WO2013135915A1 - Uso de aceites esenciales, extractos supercríticos y residuos acuosos generados en un proceso de obtención de extractos orgánicos de la planta artemisia absinthium l - Google Patents

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Azucena GONZÁLEZ COLOMA
María Fe ANDRÉS YEVES
Carmen Elisa DÍAZ HERNÁNDEZ
Jesús BURILLO ALQUÉZAR
Raimundo CABRERA PÉREZ
José URIETA NAVARRO
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Centro De Investigación Y Tecnología Agroalimentaria De Aragón (Cita)
Universidad De Zaragoza
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Abstract

La presente invención parte de un procedimiento de obtención de extractos orgánicos de la planta Artemisia absinthium L., que comprende: una fase de metodología de producción de dicha planta, una fase de extracción en la que se obtiene dicho aceite esencial y un extracto no volátil, y una fase de extracción con CO2 de extractos supercríticos, y se refiere concretamente al uso del aceite esencial y/o del extracto supercrítico extraídos como fungicida frente a hongos fitopatógenos. Para ello se emplea la planta Artemisia absinthium L., variedad Candial procedente de Teruel y/o de Sierra Nevada. También es otro objeto de la presente memoria el residuo acuoso generado en dicho procedimiento que comprende un componente orgánico que contiene a su vez (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3- diol como compuesto orgánico activo frente a los nemátodos. El método de obtención de dicha parte orgánica y de su correspondiente componente orgánico activo es objeto de rotección de esta solicitud.

Description

USO DE ACEITES ESENCIALES, EXTRACTOS SUPERCRITICOS Y RESIDUOS ACUOSOS GENERADOS EN UN PROCESO DE OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ORGÁNICOS DE LA PLANTA ARTEMISIA ABSINTHIÜM L SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento de extracción de derivados orgánicos de la planta Artemisia Absinthium L.r comúnmente conocida como Ajenjo, y más concretamente a la aplicación de dichos extractos como compuesto activo fungicida frente a hongos fitopatógenos y a la aplicación de los residuos generados en el procedimiento como nematicidas frente a nematodos fitopatógenos . La invención se basa en la producción orgánica de la planta de quimiotipo especifico con el fin de producir extractos orgánicos por arrastre de vapor (aceites esenciales) , extractos supercríticos con CO2 y recolectar el residuo acuoso de la extracción del aceite esencial (hidrolato) , considerado en el sector agrícola como un residuo sin valor.

De esta forma, la invención se engloba de manera general dentro del campo de la Química industrial, en lo que se refiere al proceso de obtención de extractos orgánicos derivados de la Artemisia absinthium L (ajenjo), y de forma más particular dentro del campo de la Agricultura, siendo la aplicación más importante de dichos compuestos y de los residuos que se generan en su proceso el de fungicida y nematicida, respectivamente. Por ser sustancias naturales tienen gran valor en Agricultura ecológica, es decir, donde no se emplean productos químicos de síntesis.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La Artemisia absinthuim L.r denominada comúnmente "ajenjo", es una planta herbácea medicinal de la familia de las asteráceas. Cada año produce desde su base ramas rectas, de 0,50 a 1,20 m de altura, que se secan en otoño tras la fructificación. Las partes básales de estas ramas permanecen durante el invierno y en la estación siguiente se producen nuevas ramas a partir de sus yemas. Toda la planta tiene una coloración blanquecina, debido a su abundancia de pelos que cubren prácticamente toda la superficie de tallo y hojas. Su área de distribución abarca principalmente desde Asia Central hasta Europa Occidental, con algunas localidades en el Norte de África. Ha sido una planta muy cultivada por su carácter aromático, especialmente en los Estados Unidos, la antigua URSS y Francia. La planta se recolecta cuando está en plena floración, entre julio y agosto. El primer año la recolección es escasa, pero en los años sucesivos es posible hacer dos recolecciones, en julio y a finales de octubre, si las condiciones meteorológicas lo permiten.

Aunque la forma más común de obtener el ajenjo que se comercializa es a través de su cultivo, en muchos lugares se recogen poblaciones silvestres de esta planta, obteniéndose asi un producto heterogéneo en calidad y rendimiento. También se han desarrollado métodos de micropropagacion de ajenjo para producir plantas con el fin de obtener metabolitos secundarios .

Esta planta era conocida desde muy antiguo ya por los egipcios y transmitida después a los griegos gracias a sus múltiples aplicaciones curativas como tónico, febrífugo y antihelmíntico. Además de por sus virtudes medicinales, el ajenjo ha sido utilizado tradicionalmente como aromatizante, empleándose su principio activo absintina (sustancia amarga) en la preparación de bebidas comerciales como por ejemplo el vermouth. El aceite esencial de ajenjo y el alcohol constituyen los ingredientes básicos de la absenta.

El ajenjo ha sido asimismo empleado desde tiempos remotos para el tratamiento de trastornos digestivos ya que estimula el apetito, previene la formación de gases en el tubo digestivo, estimula la secreción de jugos gástricos y de bilis tanto por la vesícula biliar como por el hígado y protege frente a dolencias hepáticas. Asimismo, presenta propiedades antipiréticas, antioxidantes y antiinflamatorias. También se ha utilizado como antídoto para el opio y otros venenos depresores del sistema nervioso central. También se le conocen aplicaciones en perfumes, como por ejemplo se divulga en la solicitud de patente internacional WO0249600 Al ("Composiciones de perfume") , o como elementos para su uso en medicinas alternativas, como por ejemplo se describe en la patente española ES 2076896 Bl ("Procedimiento para producir moxas") .

Asimismo, son conocidas tradicionalmente, y frecuentemente utilizadas, sus propiedades insecticidas y repelentes en la lucha contra las plagas, especialmente pulgones, ácaros, cochinillas, hormigas, orugas, y otros insectos pulverizando su extracto sobre las plantas afectadas. También repele la mariposa de la col, ácaros, roya, caracoles y babosas, si se pulveriza preventivamente. Se ha comprobado que el aceite esencial extraído de ciertos quimiotipos del ajenjo sirve como acaricida frente a la araña roja y como insecticida frente a gorgojos y mosca común. Además se ha utilizado como repelente de pulgas, moscas, mosquitos, polillas y garrapatas. Por otro lado, el extracto también ha resultado tener efectos tóxicos y antialimentarios frente al escarabajo de la patata (Leptinotarse decemnlineata) .

Además, se conoce que diversos fitoextractos obtenidos de tallos y raíces de la planta de ajenjo tienen cierta actividad nematicida sobre juveniles infectivos de Meloidogyne incógnita.

Tradicionalmente, los plaguicidas naturales se han utilizado para proteger los cultivos, pero en las últimas décadas éstos han sido reemplazados casi totalmente por compuestos de síntesis más eficaces. Sin embargo, el aumento de los problemas asociados a resistencias cruzadas, riesgos para la salud pública y daños al medioambiente, han promovido la búsqueda de productos naturales con propiedades plaguicidas. Así, existen en el mercado algunos nematicidas naturales basados en el extracto de Neem (Neemate) , de mostaza (Nemitol) , en extractos de semillas de sésamo (Dragonfire CPP) y con metabolitos fúngicos (DiTera) con efectividad variable frente a distintas especies de nematodos fitoparásitos . Entre los fungicidas naturales comercializados podemos citar los que contienen aceite esencial (8%) de tomillo rojo, Thymus zygis (Bio 75), aceite (60%) de canela (Cinnacoda) o extracto de semillas de cítricos (Zytroseed) . A pesar de ello, se necesita encontrar componentes todavía más selectivos y biodegradables para reemplazar a los plaguicidas de síntesis que persisten en el medio ambiente y poseen un amplio espectro de toxicidad. Ello es especialmente relevante ya que la producción orgánica mediante agricultura ecológica es un mercado emergente, para el que existe una demanda cada vez mayor de agroquímicos naturales .

La extracción y aplicación del ajenjo se han realizado hasta ahora por métodos tradicionales como la maceración de la planta, decocción o infusión. Estos métodos, aparte de que su utilización, dosificación y efectividad está basada casi siempre en la tradición y en la experiencia, presentan el inconveniente de que no permiten un completo aprovechamiento de toda la capacidad bioplaguicida de la planta, además de no ser transferibles industrialmente, ya que no es predecible ni el aprovechamiento, ni la concentración ni la efectividad de las soluciones utilizadas.

Para solventar esa necesidad, los inventores de la presente solicitud han desarrollado en la solicitud de patente española P201031389 un procedimiento de extracción de derivados bioinsecticidas de la planta Artemisia Absinthium L. caracterizado porque se define por una fase de extracción de extractos orgánicos, obteniendo aceite esencial y extracto no volátil, y una fase de extracción de extractos supercríticos con CO2, partiendo de una planta de quimiotipo específico que es previamente seleccionada y cultivada. De esta forma, se obtienen derivados bioinsecticidas de la planta Artemisia Absinthium L con lo que se consigue un aprovechamiento óptimo de los extractos de dicha planta, con resultados reproducibles y aplicables industrialmente . Para ello, se establecen los parámetros agronómicos y económicos de producción orgánica de la planta del ajenjo (Artemisia absinthium L.) en parcelas experimentales con el fin de producir extractos orgánicos consistentes en aceite esencial y extracto no volátil, y en otra fase de extracción extractos supercriticos con CO2 de composición química caracterizada, con efectos repelentes experimentalmente demostrados frente a larvas de lepidópteros, por ejemplo de la especie Spodoptera littoralis, pulgones y escarabajo de la patata (Leptinotarsa decemlineata) además de tener efectos sobre el desarrollo radicular de cebada Hordeum vulgare .

No obstante, al desarrollar el citado procedimiento se comprobó la existencia de una variación significativa, tanto cuantitativa como cualitativa, en la composición química del aceite esencial dependiendo del quimiotipo empleado de ajenjo.

En la presente invención se prueba una nueva aplicación industrial de los aceites esenciales y extractos supercriticos extraídos de la planta Artemisia Absinthium L. mediante el citado procedimiento como fungicida para el control del crecimiento de hongos fitopatógenos que afectan a cultivos agrícolas (no a animales, como ya se conoce para algunos quimiotipos de esta planta) . Además, un aspecto relevante de la presente invención es la aplicación o uso de los residuos acuosos o hidrolatos que se generan en dicho proceso (y que son sub-productos comunes en este tipo de destilación de plantas aromáticas) como nematicidas, frente al ataque de nematodos fitopatógenos en cultivos agrícolas. Esto es posible gracias a que se emplea» una variedad de Artemisia concreta que crece en España, con poblaciones autóctonas de Teruel y de Sierra Nevada. Estas poblaciones poseen quimiotipos específicos pero a la vez similares, carentes de tuyonas, a partir de los cuales se obtienen aceites y extractos supercriticos y se generan residuos con las pretendidas aplicaciones. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en primer término al uso de un aceite esencial y/o de un extracto supercritico extraídos ambos de la planta Artemisia absinthium L.r población de Teruel y/o de Sierra Nevada como fungicida, es decir, para el control de hongos fitopatógenos en cultivos agrícolas. Este aceite esencial y este extracto supercritico se obtienen mediante un procedimiento de extracción que comprende una fase de metodología de producción de dicha planta, una fase de extracción de extractos orgánicos en la que se obtiene dicho aceite esencial y un extracto no volátil (de naturaleza etanólica) , y una fase de extracción mediante CO2 supercritico. Estos extractos tienen una composición química definida.

En la presente memoria se entiende por extracto supercritico aquellas fracciones obtenidas mediante la extracción del material vegetal con CO2 supercritico a presión y temperaturas definidas.

Asimismo, un segundo objeto de la invención es el residuo acuoso (o hidrolato) generado en la fase de extracción del aceite esencial del procedimiento antes referido (y que se define en la solicitud de patente española P201031389), y de su uso como nematicida, es decir para el control de nemátodos fitopatógenos en cultivos agrícolas. En el caso de la presente invención, dicho residuo se obtiene concretamente del procedimiento de extracción de aceite esencial de la planta Artemisia absinthium L., variedad Candial procedente de Teruel y/o de Sierra Nevada, dicho residuo comprendiendo así un componente orgánico que contiene a su vez (Z)-2,6- dimetillocta-5 , 7-diene-2, 3-diol como compuesto orgánico activo frente a los nemátodos fitopatógenos . También es posible dentro de la presente invención usar sólo la parte orgánica extraída del residuo acuoso o hidrolato para el control de nemátodos fitopatógenos en cultivos agrícolas, e incluso también el componente activo nematicida que contiene la parte orgánica del residuo acuoso, que es (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7- diene-2 , 3-diol .

La composición química del aceite esencial y del extracto supercrítico obtenidos a partir de plantas es generalmente característica de cada especie. Por otro lado, se sabe en el campo de la agricultura que en función del biotopo (días de sol, clima, composición del suelo, altitud...) , una misma planta puede secretar esencias muy diferentes desde el punto de vista bioquímico. De estas variaciones de composición bioquímicas de los aceites esenciales surge la noción de quimiotipo; dos quimiotipos del mismo aceite esencial presentan no solamente propiedades terapéuticas diferentes sino también índices de toxicidad muy variables. En la presente invención se utiliza concretamente la especie Artemisia absinthium L. variedad Candial, poblaciones de Teruel y de Sierra Nevada, lo que ha permitido obtener un aceite esencial concreto que incluye los usos pretendidos. Esta variedad Candial de la especie Artemisia absinthium L. ha sido depositada el 25/05/2009 en la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales, Dirección 3, Bd. Maréchal Foch. BP 10121. 49101 Angers Cedex 02-France por AZAGRA Patentes y Marcas, representante de Dña. Azucena González Coloma del CONSEJO SUPERIOR DE INVES IGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) , C/ Serrano 142, 28006 MADRID (ESPAÑA); y D. Jesús Burillo Alquézar del CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA AGROALIMENTARIA DE ARAGÓN (CITA), Avda. Montañana 930, 50059 ZARAGOZA (ESPAÑA), habiendo recibido el número de depósito 2009/0972. Debe resaltarse que las poblaciones de esta variedad Candial procedentes de Teruel o de Sierra Nevada presentan un quimiotipo similar, sólo con algunas variaciones en la composición de productos minoritarios, pudiendo por tanto obtenerse aceites a partir de plantas de una de estas dos regiones, o de una mezcla de las dos, con las propiedades requeridas para cumplir el objeto de la presente invención.

Al realizar el procedimiento debe tenerse en cuenta que además del origen de la planta (que define el quimiotipo) , existen numerosos factores que pueden afectar a la composición química del aceite esencial que se obtiene, como son por ejemplo las condiciones de crecimiento y el estado de desarrollo de la planta, y que por tanto deben controlarse. Por ejemplo, el cultivo in vitro, en invernadero o en campo de cultivo influye en la composición química final del aceite. En este caso concreto, la fase de metodología de producción comprende preferentemente el cultivo en campo de un quimiotipo seleccionado de la planta en cuestión por su adaptabilidad al cultivo y por su composición química, que como se ha dicho es la variedad Candial, autóctona de Teruel (Aragón) y de Sierra Nevada (Granada), que se encuentra libre de tuyonas . Dicho cultivo se realiza preferentemente mediante multiplicación, más preferentemente mediante esquejes o semillas en vivero- semillero para su posterior plantación en el terreno de asiento. Este terreno de asiento está preferentemente ubicado en zonas altas con pluviometría superior a los 400-450 mm anuales, y se trabaja también preferentemente mediante cultivo mecanizado. El cultivo entra en producción en el primer año de su plantación, debiendo proceder entonces a la recolecta de la parte de biomasa de la planta que se emplea para realizar el procedimiento de obtención de extractos orgánicos, que consiste preferentemente en las hojas y sumidades floridas cuando las plantas se encuentran en estadio fenológico de plena floración, debiendo posteriormente proceder al secado y molido de la biomasa recolectada. Preferentemente, el secado se realiza a la sombra, bajo corriente de aire y durante un periodo de 8 días aproximadamente.

La fase de extracción de los extractos orgánicos, que es también cuando se genera el residuo acuoso o hidrolato, se realiza comúnmente mediante hidrodestilación (por arrastre de vapor) y extracción orgánica del material recolectado, obteniéndose así el aceite esencial y un extracto no volátil, además de un subproducto acuoso o hidrolato, que es un residuo del proceso. La fase de extracción de extractos supercríticos con CO2 de composición química determinada se realiza preferentemente utilizando una bomba de compresión con un filtro, un cilindro de extracción, dos colectores, un dispositivo de refrigeración cilindrica, un intercambiador de calor, un sensor de presión y un medidor de flujo. Para ello, el material recolectado se introduce en el cilindro de extracción y es embebido simétricamente con materiales porosos inertes que permiten un flujo homogéneo de CO2, a continuación se calienta hasta que se alcanza una temperatura de 40°C, para a continuación comprimir la bomba y el CO2 hasta conseguir una presión de 90 bar, momento en el que el fluido supercrítico a la presión de trabajo llena el cilindro de extracción, regulándose en los dos colectores la presión, mediante las oportunas válvulas, y la temperatura mediante el dispositivo de refrigeración, de tal forma que el primero de los colectores sirve para eliminar compuestos pesados, como ceras, y el segundo colector para la recogida del extracto supercrítico.

En unas condiciones preferidas, el valor medio de tamaño de partícula del tamaño recolectado utilizado es de 0,5 mm, y el flujo de gas a través del cilindro extractor a 25°C y 1 atm. es 10,5 1/min.

En la Figura 1 se presenta una realización práctica preferente del procedimiento en cuestión, con un diagrama de bloques simplificado, para ilustrar el procedimiento a partir del cual se obtienen los productos objeto de interés en esta invención .

Este procedimiento de extracción de derivados orgánicos del ajenjo aporta múltiples ventajas sobre otros disponibles en el campo de la técnica, como por ejemplo que contempla una metodología de producción del cultivo en campo, con quimiotipos específicos seleccionados y mediante una extracción controlada de la materia prima, posibilitando una producción controlada, predecible e industrializable . También destaca la ventaja del control en origen que implica la estandarización química y biológica de los extractos orgánicos obtenidos, al igual que la optimización del rendimiento que se consigue gracias a la extracción con CO2 supercrítico .

La efectividad de este procedimiento ha sido verificada experimentalmente . Para ello se han realizado estudios de cosechas de ajenjo con la variedad Candial registrada (poblaciones de Teruel y de Sierra Nevada) en parcela experimental para analizar la producción y la composición química del aceite esencial y extractos (Tabla 1) . Se han realizado análisis anuales (de 2008 a 2010) de los aceites esenciales de las poblaciones cultivadas mediante cromatografía de gases masa (GC-MS) .

De forma general, el aceite esencial obtenido de la especie A. absinthium consiste en una mezcla más o menos compleja de compuestos terpénicos, de bajo peso molecular. De forma particular, el interés del aceite esencial específico obtenido en la presente invención para el uso pretendido (fungicida) radica en la actividad de sus compuestos. En efecto, el aceite esencial de A. absinthium, poblaciones Teruel (AAT) y Sierra Nevada (AASN) , como se observa en la Tabla 1, presenta fundamentalmente componentes terpénicos, pertenecientes a diversos tipos estructurales, monoterpenos y sesquiterpenos que aparecen en cantidades variables dependiendo del año de cosecha de la planta. El componente mayoritario es el epoxiocimeno (26 - 44 %) , seguido de crisantenol (12 - 30 %) y el monoterpeno ( Z) -2 , 6-dimetillocta- 5, 7-diene-2, 3-diol (0, 001 - 20 %) . Por tanto, se puede considerar que el aceite esencial extraído que se aplica en la presente invención como fungicida comprende entre sus componentes: epoxiocimeno entre 26 - 44% del total de la composición, crisantenol entre 12 - 30 %, y monoterpeno (Z) - 2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol entre 0,001% y 20%, y preferentemente aparece en un máximo del 20 % de la composición total. Tabla 1. Composición química de A. absinthium variedad ndial, poblaciones Teruel (AVAAT) y Sierra Nevada (AVAASN)

Compuestos AVAAT AVAASN

2008 2009 2010 2008 2009 2010

% relativo

-Pineno 2,09 2,70 1,25 1, 62

Fencheno 0,56 1,07

Campheno 0,76

Sabineno 0, 53

β-Pineno

β -Mirceno 1,23 0, 68 0,86 1,15 1,13 β -Ocimeno 1,03 1, 54 1,27

1,8-Cineol (limoneno) 2, 17 2,43

1, 3, 6-Ocatatrieno-3 , 7- 0,75 0, 72

dimetil

Linalool 5,06 4,28 3, 42 3, 63 3,49 3, 54

152 81 68-79-41-53 1,08 1,25 0, 54 1, 94 0,49

Epoxiocimeno 44, 11 38, 92 25,89 43, 33 42,72 38,77

Epoxiocimeno (Isómero) 2, 99 7,74 0, 99 1, 93 2,45 2,16

Crisantenol 12,21 12,71 30, 32 20,73 23,48 22,49

152 82 67-71-43-41 1, 17 1,26 1, 34 0,89 1,30 1, 64

Acetato de 6, 58 7, 35 0,71 0,46

Crisantenilo

(Z) -2, 6Dimetillocta- 1,72 20,21 1, 53 1,72 1, 90

5, 7-diene-2, 3-diol

-Copaeno 0, 53 0,73 0,70 β -Bourboneno 0, 55 0, 61

β -Elemeno 0, 98 1, 54 1,46 2, 57

Trans-Caryophyllene 3,38 4,20 2,47 5,56 5,43

204 161 105-91- 1,30 1,36 1,15 2,70 5, 99 1,86

119-79

Neryl acetato 0, 52 0, 53 0,56 0, 92

Alcohol 0, 52 0,51 1,79 0,74 sesquiterpenico

Azuleno 1,13 1,09 0,87 1, 11 Gracias a la composición química del aceite esencial obtenido del proceso, éste tiene utilidad como agente fungicida. Específicamente se ha comprobado que los extractos obtenidos preferentemente por hidrodestilación (por arrastre de vapor) en el procedimiento descrito (aceites esenciales) son fungicidas efectivos frente a hongos fitopatógenos , preferentemente frente a las especies Alternaría alternata , Fusarium oxysporum, F. moniliforme y F. solani, siendo aún más efectivos frente a Botrytys cinnerea.

El rendimiento que se obtiene del aceite esencial varia en un intervalo de 0,1 -0,2 % de la biomasa verde recolectada y utilizada en el procedimiento.

En cuanto al extracto supercritico obtenido del procedimiento, éste se encuentra caracterizado en las publicaciones: L. Martin, et al. Supercri tical fluid extraction of wormwood {Artemisia absinthium i.) (2011). J. Supercrit. Fluids 56, 64-71. (2011). "Comparative chemistry and insect antifeedant action of traditional (Clevenger and Soxhlet) and supercritical extracts (C02) of two cultivated wormwood (Artemisia absinthium L.) populations" . Ind. Crop. Prod. 34, 1615- 1621 (2011) .

En cuanto al residuo acuoso, o hidrolato, generado en el proceso de extracción de los aceites esenciales, es un nematicida muy efectivo frente a nemátodos fitopatógenos formadores de nodulos (Meloidogyne sp . ) . Además, su estado acuoso facilita la aplicación directa del hidrolato generado en la extracción sobre el cultivo a tratar, como formulación nematicida, sin requerir ningún otro componente, lo que supone una ventaja añadida para este residuo que se emplea ahora como producto elaborado.

El rendimiento que se obtiene del hidrolato o residuo acuoso en el procedimiento descrito varia en un intervalo de 150-200 litros por cada 800-1000 Kg. de biomasa recolectada y empleada en dicho procedimiento.

Dicho residuo acuoso se caracteriza por contener una parte orgánica activa frente a nemátodos (denominada también en la presente memoria "componente orgánico del residuo acuoso") que resulta comprender en su mayoría (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7- diene-2 , 3-diol de fórmula general (I), componente orgánico activo presente también en el aceite, pero en menor cantidad (ver Tabla 1) .

Figure imgf000015_0001

Fórmula (I)

En definitiva, este residuo acuoso o hidrolato contiene una parte orgánica natural y activa que procede de la planta y que es arrastrada en el agua que se emplea en el proceso de extracción del aceite esencial, agua que normalmente se desecha como residuo. La parte orgánica activa del residuo acuoso se obtiene normalmente en un intervalo de concentración entre 1 y 4 gr/1 de residuo acuoso. De esta parte orgánica del hidrolato, el compuesto activo mencionado (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol) representa al menos un 80% del total y nunca más 90% (es decir, está contenido en un porcentaje comprendido entre el 80% y el 90% de la composición total del residuo, incluidos ambos limites) , siendo el responsable de la actividad nematicida del residuo acuoso .

Los autores de la presente invención han comprobado que la parte orgánica o componente orgánico del residuo acuoso que contiene este componente activo, (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7- diene-2 , 3-diol de fórmula (I), puede ser extraída de forma convencional mediante un proceso de extracción líquido- líquido, aunque este proceso requiere el empleo de un disolvente y el manejo de volúmenes considerables de productos. Por esta razón, resulta más ventajoso extraer la parte orgánica del residuo acuoso por un proceso de extracción en fase sólida que comprende las siguientes etapas:

a) decantar el residuo acuoso para eliminar restos de aceite esencial;

b) mezclar en agitación la fase acuosa anterior con carbono activado en una proporción de 10:1, hasta que se produzca la adsorción de la parte orgánica; y c) secar el carbono a 35°C.

Preferentemente, la decantación del residuo acuoso se realiza añadiendo CINa para facilitar el proceso.

El porcentaje de adsorción en el carbono activado es del 99% del componente orgánico del residuo (parte orgánica) que contiene entre un 80% y un 90% del componente orgánico activo (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol . Como resultado del proceso, este componente orgánico o parte orgánica del residuo en formato sólido queda adsorbido en carbono activado. Esto posibilita múltiples funciones desde el punto de vista industrial, ya que por ejemplo puede prepararse un cartucho de filtración en linea, que se compone del citado carbono activado con la parte orgánica adsorbida, de tal forma que el carbono de dicho cartucho de filtración tendría entre sus ventajas los mencionados efectos nematicidas.

La presente memoria se refiere asimismo al carbón activado que se obtiene mediante el método descrito, y que contiene el componente orgánico extraído del residuo adsorbido en el carbono, así como al cartucho de filtración fabricado a partir de dicho carbono, teniendo en cuenta que ambos pueden emplearse como nematicida frente a nematodos fitopatógenos .

En una realización más preferente, a partir del carbono activado resultante puede obtenerse el componente activo (Z)- 2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol en estado puro, mediante su extracción del carbono activado. Aunque esta extracción se puede hacer mediante el empleo de disolventes, se ha comprobado que es más ventajoso extraer dicho carbono y separarlo de la parte orgánica del residuo con CO2 supercrítico, obteniendo como resultado un extracto orgánico enriquecido en el componente activo y libre de carbono; el contenido en el extracto orgánico del componente activo (Z)- 2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol varía entre 80% y 100 % , es decir, su composición puede llegar a ser en su totalidad (Z)- 2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol . Este extracto orgánico enriquecido final, al igual que el residuo acuoso del que procede la parte orgánica y dicha parte orgánica extraída en formato sólido (adsorbido sobre carbono activado) , puede usarse como agente nematicida de nematodos fitopatógenos . Dicho uso, tanto del carbono activado obtenido mediante el procedimiento anterior como del propio extracto orgánico enriquecido puede ser por ejemplo mediante aplicación del producto en el suelo del cultivo, con los mismos efectos que el residuo acuoso. Una ventaja añadida para este producto natural es que en su fabricación se emplea carbono activo, un componente barato y que no contamina, o incluso comercializarlo, sin el carbono.

Las principales aplicaciones industriales de los aceites esenciales y extractos supercríticos obtenidos en el procedimiento consisten en ser la materia base para preparar formulaciones de fungicidas naturales, de especial aplicación en agricultura y más especialmente en agricultura ecológica, asi como su uso como ingrediente para formulaciones mixtas, es decir para formulaciones que comprenden combinaciones sinergistas junto con otros componentes activos naturales con la misma función (fungicida o nematicida, en cada caso) . Por su parte, el hidrolato o residuo acuoso, además de emplearse igualmente como materia base para composiciones nematicidas naturales, puede aplicarse directamente a las concentraciones indicadas sobre el cultivo a tratar. Esto mismo se aplica al carbono activado y al extracto orgánico con (Z)-2,6- dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol, dos productos de aplicación directa frente a los nemátodos fitopatógenos .

De esta forma, un tercer objeto de la presente invención lo constituye una composición fungicida natural, es decir que contiene excipientes compatibles con la agricultura ecológica, que comprende al menos el aceite esencial y/o el extracto supercritico anteriormente mencionado como componente activo, normalmente (aunque no exclusivamente) junto con al menos un excipiente y un adyuvante normalmente empleados en el campo de la agricultura. En una realización más preferida, la composición fungicida comprende además al menos otro componente activo diferente al aceite. La composición fungicida comprende una cantidad de aceite esencial y/o extracto supercritico suficiente para alcanzar el 50% de inhibición de crecimiento del hongo, cantidad que equivale a la dosis efectiva de acción fungicida del aceite esencial. Dicha dosis efectiva varia en función del hongo a tratar; asi, es de 3 -5 % frente a Fusarium sp. , 2 % frente a A. alternata y 0, 3 % frente a Botrytis cinérea, del total de la composición fungicida que lo contiene.

A su vez, un cuarto objeto de la presente invención consiste en una composición nematicida natural que comprende el residuo acuoso o hidrolato, la parte orgánica de dicho residuo acuoso, o el extracto orgánico rico en (Z)-2,6- dimetillocta-5 , 7-diene-2, 3-diol que está contenido en dicha parte orgánica. En una realización preferida, la composición nematicida comprende además al menos otro componente activo diferente al residuo acuoso o hidrolato. En otra realización todavía más preferida, la composición nematicida consiste exclusivamente en uno de estos tres componentes mencionados: residuo acuoso, su parte orgánica o el componente activo nematicida que contiene dicha parte orgánica.

La composición nematicida comprende una cantidad de residuo acuoso o hidrolato, o de extracto orgánico de dicho hidrolato suficiente para causar la mortalidad del 90% de un inoculo de juveniles infectivos, cantidad que equivale a la dosis efectiva de acción nematicida del hidrolato, de su extracto orgánico o del componente activo nematicida que ésta contiene. Dicha dosis efectiva del hidrolato es del 50%. La dosis efectiva del extracto orgánico obtenido del hidrolato es de 0,5 yg/μΐ, siendo necesario por tanto extraer 0,5 μΐ de hidrolato para obtener la dosis efectiva de extracto orgánico (0,5 yg) .

Como se ha dicho, en otra realización preferida, la composición nematicida natural consiste concretamente en el residuo acuoso o hidrolato, o en el componente orgánico extraído del hidrolato o en el componente activo extraído de dicho componente o parte orgánica del residuo. Cualquiera de estos tres componentes de la composición nematicida se encuentra diluido en un 50%.

Las formulaciones fungicida y nematicida contra fitopatógenos pueden presentarse en forma de disolución acuosa, en polvo, en emulsión concentrada o en microcápsulas , entre otras formas de presentación y comercialización conocidas para este tipo de productos en agricultura.

El uso de la formulación fungicida que comprende el aceite esencial para controlar y/o eliminar hongos fitopatógenos en un cultivo puede realizarse preferentemente pulverizando dicha formulación sobre las plantas del cultivo. Debe entenderse de la presente memoria que dicho uso corresponde a un método para controlar y/o eliminar hongos fitopatógenos en un cultivo que comprende pulverizar la formulación fungicida sobre las plantas del cultivo.

Del mismo modo, el uso de la formulación nematicida, esté compuesta sólo del residuo acuoso, del extracto orgánico obtenido del hidrolato o del componente activo nematicida, incluyendo o no otros componentes adicionales, para controlar nematodos fitopatógenos en un cultivo, puede realizarse preferentemente aplicando dicha formulación, al suelo. Debe entenderse también de la presente memoria que dicho uso corresponde a un método para controlar nemátodos fitopatógenos en un cultivo que comprende aplicar la formulación nematicida sobre el suelo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS

Figura 1. Diagrama de bloques simplificado de una realización práctica preferencial de las fases del procedimiento de extracción de derivados de la planta Artemisia absinthium L.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

A continuación se ilustra la invención mediante un ejemplo de realización preferido del procedimiento de obtención de extractos orgánicos de acuerdo a la descripción dada en esta memoria, asi como de ensayos de actividad biológica que se han llevado a cabo para determinar la actividad fungicida y nematicida de los aceites y sus residuos acuosos, respectivamente, de ajenjo cultivado experimentalmente y obtenidos en tres años de cosecha (2008, 2009 y 2010) .

Ejemplo 1. Obtención de aceite esencial de la planta Artemisia absinthum L. con variedad Candial.

El procedimiento de extracción comprende básicamente, como se muestra en la Figura 1 anexa, tres fases diferenciadas:

una fase de metodología de producción de dicha planta (1), una fase de extracción de extractos orgánicos (2) en la que se obtiene dicho aceite esencial y un extracto no volátil (3) , además de los residuos acuosos o hidrolatos que se retiran del procedimiento, y

una fase de extracción (4) de extractos supercríticos (5) con CO2 (22) de composición química definida.

La fase de metodología de producción (1) comprende el cultivo (6) en campo del quimiotipo seleccionado de la planta en cuestión, mediante multiplicación preferentemente realiza mediante esquejes o semillas en vivero-semillero (7) para su posterior plantación en el terreno de asiento. Este terreno de asiento está ubicado en zonas altas con pluviometría superior a los 400-450 mm anuales, y se trabaja mediante cultivo mecanizado. El cultivo entra en producción en el primer año de su plantación, debiendo proceder a la recolecta (8) de las hojas y sumidades floridas cuando las plantas se encuentran en estadio fenológico de plena floración, debiendo posteriormente proceder al secado (9) y posterior molido (10) de la biomasa recolectada (11) . El secado 89) se realiza a la sombra, bajo corriente de aire y durante un periodo de 8 días aproximadamente .

La fase de extracción de los extractos orgánicos (2) se realiza mediante hidrodestilación y extracción orgánica (12) del material recolectado (11), obteniéndose así el aceite esencial y un extracto no volátil (3) , además de un subproducto acuoso o hidrolato, que es un residuo del proceso. La hidrodestilación se realiza utilizando un aparato de tipo Clevenger y la extracción orgánica en un aparato Sohxlet. En el vaso de destilación se introduce una cantidad de biomasa de 800 kg. en cada destilación realizada, cada proceso de destilación con una duración de una hora y media. De esta proceso se obtienen los aceites esenciales, y también el hidrolato. El caudal de refrigeración del dispositivo está comprendido entre 150-200 litros, equivalente a la cantidad de hidrolatos que se genera en cada destilación. Esta cantidad varia en función de la temperatura ambiente.

La fase de extracción (4) de extractos supercríticos (5) con CO2 (22) de composición química determinada se realiza utilizando una bomba de compresión (13) con un filtro (14), un cilindro de extracción (15), dos colectores (16, 17), un dispositivo de refrigeración cilindrica (18), un intercambiador de calor (19), un sensor de presión (20) y un medidor de flujo (21) . Para ello, el material recolectado (11) se introduce en el cilindro de extracción (15) y es embebido simétricamente con materiales porosos inertes que permiten un flujo homogéneo de CO2 (22), a continuación se calienta hasta que se alcanza una temperatura de 40°C, para a continuación comprimir la bomba (13) y el CO2 (22) hasta conseguir una presión de 90 bar, momento en el que el fluido supercrítico a la presión de trabajo llena el cilindro de extracción (15), regulándose en los dos colectores la presión (16, 17), mediante las oportunas válvulas, y la temperatura mediante el dispositivo de refrigeración (18), de tal forma que el primero de los colectores (16) sirve para eliminar compuestos pesados, como ceras, y el segundo colector (17) para la recogida del aceite esencial obtenido como extracto supercrítico (5) .

El valor medio de tamaño de partícula del tamaño recolectado utilizado es de 0,5 mm, y el flujo de gas a través del cilindro extractor a 25°C y 1 atm. es 10,5 1/min. Mediante un análisis de cromatografía de gases masa (GC- MS) de los aceites esenciales resultantes de los tres años de cosecha, se obtuvo la composición química de la Tabla 1 para cada una de las dos poblaciones de Artemisia variedad Candial analizadas .

A continuación se adjuntan las Tablas 2 y 3 con el rendimiento anual de biomasa y aceite esencial por población y año de A. absinthium . Tabla 2. Rendimiento anual de los cultivos por población de A. absinthium (años 2008-2010) (Kg. de biomasa por hectárea de

suelo cultivado)

Año Teruel (Kg/Ha) Sierra

Nevada

(Kg/Ha)

2008 21494 18104

2009 23530 20612

2010 21355 18717

Tabla 3. Rendimiento de aceite esencial (porcentaje del peso

verde de la planta)

Año Teruel Sierra Nevada

2008 0, 174% 0,169%

2009 0, 135% 0,101%

2010 0, 172% 0, 114%

Ej emplo 2. Estudio de la actividad fungicida del aceite esencial frente a hongos fitopatógenos : Fusarium oxysporum, F. moniliforme, F. solani y Botrytys cinenerea.

Se han utilizado los métodos normalizados para este tipo de ensayos: dilución en agar (Murabayashi, 1991) y autografía en TCL (Rahalison et al, 1993) . Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del crecimiento y/o esporulación, contrastándolos respecto al control mediante técnicas estadísticas no paramétricas . Para calcular el nivel de actividad de cada uno de los productos se han ensayado distintas concentraciones, que se muestran en la Tabla 4, lo que permite calcular las dosis efectivas de inhibición de crecimiento. Los resultados obtenidos y las dosis ensayadas se muestran en la Tabla 4.

Se demuestra que los aceites esenciales obtenidos de la Artemisia, variedad Candial, son muy activos frente a Fusarium spp . y Alternaría alternata (con dosis efectivas EC50 promedio de 0.4 mg/ml) y se destaca que su efecto es del orden de 10 veces mayor sobre B. cinérea.

Tabla 4: actividad antifúngica de los aceites de ajenjo, variedad Candial cosechas 2008-2010 (para 2008-2009 se incluye el valor de EC5p (ul/ml)

Concentra Fusari um F. B. Alternaría

∑ .

Muestra ción monilifo oxysporu cinérea alternata solani

(%) rme m

100.00±0 100.00±0 100.00±0 100.00±0. 100.00±0.0

AVAaT 1 n n n1 .00 .00 .00 00 0

1.U U.U1

2008 0.35(0.1 0.47(0.7 0.37(0.5 0.009(0- 0.14

3-0.56) 1-1.28) 4-1.45) 0.019) (0.07-0.2)

100.00±0 , 100.00±0.0

100.00±0 100.00±0 100.00±0

00 0

AVAaSN .00 .00 .00

1.0-0.01 0.01 (0- 0.19 2008 0.32(0.0 0.32(0.0 0.39(0.1

0.39) (0.11- 04-0.64) 22-0.61) 4-0.63)

0.26)

100.00±0 100.00±0 100.00±0 100.00±0 , 100.00±0.0

AVAaT .00 .00 .00 00 0

1.0-0.01

2009 0.38(0.0 0.45(0.1 0.36(0.0 0.067(0- 0.02 (0 - 62-0.69) 7-0.72) 96-0.62) 0.31) 2.9)

100.00±0 100.00±0 100.00±0 100.00±0 , 100.00±0.0

AVAaSN .00 .00 .00 00 0

1.0-0.01

2009 0.39(0.0 0.36(0.0 0.35(0.1 0.016(0- 0.19 (0.11

8-0.69) 65-0.65) 3-0.56) 0.048) - 0.26)

100±0 91.97±1. 93.04±1 88.73±1.1 100.00±0.0

AVAaT 0.35 (0- 0 39 0 0

1.0-0.01

2010 3.21) 0.39 (0- 0.6 (0 0.027 (0.0 0.07 (0.03

2.25) 1.46) 21-0.032) - 0.1)

94.16±0 .01±0. 88.77±1. 91.96±1.0 100.00±0.0

AVAaSN 8 90 56 3 0

1.0-0.01

2010 (NC*) .06 (0 0.08 (0- 0.026(0- 0.2 (0.13

4.28) 4.9) 0.39) - 0.26)

T: Población Teruel

NS : Población Sierra Nevada (NC*): no se ha calculado la EC5o.

Ejemplo 3. Actividad nematicida frente a nematodos formadores de nodulos: Meloidogyne javanica.

Los ensayos se han realizado según la metodología descrita para Meloidogyne sp (Hernández-Carlos et al. 2011, Sosa et al. 2012) utilizando en los ensayos la fase biológica de juveniles infectivos (J2) de Meloidogyne javanica. Se ha cuantificado la actividad de cada producto a distintas concentraciones, mostradas en la Tabla 5, en al menos cuatro réplicas Cada bioensayo se ha repetido al menos tres veces y la actividad nematostática/nematicida se ha determinado a partir del porcentaje de juveniles infectivos inmovilizados/muertos .

Los resultados obtenidos y las concentraciones ensayadas se muestran en la Tabla 5. A partir de ellos se demuestra que todos los hidrolatos tienen una actividad máxima al la concentración más elevada que se mantiene para la mayoría de ellos a una dilución del 50%.

Tabla 5. Actividad nematicida de los aceites de ajenjo,

cosechas 2008-2010

Muestra Concentración M. javanica

(%) % J2

inmovilizados

Promedio

AQAaT 100 100

2008 50 100

25 6.36

10 1.21

AQAaSN 100 100

2008 50 100

25 4.30

10 0.22

AQAaT 100 100

2009 50 100

25 6.25

10 0 AQAaSN 100 100

2009 50 100

25 6.15

10 0

AQAaT 50 100

2010 50 100

33 20.39

25 18.53

AQAaSN 100 100

2010 50 58.57

33 5.86

25 3.75

Extracto 1 yg/μΐ 91.3 orgánico AQ

(SN+T)

(Z) -2, 6- 0 , 5 yg/μΐ 100 dimetillocta- 0,25 yg/μΐ 43.9

5, 7-diene- 0,1 yg/μΐ 19.7

2 , 3-diol 0,02 yg/μΐ 4.2

T: Población Teruel

NS : Población Sierra Nevada

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un aceite esencial y/o de un extracto supercritico extraídos de la planta Artemisia absinthium L.r variedad Candial procedente de Teruel y/o de Sierra Nevada, mediante un procedimiento que comprende: una fase de metodología de producción de dicha planta, una fase de extracción de extractos orgánicos en la que se obtiene dicho aceite esencial y un extracto no volátil, y una fase de extracción con CO2 de extractos supercríticos como fungicida frente a hongos fitopatógenos .
2. Uso según la reivindicación 1, donde el aceite esencial contiene epoxiocimeno en un porcentaje comprendido entre 26% y 44% del total de la composición; crisantenol en un porcentaje comprendido entre 12% y 30% del total de la composición y (Z) -2, 6-dimetillocta-5, 7-diene-2, 3-diol en un porcentaje comprendido entre 0,001% y 20% del total de la composición .
3 Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, como fungicida frente a los hongos fitopatógenos Alternaría alternata, Fusarium oxysporum, F. moniliforme, F. solani y Botrytys cinnerea.
4. Composición natural fungicida frente a hongos fitopatógenos caracterizada por que comprende el aceite esencial y/o el extracto supercritico extraído de la planta Artemisia absinthium L.r variedad Candial procedente de Teruel y/o de Sierra Nevada según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como componente activo .
5. Composición natural fungicida según la reivindicación 4, que comprende al menos un excipiente y al menos un adyuvante de los que se emplean en agricultura.
6. Composición natural fungicida según una cualquiera de las reivindicaciones 4 6 5, que comprende al menos otro componente activo frente a hongos fitopatógenos .
7. Composición natural fungicida según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende una cantidad de dicho aceite esencial y/o del extracto supercritico suficiente para alcanzar el 50% de inhibición de crecimiento del hongo.
8. Método para controlar y/o eliminar hongos fitopatógenos en un cultivo, caracterizado por que comprende pulverizar la composición natural fungicida definida en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 sobre las plantas del cultivo„
9. Residuo acuoso generado en un procedimiento de extracción de aceite esencial y de un extracto supercritico de la planta Artemisia absinthium L.r variedad Candial procedente de Teruel y/o de Sierra Nevada, que comprende: una fase de metodología de producción de dicha planta, una fase de extracción de extractos orgánicos en la que se obtiene dicho aceite esencial y un extracto no volátil, y una fase de extracción con CO2 de extractos supercríticos ; dicho residuo acuoso generándose en la fase de obtención del aceite esencial y comprendiendo en su formulación un componente orgánico que contiene a su vez (Z)-2,6- dimetillocta-5 , 7-diene-2, 3-diol como compuesto orgánico activo frente a los nemátodos.
10. Uso del residuo acuoso descrito en la reivindicación anterior como nematicida frente a nemátodos fitopatógenos ,
11. Uso del componente orgánico contenido en el residuo acuoso descrito en la reivindicación 9, como nematicida frente a nemátodos fitopatógenos .
12. Uso del compuesto orgánico activo contenido en el componente orgánico del residuo acuoso descrito en la reivindicación 9, como nematicida frente a nemátodos fitopatógenos .
13. Método de extracción en fase sólida del componente orgánico contenido en el residuo acuoso descrito en la reivindicación 9, que comprende las siguientes etapas:
a) decantar el residuo acuoso para eliminar restos de aceite esencial;
b) mezclar en agitación la fase acuosa anterior con carbono activado en una proporción de 10:1, hasta que se produzca la adsorción del componente orgánico del residuo acuoso; y
c) secar el carbono a 35°C, para obtener un carbón activado con el componente orgánico adsorbido.
14. Carbón activado obtenible mediante el método descrito en la reivindicación anterior, que comprende el componente orgánico extraído del residuo acuoso.
15. Cartucho de filtración fabricado a partir del carbón activado descrito en la reivindicación anterior.
16. Uso del carbón activado definido en la reivindicación 14 o del cartucho de filtración definido en la reivindicación 15 como nematicida frente a nematodos fitopatógenos .
17. Método de extracción según la reivindicación 12, que comprende además la obtención mediante extracción con CO2 supercrítico del componente activo orgánico adsorbido en el carbono activado para obtener un extracto orgánico enriquecido en el compuesto activo.
18. Extracto orgánico enriquecido en el compuesto activo nematicida obtenible mediante el método descrito en la reivindicación anterior.
19. Uso del extracto orgánico descrito en la reivindicación anterior, como nematicida frente a nematodos fitopatógenos .
20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11, 12, 16 y 19 como nematicida frente a los nemátodos fitopatógenos formadores de nodulos.
21. Uso según la reivindicación anterior, frente a Meloidogyne sp .
22. Composición natural nematicida frente a nemátodos fitopatógenos caracterizada por que comprende al menos el residuo acuoso descrito en la reivindicación 9, su componente orgánico o su compuesto activo frente a nemátodos .
23. Composición natural nematicida según la reivindicación 21, que comprende al menos un excipiente y al menos un adyuvante de los que se emplean en agricultura.
24. Composición natural nematicida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, que comprende al menos otro componente activo frente a nemátodos fitopatógenos .
25. Composición natural nematicida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, que comprende una cantidad de dicho residuo acuoso o de la parte orgánica extraída de dicho residuo suficiente para causal la mortalidad del 90% de un inoculo de juveniles infectivos del nemátodo.
26. Composición natural nematicida según la reivindicación 21, que consiste en el residuo acuoso, su componente orgánico o su compuesto activo fente a nematodos, estando éste diluido en al menos un 50%.
27. Método para controlar y/o eliminar nemátodos fitopatógenos en un cultivo, caracterizado por que comprende aplicar la composición natural nematicida definida en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 sobre el suelo.
28. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 10, 11, 12, 16, 19, 20 y 21 en agricultura ecológica.
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