WO2013103053A1 - 体内時計を指標にした低品質ES細胞およびiPS細胞の簡易判別法の開発、体内時計を指標にした細胞評価法の開発 - Google Patents

体内時計を指標にした低品質ES細胞およびiPS細胞の簡易判別法の開発、体内時計を指標にした細胞評価法の開発 Download PDF

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和弘 八木田
康浩 梅村
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for evaluating pluripotent stem cells using a biological clock as an index.
  • Non-Patent Document 1 discloses that ES cells and iPS cells do not have a biological clock, and a biological clock is formed by inducing differentiation in a test tube. However, there is no data on quality evaluation of ES cells and iPS cells. .
  • An object of the present invention is to provide a method and kit for evaluating pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells eg, ES cells
  • oncogenes e.g, oncogenes
  • the body clock was not formed.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells used in regenerative medicine
  • at least cells that do not have the body clock included in the somatic cells are formed. I thought it could be excluded, and worked to establish that method.
  • the present inventor has developed a method for simply and quantitatively evaluating the quality of pluripotent stem cells including iPS cells and ES cells, using the internal clock that somatic cells have as an index. .
  • the present invention provides the following evaluation methods and kits.
  • Item 1. A method for evaluating pluripotent stem cells, comprising analyzing the expression of clock genes in cells differentiated from pluripotent stem cells and evaluating the pluripotent stem cells based on the degree of expression.
  • Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the clock gene is Per2 and / or Bmal1 and / or Dbp.
  • Item 3. Item 2. The method according to Item 1, wherein the pluripotent stem cell is an ES cell or an iPS cell.
  • Item 4. Item 2.
  • a gene construct comprising a reporter gene linked to a clock gene promoter is introduced into the pluripotent stem cell to be evaluated, and the expression pattern of the clock gene is analyzed based on the expression of the reporter gene.
  • Item 5. The method according to Item 4, wherein the reporter gene is a fluorescent protein gene, a luciferase gene, a ⁇ -galactosidase gene, or a chloramphenicol acetyltransferase gene.
  • Item 6. A kit for evaluating pluripotent stem cells, comprising a gene construct comprising a reporter gene linked to a promoter of a clock gene.
  • Item 7. The kit according to Item 6, wherein the clock gene is Per2 and / or Bmal1 and / or Dbp.
  • Item 8. Item 7. The kit according to Item 6, wherein the pluripotent stem cell is an ES cell or iPS cell.
  • pluripotent stem cells having an abnormal expression such as an oncogene can be excluded from normal pluripotent stem cells because they do not normally form a circadian clock when differentiated. It is now possible to select and use pluripotent stem cells without worry. Various studies have been conducted using pluripotent stem cells, and it is expected that more appropriate studies will be conducted by selecting pluripotent stem cells that are not likely to become cancerous according to the present invention.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells used in regenerative medicine
  • at least cells that do not have a biological clock provided by somatic cells are formed.
  • a method for easily and quantitatively evaluating the quality of pluripotent stem cells including iPS cells and ES cells has been established.
  • FIG. 1 shows the oscillation of the circadian clock that appears when normal mouse ES cells (model of high-quality iPS cells) are induced to differentiate by the method of the present invention.
  • FIG. 2 shows the oscillation of the biological clock and the fast Fourier that appear when differentiation of ES cells (model of low quality ES cells / iPS cells) ⁇ ⁇ ⁇ with very weak expression characteristics of the oncogene c-Myc is induced by the method of the present invention. The frequency analysis by development is shown.
  • FIG. 3 shows quantitative evaluation of the ability to form a biological clock by differentiation induction culture of normal ES cells.
  • FIG. 4 shows the bioluminescence intensity before differentiation of human iPS cells (hiPS) and 4 weeks after induction of in vitro differentiation. The formation of circadian clock is reproduced by differentiation induction.
  • clock genes include Clock, Bmal1, Period (Per1, Per2, Per3), Cryptochrome (Cry1, Cry2), and Albamin D-boxbinding protein (Dbp).
  • Preferred clock genes are Bmal1, Per2, and Dbp.
  • the expression of at least one clock gene can be analyzed.
  • “analyzing expression” includes measuring the expression level of a clock gene. Measurement of the expression level of the clock gene can be carried out, for example, by measuring the expression level of a reporter gene operably linked to the promoter of the clock gene.
  • a pluripotent stem cell refers to a cell that can be differentiated into at least two types of cells, and the clock gene is stopped or almost stopped.
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells and iPS cells. However, any cell that can differentiate into at least two types of cells and whose clock gene is stopped or almost stopped is used in the present invention. Included in pluripotent stem cells to be evaluated. So-called adult stem cells are not included in the pluripotent stem cells of the present invention because the clock gene functions. Cells that are undergoing direct reprogramming may have their clock genes stopped or almost stopped, such as when the developmental lineage (endoderm, mesoderm, ectoderm) changes to a cell with significantly different properties. For example, it can be included in the pluripotent stem cells to be evaluated of the present invention.
  • pluripotent stem cells includes mammals, such as humans, monkeys, chimpanzees, mice, rats, rabbits, goats, dogs, cats, cows, horses, and pigs.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells used in the present invention exist as a cell population. Since such a cell population has a homogeneous property (quality), the whole pluripotent stem cell can be evaluated by evaluating a part of the cell population by the method of the present invention.
  • the expression of the clock gene may be measured by Northern blotting for mRNA expression, or may be measured by a method using an antibody such as Western blotting or ELISA, but preferably any one of the clock genes. It is preferable to evaluate the expression of the clock gene by linking a reporter gene downstream of the promoter and measuring the expression level of the reporter gene.
  • the reporter gene include genes such as fluorescent proteins (for example, GFP, CFP, BFP, YFP, DsRED, etc.), luciferase (fireflies, sea urchins, Renilla, etc.), ⁇ -galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, and the like.
  • luciferase is preferable.
  • the present invention introduces a gene construct in which a reporter gene is linked to a clock gene promoter into a pluripotent stem cell to be evaluated or a differentiated cell thereof, and the expression level of the reporter gene in the differentiated pluripotent stem cell It is possible to evaluate pluripotent stem cells.
  • the kit of the present invention contains this gene construct.
  • the kit may further contain at least one of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, a differentiation induction medium, a culture medium for pluripotent stem cells, and a culture container such as a petri dish.
  • ⁇ evaluating '' a pluripotent stem cell means evaluating the ability (potential) of a pluripotent stem cell to differentiate into a target cell without differentiating into a non-target cell such as a cancer cell. means.
  • pluripotent stem cells When 12% of pluripotent stem cells express a clock gene after about 4 weeks of differentiation, pluripotent stem cells are unlikely to become functional cells after differentiation induction (low evaluation) ). The higher the ratio of the expression of the clock gene in the cells differentiated from the pluripotent stem cells, the higher the evaluation of the original pluripotent stem cells.
  • iPS cells in which the circadian clock is impaired after differentiation, may cause various disorders including canceration when differentiated and transplanted into mammals including humans.
  • pluripotent stem cells are cultured in a suitable medium in a petri dish or the like and then cultured in a differentiation induction medium for several weeks. Cultivation is preferably carried out for 3 weeks or more, preferably about 3 to 5 weeks, particularly about 4 weeks, and the expression of the clock gene is evaluated. If the culture period after differentiation induction is 5-6 weeks or longer, the cells gradually weaken and the expression of clock genes decreases, so it is not preferable that the culture period after differentiation induction is too long.
  • the culture period is preferably less than 5 weeks.
  • the cells become confluent when the culture period after differentiation induction is about 3 to 4 weeks. Culture after differentiation induction can be performed while exchanging the medium.
  • the frequency of medium replacement is, for example, about once every two days, but is not limited thereto, and medium replacement can be performed once a day or in other periods.
  • a fluorescent protein such as GFP
  • light may be detected by irradiating light to cells differentiated from pluripotent stem cells.
  • luciferase When luciferase is used, luciferin is used. The amount of luminescence may be measured with luciferase. Even when other reporter genes are used, the expression of the clock gene can be evaluated by an appropriate method for evaluating the reporter gene product in accordance with the reporter gene.
  • the reproducibility of the circadian clock formation experiment in the differentiation-inducing culture protocol according to the present invention is 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • Sexual stem cells can be evaluated with good reproducibility.
  • ES cells incorporating a reporter gene (luciferase gene) for monitoring the expression of clock genes (Per2, Bmal1) are used as high-quality pluripotent stem cells, and clock genes (Per2, Bmal1)
  • clock genes Per2, Bmal1
  • c-Myc gene-introduced ES cells that show about 1.3 to 4 times the expression level of endogenous c-Myc gene in wild-type ES cells are used. It was. Of these, low-quality ES cells, whose c-Myc expression level is approximately 1.3 times that of wild-type ES cells, are measured by c-Myc gene expression levels by quantitative PCR, which is commonly used for cell quality evaluation.
  • the present invention is characterized in that quality evaluation of pluripotent stem cells that cannot be discriminated by the conventional method can be realized.
  • Example 1 Embryoid Body Formation Mouse ES cells from which feeder cells have been removed are diluted to 2 ⁇ 10 4 cells / mL in a fibroblast medium, and seeded at 100 ⁇ L each in a low adhesion round bottom 96-well plate. Incubate for 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • (2) differentiation culture of Embryoid Body Embryoid bodies prepared by hanging drop culture are transferred to a 24-well plate and cultured in fibroblast medium for 25 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . There will be no passage during this time.
  • medium exchange is performed once every two days, while changing the intervals appropriately so as not to be at regular intervals.
  • the circadian clock is measured 25 days after the differentiation induction medium.
  • the composition of the fibroblast medium is shown below.
  • DMEM Nakarai Tesque
  • FBS 1 mM sodium pyruvate
  • GabcoBRL 1 mM sodium pyruvate
  • Gabco BRL 0.1 mM MEM non-essential amino acid
  • 2-mercaptoethanol Sigma
  • 50 units / mL penicillin-streptomycin 50 units / mL penicillin-streptomycin (Nakarai Tesque )
  • the low-quality mouse ES cells and high-quality mouse ES cells used were each introduced with a gene construct (reporter vector) in which a firefly luciferase gene was linked after the promoter of the clock gene (Per2, Bmal1) into the mouse ES cells.
  • the reporter vector used was one produced by the present inventors according to a conventional method, and the luciferase gene used was a gene excised from a vector sold by Clontech (Clontech).
  • ES cells wild-type high-quality mouse ES cells and low-quality mouse ES cells were used, respectively.
  • high-quality ES cells and low-quality ES cells those described above were used.
  • FIG. 1 shows raw data (for 20 times) of an experiment in which measurement was actually performed.
  • FIG. 2 shows an ES cell in which the oncogene c-Myc used for iPS cell production, known as Yamanaka 4 factor, is weakly and continuously expressed as a model of low-quality iPS cells.
  • Fig. 6 shows data showing the formation of a circadian clock when differentiation-induced culture is performed by this method. Unlike the case of wild-type ES cells, which was a model of high-quality iPS cells, the formation of a circadian clock was observed only in about 12% (shown in red tone in FIG. 2).
  • a fast Fourier expansion (FFT) analysis method is used to evaluate the strength of vibration at a frequency of about 24 hours.
  • FFT fast Fourier expansion

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Abstract

　本発明は、多能性幹細胞を評価する方法であって、多能性幹細胞から分化した細胞の時計遺伝子の発現を解析し、その発現の程度により多能性幹細胞を評価する方法を提供する。

Description

体内時計を指標にした低品質ES細胞およびiPS細胞の簡易判別法の開発、体内時計を指標にした細胞評価法の開発
　本発明は、体内時計を指標にした多能性幹細胞の評価法及びキットに関する。
　ES細胞やiPS細胞を用いた再生医療を行う上でもっとも大きな問題は、発がんを始めとする移植細胞由来の疾患の発症である。この最大の原因は未分化な細胞の混入だと言われているが、これ以外にも，用いるES細胞やiPS細胞が低品質であることによる問題も指摘されている。このように細胞移植による再生医療の実現において、ES細胞およびiPS細胞の品質管理は非常に重要であり、現在内外の研究者が様々な方法を開発し、特にiPS細胞の品質評価基準を策定しようと努力している。
　非特許文献１は、ES細胞およびiPS細胞には体内時計がなく、試験管内で分化誘導することで体内時計が形成されることを開示するが、ES細胞やiPS細胞の品質評価に関するデータはない。
K. yagita et al. Proc. Natl. AcadSci. USA. 2010 February 23; 107(8) 3846-3851.
　本発明は、多能性幹細胞の評価法及びキットを提供することを目的とする。
　地球上のほとんどの生物には、１日の時刻を知るための約２４時間周期の体内時計（概日時計）が備わっている。哺乳類では、ほぼ全身の細胞に体内時計があり、細胞機能の制御に関わっている。本発明者はこれまでの研究で、ES細胞およびiPS細胞など多能性幹細胞（いわゆる万能細胞）には体内時計がない、およびこれらを分化させると体内時計が形成されることを発見した。
　この発見をもとに、体内時計が細胞分化の過程で形成されるメカニズムを研究していたところ、癌遺伝子などの発現異常がある多能性幹細胞(例えばＥＳ細胞)では、分化させても正常に体内時計が形成されないことを見出した。この性質を利用し、再生医療に用いるiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞の細胞分化による体内時計形成能を調べることにより、少なくとも体細胞が備えている体内時計が形成されないような細胞を除外することができると考え、その方法の確立に取り組んだ。
　今回、本発明者は、体細胞が内在性に有している体内時計を指標にして、iPS細胞およびES細胞を含む多能性幹細胞の品質を簡便にかつ定量的に評価する方法を開発した。
　本発明は、以下の評価方法及びキットを提供するものである。
項１．　多能性幹細胞を評価する方法であって、多能性幹細胞から分化した細胞の時計遺伝子の発現を解析し、その発現の程度により多能性幹細胞を評価する方法。
項２．　時計遺伝子がPer2及び／又はBmal1及び／又はDbpである、項1に記載の方法。
項３．　多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、項1に記載の方法。
項４．　評価対象の多能性幹細胞に時計遺伝子のプロモータと連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を導入し、レポーター遺伝子の発現に基づき時計遺伝子の発現パターンを解析することを特徴とする、項1に記載の方法。
項５．　レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、項４に記載の方法。
項６．　時計遺伝子のプロモータと連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を備えた、多能性幹細胞を評価するためのキット。
項７．　時計遺伝子がPer2及び／又はBmal1及び／又はDbpである、項６に記載のキット。
項８．　多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、項６に記載のキット。
項９．　レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、項６に記載のキット。
　本発明によれば、癌遺伝子などの発現異常がある多能性幹細胞は、分化させたときに正常に体内時計が形成されないことで、正常な多能性幹細胞から除外することができ、癌化などの心配のない多能性幹細胞を早期に選抜し、使用できるようになった。多能性幹細胞を用いて様々な研究が行われているが、癌化のおそれのない多能性幹細胞を本発明により選抜することで、より適切な研究が行われると期待される。
　本発明によれば、再生医療に用いるiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞の細胞分化による体内時計形成能を調べることにより、少なくとも体細胞が備えている体内時計が形成されないような細胞を除外することができ、iPS細胞およびES細胞を含む多能性幹細胞の品質を簡便にかつ定量的に評価する方法が確立された。
図１は、正常マウスＥＳ細胞(高品質ｉＰＳ細胞のモデル)を本発明の方法で分化誘導したときに出現する体内時計の振動を示す。 図２は、がん遺伝子c-Mycのごく弱い発現特徴があるES細胞(低品質ES細胞/iPS細胞のモデル) を本発明の方法で分化誘導したときに出現する体内時計の振動及び高速フーリエ展開による周波数解析を示す。 図３は、正常ES細胞の分化誘導培養による体内時計形成能の定量的評価を示す。（Ａ）分化誘導のDay7、Day14、Day21、Day28及びDay35の相対生物発光強度。（B）Day7、Day14、Day21、Day28及びDay35のRelative power。Relative powerが高値なほど明瞭な体内時計の振動があることを示す。 図４は、ヒトiPS細胞(hiPS)の分化前及びin vitro分化誘導４週間後の生物発光強度を示す。分化誘導で概日時計の形成が再現される。
　本明細書において、時計遺伝子としては、Clock, Bmal1, Period (Per1, Per2, Per3), Cryptochrome(Cry1, Cry2)、Albmin D-boxbinding protein (Dbp)などが挙げられる。好ましい時計遺伝子は、Bmal1, Per2, Dbpである。
　本発明の方法では、少なくとも1種の時計遺伝子の発現を解析することができる。ここで、「発現を解析」するとは、時計遺伝子の発現量を測定することが挙げられる。時計遺伝子の発現量の測定は、例えば時計遺伝子のプロモータに発現可能に連結したレポーター遺伝子の発現量を測定することで、実行できる。
　多能性幹細胞は、少なくとも2種の細胞に分化可能であり、かつ、時計遺伝子が停止あるいはほとんど停止している細胞を指す。好ましい多能性幹細胞はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞であるが、これら以外にも少なくとも2種の細胞に分化可能であり、かつ、時計遺伝子が停止あるいはほとんど停止している細胞であれば、本発明で評価対象になる多能性幹細胞に包含される。いわゆる成体幹細胞は、時計遺伝子が機能しているので、本発明の多能性幹細胞には含まれない。ダイレクトリプログラミングの途中の細胞は、発生の系統(内胚葉、中胚葉、外胚葉)が変わる場合のように性質の大きく異なる細胞に変化する場合などは、時計遺伝子が停止あるいはほとんど停止していれば、本発明の評価対象の多能性幹細胞に含まれ得る。
　多能性幹細胞の由来は、哺乳動物が挙げられ、例えばヒト、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられる。
　本発明で使用するES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞は、細胞集団として存在する。このような細胞集団は均質な性質(品質)を有しているので、その一部を本発明の方法により評価することで、多能性幹細胞全体の評価が可能である。
　時計遺伝子の発現は、mRNAの発現をノーザンブロッティングにより測定してもよく、蛋白質の発現をウェスタンブロッティングあるいはELISAなどの抗体を用いた方法で測定してもよいが、好ましくは時計遺伝子のいずれかのプロモータの下流にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の発現量を測定することにより時計遺伝子の発現を評価するのがよい。レポーター遺伝子としては、蛍光蛋白質(例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲＥＤなど)、ルシフェラーゼ(ホタル、ウミボタル、ウミシイタケなど)、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどの遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼが好ましい。
　好ましい実施形態において、本発明は、時計遺伝子のプロモータにレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物を評価対象の多能性幹細胞あるいはその分化した細胞に導入し、分化した多能性幹細胞においてレポーター遺伝子の発現量を評価することにより、多能性幹細胞を評価することができる。
　本発明のキットは、この遺伝子構築物を含むものである。該キットには、さらにES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞、分化誘導培地、多能性幹細胞の培養培地、シャーレなどの培養容器などの少なくとも1種が含まれていてもよい。
　本明細書において、多能性幹細胞を「評価」するとは、多能性幹細胞が癌細胞などの目的以外の細胞に分化せず、目的の細胞に分化できる能力(潜在性)を評価することを意味する。多能性幹細胞を分化させた細胞の時計遺伝子の発現割合が高いほど、多能性幹細胞は目的とする細胞に分化させたときにその機能を発揮することができる。例えば、実施例で示されるように、多能性幹細胞の９２％以上、特に１００％が分化4週間程度後に時計遺伝子を発現している場合、多能性幹細胞は、分化誘導後に機能的な細胞になると高評価することができ、多能性幹細胞の１２％が分化4週間程度後に時計遺伝子を発現している場合、多能性幹細胞は、分化誘導後に機能的な細胞になり難い（低評価）と判定される。多能性幹細胞を分化させた細胞の時計遺伝子の発現の割合が高いほど、もとの多能性幹細胞は高評価となる。
　分化後に体内時計の障害が見られる低品質iPS細胞は、分化してヒトを含む哺乳動物に移植した際にがん化を含む様々な障害を生じることが懸念される。
　近年、体内時計とがんとの関連が注目されている。２００７年には、世界保健機関（WHO）が「概日リズム障害を伴う交代制勤務」が、おそらく発がん性があるとされる「Group2A」のリスク因子として認定した。がんと体内時計の研究は、現在、世界中で精力的に行われており、全てではないものの、少なくとも一部のがん細胞では体内時計が障害されていることが報告され始めている（Shou-Jen Kuoら、Virchows Arch (2009) 454: 467-474）。がん細胞で体内時計の障害が見られるという報告は、低品質iPS細胞では体内時計の形成が障害されるという、本発明の理論を支持する知見である。本発明により分化された細胞の体内時計に障害のないことが証明された多能性幹細胞は、癌化のリスクがなく、得られた分化細胞の機能が優れているために、分化後に生体に移植する移植材料として好適に使用される。
　本発明の方法は、多能性幹細胞をシャーレなどの容器において、適当な培地で培養後、分化誘導培地で数週間培養する。培養は3週間以上行うのがよく、好ましくは３～５週間程度、特に４週間程度培養し、時計遺伝子の発現を評価する。分化誘導後の培養期間が５～６週間またはそれ以上になると細胞が徐々に弱ってきて時計遺伝子の発現が低下してくるので、分化誘導後の培養期間が長すぎるのは好ましくない。培養期間は、５週間未満が好ましい。分化誘導後の培養期間が３～４週間程度で細胞はコンフルエントの状態になる。分化誘導後の培養は、培地を交換しながら行うことができる。培地交換の頻度は、例えば２日に１回程度が挙げられるが、これに限定されることはなく、１日１回あるいはその他の期間で培地交換を行うことができる。
　レポーター遺伝子に、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を使用した場合には、多能性幹細胞から分化した細胞に光を照射して、蛍光を検出すればよく、ルシフェラーゼを用いた場合には、ルシフェリンを使用してルシフェラーゼにより発光量を測定すればよい。他のレポーター遺伝子を用いた場合にも、レポーター遺伝子に合わせてレポーター遺伝子産物の適切な評価方法により時計遺伝子の発現を評価することができる。
　本発明による分化誘導培養プロトコルにおける体内時計の形成実験の再現性は８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上あるいは１００％であり、低品質と高品質の多能性幹細胞を再現性良く評価することができる。
　実施例では、高品質多能性幹細胞として、時計遺伝子(Per2、Bmal1)発現をモニターするレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を組み込んだES細胞を用い、低品質多能性幹細胞として、時計遺伝子(Per2、Bmal1) 発現をモニターするレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）に加え、野生型ES細胞における内在性c-Myc遺伝子発現量の約1.3倍から約4倍の発現量を示すc-Myc遺伝子導入ES細胞を用いた。このうち、c-Myc発現量が野生型ES細胞に比べ約1.3倍の発現量を示す低品質ES細胞は、細胞品質評価に一般的に用いられる定量PCR法によるc-Myc遺伝子発現量測定では野生型と統計学的な有意差はなく、遺伝子発現解析によるスクリーニング検査では野生型ES細胞と選別不可能であった。本発明の方法によれば、上述の癌遺伝子c-Mycの発現が微量に残存し，発がんリスクが高いES細胞を用いた低品質ES細胞の判別試験を繰り返し行った結果、全ての試験で低品質ES細胞を判別することができた。
　本発明の評価方法によれば、このような従来法では選別不可能な低品質の多能性幹細胞であっても、正しく品質評価できる。このように、本発明は、従来法では判別不可能であった多能性幹細胞の品質評価を実現できる点に特徴を有する。
　以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１
(1) Embryoid Body Formation
　フィーダー細胞を除去したマウスＥＳ細胞を線維芽細胞用培地にて２×１０４細胞／ｍＬに希釈し、低接着性の丸底９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種する。４８時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養する。
(2) differentiation culture of Embryoid Body
　hanging drop cultureで作製した胚様体（Embryoid Body）を24ウェルプレートに移して、線維芽細胞用培地にて、２５日間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養する。この間、継代はしない。また、培地交換は、１日から２日に１回ずつ、一定の間隔にならないように適度に間隔を変えながら行う。分化誘導培地２５日後に体内時計を測定する。
　線維芽細胞用培地の組成を以下に示す。
[DMEM (Nakarai Tesque) / 10% FBS, 1 mM ピルビン酸ナトリウム(GibcoBRL), 0.1 mM MEM 非必須アミノ酸(Gibco BRL), 0.1 mM2-メルカプトエタノール(Sigma), 50 units/mL ペニシリン-ストレプトマイシン(Nakarai Tesque)]
　なお、使用した低品質マウスES細胞及び高品質マウスES細胞は、いずれも時計遺伝子(Per2、Bmal1)のプロモータの後ろにホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結した遺伝子構築物（レポーターベクター）をマウスES細胞に導入したものである。レポーターベクターは、本発明者が常法に従い製造したものを用い、ルシフェラーゼ遺伝子はClontech（クロンテック社）で販売しているベクターから切り出した遺伝子を使用した。
　ES細胞としては、野生型の高品質マウスES細胞と低品質マウスES細胞を各々用いた。これらの高品質ES細胞と低品質ES細胞は、上記に記載したものを用いた。
　野生型マウスES細胞（高品質iPS細胞のモデル）を本発明の方法で評価した結果、正常に体内時計が形成されその振動が確認された例は１００％であった。（１９６回の実験の結果）
　図１は、実際に測定を行った実験の生データ（２０回分）を示したものである。　　 
　また、図２は、低品質iPS細胞のモデルとして、山中４因子として知られるiPS細胞作製に用いられるがん遺伝子c-Mycを弱く持続発現させたES細胞を樹立し、これを図１と同様に本方法で分化誘導培養したときの体内時計形成を見たデータである。高品質iPS細胞のモデルであった、野生型ES細胞のときとは大きく異なり、約１２％程度（図２赤色トーンで示したもの）でしか体内時計の形成が認められなかった。
　また、体内時計の形成の有無を評価する定量的な方法として、高速フーリエ展開（FFT）解析法を用い、約２４時間周期の周波数での振動の強さを評価している。（図３）このように、分化誘導後の時計遺伝子の発現を調べることで、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）の品質評価ができることが明らかになった。
実施例２：
　ヒトiPS細胞の品質評価に向け、本発明者らの開発した「体内時計を指標としたin vitro細胞評価法」が実際にヒトiPS細胞でも応用できることを示すための実験を行った。京都大学iPS細胞研究所で樹立されたヒトiPS細胞を、本方法で分化誘導培養した結果、分化誘導４週間後に体内時計が正常に形成された（図４）。この結果から、本方法がヒトiPS細胞の品質評価法としても利用可能であることが強く示唆された。

Claims (9)

  1. 多能性幹細胞を評価する方法であって、多能性幹細胞から分化した細胞の時計遺伝子の発現を解析し、その発現の程度により多能性幹細胞を評価する方法。
  2. 時計遺伝子がPer2及び／又はBmal1及び／又はDbpである、請求項1に記載の方法。
  3. 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項1に記載の方法。
  4. 評価対象の多能性幹細胞に時計遺伝子のプロモータと連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を導入し、レポーター遺伝子の発現に基づき時計遺伝子の発現パターンを解析することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  5. レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項４に記載の方法。
  6. 時計遺伝子のプロモータと連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を備えた、多能性幹細胞を評価するためのキット。
  7. 時計遺伝子がPer2及び／又はBmal1及び／又はDbpである、請求項６に記載のキット。
  8. 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項６に記載のキット。
  9. レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項６に記載のキット。
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