WO2013142935A1 - Derivados de combretastatina, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e o uso de tais derivados como agente antitumoral - Google Patents

Derivados de combretastatina, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e o uso de tais derivados como agente antitumoral

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Abstract

A presente invenção está relacionada ao uso de derivados da combretastatina como agentes antitumorais, em especial contra leucemia, tumores de cólon, glioblastoma, melanoma, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de ovário e carcinoma bronqui-alveolar pulmonar, e a composições compreendendo tais derivados.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

DERIVADOS DE COMBRETAST ATINA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS E O USO DE TAIS DERIVADOS COMO AGENTE ANTITUMORAL

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada ao uso de derivados da combretastatina como agentes antítumorais, em especial contra leucemia, tumores de cólon, glioblastoma, melanoma, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de ovário e carcinoma bronqui-alveoiar pulmonar, e a composições compreendendo tais derivados.

Antecedentes da Invenção

Câncer: Aspectos econômico-sociais

O acesso da população em geral a serviços básicos de saneamento e de saúde, em especial a medicamentos (por ex. antibióticos beta-lactâmicos), permitiu que a expectativa de vida da população mundial aumentasse consideravelmente nos últimos 50 anos. Em consequência, a incidência de doenças de natureza crônico-degenerativa tem crescido a cada ano, tanto em países em desenvolvimento como nos países subdesenvolvidos (INCA, 2011).

Segundo a base de dados DATASUS do Ministério da Saúde - Brasil, as doenças do aparelho circulatório correspondem a aproximadamente 30% dos obtidos ocorridos no ano de 2009, sendo a principal causa mortis entre a população brasileira. Desde 2003, as neoplasias (tumores) ocupam a segunda posição deste ranking, representando no ano de 2009, 15,6% do numero total de óbitos.

Em 2009, o valor arrecadado com vendas de medicamentos anti- neoplásicos nos Estados Unidos ultrapassou 18 bilhões de dólares e tamanha arrecadação permite a classificação destes medicamentos como "btockbusters". Este patamar é atingido devido ao alto custo da terapia por paciente, valor estimado em torno de 50 a 100 mil dólares por ano (AGGARWAL, 2010), o que dificulta e limita o acesso da população em geral a esses medicamentos.

No Brasil, em 2009, o gasto total do Ministério da Saúde com tratamentos oncológicos (quimioterapia e radioterapia) foi de 16 bilhões de reais, período no qual, apenas 300 mil pacientes foram atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (ALENCASTRO, 2010).

Segundo a publicação "Estimativa-20 2: Incidência de Câncer no Brasil" do Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) são estimados para o ano de 2012 a notificação de 418.510 novos casos de câncer na população brasileira e de acordo com o relatório anual "Câncer Facts & Figures - 2011 " da Sociedade Americana do Câncer tinha-se a expectativa de se diagnosticar aproximadamente 1.596.670 casos de câncer no ano de 201 apenas nos Estados Unidos.

Tabela 1. Número de novos casos de câncer, por localização e pelo género, estimados para 2012. (Reproduzido de "Estimativa 2012: Incidência de Câncer no Brasil", Rio de Janeiro, 2011).

Lecsriiaçâe primária < «es IK'«>< p¾e«stual Uwafeaçie pf tatwta i jtereertas»

FrÉKa¾ S0.180 30,8% ¾J;¾f¾s attia. ¾nlr¾rí3 52.888 27,9%

Traqueia, er&^s a Mmãa 17.2» 8,8% Colo do fera 17.5*t 9,3*

Cótan eReto 1 .! 80 7.3% ¾" Celas « ¾¾> 15.980 8,4%

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Cwídacfe Oral 9.S90 5,1% w$ ff Τι¾ι»Β, Βϊ0!Κ('.ι» βί¾Ιί!ΐ¾ι 10.110 5,3%

r. 4,C¾ i¾ Estômaao T.m 3.9%

Baga S.210 3,2% fui f§ Qvàio €.130 3,3% lawge 6.1 « 3.1% '' : Cor?» do (Haro 4.523 2,4¾

UriorranAo Hodqkift 5.199 2,7% fâ' Utfoma náe Hodgkia 2,4%

Sistema ««vaso Central «.820 2,5% ! ! Sistema Nervoso Contini «5S Historicamente, os tipos de câncer mais incidentes em países desenvolvidos são os tumores de pulmão, mama, próstata e cólon, enquanto que nos países em desenvolvimento se destacam os tumores de estômago, fígado, cavidade oral e colo de útero. Curiosamente, no Brasil os tipos de câncer mais incidentes, sem considerar o câncer de pele não melanoma, são os tumores de próstata, de mama. colo de útero, pulmão, cólon-retal e estômago (INCA, 2011). O que significa que, quanto às estatísticas do câncer, o Brasil apresenta um caráter híbrido de país desenvolvido e de pais em desenvolvimento, possivelmente em consequência da má distribuição de renda.

O grande impacto económico e social provocado pelas neoplasias, em especial pelos tumores malignos, na sociedade contemporânea fez com que a busca por medicamentos anti-tumorais tenha recebido cada vez mais atenção dos grandes laboratórios farmacêuticos (big pharmas) e, por consequência dos esforços dispensados nessa cruzada, grandes avanços no entendimento da biologia molecular das células, de suas vias de sinalização e dos processos de divisão celular foram observados nos últimos anos (ALBERTS, 2010).

O avanço no desenvolvimento de técnicas bioquímicas e de diagnóstico por imagem, permitiram a melhora no diagnóstico de tumores em estágios iniciais e junto às inovações terapêuticas disponíveis são responsáveis peio aumento da taxa de sobrevida de pacientes com câncer na ultima década (ACS, 2011).

Carcinoqênese

O termo câncer é utilizado para designar um conjunto de doenças que apresentam como característica comum o aumento sem controle do número de células de um determinado órgão ou tecido (neoplasias). (INCA, 2009)

O desenvolvimento de neoplasias, processo conhecido por carcinogênese, é desencadeado por alterações genéticas de uma célula ou conjunto de células em um processo dinâmico de várias etapas caracterizado por modificações na capacidade de proliferação e diferenciação celular. O processo está associado a mutações genéticas, dieta, estilo de vida, exposição à carcinógenos e inflamações crónicas (MONTENEGRO et.af., 2004).

Segundo Hanahan e colaboradores (2000), as modificações essenciais ocorridas na carcinogênese são: auto-suficiência em sinais de crescimento, perda de sensibilidade a fatores de inibição de crescimento, imortalização, angiogênese sustentada, evasão tecidual e metástase. A carcinogênese é divida em três fases (iniciação, promoção e progressão) podendo ser induzida por agentes químicos, físicos (raios ultravioleta e radiação ionizante) ou biológicos (vírus) (MONTENEGRO et.al., 2004).

A fase de iniciação está associada a uma modificação irreversível sobre o ácido desoxiribunucléico (ADN) provocada por um carcinógeno, induzindo mutações tais como, inativação de genes de supressão de tumor ou ativação de genes que estimulam a formação de tumores (oncogenes) (MARTINEZ et.al., 2003).

Alguns compostos químicos necessitam de ativação metabólica por enzimas do complexo enzimático citocromo P450 (CYP45Q) para interagirem com o ADN e formar os adutos responsáveis pela fase de iniciação (MONTENEGRO et.al, 2004).

A fase de promoção é caracterizada por um processo reversível onde há a estimulação da proliferação rápida das células iniciadas através de mecanismos variados como a ligação com receptores de membrana, como receptores de fatores de crescimento, proteínas de membrana reguladora de canais de íons e/ou proteínas nucleares indutoras da divisão celular (MARTINEZ et.al., 2003).

Os agentes promotores da carcinogênese podem ser de natureza exógena como tabagismo nos tumores de pulmão, traqueia e esôfago, fatores ambientais e inclusive de natureza endógena como os hormônios sexuais nos tumores de mama, colo de útero e testículos (CHABNER et.al., 2006).

A fase de progressão está associada à ocorrência de mutações adicionais que induzem mudanças fenotípicas no grupo de células em divisão e determinam a malignidade do tumor, as manifestações clínicas e a propriedade de metástase do mesmo (MONTENEGRO et.al., 2004).

É importante salientar que para o estabelecimento de um tumor são necessárias as três fases descritas acima. Prova disso é que apenas a exposição aos fatores de promoção não é suficiente para o desenvolvimento de tumores, sendo obrigatoriamente necessária a fase de iniciação. Outro ponto é que sem a ocorrência das modificações adicionais da fase de progressão, apenas lesões tumorais benignas e células fenotipicamente alteradas são observadas, sem apresentarem a capacidade invasiva e malignidade dos tumores correspondentes. (MARTINEZ ef.a/., 2003; MONTENEGRO et. ai, 2004).

Estratégias Terapêuticas

As manifestações clínicas, morbidade e mortalidade associadas aos tumores, assim como o esquema terapêutico adotado, dependem do locai e tipo de tumor estabelecido e do estágio de desenvolvimento do mesmo quando diagnosticado. (MERKLE, 2010). As neoplasias podem ser tratadas com radiação, cirurgia, terapia hormonal, terapia imuno-biológica e por quimioterapia. Usualmente são empregados na grande maioria dos esquemas terapêuticos duas ou mais estratégias para o controle e, quando possível, extinção do tumor (CHABNER ef.a/., 2006).

A abordagem quimioterápica utilizada no tratamento de tumores é baseada no uso de fármacos que atuam por diferentes mecanismos de ação relacionados ás etapas do processo de divisão celular (CHABNER et. ai, 2006) (Figura 1). Os fármacos utilizados podem ser classificados como quimioterápicos citotóxicos clássicos e fármacos molecularmente dirigidos (AGGARWAL, 2010).

Os primeiros compostos antitumorais ou antíneoplásicos, desenvolvidos na década de 1950, tinham como objetivos inibir a síntese de bases nitrogenadas, tais como a 6-mercaptopurina (1) e 5-fluorouracsla (2), e até mesmo lesar o próprio ADN pelo uso de compostos intercaiantes como a cisplatina {3) e alquilantes como o melfaian (4) (Figura 2) (AARBAKKE et. ai, 1997; BELLON eia!, 1991 ; WER UTH, 2008).

Na década de 1970, o presidente Nixon declarou "guerra ao câncer" e o instituto do Câncer Estadunidense, através de programas de screenings conseguiu identificar diversas substâncias bioativas de origem natural dotadas de ativídade citotóxica (AGGARWAL, 2008; BANERJEE et.af. 2008). Dentre as substâncias identificadas a partir dessa metodologia, se destaca o paclitaxel (5), um diíerpeno isolado da casca do teixo {Taxas baccata), que apresentava mecanismo de ação distinto das demais substâncias bioativas identificadas até então (WANI etal., 1971), que possuíam principalmente a inibição de enzimas (topoisomerase I e II) responsáveis pela estabilização da dupla hélice de ADN durante o processo a divisão celular como mecanismo de ação citotóxico a exemplo da campotecina (6) e do etoposídeo (7) (Figura2) (WALL & WANI, 1996; WERMUTH. 2008).

Atuaimente o planejamento de fármacos antineopiásicos e os estudos clínicos de candidatos a fármacos antitumorais se concentram em descobrir compostos que atuem em alvos moleculares à nível do metabolismo das células tumorais (SCHANABELL, 2010).

Terapia moíecularmente dirigida

Inibidores de proteínas tirosina cinases

Dentre os fármacos atuaimente desenvolvidos para o arsenal terapêutico antitumoral, aqueles que atuam como inibidores de enzimas proteína cinase, em especial tirosina cinase, e inibidores multi-cinases são os alvos mais estudados para intervenção farmacológica de neoplasias, possuindo comprovada eficácia clínica (GOTÍNK& VERHEUL, 2010; SILVA etal., 2009).

Em maio de 2001, o imatiníbe (8) foi aprovado pelo FDA como primeiro fármaco para o tratamento de tumores que possui mecanismo de ação citotóxico sobre proteínas tirosina cinase, especificamente sobre a ABL (Abelson tirosina cinase) (COHEN, 2002).

Em consequência do sucesso terapêutico do imatinibe no tratamento de leucemia mielóide crónica e tumores do estroma gastrointestinais, nos anos seguintes outros inibidores de tirosina cinase foram lançados no mercado farmacêutico mundial, apresentando também ι elevada eficácia clínica no tratamento de diversos tipos de tumores (Figura 3).

Os inibidores de tirosina cinase mais recentes (a partir de 2006) apresentam a capacidade de inibir mais de um tipo de proteína tirosina cinase, sejam estas receptoras ou não receptoras, sendo chamados de inibidores multi-cinase (GOTINK & VERHEUL, 2010). Atuaimente, sabe-se que o imatinibe também è um inibidor rnulti-cinase, sendo também capaz de inibir proteínas tirosina cinase tais como: c-KIT e o receptor do faíor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR, do inglês platelet-deríved growth fator receptor) (NOVARTIS, 2012).

Na década de 1970, Judah Folkman propôs que a formação de novos vasos e capilares sanguíneos (i.e. angiogênese) seria essencial para a manutenção, crescimento e metástase de tumores. Este processo é desencadeado por diversos fatores pró-angiogenicos liberados pelas próprias células tumorais, como o fator de crescimento vascular endote!iai (VEGF, do inglês: vascular endothelial growth factor) e angiopoetina-2, e estes se ligam aos seus respectivos receptores estimulando a degradação das paredes de células endoteiiais e a migração das células endoteliais para a formação de novos capilares (FOLKMAN, 2007).

Os inibidores multi-cinase mais recentes, a exemplo do sunitinibe (11) tem os fatores associados à angiogênese como principais alvos moleculares (GOTINK & VERHEUL, 2010). O sunitinibe é um derivado 5-fluor-2-oxindólico aprovado em 2006 pelo FDA para o tratamento de pacientes com carcinona de células renais e pacientes com tumor estromal gastrointestinal (GIST, do inglês: Gastrointestinal stromal câncer) resistentes ao imatinibe e mais recentemente para tumores neuroendócrinos de pâncreas em estágio avançado (PFIZER.. 2011).

Embora a abordagem terapêutica visando a angiogênese seja apontada como o novo hit no combate ao câncer, alguns especialistas discutem a validade desta estratégia, colocando em xeque sua eficácia clinica, haja vista que fármacos "antiangiogênese" são capazes apenas de evitar a formação de novos vasos sanguíneos sem afetar os já existentes (ROODÍNK & LEENDER, 2010).

Inibidores da função de microtúbulos

Outra abordagem dita molecularmente dirigida tem os microtúbulos como seu alvo molecular. Os microtúbufos são um dos componentes do citoesqueleto de células eucariotas e são responsáveis por diversas funções celulares essenciais, tais como: organização do formato celular, direcionamento do transporte intracelular de vesículas, posicionamento das organelas e especialmente na formação dos fusos mitóticos durante a etapa de mitose no processo de divisão celular (ALBERTS, 2010; LIU et ai, 2009; NIEN et.ai. 2010).

Os microtúbulos são estruturas cilíndricas e ocas formadas por 13 filamentos paralelos compostos por subunidades heterodiméricas de duas proteínas globulares (α-tubulina e β-tubulina) unidas por interações de hidrogénio. (SOUZA, 2004; ALBERTS, 2010), (Figura 4)

Na etapa de elongamento, a adição das proteínas globulares ocorre verticalmente de maneira alternada, enquanto que horizontalmente no microtúbulo as proteínas α e β tubulina se encontram sempre dispostas lado a lado com suas semelhantes (JORDAN & WILSON, 2004; ALBERTS, 2010).

São conhecidas seis isoformas da α-tubulina e sete isoformas da β- tubulina e, dessa forma, fármacos que se ligam aos microtúbulos podem apresentar efeitos farmacológicos e toxicidades diferentes de acordo com as isoformas de α e β tubulina encontradas em determinados tipos de tumores. (ATTARD et.ai, 2006; ALBERTS, 2010).

Os microtúbulos apresentam natureza dinâmica, alternando as etapas de elongamento e encurtamento constantemente. Assim, as extremidades dos microtúbulos são denominadas como polo positivo (extremidade mais dinâmica) e polo negativo (extremidade menos dinâmica). A extremidade composta pela α-tubulina é o polo negativo, enquanto a extremidade oposta composta pela proteína β-tubulina ó considerada o polo positivo. Graças ao maior dinamismo da β-tubulina, esta proteína é o alvo molecular dos fármacos que atuam sobre os microtúbulos (JORDAN & WILSON, 2004: ALBERTS, 2010).

Em consequência do dinamismo do processo de encurtamento e enlogamento dos microtúbulos, há grande dificuldade para a obtenção de estruturas cristalográficas da proteína com boa definição. (BAI et.ai, 2000) e apenas em outubro de 2011 foram publicados no banco de dados de proteínas (PDB do inglês: protein data bank) estruturas cristalográficas com resolução menor que 3.0Â (NAWROTEK et.ai., 2011; em: ttp^/wvvw.rcsb.org/pdb/results/resuits.do?qrid=25A6AA5E&tabtos ow=Current , Acesso em: 9 de março de 2011). Até então a estrutura cristalográfica de melhor resolução apresentava 3.58 Á de resolução (RAVELLI, et.ai, 2004) tendo sido utilizada em diversos estudos de modelagem molecular (LIU, et.ai., 2009; HU, et.ai., 2011 ; RU AN, et.ai., 2011).

Em ensaios celulares e bioquímicos são observados dois tipos de equilíbrio não dinâmico no processo de construção e catástrofe de microtúbuios, a saber: "Treadmilling" e "instabilidade dinâmica". Uma linhagem celular é capaz de apresentar os dois tipos de equilíbrio, sem um motivo aparente ou compreendido para a escolha de um tipo de equilíbrio em detrimento do outro (ALBERTS, 2010).

No processo chamado de instabilidade dinâmica é observada a troca de fases para crescimento e encurtamento com maior crescimento na extremidade positiva (β-tubulina) que encurtamento na fase negativa (α-tubulina). A instabilidade dinâmica leva em consideração as seguintes variáveis: taxa de crescimento, taxa de encurtamento (construção), frequência de transição entre crescimento-pausa-encurtamento (catástrofe). Enquanto que no "treadmilling", são observados crescimento na extremidade positiva (β-tubulina) e encolhimento na extremidade negativa (a-tubulina), com uma mesma taxa, sendo o tamanho do polímero constante. (JORDAN & WILSON, 2004; ALBERTS, 2010).

O primeiro fármaco descoberto como capaz de atuar sobre os microtúbuios foi a vimbiastina (16). Essa descoberta fortuita decorreu da observação de efeitos tóxicos sobre a medula óssea durante pesquisas que avaliavam as propriedades antidiabéticas da planta Catharanthus roseus, da qual se obtém a vimbiastina (NOBLE, 1990).

Anos mais tarde, o paclítaxel (5) foi descoberto na casca do teixo (Taxus baccata) e aprovado para uso clínico pelo FDA em 1992, sendo empregado com sucesso no tratamento de tumores de mama. ovário, pulmão de células não pequenas e sarcoma de Kaposi (CHABNER ef.a/., 2006), atuando através da estabilização da polimerização de microtúbulos.

Após a identificação dessas duas potentes substâncias de origem natural (i.e. vimblastina e paclitaxel), atuando como antitumoral, por mecanismo molecular de ação a época inovador, havia ainda dois grandes empecilhos para a produção destes medicamentos anti-microtúbulos em larga escala: a baixa ocorrência natural dos princípios ativos nas plantas de origem e a complexidade estrutural que dificultava a síntese total desses compostos {Figura 5), limitação que foi contornada apenas 2 décadas depois da identificação das propriedades cítotóxicas dessas substâncias com a síntese total do paclitaxel em 1994 (NICOLAU et.al., 1994) e da vimblastina em 2002 (YOKOSHI A et.al. , 2002).

Classificação dos li antes de B-tubulina

Os ligantes de β-tubulina podem ser classificados de acordo com o sitio de reconhecimento molecular à proteína alvo ou quanto ao efeito provocado sobre a dinâmica dos microtúbulos.

Classificação quanto ao sítio de ligação

Atualmente são conhecidos três sítios de ligação para fármacos e substâncias bioativas na proteína β-tubulina (SCHWARTZ, 2009; PANDIT et.ai, 2006):

1) sitio da vinca;

2) sítio dos taxóis;

3) sítio da colchicina.

- sitio da vinca: sitio de ligação dos alcalóides da vinca (vimblastina

(16), vincristina (17}). A vimblastina, por exemplo, é capaz de se ligar à tubulina solúvel e aos microtúbulos, apresentando a capacidade de aumentar sua própria afinidade pela β-tubulina.

- sitio dos taxóis: sitio de ligação do paclitaxel (5), docetaxel (18), epotiíona B (19), que são capazes de se ligar apenas ao microtúbulos e este sítio está localizado na parte interna dos microtúbulos. - sitio da colchicina: sitio mais tolerante a variações estruturais e diversidade molecular. A colchicina (20) e combretastatina A4 (21) são exemplos de ligantes deste sitio de reconhecimento molecular e apresentam afinidade à β-tubulina solúvel. Após a interação entre molécula-receptor ocorrem mudanças conformacionais, reduzindo a construção dos microtúbulos.

Classificação quanto ao efeito sobre a dinâmica dos microtúbulos Com relação ao efeito desencadeado após interação com seus respectivos sítios, fármacos e substâncias bioativas podem ser classificados como estabilizadores ou desestabiíizadores da polimerização de microtúbulos.

Os ditos estabilizadores estimulam a polimerização dos microtúbulos criando durante a mitose, estruturas aberrantes que induzem a apoptose celular, enquanto os desestabiíizadores inibem a polimerização das tubulinas e consequentemente a formação dos microtúbulos. Independente do efeito desencadeado após interação,. são observadas mudanças na dinâmica dos microtúbulos e apoptose da célula em divisão (JORDAN & WILSON, 2004).

A maior seletividade citotóxica dos fármacos que atuam sobre os microtúbulos está associada ao mecanismo de ação e à velocidade de tum- overdos microtúbulos na mitose (JORDAN & WILSON, 2004).

A eficiência da abordagem sobre os microtúbulos é confirmada pelo sucesso terapêutico de alcalóides de vinca (vimblastina e vincristína) e taxóis (paditaxel) no tratamento de diversos tipos de tumores, desde a década de 60 (CHABNER et.al., 2006).

Outrossim, o uso prolongado dos alcalóides da vinca e taxóis na clinica médica está associado ao surgimento da resistência quimioterápica. (CHEN et. a!. 2011). Os mecanismos de resistência possuem natureza diversa e os mais aceitos incluem a participação de: bombas de efluxo dependente de ATP, glicoproteínas P e superexpressão da ísoforma β III de tubulina (CHEN et.al. 2011; LEE ef.a/.2010; SÈVE & DUMONTET, 2008).

Combretastatinas As combretastatinas são um grupo de substâncias isoladas, no inicio da década de 80 por Petit e coíaboradores, do arbustro sul-africano CombfBttum caffrum. (FURST et.al., 2009) As propriedades terapêuticas de plantas do género Combrettum já eram conhecidas e empregadas por tribos africanas e em povoados indianos no tratamento de distintas enfermidades (PETÍT et.al. 1995).

Compostos de natureza estilbênica (combretastatina A1-6), bibenzíiíca (combretastatina B1-4), fenantrênica (combretastatina C1) e macrolatônica (combretastatina D 1-2) compõem o grupo das combretastatinas (NAM, 2003) (Figura 7).

Dentre as combretastatinas, a combretastatina A4 (CA-4) se destaca por apresentar potente atividade crtotóxica frente a diversas linhagens tumorais normais e em linhagens que apresentam resistência aos fármacos disponíveis na terapêutica (TRON et.al., 2006).

A combretastatina A4 (21) é encontrada na casca do Combretum caffrum. É o composto de estrutura química mais simples conhecido a exercer potente atividade citotóxica, (PETIT et.al. , 1995) através da interaçáo reversível com o sitio da colchicina da β-tubulina (SHAN et.al., 2011).

Mais recentemente, a CA-4 tem sido apontada como ativadora de proteínas cinases ativadas por AlvtP (AMPK) e estimuladora das proteínas cínase regulada por sinal extracelufar (ERK1/2) e proteína cinase ativada por mitógeno p38 (MAPK p38). (COCCETI et.al., 2010), conferindo a este derivado estilbêníco natural perfil de ação multi-alvo.

Um fato interessante observado é que alguns fármacos ou substâncias bioativas que alteram de alguma maneira a dinâmica dos microtúbulos, quando administrados em menores concentrações apresentam atividade específica sobre a vasculatura tumorai e, portanto, são considerados agentes perturbadores vasculares (VDAs, do termo em inglês vascular disrupting agents). (KANTHOU & TOZER, 2009)

A CA-4 (21) é o mais conhecido e estudado dos VDAs e é capaz de interromper o fluxo sanguíneo no centro de um tumor sólido em doses menores que as máximas toleradas, uma vez que apresenta maior seletividade citotóxica frente às células endoteliais, que a princípio são mais sensíveis à desorganização dos microtúbulos que outros tipos celulares (TRON, et. ai. 2006).

CA-4: Aspectos estruturais e modificações moleculares

Composta por dois anéis aromáticos e um espaçador etilênico (Figura 8), a combretastatina A4 (21) tem sido amplamente utilizada como protótipo para modificações moleculares na busca de compostos sintéticos que apresentem potência equivalente e melhores parâmetros farmacocínéticos (FURST etal. 2009; COMBES et.al., 2011; TRON etal., 2006).

A busca por moléculas com melhores propriedades farmacocinéticas que a CA-4 se faz necessário, pois a isomerização in vivo da ligação dupla de estereoquímica Z no isômero E e a baixa solubilidade são os principais problemas associados à estrutura da CA-4 (FURST et.al., 2009; TRON et.al., 2006). A despeito dessas limitações a CA-4 se encontra em estudos clínicos para o tratamento de tumores sólidos e doenças relacionadas com a formação excessiva de vasos sanguíneos (ex. degeneração macular relacionada à idade), sendo utilizados nestes estudos clínicos, o fosfato dissódico da combretastatina A4 (em: <http://oxigene.com/pipeline/pipeiine/>. Acesso em: 15 de Fevereiro de 2012).

Nos últimos anos, foram realizadas diversas modificações sobre a estrutura da CA-4, baseadas em modificações nos anéis A e/ou B, e no espaçador etilênico. (Para mais informações: NAM, 2003; SHAN et.al., 2011 ; TRON et. aí. , 2006) (Figura 9).

Os anéis aromáticos da combretastatina A4 não são dispostos de forma plana entre si (LEE et.al., 2010). Dessa forma, as modificações moleculares realizadas no espaçador etilênico visam manter a distância e os ângulos entre os dois anéis eliminando a possibilidade de isomerização e consequente mudança da disposição espacial propícia para a atividade citotóxica (FURST etal., 2009). Dentre as modificações estruturais realizadas, merecem destaque aquelas realizadas por Ducki e colaboradores (1998), tendo como base o trabalho publicado por Edwards e colaboradores anos antes (1990), que sintetizaram e avaliaram a aíividade crtotoxica de oito chalconas sobre a linhagem de leucemia K562 e identificaram que a chalcona correspondente à CA-4 (41) mantém potente atividade cítotóxica (Figura 10).

Segundo Ducki e colab.(1998), a justificativa para a atividade citotóxica observada para um derivado com estereoquímica E, em nível da ligação dupla, com consequente manutenção da inibição da polimerização dos microtúbulos, estaria associada a fatores conformacionais e à preferência peta conformação s-trans das chalconas testadas quando em solução. (Figura 11)

Derivados de combrestatinas, os quais podem estar na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como composições farmacêuticas antitumorais compreendendo os mesmos e suas sínteses estão descritas em diversos documentos da literatura, como por exemplo US 4996237, US 5525632, US 5731353, US 5674906, WO 94/05682 e WO 2007/059118. Tais documentos descrevem derivados de combrestatínas e suas atividades antitumorais in vitro. É importante ressaltar que nenhum dos derivados mencionados acima possui estrutura semelhante, e tampouco sugerem os derivados aqui descritos.

Embora alguns dos derivados aqui propostos tenham sido utilizados como intermediários de síntese para compostos antibacterianos como descritos em CAO, X. et.el , tal documento sequer menciona sua atividade antitumoral nem sugere composições eficazes no tratamento de tumores.

Sumário da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção descreve composições antitumorais compreendendo derivados da combretastatina.

É, portanto um objeto da presente invenção uma composição farmacêutica antitumoral compreendendo:

a) derivados da combretastatina de acordo com a fórmula geral (I):

Figure imgf000016_0001

Figure imgf000016_0002

R2 é H, OH, C C6 a!coxi, Ci-C10 aiquil linear ou ramificado, F, Cl, Br,

NOs, CN, Ci~C6 haioalquif, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br;

R3 é H, OH, CrC6 alcoxi, C Ci0 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, fenií opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-;

R é H, OH, OC C6 alcoxi, Ci-d0 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br,

N02, CN, Ci-Ce haioalquif, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br;

R5 é H, C CfQ aiquil linear ou ramificado, fenií opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-f benzil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-; anel heterocídico; ou seu sal farmaceuticamente aceitável;

b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferenclaimeníe, a composição ê eficaz em tumores selecionados dentre leucemia, tumores de cólon, giioblaâtoma, melanprna, cafcinoma de próstata, adenocarcinoma de ovário e carcinoma bronqut-alveolar pulmonar.

É um adicional objeto da presente invenção o uso de compostos derivados da combretastatina de acordo com a fórmula gera! (t):

Figure imgf000017_0001

R2 é H, OH, C--C6 aícoxi, d-Gio alqui! linear ou ramificado, F, Cl, Br, O2, OH, C C6 haloaíquil, em que o halogênio pode ser F, Cl é/ou Br; F¾ é H, OH, Ci-C6 aícoxi, C C10 alquíi linear ou ramificado, F, Ci, Br, feni! opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-;

RA é H, OH, OC^-Ce aícoxi, C G 0 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02l CN, Ci-C6 haloaiquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; Rs é Hj Ci-Cip aiquil linear ou ramificado, fenil opcionalmente substituído por R? na posição ò-, m- e/ou. p - -benzi! opcionalmente substituído- por f¾ na posição o-, rn~ e/ou p-; anef heterocíclicos ou seu sai farmaceuticameníe aceitável;

como agentes antitumorais.

Ê um adicionai objeto da presente invenção o uso de compostos derivados da com retastatina de acordo com a fórmula gerai (I):

Figure imgf000018_0001

R2 é H, OH, Cj-Ce a!coxi, C C,o alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, Ci-Cs haloaiquil, em que o haiogênio pode ser F, Cl e ou Br; R3 é H, OH, Ci-Ce aícoxi, Ci-C10 aiquil linear ou ramificado, F, Cí, Br, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-; é H, OH, OCi-Ce a!coxi, C G10 atquíl linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, Cr Ce hatoalquíf, em que o haiogênio pode ser F, Cl eiou Br; Rs é H, C -C10 aíquil linear ou ramificado, feníi opcionalmente substituído por Ra na posição o-, m- e/ou p- benzi! opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-; anel heterocíclico; ou seu sal farmaceuticamente aceitável;

como sondas farmacológicas em estudo de ligação θ ou interação com a β-tubulina e as isoformas desta proteína.

Estes e outros ofajetos da invenção serão imediatamente valorizados petos versados na arte e pelas. empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

figura 1. Resumo dos mecanismos de ação e locais de acão de fármacos antineopíásicos. (adaptado de Goodman & Gilman, As Bases Farmacológicas da Terapêutica, 10°edfçâo, Ed. McGraw Hifí.Río de Janeiro 2001).

Figura 2. Estruturas químicas dos fármacos quimioterápicos 6- mercaptopurina (1), 5-fluorouracila (2), cisplatina (3), melfaian (4), paclitaxel (5), campotecina (6) e etoposídeo (7).

Figura 3. Timeíine dos inibidores de tirosina cinase.

Figura 4. Estrutura dos microtúbulos e suas subunidades. Â. Estrutura do heterodímero das proteínas α e β-tubulina (subunidade de tubuiina); B. subunidade de tubuiina e um protofilamento que compõe os microtúbulos; C. Representação esquemática de um microtúbuio.

Figura reproduzida de ALBERTS.B. Biologia Molecular da Célula. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010).

Figura 5. Estruturas químicas da vimbiastina (16) e paclitaxel (5). 39

Figura 6. Estruturas químicas dos inibidores inibidores da função de microtúbulos. vimbiastina (16), vincristina (17), paclitaxel (5), docetaxei (18), epotilona B (19), coíchicina (20), combretastatina A4 (21). Figura 7. Estrutura química das combretastatinas A - D.

Figura 8. Subunidades que constituem a CA-4 (21).

Figura 9. Modificações estruturais realizadas tendo a CA-4 como protótipo. A. modificações sobre o anel A (34 e 35); B. modificações sobre o espaçador (36, 37 e 38); C. modificações sobre o anel 8 (39 e 40).

Figura 10. Estrutura química da chalcona análoga a CA-4 (41) que apresenta potente atividade cítotóxica.

Figura 11. Representação cios confôrmeros da '.chalcona análoga a CA-4 e estrutura química da CA-4.

figura 12. Planejamento estrutural de análogos N-aci!idrazôntcos da combretastatina A-4. Em azul a subunidade aromática A, em verde a subunidade B e em vermelho o espaçador.

Figura 13. Ugartes de β-tubulina de origem natura! (A) e síntética(B).

Figura 14. Alinhamento por padrão estrutural em comum realizado através do programa MARVIN SKETCH 5.3 (ChemAxon) a partir dos confôrmeros de menor energia da combretastatina A4 e LASSBio-1593 (42h) calculados peio programa SPARTAN'08 (Wavefítnciton Inc.) ,

Figura 15. Representação dos análogos N-acilidrazônicos planejados como análogos da CA-4.

Figura 16. Espectro de infravermelho do composto 3,4,5- trimetoxibenzoidrazida (49) em pastilha de KBr.

Figura 17. Espectro de R N 1H da 3,4,5-trimôtoxihidrazida (49)'(D SO- d6/ 200MHz TMS) .

Figura 18. Espectro de RMN 1H do composto LASSBio-1595 (42]) (DMSO-d6/ 200MHz/TMS).

Figura 19. Espectro de RMN 13C do composto LASSBio-1595 (42j) <DMSO-d6/ 50MHZ/TMS).

Figura 20 A. Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 3,4,5- trimetoxibenzidrazida (49) e B. Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto LASSBio-1587 (42b). Figura 21. Termograma do lote 1 do composto LASSBio-1586. {Análise térmica no aparelho DSC-60-SHIMADZU com taxa de aquecimento de 20°C/min e temperatura máxima de 300°C .

Figura 22. Cromatograma do lote 1 do compostos LASSBio-1586 (42a).

Figura 23. Espectro de RMN 1H do lote 1 do composto LASSBio-1586

(42a).

Figura 24. A. Termograma de DSC do lote 1 antes de ser recristalizado.

B. Termograma de DSC do lote 1 após cristalização com metanol/ água sob aquecimento.

Figura 25. Representação Ortep do composto LASSBio-1586 (42a).

Figura 26. Estruturas químicas de LASSBio-1586 (42a) β LASSBio-1587 (42b). Em destaque estão os anéis A (em vermelho) e B (verde).

Figura 27, ínteraçôes polares observadas para o composto LASSBio- 1586 (A) e LASSBio-1587(B). Linhas tracejadas em amarelo indicam ligações de hidrogénio.

Figura 28. Estrutura química da CA-4 (21). Em destaque estão os anéis A (em vermelho) e B (verde).

Figura 29. A. Ligações de hidrogénio observadas para a CA-4 no sítio da colchicina. B. Superffcie de aminoácidos (a 5Â de distância da CA-4) do sítio de reconhecimento molecular para a CA-4, em amarelo e LASSBio-1586 em azul claro.

Figura 30. Estrutura química de LASSBio-1596(421). Em destaque estão os anéis A (em vermelho) e B (verde).

Figura 31. A. Interações de LASSBio-1596 no sítio da colchicina da proteína beía-tubuiina. B. Superfície de aminoácidos que circundam LASSBio- 1596 (amarelo) e LASSBio-1586 (verde) a 5Â de distância.

Figura 32. Superfície dos aminoácidos que circundam a 5 Â de distância o composto LASSBio-1586 em seu sítio de reconhecimento molecular. A) perspectiva frontal B) perspectiva lateral.

Figura 33. Grupamentos arila das modificações propostas sobre a série inicial. Figura 34. Espectro de RMN 1 H -do composta LASSBIo-1742 (DMSO-d6/'

200 fVIHz/ T S).

Figura 35. Espectro de 13C RMN do composto LASSBio-1742 (DMSO- d6/ 50 M zJ TMS).

Figura 36. Espectro de 1H RMN do composto LASSBio-1744 (D SO-d6/ 200 MHz TMS).

Figura 37. Estratégias de Modificações Moleculares empregadas sobre LASSBio-1586 para o desenho de novos análogos.

Figura 38. Estruturas-cristatográficas determinadas por cristalografia de' raios-X dos compostos LASSBio-294 e LASSBio-785 (Reproduzido de KUMMHRLE, et.al 2009).

Figura 39. Equilíbrio conformacional para chalconas a-metiladas análogas a CA-4.

Figura 40 Compostos LASSBio-1586 (carbonos em cinza) e LASSBio- 1734 (carbonos em verde) no sítio da coíchíc na da proteína β-tubulina.

DeserlcãQ Detalhada da.. Invengão

Os exemplos aqui descritos têm o intuito apenas de exemplificar alguns dos inúmeros meios de realizar a presente invenção, não devendo ser encarados de forma a limitá-la» mas somente de ilustrá-la.

Os derivados da combretastatina com atividade antitumoral da presente invenção são exemplificados na fórmula geral (í):

Figure imgf000022_0001

onde:

Figure imgf000023_0001

R? è H, OH, CrC6 alcoxi, -Ci-Cio alquii linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, C Cs haloalquil, em que o alogênio pode ser F, CS e/ou Br; R3 é H, OH, Ct-Ce aícpxi, C1-C10 alquíl linear ou ramificado, F, Ci, Br, fenii opcionalmente substituído por 2 na posição o-, m- e/ou p-;

R4 é H, OH, ÔCrCe aicoxi, C1-C10 alquii linear ou ramificado,. F, Cl, Br, O . CN, CrCe haloalquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; f¾é H, C1-C10 alquíl linear ou ramificado, fenif opcionalmente substituído por i¾ na posição o-, m- e/ou p-, benzil opcionalmente substituído por f¾ na posição o-, m- e/ou p-; anel heterocíclico; ou seu sal farmaceuticamente aceitável;

Para efeitos da presente invenção, ente de-se como anel heterocíclico todo anel, saturado ou insaturado, composto por 5 a 8 membros, onde pelo menos um dos átomos de carbono é substituído por N, S ou O; Além disso, os compostos da fórmula geral (I) podem apresentar estereoquímica tanto Z quanto E, estando dessa forma ambas as configurações cobertas pela presente invenção.

Tais derivados são úteis no tratamento de tumores sólidos e/ou hematológicos Exemplos de tumores sólidos para efeitos da presente invenção incluem, sem se limitar, tumores de mama, pulmão, bexiga, fígado, pâncreas, laringe tireóide, esôfago, cólon, pele, próstata, trato gastrointestinal, sistema nervoso central e combinações dos mesmos. Exemplos de tumores hematológicos incluem, sem limitações, tumores do sistema hematopoiétíco e reticuloendoteiial, e tumores dos linfonodos, como p. ex. leucemia, Itnfomas, mielomas, e doença de Hodgkin.

Os derivados da presente invenção, bem como suas composições mostraram desempenho especial no tratamento de leucemia, tumores de cólon, glioblastoma, meianoma, carcinoma de próstata, adenocârcínoma de ovário e carcinoma bronqui-atveolar pulmonar.

Além disso, os compostos acima são úteis como ferramentas farmacológicas (sondas ou "probes" farmacológicos em estudos de ligação e/ou interaçâo corn a β-tubulina e as isoformas desta proteína.

As composições farmacêuticas da presente invenção -sãocomposições compreendendo os derivados da combretastâtima descritos acima em um veiculo fannaceuticamente aceitável.

As composições da presente invenção podem ser administradas por quaisquer vias comumente conhecidas, sendo preferencial as vias oral, parentsral, intramuscular e transdérmica. O veículo farmaceuticamente aceitável como mencionado acima é adaptado para a forma farmacêutica de escolha, sendo a¾o comum para um técnico no assunto,

A composição compreendendo os derivados mencionados acima pode ainda compreender um ou mais ativos antitumorais, visando potencializar o efeito. A combinação de ativos pode ser por meio de composições distinta ou ambos os ativos podem estar presentes na mesma composição. O que irá determinar a forma de associação será o regime terapêutico e também a compatibilidade dos ativos. Além disso, sua administração pode ser tanto simultânea quanto sequenciai

Exemplos de agentes antitumorais que podem ser utilizados nessas combinações íncíuem os fármacos conhecidos do estado da técnica.

Planejamento Molecular

O planejamento molecular empregado no desenho dos compostos 42a -I (Figura 12), baseou-se em modificações estruturais propostas no protótipo CA- 4. Estas modificações foram planejadas considerando a atividade citotóxica, em potência 4,3 nM, para a chalcona (41), a qual revela a manutenção da atividade desejada para um sistema estireno com estereoquírnica E. Dessa forma foi proposta a introdução da subunkJade /V-açilidrazona (NAH) como espaçador entre os anéis aromáticos presentes em CA-4 e na chalcona 41

A manutenção da unidade 3,4,5-trimetoxifenila (anel A, em azul na Figura 12), considerou sua ocorrência em diversos produtos naturais e substâncias bioativas que apresentam atividade citotóxica via alteração na dinâmica de mícrotúbulos, a exemplo da CA-4, coichicina (20), podofilotoxina (43), esteganacina (44) e os compostos 45, 46 e 47 (Figura 13). (LIU et. ai., 200Ô; CHEN etai, 201 ; TRON eia!., 2006; PANDIT eta/., 2006).

Considerando as diferenças eletrônicas e esterèoquímicas relacionadas a troca do espaçador etileno em 21, pela subunidade /V-acitidrazona nos compostos planejados (42a-l), foi realizado estudo in siíico através da determinação e posterior alinhamento dos confôrmeros de menor energia da CA-4 e do análogo 42h (LASSBio-1593), visando detectar diferenças relevantes na orientação espacial entre as subunidades aromáticas A e B. (Figura 14). Foi observado que a despeito da estereoquírnica £ relativa à ligação imínica da /V-acilidrazona 42h, houve boa sobreposição entre as moléculas, sugerindo que em ambos os compostos as subunidades A e B, presentes nô protótipo CA-4 e no análogo 42h, poderiam interagir de forma similar com o sítio de reconhecimento molecular.

Em continuidade ao planejamento dos análogos da CA-4, inicialmente foi proposta a manutenção do anel isovanilina (anel B, em verde na Figura 12), presente no protótipo CA-4, de modo a permitir a construção de análogo direto do protótipo sefecionado, i.e. LASSBio- 593. Posteriormente foi planejada a adição de substituintes nas posições meta e para do anel B, explorando diferentes padrões de oxigenação, tamanho é propriedades oxi-redutivas/ antioxidantes dos substituintes, resultando no planejamento de 1 compostos W-acilidrazônicos (42a-l)t representados esquematicamente na Figura 15.

Síntese dos análogos N-aciiidrazômcos (42a-l) A metodologia sintética selecionada para a obtenção dos compostos planejados, ilustrada no esquema 1 , baseia-se em reações clássicas da química orgânica, fundamentadas em interconversão de grupos funcionais (IGF) rápidas e facilmente acompanhas pelos métodos anaiiticos disponíveis, como cromatografia de camada delgada (CCD) e espectroscopia de infravermelho (IV).

Em linhas gerais, os compostos foram obtidos em bons a. elevados rendimentos .-a partir de síntese linear de duas etapas (Esquema 1), discutidas a seguir:

Figure imgf000026_0001

Esquema 1. Etapas reacionais planejadas para a síntese dos derivados N-acliidrazónícos

(LIMA ot.al. 2000).

Síntese do intermediário 3,4,S-«frÍmètoxíbefiiíclfa2ida (48).

A primeira etapa da metodologia sintética proposta foi a obtenção da 3,4,5-trimetoxíbenzidrazida (49), intermediário-chave para a obtenção dos derivados /V-acilidrazônicos planejados. O composto 49 foi obtido em 92% de rendimento após reação de hidrazinólise do 3, , 5-trimetoxibenzoato de metila (48), adquirido comercialmente, a refluxo em metanol por 2 horas. (LIMA er.a/.,2000).

A IGF pôde ser confirmada peio espectro de infravermelho do sólido obtido, peia visualização das bandas de deformação axial simétrica e assimétrica das ligações HH e NH2 em 3379, 3336 e 3263 cm ', banda de deformação axial da ligação C=0 de amida (banda l de amida) a 1657 cm"1 e banda de deformação angular da ligação N-H (banda II de amida) em 1614 cm" \ (Figura 16) A estrutura química foi confirmada após análise e interpretação do espectro de RMH 1H do produto obtido, que permitiu a visualização de um simpieto com integrai igual a um, centrado a 9,72 ppm, e um sinal largo com integrai .igual -a dois em 4,47 ppm, referentes, respectivamente, aos hidrogênlos amídsco Θ amínicos da hidrazida. O símpíeto . a 7,16 ppm relativo aos hidrogênios aromáticos, permitiram completar a elucidação estrutural do intermecSiário-chave 49 (Figura 17),

O intermediário 49 foi obtido em rendimento médio de 92,1 % ± 3,68 (n= 3), sendo utilizado, sem a necessidade de procedimentos adicionais de purificação, na. :efapâ seguinte para obtenção dos derivados W-ácílidrazônicos planejados.

Síntese dos derivados JW-acilldrazõn ços Í42a-S)

Dispondo do intermediário 49, a etapa de condensação, ácido catalisada, da hidrazida (49) com diferentes aldeídos funcionalizados, previamente selecionados de acordo com a etapa de planejamento molecular, foi realizada nas condições clássicas utilizadas rotineiramente em nosso laboratório (LASSBio-UFRJ), permitiram a obtenção dos derivados N~ aciiidrazônicos desejados em bons a elevados rendimentos (42a-t) {LIMA etal,. 2000).

Após a sofubiizaçâo da hidrazida intermediária (49) em etanol, adição do aldeído correspondente, e do catalisador (i.e. HCI cone), manteve-se o sistema sob agitação constante a temperatura ambiente por tempos que variaram de 0,5 a 4 horas, quando o acompanhamento por CGD indicou total consumo da hidrazida e do aldeído. Nestas condições, os compostos planejados foram obtidos em bons rendimentos (Tabela 2), com grau de pureza satisfatória (>95%) e sintetizados em rendimentos globais médios à elevados (Tabela 3).

Tabela 2. Rendimentos obtidos na etapa de construção da função imina durante a síntese dos derivados AZ-acilidrazônicos planejados (42a-l). Atile, Rendimento

ΓΑδ?Βίο-1586Τ 2ο) fértil 75,81 10.2 % (n=6)

LASSBio-1587 (42 b) 3- OH- fenil 83.3 ± 7,2 % (n=3)

LASSBio-1588 (42c) 4- OH- fent! 64.4 ± 0,8 %.(n=2>

LAS5BÍ -J.589 (42d) 3.4-OH- fenil 85 % (n=l)

LASSBio-1590 (42a) 3,4-OCH3- fenii 76,3 * 13,7 % (ne2>

USSBio-1591 (42f) 3 OCH2Q~feriif 70 % (n= 2)

L SSBio-139242g) 4-OH-3-OCH3- ferul 61,9 Í 11,4 % (n=2)

WSSBfo-í593 (42h) 3-OH-4-OCH3- fenil 72,2 ± 18,7 % (n=2)

SSBÍO-15 4 (42i) 3,4(5-OCH3- fenif 92 % (n~í)

SSBio-1595 (42j) 3 -cromon 95 % (n=l)

LASSBfo-1596 (42Í) 3,5-di†ercbutfl-4-OH- fenil 67.2 ± 9.3-% («=£)

Tabela 3. Rendimentos globais de obtenção, ponto de fusão, pureza determinada e tempo de retenção dos compostos AZ-acilidrazônicos

sintetizados (42a-l).

Comporto <%> P.f. DSC} ('d Putta» (CL/E) (¾)

5S8½-1586 <4¾) 70 131 Λ6 99.4 3.89

Tf 251.1 975 3ia ro¾ a¾c ao % Hjo S5S (42*) 1982 93.7

£S8» 5S9 (424) n 281.9 »0 2.Ôâ 73% CH N 30 % H20

MS5B¾ -IS90 MZc) 70 179.2 mi.Z /Σ00.2 3.79 60% ÍH3ÍN 40 % $¾ø* 991 (4Zf) Í22.7 sr.9 3.» CHjíN HtO*

LASS!Jio 1592 (42$) *>? 22È.8 Í.32

USS8/.4893 (42 ) té S01.S 99.6 3Λ3 70¾ CHSCN30 % HjO SS6ii3")094 (42i) 84 .soa 96.0 3.41 7a¾.«45CN 3ô ¾ f¾0* 5SSb-1295 (4¾i ê 206.2 98.C 3.49

LASS8io-18% (42f) 249.3 z . ......

* fase môvei contendo 0,05% de ácido trifluoracético

Os compostos foram caracterizados por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogénio (RMN 1H) e de carbono {RMN 13C), espectroscopia de infravermelho (IV) e caforimetria exploratória díferenciaf (DSC, do termo em inglês Differentiai Scanning Calorimetty). A pureza foi determinada por Cromatografia Liquida de Ãlta Eficiência (CLAE) {coluna romasil 100-5 C18 (4,6 mm x 250 mm), detector SPD- 20A (Diode Array) no comprimento de onda de 254 nm para quantificação do anaiito em um fluxo constante de ImUmin, com a injeçào de um volume de 20 pL. Solventes padrão CLAE foram adquiridos da TEDIA). Devido à simplicidade do padrão estrutural cios derivados planejados foi possível a rápida elucidação estrutura! peias técnicas de RMN H e RMN 13C.

No espectro de RM 1H dos compostos; 42a-l foram visualizados simpletos correspondentes ao hidrogénio amfdico {COM|i; δ 11,49 - 11,80), hidrogénio irnínico (N=CH; δ 8,27 - 8,48), hidrogênios aromáticos do anel 3,4,5 trimetoxilado (Õ 7.22 - 7,26) e às metoxilas (δ 3,86 ppm e -3,73 ppm). Ademais foram observados os sinais característicos dos subsíítuintes do ..anel B, que aumentam a complexidade na elucidação estrutural (Tabela 4). No espectro de RMN 13C, os sinais mais característicos observados foram aqueles relativos â carbonila (ô 162 ppm), aos carbonos 3 e 5 do anel trimetoxilado (δ 157 ppm), ao carbono da imina (147 ppm), ao carbono 4 do anei trimetoxiiado (δ 140 ppm), aos carbonos 2 e 6 do anel trimetoxilado (δ 105 ppm) e aos carbonos das metoxilas (δ 60 ppm e 56 ppm) (Tabela 5). As figuras 18 e 19 exemplificam a elucidação estrutura! por RMN 1H e RMN 3C do composto LASSBío-1595.

Tabela 4a. Deslocamentos químicos (õ em ppm) observados- nos espectros de RMN 1H a 200 MHz dos compostos LASSBio-1586 a LASSBio-1596.

Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001

Tabela 4b. Desíocameníos químicos (δ em ppm) observados nos. espectros de R N *H a 200 MHz dos compostos LASSBio- 586 a LASSBio-1596.

Composto H2VH6' H37H5' Η4· HT H8' W

7,73 7,47 ~~ 7,47 -

LASSSio- (2H, d 7,45 7,45

1586(42a)

J=2Hz) (3H, m) (3H, m)

7,23 <4H,m) 7,11

LASSBio- /6,84 — / 7,23

(2H. d, 9,68 (OH) 1587(42b) (2H, d, (4H,m) J=10H2)

J=BHz)

6.84 7,57

LASSBio- {2H, d, (2H, d, 9,94 (OH) I588(42c)

J=8Hz) J=8Hz)

7,22 (3H, m) - / 6,94

LASSBio- / Ô.89 (1H. d, 9,34 (OH) 1589(42d) (1H, d,

J=QBx)

JK8Hz)

7,35 {1H, s)

— - /7«21

LASSBIo- / 7.03 {3H, m, 3,81 (OCH3) 1590(42e) (1H, d,

J=10 Hz}

J~8Hz)

6,09 (2H,s)/ 6,99

LASSBio- 7,31

7,23 - 7,16 (IH, d,

1591 <42f)

{3H. m) J=8Hz)

7,32 (1H, s)

— / 7..09

LASSBio- /β,85 3,83(OCH3); 1592(42g) (1H. d,

(1 H, d, 9,56 (OH)

J=8Bz)

J=8Hz)

7,28 (1H, s) — / 6.97

LASSBio- 7,07 3,80 (OCH3);

(2H, rn,

1593(42h) (2H, m, 9,36 (OH)

J=6Hz J=8Hz)

LASSBio- 3,84 & 3,71

7,03 (2H, s)

1594(42i) íOCH3)

8,65 <1H, s}/ -~/7J2 7,55 8.13

LASSBro- 7,86 (1 H, t,

1585(42j) (1H, d, (1Η (1H, d,

J~8Hz) J*8Hz) J=8Hz) J=8Hz)

LASSBio- 7,43 (OH);

7,48 (2H, s) 1 άΛ (ΓΜΔ Tatiela Sa. Deslocamentos químicos (δ em pprn) observados nos espectros de RMN 13C a 50 MHz dos compostos LASSBÍCK1586 a LASSBio-1596.

Composto CO CN Cl C2 C3 C4 C3a & C4a

&C6 &C5 C5a

LÂSSBw- 162,6 147/8 128,5 105,3 152,7 140,5 56,1 60,2

1586(42a)

LASSBio- 162,7 143,0 128.6 105,3 152,8 140,6 56,2 60,2

15871421))

LASSBío- 162,4 148,2 "128,8 1.05,2 152,7 140.4 56,1 60,2

1S88|42c)

tASSBto- 162,3 148,3 128,2 105,2 152,7 140,4 56,1 60,1

158Ô(42d)

LASSBto- 162,5 148,1 127,0 105,2 152,7 140,6 56.1 60,1

1990 42e)

lÃSSBfe- 162,5 147.7 128.6 104,7 152,7 140,4 56,1 60,1

1691(421)

LASSBto- 162,3 148,5 125,7 105,2 52;? 140,4 56,1 60,1

1592(42g}

LASSBio- 162,5 148,1 127,2 105,2 152,8 140,4 56,2 60,2

1S93{42 )

LASSBio- 162,6 148,0 129,8 105,3 153,2 140,5 56,1 60,1

1594(421)

LASSBio- 162,3 140,6 128, 1 105,3 152,7 140,2 56,1 60,1

1SS5(42j)

LASSBio- 162,2 149,4 128.7 105,1 152,7 1 0,3 56,1 60,1

1596(421)

Tabela 5b. Deslocamentos químicos (Õ.em ppm) observados" nos espectros de

RMN 13C a 50 MHz dos compostos LASSBiô-1686 a LASSBio-1596.

C3'a/ C7'a/

Composto CC11** 'CC22VWC6' Ce3VCe5s'* C4' CF

C4' C8'a

LASSBfo-

134,3 128,9 127,1 130,1

1586(42a)

LASSBio-

135,7 112,8 167,8

1587(42b) . 1 ,5

LASSBIo-

125,3 115,8 128,9

1588(42c> 159,5 —

LASSBjo- 125.8 122,7 145,8 148,0

1589(42d) —

LASSBio-

128,7

1590{42e) 111 ,0 149.1 150,8

LASSBio- _ 11M

1£9l( 0 in08a,2, 4 14Λ8®,η0 _ W 1

42f) 1,fi6/„12M3,31 - 1 48,0/

123,7

LASSBio*

128,8 109,1 148,1 149,0

1592(429)

LASSBio- 1593(42h) 128,7 122,4 147,0 49,9 —

LASSBIo-

128,6

1594(421) 104,3 152,7 135,2 — LASSBio- 155,8/

175,1 118,3/ 134,7 123,3 128,1

1S9S(42j 118.7 '54,5 7125,2 LASSBio-

125,8 1.23.9 139,5 156,1

1696(4.

De forma análoga ao descrito para o intermediário hidrazída (49), a conversão à /V-acsiidrazona foi acompanhada por espectroscopia de infravermelho através dó desaparecimento de bandas de deformação axial simétrica e assimétrica da ligação N-H (CONHNH^), e visualização da banda de deformação axiaí da ligação C=N e de bandas características ao padrão de substituição do anel B, proveniente do aldeído funcionalizadd utiiizado na reaçao de condensação ácido catalisada. Para ilustrar são mostrados ná figura 16 os espectros de infravermelho da hidrazida (49) e do composto LASSBio- 1587 (42b).

Síntese do derivado 3AS r«met0Xfbefi2ldrazidâ (49) (adaptado de LIMA etai 2000).

Figure imgf000032_0001

Em um baião da 250 ml, foram adicionados 5 g (22,1 mmofes) de 3,4,5- trimetoxibenzoato de meti!a (48) e 60 mL de etanol. A suspensão foi aquecida até soiubilízação para em seguida adicionar 21 ,4 mL (442 mmoles) de hidrazina hidrato 64%. A mistura reacional foi refiuxada por 2 horas até a conversão total do éster (48) na hidrazida correspondente (49), evidenciada por acompanhamento por CCD (efuente: n-hexano/ acetato de etifa 50%)

O isolamento foi feito por redução do volume de solvente e adição do conteúdo do balão sobre bécher contendo gelo picado (ca. 50 mL). O precipitado formado foi filtrado e seco a vácuo. P.F.= 166-168°C (lit. 158- 16CTÇ) (CAO et. ai. J. Chin. Chem. Soe, v;58,-n;2, .p,35-40, 2011..). Rendimento médio: 92,3 + 3,7% (t— 3).. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca'

Í.V. ( Br) (cm ): 3392, 3335, 3294, 3196 (V s;m. e 3ssim, NH), 1656 (VCO), 1614 (δ NH)

N 1H (200 MHz, D SO-de) õ (ppm): 9,72 (1 H, s, NH), 7,16 (2 H, s,

H2 & H6), 4,47 (2 H, sí, ΝΗ¾), 3,81 (6 H, s, H3a & H5â),. 3,69 (3 H, s, H4a).

RMU 1¾ (50 MHz, PMSG«<fc) δ (ppm): 165,4 (CO). 152,6 (C3 &- Ç5), 139,8 (C4), 128,4 (C1)S 104,5 (C2 & C6), 60,0 (C8), 55,9 (C7.&-.Ç8). Metodologia gerai para a obtenção dos compostos N- acllidrazôntcos a partir da 3,4,5 - trímetoxi - benzidrazída (42a-l) (adaptado de LIMA, et.al., 2000)

Em um balão de 25mL foram dissolvidos 0,2 g. (0,88 mmoles) da 3,4,5- trimetoxibenzidrazida (49) em 7mL de. etanol absoluto. Em seguida, foram adicionados 0,88 mrnoles do respectivo aldeído funcionalízado e uma gota de ácido clorídrico 37%. O sistema reacional foi deixado sob agitação a temperatura ambiente pelo tempo necessário para conversão dos reagentes no derivado /V-acilidrazônico correspondente, evidenciado por CCD (eiuente: n- hexano/ acetato de etila 50% ou diclorometano/metanol 5%

Os compostos 42a-I foram isolados após adição da mistura reacional sobre bécher contendo gelo picado (ca. 20 ml). O precipitado obtido foi filtrado e seco a vácuo, sendo, quando necessário, purificado por recristaliza âo ou coluna cromatográfica em sílica gel. Síntese do derivado (£)-W'-benziíideno-3,4,5-trimetoxibenzidrazfda rLASSBio-1586] (42a)

Figure imgf000034_0001

O composto 42a foi obtido ¾·· pártir da condensação da hidrazida {49} com benzaldeído (59) em rendimento médio de 75,8.± 10,2% {n=6). Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F.= 132,4*G (lit. 141-142eC)-(CAO etM J. Chin. Chem. Soe, v.58, n.2, p.35-40, 2011.) e 167,8°C (lit. 167-168X5) ( AZZONE & REINA. Bofíeíino deíe Sedute deía Accademia Gioenia dí Scienze Naturaíf in Catania, v.10, n.8, p. 689-702, 1971.).

IV (KBr) (cm-1): 3183 (V NH), 1648 (V CO), 1584 (V CN)

RMN H (200 Hz, DMSO-do) õ(ppm): 11,73 (1 H, s» NH), 8,48 (1 H, s, N=CM), 7,73 (2 H, d, J=2 Hz, HZ & H6'), 7,47- 7,45 (3 H, m, Η3\Η4' & H5'), 7,25 (2 H, s, H2 & H6), 3,87 (6 H, s, H3a & H5a), 3,73 (3 H, s, H5a).

RMN 13C (50 MHz, D SO-d6) δ (ppm): 162,6 (CO), 152,7' (C3 & C5), 147,8 (CN), 140,5 (C4), 134,3 (01 130,0 (C4% 128,8 (C2' & C6% 128,5 (C1). 127,0 (C3' & C5')t 105,3 (C2 & Ç6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a & C5a).

Pureza: 99,4 % (CLAE; T.R.= 3,89; CH3CN:H20 (7:3)).

Síntese do derivado (E) - N' - (3-hidroxfbenzHideno) - 3,4,5 - trlmetoxibenzidrazida£LASSBio«1587](42b).

Figure imgf000034_0002
O composto 42b foi obtido a partir da condensação cia hidrazida (49) com 3-hidroxibenzaldeído (65) em rendimento médio de 83,3 ± 7,2% (n=3). Aspecto físico: sólido amorfo de cor marrom. P.F. - 251 ,1°C

ÍV (KBr) (cm''): 3462 (V OH), 3230 (V NH), 1665 (V CO), 587 (V CN) RMN 1H (200 MHz, O SO-d6) δ (ppm): 11 ,68 (1 H, s, NH), 9,68 (1 H: s,

OH), 8,37 (1 H, s, N=CH), 7,23 (4 H, m, H2, H6, ), 7,11 (2 H, d, J=1GHz, H4'), 6,84 (2 H, d, J*6Hz, H6'), 3,86 (6 H, s, H3a . & H5a), 3,73 (3 H, s, H4a).

RMN 3C (50 MHz, D SO-cfe) δ (ppm): 162,8 (CO), 157,7 (C3'J, 152,7 (C3 & CS), 147,9 (CN), 140,5 (C4), 135,6 (Cf), 129,9 (C5*), 128,5 (C1), 118,8 (C6'), 117,5 (C41), 112,7 (C2*), 105,3 (C2 & C6), 60,2 (C4a), 56,1 (Cõa & C3a).

Pureza: 97,5 % (C1.AE; T.R - 3,12; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do derivado (E)-A/'-(4- idroxifaenzilideno) - 3,4,5 - trimetoxibenzidrazida [LASSBio-1588] (42c).

Figure imgf000035_0001

O composto 42c foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4-hidroxibenzaldeído (66) em rendimento médio de 64,5 ± 0,8% (n-2). Aspecto físico: sólido amorfo de cor amarelo claro, P.F. = 198,1°C

IV (KBr) cm"1: 3382 (V OH), 3279 (V NH). 1638 (V CO), 1584 (V CN) RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1 ,51 (1 H, s, NH), 9,94 (1 H, s,

OH), 8.36 (1 H, s, N=CH), 7,57 (2 H, d, J=8Hz, H3! & H5'), 7,22 (1 H, s, H2 & H6), 6,84 (2H, d, J=8Hz, H2' & H6 ), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,72 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 162,3 (CO), 159,4 (C4')t 152,7 (C3 & C5), 148,2 (CN), 140,3 (C4), 128,8 (C3' & C5'). 128,7 (01), 125,3 (CV), 115.77 (C2' & C6'), 105,2 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a & Cõa). Pureza: 95,7% (CLAE; T.R.= 3,26 min; CH3CN:H20 {6:4})

Síntese do derivado (£)-Ar^3,44iidroxibénzil.deno^

Figure imgf000036_0001

O composto 42d foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 3,4-dildroxibenzaldeído (67) em rendimento de 85% (n=1) . Aspecto físico: sólido cristalino (aspecto de algodão) de cor branca. P.F. = 281 ,9°C

IV (KBr) cm'"1: 3435 (V OH), 3215 (V NH), 1649 (V CO). 1582 (V CN) RMH 1H (200 MHz, D SO-de) δ (ppm): 11 ,48 (1 H, s, NH), 9,35 (2 H, si,

OH), 8,27 (s, 1 H, N=CH), 7,22 (3 H, m, H2, H8 & H2'), 6,95 (1H, d, J=6Hz, H5'), 6,89 (I H, d, J=8Hz, H6'), 3,86 (8 H, s, H3a & H5a), 3,72 (3 H, s, H4a).

13C (50 Hz, D SO-d6) δ (ppm): 162,2 (CO), 152,7 (C3 & G5)f 148,3 (CN), 148,0 (C4!), 145,7 (C3"), 140,3 (C4), 128,7 (C1 '), 125,7 (C1), 120,5 (C8'), 115,6 (C5')t 122,7 (C2'), 105, 1 (C2 &C6), 60,1 (C4a), 56, 1 (C3a & C5a)

Pureza: 99.0% (CLAE; T.R .« 2,88 min; CH3CN:HâO (7:3))

Síntese do derivado CE W'-{3,4-dimetoxib©nzilideno)-3,4,5- trimetoxibenzidrazida [LASSBio-1590] (42e)

Figure imgf000036_0002

O composto 42© foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 3,4-dimetoxibenzaldeído (68) em rendimento médio de 78,3 ± 13,7% (n=2). Aspecto físico: sólido amorfo de cor begé /P,F. = 179,2/ 191,2/ 200,2 °C (Foram observados três sinais no -temiogrania do iofe de lAÔSBio 590 utilizado para ensaios farmacológicos.).

IV (KBr) cm'1; 3221 (V NB), 1647 (V CO), 1582 (V CM)

HMH 1H (200 MHz, DMSO-de) δ (ppm>: 11 ,62 (1 H, s, NH), 8,40 (1 H, s, H=CH), 7.35 (1 H, s, H2'), 7.23 - 7,19 (3 H, ffl, H2, H6' & H5 , 7,03 (IH, d, J*8Hz, Ηβ'), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,81 (6 H, s, H3a' & H4a 3,72 (3 H, s, H4a)

RMN 13C (50 MHz, DMSO-de) Ô- (ppm): 162,4 (CO), 152,7 (C3 & CS), 50,8 (C4l), 149,1 (C3!), 148,1 (CN), 140,5 (C4), 128,6 (Cf ), 127,0 (C1), 121 ,8 (CÔ'), 111 ,5 (C2'), 108,3 (C41), 105,2 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3*a & 'C5'a), 55,5 (C4'a), 55,4 (C3'a).

Pureza: 97,6 % (CLAE; T.R.* '3.78 min; ChfeCNrf-fcO (8:4))

Síntese do derivado (E)-N'-<benzoId3[1 {3]d«oxoI-5-íImetHeno)- 3,4,5»

Figure imgf000037_0001

O composto 42f foi obtido a partir da condensação da hídrazida (49) com 3,4-metitenodioxi-benzaldeído (piperonal) (69) em 70% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F.* 222.6°C (lit 216°C) (MAZZONE et. ai, Fármaco, Edizione Scientífíca, v,39, n.5, p.4 4-420, 1984) IV (KBr) cnrf1 3223 (V NH), 1638 (V C0),:1582 (V CN)

RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) Õ (ppm): 1 1 ,63 (1 H, s, NH), 8,38 (1 H, s, W-CH), δ 7,31 (1 H, s, B4% 7,23 - 7, 16 (3 H, m, H2, H6 & H6*), 6,99 (1 H, d, J=8Hz, H7'), 6,09 (2 H, s, O-CH^-O), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,72 (3 H, s, H4a). R N 13C (50 Hz, DMSO-de) δ (pp ): 102,4 (CG)V 152,7 (C3 & C5}, 149,1- (C3'a), 148,0 (C7'a), 147,6 (CN) 140, - <C4), 128,7 (C ), 128,6 (C1), 123,2 (C6"), 108.2 (C4'),.104,6 (C2 & C6), 101,5 (C2 60,1 (G4a), 56,1 (C3a & C5a).

Pmeza: 97,9 % (CLAE; T.R. = 5,94 min ; CH3CN:H20 (1 : 1 })

Síntese do derivado £J-W -(4-hidro W-metoxIbei zllici©no)- 3,4,5- trim

Figure imgf000038_0001

O composto 42g foi obtido a partir da condensação da hidrazída (49) com 4-hidroxt-3-metoxi-ben2aideído (vaniiina) (70) em rendimento médio de 61,9 ± 11 ,5% (n-2). Aspecto físico: sólido amorfo de cor amarela. P.F.= 226,8CC (fií. 198°C) (BORCHHARDT etal J.Braz. -Chem. Soe; 21, n.l, p. 142-150, 2010)

IV (KBr) cm"1: 3223 (V NH), 1638 (V CO), 1582 (VGN)

R N^H (200 MHz, 0MSO-ds) δ (ppm): 11 ,55 (1 H, s, NJj), 9,56 (1 H, s,

OH), 8,36 (1 H, s, N=CH)r 7,32 (1 H, s, H2'), 7,23 (2 H, s, H2 & H6), 7,09 (1 H, d, J= 8Hz, H5*), 6,85 (1H, d, J= 8Hz, H6'), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,83 (3 H, s, H3a'), 3,73 (3 H, s, H4a).

R N 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 162,3 (CO), 152,6 (C3 &C5). 149,0 (C4')( 148,4 (CN), 148,0 (C3'), 140,3 (C4), 128,7 (C1'}, 125,7 (C1), 122,1 (C6% 115,4 (C5'}, 109,0 (C2'), 105,1 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a & C5a), 55,5 <C3'a).

Pureza: 97,3 % (CLAE, T.R.= 3,32 min; CH3CN:H20 (6:4))

Síntese do derivado (£ WH3"hidr xs-4-m0t©xibenElSicleno)-3A5- trimetoxibenzídrazida [LASSBio-1593J (42h)

Figure imgf000039_0001

O composto 42h foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 3-hidroxí-4-metoxi-benza!deído {isovanilina) (71) em rendimento médio de 72,2 ± 18,7% (n=2). Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca, P.F.- 101 , 8°C IV (KBr) cm . 3220 (V NH), 1835 (V CO), 1579 (V CN)

MN H (200 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 11,58 (1 H, s. NH), 9,35 (1 H, s, OH), 8,30 (1 H, s, N=CH), 7,28 (1 H, s, H2!), 7,22 (2H, s, H2 & H6), 7,08 - 6,95 (2 H, rn, H5* & H6'), 3,85 (8 H, s, H3a & H5a), 3,80 {3 H, s, H4a'), 3,72 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 162,4 (CO), 152,7 (C3 & C5), 149,9 (C4'), 148,0 (CN), 146,9 (C3'), 140,4 (C4), 128,7 (C1'), 127,2 (C1), 120,3 (C6')„ 112,4 (C2:), 111.9 (C5'), , 105,2 (G2 & C6), 60,2 (C4a), 56,1 (C3a & C5a), 55,6 (C4*a).

Pureza: 99.6% (T.R.= 3,03 min; CH3CN:HzO (7:3))

Síntese do derivado (E) - 3,4,5 - trimotoxi - N' - (3,4,5-

Figure imgf000039_0002

O composto 42i foi obtido a partir da condensação da hidrazida {49} com. 3,4,5-trimetoxibenzaideído (60) em 92 % (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor amarelo claro, P.F. = 250,8QC (lit 239-240'C (MAZZO E etai, Fármaco, Ediziorie Sctentífteã, ν,39·, fi.S, .414- 20, 1984)

IV (KBr) cm'"1: 3210 (V NH), 1641 (V CO), 1579 (V: CN)

RMN Ή (200 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 11,71 (1 H, s, NH), 8,42 (1 H, s,

N=CH), 7,23 (2 H, s, H2 & H6), 7,03 (2 H, s, Ή2' & H6:), 3,86/ 3,84 (12 H, 2s,

H3a, H5a, H3a' & HSa'), 3,73/ 3,71 (6 H, 2s, H4a & H4a ).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-de) δ. (ppm):.162,6 (CO) 153,2 (C3 & C5),

152,6 (C31 & C5% 147.9 (CN), 140,4 (C4), 139,1 (C4')( 129,8 (Cl), 128,6 (CT),

105.2 (C2 & C6), 104,3 (C2*■& C6'), 60,1- (C4a & C4'a), 56,1 (C3a & C5a), 55,9

(C3.'a &.'C5'a):

Pureza: 96,0 % (CLAE; T.R, ≠ 3 1miri; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do derivado (^• í4,5-trlmetoxl-M*-f|4-*oxo-4H*cromeri-3- iSJnietíletio} trimetoxibenzoidrazida ÍLASSBío-1595] (42j)

Figure imgf000040_0001

O composto 42| foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4-0X0-4 W-cromona-3 carbaldeído (72) em 95% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo bege. P.F. = 206,2°C.

ÍV (KBr) cm"1. 3222 (V NH), 1640 (V CO), 1584 (V CN)

RMN Ή (200 MHz, DMSO-de) δ (pprn): 11 ,80 (1 H, s, NH). 8,84 (1 H, s, N=CH), 8,65 (1 H, s, H2')( 3,13 (1 H, d, J=8 Hz, H8% 7,86 (1 H, t, J=8Hz, H6')f 7,72 (1 H, d, J=8Hzr H5'), 7,55 (1 H, t J=8Hz, H7'), 7,26' (2. H, s, H2 & H6), 3,87 (6 H, s, H3a & H5a), 3,57 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 175,1 (Cf), 162,2 (CO), 155,7 (C3'), 154.5 (C4'a), 152,7 (C3 & C5), 140,5 (CN), 140,1 (C4), 134,6 (C6'), 128.14 (C1). 128,0, (C8-'), 125,2 <C8'a), 123,3 (C7*), 118.7 (05'), 1 18,3 (02'),

105,2 (C2 & 06), 60.1 (C4a), 56,1 (C3a, C5a).

Pureza: 98,0% (CLAE; T.R." 3,49 min; CH3CN:H20 (7:3)}

Síntese do derivado í£j«W-<3,S~di-tert-butfí- » ídr©x.IbenziUdeno)-

Figure imgf000041_0001

O composto 421 foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 3,5»di;-lerc-butil-4~hidroxibôn2aldeído (73) em rendimento médio de 67,2 ± 9,3% (n=2). Aspecto físico; sólido amorfo de cor bege. P.F.= 249,3°C

IV (KBr) cm 1: 3207 (V NH), 1646 (V CO), 1583 (V CM)

RMN 1H {200 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 1,49 (1 H, s. NH), 8,42 (1 H, s, N=CH), 7,48 (2 H, s, H2' & H6'), 7,43 (1 H, s, OH). 7,23 (2 H, s, H2 & H6): 3,86 (6 H. s, H3a & H5a), 3,72 (3 H. s, H4a), 1,41 (18H, s, H5b' & H3b').

RMN 13C (50 MHz, DMSO-de) õ (ppm): 162,2 (CO), 156,1 (04'), 152,6 (03 & 05), 149,4 (CN), 140,3 (04), 139,4 (03' & 05'), 128,7 (01), 125,5 (Cf}, 123.87 (02' & 06'), 105,1 (02 &C6), 60,1 (C4a), 56,0 (03a & C5a). 34.4 (3a'), 30,1 (3b')

Pureza: 98,9% (CLAE; T.R. = 7,56 min; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do derivado (iE)-3?4,5-trimetoxj-W'-(na talen-1-ilrnetifeno) benzídrazída [LASSBio-1738] (42m)

Figure imgf000042_0001

O composto 42m foi obtido a partir da condensação da hidrazída (40) com 1-naftaideído (74) em 88% (n~1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor. creme. P.F. = 244,0nC (lit. 233-234°C) { AZZONE & REINA. Bofletino dele Sedute dela Accademia Gioenia di Scienze Natura!» in Catania, v.10, n.8. p. 689-702, 1971.)

IV (KBr) cm 1: 3226 (V NH), 1646 (V CO), 1591 (V CN)

R N 1H (200 MHz, D SG-ds) δ (ppm): 11 ,84 (1 H, s, NH), 9,12 (1 H, s,N*Ctí), 8,89 (1 H, d, J=8Hz, H2'), 8,04 - 7,93 (3 H, m, H4\ H5* & H8'}, 7,68 ~~ 7,57 (3 H, m, H3\ Η6' & H7')„ 7,31 (2 Η,.β, H2 & H6), 3,89 (6 H, s, H3a & H5a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 162,6 (CO), 152,7 (C3 & C5), 147,4 (CN), 140,5 (C4). 133,5 (C4'a), 130,5 <C4'), 130,1 (C8'a), 129,6 (C1), 128.78 (Cf), 128,5 (C5'). 127,7 (C3% 127,2 (C6'), 126,2 (C7!), 125,5 (C2'), 124 (C8!), 105,3 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a, C5a).

Pureza: 97,0% (CLAE; T.R. = 4,95 min; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do derivado (E^Ae^rtmetoxf- ^naftatsn^-ilmetlleno) benzidrazida [LASSBio-1739 42n

Figure imgf000042_0002
O composto 42n foi obtido a partir da condensação' da hidrazida .(49) com 2-ríâftaldeldo (75) em 89 % '{fi=1)^ de/feridimerito. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P..F 246,2°C (iit. 234-235eC) (MA2ZONE & REINA. Bolletino dele Sedute dela Accademia Gioeràa di Scienze Naturaii in Catania, v.10, n.8, p. 689-702, 1971.).

IV (KBr) cm"1: 3176 (V NH), 1645 (V CO), 1578 (V CN)

RMU H (200 MHz, D SO-de) δ (ppm): 11 ,8 (1 H, s, NH), 8,63 (1 H, s, N=CH), 8,15 (1 H, s, H1'), 8,04 (4 H, m, H3", H4', H5* & H8'). 7,59 - 7,55 (2 H, m, Η6' & H7'), 3,88 (6:H, ss H3a . & HSaj

N 3C (Ç0 MHz, DMSO-de) δ (ppm); 162,6 (CO), 152,6 (C3 & CS), 147,6 (CN), 133.7 (C4'á), 132,8 (Cl'), 132.0 (C2'), 128,5 (Ç8*a)t 128,5 (C8" & C1). 128,3 (C6*), 127.7 (C4l), 127,1 (C5"). 128,7 (C71.), 122,6 (C3*), 105,2 (C2 & CS), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a, C5a).

Pureza: 98,1% (CLAE; T.R. = 5,03 min; CH$CN:H20 (7:3))

Figure imgf000043_0001

O composto 42o foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4-fenil-benzatdeído (76) em 87% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F.= 185,7°C

IV (KBr) cm"1: 3204 (V NH), 1644 (V CO), 1585 (V CN)

RMN 1H (200 MHz, DMSG~d6) δ (ppm): 11,77 (1 H, s, NH), 8,52 (1 H, e,

N=CH), 7,86 - 7,71 (6 H, m, H3\ Ηδ', Η2', Η6', H6'a & H2'a), 7,52 - 7,39 (3 H, m, H3'a, H4'a & H5'a), 3.87 (H3a & H5a), 3,74 (H4a). RMN 13C (50 Hz, DMSO-d6) δ (ppm):. 162,6 (CO), 152,7 (G3 & C5), 147,3 (CN). 141,6 (C1')t 140,5 (C4), 139,3 (Cfa), 133,4 (C4>); -129,0 (G3* & C5 ), 128,5 (C3'a & C5'a), 127,8 (C1), 127.6 (Ç2* & C6% 127,0 (C2'a & C6'a), 126,6 (C4'a), 105,3 (C2 & C6)» 60,1 (C4a), 56,1 (C3a, C5a).

Pureza: - 98,8% (CLAE; T.R. = 5,57 min; CH3CM:H20 (7:3»

Síntese do derivado (¾ ,454rini©toxí«A ^{4-metllb«nzMid©no benzoidrazida rj.ASSBio- 741} (42p)

Figure imgf000044_0001

O composto 42p foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4~metli- erízaldeído (77), em 83% (d=1) de rendimento.. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F. = 192,4°C (!it.186-187 &C}1

IV (KBr) cm'1: 3208 (V NH), 1644 (V CO), 1586 (V CN)

RMN Ή (200 MHz, O SO-de) δ (ppm): 11,6 (1 H, s, NH), 8,43 (1 H, s, N=CH), 7,63 (2 H, d, J=8Hz. H2' & H6'), 7,29 - 7,24 (4 H, m, Η3'. Η5', H2 & H6), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,73 (3 H, s. H4a), 2,34 (3H, $, H4'a)

RMN 13C (50 MHz, D SO-de) δ (ppm): 162,5 (CO), 152,7 (C3 & C5), 147,9 (CN), 140,5 (C4), 139,9 (C4'), 131,6 (CT), 129,5 (C3' & C5'), 128,6 (C1), 127,1 (C2* &.C6*), 105,2 (G2 & G6), 60,1 (C4a), 56,1 (C3a, C5a), 21.1 (C4'a).

Pureza: 96,7% (CLAE: T.R. = 4,12 min; CH3CN;H20 (7:3))

Síntese do derivado ('E A/ -(4-fluorbenzilideno) - 3,4,5- trimetoxlbenzidrazida [LASSBio-1742] (42q)

1 AZZONE & REINA. Bolleíino dele Sedute dela Accademia Gioenia di Scienze Naturali in Catania, v.10, n.8, p. 689-702, 1971.

Figure imgf000045_0001

O composto 42q foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4-f uor-befi2aldeído (78) em 82% (rp-1) de rendimento. Aspecto físico: solido amorfo de cor branca. P.F. = 183,8°C (lit. 183-184 )2

IV ( Br) cm'1: 3185 (V NH), 1649 (V CO) 588 (V.€N)

RMN 1H (200 M z, DMSOdg) õ (ppm): 11 ,78 (1 H,. s, NH), 8,47 (1 H, s, N=CH), 7,83 - 7,76 (2 H, m, H2' & H6!), 7,35 - 7,24 (4 Hf .m, H3\ H5\ H2 & H6), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,73 (3 H, s, H4a).

RMN t3C (50 Hz, DMSO-dg) β (ppm): 165,5 - 160,8 (C4\ JCFe246Hz}, 162,5 (CO). 152.7 (C3 & C5), 146,6 (CN), 140,5 (C4), 130,9 (C1 '), 129,3 ~~ 129.13 (C2* & C6*, JcFa8,5Hz), 128,4 (Cl),. 116,1 -~ 1 15,7 (C3S .& C5', JCF*21,5HZ), 105,2 ( C2 & C6),.60,1 (Ç4a), 56.1 (C3a, C5a).

Pureza: 98,0% (CLAÊ; T.R. = 3,79 min; CH3CN.H?0 (7:3))

Síntese do derivado fE M -(4-elorob©nzilid8no) - 3,4,5 -

Figure imgf000045_0002

Ô composto 42r foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4~c!oro~benzatde!do (79) em 82.9% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F. = 185,6°C {fit 183~184°C) ( AZZONE & REINA.

2 MAZZONE, BONINA & FORMICA, II Fármaco. Ed. Sc v.33 n 12, p 963-971, 1978 Bolletino dele Sedute dela Accademia Gioenia di Scienze Naturaíi in Catania, v.10, n.8, p. 689-702, 1971.)

IV (KBr) cm-1: 3235 (V NH), 1647 (V CO), 1582 (V CN), 079 (V Ar-C!)

RMN 1H (200 Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 11 ,78 (1 H, s, NH), 8,46 (1 H, s, N=CH), 7,76 (2 H, d, J=8Hz, H2' & H6'), 7,52 (2 H, d, J=8Hz, H3'& H5'), 7,24 (2 H, s, H2 & H6), 3,86 (6 H, s. H3a & H5a), 3,73 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d5) õ (ppm): 162,6 (CO), 152,7 (C3 & C5), 146,4 (CN), 140,5 (C4), 134,5 (C4')t 133,2 (C1'), 128,9 (C3! & C5'), 128,6 (C2'& C6!), 128,3 (C 1), 105,3 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56, 1 (C3a, C5a).

Pureza: 97,5% (CLAE; T.R. = 4,36 min; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do derivado (E W'-(4-bromobenzHideno) trimetoxibenzoidrazida LASSBio-1 44] (42s)

Figure imgf000046_0001

O composto 42s foi obtido a partir da condensação da hidrazida (49) com 4-bromo-benzaideído (80) em 77,8 ± 9,9% (n=2) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca P.F. = 215,2°C (lit. 21 1~212°C) (MAZZONE, BONINA & FORMICA, II Fármaco, Ed. Sc. v.33 n.12, p. 63-971 , 978).

IV (KBr) cm'1: 3263 (V NH), 1664 (V CO), 1587 (V CN), 1067 (V Ar~Br)

RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1 1 ,78 (1 H, s, NH), 8,44 (1 H, s, N=CH), 7,67 (4 H, s, Η2', Η3', H5* & Η6'), 7,24 (2 H, s, H2 & H6), 3,86 (6 H, s, H3a & H5a), 3,73 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 162,5 (CO), 152,6 (C3 & C5), 146,4 (CN), 140,5 (C4), 133,6 (C11), 131 ,8 (C3' & C5'), 128,8 (C2' & C6'), 128,3 (C1 ), 123,2 (C4*), 105,3 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 56, 1 (C3a, C5a).

Pureza: 98,5% (CLAE; T.R. = 4,74; CH3CN:H20 (7:3)) Síntese do derivado benzoato de metila (57) (adaptado PETERSO

Figure imgf000047_0001

Em um balão de 125 mL foram adicionados 2,0 g (16,4 mmoles) de ácido benzóico (56), 50 mL (1 ,23 mofes) de metanol e 0,4 mL de ácido sulfúrico. A mistura reacional foi deixada em refluxo com agitação constante até conversão do ácido ao éster correspondente (ca. 5 horas); acompanhamento por CCD (eluente: n-hexano/ acetato de etjla 50%)

O isolamento foi realizado por redução do volume de solvente em rota- evaporador, seguido da diluição em 20 mL de água e extração com acetato de etila (3 x 40 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada a vácuo para obtenção do éster 57 em 70% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: óleo incolor.

Síntese do derivado benzidrazida (58) (adaptado de LIMA, etal.

2000).

Figure imgf000047_0002

Em um balão de 125 mL foram adicionados 40 mL de metanol, 20,3 g (145 mmoles) de carbonato de potássio, mL de água destilada e 10,07 g (147 mmoles) de cloridrato de hidrazina. O sistema foi deixado sob agitação a temperatura ambiente por 1 hora. Após esse intervalo de tempo, foram adicionados 1 ,0 g (7,34 mmoles) de metanoato de benzoíla em 7,3 mL de metanol e a mistura reacional foi aquecida para refluxo até total conversão do éster na hidrazida correspondente, evidenciada por acompanhamento por CCD (eluente: dicíorometano/metanof 5%). O isolamento foi realizado por redução do volume de solvente em rota-evaporador, seguido de extração com dlclorometano (3 x 50 mL) e água (20mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada a vácuo para obtenção da benzidrazida (58) em 56% (n=1) de rendimento. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F. = 112-1 14°C (lit. 112 °C) (HORWITZ & GRAKAUSKAS, J. Org. Chem. v. 9, n.2, p.194-201 , 1954).

Metodologia geral para obtenção de derivados N-acilidrazônicos a partir da benzidrazida (50-51) (LIMA, etai. 2000)

Em um balão de 25mL foram dissolvidos 0,2 g (1,47 mmoles) da benzidrazida (58) em 7mL de etanol. Em seguida, foram adicionados 1 ,47 mmoles do respectivo aldeído funcionalizado e uma gota de ácido clorídrico 37%. O sistema reacional foi deixado sob agitação a temperatura ambiente pelo tempo necessário para conversão dos reagentes no derivado N- acilidrazônico correspondente, determinado por CCD (eluente: díciorometanol/metanol 5%).

Os compostos foram isolados após adição da mistura reacional sobre bécher contendo gelo picado (ca. 20 mL). O precipitado obtido foi filtrado e seco a vácuo, sendo purificado, quando necessário, por coluna cromatográfica em sílica gel.

Síntese do composto (£ -W -benziltdenobenzidrazida [LASSBio-372]

Figure imgf000048_0001

O composto 50 foi obtido a partir da condensação da hidrazida (58) com benzaldeído (59) em rendimento médio de 52,9 ± 14,3% (n=2). Aspecto físico: sólido amorfo de cor bege claro. P.F. = 2113X (lit. 210-211°C) (ANDRADE & BARROS, J. Comb. Chem. V.12, n.2, p. 245-247, 2010.)

IV (KBr) cm 1: 3181 (V NH), 1641 (V CO), 1600 (V CN)

R N 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1 1 ,86 (1 H, s, NH), 8,48 (1 H, s, N=CH), 7,93 ( 2 H, d, J = 6 Hz, H2 & H6), 7,73 (2 H, d, J = 4 Hz, H2* & H6'), 7,60 - 7,45 (6 H, m, H3, H4, H5, Η5', H4' & H3').

RMN 13C (50 MHz, D SO-d6) δ (ppm): 163,1 (CO), 147,7 (CN), 134,3 (C1), 133,4 (01 '), 131,6 (04), 130.0 (C4')t 128,8 (C2 & C6), 128,4 (02' & 06'), 127,5 (03 & 05), 127,0 (03' & 05')

Pureza: 97,8% (CLAE; T.R. = 3,78; CH3CN:H2O (7:3))

Síntese do composto (£)-W'-(3,4,5-trimetoxibenzilideno) benzoidrazida [LASSBio-1734] (51).

Figure imgf000049_0001

O composto 51 foi obtido a partir da condensação da hidrazida (58) com 3,4,5-trimetoxi-benzaldeído (60) em rendimento médio de 55,5 ± 0,6% (n=2). Aspecto físico: sólido amorfo, cor bege, purificado em coluna cromaíográfica de sílica gel (eluente: diclorometano: metanol 1%). P.F.= 211 ,7°C

IV (KBr) cm 1: 3239 (V NH), 1649 (V CO), 1575 (V CN)

RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 11 ,86 (1 H, s, NH), 8,39 (1 H, s, N=CH), 7,91 (2 H. d, J=8Hz, H2 & H6), 7,62 -7,51 (3 H. m, H3, H4 & H5), 7,03 (2 H, s, H2' & H6'), 3,84 (6 H, s, C3'a & C5'a), 3,35 (C4'a).

RMN '3C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 163,1 (CO), 153,1 (C3' & C5'), 147,8 (CN), 139,2 (04'), 133,5 (01), 131 ,6 (01 '), 129,8 (C4), 128,4 (02 & 06), 127.6 (C3 & C5), 104,3 (C2! & C6'), 60,1 (C4'a), 55,9 (C3'a & C5'a).

Pureza: 98,3% (CLAE; T.R. = 3,47; CH3CN:H2O (7:3)) Síntese do composto (E)~ N'- benzilideno-3,455-trimetoxi-/V- metilbenzoidrazida [L ASSBio-1735J (53) (adaptado de KÚM ERLE, etal., 2009)

Figure imgf000050_0001

Em um balão de 25 mL foram dissolvidos 0,4 g (1 ,27 mmoies) de LASSBio-1586 (42a) em 7 mL de acetona e adicionados 3,82 mmoies de carbonato de potássio. A suspensão resultante foi mantida sob agitação constante a temperatura ambiente por 50 minutos. Após esse intervaío de tempo foi adicionado 0,48 mL (7,63 mmoies) de iodeto de metila e a mistura reacional refluxada em temperatura constante de 40° C até a conversão total do reagente no produto correspondente, evidenciado por CCD (eluente: n- hexano/acetato de etiía 50%).

O isolamento foi realizado com a redução do volume de solvente e resuspensão do sólido obtido em 2 mL de etanol, sendo o mesmo filtrado a vácuo e lavado com éter de petróleo (2 x 10mL). O produto foi purificado por recristalização em mistura etanol/água e obtido em rendimento médio de 93,5 ± 5,2% (n=2). Aspecto físico: sólido cristalino aspecto de algodão de cor branca. P.F. = 71-73°C

IV (KBr) cm'1: 1648 (V CO), 1592 (V CN)

RMN *H (200 MHz, D SO-d6) δ (ppm): 8,04 (1 H, s, N=CH), 7,58 (2 H, d, J =8 Hz, Η2' & H6'), 7,41 - 7,38 (3 H, .m, Η3', H4' & H5'), 7,00 (2 H, s, H2 & H6), 3.77 (6 H, s, H3a & H5a), 3,75 (3 H, s, H4a), 3,50 (3 H, s, NCHâ).

RMN !3C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 169, 1 (CO), 151 ,8 (C3 & C5), 140,4 (CN), 139,2 (C4), 134,9 (Cf), 130,3 (C4'), 129,5 (C1), 128,7 (C2' & C6 ), 126,8 (C3' & C5'), 107,6 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 55,9 (C3a & C5a). Pureza; 97,8% (CLAE; T.R. = 5,53; CH3CN:H20 (7:3))

Síntese do composto fenil 3,4,5-trÍmetoxifenilcarbamato (adaptado de YOGEES ARI, etal. 2005)

Figure imgf000051_0001

2,0 g (10,92 mmoles) de 3,4,5-trimetoxi-anilina (61) dissolvidas em 20 mL de clorofórmio foram adicionados, gota a gota, em um balão de 125 mL contendo 20 mL de clorofórmio e 1 ,4 mL (10,92 mmoles) de fenildoroformato (63). A suspensão formada foi ref luxada até consumo total dos reagentes, evidenciado por CGD (eluente: π-hexano/acetato de etiia 50%) e revelador para-dimetilamino-benzaideído.

O isolamento foi realizado por resfriamento a ta. do meio reacional e adição de 15 mL de n-hexano. O sólido obtido foi filtrado a vácuo e lavado com n-hexano.

Aspecto físico: cristais em agulha, cor bege. Rendimento médio de 47,6 ± 0,6% (n=4). P.F. = 170- 7 TC (lit. 155-156°C) (MACK etal. J. Chem. Eng. Data, M.14, n. 2,p. 258-261 , 1969).

IV (KBr) cm"1: 3334 (V NH), 1717 (V CO)

RMN H (200 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 10,12 (1 H, s, Ar-NH), 7,46 - 7,39 (2 H, m, H3' & H5'), 7,29 - 7,18 (3 H, m, Η2', H4' & H6'), 6,88 (2 H, s, H2 & H6), 3,73 (6 H, s, H3a & H5a), 3,62 (3 H, s, H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 152,9 (C3 & C5), 151 ,8 (C1'), 150,5 (CO), 134,7 (C4), 133,4 (C1), 129,4 (C3' & C5'), 125,5 (C4'), 122,0 (C2' & C6'), 96,5 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 55,8 (C3a & C5a). Síntese do composto W-(3,4,5-trimetoxifenH) hidrazinacarboxamida

Figure imgf000052_0001

Em um balão de 25 mL, foram adicionados 0,6 g (1,98 mmoies) do carbamato (62) e 15 mL de tolueno seco a suspensão agitada a ta. por 10 minutos. À suspensão foi adicionado 1,4 mL de hidrazina hidrato 64% (29,7 mmoí) e o sistema foi deixado sob agitação a temperatura constante por 75 horas até o conversão do reagente na semicarbazida (64), evidenciada por acompanhamento em CGD (eluente: diclorometano/metanol 5%).

O isolamento foi feito por filtração a vácuo do precipitado formado, o qual foi lavado com n-hexano (30 mL). A semicarbazida (49) foi obtida como um sólido amorfo de cor marrom sendo utilizada na etapa reacional seguinte sem prévia purificação. Rendimento médio de 89,28 ± 24,7% (n =3}. P.F. = >250°C iV (KBr) cm'1: 3582, 3459, 3346, 3145 (V NH), 1718 ((V CO-éster), 1684 (V CO amída).

RMN 1H (200 MHz, DMSO-dg) δ (ppm): 8,83 (1 H, s, NH), 7,75 (1 H, sl, Ar-NH), 6,89 (2 H, s, H2 & H6), 3,71 (11 H, sl, NH¾, H3a, H4a, H5a)

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 156,9 (CO), 152,8 (C3 & C5), 135,9 (C4), 132,5 (C1), 96,2 (C2 & C6), 60,2 (C4a), 55,8 (C3a & C5a).

Síntese do composto (£)-2-benzilideno- V-(3,4,5-trimetoxifenil) hidrazinacarboxamida [LASSBIo-1714] (52) (adaptado de LIMA etaí., 2000)

5'

Figure imgf000052_0002
Em um balão de 25 mL, 0.2g (0,83 mmoles) de semicarbazida (64) foram solubilizados em 7 mL de etanol e sendo em seguida adicionados 0,83 mmoles de benza!deido (59) e uma gota de ácido clorídrico 37%.

A mistura reacional foi deixada sob agitação constante a temperatura ambiente até conversão total da semicarbazida (64) na semicarbazona correspondente (52), evidenciada por CCD (eluente: diclorometano/metanol 5%).

O produto foi isolado após adição da mistura reacional sobre bécher contendo gelo picado (ca. 20 mL) e filtração do precipitado obtido a vácuo. Aspecto físico: sólido amorfo de cor branca. P.F.= 217, 5°C. Rendimento médio de 82,8 ± 5,9% (n=3).

IV (KBr) cm'1: 3371 ,3193 (V NH), 1685 (V CO)

R N H (200 MHz, DMSO-d6): δ 10,73 (1 H, s, NH), 8,79 (1 H, s. Ar- NH), 7,97 (1 H, s, N=CH), 7,85 (2 H, d, J=6Hz, H2' & H6'), 7,44 - 7,41 (3 H, m, Η3', Η4' & H5'), 7,11 (2 H, s, H2 & H6), 3,76 (6 H, s, H3a & H5a), 3,62 (3H, s,

H4a).

RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6): δ 152,9 (CO), 152,6 (C3 & C5), 140,9 (CN), 135,2 (C4), 134,2 (C4')( 132,9 (C1 '), 129,4 (C1), 128,6 (C2' & C6'), 127,0 (C3* & C5') 97,7 (C2 & C6), 60,1 (C4a), 55,8 (C3a & C5a).

Pureza: 99,0% (CLAE; IR. = 4,23; CH3CN:H20 (7:3))

Modificações Estruturais sobre LASSBio-1586

Após a identificação de LASSBio-1586 como potente composto citotóxico, com índice de seletividade adequado, foram planejadas modificações moleculares sobre LASSBio-1586 (Figura 37) no intuito de compreender melhor a relação entre a estrutura química deste composto N- acilidrazônico e a atividade citotóxica. O estabelecimento dessa relação nortearia a busca por um padrão molecular novo que permitiria, futuramente, a identificação de compostos citotóxicos que sejam potentes, seletivos e originais. Desta forma, para confirmar a natureza farmacofórica do anel 3,4,5 trimeíoxifenila, foi empregado a estratégia de simplificação molecular, resultando no planejamento do composto LASSBio-372 (50), previamente sintetizado em nosso laboratório no trabalho de Lima e colab. (2000) (Figura 37).

Para avaliar se a atividade citotóxica estaria relacionada com o arranjo dos átomos da subuntdade /V-acílidrazona, visualizada como grupo auxofórico por modelagem molecular, e os anéis aromáticos, foi planejado o composto LASSBio-1 34 (51), empregando a estratégia de retroisosterismo.

De forma análoga, com o intuito de compreender como os faíores conformacionais e interações intermoleculares de hidrogénio influenciariam na atividade e seletividade citotóxica, foram planejados mais dois compostos: LASSBio-1714 (52), aplicando a estratégia de aza-homoiogação, e LASSBio- 1735 (53), desenhado por homologação.

Alguns comentários adicionais podem ser feitos em relação as modificações empregadas na estrutura do protótipo LASSBio-1586 e serão comentadas a seguir:

A introdução de um nitrogénio com hibridização sp3 em LASSBio-1586 aumenta a liberdade conformaciona! para o padrão estrutural e adiciona um sitio doador e outro aceptor de interaçâo de hidrogénio na molécula.

A substituição do hidrogénio por uma metila em substâncias bioativas é capaz de modificar propriedades como coeficiente de partição, biodisponibilidade, farmacocinética e aspectos eíetrônicos e esféricos (WER UTH, 2008). Em revisão recentemente publicada, Barreiro e colaboradores discutem através de exemplos pontuais o efeito da metila nas interações entre substâncias bioativas e seus receptores (BARREIRO et.al., 2011 ).

Estes autores demonstraram através de estudos de cristalografia de raios-X, que a substituição do hidrogénio amídico de uma /V-acilidrazona (ex: LASSBio-294 (54)) por uma metila (ex: LASSBro-785 (55)) gera mudanças na estrutura cristalográfica de A/-acilidrazonas conduzindo a conformações distintas que podem contribuir para a existência de conformações bioativas igualmente diferenciadas. (Figura 38)

Para as c alconas análogas a CA-4, a introdução da metila foi capaz de aumentar em 20 vezes a aíividade citotóxica sobre a linhagem K562 (leucemia), em consequência da preferência conformacional peia conformação s-trans por razões estéricas (DUCKI er a/., 1998) (Figura 39).

Modificações Estruturais sobre os Derivados da Série iniciai.

A observação de que o sitio de reconhecimento molecular de LASSBio- 1586. derivado mais potente e seletivo da série estudada, é essencialmente dependente da participação de aminoácidos hidrofóbicos (Figura 32), visualizados através da relevância do parâmetro hidrofóbico na determinação dos scom, incitou a realização de novas modificações no anel B dos análogos W-acilidrazontcos inicialmente planejados e sintetizados. Essas modificações tiveram como objetivo compreender como o tamanho e a orientação dos substituintes hidrofóbicos influenciariam a atividade citotóxica.

Partindo deste pressuposto, sete novos derivados N-acilidrazônicos foram planejados encontrando-se sumarizados na Figura 33. O planejamento dos novos derivados foi validado pelos mesmos cálculos de ancoramento molecular realizados para os derivados iniciais, apresentando maior valor de score que o derivado LASSBio-1586 (Tabela 6).

Tabela 6. Scores calculados para os compostos 42m-s e 42a com o sítio da colchicina da β-tubu!ina (código do PDB 1sa0) utilizando a função ChemScore do programa GOLD (CCDC Inc.) Compostos Score médio Desvio padrão

(n=5)

SSBio-1586 (42α) 24,54 1,10

LASSBto-1738 (42m) 29,19 0,35

LASS8io-1739(42n) 29,21 0,91

LASSBio-!740(42o) 30,66 1,29

U5SBío-I741(42p) 26,23 0,99

SSBio-1742(42q) 22,98 1,21

LASSB«o-1743(42r) 24,90 0,73

LASSBio-1744(42s) 25,08 0,66

Os novos derivados planejados foram sintetizados em bons rendimentos (Tabeia 6) como descrito anteriormente (Esquema 1), em grau de pureza satisfatória (>95%) e elevados rendimentos globais (Tabela 7).

Tabela 7. Rendimentos da segunda etapa reacional para obtenção das N- acilidrazonas com substituintes hidrofóbicos (42m-s).

Composto Arilo Rendimento

LA5SBio 738 (42m) Affa-rwfttI 88 % (n=l)

LASSSio-1739 (42n) Se†a-naf†il 89 % (n=l)

LASSBio-1740 (42o) 4-feníí™ fenií 87 % (n=í)

LASSBio-1741 (42p) 4-CH3- fenií 83 % (n=l)

LASSBfO-1742 (42q) 4-F- feni! 81 % (rt=l)

LASSBio-1743 (42r) 4-CI- fenií 83 % (n=l)

LASSBio-1744 (42s) 4-Br- fenil 77(8 ± 9,9 % (n=2)

Tabela 8. Rendimento global, ponto de fusão, pureza e tempo de retenção dos derivados com substituintes hidrofóbicos (42m-s). Cotttposto P.F, Porezc (<ΧΛ£) Tempo de Condição

Stobd (%) (DSC) C) (%) retenção (min) SSBie-1738(4Zm) 81 244.0 97.0 4.95 70% CH3CN 3C % Η,Ο

LASSBio-l739(42n) 82 246.2 98,1 5.03 70% CHSGN 30 7» HsO

LASS8io-1740(4Eo) 80 1S5.7 98,8 S.57 70% CHSCN 30 % Hz0

LASSBio-1741(42p) 76 192.4 96,7 4.12 70% CH,CN 30 ¾ HjO

LASSBio-1742(42<}) 75 183.8 98.0 3.79 70% CHj 30 % HjO lASS8io-!7~V3(42r) 76 185.6 97,5 4.36 70¾. CH3CN 30 % H30

LASSBio 744(42s) 72 215.2 98,5 4.74 70% CB>CN 30 % H?0

A caracterização estrutura! dos novos derivados foi menos trivial que para os derivados iniciais, pela complexidade de sinais especialmente no espectro de RMN 13C dos derivados LASSBio-1738 (42m}: LASSBio-1739 (42n) e LASSBio-1740 (42o).

Os compostos LASSBio-1742 (42q) e LASSBio1744 (42s), não apresentaram o padrão AB clássico de espectros de RMN 1H de derivados aromáticos para-substituidos.

Em LASSBio-1742, ocorreu acoplamento entre os hidrogênios do anel aromático e o átomo de flúor. Este fato deve-se a presença do flúor que como o hidrogénio, possui spin igual a 1/2 (SILVERSTEIN, 2007). Em consequência ao invés de dois du fetos, são visualizados um tripleto em δ 7.79 ppm (J=6Hz) e outro em õ 7 30 ppm (J=10Hz); que coalesce com o singleto do anel aromático 3,4.5- trímetoxi substituído. (Figura 34)

O átomo de flúor também é capaz de acoplar com carbonos e, portanto, o espectro de RMN 1?'C apresenta dupletos com constantes de acoplamento carbono-fluor (JC-F) característicos em relação aos carbonos do anel aromático para-substituídos (LEVY, 1980) (Figura 35).

No espectro de RMN H de LASSBio-1744, os hidrogênios do anel para bromo substituído são visualizados como um simpleto de integrai equivalente aos quatro hidrogênios aromáticos.

A presença do átomo de bromo no anel iguala o ambiente químico dos quatro hidrogênios aromáticos provocando a diminuição da constante de acoplamento entre os hidrogênios e aproximam o deslocamento químico dos mesmos. Em virtude da diminuição da razão entre a diferença de deslocamento químico e constante de acoplamento, os sinais exteriores dimunuem de intensidade e os interiores aumentam a intensidade (SILVE STEIN.2007) sendos observados na forma de um stmpleto. (Figura 36).

Tabela Sa. Deslocamentos químicos (õ em ppm) observados nos espectros de

RMN 1H a 200 Hz dos com ostos LASSBio-1738 a LASSBio-1744.

Figure imgf000058_0001

Composto N-H N=CH H2 & H6 H3a & H5a H4a

LASSBio-1738 (42m) 11,84 9,12 7,31 3,89 3,75

LASSBio-1739 (42n) 11,84 8,63 7,27 3,88 3,74

LASSBío-1740 (42o) 11,77 8,52 7,27 3,86 3,73

LASSBio-1741(42p} 11,66 8,43 7,24 3,86 3,73

LASSBio-1742(42q) 11,74 8,47 7,24 3,87 3,73

LASSBiO-1 43 <42r} 11,78 8,46 7,24 3,86 3,73

LASSBio-1744 (42s) 11 ,78 8,44 7,24 3,87 3,74

Tabela 9b. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados nos espectros de

RMN H a 200 MHz dos compostos LASSBio-1738 a LASSBio-1744.

I42'a H3'a

ΗΙ' Η2' H3' H4' HS' H6' H7' H8' & H4'a

Composto

H6'a & HSa'

LASSBio- 8,89 a,04~

7.68-7,57 7.68- (IH, d, 8,04-7,93 8,04-7,93 7.68-7,57 7.93

1738 (42m) (3H, m) (3H, m) Í3H, m) (3H, m} 7,57

<3H, m) (3H,

mj

LASSB10- 8,15 8,04 8,04 8,04 7,59-

7,59-7,55 8,04

1739 (42n) (1H,S) (4H, m) (4H, m) 7,55 (4H,

(4H, m) (2H, m)

(2H, rn)

LASSBia- 7,m~ 7,80-

7,88-7,71 7,86-7,71

7,71 (6H, 7,8β~7,71 7,52- 7.71

1740 (42o) (6H, m) (SH, m) (6H, rn) 7,39 m) <6H,

(3H, m) m) LASSBio- 7.Θ3

7,29 -7,24 7,29-7,24 7,63

2,34 <2H, d, (2H, d,

741(42p) (4H, m) (4H, m) (3H,s)

J=8Hz) J=8Hz)

LASSBto- 7,80 7,30 7,30 7,80

(2H, t, <2H, i. (2H, t (2H, t,

1742(42q) J=6Hz) J=1GHz) J»10Hz) J=8Hz)

LASSB!o- 7,76 7,52 7,52 7,76

(2H, d, (2H, d, (2H. Ci. (2H, d,

1743 (42r) J=8HZ) J=8Hz} J=8Hz) J=8Hz)

LASSBio- 7,67 7,67 7,67 7,67

1744 (42s) <4H. ») (4H, S) (4H, s) (4H, s)

Tabela 10a. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados nos espectros de RMN 13C a 50 MHz dos compostos LASSBio-1738 a LASSBio-1744.

C2 &

Composto CO CN C1 C3 & C4 C3a &

C4a

C5 CS C5a

LASSBio-1738

162,6 147,5 129,6 152,7 105,3 140,6 56,2 60,1

(42m)

LASSBto-1 39

162,6 147,7 128,5 152,7 105,3 140,5 56, 1 60,1

(42ti)

LASSBiO- 740

160,6 147,4 128,5 152,7 105,3 140,5 56,1 60,2

(42o)

LASSBio- 1741 (42p) 162,6 147,9 128,6 152, 7 105,3 140,5 56,2 60,2

LASSBio-

162,6 146,6

1742(42q) 128,5 152,7 105,3 140,5 56, 1 60, 1

LASSBÍO-1743

162,6 146,4 128,4 152,7 105,3 140,6 56,1 60,1

(42r)

LASSBio-1744

162,6 146,5 128,4 152,7 105,3 140,5 56,1 60, 1 (42s)

Tabela 10b. Deslocamentos químicos (õ em ppm) observados nos espectros

de RMN 13C a 50 MHz dos compostos LASSBio-1738 a LASSBio-1744

Composto CC11!! CC22 CC66'' CC3377CC55'' C4' C7' CS' C1 'a C4'a C8'a

LASSBIo-

125,6 127,8/

1738 1 12288,,77 130,5 126,3 124,3 133,6 130,2

/127.3 128,5

(42m)

LASSBio- 132,1/ 127,1/

127,7 128,5 122,7 128.3 - 133,7 132,8 1739 (42n} 126,7 128,5

LÂSSBÍo-

141 ,6 127,7 129,0 133,4 139,4 127,1 127,9 126,7

1740 (42o)

LASSBio-

131 ,6 127,1 129,5 140.0 — --- 21 ,1

1741 (42p)

LASSBio-

17 l9 A9rtí 1 '3<■'0",<9*■'

Figure imgf000059_0001

133,2 128,6 128,9

17 3S(42r) 133,2 128,6 128,9 13 ,

LASSBio-

131,8

1744 Í42si 133,6 126,8 123,3 Síntese dos novos análogos de LASSBio-1586.

Os compostos LASSBio-372 e LASSBio-1734, foram obtidos em 3 etapas reacionais a partir do ácido benzóico (56) comercial que foi convertido ao éster metílico correspondente (57) (PETERSON et ai, 2008) e, posteriormente, à benzoidrazída (58) (LIMA et. ai, 2000 adaptado). A hidrazida 58 foi então condensada como benzaldeído (59) e com 3,4,5- trimetoxibenzaldeído (60) para síntese de LASSBio-372 (50) e LASSBio-1734 (51), respectivamente {LIMA et.ai, 2000) (Esquema 2).

Figure imgf000060_0001

Esquema 2. Etapas reacionais empregadas para a síntese dos compostos LASSBio-372 e LASSBio-1734.

O composto LASSBio-1735 (53) foi obtido pela reação de W-metilação do composto LASSBio-1586, utilizando iodeto de metila, carbonato de sódio e acetona sob refluxo (KUMMERLE et ai, 2009). O carbonato de potássio é utilizado nessa reação como base de Brõnsted-Lowry no intuito de desprotonar o nitrogénio amídico da /V-acilidrazona e consequentemente aumentar a nucleofilicidade do mesmo na reação de substituição nucteofílica bimolecular (SN2) com o iodeto de metila. (Esquema 3)

Figure imgf000060_0002

Esquema 3. Etapa reactonal empregada para a síntese do composta LASSBio- 735. O composto semicarbazônico LASSBio-1714 (52) foi obtido por síntese linear em 3 etapas reacionais. O reagente de partida foi a 3,4,5-trimetoxianilina (61) que originou o carbamato (62) correspondente após reaçâo com fenií- cloroformato (63) em clorofórmio sob refluxo. O carbamato foi tratado com hidrazina hidrato em tolueno seco para obtenção da semicarbazida (64) (YOGEESWARI eí.a/.,2005), que foi condensada com benzaldeído (59) para síntese da semicarbazona LASSBio-1714 (52) (LIMA ef.a/., 2000) (Esquema 4).

Figure imgf000061_0001

Esquema 4. Etapas reacionais empregadas para a síntese do composto LASSBio-1714 (52).

A caracterização dos compostos planejados por modificações sobre LASSBio-1586 (i.e. 50-53) foi realizada empregando as mesmas técnicas usadas para os demais compostos sintetizados neste trabalho e comentados anteriormente. Rendimentos globais, ponto de fusão e pureza estão demonstrados na tabela 11. Os sinais mais característicos do processo de elucidação estrutural dos compostos 50-53 estão representados nas tabelas 12 - 17.

Tabela 11. Rendimento global, ponto de fusão, pureza e tempo de retenção dos compostos LASSBio-372, LASSBio-1714, LASSBio- 734 e LASSBio-1735. Composto Rend. Glohat P.F.CC) Pureza Tempo de Condição

(*) (OAE (%) retenção (min)

LASS8ÍQ-372 (50) 20,a 211.3 (DSC) 97,0 3.78 70% CM3CN 30 % H?0

LASSBio-1714 (52) 25 217.4 (DSC) 99,0 4.23 70% £H3CN3G % H-,0

LASSBio-1734 (51) 21,6 211.7 (DSC) 98,3 3.47 70% CH}C 30 % HjO

LA55Bio-1735 (53) 65.3 71 - 73* 97,8 5.23 70% CH,CN 30 % H,O

*Ponto de fusão determinado no aparelho Químis 340 (LASSBio/UFRJ).

Tabela 12. Deslocamentos químicos {õ em ppm) observados nos espectros de RMN 1H a 200 MHz dos compostos LASSBio-372 (50) e LASSBio-1734(51).

Figure imgf000062_0001

Composto NH N=CH K2 & H6 H3, H4 & H2' & H3'( H4' & W

H5 H6' H5'

LASSBio-372 11 ,86 8,48 7,93 {2H, 7,60-7,45 7.74 (2H, 7,60-7,45

(50) d, (6H, rrt) d, (6H, m)

J=6Hz) J=4Hz)

LASSBio- 1 1 ,88 8,41 7,92 (2H, 7,46 {3H, 7,03 3,84 /

1734 (61) d, m, J=8Hz) 3,71

J=6Hz)

Tabela 3. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados nos espectros de RMN 13C a 50 MHz dos compostos LASSBio-372 (50) e LASSBio-1734(51).

Figure imgf000062_0002

C2' C3'

C2 & C3 &

Composto ço ÇN Cl €4

C5 cr & & C4" C6

C6' CS'

LASSBio-

163,1 147,8 134,3 128,8 127,6 131,7 133,4 128,4 127,0 130,0

372 (50)

LASSBio-

163,1 147,8 133,5 128,4 127,6 131 ,7 153,2 139,2 0 1 , 1734 (51) 131,7 104,3 55,9

Tabela 14. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados no espectro de

RMN 1H -1714 (52).

Figure imgf000063_0001

Composto NH N=CH Ar-NH H2 & H2' & H3\ H3a & H4a

H6 H6* H4 ' & H5a

H5'

LASSBío- 10,73 7,97 8,79 7,11 7,85 7,44 - 3,76 3,62 1714 (52) (2H, d, 7,41

J=6Hz) (3H, m)

Tabela 15. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados no espectro de

RMN 13C 714 (52).

Figure imgf000063_0002

Compost ço CM C1 C2 C3 C4 C1' C2' C3' C4' C3a C4a

0 & & & & &

C6 CS CS' CS' C5a

LASSBio- 153, 140, 129, 97, 152, 135, 133, 128 127 134, 60, 55.8 1714 {52) 0 9 4 7 6 2 0 ,6 ,1 2 1

Tabela 16, Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados no espectro de RMN 1H a 200 MHz do composto LASSBio-1735 (53)

Figure imgf000064_0001

Composto N-CHâ H2 & H2' & Η3', H4' H3a & H4a

H6 H6' & H5' H5a

LASSBlo-1735 3,50 8,04 7,00 7,58 (2H, 7,41 - 3,77 3,75 (53) d. 7,38

J=8Hz) (3H, m)

Tabela 17. Deslocamentos químicos (δ em ppm) observados nos espectro de

RMN 13C -1735 (53).

Figure imgf000064_0002

C3

C2 C3 C2' C3-

Compost MC a &

CN C1 & & C4 C1' & & C4' C4a o co

& CS

C6 CS C6' C5'

a

LASSB50

169 140 28, 134 10 151 139 169, 40 28, 129 89, 60, -1735

4 3 ,B 7,6 ,8 ,2 1 ,4 3 ,5 9 2 (53) ,1 ,

Generalidades

As reações foram acompanhadas por Cromatografia de Camada Delgada (CGD), em placas sílica gel 60 (HF-25 , Merck) de alumínio de 0.25 mm de espessura. Os cromatogramas foram revelados por luz ultravioleta (254-365nm) e por iodo molecular. Em colunas cromatográficas foi utilizada sílica gel da Merck (70-230 mesh).

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogénio (1H RMN) e de carbono (,3C RMN) foram obtidos no aparelho DPX-200 da Bruker (IQ-UFRJ) em 200 MHz e 50 MHz respectivamente, utilizando dimetil suifoxido deuterado (DMSO-d6) como solvente. Os valores de deslocamento químico são referidos em partes por milhão (ppm) e os valores de constante de acoplamento (J) em Hertz (Hz). As integrais dos picos foram obtidas por integração eletrônica e suas multiplicidades são descritas do seguinte modo: s-simpleto d-dupleto t-tripleto m-multipieto sl-sinal largo

Os espectros de infravermelho (IV) foram obtidos no espectofotômetro ABB modelo FTLA 2000-100 (LASSBio- UFRJ) utilizando pastilhas de brometo de potássio (KBr-ACROS Organics®). Os valores de absorção estão em número de onda, sob a unidade centímetro recíproco (cm"1).

Os pontos de fusão (P.F.) de intermediários sintéticos foram determinados no aparelho Químis 340 (LASSBio- UFRJ) e os valores não foram corrigidos. Os pontos de fusão de produtos finais foram determinados por análise térmica utilizando a técnica de Calorimetria de Diferencial Explanatória (DSC, do inglês Diferential Scanning Calorimetry) pelo apa ralho DSC-60 da Shimadzu (LASSBio- UFRJ), com taxa de aquecimento de 20°C/min com temperatura máxima de 300°C. O aparelho DSC-60 foi calibrado com padrão de índio (In ; P.F. 157,2°C).

Os reagentes e solventes adquiridos comercialmente foram utilizados como recebidos com exceção do tolueno que foi tratado com sódio metálico e destilado.

A pureza dos compostos finais foi determinada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando o aparelho Shimadzu - LC20AD, coluna Kromasil 100-5 C18 (4,6 mm x 250 mm) e detector SPD-M20A (Diode Array) no comprimento de onda de 254 nm, para quantificação do analito, em fluxo constante de 1mL/minr com injeção de volume de 20 pL. Os dados foram adquiridos pelo software "LC solution" versão 4.0. Solventes padrão CLAE foram adquiridos da TEDSA®.

Análise Térmica

O uso de análise térmica é de grande valia na caracterização de substâncias químicas, já que permite acompanhar como um composto orgânico ou inorgânico se comporta com o aumento da temperatura e visualizar qualquer processo entáipico, seja endotérmico ou exotérmico, ocorrido na faixa de temperatura avaliada (COSTA NETO, 2004).

As técnicas de análise térmica tem ganhado importância crescente nas indústrias farmacêuticas, sendo cada vez mais descritas em monografias que compõe farmacopeias internacionais como a Farmacopeia Britânica, Farmacopeia Japonesa e Farmacopeia Americana (USP). As técnicas de análise térmica (calorimetria explanatória diferencial e termogravimetria) são utilizadas para a caracterização, determinação de estabilidade e compatibilidade de formulações farmacêuticas, determinação de umidade, pureza, cinética de degradação térmica e particularmente na determinação de polimorfismo de fármacos (OLIVEIRA et.al., 2011).

O estudo de formas polimórficas é extremamente relevante para a indústria farmacêutica, uma vez que os polimorfos apresentam propriedades físico-qu [micas diferentes (por ex. ponto de fusão, solubilidade, densidade e cor), afetando parâmetros farmacocinéticos, como biodísponibitidade, e parâmetros farmacêuticos, como a dissolução. Também comprometem as estabilidades físicas e químicas de formulações farmacêuticas (LLINÀS & GOODMAN ; 2007). Dada tamanhas diferenças, os polimorfos são comumente entidades químicas distintas e a identificação de um novo polimorfo de um fármaco frequentemente permite a concessão de patente, sendo considerada inovação incremental (LOURENÇO, 2010). Dessa forma, a detecção e caracterização de polimorfos devem ser realizadas ainda nos estágios iniciais do desenvolvimento de novos fármacos e candidatos a fármacos (LLINÀS & GOODMAN, 2007).

Ainda há divergências sobre a definição exata de polimorfismo. Questões como: "Estruturas polimórficas obrigatoriamente tem de apresentar arranjo cristalino diferente? "Apenas a diferença das propriedades físico- químicas já é suficiente para definir polimorfismo?" polemizam o tema. Ainda assim, uma definição amplamente aceita pelos químicos é que polimorfos são diferentes formas cristalinas de um mesmo composto químico (DES!RAJU,2008).

Ainda assim, mesmo com todo o esforço para identificação da existência de polimorfos nos estágios iniciais de pesquisa e desenvolvimento, não é raro a identificação de polimorfos apenas quando o fármaco já está no mercado. Caso exemplificado pelo inibidor de protease da Abbott, Norvír® (ritonavir), utilizado no tratamento da infecção pelo vírus de imunodeficiência humana (HIV) é emblemático, (para mais informações: CHEMBURKAR et. ai, 2000)

Dessa forma, considerando que os compostos desenvolvidos foram planejados como futuros candidatos eventuais de fármacos antitumorais, decidiu-se utilizar a técnica de calorimetria expíanatória diferencial (DSC) para determinação dos pontos de fusão dos derivados /V-acilidrazônicos sintetizados, comparando-os aquelas curvas caiorimétricas obtidas a partir de diferentes lotes dos compostos planejados.

Durante o preparo de novos "lotes" de LASS Bio- 1586 (42a), visando assegurar quantidade necessária a realização dos ensaios in vivo, foi observada a presença de um segundo pico no termograma de LASS Bio- 1586 (Figura 21), suscitando a formulação de três hipóteses:

A primeira hipótese considerava que o segundo pico tratava-se de uma impureza. Para confirmar ou descartar essa hipótese foi realizada a análise do lote de LASSBio-1586 em questão por CLAE (Condição. 70% CH3CN; 30%H2O e 0,05% de ácido trifluoracético). Foi observado um único pico no cromatograma com tempo de retenção de 3,67 minutos e área igual a 99,3% (Figura 22), sugerindo que o segundo pico observado não seria possivelmente atribuído a impurezas.

A segunda hipótese considerou que a presença do segundo pico poderia estar associado à obtenção de uma mistura dos diastereoisomêros £ e Z de LASSBio-1586, que apresentariam propriedades físico-químicas distintas. Essa hipótese foi descartada após análise do espectro de R N 1H do lote sob suspeita, no qual foi observado apenas um sinal imínico a δ 11 ,73 (Figura 23) e um único carbono imínico centrado a δ 162,61. Estes resultados igualmente ajudaram a descartar a hipótese de impureza orgânica, uma vez que, nenhum outro sinal não atribuível a estrutura de LASSBio-1586 foi identificado no espectro de RMN 1H.

A terceira hipótese considerou que a presença de dois picos no termograma estaria associada à existência de polimorfos. Para verificar essa hipótese, foi reinvestigado com precisão as condições experimentais empregadas para a síntese e isolamento de LASSBio-1586 nos diferentes lotes.

Na literatura já havia sido reportado dois pontos de fusão distintos para LASSBio-1586. Cao e colaboradores (20 ) reportaram a faixa de P.F. de 141- 142°C, enquanto Mazzone e colaboradores (1971 ) reportaram a faixa de 167- 168°C. Todavia, o fenómeno de polimorfismo para LASSBio-1586 ainda não foi reportado.

De fato, LASSBio-1586 apresentou um comportamento anómalo em relação aos seus congéneres, pois durante a reação de condensação da hidrazida com o benza!deido não observou-se precipitação no meio reacional da /V-acílidrazona (42a). Constatou-se que o procedimento utilizado no isolamento desse composto é crucial para a determinação de qual "pofimorfo" pode ser obtido.

Quando o isolamento é feito pela adição ao meio reacional de gelo, é obtida a forma polimórfica A (P.F. = 131 ,6°C) em maior proporção ou exclusivamente (Figura 24.A). Já quando se reduz o volume do meio reacional em rota evaporador com uso de banho-maria, obtém-se a forma polimórfica B (P.F. = 168,3°C) puro ou em maior proporção na mistura (Figura 24.B). Quando obtidos isoladamente os polimorfos A e B foram analisados em CLAE e apresentam o mesmo tempo de retenção.

A distribuição das formas polimórifcas A e B parecem de fato ser afetadas por aquecimento. Quando a amostra de LASSBio-1586, contendo exclusivamente ou maioritariamente o polimorfo A, foi recristalizada em mistura de solvente aprótico (diclorometano: n-hexano) ou prótico (metanol, água), obsevou-se através da análise térmica a conversão da forma poiimórfica A em B, conforme ilustrado nos termogramas exemplificados na Figura 24.

Contudo, a confirmação inequívoca da existência das formas polimórficas A e B depende da aplicação de métodos distintos da calorimetria diferencial exploratória.

Vários métodos para caracterização e elucidação de estruturas polimórficas podem ser empregados, dentre eles destacam-se: RMN 13C de sólidos, microscopia ótica, difração de raios-X de pós e cristalografia de raios- X. Entretanto os maiores desafios são controlar a obtenção de estruturas polimórficas isoladas, a reprodutibilidade na relação dos polimorfos obtidos e a estabilidade dos polimorfos formados (LLINÀS & GOODMAN, 2007). No contexto deste trabalho estão previstos a realização de estudos de difração de raios-X com os polimorfos A e B de LASSBio-1586.

Elucidação da diastereoisomeria da função imina.

A reação de condensação ácido catalisada entre a hidrazida (49) e os aldeídos funcionalizados selecionados para a obtenção dos derivados 42a-f, permitiria a formação dos diastereoisõmeros f e Z em relação a ligação imínica formada. Ainda assim, foi observado nos espectros de RMN 1H e RMN 13C, apenas um sinal referente ao hidrogénio e carbono imínico respectivamente.

Baseando-se em estudos anteriores que descrevem o uso da técnica de RMN !H para a elucidação da diastereoisomeria e proporção entre os diastereoisõmeros de hidrazonas e N-acilidrazonas (PALLA et. ai, 1986; KARABATSOS eí.a/.,1963) foi incialmente proposto que os derivados N- acílidrazonicos obtidos apresentam estereoquímica E em relação a ligação iminica, uma vez que, Palia e colab. (1986) afirmam que para N-acilidrazonas, o deslocamento químico do hidrogénio imínico de diastereoisômero E, assim como o deslocamento químico do carbono imínico é fixado em campos mais baixos que os respectivos hidrogênios de diastereoisômero Z.

Posteriormente foram realizados estudos de cristalografia de raios-X para a determinação da estrutura cristalográfica do derivado LASSBio-1586 (42a) (Figura 25), confirmando a estereoquímica E para a ligação imínica dos derivados 42a-l.

Determinação do Mecanismo de Ação de LASSBio-1586 e LASSBio- 1587.

Considerando o planejamento molecular dos derivados /V-acilidrazônicos (42a-l) como análogos da CA-4, conhecido inibidor de β-tubulina, os compostos LASSBio-1586 e LASSBio-1587 foram selecionados para a realização de ensaios terceirizados de binding com a proteína tubulina pela empresa CEREP®

O ensaio de binding com a proteína β-tubulina foi realizado pela empresa CEREP® (www.cerep.com), segundo o protocolo descrito por Bonne e colaboradores(1985).

O ensaio avaliou a capacidade dos compostos inibirem a polimerização da β-tubulina na concentração de screening de 30 μΜ (3.10"5M), empregando o protocolo descrito por Bonne e colaboradores (1985), utilizando a vimblastina como padrão positivo.

O efeito farmacológico dos compostos ensaiados sobre a tubulina é acompanhado com a utilização de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), um agente que emite fluorescência e se figa a tubrlina com afta afinidade em um sítio não relacionado aos sítios da coíchicina e dos taxóis (BONNE ef.a/., 1985).

Na concentração avaliada 30 μΜ (3.10~5M), os compostos foram capazes de inibir a polimerização de tubulina (Tabela 18). Este resultado confirmou o mecanismo de ação citotóxica dos compostos v-acilidrazônicos, análogos a CA-4, e por consequência validou o planejamento estrutural empregado.

Tabela 18. Percentual de inibição da polimerização da tubulina dos compostos

LASSBio-1586 e LASSBio-1587 na concentração de 3.10"5M. Composto % de inibição da

polimerização de tubulina*

LASSBio-1586 91

LASS8ÍO-1587 81

*Em relação à vimblastina (padrão positivo) considerada corno 100% da inibição.

Estudos de Ancoramento Molecular

Sabendo que os compostos planejados, LASSBio-1586 e LASSBio-

1587, tem a capacidade de inibir a polimerização da tubulina, foram realizados estudos de ancoramento molecular com a proteína β-tubuiina (código do PDB: 1sa0) (RAVELLI et.ai. , 2004) para a melhor compreensão dos modos de interação do ligante com o sítio de reconhecimento molecular da proteína alvo.

Os compostos LASSBio-1586» LASSBio-1587, LASSBio-1593, LASSBio-

1594, LASSBio-1596 e combretastatína A4 tiveram a distribuição de confôrmeros determinada por mecânica molecular ( MFF), utilizando o software SpartanOS (Wavefunction, Inc.). Com os confôrmeros de menor energia, de cada composto estudado foi realizada a minimização de energia pelo método semiempírico AM1 para a utilização dos mesmos em estudos de ancoramento molecular (DEWAR et ai, 1985).

Os estudos de ancoramento molecular foram realizados com a proteína β-tubuiina (código de PDB: 1sa0) utilizando o programa GOLD 5.0.1 (CCDC Software Ltd.) ("Agreement number": G/414/2006.) na função ChemScore, conferindo liberdade conformacíonal à cadeia lateral dos aminoácidos: et259, Lys254, Asn258, Ser168, Lys352 e Asn 01. Foram utilizados como referência para os estudos o ligante "A/~deacetyi-W-(2-mercaptoacetyl)-colchicine" (DAMA- colchicine) e a combrestatina A4.

De acordo com o estudo in sitico, os compostos avaliados se ancoram ao sítio da colchicina sem fazer muitas interações específicas com os aminoácidos presentes. Essa observação é ratificada por Dorléans e colaboradores (2009) que descreveu que compostos inibidores de polimerização de tubu!ina apresentam poucas ínterações polares com a proteína e que as ínterações de Van der Waals seriam mais relevantes no reconhecimento ligante - sítio ativo receptor.

O estudo de ancoramento molecular com os derivados A -acilidrazônicos sugere a existência de ligações de hidrogénio com resíduo de Ser-168 para LASSBio-1586, envolvendo o grupo metoxila em C3 do anel A, e com os resíduos Val-662 e Asn-9 para LASSBio-1587, envolvendo o mesmo grupo metoxila do anel A e o grupo hidroxila do anel B (Figura 27).

Durante os cálculos de ancoramento molecular ocorre mudança na conformação de menor energia otimizada calculada pelo programa SPARTAN'08 (Wavefunction Inc.) para os compostos /V-aciltdrazonicos LASSBio-1586 e LASSBio- 587. Ainda assim, estes compostos ancoraram no mesmo sítio que a combretastatina A4 (Figura 29.B), a qual, segundo os cálculos realizados, é capaz de interagir por ínterações de hidrogénio com resíduos de Ser-168 e Thr-169 da β-tubulina com os grupos hidroxila do anel B da CA-4 (Figura 29.A).

As mudanças conformacíonais dos compostos AAacilidrazônicos em solução e durante a ínte ração com o sítio da colchicina na β-tubulina devem ser os fatores determinantes para a diminuição da atividade citotóxica observada para os compostos avaliados quando comparados com a colchicina e combretastatina A4, que apresentam rigidez quanto à disposição espacial dos anéis aromáticos. Ao contrario da previsão realizada a partir da sobreposição entre os confôrmeros de menor energia de LASSBio-1593 e CA-4, comentada no capitulo de planejamento molecular (vide página 20), a comparação entre as conformações de LASSBio-1586 e CA-4 que interagem com a β-tubulina, no ensaio de ancoramento molecular, são significamente distintas (Figura 29. B).

Além de LASSBio-1586 e LASSBio-1587, foram incluídos nos estudos de ancoramento molecular os compostos LASSBio-1591 , LASSBio-1593, LASSBio-1594 e LASSBío-1596 a fim de entender melhor quais seriam as Ínterações específicas que justificariam a presença ou ausência da atividade citotóxica dos compostos avaliados. Em linhas gerais, os estudos de ancoramento molecular com o protótipo CA-4 e como os análogos sintetizados permitiram identificar um número pequeno de interações eletrostáticas as quais, quiçá, não explicariam a alta potencia citotóxica destes derivados.

Assim sendo, decidiu-se investigar a contribuição das interações apoiares no processo de reconhecimento ligante-p-tubulina.

Os resultados dos estudos de modelagem molecular com a proteína β- tubulina apontaram grande relevância dos grupos hidrofóbicos na determinação dos scores obtidos no processo de ancoramento (Tabela 19), o que poderia justificar a menor potência citotóxica observada para os compostos que apresentam maior padrão de oxigenação e metoxilação sobre o anel B.

Tabela 19. Componentes utilizados para a determinação do score de um experimento de ancoramento molecular realizado entre os compostos-alvo e a proteína β-tubulina (código do PDB:1sa0).

Compostos Δ£ S(hbond) S(metel) S(lipe) Hírot) AE(dasW l AE(int) : inteor S(protein) Score

CA-4 (21) -30.88 0.96 0.00 232.71 3.97 1.84 0.16 0.73 0.00 28.88

LASSBio-1586 (42a) -31.23 0.00 0.00 250.56 1.39 4.43 0.39 0.09 0.00 26.40

LASSBio-1587(42b) -24.47 0.94 0.00 178.01 1.95 0.13 0.16 0.11 0.00 24.18

LASSBío-1593(42h) -27.72 1.57 0.00 193.23 2.19 1.87 0.43 0.12 0.00 25.42

LASSBio-l591(42f) -26.97 0.73 0.00 195.75 1.51 2.28 1.43 0.07 0.00 23.26

LASS8io-1594(42i) -24.81 1.00 0.00 180 95 2.02 0,06 0.17 0.18 0.00 24.58

LASSBío-!596(42l) -3Í.72 0.92 0.00 243.03 2.06 1.87 0.55 2.85 0.00 29.30

AG: energia livre; S(hbond): entropia de ligação efe hidrogénio; S(metai): entropia de metais;

S(lipo): entropia de contribuições hidrofóbicas; H{rot): entalpia de rotação; AE(ciash) penalidade de clas ; AE(int): termo de torsâo interna, inteor. correção de energia interna; S(protein): entropia da proteína

Porém, não foi encontrada relação direta entre os valores de citotoxidade in vitro e os scores calculados in silico (Tabela 20). A falta de relação entre o score e a citotoxicidade experimental de LASSBio-1596, por exemplo, pode estar relacionada ao fato de que o valor de citotoxicidade é determinada em um ensaio celular enquanto que o estudo de ancoramento molecular é realizado sobre a enzima in silico. Um motivo para essa observação poderia ser a incapacidade da molécula de chegar ao sítio de reconhecimento molecular para exercer a atividade citotóxica no ensaio in vitro, enquanto que no ensaio in silico a molécula interage diretamente com o sítio selecionado.

Outro possível motivo para a ausência da atividade citotóxica de LASSBio-1596 pode ser consequência do aumento do volume do substituinte do anel 8, já que é observado in silico que LASSBio-1596 não é capaz de ocupar a mesma região do sítio ativo que LASSBio-1586 e LASSBio-1587. (Figura 31. B). Essa hipótese é endossada na literatura por estudos de relação estrutura atividade (REA) de diferentes padrões estruturais planejados como ligantes de tubulina (LIU eí.a/.,2009; CHEN eí.a/.,2010), que revelam a presença de substituintes volumosos no anel B extingue a atividade citotóxica de compostos planejados como inibidores de β-tubulina.

Tabela 20. Scores calculados para os compostos desenhados com o sítio da colchicina da beta-tubulina (código do PDB 1sa0) utilizando a função

ChemScore do programa GOLD (CCDC Inc.)

Compostos Score médio Desvio padrão

(n=5)

CA-4 (21) 26,45 1,53

LASSBio-1586(42a) 24,54 1,10

LASSBio-í587(42b) 24,43 0,33

L 5SBto4593(42h) 24,64 0,76

LASSBio~1591{42f) 22,76 0,39

LASSBio-1594(42i) 22,54 0,69

S5Bio 596(42í) 27,96 0,84

Curiosamente, LASSBio- 596 possui padrão de interação eletrostática com a β-tubulina diferente daquela encontrada para LASSBio-1586 e LASSBio- 1587. Para LASSBio-1596 estas interações dependem de ligações de hidrogénio envolvendo resíduos de Ser- 168 e Thr-769 com a carbonila e a amina da unidade amida do grupo N-acilidrazona. Para os demais compostos foi observada contribuição meramente auxofórica para o espaçador N- acilidrazona. Determinação da Ativídade Citotóxica

A atividade citotóxica dos compostos sintetizados foi avaliada segundo o protocob descrito por Mosmman (1983) peio Laboratório de Oncologia Experimental (LOE) da Universidade Federal do Ceará (UFC). A viabilidade celular foi determinada pelo método do brometo de (3-(4 , 5-dirnetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazola (MTT). Nos ensaios foram utilizados linfócitos humanos e as seguintes linhagens tumorais cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI- EUA):

- HL-60 (leucemia- humana - código ATCC:CCL240 TM);

- HCT8 (cólon- humano - código ATCC:CCL244 TM);

- SF295 (glioblastoma - humano);

- MDA-MB435 (meianoma);

- PC3M (carcinoma de próstata);

- OVCAR-8 (adenocarcinoma de ovário) e;

-■ NCI-H358M (carcinoma bronqui-alveolar pulmonar).

As células tumorais foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37 °C e atmosfera contendo 5% de C02 (dióxido de carbono).

Para a determinação do índice de seletividade (I.S.), foram consideradas as potencias citotóxicas dos compostos sintetizados frente a linfócitos humanos e frente às linhagens celulares tumorais estudadas. O I S foi calculado pela razão da potência citotóxica sobre linhagens tumorais e a potência sobre linfócitos humanos.

Os linfócitos humanos foram isolados através de gradiente de densidade (Ficoll-Hypaque) e cultivados em meio RPMI 1640, suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de antibióticos e 4% de fitohemaglutinina. As células serão mantidas em estufa a 37°C e atmosfera contendo 5% de CO2.

Os compostos ensaiados foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparação de soluções estoque de 100 mg/rnL.

As células tumorais foram plaqueadas em placas de 96 poços com densidades celulares diferentes, sendo incubadas com as substância-teste durante 72 horas em concentrações que variam de 0,008 a 25 pg/mL Após o período de incubação foi adicionado a cada poço 100 pl_ de uma solução de MTT (5mg/mL) em meio RPMI. As absorbâncias foram obtidas com auxilio de um leitor de ELISA no comprimento de onda de 550 nm.

Cada substância-teste foi avaliada em triplicata em dois experimentos independentes. As médias e intervalos de confiança foram analisados a partir de regressão não linear pelo software Graphpad Prísm.

A viabilidade celular ó determinada por um método espectrofotométrico , com a utilização do brometo de (3-(4,5-dimetíltiazo!-2-il)-2,5-difeniltetrazola (MTT), que é solúvel em água e possui originalmente coloração amarela-palha. Este sal após entrar na célula é clivado pela enzima succinato desidrogenase, originando cristais insolúveis de coloração violeta (MTT-formazan) Desta forma, há relação direta entre a viabilidade celular e coloração do meio e consequentemente com a absorbància (MOS ANN, 1983).

Os compostos /V-acilidrazônicos 42a-l foram incubados em concentrações variadas (0,008 - 25 pg/mL) por 72 horas a 37°C com as linhagens de células tumorais selecionadas. Após esse intervalo de tempo adicionou-se M T ao meio e após 1 hora de incubação nas mesmas condições realizou-se a quantificação da respiração celular em espectrofotômetro com leitura a 550 nm.

Os compostos sintetizados (42a-l) foram avaliados quanto seus efeitos citotóxicos frente as linhagens HL-60 (leucemia humana), SF-295 (glioblasíoma humano), MDA-MB-435 (melanoma) e HCT-8 (carcinoma ileocecal - cólon). Os experimentos foram analisados de acordo com a média e respectivos intervalos de confiança a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism. Cada substância foi avaliada em triplicata em dois experimentos independentes, tendo como controle e padrão positivo a colchicina (20) e combretastatina A-4 (21). Os valores de citotoxicidade das /V-acilidrazonas (42a-l) foram comparados com os valores de citotoxicidade dos padrões positivos. Os valores da atividade citotóxica determinada para os compostos N- acilidrazônicos análogos a CA-4 estão sumarizadas na tabela 6.

A análise dos resultados obtidos permitiu observar que os compostos que possuem maior padrão de substituição em nível do anel B (ligado ao carbono imínico) apresentam menor citotoxicidade e, em geral, as N- acilidrazonas avaliadas apresentam maior potência citotóxica sobre a linhagem MDA-MB435 (melanoma).

Dentre a série (42a-l), o composto LASSBio-1586 (42a) se destacou por apresentar elevada potência citotóxica na ordem de namomo!ar em todas as linhagens avaliadas. Entretanto, LASSBio-1586 (42a) foi menos potente que os padrões utilizados (coichicina e combretastatina A4) (tabela 21 ).

Tabela 21. Potência citotóxica (<¾o; micromolar - μΜ) para dos compostos sintetizados (42a-l) frente às linhagens tumorais selecionadas e frente a linfócitos humanos.

Compostos HL-60 (CTsa-ittó) SPZ95 (ClK'iiM,) Hcr-e {(¾-Í;« B - 8345 (CTM-« ) Unfácitos

CA-4 (21) 0,0021 0,0062 0,0053 0,0079 0.0032

(0.C009-0038) (0,0037-0.0085) (0.0013-0.0071) (0,0046-0,0092) (0.0001-0.0036) colchidwi(20} 0,038 0,054 0,077 0,061 Q,064

{0,026 O.ORS) (0,023-0,072) (0,056-0,090) (0.012-0,085) (0.042- .085)

LASSBic-2586 (42a) 0,29 0,26 0,45 0,064 1.34

(0.29- 0,32) (0,13 - 0,54) (0,35 -0,57) (0,02 - 0,16) (1,05 - 1,66) SSBio-1587(42b) 1,63 13,05 4,3 0.12 4,46

(1,48- 1,78) (6,33 - 26,91) (2,88 - 6,35) (0,02 - 0,79) (3,63- 5.84) SSBÍo-1588 (4?.c) 2,63 15,95 6,54 0,88 13,38

(2.36 - 2,9.1) (8,14 - 31.24) (4,12 - 10,38) (0,36 - 2,09) (10,26 - 17,44) l.ASSBio-1589 {42d) 9.3 42,68 29,65 11,78 7,36

(4,76 - 18,16) (33,35■■ 94,86) (17,96 - 48,91) (10,05 - 13,86) (6,44- 8.46)

LASSSIo-1590 (42e) 4,43 18,08 7.05 2,11 17,98

(3.63 - 545) (7.56 - 43,21) (4,35- 11,46) (1,36 - 3.23) (13,46 - 23.99) SSSio 1591 (42 f) 3,07 0.86 55,81 0,11 1,31

(0.28 - 0.33) (0,47- 1,59) (0,42 - 0,7) (0,06 - 0,22) (0,84 - Z,0i)

LASSBio-159? (42g) 9,85 13,57 9,27 6.S2 36,51

(7,71 - 12.63) (10,99 - 16,73) (8,24 - 10,41) (4,83 -8.8) (31.27 - 42,62)

LASSBíc-139- (42h) 4,72 1,55 2,08 0.39 2.5B

{0,4?. - 0,5) (0.69 - 3.5) (1,4 - 2.08) (0.31 - 0,53) (2.22 -3,0)

US5&V1594 (42i) > 61.82 > 61,82 > 61.82 > 61,82 > 61,82

LASSBií t5 5 (42j) > 63,38 65,36 23,35 > 65.38 > 65,38

(17,42 -31.33)

LASS8ÍO-I596 (421) 53,35 > fíó.49 > 56,49 >56,49 > 36.49

(40,83 - 69,69)

Para a determinação do perfil de citotoxicidade sobre as a células sadiasoi realizada a determinação da atividade citotóxica dos compostos N- acilidrazónicos (42a-l), frente a linfócitos humanos (Tabeía 21). Estes resultados permitiram determinar o índice de seletividade citotóxica através da razão entre a potência citotóxica frente a células tumorais e a potência citotóxica sobre células sadias (Tabela 22). O índice de seletividade indica o quanto mais tóxico é o composto para uma determinada linhagem de células tumorais que para linfócitos humanos e embora não haja consenso, índice de seletividade (IS) igual ou superior a 10, é considerado satisfatório para atribuir segurança a um novo agente citotóxica.

Quando levamos em consideração o valor de citotoxicidade e índice de seletividade, os compostos LASSBio-1586, LASSBio-1587 e LASSBio-1591 se destacam por apresentarem elevado potencial citotóxico e valor de I S. superior a 10 sobre a linhagem DA-MB435, o que sugere eventual segurança terapêutica para esses compostos. Cabe destacar que o I.S. destes análogos foi até 74 vezes maior que aquele encontrado para os padrões positivos (i.e. colchicina e CA-4).

Tabela 22. índice de seletividade calculado para os compostos N- acilidrazônicos (42a-l), colchicina e CA-4 através da razão da potência citotóxica sobre linhagens tumorais e a potência sobre linfócitos humanos.

Compostos Hl-60 SF295 HCT-8 MDA-MB345

CA-4 (21) 1.5 04 0.6 0.5

Colchicina (20) 1.7 1.0 0.8 1.2

LASSBio-1586(42a) 47 5,2 3 21

LASSBio-1587 (42b) 2.7 0,3 1.0 37

LASSBio-1588(42c) 5,1 0,8 2,0 15,2

LASS8io4589(42d) 0,8 0,2 0,2 0.6

LASSBío-1590(42e) 4,0 1,00 2,5 8,5

lAS5Bio 591(42f) 4,3 1,5 2,3 Π.7

LASSBio 1592(42g) 3,7 2,7 3,9 5,6

LASSBio-1593(42h) 5,5 1,7 1,2 6,6

LASSBío4594(42i) 1 1 1 1

LASSBio-1595(42J) 1 1 2,8 1

LASSBio4596(42l) 14 1 1 1 Determinação da Atividade Citotóxica dos derivados N- acilidrazônicos llpofíllcos (42m-s).

A atividade citotóxica dos derivados com substituintes lipofílicos (42m-s) foi determinada, empregando a mesma metodologia descrita no item 3.5, nas quatro linhagens avaliadas para a série anterior e em mais três novas linhagens, a saber:

- PC3M (carcinoma de próstata);

- OVCAR-8 (adenocarcinoma de ovário);

- NCI-H358M (carcinoma bronquio-alveolar pulmonar);

A inclusão dessas três novas linhagens, cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer estadunidense, aumenta o screening para outros tipos de tumores e amplia as aplicações terapêuticas potenciais para os derivados sintetizados. Os valores de citotoxicidade dos derivados da série II estão ilustrados na Tabela 23.

Tabela 23. Potência citotóxica (CI50; micromolar-μ ) para os compostos (42m- s) sintetizados frente às linhagens celulares selecionadas e frente a linfócitos humanos

«(,-«! Μ6Λ-Μβ43ϋ Ηί -β SFZ95 PC3 CVCAR-8 Κ - Η358*

(£¾>-»/*¾ (<¾,-ø«)

£Λ-4 (2ί) 0.0021 0.0062 0,0053 0,0079 0,0047 0,00037 0,008 0,0032

(0,0009-OOS8) (0,00.17-0.0065) (0,0013-0.0071) (0,0046-0.0092) (0,00?8-0.00β) (0.00023 O.00079) (0,003-0,037) (0,0001-0,0036)

<¾leMein<i£2Q) 0.0» 0,034 0,07 O.OSt 0,0*7 0.00fi7 0.OÍ9 0.064

{0,026-0,055) (0,025 0.07!) (.0,05*0,050) (0.012-0,065) (0.039-0,070) (0,0050-0.00») (0,003-0.031) (0,042-0.088) l.rt5SM>-l7¾t (<tím) 0,015 0,004 0,011 0,057 0,000 0,0054 0,079 ο,οιο

(0,007-0,02¾ (0,001-0,016) (o,oas-o,Q2a) (o,oza.o,07t) (0,006-0,010) (0,004-0,006) (0.02 (-0,94) (0.006-0,016)

I..ASS8íc-i739 (4¾l) 0,018 0.043 O.0BO 0,085 Q.027 0,026 0.63 o.oto

(0,012-0.026) (0,027-0,06$) (0,034-0.071) (Q,079~0.ÍÚ4) (0,022-0,03)3) (0,024-0,027) (0.4Kt,96) (0,008 -0.014)

LASSBi -I740 t42o) >64,07 >64,07 ►64,07 »S4,07 >64,07 vi54,07 '64,07 J64.07

ÍASS8ÍO-Í74Í (42(0 0.004<j 0,039 0,046 0.093 0 0.0062 0.Í91 0.0073

(0.0031 -0,0097) (0,012 0.04(0 (0Í1Í-0.061) (0,070-i,!?) (0,009-0,017) (0,006-0,010) (0,33-1,211) (Ο.0061-0Π2!

LASSBio-1742 (4fcj) 1,-7 1.98 2,02 2,69 4.48 0,96 2.16 3.82

0J.M-i,4») (1,;Η-1,ίΗ) (1.83-Í.17) (2,33-3,04) (3,M-ó,«a) (0,«-·«5) (J,«-Z,6 ) (3,274,68) l.ASS8ío-1743 (42?) 0,036 0,018 0,04* 0,072 0,0275 0,024 I.OSS 0,040

(0,019-0,034) (O.OOS-0,023) <P,0«3O,O72) (0,085-0.097) (0,022-0,031) (0,020-0,0») (a,«-i,40) (0,047-0,084)

LASSBio-l?44 (42s) 0,0109 o.oias 0,022 0,059 o.oi zr . 6,0073 0,167 0.03Í4

(O,O03-0,020J__ ío.mo-o.o¾5j___ (0,014-0,031) (0,036-0,074) (0 ,007-0,017) (0,003-0,00?) (0,05O,4S) (0,019-0,048)

Como apontado pelos estudos de modelagem molecular, a exceção dos compostos LASSBio-1740 e LASSBío-1742, os compostos com substituintes lipofílicos apresentaram maior potência citotóxica na ordem de nanomolar sobre as linhagens tumorais avaliadas. Estes compostos foram significativamente mais potentes que os compostos da série I e apresentaram atividade citotóxica equipotente ao protótipo CA-4, a exemplo de LASSBio-

1741.

A ausência de atividade citotóxica encontrada para LASSBio-1740, que possui a bifentia como substituinte ligado a função imina está em concordância com os resultados discutidos anteriormente para LASSBio-1596, que sugeria relação inversamente proporcional entre o tamanho do substituinte e a atividade citotóxica in vitro.

A constante de Hansch (ττ) é o parâmetro físico-químico utilizado por químicos medicinais que está associado à lipofílicidade de grupos substituintes. (BARREIRO & FRAGA, 2008). Os valores de π para metila e halogênios estão listados na Tabela 24. Com base nesta tabela observamos que a substituição de átomos de hidrogénio por halogênios e pela metila, teria como vantagens o aumento da lipofílicidade dos compostos, em especial do anel aromático ligado a parte iminica (anel B), facilitando o processo de reconhecimento pela proteína β-tubulina. Ademais, a introdução de halogênios no anel aromático previne reações de biotransformação catalisadas por enzimas do complexo enzimático CYP 450 (WERMUTH, 2008). Tabela 24. Valores da constante de Hansh (π) para hidrogénio, metila e halogênios (BARREIRO & FRAGA.2008)

X w benzeno

H 0,00

CH3 0,58

F 0, 14

Ci 0,71

Br 0,86

A substituição de átomos de hidrogénio por átomos de flúor não é suficiente para alterar significativamente a lipofílicidade de um composto (vide constante de Hansch), porém devido à elevada eletronegatividade do flúor são criados dipolos na molécula (WERMUTH, 2008) que podem estar associados à diminuição da atividade citotóxica de LASSBio-1742 em relação aos seus congéneres.

O aumento de !ipofiiicidade dos derivados lipofílicos com aromáticos e/ou arila halogenados também pôde ser verificada pelo tempo de retenção dos compostos no cromatograma de CLAE quando comparados com o tempo de retenção de LASSBio-1586 (Tabela 25).

Tabela 25. Tempo de retenção dos derivados LASSBio-1586, LASSBio-1738, LASSBio-1739, LASSBio-1740, LASSBio-1741 , LASSBio-1742, LASSBio- 743 e LASSBio-1744 (Fase móvel: CH3CN/H207:3).

Composto Tempo de retençSo (mm)

LASSBio-1586 (42a) 3,89

LASSBio-1738(42m) 4,95

LASSBio-1739(42n) 5,03

LAS5Bio-1740(42o) 5,57

LASSBio-1741(42p) 4,12

LASSBio-1742(42q) 3,79

LASSBio-1743(42r) 4,36

LASSBio-1744(42s) 4,74

Quanto à orientação espacial do anel naftaiênico foi observado que o regioísômero alfa apresenta, para algumas linhagens tumorais. maior atividade citotóxica que o regioísômero beta. Curiosamente LASSBio-1738 e LASSBio- 1739 são equipotent.es sobre os linfócitos humanos. Consequentemente, LASSBio-1738 apresenta índice de seletsvidade superiores a LASSBio-1739. A diferença de atividade dos regioisômeros frente as linhagens tumorais pode estar associada a diferença de afinidade às isoformas de beta tubulina de cada linhagem celular específica.

Embora as modificações baseadas na introdução de substttuintes lipofílicos tenha levado a identificação de derivados mais potentes, o índice de seletividade dos compostos avaliados é bem inferior a 10, inclusive para alguns compostos o IS foi menor que um (Tabela 26). De acordo com Jordan & Wifson (2004) a falta de seletividade dos inibidores de polimerização de tubuiina pelo sítio da coichicina seria um dos principais motivos para o insucesso desses compostos a chegar na clínica. Afirmativa que questiona a validade clínica dos compostos da série II e reafirma a importância de LASSBio-1586 como promissor agente citotóxico.

Tabela 26. índice de seletividade calculado para os compostos avaliados (42m- s) e para os padrões CA-4 e coichicina calculados entre a razão da potência citotóxica sobre linhagens tumorais e a potência sobre linfócitos humanos.

Composto HL-60 M5A-M8435 HCT-8 SF295 PC3M OVCAR-8 NCI-H358M

Coichicina (20) 1.7 1.2 0.8 1.0 1.4 9.6 3.4

CA-4 (21) 15 0.5 0.6 0,4 0.7 8.6 0.4

LASSBio-1738 (42m) 0.7 2.5 0.9 0.2 1.3 1.9 0.1

LASSBio-1739 (42n) 0.6 0.2 0.2 0.1 0.4 0.4 0.02

LASSBto-1740 (42o) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

LASSBio-1741 (42p) 1.5 0.2 16 0.1 0.6 0.9 0,01

LAS5Ôio 742 (42<?) 3.0 2.4 1.9 1.4 Q.8S 4.0 Í.S SS8io-l743 (42r) 1.7 3.3 1.3 o.s 2.2 2.5 0.06

USSBto-1744 (42s) 2.9 1.7 1.4 0.5 2.5 4.3 0.2

Avaliação da atividade citotóxica dos análogos modificados a partir de LASSBio-1586 (i.e. 50-53).

A potência citotóxica dos análogos planejados por simplificação, aza-homologação, retroisosterismo e homologação (figura 37, página 62) foi determinada empregando a mesma metodologia e linhagens tumorais, descrito anteriormente para os compostos 42a«s, e encontra-se sumarizada na tabela 27.

Tabela 27. Atividade citotóxica determinada para os compostos LASSBio-372,

LASSBio-1714, LASSBio-1734 e LASSBio-1735 Amostras Ht-60 DA- B435 HCT-8 SF295 Unfócfo»

0¾>- Μ) W ) ( ¾-í/ )

CA-4 (21) 0,0021 0,0062 0,0053 0,0079 0,0032

(0,0009-0033) (0,0037-0,0085) (0,0013-0,0071) (0,0046-0,0092) (0,0001-0,0036)

Colc icina (20) 0,038 0,054 0,077 0,061 0,064

(0,026-0,055) (0,023-0,072) (0,056-0,090) (0,012-0,085) (0,042-0,085) SSBfo-372 (50) >il.1.,48 >m,48 >1Μ,4β >U1.48 >111,48

USSSBio-1734 (51) >79,53 >79,53 >79,53 >79,53 >79,53 SSBie-1714 (52) >7S,90 >75,90 >75,90 >75,90 N.D

WSSBio- 1735 (53) 0,03 1.91 0,54 3,80 IM.D

(0,006-0,21) (0,94-2,83) (0,12-0,70) (2.83-5,23)

LASSBw- lS86 (42a) 0,29 0,064 0.45 0,26 1,34

- 0,32) (0,02 - 0,16) (0,35 -0.57) (0,13 - 0,54 ^05^1,66) _

A falta de atividade citotóxica observada para LASSBio-372, ratifica a importância da subunidade 3,4,5-trimetoxifenila para o reconhecimento molecular dos derivados N-acilidrazônicos, com sítio da colchicina, na β- tubulina, conforme sugerido pelos estudos de ancoramento molecular para os compostos LASSBio-1586 e LASSBto-1587 (vide Figura 27, página 44).

O retroisóstero de LASSBio-1586, isto é, LASSBio- 1734 não apresentou atividade citotóxica, indicando que a troca da posição original do anel A (3,4,5-trimetoxifenila) resulta em (natividade. Este dado pode ser explicado a partir de estudos de ancoramento molecular que demostram a incapacidade de LASSBio-1734 interagir com resíduos polares do sítio ativo, ao contrário do observado para LASSBio-1586, resultando provavelmente em perda do reconhecimento molecular (Figura 40).

A modificação planejada em nível da função /V-acilidrazona, baseada na estratégia de aza-homologação, resultou na inatividade do composto semicarbazônico LASSBio-1714 (52). É proposto que a maior liberdade conformacional originada a partir da introdução do grupo NH possa ter comprometido a conformação bioativa, alterando a disposição espacial ideal entre os anéis aromáticos A e B, necessária a etapa de reconhecimento molecular.

O derivado N-metilado, LASSBio-1735 (53), manteve a atividade citotóxica sobre as linhagens celulares avaliadas. Observou-se que LASSBio- 1735 apresenta menor atividade citotóxica que LASSBio-1586 sobre linhagens de tumores sólidos (melanoma, carcinoma íleocecal e glioblastoma), enquanto apresenta potente atividade citotóxica sobre a linhagem de tumor hematológico (leucemia), equipotente ao padrão colchicina.

As alterações conformacionais eventuais, resultantes da estratégia de homologia de LASSBio-1586, não comprometem o reconhecimento molecular pelo bioreceptor, mas podem estar associadas a mudança de perfil citotóxico observado, que quiçá possam resultar da mudança na seletividade frente as isoformas da proteína β-tubuiina presente nas diferentes linhagens celulares.

Avaliação da atividade antitumoral in vivo de LASSBio-1586

Considerando os resultados de citotoxicidade in vitro frente a diferentes linhagens tumorais, índice de seletividade citotóxica, atividade inibidora da polimerização de microtúbulos, o composto LASSBio-1586 foi selecionado para a realização de ensaios de determinação da sua capacidade antitumoral deste composto em modelo in vivo.

O modelo in vivo baseou-se no ensaio de Hoilow Fiber, que permite a avaliação simultânea da eficácia antiproliferativa de um composto contra até seis diferentes linhagens celulares em 2 compartimentos fisiológicos distintos do animal (intraperitoneal - i.p. e subcutâneo - s.c.) (HOLLINGSHEAD et a/., 1995). O ensaio de Hoilow Fiber foi desenvolvido pelo instituto Nacional do Câncer estadounidense para a identificação de compostos que possuem potencial atividade antitumoral em estágios iniciais de pesquisa e desenvolvimento (DECKER etai, 2004).

O ensaio de Hoilow Fiber possui como vantagens a redução de custos relacionados ao numero de animais usados e a possibilidade de avaliar a capacidade do composto ensaiado em atravessar barreiras fisiológicas (DECKER et. ai... 2004).

O ensaio consiste no preenchimento de fibras de fluoreto de polivinilideno (PVDF, do inglês: polyvínyiidene fiuoride) de 1 mm de diâmetro, previamente esterilizadas, com células de linhagens celulares tumorais seiecionadas (SF-295 e HCT-116) e posterior implantação das fibras no dorso de camundongos (BALB/c) (n=6/n=7) anestesiados sob condições cirúrgicas de assepsia, sendo as incisões seladas com um grampeador cirúrgico.

Preparação das fibras

Fibras de fluoreto de polivinilideno ou PVDF (Polyvinylídene Ftuoríde, Spectrum Medicai Industries, Houstoun, USA), com 550kDa de arfo/f (exclusão molecular) e 1.0 mm de diâmetro foram utilizados nos estudos. As fibras foram cortadas em pedaços de 12-15 cm de comprimento, lavadas com água destilada e mergulhadas em álcool etílico a 70 % por 72-96 h. Em seguida, as fibras foram lavadas novamente com água destilada e autoclavadas em água. As fibras foram mantidas em condições estéreis até o momento do uso.

Preenchimento das fibras

Antes do uso e sob condições estéreis, as fibras foram incubadas em RPM! completo com 20 % de soro fetal bovino (SFB) por um período mínimo de 12 h (período de acondicionamento) . Em seguida, uma suspensão de células a 4 °C foi injetada dentro das fibras, sendo as extremidades das mesmas imediatamente seladas por calor. As fibras foram cortadas a cada 2 cm, transferidas para placas de petri e incubadas em meio RPMI completo por 24-48 h antes da implantação nos camundongos. Cada célula foi injetada em uma fibra de cor diferente. Foram utilizadas as linhagens HCT-116 (carcinoma de colón humano, fibra azul) e SF-295 (Glioblastoma humano, fibra amarela).

Cirurgia de implantação

Os camundongos foram anestesiados com ceíamina-xilazina. As fibras foram implantadas subcutaneamente no dorso sob condições cirúrgicas de assepsia (dentro de uma capela de fluxo laminar). Uma pequena incisão foi feita incisão na nuca para permitir a implantação subcutânea das fibras na parte dorsal do corpo do animal. Todas as incisões realizadas foram seladas com um grampeador cirúrgico. Cada animal recebeu entre 2 fibras. Os compostos testes foram administrados durante 4 dias consecutivos, por via intraperitoneal, e no 5o dia as fibras foram retiradas para a determinação da capacidade antiproliferativa. Foram utilizados 46 animais BALB/c nude do sexo feminino, adultos, jovens, saudáveis e que não foram anteriormente submetidos a processos experimentais. A tabela 39 mostra o detalhamento dos grupos.

Tabela 39. Detalhamento dos grupos testados.

Grupo Tratamento Dose diária Via de Dias de n

(mg/kg) adm. tratamento

Controle Veículo (D SO) Sol. 5% i.p. 4 6 negativo

Controle 5-FU 25 i.p. 4 7 positivo

Teste LASSBio-1586 25 Lp. 4 7

Teste LASSBio-1586 50 i.p. 4 6

Determinação da viabilidade cefular

Para determinar a viabilidade das células contidas nas fibras, as células foram incubadas com o sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazot)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium (MTT), a fim de quantificar a capacidade das células metabolicamente viáveis em reduzir MTT a azul de formazan (MOSMANN, 1983). Para tanto, as fibras retiradas dos animais após o procedimento experimenta! foram incubadas com 1mg/mt de MTT em placas de 6 poços por 4 h em estufa a 37 °C com atmosfera de 5 % de GC½ e 95 % de umtdade. A solução de MTT foi aspirada e as fibras foram lavadas com solução salina contendo 2,5 % de cloridrato de protamina e incubadas na mesma ovemight a 4 °C. As fibras foram transferidas para placas de 24 poços, cortadas em 2 ou 3 partes e colocadas para secar. O formazan foi dissolvido em 500 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e alíquotas (150 μί) foram repassadas para placas de 96 poços e a leitura foi feita em espectrofotômetro de placas a 590 nm.

Os resultados foram expressos como da média ± erro padrão da média (E.P.M.). Possíveis diferenças significativas foi calculadas por análise de variância (ANOVA) seguida de Student Newman-Keuts (P < 0,05), usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

O composto teste, i.e. LASSBio- 586, foi administrado por via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 25 e 50 mg/kg, durante 4 dias consecutivos e no 5o dia, as fibras foram retiradas para a determinação da capacidade antiproliferativa in vivo, utilizando o protocolo descrito no item 3.5.

Foi utilizado como controle positivo no ensaio realizado, o fármaco 5- fluoruracila (5-FU). Os resultados obtidos encontram-se sumanzados na tabela 40.

Tabela 40. Efeito do composto LASSBio-1586 sobre a proliferação celular de células tumorais avaliado pelo ensaio do Hollow Fiber.

Proliferação

Dose Dias de Inibição (%}

Via de (Absorbáncia)

Tratamento diária tratame

adm.

(mg/kg} nto HCT- SF- HCT-

SF-295

116 295 116

Veículo (DMSO) 500 ±

Sol. 5% Lp. A 1,

*r 1,645 ±

(Controle negativo) 0,21 0,18

5-FU 0,519 ± 0,586 ±

25 i.p. 4 65,40 62,08

(Controle positivo) 0,08* 0,10*

0,571 ± 0,264 ±

LASSBio-1586 25 i.p. 4 61,89 82,89

0,05* 0,04*

0,409 ± 0,297 ±

LASSBio-1586 50 i.p. 4 72,68 80,76

0,06* 0,05*

Os animais foram tratados diariamente por quatro dias consecutivos e a proliferação celular avaliada no quinto dia. Os valores correspondem à média ± E-P.M- de 5-7 animais. * P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman- Keuls.

De acordo com os resultados obtidos, o composto LASSBio-1586 foi capaz de reduzir de forma significativa, nas doses avaliadas (25 e 50 mg/kg), a proliferação celular das linhagens SF-295 e HCT-116 em camundongos BALB/c no modelo in vivo utilizado.

O composto LASSBio-1586 apresentou inibição da proliferação celular maior que a 5-FU, frente a linhagem HCT-116 em ambas as doses estudadas e frente a linhagem SF-295 na dose de 50 mg/kg.

Cabe destacar ainda que não foram observados sinais de toxicidade macroscópica nos animais tratados com o composto LASSBio-1586. Estudos histológicos serão realizados a fim de descartar eventuais toxicidades de LASSBio-1586 sobre órgãos e tecidos.

Foram identificados derivados /V-acilidrazônicos análogos à CA-4, com potente aíividade citotóxica in vit.ro especialmente sobre a linhagem MD- MBA435 (melanoma);

Os compostos LASSBio-1586 ((E) - Λ/' - benzilideno - 3,4,5 - trimetoxibenzidrazida) e LASSBio-1587 ((E) - ΛΓ - (3-hidroxibenzih'deno) - 3,4,5 - trimetoxibenzidrazida) se destacaram por apresentar potência citotóxica na faixa de nanomoiar e por possuírem índice de seíetividade superior a 20 para a linhagem de melanoma.

O mecanismo de ação citotóxica de LASSBio-1586 e LASSBio-1587 foi elucidado e trata-se da inibição da proteína β-tubulina, corroborando com o planejamento molecular empregado no desenho destes derivados.

Os estudos de Modelagem Molecular realizados permitiram compreender melhor os requisitos estruturais necessários ao reconhecimento pela β-tubulina, auxiliando na etapa posterior de otimiza ão do efeito citotóxico dos análogos de LASSBio- 586.

O efeito antitumorai de LASSBio-1586foi comprovado em modelo murinho, demostrando perfil citotóxico, por via í.p„, superior a 5-FU frente a proliferação de células HCT-116 (carcinoma coloretal).

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Claims

Reivindicações
1. Derivado da combretastatina de acordo com a fórmula geral (!)
Figure imgf000097_0001
R2 é H, OH, Ci-C6 alcoxi, Cf-C-ic alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, C C6 haioalquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; R3 é H, OH, Ci-C6 alcoxi, Ci-Ci0 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-;
R4 é H, OH, OCi-C6 alcoxi, C Ci0 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, Ci-C6 haloaiquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; Rg é H, Ci-C-to alquil linear ou ramificado, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-, benzi! opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-, anel hete rociei ico; ou seu sal farmaceuticamente aceitável; caracterizado por ser utilizado como agente antitumoral.
2. Derivado, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado peio tumor ser escolhido dentre tumores sólidos e/ou hematológicos.
3. Derivado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tumor ser escolhido do grupo que compreende leucemia, tumores de cólon, glioblastoma, me!anoma, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de ovário, carcinoma bronqui-alveolar pulmonar e combinações dos mesmos.
4. Uso de um derivado de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser na manufatura de um medicamento para tratamento de tumores.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo tumor ser escolhido dentre tumores sólidos e/ou hematológicos
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo tumor ser escolhido do grupo que compreende leucemia, tumores de cólon, glioblastoma, melanoma, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de ovário, carcinoma bronqui-alveolar pulmonar e combinações dos mesmos.
7. Composição farmacêutica antitumoral caracterizada por compreender: a. Um derivado da combretastatina de acordo com a fórmula geral (I)
Figure imgf000098_0001
onde:
Figure imgf000099_0001
R2 é H, OH, C Ce alcoxi, Ci-Cto aíquií linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02l CN, Ci-Ce haloalquil, em que o alogênio pode ser F, Cl e/ou Br; R3 é H, OH, C1-C5 alcoxí, C1-C10 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-;
R4 é H, OH, OCrCe alcoxi, C1-C10 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br. NO?., CN, C C6 haloalquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; R5 é H, Ci-C10 alquil linear ou ramificado, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-, benzi! opcionalmente substituído por Ra na posição o-, tn- e/ou p~; anel heterocíclico: ou seu sal farmaceuticamente aceitável; e
b. Um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser administrada pela via oral, parenteral e/ou intramuscular.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender adicionalmente um segundo ativo antitumoral, o qual é administrado concomitantemente ou de forma separada do derivado da combretastatina.
10. Derivado da combretastatina de acordo com a fórmula geral (I)
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000100_0002
R2 é H, OH, Ci-C6 alcoxi, C1-C10 aíquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, N02, CN, C C6 haloalquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; R3 é H, OH, Ci-C6 alcoxi, Ci-C10 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-;
4 é H, OH, OC Ce alcoxi, C1-C10 alquil linear ou ramificado, F, Cl, Br, NO2, CN, Ci-Ce haloalquil, em que o halogênio pode ser F, Cl e/ou Br; s é H, C Cio alquil linear ou ramificado, fenil opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-, benzi! opcionalmente substituído por R2 na posição o-, m- e/ou p-; anel heterocíclico; ou seu sal farmaceuticamente aceitável;
caracterizado por ser utilizado como ferramenta farmacológica em estudos de ligação e/ou interação com a β-tubulina e ou isoformas da β-tubulina.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06279432A (ja) * 1993-03-26 1994-10-04 Tsumura & Co 新規な化合物および該化合物を有効成分とする抗癌剤
EP2338877A1 (en) * 2009-12-15 2011-06-29 The Provost, Fellows and Scholars of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth near Dublin Combretastatin Derivatives and Uses Therefor

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