WO2013072545A1 - Nanoparticulas mixtas de liberación controlada de principios activos - Google Patents

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WO2013072545A1
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nanoparticle
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José Luis ARIAS MEDIANO
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Mª Adolfina RUIZ MARTÍNEZ
Eva Antonia SÁEZ FERNÁNDEZ
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Universidad de Granada
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Universidad de Granada
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention falls within the general field of nanomedicine and in particular refers to mixed nanoparticles of controlled release of active ingredients.
  • the unfavorable pharmacokinetics of antitumor agents determines the use of highly toxic doses and a rigorous treatment regimen to achieve the desired therapeutic effect; ii) the extensive biodistribution and extravasation of the antitumor molecule in unwanted areas determines its high toxicity; iii) the selectivity of these drugs by tumor tissue is generally very poor; iv) the susceptibility to develop resistance to anticancer cells by tumor cells; and, v) the unfavorable physicochemical properties of antitumor agents, for example, their hydrophobia, induce a low accumulation in the place of action [Arias, 2008; Durán and cois., 2008].
  • antitumor agents have been associated with colloidal systems in the treatment of cancer [Reddy, 2005; Arias, 2008]. This association aims to increase the specific accumulation of the drug in the tumor area, and increase the time of exposure of cancer cells to these active agents.
  • Other benefits of the exclusive location of chemotherapeutic agents in the target region are the improvement of their pharmacokinetic profile and the decrease in toxicity associated with the extensive biodistribution of these molecules.
  • colloidal systems can achieve adequate protection of these active ingredients in vitro (during storage) and in vivo (against biodegradation phenomena related mainly to enzyme systems), which will reduce the formation of potentially toxic degradation products [Arias , 2008; Durán and cois., 2008; Davis et al., 2008]. That is why numerous efforts are focusing on the formulation of colloids, based mainly on vesicular systems (liposomes and niosomes) or polymeric, to achieve the effective transport of any antitumor to the target area [Arias, 2008; Cho et al., 2008].
  • the present invention relates to mixed nanoparticles of prolonged release of active ingredients characterized in that the nanoparticles have an average diameter between 74-98 nm and comprise an iron oxide core, a biodegradable poly ( ⁇ -) coating. caprolactone) and at least one active substance.
  • nanoparticles of the present invention are described in detail below.
  • active ingredient and drugs are equivalent and refers to any chemical substance used in the prevention, diagnosis, treatment, mitigation and cure of a disease; to avoid the appearance of an unwanted physiological process; or to modify physiological conditions for specific purposes.
  • the nanoparticles of the present invention have an average diameter of 86 nm.
  • the iron oxide core of the nanoparticles of the present invention has an average diameter between 10-14 nm.
  • the active ingredient of the nanoparticles of the present invention is an NSAID. More particularly the NSAID is diclofenac sodium.
  • the active principle of the nanoparticles of the present invention is an antitumor. More particularly, the antitumor is selected from doxorubicin or 5'-fluorouracil.
  • the present invention relates to the use of the mixed nanoparticles of the present invention as a medicament.
  • the nanoparticles of the present invention are for the treatment of cancer.
  • the nanoparticles of the present invention are for the treatment of diseases related to inflammation, mainly in the treatment of arthritis and osteoarthritis. They can also be used for the treatment of other inflammatory processes such as pharyngitis, laryngitis, colitis, conjunctivitis, etc.
  • the present invention relates to a method for the preparation of the nanoparticles of the present invention comprising the following steps: a) synthesis of the magnetite core by co-precipitation in aqueous solution, b) interfacial arrangement of the poly ( ⁇ -caprolactone) in dichloromethane together with the magnetite nanoparticle of step a) in aqueous solution,
  • step d) of adding the drug is carried out by surface adsorption on the nanoparticles obtained after step c)
  • step d) of adding the drug is carried out by absorption in the matrix of the nanoparticles in step b)
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of the present invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of the present invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the present invention as a medicament.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for the treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for the treatment of diseases related to inflammation.
  • the present invention relates to the use of the nanoparticles of the present invention and / or the pharmaceutical composition of the present invention in hyperthermia therapy. Description of the figures
  • Figure 1 shows the HRTEM images of the magnetite (a), poly (£ -caprolactone) (b), and magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles (c). Bar length: 100 nm (a and b), and 20 nm (c).
  • Figure 2 shows FeSEM images of the magnetite (a), poly (£ -caprolactone) (b), and magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles (c). (Figure inserted: detail of the sample). Bar length: 20 nm (a), and 100 nm (b and c).
  • Figure 3 shows a HRTEM photomicrograph of the Fe 3 0 4 / PCL composite nanoparticles obtained from an initial Fe 3 0 4 : PCL mass ratio of 4: 1 (a), 2: 4 (b) and 1: 4 ( C).
  • Figure 4 shows X-ray diffractograms of magnetite particles (Fe 3 0 4 , black line), poly (£ -caprolactone) (PCL, blue line) and magnetite / poly (£ -caprolactone) (Fe 3 0 4 / PCL, magenta line).
  • Figure inserted X-ray diffraction pattern of Fe 3 0 4 . The intensity is expressed in standardized units.
  • Figure 5 shows the infrared spectrum of the particles of magnetite (Fe304, - or-), poly (£ -caprolactone) (PCL, -) and magnetite / poly (£ -caprolactone) (Fe304 / PCL, -) .
  • Figure inserted chemical structure of the PCL.
  • Figure 6 shows the hysteresis cycle of magnetite particles (Fe 3 0 4 , ⁇ ) and compounds Fe 3 0 4 / poly (£ -caprolactone) (Fe 3 0 4 / PCL, ⁇ )
  • Figure 7 visually shows the magnetic decantation of the magnetite (Fe304) and magnetite / poly (£ -caprolactone) (Fe304 / PCL) particles under the influence of a permanent 400 mT magnet, located on the side (a) or below (b) of the samples.
  • Figure 9 shows the zeta ( ⁇ ) potential of magnetite (Fe 3 0 4 , ⁇ ), poly (£ -caprolactone) (PCL, ⁇ ), and magnetite / poly (£ -caprolactone) (Fe 3 0) nanoparticles 4 / PCL, A) as a function of pH, in the presence of 10 ⁇ 3 M KN0 3 .
  • Figure 1 1 shows the histogram of the electrophoretic mobilities (tv e ) of the magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles (Fe 3 0 4 / PCL) in an aqueous solution 1 0 "3 M KN0 3 , for different ratios of initial masses Fe 3 0 4 : PCL
  • the values of u e of Fe 3 0 4 and PCL are also included.
  • Figure 13 shows the contact angles (degrees) of the liquids used in the determinations with magnetite (Fe 3 0 4 ), poly (£ -caprolactone) (PCL) and magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles (Fe 3 0 4 / PCL).
  • Figure 14 shows components of the surface free energy (mJ / m 2 ) of magnetite (Fe 3 0 4 ), poly (£ -caprolactone) (PCL) and composite magnetic nanoparticles
  • ⁇ s is the component of Lifshitz-van der Waals; ⁇ s ( ⁇ s ) is the electron-acceptor component.
  • Figure 15 shows the values of ⁇ 121 (mJ / m 2 ) and hydrophilic / hydrophobic character of the three types of nanomaterials: magnetite (Fe 3 0 4 ), poly (£ -caprolactone) (PCL) and magnetite / magnetic composite nanoparticles poly (£ -caprolactone) (Fe 3 0 4 / PCL).
  • Figure 19 shows the heating curve of an aqueous suspension of Fe 3 0 4 / PCL nanoparticles (10 mg / mL) under exposure to an alternating high frequency electromagnetic gradient (frequency and intensity: 250 kHz and 4 kA / m, respectively).
  • Example 1 Formulation of the magnetite / poly (e-caprolactone) nanoparticles
  • the synthesis method is based on the interfacial arrangement method of ⁇ ( ⁇ -caprolactone), used in the synthesis of nanoparticles of this polymer.
  • ⁇ ⁇ -caprolactone
  • the precipitation of the polymer was caused in a polymerization medium in which the iron oxide (magnetite) nuclei were found.
  • ⁇ ( ⁇ -caprolactone) coated the magnetite nuclei that were present in the aqueous medium where precipitation occurred.
  • the synthesis of magnetite nanoparticles was performed using the solution co-precipitation method [Massart, 1981]. Specifically, the synthesis methodology followed consisted of the addition, at room temperature and dropwise, to an aqueous solution of ammonia (500 mL, 0.7 M) of an aqueous solution of ferric chloride (40 mL, 1 M) and another aqueous solution of ferrous chloride (10 mL, 2M) which also contained a 2M concentration of HCI. Under these conditions, spontaneous formation of magnetite nanoparticles occurred, which were isolated by magnetic sedimentation. The last phase of this synthesis consisted of thermodynamic stabilization of magnetite nanoparticles in a 2M aqueous solution of perchloric acid for 12 hours.
  • the magnetite particles were prepared at the time of their use for the synthesis of the magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles.
  • the synthesis process of the magnetite / poly (£ -caprolactone) nanoparticles began with the addition of 10 mL of a 0.3% (w / v) solution of polymer in dichloromethane on 50 ml_ of an aqueous suspension of magnetite nanoparticles (0.3%, w / v) containing a concentration of pluronic ® F-68 of 2% (w / v). The organic phase was added to the aqueous phase under mechanical agitation (1200 rpm), which was maintained for an additional hour. Finally, the cleaning of the magnetite / poly (£ -caprolactone) composite magnetic nanoparticles was performed by magnetic sedimentation.
  • the suspension was subjected to consecutive cycles of exposure to a 400 mT magnet for 5 minutes, proceeding with the removal of the supernatant after this time, and redispersion in double-distilled water. This routine was maintained until the obtained supernatant was transparent and had a conductivity of less than 10 ⁇ / ⁇ .
  • the geometry (shape and size) of the magnetite and magnetite / poly (£ -caprolactone) particles was studied by high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM) [STEM PHILIPS CM20, The Netherlands] and by high-resolution scanning electron microscopy (FeSEM) [Zeiss DSM 950, Germany].
  • HRTEM transmission electron microscopy
  • FeSEM high-resolution scanning electron microscopy
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the average size of the magnetite particles was 12 ⁇ 2 nm ( Figure 1 a and 2a), which made us think that the nanoparticles should be superparamagnetic.
  • the average size of the pure polymer nanoparticles was 97 ⁇ 7 nm.
  • Figure 3 shows the HRTEM photomicrographs of the composite nanoparticles obtained according to all these variants of the synthesis procedure.
  • Fe 3 0 4 PCL nanoparticles with a size of 20 to 3 ⁇ were obtained, when the stirring speed varied between 500 and 2000 rpm, respectively [Hamoudeh and Fessi, 2006] , of 160 ⁇ 5 nm [Yang et al., 2006], and of 164 ⁇ 3 nm [Gang et al., 2007].
  • PCL nanoparticles that we have synthesized is really interesting in the transport of drugs to the place of action (tumor mass, inflamed tissue, etc.), since it allows to estimate a greater accumulation of the nanoparticles in the target region by minimizing recognition and withdrawal phenomena by the immune system [Jacuzzi and cois., 2009].
  • Figure 5 shows the infrared spectrum of our three types of particles (Fe 3 0 4 , PCL and Fe 3 0 4 / PCL).
  • the analysis allowed the identification of the functional groups of the polymer in the composite particles.
  • the bands were less intense due to the lower amount of polymer present in the composite particles for the same sample weight. Specifically, the bands observed were:
  • ⁇ A band due to the humidity acquired by the samples as a result of their handling process. It is located at 3388 cm "1 .
  • ⁇ B group of two bands that correspond to the stretching vibration of the CH bond of the molecule.
  • the characteristic band of the asymmetric elongation vibration of the CH 2 group (or AS CH 2 ) is located and at 2888 cm “ 1 we observe the one belonging to the symmetrical elongation vibration of the CH 2 ⁇ u / s CH 2 ).
  • ⁇ D band corresponding to the asymmetric vibration of CH 2 (or AS CH 2 ).
  • ⁇ F band belonging to the elongation vibration of the C-0 bond of the primary alcohol of the polymer (1242 cm “1 ).
  • ⁇ G group of three bands that appear at 1 150 cm “1 , 1 1 1 1 cm “ 1 and 1061 cm “1 , correspond to the elongation and flexion vibration of the C-CO-C group, and which results from the Elongation and flexion vibration of the CCC chain present in this group.
  • ⁇ I permanent oscillation vibration band of CH 2 (pCH 2 ), is observed at 840 cm 1 and is typical of a long CH 2 chain.
  • ⁇ J only missing band in the spectrum of polymer particles. It appears at 581 cm “1 and is a broad and intense band, characteristic of magnetite absorption [Lyon, 1967], corresponding to the f ⁇ trastrahl (or residual ray) frequency, of maximum absorbance of ionic (or partially ionic) crystals in the infrared [Gartstein et al., 1986].
  • the magnetic properties of the Fe 3 0 4 nuclei were characterized and the effect that the polymeric coating could have on them.
  • the magnetic characteristics of the Fe 3 0 4 / PCL particles obtained for each of the initial mass ratios were investigated.
  • the magnetic properties of magnetite and Fe 3 0 4 / PCL particles were perfectly defined by the hysteresis cycle. This macroscopic characterization of the magnetic behavior of colloidal particles was carried out with the help of a Peanut DSM-8 magnetometer-susceptibility meter (France). All measurements were performed at 25.0 ⁇ 0.5 e C, since at this temperature the preparation and storage of the suspensions was carried out.
  • Figure 6 shows the hysteresis cycle of Fe 3 0 4 nanoparticles and Fe 3 0 4 / PCL compounds.
  • pure magnetite nuclei no observed hysteresis due to their superparamagnetic character. This superparamagnetism was a consequence of the small size of Fe 3 0 4 ( ⁇ 20 nm).
  • the ability to respond to applied magnetic fields of Fe 3 0 4 and Fe 3 0 4 / PCL particles was analyzed qualitatively by visualizing the effect of a permanent magnet on an aqueous suspension of these nanoparticles.
  • two colloidal aqueous suspensions were prepared with a concentration ⁇ 0.5% (w / v).
  • the Fe 3 0 4 and Fe 3 0 4 / PCL suspension were contacted with a magnetic field of 400 mT, and the behavior of the nanoparticles was observed as a function of time .
  • the nanoparticles composed of Fe 3 0 4 / PCL were attracted very quickly by the magnet, confirming the great magnetic properties of the designed system.
  • the supernatant was completely transparent, in less than 1 minute.
  • the Fe 3 0 4 nanoparticle suspension maintained its homogeneous appearance even after 24 hours of exposure to the applied magnetic gradient.
  • the superparamagnetic character of the Fe 3 0 4 nanoparticles justified the absence of a response to the 400 mT magnetic gradient.
  • aqueous suspensions of the Fe 3 0 4 / PCL composite nanoparticles In order to analyze the microscopic behavior of the aqueous suspensions of the Fe 3 0 4 / PCL composite nanoparticles, we monitored them using optical microscopy.
  • the aqueous suspensions had a concentration of 0.1% (w / v) of nanoparticles and exposure to a magnetic gradient of 400 mT was performed at 25.0 ⁇ 0.5 e C.
  • a drop of aqueous suspension of the magnetic nanoparticles was placed in a slide and was subjected to a magnet located in different positions with respect to the magnetic suspension.
  • the visualization of the effect that the applied magnetic gradient exerted on the nanoparticle suspension was performed using an optical microscope (magnification: 40X).
  • the nanoparticles with the best magnetic properties were those obtained from an initial Fe 3 0 4 : PCL mass ratio between 4: 4 and 2: 4, mainly because the particles thus obtained harbored a large number of superparamagnetic nuclei inside and, therefore, had a greater capacity to respond to magnetic gradients.
  • the proportions 4: 3 to 4: 1 the polymeric coating obtained was much thinner and in its interior there was a smaller number of magnetite particles (Figure 3a). This effect was increasingly evident as the excess in superparamagnetic nuclei used in the synthesis increased. Thus, the magnetic properties were getting smaller.
  • the determination of the electrophoretic mobilities (or e ) of the different aqueous suspensions was carried out using a Malvern Zetasizer 2000 device (Malvern Instruments, England). The measurement was based on the analysis of the autocorrelation of the laser light dispersed by the moving nanoparticles. The device used allowed to determine u e with errors ⁇ 5%. The measuring temperature (25 e C) was kept constant (up to ⁇ 0.2 e C) using a Peltier module. The suspensions studied had a concentration of nanoparticles ⁇ 0.1% (w / v). Before preparing the suspension, the desired electrolyte concentration (KN0 3 ) was set and the pH adjusted, if necessary, with HN0 3 or KOH.
  • KN0 3 desired electrolyte concentration
  • Electrophoretic measurements of aqueous suspensions (concentration ⁇ 0.1%, m / v) of magnetite and magnetic nanocomposites were performed by reproducing physiological conditions (pH 7.4 ⁇ 0.1, and 37.0 ⁇ 0.5 e C). The experiment was considered completed when the electrophoretic mobility values (u e ) of the Fe 3 0 4 / PCL nanoparticles coincided with those of the pure Fe 3 0 4 nanoparticles, an unequivocal sign of the loss of the polymeric coating.
  • Figure 12 shows how the values of u e of the magnetite remain constant throughout the study period ⁇ u e ⁇ -3.5 ⁇ ⁇ - ⁇ 1 ).
  • This negative value of u e so high was due to the formation on the surface of the magnetite of a thin layer of oxidation (maghemite, a more oxidized state of it).
  • the values of u e of maghemite nanoparticles of equal size to Fe 3 0 4 (under the same experimental conditions) were very similar (tv e -3.6 ⁇ Vv-cm "1 ).
  • Figure 12 shows how the e- values of the Fe 3 0 4 / PCL nanoparticles progressively approximate the characteristics of the magnetic cores. Specifically, they are made equal after 15 days. Thereafter, no significant differences were observed between the u e of both materials. Therefore, the surface of the Fe 3 0 4 nuclei of the nanocomposites was increasingly exposed to the dispersion medium (hence the increasingly negative values of u e ), due to the progressive degradation of the coating. Thus, when the polymer shell was completely lost, both values of u e became indistinguishable. This very progressive evolution of u e towards the typical values of Fe 3 0 4 , showed qualitatively that the degradation rate of the polymer was slow, which has been associated with the high degree of crystallinity and the great hydrophobia of this polymer.
  • the contact angles were measured with a Ramé-Hart 100- 0.7-00 goniometer (USA), which allows to observe the drops of liquid deposited on a solid.
  • This device has a set of micrometric screws that allow vertical and horizontal displacements of the substrate, as well as a graduated blade for measuring the angle with an accuracy of ⁇ 1 e .
  • the use of a Gimont microjeringa (USA) allowed to control the volume of the drop deposited between 2 and 4 ⁇ _.
  • the measurements were made at 25.0 ⁇ 0.5 e C, using a camera thermostatic
  • the images of the drops of the liquids deposited on the surface of the materials were captured using a digital camera that has a charge-coupled device (CCD) and a digital image analysis system.
  • CCD charge-coupled device
  • the contact angles of the selected liquids were determined on thin layers of the three types of nanoparticles deposited on microscope slides (glass plate). These smooth surfaces were obtained after the uniform addition of an aqueous suspension of each type of nanomaterial ( ⁇ 10%, w / v) on the clean and dry surface of a glass plate. In the preparation of the sample we verified that with the addition of 10 mL of aqueous suspension of nanoparticles a sufficiently thick layer of material was obtained. The drying of the slides with each of the samples was carried out at 35.0 ⁇ 0.5 e C, using a drying oven for 24 hours. In this way, a very uniform layer of material was obtained at the macroscopic level, which allowed the measurement of the contact angles to be carried out in very stable drops.
  • the electron-acceptor component ( s ) was very small for the three types of materials, its magnitude for the Fe 3 0 4 / PCL nanoparticles was virtually zero and identical to that corresponding to the PCL, acquiring finite values for the magnetite .
  • the electronic contribution Donor ( ⁇ s ) show a much more noticeable difference between iron oxide nuclei and compound magnetic particles Fe 3 0 4 / PCL. The high value of this last component in the case of magnetite confirms its electron-donor monopolar character.
  • the interactions involved in determining the surface free energy of nanomaterials are manifested in phenomena such as aggregation of suspended nanoparticles or their adhesion to different substrates.
  • both the Fe 3 0 4 / PCL composite nanoparticles and the polymer have negative AG (hydrophobic attraction) values, which are added to the van der Waals attraction.
  • Solid A 3 ⁇ 41 (mJ / m 2 ) A 3 ⁇ 41 (mJ / m 2 ) AG i2i (mJ / m 2 )
  • hydrophilicity corresponds to positive values of 121.
  • Figure 15 shows the results obtained for the three types of nanomaterials. As can be seen, the hydrophilic nature of magnetite is lost when it is coated by the hydrophobic polymer, which can be considered as a very clear indication that said coating is effective.
  • the amount of drug incorporated was expressed in terms of entrapment efficiency ⁇ entrapment efficiency, EE) (%) [(vehiculized drug (mg) / quantity Total drug used (mg)) x 100] and drug loading ⁇ drug loading, DL) (%) [(vehiculized drug (mg) / total mass of nanoparticles (mg)) x 1 00].
  • the determination of the surface adsorption of drug on the nanoparticles of Fe 3 0 4 / PCL compounds was carried out based on a series of aqueous solutions (1 0 ml_) with different molar concentration of active ingredient (10 ⁇ 5 , 1 0 ⁇ 4 , 10 ⁇ 3 and 10 ⁇ 2 ), except in the case of doxorubicin where the maximum concentration used was 1 0 ⁇ 3 M. In all these dispersion media a concentration of nanoparticles of 1% (w / v) was set.
  • Table 5 shows the amount of the active ingredients in the nanoparticles of each of the active ingredients based on their concentration in the aqueous solution. It can be seen how the concentration of drug used positively influences vehiculization.
  • Table 6 shows the amount of the active ingredients in the nanoparticles of each of the active ingredients based on their concentration in the aqueous solution. As can be seen, the absorption of these drugs in the nanoparticle matrix increases with the concentration of these drugs present in the synthesis medium. The values obtained from the incorporation of each of these drugs are higher than those corresponding by the surface adsorption procedure (at the same concentrations of active ingredient), which justifies the selection of the method of vehiculization by matrix absorption as the most suitable for the synthesis of the Fe 3 0 4 / PCL compound particles loaded with these drugs.
  • the in vitro release assay of each of the drugs from the compound nanoparticles Fe 3 0 4 / PCL was performed in triplicate at 37.0 ⁇ 0.5 e C.
  • the dialysis bags were left submerged in double-distilled water for 12 hours before starting the test.
  • the dialysis bag used (Spectrum ® Spectra / Por ® 6, USA) is characterized by a pore size of 2000 Da, which allows the nanoparticles to be retained inside, leaving only the drug released to the release medium.
  • Samples of the release medium (1 mL) were collected according to the following time interval: 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 and 12 hours, and 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14 and 15 days.
  • the samples were analyzed by UV-Vis spectrophotometry at the maximum absorbance wavelengths of each of the active substances (doxorubicin: 481 nm, 5-fluorouracil: 266 nm, and sodium diclofenac: 276 nm).
  • antineoplastic agent 5-fluorouracil (Figure 17) if it was incorporated into the surface of the nanoparticles by adsorption, its release occurred in just 3 hours. On the contrary, if the incorporation of the drug was carried out by the matrix absorption method, 30% of the vehicle dose was released during the first hour and the remaining 70% was released in a total of 10 days. Finally, in reference to the diclofenac sodium NSAID ( Figure 18), when this molecule was incorporated exclusively on the surface of the nanoparticles by adsorption, the release of the vehicular dose occurred in only 2 hours. On the contrary, if the incorporation was carried out by the matrix absorption method, 33% of the vehicle dose was released during the first hour and the remaining 67% was released in a total of 7 days.
  • the release process was clearly biphasic when the dose of active ingredient was incorporated into the compound nanoparticles Fe 3 0 4 / PCL by the matrix absorption procedure.
  • the release consisted of a rapid phase that meant the loss of the active substance associated with the surface or weakly trapped (adsorbed in the surface pores). The more sustained drug release over time that occurred during the second phase was due to a process of diffusion of the drug through the polymer matrix.
  • Example 3 Hyperthermic capacity of the nanoparticles of the present invention
  • the ability to generate heat of the nanoparticles of Fe 3 0 4 / PCL under the action of an alternating electromagnetic gradient was tested in vitro at 25.0 ⁇ 0.5 e C, in triplicate.
  • 5 mL of an aqueous suspension of these nanoparticles (10 mg / mL) were prepared.
  • the frequency and intensity of the magnetic gradient used were 250 kHz and 4 kA / m, respectively.
  • Figure 19 shows the in vitro heating of the aqueous nanoparticle suspension as a function of time.
  • the oscillation of the magnetic moments of the Fe 3 0 4 / PCL nanoparticles caused them to generate heat, reaching the minimum hyperthermia temperature ( ⁇ 41 e C) after 25 minutes.
  • the suspension reached a maximum temperature of 45 e C after 35 minutes.
  • this temperature was stably maintained throughout the duration of the experiment. This circumstance was especially interesting, as numerous investigations have shown that heating at this temperature of a mass of tumor cells for about 30 minutes, causes irreversible damage to them and induces death [Huber, 2005].
  • the temperature stabilization at 45 e C demonstrated good control over the temperature and heat flow offered by the nanoparticles, a basic requirement for application in hyperthermia. This is especially important if we consider that if the temperature continues to grow uncontrollably (> 48 e C), the healthy tissues surrounding the tumor mass would burn and die.

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Abstract

La presente invención se refiere a nanopartículas mixtas de liberación prolongada de principios activos, el uso de dichas nanopartículas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación y para como antitumorales y al método se síntesis de dichas nanopartículas.

Description

NANOPARTICULAS MIXTAS DE LIBERACIÓN CONTROLADA DE PRINCIPIOS ACTIVOS
Campo de la invención
La presente invención se encuadra en el campo general de la nanomedicina y en particular se refiere a nanopartículas mixtas de liberación controlada de principios activos.
Estado de la técnica
La necesidad de encontrar tratamientos eficaces contra el cáncer, ha hecho que se incrementen las líneas de investigación en esta materia. Esto ha permitido un mayor conocimiento de sus orígenes moleculares, con la consiguiente identificación de novedosas líneas terapéuticas y el desarrollo de un amplio arsenal de agentes terapéuticos. Aún así, estas nuevas moléculas suelen presentar las siguientes limitaciones: i) no llegar en cantidad suficiente al lugar donde se localiza el tumor; y, ii) no son suficientemente eficaces en el micro-entorno tumoral. Por estos motivos, el fracaso del tratamiento es muy frecuente incluso en los tipos de cáncer teóricamente más sensibles a los agentes quimioterapéuticos. Un claro ejemplo lo constituye el uso del fármaco antitumoral 5-fluorouracilo en el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado, el cuál sólo induce una respuesta global entorno al 10 %. Además, se ha descrito que la combinación de este agente con otros antitumorales sólo ha logrado mejorar la eficacia antitumoral entorno al 45 % de los casos [Zhang y cois., 2008].
Entre las principales razones que justifican el fracaso del tratamiento antitumoral destacan: i) la farmacocinética desfavorable de los agentes antitumorales (caracterizada por un rápido aclaramiento y una rápida biodegradación, que dan lugar a una corta vida plasmática) determina el uso de dosis altamente tóxicas y una rigurosa pauta de tratamiento para conseguir el efecto terapéutico deseado; ii) la extensa biodistribución y extravasación de la molécula antitumoral en zonas no deseadas determina su elevada toxicidad; iii) la selectividad de estos fármacos por el tejido tumoral generalmente es muy pobre; iv) la susceptibilidad de desarrollar resistencia a los anticancerosos por parte de las células tumorales; y, v) las propiedades fisicoquímicas desfavorables de los agentes antitumorales, por ejemplo, su hidrofobia, inducen una escasa acumulación en el lugar de acción [Arias, 2008; Durán y cois., 2008].
Con el objetivo de solucionar estos problemas se han asociado antitumorales con sistemas coloidales en el tratamiento del cáncer [Reddy, 2005; Arias, 2008]. Esta asociación pretende aumentar la acumulación específica del fármaco en la zona tumoral, e incrementar el tiempo de exposición de las células cancerosas a estos agentes activos. Otros beneficios de la localización exclusiva de los agentes quimioterápicos en la región diana son la mejora de su perfil farmacocinético y la disminución de la toxicidad asociada a la extensa biodistribución de estas moléculas. Además, los sistemas coloidales pueden lograr una protección adecuada de estos principios activos in vitro (durante el almacenamiento) e in vivo (frente a fenómenos de biodegradación relacionados principalmente con sistemas enzimáticos), lo que reducirá la formación de productos de degradación potencialmente tóxicos [Arias, 2008; Durán y cois., 2008; Davis y cois., 2008]. Es por ello que numerosos esfuerzos se están concentrando en la formulación de coloides, basados principalmente en sistemas vesiculares (liposomas y niosomas) o poliméricos, para conseguir el transporte eficaz de cualquier antitumoral a la zona diana [Arias, 2008; Cho y cois., 2008]. Sin embargo, recientes investigaciones han probado que esta simple asociación no siempre resulta suficiente para lograr dirigir específicamente un fármaco a cualquier zona del organismo, más allá de los órganos pertenecientes al sistema retículo endotelial [Reddy, 2005; Couvreur y Vauthier, 2006]. Es por todo esto que actualmente se están desarrollando importantes investigaciones (con resultados muy prometedores) encaminadas al diseño de sistemas transportadores pasivos de fármacos [basados en el efecto de permeacion y retención incrementada] y sistemas transportadores activos de fármacos al lugar de acción (fundamentados en las interacciones ligando-receptor, y en el diseño de nanopartículas sensibles a estímulos externos) [Reddy, 2005; Arias, 2008].
Gang J, Park SB, Hyung W, Choi EH, Wen J, Kim HS, Shul YG, Haam S, Song SY. Magnetic poly epsilon-caprolactone nanoparticles containing Fe304 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cáncer xenograft mouse model. J Drug Target. 2007 Jul;15(6):445-53 y Arias JL, López-Viota M, Sáez-Fernández E, Ruiz MA. Formulation and physicochemical characterization of poly(£-caprolactone)nanoparticles loaded with ftorafur and diclofenac sodium. Colloids Surf. B: Biointerfaces 2010; 75: 204-208, describen nanopartículas magnéticas de poli-épsilon caprolactona que contienen un fármaco para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, el gran tamaño que presentan dichas partículas hace que su acumulación en la región diana sea pobre, de tal forma que la eficacia del tratamiento se ve mermada.
Existe pues la necesidad de proporcionar unas nanopartículas que sean de un tamaño mínimo que permita una mayor mayor acumulación de las mismas en la región diana, que minimicen los fenómenos de reconocimiento y retirada de las mismas por el sistema inmune y mejore por tanto la eficacia del tratamiento.
Descripción de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a nanopartículas mixtas de liberación prolongada de principios activos caracterizadas porque la nanopartículas tienen un diámetro medio de entre 74-98 nm y comprende un núcleo de óxido de hierro, un recubrimiento biodegradable de poli (ε-caprolactona) y al menos un principio activo. De ahora en adelante nanopartículas de la presente invención.
En la presente invención principio activo y fármacos son equivalentes y se refiere a cualquier sustancia química utilizada en la prevención, diagnóstico, tratamiento, mitigación y cura de una enfermedad; para evitar la aparición de un proceso fisiológico no deseado; o para modificar condiciones fisiológicas con fines específicos.
En una realización particular las nanopartículas de la presente invención tienen un diámetro medio de 86 nm.
En una realización particular el núcleo de óxido de hierro de las nanopartículas de la presente invención tiene un diámetro medio de entre 10-14 nm
En una realización particular el principio activo de las nanopartículas de la presente invención es un AINE. Más en particular el AINE es diclofenaco sódico. En una realización particular el principio activo de las nanopartículas de la presente invención es un antitumoral. Más en particular el antitumoral es seleccionado de entre la doxorrubicina o 5'-fluorouracilo.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas mixtas de la presente invención como medicamento. En un tercer aspecto, las nanopartículas de la presente invención son para el tratamiento del cáncer.
En un cuarto aspecto, las nanopartículas de la presente invención son para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación, principalmente en el tratamiento de artritis y artrosis. También se pueden utilizar para el tratamiento de otros procesos inflamatorios como faringitis, laringitis, colitis, conjuntivitis, etc.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de las nanopartículas de la presente invención que comprende los siguientes pasos: a) síntesis del núcleo de magnetita mediante co-precipitación en solución acuosa, b) disposición interfacial de la poli (ε-caprolactona) en diclorometano junto con la nanopartícula de magnetita del paso a) en solución acuosa,
c) purificación de la partícula obtenida en el paso b)
d) adición del principio activo
En una realización preferente, el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante adsorción superficial sobre las nanopartículas obtenidas tras el paso c)
En otra realización preferente, el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante absorción en la matriz de las nanopartículas en el paso b)
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. De ahora en adelante composición farmacéutica de la presente invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la presente invención como medicamento.
En un octavo aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención es para el tratamiento del cáncer.
En un noveno aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención es para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación.
En un décimo aspecto, la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas de la presente invención y/o de la composición farmacéutica de la presente invención en terapia de hipertermia. Descripción de las figuras
La figura 1 muestra las imágenes de HRTEM de las nanopartículas de magnetita (a), poli(£-caprolactona) (b), y magnetita/poli(£-caprolactona) (c). Longitud de barra: 100 nm (a y b), y 20 nm (c).
La figura 2 muestra imágenes de FeSEM de las nanopartículas de magnetita (a), poli(£-caprolactona) (b), y magnetita/poli(£-caprolactona) (c). (Figura insertada: detalle de la muestra). Longitud de barra: 20 nm (a), y 100 nm (b y c).
La figura 3 muestra una microfotografía HRTEM de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL obtenida partiendo de una relación de masas inicial Fe304:PCL de 4:1 (a), 2:4 (b) y 1 :4 (c).
La figura 4 muestra difractogramas de rayos X de las partículas de magnetita (Fe304, línea negra), poli(£-caprolactona) (PCL, línea azul) y de magnetita /poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL, línea magenta). Figura insertada: patrón de difracción de rayos X de la Fe304. La intensidad está expresada en unidades normalizadas.
La figura 5 muestra el espectro de infrarrojos de las partículas de magnetita (Fe304, - o-), de poli(£-caprolactona) (PCL,— ) y de magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL, — ). Figura insertada: estructura química de la PCL.
La figura 6 muestra el ciclo de histéresis de la partículas de magnetita (Fe304, □) y compuestas Fe304/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL,■)
La figura 7 muestra visualmente la decantación magnética de las partículas de magnetita (Fe304) y magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL) bajo la influencia de un imán permanente de 400 mT, localizado en el lateral (a) o debajo (b) de las muestras.
La figura 8 muestra una microfotografía óptica (magnificación: 40X) de una suspensión acuosa de nanopartículas de magnetita/poli(£-caprolactona) en ausencia (a) o bajo la infuencia (b, c, d, e, f) de un gradiente magnético externo, B= 400 mT, en la dirección de la flecha.
La figura 9 muestra el potencial zeta (ζ) de las nanopartículas de magnetita (Fe304, ·), poli(£-caprolactona) (PCL, ■), y compuestas magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL, A ) en función del pH, en presencia de 10~3 M KN03. La figura 10 muestra el potencial zeta (ζ) (b) de las nanopartículas de magnetita (Fe304, ·), poli(£-caprolactona) (PCL,■), y compuestas magnetita/poly(£-caprolactona) (Fe304/PCL, A ) en función de la concentración de KN03 a pH = 6.
La figura 1 1 muestra el histograma de las movilidades electroforéticas (tve) de las nanopartículas compuestas magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL) en una solución acuosa 1 0"3 M KN03, para diferentes relaciones de masas iniciales Fe304:PCL. También se incluyen los valores de ue de Fe304 y de PCL.
La figura 12 muestra la movilidad electroforética (tve) de las nanopartículas de Fe304 (USPIO,■) y de Fe304/PCL (USPIO/PCL,□) en función del tiempo, a pH = 7.4 ± 0.1 , y a 37.0 ± 0.5 eC.
La figura 13 muestra los ángulos de contacto (grados) de los líquidos utilizados en las determinaciones con magnetita (Fe304), poli(£-caprolactona) (PCL) y nanopartículas de magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL).
La figura 14 muestra componentes de la energía libre superficial (mJ/m2) de magnetita (Fe304), poli(£-caprolactona) (PCL) y nanopartículas magnéticas compuestas
LW
magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL). ^s es la componente de Lifshitz-van der Waals; ^s ( ^s ) es la componente electrón-aceptor (electrón-donante).
La figura 15 muestra los valores de ^121 (mJ/m2) y carácter hidrófilo/hidrófobo de los tres tipos de nanomateriales: magnetita (Fe304), poli(£-caprolactona) (PCL) y nanopartículas magnéticas compuestas magnetita/poli(£-caprolactona) (Fe304/PCL).
La figura 16 muestra la liberación de doxorrubicina (%) adsorbida (a), y (b) absorbida desde las nanopartículas Fe304/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ) a 37.0 ± 0.5 eC.
La figura 1 7 muestra la liberación de 5-fluorouracilo (%) adsorbido (a), y (b) absorbido desde las nanopartículas Fe304/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ) a 37.0 ± 0.5 eC.
La figura 18 muestra la liberación de diclofenaco sódico (%) adsorbido (a), y (b) absorbido desde las nanopartículas Fe304/PCL en función del tiempo de incubación en una solución tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ) a 37.0 ± 0.5 eC. La figura 19 muestra la curva de calentamiento de una suspensión acuosa de nanopartículas Fe304/PCL (10 mg/mL) bajo la exposición a un gradiente electromagnético alterno de alta frecuencia (frecuencia e intensidad: 250 kHz y 4 kA/m, respectivamente).
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: Formulación de las nanopartículas magnetita/poli(e-caprolactona)
El método de síntesis se basa en el método de disposición interfacial de la ροΝ(ε- caprolactona), utilizado en la síntesis de nanopartículas de este polímero. Para ello se provocó la precipitación del polímero en un medio de polimerización en el que se encontraban los núcleos del óxido de hierro (magnetita). De esta manera, la ροΝ(ε- caprolactona) recubrió los núcleos de magnetita que se encontraban presentes en el medio acuoso donde se produjo su precipitación.
En primer lugar, la síntesis de las nanopartículas de magnetita se realizó mediante el método de co-precipitación en solución [Massart, 1981 ]. En concreto, la metodología de síntesis seguida consistió en la adición, a temperatura ambiente y gota a gota, a una solución acuosa de amoniaco (500 mL, 0.7 M) de una solución acuosa de cloruro férrico (40 mL, 1 M) y otra solución acuosa de cloruro ferroso (10 mL, 2M) que además contenía una concentración 2 M de HCI. En estas condiciones, se produjo la formación espontánea de las nanopartículas de magnetita, las cuáles fueron aisladas mediante sedimentación magnética. La última fase de esta síntesis consistió en la estabilización termodinámica de las nanopartículas de magnetita en una disolución acuosa de ácido perclórico 2 M durante 12 horas. De esta manera, aseguramos que las partículas de este óxido de hierro se mantuvieran aisladas en el medio de dispersión, no formándose agregados de mayor tamaño. Las partículas de magnetita fueron preparadas en el momento de su utilización para la síntesis de los nanopartículas magnetita/poli(£-caprolactona).
Por el contrario, si las nanopartículas de este óxido de hierro no eran utilizadas en el momento, se desecaban en una estufa de desecación [P-Selecta, España] a 40.0 ± 0.5 eC, y se conservaron en estado seco hasta su utilización.
El proceso de síntesis de las nanopartículas magnetita/poli(£-caprolactona) comenzó con la adición de 10 mL de una solución al 0.3 % (p/v) de polímero en diclorometano sobre 50 ml_ de una suspensión acuosa de nanopartículas de magnetita (0.3 %, p/v) que contenía una concentración de pluronic® F-68 del 2 % (p/v). La adición de la fase orgánica sobre la fase acuosa se realizó bajo agitación mecánica (1200 rpm), la cual se mantuvo durante 1 hora más. Finalmente, la limpieza de las nanopartículas magnéticas compuestas magnetita/poli(£-caprolactona) se realizó mediante sedimentación magnética. Para ello, la suspensión fue sometida a ciclos consecutivos de exposición a un imán de 400 mT durante 5 minutos, procediendo a la eliminación del sobrenadante tras este tiempo, y redispersión en agua bidestilada. Esta rutina se mantuvo hasta que el sobrenadante obtenido era transparente y presentaba una conductividad inferior a 10 με/οηι.
Finalmente, con el objetivo de establecer comparaciones durante la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas magnetita/poli(£-caprolactona), realizamos también la síntesis de nanopartículas puras de poli(£-caprolactona) según la metodología indicada en el párrafo anterior, pero sin la utilización de los núcleos de óxido de hierro. A continuación se realizó una caracterización física, química y fisicoquímica de las nanopartículas.
La geometría (forma y tamaño) de las partículas de magnetita y magnetita/poli(£- caprolactona) fue estudiada mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) [STEM PHILIPS CM20, Holanda] y mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución (FeSEM) [Zeiss DSM 950, Alemania]. La determinación del tamaño de partícula medio (± desviación estándar) se obtuvo mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS) [Malvern 4700 analyzer, Malvern Instruments, Inglaterra].
El tamaño medio de las partículas de magnetita fue de 12 ± 2 nm (figura 1 a y 2a), lo que nos hizo pensar que las nanopartículas debían ser superparamagnéticas.
El tamaño medio de las nanopartículas puras de polímero fue de 97 ± 7 nm.
En cuanto a las nanopartículas magnetita/poli(£-caprolactona), tal y como puede apreciarse en la figura 1 c, el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos fue completo.
Como muestra la figura 2b, los núcleos de magnetita quedaron recubiertos por un halo blanco/grisáceo que coincidió con el aspecto de las nanopartículas puras de polímero. Es más, las microfotog rafias de FeSEM (figura 2) muestran cómo externamente las partículas puras de poli(£-caprolactona) y las partículas compuestas magnetita/poli(£- caprolactona) son indistinguibles. Este hecho confirmó la eficacia del recubrimiento de los núcleos magnéticos por el polímero biodegradable.
Finalmente, el análisis PCS de la nanopartículas magnéticas magnetita/poli(£- caprolactona) permitió confirmar el pequeño tamaño de éstas (86 ± 12 nm), muy adecuado para la vía de administración parenteral.
Las condiciones de síntesis descritas en el ejemplo anterior son las que posibilitan un mayor rendimiento en la obtención de nanopartículas compuestas magnetita/poli(£- caprolactona) (tabla 1 ). Sin embargo, para llegar a esta conclusión fue necesario el análisis del efecto que tienen las diferentes proporciones de masa magnetita:poli(£- caprolactona) (Fe304:PCL) en el rendimiento de la síntesis. En concreto, variamos las proporciones de Fe304:PCL desde 1 :4 a 4:1 .
La figura 3 recoge las microfotografías de HRTEM de las nanopartículas compuestas obtenidas según todas estas variantes del procedimiento de síntesis. Observamos cómo las diferencias más significativas se dieron entre las nanopartículas obtenidas utilizando una relación Fe304:PCL 1 :4 y 4:1 , en comparación con las otras posibilidades investigadas. Si la relación inicial entre las masas era 4:1 , el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos era prácticamente inexistente. Como mucho llegó a apreciarse ocasionalmente en las zonas de contacto entre los núcleos magnéticos (figura 3a). En el caso contrario, cuando la relación era 1 :4, las partículas de Fe304 quedaban totalmente englobadas por una enorme matriz de polímero. Incluso se apreció la formación de una excesiva cantidad de partículas de polímero puro (figura 3c).
El análisis de la influencia de esta relación de masas iniciales Fe304:PCL sobre el rendimiento de la síntesis en la obtención de nanopartículas magnéticas compuestas Fe304/PCL, permitió comprobar que éste era máximo para una proporción 2:4 (~ 90 %), seguido de la proporción 4:3 (~ 84 %) (tabla 1 ). El rendimiento de la reacción de síntesis fue calculado mediante la ecuación: masa total obtenida de nanopartículas compuestas Fe304/PCL (mg)
X 1UU
masa total utilizada de material (mg) Proporción de masas iniciales Rendimiento (%) Apariencia del sobrenadante magnetita : polímero no magnético
4 : 1 2 anaranjado oscuro
4 : 2 12 anaranjado claro
4 : 3 84 amarillento
4: 4 42 blanquecino/amarillento
3 : 4 51 banquecino/amarillento claro
2 : 4 90 transparente
1 : 4 40 blanco
Tabla 1. Rendimiento (%) de la reacción de síntesis de las partículas compuestas
Fe304/PCL para cada una de las proporciones de masas iniciales Fe304:PCL.
Desde 1 :4, hasta 4:1.
Como muestran los datos, si existe un exceso en la cantidad de núcleos magnéticos sobre la cantidad de polímero mucha Fe304 quedó sin recubrir (no formando parte de las partículas compuestas) y, por su particular superparamagnetismo, quedó en el sobrenadante de la suspensión en lugar de formar parte del sedimento magnético atraído por el imán. En estas condiciones, el sobrenadante no magnético presentó un característico color anaranjado (indicativo de la presencia de estos núcleos superparamagnéticos de óxido de hierro). Por el contrario, si la relación era de 1 :4 el sobrenadante no magnético obtenido era totalmente blanco, consecuencia de la formación de nanopartículas de polímero puro en exceso. Además, al incrementar la cantidad de PCL con respecto a Fe304 el grosor del recubrimiento polimérico de las nanopartículas de magnetita tendía a ser algo mayor.
El hecho de que el sobrenadante de las nanopartículas compuestas obtenidas con la relación Fe304:PCL 2:4 fuera totalmente transparente, significa que toda la cantidad de los materiales utilizados en la formulación de nanopartículas Fe304/PCL se transformó en estas nanopartículas magnéticas compuestas. De hecho, como hemos comentado el rendimiento es ~ 90 % (tabla 1 ).
Por último, cuando hay un exceso de Fe304 sobre PCL (en concreto, en la relación 4:3) todo el polímero utilizado pasó a formar parte de los recubrimientos poliméricos biodegradables de las partículas compuestas. Este exceso en Fe304 hizo que hubiera núcleos magnéticos no recubiertos que permanecieron aislados en el sobrenadante del medio de dispersión, haciendo que el rendimiento de la reacción de síntesis fuera el menor, en comparación con la relación 2:4 como hemos señalado. La metodología de síntesis implicó la utilización de una relación de masas iniciales Fe304:PCL 2:4. Así (figuras 1 c y 2c), el rendimiento de la reacción fue el máximo posible (~ 90 %) y se obtuvieron nanopartículas compuestas de tamaño muy pequeño (86 ± 12 nm) y adecuado para la vía de administración parenteral.
Este tamaño fue sensiblemente inferior al obtenido en trabajos previos. En concreto, y en función de las condiciones de formulación, se obtuvieron nanopartículas Fe304:PCL con un tamaño de 20 a 3 μηι, cuando la velocidad de agitación variaba entre 500 y 2000 rpm, respectivamente [Hamoudeh y Fessi, 2006], de 160 ± 5 nm [Yang y cois., 2006], y de 164 ± 3 nm [Gang y cois., 2007].
El menor tamaño de las nanopartículas Fe304:PCL que hemos sintetizado es realmente interesante en el transporte de fármacos al lugar de acción (masa tumoral, tejido inflamado, etc.), ya que permite estimar una mayor acumulación de las nanopartículas en la región diana al minimizarse los fenómenos de reconocimiento y retirada por el sistema inmune [Decuzzi y cois., 2009].
Posteriormente realizamos una caracterización muy exhaustiva de las nanopartículas, en comparación con los trabajos previamente publicados [Hamoudeh y Fessi, 2006; Yang y cois., 2006; Gang y cois., 2007]. En concreto, difractometría de rayos X, espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier, propiedades magnéticas (ciclo de histéresis), propiedades eléctricas superficiales (electroforesis: dependencia del potencial zeta con el pH y con la fuerza iónica) y termodinámica superficial (análisis de la naturaleza hidrófila/hidrófoba del nanomaterial).
1 .- Difractometría de rayos X
Realizamos un difractograma de rayos X de los tres tipos de materiales (Fe304j PCL y Fe304/PCL), empleando el método de Debye-Scherrer. El dispositivo empleado fue un difractómetro Philips PW1710 (Holanda), utilizando una longitud de onda de 1 .5405 Á (Cu-Ka). La masa utilizada en el análisis fue la misma para todos los materiales (~ 0.5 g). En la figura 4 se recogen los difractogramas obtenidos para la magnetita, el polímero y las partículas compuestas. Al comparar los difractogramas de la magnetita y de las partículas compuestas con el patrón de la "American Society for Testing and Materials" de la magnetita (figura 4), comprobamos la perfecta coincidencia de las líneas del difractograma con las del patrón, lo que permitió identificar la muestra como magnetita y observar la elevada cristalinidad de ésta (tamaño de gramo ~ 300 Á), incluso tras ser recubierta por el polímero. Las características semicristalinas de la PCL también quedaron reflejadas en los difractogramas. Destacamos cómo los picos característicos de la PCL se encontraron presentes en el difractograma de rayos X de las partículas magnéticas compuestas, aunque con una menor intensidad. A igualdad de masa utilizada en el análisis, la cantidad de polímero presente en la muestra de partículas compuestas Fe304/PCL era menor. Demostrando de nuevo la eficacia de la formación de partículas compuestas Fe304/PCL mediante la metodología de síntesis de la presente invención.
2.- Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier
Para la preparación de las muestras a analizar tomamos 1 .0 mg de material sólido y se mezclaron con 1 00 mg de bromuro potásico pulverizado y seco. A continuación, prensamos el material a 15000 kPa para obtener un disco transparente. Como consecuencia de esta manipulación, aparecieron bandas en el espectro de infrarrojos a 3448 cm"1 y 1 639 cm"1 debido a la humedad. La obtención del interferograma se realizó utilizando un espectrofotómetro de infrarrojos (Nicolet 20 SXB, EE.UU.), con una resolución de 2 cm"1.
En la figura 5 se recoge el espectro de infrarrojos de nuestros tres tipos de partículas (Fe304, PCL y Fe304/PCL). El análisis permitió la identificación de los grupos funcionales del polímero en las partículas compuestas. Sin embargo, las bandas fueron menos intensas debido a la menor cantidad de polímero presente en las partículas compuestas para el mismo peso de muestra. En concreto, las bandas observadas fueron:
■ A: banda debida a la humedad que adquieren las muestras como consecuencia de su proceso de manipulación. Se localiza a 3388 cm"1.
■ B: grupo de dos bandas que corresponden a la vibración de estiramiento del enlace C-H de la molécula. En el polímero, a 2937 cm"1 se localiza la banda característica de la vibración de elongación asimétrica del grupo CH2 (uAS CH2) y a 2888 cm"1 observamos la perteneciente a la vibración de elongación simétrica del CH2 {u/ s CH2).
■ C: banda que corresponde a la vibración molecular del enlace C = O del polímero, aparece a 1 727 cm"1.
■ D: banda que corresponde a la vibración de flexión asimétrica del CH2 (uAS CH2).
En las partículas poliméricas aparece a 1469 cm"1. ■ E: grupo de dos bandas correspondientes a la vibración de flexión del enlace O-H (1345 cm"1) y a la vibración de elongación del enlace C-0 (1281 cm"1) del ácido carboxílico de la molécula.
■ F: banda perteneciente a la vibración de elongación del enlace C-0 del alcohol primario del polímero (1242 cm"1).
■ G: grupo de tres bandas que aparecen a 1 150 cm"1, 1 1 1 1 cm"1 y 1061 cm"1 , corresponden a la vibración de elongación y flexión del grupo C-CO-C, y que resulta de la vibración de elongación y flexión de la cadena C-C-C presente en este grupo.
■ H: en las muestras que contienen polímero, a 961 cm 1 aparece una banda media característica de un alcano.
■ I: banda permaneciente a la vibración de oscilación del CH2 (pCH2), se observa a 840 cm 1 y es propia de una cadena larga de CH2.
■ J: única banda ausente en el espectro de las partículas de polímero. Aparece a 581 cm"1 y es una banda ancha e intensa, característica de la absorción en la magnetita [Lyon, 1967], correspondiente a la frecuencia fíestrahl (o rayo residual), de máxima absorbancia de cristales iónicos (o parcialmente iónicos) en el infrarrojo [Gartstein y cois., 1986].
3.- Propiedades magnéticas
Se caracterizaron las propiedades magnéticas de los núcleos de Fe304 y el efecto que el recubrimiento polimérico podía tener sobre éstas. Además, y con el fin de clarificar las condiciones óptimas para la formulación de nanopartículas magnéticas compuestas Fe304/PCL, se investigaron las características magnéticas de las partículas de Fe304/PCL obtenidas para cada una de las relaciones de masa inicial Fe304:PCL (desde 1 :4 hasta 4:1 ). Las propiedades magnéticas de la magnetita y de las partículas Fe304/PCL quedaron perfectamente definidas mediante el ciclo de histéresis. Esta caracterización macroscópica del comportamiento magnético de las partículas coloidales se realizó con la ayuda de un magnetómetro-susceptibilímetro Maníes DSM-8 (Francia). Todas las medidas se realizaron a 25.0 ± 0.5 eC, ya que a esta temperatura se realizó la preparación y el almacenamiento de las suspensiones.
La figura 6 recoge el ciclo de histéresis de las nanopartículas de Fe304 y de las compuestas Fe304/PCL. En el caso de los núcleos puros de magnetita, no se observó histéresis por el carácter superparamagnético de éstos. Este superparamagnetismo fue consecuencia del pequeño tamaño de la Fe304 (< 20 nm).
De la región lineal del ciclo de histéresis (zona de campo magnético bajo) se estimó la susceptibilidad magnética inicial Otf) de las partículas compuestas Fe304/PCL: 3.13 ± 0.17; y, el valor de la magnetización de saturación 258 ± 7 emu/g. Las partículas compuestas Fe304/PCL obtenidas en las mejores condiciones posibles (relación 2:4 de masas iniciales Fe304:PCL) tuvieron unas propiedades magnéticas muy superiores a las de coloides de igual composición (Fe304/PCL), p. ej., valores de magnetización de saturación: ~ 8 emu/g [Hamoudeh y Fessi, 2006], ~ 17.6 emu/g [Yang y cois., 2006], y « 10.2 emu/g [Gang y cois., 2007].
Estas propiedades magnéticas de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL del sistema coloidal diseñado demuestra que dichas nanopartículas tenían las características adecuadas para su utilización en el transporte de fármacos a un órgano o tejido diana: un recubrimiento polimérico que permitirá el transporte de cantidades suficientes de fármaco y su liberación a una velocidad controlable, y una más que adecuada capacidad para responder a gradientes magnéticos aplicados. Esta respuesta a gradientes magnéticos aplicados debe mejorar notablemente la concentración en el lugar de acción de la dosis de nanopartículas Fe304/PCL administradas y, de esta manera, la total acumulación de la dosis de fármaco en la región diana (potenciación del efecto farmacológico y reducción de la toxicidad asociada a una extensa biodistribución).
De forma adicional, la capacidad de respuesta a campos magnéticos aplicados de las partículas de Fe304 y de Fe304/PCL fue analizada cualitativamente mediante visualización del efecto que ejerce un imán permanente sobre una suspensión acuosa de estas nanopartículas. En concreto, se prepararon sendas suspensiones acuosas coloidales con una concentración < 0.5 % (p/v). A una temperatura de 25.0 ± 0.5 eC, se puso en contacto la suspensión de Fe304 y la de Fe304/PCL con un campo magnético de 400 mT, y se observó el comportamiento de las nanopartículas en función del tiempo. Como puede apreciarse en la figura 7, las nanopartículas compuestas de Fe304/PCL fueron atraídas muy rápidamente por el imán, confirmando las grandes propiedades magnéticas del sistema diseñado. El sobrenadante quedó completamente transparente, en menos de 1 minuto. Por el contrario, la suspensión de nanopartículas de Fe304 mantuvo su aspecto homogéneo incluso tras 24 horas de exposición al gradiente magnético aplicado. El carácter superparamagnético de las nanopartículas de Fe304 justificó la ausencia de respuesta al gradiente magnético de 400 mT.
Con el fin de analizar el comportamiento microscópico de las suspensiones acuosas de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL, realizamos un seguimiento mediante microscopía óptica de éstas. Las suspensiones acuosas tenían una concentración del 0.1 % (p/v) de nanopartículas y la exposición a un gradiente magnético de 400 mT se realizó a 25.0 ± 0.5 eC. En concreto, una gota de suspensión acuosa de las nanopartículas magnéticas se colocó en un portaobjetos y fue sometida a un imán localizado en diferentes posiciones con respecto a la suspensión magnética. La visualización del efecto que el gradiente magnético aplicado ejerció sobre la suspensión de nanopartículas se realizó utilizando un microscopio óptico (magnificación: 40X).
Como puede apreciarse en la figura 8a, la suspensión acuosa de nanopartículas de Fe304/PCL fue muy homogénea en ausencia de un gradiente magnético aplicado. Sin embargo, cuando la gota de suspensión quedaba bajo la influencia del imán permanente de 400 mT, las partículas formaban agregados en forma de cadenas paralelas a la dirección del gradiente magnético (figura 8b en adelante).
El proceso de análisis de las condiciones óptimas de formulación de las nanopartículas de Fe304/PCL se completó con el estudio de las propiedades magnéticas de las partículas obtenidas según cada una de las relaciones de masa iniciales Fe304:PCL (desde 1 :4, hasta 4:1 ). La susceptibilidad inicial y la magnetización de saturación de cada uno de los tipos de partículas magnéticas compuestas quedan recogidas en la tabla 2. Estos parámetros magnéticos fueron calculados a partir del ciclo de histéresis de cada una de las muestras.
PROPORCIÓN DE MASAS SUSCEPTIBILIDAD MAGNETIZACIÓN DE INICIALES Fe304:PCL INICIAL (¿i) SATURACIÓN (emu/g)
4:01 0.62 ± 0.14 52 ± 8
4:02 2.38 ± 0.13 196 ± 7
4:03 2.78 ± 0.1 1 229 ± 6
4:04 3.07 ± 0.12 253 ± 6
3:04 3.04 ± 0.14 249 ± 8
2:04 3.13 + 0.17 258 ± 7
1 :04 2.44 ± 0.23 201 ± 9 Tabla 2. Propiedades magnéticas de las partículas compuestas magnetita/poli(£- caprolactona) (Fe304/PCL) obtenidas a partir de diferentes proporciones de masa inicial magnetita:polímero.
Como puede observarse en la tabla 2, las nanopartículas con mejores propiedades magnéticas fueron aquellas obtenidas a partir de una relación de masas inicial Fe304:PCL entre 4:4 y 2:4, debido principalmente a que las partículas así obtenidas albergaban un gran número de núcleos superparamagnéticos en su interior y, por lo tanto, presentaban una mayor capacidad para responder a gradientes magnéticos. Cuando la síntesis de las partículas compuestas se realizó con las proporciones 4:3 a 4:1 , el recubrimiento polimérico obtenido fue mucho más delgado y en su interior hubo un menor número de partículas de magnetita (figura 3a). Este efecto fue cada vez más patente conforme se incrementaba el exceso en núcleos superparamagnéticos utilizado en la síntesis. Así, las propiedades magnéticas fueron cada vez menores. Finalmente, cuando el exceso de polímero utilizado en la síntesis de las partículas compuestas era muy grande (relación de pesos iniciales 1 :4), las partículas superparamagnéticas quedaban embebidas por una cubierta de polímero tan grande que lograba reducir significativamente la magnetización de la muestra (figura 3c).
Estos resultados demostraron que con la relación de masas inicial Fe304:PCL de 2:4, se conseguían los mejores resultados para obtener unas nanopartículas magnéticas compuestas con las mejores características para su uso en el transporte magnético de fármacos hasta el órgano o tejido diana.
4.- Propiedades eléctricas superficiales
La determinación de las movilidades electroforéticas (ue) de las distintas suspensiones acuosas se llevó a cabo utilizando un dispositivo Malvern Zetasizer 2000 (Malvern Instruments, Inglaterra). La medida estaba basada en el análisis de la autocorrelación de la luz láser dispersada por las nanopartículas en movimiento. El aparato utilizado permitió determinar ue con errores ≤ 5 %. La temperatura de medida (25 eC) se mantuvo constante (hasta ± 0.2 eC) utilizando un módulo Peltier. Las suspensiones estudiadas tenían una concentración de nanopartículas ~ 0.1 % (p/v). Antes de preparar la suspensión se fijaba la concentración del electrolito (KN03) deseada y se ajustaba, en su caso, el pH con HN03 o KOH. Las medidas se realizaron tras 24 horas de contacto de las nanopartículas con el medio de dispersión a 25.0 ± 0.5 eC y bajo agitación mecánica (50 rpm). Los datos presentados fueron el promedio de 12 determinaciones, cambiando la muestra cada tres. La teoría de O'Brien y White [O'Brien y White, 1 978] se utilizó para convertir los valores de ue en potencial zeta { .
En el caso del estudio de la estabilidad de las propiedades eléctricas superficiales de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL, las medidas se realizaron de igual forma. La única diferencia introducida fue la composición del medio de dispersión de las nanopartículas: tampón NaOH-KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ).
Debido a que las propiedades de los óxidos de hierro son extremadamente sensibles a las variaciones del pH, lo cual no es predecible en el caso de la poli(£-caprolactona) debido a la naturaleza de los grupos responsables de su carga (los ácidos carboxílicos libres) , centramos en primer lugar nuestro estudio en el efecto del pH sobre el potencial zeta (ζ) de las nanopartículas. La figura 9 muestra la evolución del ^ de las nanopartículas en función del pH (con una fuerza iónica moderada constante: KN03 10"3 M). Como puede observarse, las nanopartículas de magnetita presentaron un punto isoeléctrico o pH de potencial zeta zero bien definido en torno a pH 7. En el caso del polímero, el punto isoeléctrico se encontraba en las proximidades del pH 5.5. A partir de estos valores la carga eléctrica superficial fue negativa. Esta diferencia entre el comportamiento electrocinético de las nanopartículas de Fe304 y de PCL convirtieron a la electroforesis en una herramienta muy útil para comprobar cualitativamente la eficacia del recubrimiento y, de esta manera la obtención de partículas compuestas Fe304/PCL. La figura 9 muestra cómo las nanopartículas Fe304/PCL presentaban un comportamiento casi idéntico a las de polímero puro. Por lo tanto, podemos concluir que el recubrimiento polimérico oculta muy eficazmente el núcleo magnético, haciendo que la superficie de las partículas compuestas sea indistinguible de la de las nanopartículas puras de polímero. Para confirmar estos resultados determinamos el ^de los tres tipos de nanopartículas en función de la concentración de KN03 a pH = 6 constante, siguiendo la misma metodología. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 10. De nuevo se observa la similitud entre la electrocinética del polímero y de las partículas compuestas Fe304/PCL, y las diferencias con respecto a la magnetita.
Con toda la información expuesta sobre las características superficiales de los materiales estudiados, demostramos el mecanismo por el que una matriz de ροΝ(ε- caprolactona) se deposita sobre los núcleos de magnetita y los engloba. En concreto, predecimos una interacción electrostática netamente atractiva entre las nanopartículas de magnetita con carga eléctrica positiva y el polímero con carga eléctrica negativa. Las condiciones ligeramente ácidas en las que se formulan las nanopartículas compuestas Fe304/PCL (pH = 6.0) determinaron estas cargas eléctricas superficiales (figura 9). Gracias a esta interacción electrostática de tipo netamente atractivo, fue posible la concentración del polímero en la superficie de la matriz polimérica de la magnetita. Hecho que favoreció la inclusión de los núcleos superparamagnéticos en el interior de la matriz polimérica y, por lo tanto, la formación de las partículas magnéticas compuestas Fe304/PCL.
La técnica de electroforesis también fue utilizada, siguiendo la misma metodología y rutina, para analizar las características y la eficacia del recubrimiento cuando cambia la relación de masas iniciales Fe304:PCL utilizada en la formulación de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL. La figura 1 1 muestra los valores de ue de las nanopartículas compuestas en un medio de dispersión acuoso, en presencia de una fuerza iónica moderada constante (KN03 10"3 M).
De forma muy patente, puede apreciarse cómo los valores de ue característicos de los núcleos magnéticos condujeron hacia los de las partículas de polímero puro al aumentar la cantidad de polímero utilizada en la relación de masas iniciales Fe304:PCL, principalmente por encima de 3:4. Por lo tanto, desde un punto de vista electroforético justificamos la utilización de una relación de masas iniciales 2:4 para la formulación de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL. Sólo así los valores de ue de las nanopartículas compuestas son indistinguibles de los de la PCL y, por lo tanto, el recubrimiento polimérico de los núcleos magnéticos fue óptimo y eficaz.
Las medidas electroforéticas de las suspensiones acuosas (concentración ~ 0.1 %, m/v) de magnetita y de nanocompuestos magnéticos se realizaron reproduciendo las condiciones fisiológicas (pH 7.4 ± 0.1 , y 37.0 ± 0.5 eC). El experimento se consideró finalizado cuando los valores de movilidad electroforética (ue) de las nanopartículas Fe304/PCL coincidían con los de las nanopartículas puras de Fe304, señal inequívoca de la pérdida del recubrimiento polimérico.
En la figura 12 se aprecia cómo los valores de ue de la magnetita permanecen constantes durante todo el período del estudio {ue ~ -3.5 μηνε ν-οηι 1). Este valor negativo de ue tan elevado fue debido a la formación en la superficie de la magnetita de una fina capa de oxidación (maghemita, un estado más oxidado de ésta). De hecho, los valores de ue de nanopartículas de maghemita de igual tamaño a la Fe304 (bajo las mismas condiciones experimentales) fueron muy similares (tve -3.6 μηνε Vv-cm"1).
En la figura 12 se ve como los valores de ue de las nanopartículas Fe304/PCL se aproximan progresivamente a los característicos de los núcleos magnéticos. En concreto, se hacen iguales tras 15 días. A partir de entonces, no se observaron diferencias significativas entre la ue de ambos materiales. Por tanto, la superficie de los núcleos de Fe304 de los nanocompuestos quedó cada vez más expuesta al medio de dispersión (de ahí los valores cada vez más negativos de ue), por la degradación progresiva del recubrimiento. Así, cuando la cubierta de polímero se perdía completamente, ambos valores de ue se hacían indistinguibles. Esta evolución tan progresiva de ue hacia los valores típicos de la Fe304, puso de manifiesto cualitativamente que la velocidad de degradación del polímero fue lenta, lo que ha sido asociado al alto grado de cristalinidad y a la gran hidrofobia de este polímero.
5.- Termodinámica superficial
El análisis termodinámico superficial de los núcleos de magnetita (Fe304), el recubrimiento polimérico [poli(£-caprolactona), PCL] y las nanopartículas Fe304/PCL, se realizó utilizando agua filtrada y desionizada (sistema Milli-Q Academia, Millipore, Francia), formamida (Cario Erba, Italia) y α-bromonaftaleno (Merck, Alemania). En la aplicación del modelo de van Oss se utilizaron los valores de las componentes de la tensión superficial de los líquidos de prueba utilizados (tabla 3) [van Oss, 2006].
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os líquidos utilizados en el experimento de medida del ángulo de contacto a 25.0 ± 0.5 eC.
La medida de los ángulos de contacto se realizó con un goniómetro Ramé-Hart 100- 0.7-00 (EE.UU.), que permite observar las gotas de líquido depositadas sobre un sólido. Este aparato dispone de un conjunto de tornillos micrométricos que permiten los desplazamientos verticales y horizontales del sustrato, así como de un limbo graduado para la medida del ángulo con una precisión de ± 1 e. El uso de una microjeringa Gimont (EE.UU.) permitió controlar el volumen de la gota depositada entre 2 y 4 μΙ_. Las medidas se realizaron a 25.0 ± 0.5 eC, utilizando una cámara termostática. La captura de las imágenes de las gotas de los líquidos depositados sobre la superficie de los materiales se realizó utilizando una cámara digital que tiene un dispositivo de carga acoplada ("charge-coupled device", CCD) y un sistema de análisis digital de imágenes.
Los ángulos de contacto de los líquidos seleccionados se determinaron sobre finas capas de los tres tipos de nanopartículas depositadas sobre unos portaobjetos de microscopio (placa de vidrio). Estas superficies lisas se obtuvieron tras la adicción de manera uniforme de una suspensión acuosa de cada tipo de nanomaterial (~ 10 %, p/v) sobre la superficie limpia y seca de una placa de vidrio. En la preparación de la muestra comprobamos que con la adición de 10 mL de suspensión acuosa de nanopartículas se obtenía una capa de material suficientemente gruesa. La desecación de los portaobjetos con cada una de las muestras se realizó a 35.0 ± 0.5 eC, utilizando un horno de desecación durante 24 horas. De esta manera, se obtuvo una capa de material muy uniforme a nivel macroscópico, la cual permitió que la medida de los ángulos de contacto se realizara en gotas muy estables.
En la figura 13, se recogen los valores promedio de los ángulos de contacto obtenidos tras realizar 16 determinaciones midiendo sobre una nueva gota después de cada dos medidas. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la existencia de importantes diferencias entre los núcleos de óxido de hierro y las nanopartículas magnéticas compuestas Fe304/PCL.
Para aportar una información física veraz sobre la termodinámica de los tres tipos de superficies fue necesaria la evaluación de las componentes ys. Los datos representados en la figura 14 confirman en gran medida nuestras estimaciones sobre la eficacia del recubrimiento de los núcleos magnéticos basadas en las propiedades electrocinéticas anteriormente analizadas. En particular, para cualquier componente de la energía libre superficial considerado, sus valores para las partículas magnéticas compuestas Fe304/PCL coinciden casi totalmente con los correspondientes al yLW polímero puro. Además, a pesar de que la componente Lifshitz-van der Waals ( / s ) fue la menos afectada por el tratamiento superficial, su valor para las nanopartículas Fe304/PCL fue casi el mismo que para el polímero. A pesar de que la componente electrón-aceptor ( s ) era muy pequeña para los tres tipos de materiales, su magnitud para las nanopartículas Fe304/PCL fue virtualmente cero e idéntico al correspondiente a la PCL, adquiriendo valores finitos para la magnetita. La contribución electrón- donante ( ^s ) muestro una diferencia mucho más notable entre los núcleos de óxido de hierro y las partículas magnéticas compuestas Fe304/PCL. El elevado valor de esta última componente en el caso de la magnetita confirma su carácter monopolar electrón-donante.
Los resultados mostraron que el recubrimiento de los núcleos magnéticos fue completo bajo las condiciones óptimas de la síntesis.
Las interacciones implicadas en la determinación de la energía libre superficial de los nanomateriales se manifiestan en fenómenos como la agregación de las nanopartículas en suspensión o su adhesión a diferentes sustratos.
La idea que subyace en nuestro estudio es que las metodologías empleadas, junto con su base teórica, permiten: i) especificar completamente la componente LW de la energía de interacción entre las partículas dispersas (contemplada, junto con la repulsión electrostática entre dobles capas eléctricas, en la teoría clásica DLVO); y ii) cuantificar igualmente las contribuciones no-DVLO a la energía total del sistema, las cuáles se relacionan con la componente AB de la teoría superficial tanto del sólido en suspensión como del líquido.
Consideramos aquí la importancia de los términos LW y AB de la energía de interacción entre los materiales descritos {fase 1) en un medio acuoso {fase 2):
AGm = AG% + AG£ (2)
ACLW ACAB
Los valores obtenidos de 121 y 121 se muestran en la tabla 4, donde puede apreciarse que para la magnetita, el intercambio energético debido a la componente LW es bastante menor que el asociado a la componente AB, siendo además negativo. Por tanto, la variación de la energía libre de interacción total es debida, principalmente, a la componente AB [Plaza y cois., 1998]. El hecho de que sea positiva la contribución AB en la magnetita, indica que su naturaleza fuertemente monopolar provoca una significativa repulsión entre las nanopartículas. La interacción LW debida a la contribución apolar, siempre atractiva en estos casos, es mucho menos intensa, provocando por ello un valor neto positivo para AG . Por el contrario, tanto las nanopartículas compuestas Fe304/PCL como el polímero tienen valores negativos de AG (atracción hidrófoba), que se añaden a la atracción de van der Waals. Sólido A ¾1 (mJ/m2) A ¾1 (mJ/m2) AGi2i (mJ/m2)
Fe304 -2.9 ± 0.4 14.9 ± 2.1 12.1 ± 1 .5
PCL -7.1 ± 1 .3 -1 .3 ± 0.4 -8.3 ± 2.1
Fe304/PCL -6.5 ± 1 .1 -0.7 ± 0.2 -7.2 ± 1 .5 Tabla 4. Energía libre de interacción entre las partículas y sus componentes AB y LWen medio acuoso.
Obviamente, estos cambios en la energía libre superficial se manifiestan en el carácter hidrófobo/hidrófilo de los diferentes nanomateriales estudiados. Podemos utilizar el siguiente criterio para determinar cuándo un material puede considerarse hidrófilo o hidrófobo [van Oss, 2006]: Si AGm resulta ser negativo, las interacciones interfaciales favorecen la atracción entre sí de las nanopartículas, y se consideran hidrófobas. Por
AC
el contrario, la hidrofilia se corresponde con valores positivos de 121 .
La figura 15 muestra los resultados obtenidos para los tres tipos de nanomateriales. Como puede apreciarse, la naturaleza hidrófila de la magnetita se pierde al ser recubierta por el polímero hidrófobo, lo que puede considerarse como un indicio muy claro de que dicho recubrimiento es eficaz.
Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad de vehiculización de fármacos
Evaluamos la vehiculización de dos fármacos antitumorales (doxorrubicina y 5- fluorouracilo) y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE, diclofenaco sódico) en las nanopartículas compuestas. Se siguieron dos metodologías para la incorporación de estos principios activos. En concreto, la adsorción superficial tras la formación e incubación de las nanopartículas en una disolución de principio activo (método de adsorción), y la adición en el momento en el que se generaban las nanopartículas, de forma que quedaba atrapado el principio activo principalmente en la matriz de éstas (método de absorción). Utilizamos la técnica de espectrofotometría UV-Vis como metodología de cuantificación de la cantidad de fármaco incorporada en las nanopartículas. Los experimentos se repitieron por triplicado para cada una de las concentraciones molares de fármaco.
La cantidad de fármaco incorporado se expresó en términos de eficacia de atrapamiento {entrapment efficiency, EE) (%) [(fármaco vehiculizado (mg) / cantidad total de fármaco utilizado (mg)) x 100] y de carga de fármaco {drug loading, DL) (%) [(fármaco vehiculizado (mg) / masa total utilizada de nanopartículas (mg)) x 1 00].
La determinación de la adsorción superficial de fármaco sobre las nanopartículas de compuestas Fe304/PCL se realizó partiendo de una serie de disoluciones acuosas (1 0 ml_) con diferente concentración molar de principio activo (10~5, 1 0~4, 10~3 y 10~2), salvo en el caso de la doxorrubicina donde la concentración máxima utilizada fue de 1 0~3 M. En todos estos medios de dispersión se fijó una concentración de nanopartículas del 1 % (p/v). Tras 24 horas de contacto de las nanopartículas con el fármaco a 25 eC ± 0.1 eC y bajo agitación mecánica (50 rpm), se obtuvieron los sobrenadantes mediante doble centrifugación a 1 1000 rpm durante 40 minutos y la cantidad de fármaco vehiculizada se evaluó mediante espectrofotometría UV-Vis. La tabla 5 recoge la cantidad vehiculizada en las nanopartículas de cada uno de los principios activos en función de la concentración de éstos fijada en la solución acuosa. Puede apreciarse cómo la concentración utilizada de fármaco influye positivamente en la vehiculización.
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Tabla 5. Eficacia de atrapamiento (%) y carga del fármaco de los fármacos en la superficie de las nanopartículas de Fe304/PCL, en función de la concentración de fármaco.
Una vez caracterizada la escasa incorporación de los tres fármacos en la superficie de las nanopartículas compuestas Fe304/PCL, estudiamos la contribución del método de vectorización de fármacos en sistemas transportadores: la incorporación del principio activo en el momento en que se produce la formación de las nanopartículas. Para ello, analizamos el efecto del principal factor condicionante de la captación de principio activo en la matriz de las nanopartículas: la propia concentración de fármaco. De esta manera, definimos las condiciones de vehiculización óptimas de estos principios activos en las nanopartículas compuestas magnéticas.
El análisis de la influencia de la concentración de estos principios activos sobre su incorporación en la matriz de las nanopartículas fue realizado siguiendo la rutina de síntesis y el procedimiento espectrofotométrico UV-Vis ya señalados. Las concentraciones molares utilizadas en el caso de la doxorrubicina fueron: 10"5, 10"4 y 10"3. Sin embargo, en el caso del 5-fluorouracilo y del diclofenaco sódico, además de las concentraciones citadas, también se utilizó una concentración 1 0"2 M. Los experimentos se repitieron por triplicado para cada una de las concentraciones molares de fármaco.
La tabla 6 recoge la cantidad vehiculizada en las nanopartículas de cada uno de los principios activos en función de la concentración de éstos fijada en la solución acuosa. Como puede apreciarse, la absorción de estos fármacos en la matriz de las nanopartículas aumenta con la concentración de éstos presente en el medio de síntesis. Los valores obtenidos de incorporación de cada uno de estos fármacos son superiores a los correspondientes mediante el procedimiento de adsorción superficial (a iguales concentraciones de principio activo), lo que justifica la selección del método de vehiculización mediante absorción en matriz como el más adecuado para la síntesis de las partículas compuestas Fe304/PCL cargadas con estos fármacos.
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Tabla 6. Eficacia de atrapamiento (%) y carga del fármaco de los fármacos en la matriz de las nanopartículas de Fe304/PCL, en función de la concentración de fármaco. Las nanopartículas compuestas Fe304/PCL formuladas bajos las condiciones óptimas de vehiculizacion de cada uno de los tres fármacos se utilizaron en los ensayos in vitro de liberación. Tales condiciones fueron: adsorción superficial 10"3 M de doxorrubicina, y, 10"2 M para 5-fluorouracilo y diclofenaco sódico. Concentraciones similares se utilizaron el caso de la absorción en matriz, procedimiento con el que se obtiene una mayor vehiculizacion de fármaco (tablas 5 y 6). El ensayo de liberación in vitro de cada uno de los fármacos desde las nanopartículas compuestas Fe304/PCL se realizó por triplicado a 37.0 ± 0.5 eC. Para ello, se utilizó el método de diálisis y un tampón NaOH- KH2P04 (pH = 7.4 ± 0.1 ) como medio de liberación. Las bolsas de diálisis se dejaron sumergidas en agua bidestilada durante 12 horas antes de comenzar el ensayo. La bolsa de diálisis utilizada (Spectrum® Spectra/Por® 6, EE.UU.) se caracteriza por un tamaño de poro de 2000 Da, que permite retener las nanopartículas en su interior, dejando sólo el fármaco liberado hasta el medio de liberación.
Las muestras del medio de liberación (1 mL) se recogieron según el siguiente intervalo de tiempos: 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 9 y 12 horas, y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 y 15 días. Las muestras fueron analizadas mediante espectrofotometría UV-Vis a las longitudes de onda de máxima absorbancia de cada uno de los principios activos (doxorrubicina: 481 nm, 5-fluorouracilo: 266 nm, y diclofenaco sódico: 276 nm). Un volumen igual de la solución tampón, mantenido a la misma temperatura, fue añadido al medio de liberación tras cada toma de muestra con el objetivo de mantener las condiciones sink.
En el caso del antitumoral doxorrubicina (figura 16), cuando se incorporaba esta molécula exclusivamente en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, la liberación de la dosis vehiculizada ocurría en sólo 4 horas. Por el contrario, si la incorporación de doxorrubicina se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 17 % de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora, mientras que el 83 % restante lo hacía mucho más progresivamente durante 1 1 días.
En cuanto al agente antineoplásico 5-fluorouracilo (figura 17), si era incorporado en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, su liberación ocurría en tan sólo 3 horas. Por el contrario, si la incorporación del fármaco se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 30 % de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora y el 70 % restante se liberaba en un total de 10 días. Finalmente en referencia al AINE diclofenaco sódico (figura 18), cuando se incorporaba esta molécula exclusivamente en la superficie de las nanopartículas mediante adsorción, la liberación de la dosis vehiculizada ocurría en sólo 2 horas. Por el contrario, si la incorporación se realizaba mediante el método de absorción en matriz, el 33 % de la dosis vehiculizada se liberaba durante la primera hora y el 67 % restante se liberaba en un total de 7 días.
En el caso de los 3 fármacos, el proceso de liberación fue claramente bifásico cuando la dosis de principio activo se incorporaba en las nanopartículas compuestas Fe304/PCL mediante el procedimiento de absorción en matriz. En estos casos, la liberación constaba de una fase rápida que significaba la pérdida del principio activo asociado a la superficie o débilmente atrapado (adsorbido en los poros superficiales). La liberación de fármaco más sostenida en el tiempo que se producía durante la segunda fase, fue debido a un proceso de difusión del fármaco a través de la matriz polimérica.
Estos resultados demuestran la gran capacidad de las nanopartículas magnéticas de la presente invención para el transporte de una amplia variedad de fármacos y, por lo tanto, su versatilidad como sistema magnético transportador de principios activos.
Ejemplo 3: capacidad hipertérmica de las nanopartículas de la presente invención La capacidad de generar calor de las nanopartículas de Fe304/PCL bajo la acción de un gradiente electromagnético alterno fue ensayada in vitro a 25.0 ± 0.5 eC, por triplicado. Para ello, se prepararon 5 mL de una suspensión acuosa de estas nanopartículas (10 mg/mL). La frecuencia y la intensidad del gradiente magnético utilizado fueron 250 kHz y 4 kA/m, respectivamente.
La figura 19 muestra el calentamiento in vitro de la suspensión acuosa de nanopartículas en función del tiempo. Bajo la exposición a un gradiente electromagnético alterno de alta frecuencia, la oscilación de los momentos magnéticos de las nanopartículas Fe304/PCL provocó que éstas generaran calor, alcanzándose la temperatura mínima de hipertermia (~ 41 eC) tras 25 minutos. La suspensión alcanzó una temperatura máxima de 45 eC tras 35 minutos. Como puede apreciarse en la figura, esta temperatura fue mantenida de forma estable durante toda la duración del experimento. Esta circunstancia fue especialmente interesante, ya que numerosas investigaciones han puesto de manifiesto que el calentamiento a esta temperatura de una masa de células tumorales durante unos 30 minutos, provoca daños irreversibles en éstas e induce su muerte [Huber, 2005]. Además, la estabilización de la temperatura a 45 eC, demostró el buen control sobre la temperatura y el flujo de calor que ofrecían las nanopartículas, un requisito básico para su aplicación en hipertermia. Esto es especialmente importante si tenemos en cuenta que si la temperatura siguiera creciendo sin control (> 48 eC), los tejidos sanos que rodean la masa tumoral se quemarían y morirían.
Los resultados de los ejemplos descritos en la presente invención confirmaron que las nanopartículas compuestas magnetita/poli(£-caprolactona) constituyeron una nanoplataforma ideal para el transporte de fármacos hasta el lugar de acción, proceso facilitado enormemente por su óptima capacidad de respuesta a gradientes magnéticos aplicados. Su versatilidad en el transporte de moléculas activas supuso una mejora de la terapia antitumoral y del tratamiento de enfermedades inflamatorias de diverso origen. Finalmente, y en el caso del cáncer, su capacidad para la hipertermia, permite la terapia combinada (quimioterapia optimizada + hipertermia) mucho más eficaz contra el tumor.
Los resultados además demostraron que la técnica de formulación desarrollada en la presente invención simplificó considerablemente otras metodologías propuestas previamente [Hamoudeh y Fessi, 2006; Yang y cois., 2006; Gang y cois., 2007]. Ya que como muestra el ejemplo 1 se evita un paso intermedio que conduce a la obtención de partículas de magnetita hidrófoba, la cuál complica las etapas siguientes del proceso (muy difícil manipulación de estas partículas hidrófobas por extremada tendencia a formar agregados) y encarece la obtención de la nanoformulación final.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Nanopartícula mixta de liberación prolongada de principios activos caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro medio de entre 74-98 nm y comprende un núcleo de óxido de hierro, un recubrimiento biodegradable de poli (ε-caprolactona) y al menos un principio activo.
2. Nanopartícula mixta según la reivindicación 1 , caracterizada porque tiene un diámetro medio de 86 nm.
3. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el núcleo de óxido de hierro tiene un diámetro medio de entre 10- 14 nm
4. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el principio activo es un AINE.
5. Nanopartícula mixta según la reivindicación 4, donde el AINE es diclofenaco sódico.
6. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde el principio activo es un antitumoral.
7. Nanopartícula mixta según la reivindicación 6 donde el antitumoral es seleccionado de entre la doxorrubicina o 5'-fluorouracilo.
8. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento.
9. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 para el tratamiento del cáncer.
10. Nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación.
1 1 . Método para la preparación de una nanopartícula mixta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) síntesis del núcleo de magnetita mediante co-precipitación en solución acuosa, b) disposición interfacial de la poli (ε-caprolactona) en diclorometano junto con la nanopartícula de magnetita del paso a) en solución acuosa,
c) purificación de la partícula obtenida en el paso b)
d) adición del principio activo
12. Método según la reivindicación 1 1 , donde el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante adsorción superficial sobre las nanopartículas obtenidas tras el paso c)
13. Método según la reivindicación 1 1 , donde el paso d) de adición del fármaco se realiza mediante absorción en la matriz de las nanopartículas en el paso b)
14. Composición farmacéutica que comprende una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso como medicamento.
16. Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para el tratamiento del cáncer.
17. Composición farmacéutica según la reivindicación 14 para el tratamiento de los procesos inflamatorios.
18. Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento.
19. Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
20. Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de los procesos inflamatorios.
21 . Uso de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 o la composición farmacéutica según reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento que se aplica en terapias realizadas mediante hipertermia electromagnética.
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