions with N-acetylgalactosamine and Thomsen-Friedenreich antigen by isothermal titration calorimetry. BMC Biochem 6: 1 1 .
Francis F, Marty-Detraves C, Poincloux R, Baricault L, Fournier D, Paquereau L. Fungal lectin, XCL, is internalized via clathrin-dependent endocytosis and facilitâtes uptake of other molécules. Eur J Cell Biol. 2003 Oct;82(1 0) :515-22.
Galat A, Gross G, Drevet P, Sato A, Ménez A. Conserved structural déterminants in three- fingered protein domains. FEBS J. 2008 Jun;275(12) :3207-25. Epub 2008 May 13. Heimburg J, Yan J, Morey S, Glinskii OV, Huxley VH, Wild L, Klick R, Roy R, Glinsky VV, Rittenhouse-Olson K. Inhibition of spontaneous breast cancer metastasis by anti-Thomsen- Friedenreich antigen monoclonal antibody JAA-F1 1 . Neoplasia. 2006 Nov;8(1 1 ) :939-48.
Itzkowitz SH, Yuan M, Montgomery CK, Kjeldsen T, Takahashi HK, et al. (1989) Expression of Tn, sialosyl-Tn, and T antigens in human colon cancer. Cancer Research 49: 197-204.
Khan F. et Khan M. I. The Mushroom Lectins Show Three Types of Conservée! Domain in a Bioinformatics Analysis American Journal of Biochemistry and Molecular biology 1 (4) : 375- 388, 201 1 Langkilde NC, Wolf H, Clausen H, Orntoft TF (1992) Localization and identification of T-(Gal beta 1 -3GalNAc alpha 1 -O-R) and T-like antigens in expérimental rat bladder cancer. J Urol 148: 1279-1284.
Lovatt M, Cooper A, Camilleri P. Energetics of cyclodextrin-induced dissociation of insulin. Eur Biophys J. 1996;24(5) :354-7.MacLean GD, Bowen-Yacyshyn MB, Samuel J, Meikle A, Stuart G, et al. (1992) Active immunization of human ovarian cancer patients against a common carcinoma (Thomsen-Friedenreich) déterminant using a synthetic carbohydrate antigen. J Immunother (1991 ) 1 1 : 292-305.
Maham A, Tang Z, Wu H, Wang J, Lin Y. Protein-based nanomedicine platforms for drug delivery. Small. 2009 Aug 3;5(15) :1706-21 .
Michèle Bovi, Maria E Carrizo, Stefano Capaldi.Massimiliano Perduca, Laurent R Chiarelli.Monica Galliano, and Hugo L Monaco. Structure of a lectin with antitumoral properties in kingbolete (Boletus edulis) mushrooms, Glycobiology vol. 21 no. 8 pp. 1 000-1009, 201 1
Milton JD, Fernig DG, Rhodes JM: Use of a biosensor to détermine the binding kinetics of five lectins for Galactosyl-Nacetylgalactosamine. Glycoconj J 2001 , 18:565-569.
Springer GF (1984) T and Tn, gênerai carcinoma autoantigens. Science 224: 1 198-1206. Stein R, Chen S, Grossman W, Goldenberg DM (1989) Human lung carcinoma monoclonal antibody spécifie for the Thomsen-Friedenreich antigen. Cancer Research 49: 32-37.
Trigueros V, Lougarre A, Ali-Ahmed D, Rahbe Y, Guillot J, et al. (2003) Xerocomus chrysenteron lectin: identification of a new pesticidal protein. Biochimica Et Biophysica Acta- General Subjects 1621 : 292-298.
Wang M, Trigueros V, Paquereau L, Chavant L, Fournier D (2002) Proteins as active compounds involved in insecticidal activity of mushroom fruitbodies. J Econ Entomol 95: 603- 607.
Wolf BC, Salem RR, Sears HF, Horst DA, Lavin PT, et al. (1989) The expression of colorectal carcinoma-associated antigens in the normal colonie mucosa. An immunohistochemical analysis of régional distribution. Am J Pathol 135: 1 1 1 -1 19.
Yu CM, Mun S, Wang NH (2006) Theoretical analysis of the effects of réversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A 1 132: 99-108.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Utilisation d'une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique pour la délivrance d'un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic à une cible biologique.
2. Complexe comprenant :
- un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic et
-une lectine de sporocarpe fongique ou un variant d'une lectine de sporocarpe fongique.
3. Complexe selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'agent actif est un agent thérapeutique.
4. Complexe selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'agent actif est un agent de diagnostic.
5. Complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que ladite lectine est choisie dans le groupe consistant en ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL et
PIL ou ledit variant est un variant d'une lectine de sporocarpe fongique choisie dans le groupe consistant en ABL, AOL, GZL, XCL, PCL, BEL et PIL.
6. Procédé de fabrication d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en contact d'une lectine de sporocarpe fongique ou d'un variant d'une lectine de sporocarpe fongique avec un agent actif qui est un agent thérapeutique ou un agent de diagnostic.
7. Variant de XCL ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe consistant en SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
8. Composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
9. Complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 pour son utilisation dans une méthode de traitement du corps humain ou animal.
10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 pour son utilisation dans une méthode de traitement d'un cancer.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108047349B (zh) * 2018-01-11 2020-10-27 吉林农业大学 一种卷边桩菇多糖提取物及其制备方法和医用用途
KR20240095532A (ko) * 2021-10-01 2024-06-25 유니켐 레버러토리스 리미티드 렉틴-약물 접합체
CN116497034B (zh) * 2023-01-12 2023-11-07 深圳市仙湖植物园(深圳市园林研究中心) 一种抗虫蛋白及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000840A1 (fr) * 1999-06-24 2001-01-04 Syngenta Limited Proteines insecticides et nematicides

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010099543A2 (fr) * 2009-02-27 2010-09-02 Inter-Med, Inc. Compositions et procédés pour la détection d'un néoplasme oral
CN104374919B (zh) * 2009-07-14 2017-01-18 独立行政法人产业技术综合研究所 糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000840A1 (fr) * 1999-06-24 2001-01-04 Syngenta Limited Proteines insecticides et nematicides

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIRCK C ET AL: "A New Lectin Family with Structure Similarity to Actinoporins Revealed by the Crystal Structure of Xerocomus chrysenteron Lectin XCL", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, UNITED KINGDOM, vol. 344, no. 5, 10 December 2004 (2004-12-10), pages 1409 - 1420, XP004650016, ISSN: 0022-2836, DOI: 10.1016/J.JMB.2004.10.007 *
CHRISTIANE BIES ET AL: "Lectin-mediated drug targeting: history and applications", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 56, no. 4, 1 March 2004 (2004-03-01), pages 425 - 435, XP055081194, ISSN: 0169-409X, DOI: 10.1016/j.addr.2003.10.030 *
DAMIAN LUMINITA ET AL: "Determination of thermodynamic parameters of Xerocomus chrysenteron lectin interactions with N-acetylgalactosamine and Thomsen-Friedenreich antigen by isothermal titration calorimetry", BMC BIOCHEMISTRY, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, vol. 6, no. 1, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 11, XP021000335, ISSN: 1471-2091, DOI: 10.1186/1471-2091-6-11 *
FRANCIS F ET AL: "Fungal lectin, XCL, is internalized via clathrin-dependent endocytosis and facilitates uptake of other molecules", EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY, WISSENSCHAFLICHE VERLAGSGESELLSCHAFT, STUTTGART, DE, vol. 82, no. 10, 1 October 2003 (2003-10-01), pages 515 - 522, XP004954648, ISSN: 0171-9335, DOI: 10.1078/0171-9335-00338 *
JOHN D. SMART: "Lectin-mediated drug delivery in the oral cavity", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 56, no. 4, 1 March 2004 (2004-03-01), pages 481 - 489, XP055081193, ISSN: 0169-409X, DOI: 10.1016/j.addr.2003.10.016 *
SYCHROVA H ET AL: "STUDIES ON LECTINS. LIX. ISOLATION AND PROPERTIES OF LECTINS FROM FRUITING BODIES OF XEROCOMUS CHRYSENTERON AND LACTARIUS LIGNYOTUS", CANADIAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, OTTAWA, CA, vol. 63, no. 7, 1 July 1985 (1985-07-01), pages 700 - 704, XP000960398, ISSN: 0714-7511 *
T G PISTOLE: "Interaction of Bacteria and Fungi with Lectins and Lectin-Like Substances", ANNUAL REVIEW OF MICROBIOLOGY, vol. 35, no. 1, 1 October 1981 (1981-10-01), pages 85 - 112, XP055061703, ISSN: 0066-4227, DOI: 10.1146/annurev.mi.35.100181.000505 *

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