WO2013051266A1 - タウ凝集阻害剤 - Google Patents

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WO2013051266A1
WO2013051266A1 PCT/JP2012/006363 JP2012006363W WO2013051266A1 WO 2013051266 A1 WO2013051266 A1 WO 2013051266A1 JP 2012006363 W JP2012006363 W JP 2012006363W WO 2013051266 A1 WO2013051266 A1 WO 2013051266A1
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isoprenaline
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aggregation inhibitor
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明彦 高島
義行 添田
長田　裕之
康夫 井原
知宏 宮坂
八郎 杉本
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独立行政法人国立長寿医療研究センター
学校法人同志社
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Definitions

  • the present invention relates to a tau aggregation inhibitor that inhibits formation of tau aggregates that cause nerve loss and synapse loss.
  • AD Alzheimer's disease
  • Dementia is a type of dementia whose main symptoms are cognitive decline and personality changes.
  • Dementia is a common disease that affects about 25% of the Japanese population over the age of 85, and AD accounts for about half of the population.
  • AD accounts for about half of the population.
  • acetylcholinesterase inhibitors currently being effective for the prevention and treatment of AD are only partially effective in mild to moderate patients, and a negative view of their effectiveness in patients with advanced disease There are many.
  • AD neuropathological findings in AD patients are characterized by two features: senile plaques composed of ⁇ -amyloid and neurofibrillary tangles (NFT) formed by abnormal polymerization of tau protein
  • NFT neurofibrillary tangles
  • Tau protein is abundant in central neurons and is essential for the function of the nerve axons that make up the neural network of the brain. However, if tau protein forms insoluble aggregates in cells, axonal transport is successful. It causes the death of nerve cells.
  • Patent Document 1 describes a drug mainly composed of a naphthoquinone type compound that inhibits tau aggregation for the improvement of AD symptoms. According to this drug, intracellular tau aggregation is suppressed to some extent, and thus, the symptoms of AD are alleviated by suppressing the formation of NFT.
  • tau aggregation inhibitor does not have sufficient inhibition of intracellular tau aggregation, and it cannot be said that tauopathy including AD is treated accurately.
  • the present invention has been made in view of such problems, and an object thereof is to provide a tau aggregation inhibitor capable of sufficiently suppressing intracellular tau aggregation.
  • the tau aggregation inhibitor of the present invention is characterized by containing isoprenaline or a salt thereof.
  • Isoprenaline can be in d-form.
  • isoprenaline can be in d / l form.
  • d-isomer or d-isoprenaline means (S)-(+)-isoprenaline, d / l-isomer or d / l-isoprenaline means (S)-(+)-isoprenaline, (R)- (-)-Isoprenaline mixture is shown.
  • the tau aggregation inhibitor of the present invention comprises a catechol structure-containing compound or a salt thereof selected from the group consisting of dopamine, dobutamine, levodopa, levodopa / carbidopa, trimethquinol, hexoprenalin, methyldopa, and droxidopa. To do.
  • intracellular tau aggregation can be sufficiently suppressed.
  • AD tauopathy
  • many societies have been improved by improving the lives of the elderly, reducing the burden of care, and reducing medical expenses. Contribution can be made.
  • FIG. 2 is a graph showing thioflavin T activity, of which (a) is (R)-( ⁇ )-epinephrine, (b) is levodopa, (c) is dopamine, (d) is norepinephrine, (e) is thioflavin T of isoprenaline.
  • the activity suppression effect is shown. It is a result of SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE Western blotting showing the effect of inhibiting aggregation of tau detected by sucrose density gradient centrifugation, of which (a) is (R)-(-)-epinephrine, (b ) Shows the results for isoprenaline.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the increase in the amount of tau and acetylated tubulin in the microtubule fraction of isoprenaline, of which (a) is the tau of the microtubule fraction, (b) is the tau of the total fraction, (c) Is a graph of (a) showing that isoprenaline increases the amount of tau in the microtubule fraction. (D) acetylated tubulin in the microtubule fraction, (e) detected acetylated tubulin in the total fraction, (f) graphed (d), and isoprenaline in the microtubule fraction. It shows increasing the amount of acetylated tubulin.
  • FIG. 1 shows the increase in the amount of tau and acetylated tubulin in the microtubule fraction of isoprenaline, of which (a) is the tau of the microtubule fraction, (b) is the tau of the total fraction, (c) Is a graph of
  • FIG. 5 is a graph showing a decrease in sarkosyl-insoluble tau in the brain by isoprenaline in a mouse overexpressing human P301L mutant tau (P301L tau Tg mouse), of which (a) shows a detected sarkosyl-insoluble fraction, (b ) Is a graph of (a) showing that isoprenaline reduces the amount of sarkosyl-insoluble tau in the brain of P301L tau Tg mice.
  • FIG. 1 It is a figure which shows that the isoprenaline suppresses the reduction
  • FIG. 4 is a graph showing increased dephosphorylation of TBS soluble tau by isoprenaline in mice overexpressing wild-type tau (WT tau Tg mice), of which (a) shows the detection of dephosphorylation of TBS soluble fraction with tau1 antibody. (B) shows the ratio of dephosphorylated tau to tau. It is a figure which shows the change of the thioflavin T activity by d-isoprenaline, (a) is d-isoprenarin, (b) has shown the thioflavin T activity inhibitory effect of d / l-isoprenaline.
  • (C) is a graph showing a measurement of the diameter of tau aggregates, which shows that d-isoprenalin reduces the number of granular tau aggregates and tau fibers.
  • the cerebral cortex of P301L tau Tg mice it is a diagram showing the decrease of sarkosyl-insoluble tau by d-isoprenalin, of which (a) shows tau of sarkosyl-insoluble fraction, and (b) shows tau in TBS-soluble fraction.
  • GAPDH intrasic control.
  • the catechol structure-containing compound here is a compound containing a catechol structure in the structural formula.
  • the catechol structure means a structure of catechol, which is a compound in which two of the substituents are hydroxyl groups, and the two hydroxyl groups are in a 1-position and 2-position relationship.
  • the catechol structure-containing compound is specifically selected from the group consisting of isoprenaline, dopamine, dobutamine, levodopa, levodopa / carbidopa, trimethquinol, hexoprenalin, methyldopa and droxidopa.
  • these catechol structure-containing compounds may be used singly or in combination.
  • isoprenaline As isoprenaline, any of l-form (R configuration), d-form (S configuration), or d / l-form can be suitably used.
  • the side effects of isoprenaline include increased heartbeat and myocardial ischemia, and isoprenaline has a stronger effect in the l form than in the d form, and the degree of the side effect is larger in the order of the l form, d / l form, and d form. .
  • d-isoprenalin has almost the same tau aggregation inhibitory effect as d / l-isoprenalin. Therefore, among optical isomers, d-isomer is considered to be most preferable when isoprenaline is used as a therapeutic agent for dementia in the sense that it has almost the same tau aggregation inhibitory effect but has few side effects.
  • the salts of these catechol structure-containing compounds are pharmacologically acceptable salts such as alkali metal salts (for example, potassium salts, sodium salts), alkaline earth metal salts (for example, magnesium salts, calcium salts, etc.), etc.
  • alkali metal salts for example, potassium salts, sodium salts
  • alkaline earth metal salts for example, magnesium salts, calcium salts, etc.
  • alkali metal carbonates eg, lithium carbonate, potassium carbonate, sodium carbonate, cesium carbonate, etc.
  • alkali metal hydrogen carbonates eg, lithium hydrogen carbonate, sodium bicarbonate, potassium hydrogen carbonate, etc.
  • alkali metal hydroxides Salts of inorganic bases such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; trialkylamines such as trimethylamine and triethylamine; pyridine, quinoline, piperidine, imidazole, picoline, dimethylaminopyridine, dimethylaniline, N- Alkyl-morpholine, DBN, DB Salts of organic bases such as: salts of inorganic acids such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, nitrate, phosphate; formate, acetate, propionate, oxalate , Malonate, succinate, fumarate, maleate, lactate, malate, citrate, tartrate, citrate, carbonate, pic
  • the tau aggregation inhibitor according to this embodiment can also contain at least one effective amount selected from the group consisting of a catechol structure-containing compound and a salt thereof together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier a solid such as an excipient or a liquid such as a diluent is used. Specific examples include magnesium stearate, lactose, starch, gelatin, agar, talc, pectin, gum arabic, olive oil, sesame oil, cocoa butter, ethylene glycol, distilled water and the like.
  • Tauopathy is a neurodegenerative disease in which phosphorylated tau is accumulated in nerve cells and glial cells.
  • Tauopathy is, for example, AD, Down's syndrome, Pick's disease, cortical basal ganglia degeneration (CBD), progressive supranuclear palsy (PSP) and the like.
  • the tau aggregation inhibitor according to this embodiment is appropriately mixed with one or more additives selected from pharmaceutically acceptable isotonic agents, buffers, solubilizers, preservatives, and pH adjusters. Can do.
  • the isotonic agent for example, potassium chloride, sodium chloride, boric acid, mannitol, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, maltose, sucrose, sorbitol, glucose and the like can be used.
  • buffer examples include organic acids such as amino acids and succinic acid, inorganic acids such as boric acid and phosphoric acid, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • solubilizing agents include polymers such as polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, and hydroxypropyl methylcellulose; surfactants such as polysorbate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and polyoxyethylene polyoxypropylene; propylene glycol and the like Polyhydric alcohols; organic acids such as benzoic acid and sorbic acid; amino acids such as aspartic acid, histidine, glycine and lysine can be used.
  • preservative examples include quaternary ammonium salts such as benzethonium, benzalkonium, and benzododecinium, salts of cationic compounds such as chlorhexidine, and paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate and propyl paraoxybenzoate.
  • quaternary ammonium salts such as benzethonium, benzalkonium, and benzododecinium
  • salts of cationic compounds such as chlorhexidine
  • paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate and propyl paraoxybenzoate.
  • Alcohol compounds such as chlorobutanol and benzyl alcohol can be used.
  • pH adjusters include sulfuric acid, hydrochloric acid, acetic acid, lactic acid, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide, magnesium hydroxide, monoethanolamine, triethanolamine, diisopropanolamine, triisopropanolamine, etc. can do.
  • the dose of the tau aggregation inhibitor according to this embodiment is not particularly limited as long as an appropriate effect is produced, and is appropriately determined in consideration of the symptom level, sex, age, etc. of the patient to be administered.
  • the amount of the tau aggregation inhibitor can be 0.0001 to 1000 mg per adult per day. This daily dose may be administered once a day, but is preferably divided into several times a day.
  • the tau aggregation inhibitor according to this embodiment can be prepared in a dosage form according to the administration mode.
  • the oral administration form include solid preparations such as granules, pills, tablets, capsules, powders, and liquids, and liquid forms.
  • parenteral administration form it can be set as injection forms, such as an intravenous injection and an intramuscular injection, for example.
  • tau When tau is phosphorylated, it associates to form a tau oligomer. When this tau oligomer grows and has a ⁇ -sheet structure, spherical granular tau aggregates are formed. Granular tau aggregates are thought to be composed of about 40 tau molecules. These granular tau aggregates are linked to form a tau fiber called a paired helical filament (PHF) (NFT).
  • PHF paired helical filament
  • the tau aggregation inhibitor according to the present embodiment not only inhibits tau aggregation in the process in which granular tau aggregates are linked to form PHF, but also tau aggregation in the process of forming spherical granular tau aggregates. It also inhibits. Moreover, degeneration of brain neurons occurs not only by mutant tau protein but also by accumulation of normal tau protein, but the tau aggregation inhibitor of the present invention also inhibits aggregation of normal tau protein. Therefore, it becomes possible to prevent or treat tauopathy symptoms including AD.
  • Example 1 We searched for compounds that can bind to tau. 10 ⁇ M 2N4R tau (Tau-441 human) and 10 ⁇ M heparin were mixed and incubated at 37 ° C. to aggregate tau. This agglomerated tau sample (1 ml) was loaded into a sucrose density gradient solution (20 ml, 30%, 40%, 50% in 1 ml layers) and centrifuged (200000xg, 2 h, 20 ° C.). Thereafter, 1 ml each of the solution was collected from the upper layer to obtain a sample of fraction (Fr) 1-5. The pellet was suspended in HEPES solution to give Fr6. Thereafter, the binding ability between tau contained in Fr1, 3, and 5 and predetermined 6600 compounds was analyzed by the surface plasmon resonance method.
  • the surface plasmon resonance method is a technique for analyzing the intermolecular interaction between two kinds of substances by monitoring a change in refractive index caused by a change in the weight of a molecule fixed on a thin gold film.
  • the surface plasmon resonance method can be performed by a commercially available surface plasmon resonance apparatus, for example, BIAcore 2000 (manufactured by Pharmacia Biosensor). As a result, it was found that 111 compounds out of 6600 compounds bind to tau.
  • Example 2 Next, whether or not (R)-( ⁇ )-epinephrine and pyrocatechol violet similar structures suppress tau aggregation was analyzed by thioflavin T staining.
  • levodopa, dopamine, norepinephrine, and isoprenaline significantly reduced thioflavin T activity, similarly to (R)-( ⁇ )-epinephrine.
  • 1 (a) is (R)-( ⁇ )-epinephrine
  • FIG. 1 (b) is levodopa
  • FIG. 1 (c) is dopamine
  • FIG. 1 (d) is norepinephrine
  • FIG. 1 (e) isisoprenaline. Shows changes in thioflavin T activity due to.
  • FIG. 2 (a) shows the tau aggregation inhibitory effect of (R)-( ⁇ )-epinephrine
  • FIG. 2 (b) shows the tau aggregation inhibitory effect of isoprenaline.
  • isoprenaline is an existing drug and is considered to be safer than other catecholamine drugs. Therefore, below, it analyzed using isoprenaline.
  • Example 3 Next, it was examined whether isoprenaline suppresses tau aggregation in cultured cells.
  • the cells used were Neuro2a cell line in which human P301L mutant tau (tau in which the 301 th proline of the tau isoform was mutated to leucine) was expressed in a stable manner. These cells were treated with isoprenaline at concentrations of 0.01, 0.1 and 1 ⁇ M for 48 hours. Thereafter, SDS-insoluble fractions were collected and examined for changes in the amount of tau. As a result, as shown in FIG.
  • isoprenaline is a positive control GSK3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 ⁇ ) inhibitor (meaning a substance that physically or chemically inhibits the function of GSK3 ⁇ ) and lithium chloride.
  • GSK3 ⁇ glycose kinase 3 ⁇
  • Fig. 3 (a) shows the detection of tau in the SDS-insoluble fraction
  • Fig. 3 (b) is a graph of Fig. 3 (a)
  • isoprenaline shows that the amount of SDS-insoluble tau is decreased. Show.
  • FIG. 4 (a) shows the detection of phosphorylated tau (AT8 site) and tau in the RIPA soluble fraction
  • FIG. 4 (b) shows the ratio of phosphorylated tau to tau.
  • Example 4 It is known that tau phosphorylation of AT8 induces tau structural changes (detectable with MC1 antibody) observed in AD pathology. Therefore, WT tau was expressed in COS-7 cells (derived from African green monkey kidney), and tau structural change was detected by dot blot method using MC1 antibody. In the dot blot method, proteins are immobilized on a nitrocellulose membrane or PVDF membrane without being separated by electrophoresis, and the amount of protein is specifically quantified with an enzyme-labeled antibody. As a result, as shown in FIGS. 5 (a) and 5 (b), isoprenaline decreased the tau structural change detected with the MC1 antibody.
  • FIG. 5 (a) and 5 (b) isoprenaline decreased the tau structural change detected with the MC1 antibody.
  • FIG. 5 (a) shows MC1 antibody positive tau, tau phosphorylation (AT8 site), tau and GAPDH (endogenous control) detected in the TBS soluble fraction
  • FIG. 5 (b) shows MC1 antibody against tau. The percentage of positive tau is indicated.
  • isoprenaline also decreased phosphorylation under the same conditions.
  • FIG. 5C shows the ratio of phosphorylated tau to tau.
  • Example 5 We investigated how isoprenaline affects the binding of microtubules to tau.
  • COS-7 cells expressing WT tau were treated with 10 ⁇ M of isoprenaline for 24 hours and then homogenized with RA buffer (0.1 ⁇ M MES, 0.5 mM MgSO 4 , 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0.1% TritonX-100, 20 ⁇ M taxol, 2 mM GTP) did. After centrifugation at 3000 ⁇ g for 5 minutes at 25 ° C., the supernatant was collected as a total fraction.
  • RA buffer 0.1 ⁇ M MES, 0.5 mM MgSO 4 , 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0.1% TritonX-100, 20 ⁇ M taxol, 2 mM GTP
  • microtubule fraction was collected from COS-7 cells expressing WT tau, and acetylated tubulin, which is an indicator of tau and microtubule stabilization, was detected.
  • FIG. 6A shows the tau of the microtubule fraction
  • FIG. 6B shows the tau of the total fraction
  • FIG. 6C is a graph of FIG. 6A.
  • FIG. 6 (d) is the acetylated tubulin of the microtubule fraction
  • FIG. 6 (e) is the acetylated tubulin of the total fraction
  • FIG. 6 (f) is a graph of FIG. 6 (d). It is.
  • Example 6 it was examined whether isoprenaline suppresses tau aggregation in mice.
  • P301L tau Tg mice were ingested for 3 months with isoprenaline (1.5 mg / g fed) mixed in powdered diet. Thereafter, cerebral cortex and hippocampus were collected from the mice and stored at ⁇ 80 ° C.
  • cerebral cortex and hippocampus were collected from the mice and stored at ⁇ 80 ° C.
  • a TBS solution was added to the frozen tissue, homogenized, and then centrifuged (23000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to separate into a supernatant and a pellet. Among them, the supernatant was used as a TBS soluble fraction (including soluble tau).
  • sucrose was added to the pellet, homogenized again, and then centrifuged (23000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to separate into a supernatant (including tau aggregates) and a pellet (including nuclei). Thereafter, a surfactant (1% sarkosyl) was added to the supernatant, incubated (37 ° C., 1 h), and centrifuged (200000 ⁇ g, 1 h, 4 ° C.). The pellet was dissolved in a Remli buffer (containing 2-mercaptoethanol) to obtain a sarkosyl insoluble fraction. Tau in TBS soluble fraction and sarkosyl insoluble fraction was detected by SDS-PAGE Western blot.
  • a surfactant 1% sarkosyl
  • FIG. 7 shows the detection of tau in the sarkosyl-insoluble fraction
  • FIG. 7B shows the quantitative and graphed result of FIG. 7A.
  • Ntg means Non-transgenic mouse.
  • Example 7 In the brain of P301L tau Tg mice, the number of neurons decreases as tau aggregation progresses. For this reason, isoprenaline having a tau aggregation inhibitory action may be able to improve this decrease in the number of neurons. Therefore, brain slices were prepared from mice treated with isoprenaline, and the number of neurons was counted. As a measurement method, a 0.1 mm2 box as shown in Fig. 8 (a) is drawn on the entorhinal cortex or temporal area, and the number of cells in the box is counted and averaged. The result was taken as the value of 1 slice. Two slices were prepared from one individual. As a result, as shown in Fig. 8 (b) and Fig.
  • isoprenaline suppressed the decrease in the number of cells in the entoehinal cortex and temporal area exhibited by P301L tau Tg mice. did. Therefore, it was suggested that isoprenaline may improve the decrease in the number of neurons by suppressing tau aggregation.
  • Mice is the number of mice used
  • Slice is the number of slices per individual for which the number of cells was measured.
  • Example 8 The change of tau phosphorylation in TBS soluble fraction collected from WT tau Tg mice was examined. As a result, as shown in FIG. 9, isoprenaline increased the dephosphorylation of tau recognized by the monoclonal antibody tau1.
  • FIG. 9A shows the TBS soluble fraction
  • FIG. 9B shows the ratio of dephosphorylated tau to tau. Therefore, it was suggested that isoprenaline suppresses tau aggregation and tau phosphorylation in mice.
  • Example 2 shows the effect by isoprenaline
  • the catecholamine structure skeleton has been found as a novel common skeleton that suppresses tau aggregation (Example 2 above)
  • Example 9 Tau (10 ⁇ M), d- and d / l-isoprenalin (1-100 ⁇ M) and thioflavin T were mixed. Heparin was then added and incubated at 37 ° C. to aggregate tau. In addition, at the time indicated in the figure, the thioflavin T activity in the incubation sample was measured, and the tau aggregation inhibitory action by the compound was examined.
  • FIG. 10 (a) is a diagram in which the effect of d-isoprenaline on the activity of thioflavin T is examined. As shown in FIGS. 10 (a) and 10 (b), d-isoprenalin exhibited almost the same thioflavin T activity inhibitory action as d / l-isoprenalin.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE Western blotting showing the effect of suppressing tau aggregation detected by sucrose density gradient centrifugation, in which d-isoprenalin is shown in FIG. 11 (a) and FIG. 11 (b) is shown. Results for d / l-isoprenalin are shown.
  • d-isoprenalin clearly reduces tau (granular tau aggregates and tau fibers) detected after Fr3 in substantially the same manner as d / l-isoprenalin. It was.
  • FIG. 12 is a diagram showing the morphological change of tau aggregation using an atomic force microscope, in which FIG. 12 (a) is a photograph of a control, and FIG. 12 (b) is a d ⁇ for a tau aggregation sample.
  • P301L tau Tg mice were used. 20- to 21-month-old P301L tau Tg mice were ingested with d-isoprenalin (2.168 mg / g fed) mixed for 3 months. Thereafter, cerebral cortex and hippocampus were collected from the mice and stored at ⁇ 80 ° C. Thereafter, TBS soluble fraction and sarkosyl insoluble fraction were prepared from these brain tissues, and tau was detected by SDS-PAGE Western blotting.
  • FIG. 13 is a diagram showing a decrease in sarkosyl-insoluble tau by d-isoprenalin in the cerebral cortex of P301L tau Tg mice, of which FIG. 13 (a) shows the tau of the sarkosyl-insoluble fraction, and FIG. 13 (b) shows the TBS-soluble fraction. In which Tau and endogenous control GAPDH were detected.
  • FIG. 14 is a graph showing a decrease in sarkosyl-insoluble tau by d-isoprenalin in the cerebral cortex of P301L tau Tg mice, and FIG. 14 (a) shows the ratio of sarkosyl-insoluble tau to TBS-soluble tau as shown in FIG. b) shows the ratio of tau to GAPDH in the TBS soluble fraction.
  • d-isoprenalin clearly reduced the amount of insoluble tau in the cerebral cortex of P301L tau Tg mice.
  • FIG. 15 is a graph showing a decrease in sarkosyl-insoluble tau by d-isoprenalin in the hippocampus of P301L tau Tg mice, of which FIG. 15 (a) shows the tau of the sarkosyl-insoluble fraction and FIG. 15 (b) shows the TBS-soluble fraction. Tau and endogenous control GAPDH were detected.
  • FIG. 15 (a) shows the tau of the sarkosyl-insoluble fraction
  • FIG. 15 (b) shows the TBS-soluble fraction. Tau and endogenous control GAPDH were detected.
  • FIG. 16 is a graph showing a decrease in sarkosyl-insoluble tau by d-isoprenalin in the hippocampus of P301L tau Tg mice.
  • FIG. 16 (a) shows the ratio of sarkosyl-insoluble tau to TBS-soluble tau in FIG. b) shows the ratio of tau to GAPDH in the TBS soluble fraction.
  • d-isoprenalin clearly reduced the amount of insoluble tau in the hippocampus of P301L tau Tg mice.

Abstract

　細胞内のタウ凝集を十分に抑制できるタウ凝集阻害剤を提供する。イソプレナリン、ドーパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ及びドロキシドパからなる群から選ばれたカテコール構造含有化合物又はその塩を含む。好ましくはイソプレナリンである。対象となるタウオパチーは、例えば、AD、ダウン症、Pick病、皮質基底核変性症(CBD)、又は進行性核上性麻痺(PSP)である。

Description

タウ凝集阻害剤
　本発明は、神経脱落及びシナプス消失の原因となるタウ凝集体の形成を阻害するタウ凝集阻害剤に関する。
　アルツハイマー病（Alzheimer's disease;AD）は、認知機能低下や人格の変化を主な症状とする認知症の一種である。認知症は８５歳以上の日本人口の約２５％が発症するcommon diseaseであるが、ADがそのうち約半数を占めている。２０１１年の日本には約１６０～１８０万人のAD患者が存在し、今後の高齢化に従い患者数は増加の一途を辿る。これはとりわけ少子高齢化が進む我が国において深刻な問題となっている。
　ADの予防と治療について現在最も有効とされているアセチルコリンエステラーゼ阻害薬は、軽度乃至中度の患者に部分的に効果を有するのみであり、病状が進行した患者に対する有効性については否定的な見解が多い。
　AD患者の神経病理学的所見においてはβアミロイドからなる老人斑とタウタンパク質が異常に重合し形成される神経原線維変化（Neurofibrillary Tangles: NFT）の二つが特徴的であるにもかかわらず、現在のAD研究はアミロイドβペプチドの異常がAD発症の引き金であるとするアミロイドβ仮説に基づくものが主流である。
　しかしながら、家族性前頭側頭型認知症（FTDP）ではタウ遺伝子の変異によりNFTの形成が促進され認知症状が出現すること、タウタンパク質が脳内で凝集・蓄積するだけで神経細胞に異常が生ずること等が明らかとなってきている。そのため、近年、タウの凝集とAD発症との関係について大きな注目が集まっている。
　タウタンパク質は中枢神経細胞に多量に存在し、脳の神経ネットワークを構成する神経軸索の機能に必須なタンパク質であるが、タウタンパク質が細胞内で不溶性の凝集を作ると軸索輸送がうまくいかず、神経細胞の死を招く。
　特許文献１には、ADの症状改善のため、タウ凝集を阻害するナフトキノン型化合物を主成分とする薬剤が記載されている。この薬剤によれば細胞内のタウ凝集がある程度抑制されるため、NFTの形成が抑制されることによりADの症状が緩和される。
特表２００４－５３４８５４号公報
　しかし、上述のタウ凝集阻害剤では、細胞内のタウ凝集阻害の程度は十分ではなく、ADをはじめとするタウオパチーの治療が的確になされるとはいえない。
　本発明は斯かる問題点に鑑みてなされたものであって、細胞内のタウ凝集を十分に抑制できるタウ凝集阻害剤を提供することを目的とする。
　本発明のタウ凝集阻害剤は、イソプレナリン又はその塩を含むことを特徴とする。イソプレナリンはｄ体とすることが可能である。また、イソプレナリンはｄ/ｌ体とすることも可能である。但し、d-体又はd-イソプレナリンとは(S)-(+)-イソプレナリンを示し、d/l-体又はd/l-イソプレナリンとは(S)-(+)-イソプレナリン、(R)-(-)-イソプレナリンの混合物を示す。
　また、本発明のタウ凝集阻害剤は、ドーパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ及びドロキシドパからなる群から選ばれたカテコール構造含有化合物又はその塩を含むことを特徴とする。
　本発明によれば、細胞内のタウ凝集を十分に抑制できる。そのため、有効な治療法のなかったADをはじめとするタウオパチーに罹患した患者を救済し、高齢化社会を迎える現在において、高齢者の生活向上、介護負担軽減、医療費の削減等により多くの社会的貢献が可能となる。
チオフラビンT活性を示す図であり、そのうち（ａ）は(R)-(-)-エピネフリン、（ｂ）はレボドパ、（ｃ）はドーパミン、（ｄ）はノルエピネフリン、（ｅ）はイソプレナリンのチオフラビンT活性抑制効果を示している。 ショ糖密度勾配遠心法にて検出したタウの凝集抑制効果を示すSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)-PAGEウェスタンブロット法の結果であり、そのうち（ａ）は(R)-(-)-エピネフリン、（ｂ）はイソプレナリンの結果を示している。 イソプレナリンがSDS不溶性タウ凝集を低下することを示す図であり、そのうち（ａ）はSDS不溶性フラクションのタウを検出したもので、（ｂ）は（ａ）をグラフ化したものでイソプレナリンがSDS不溶性タウを減少させることを示している。 イソプレナリンのタウリン酸化抑制作用を示す図であり、そのうち（ａ）はRIPA可溶性フラクションのリン酸化タウ（AT8サイト）及びタウを検出したもので、（ｂ）は（ａ）をグラフ化したものでイソプレナリンがRIPA可溶性フラクションのリン酸化タウを減少させることを示している。 AD病態で観察されるタウの構造変化（MC1抗体で検出可）に対するイソプレナリンの効果を示す図であり、そのうち（ａ）はTBS可溶性フラクションのMC1抗体陽性タウ、タウリン酸化（AT8サイト）、タウ及びGAPDH（内在性コントロール）を検出したもので、（ｂ）はタウに対するMC1抗体陽性タウの比率であり、（ｃ）はタウに対するリン酸化タウの比率を示す。 イソプレナリンの微小管フラクションにおけるタウ及びアセチル化チューブリンの量の増加を示す図であり、そのうち（ａ）は微小管フラクションのタウ、（ｂ）はトータルフラクションのタウを検出したもので、（ｃ）は（ａ）をグラフ化したものでイソプレナリンは微小管フラクションにおけるタウの量を増加させることを示している。（ｄ）は微小管フラクションのアセチル化チューブリンを、（ｅ）はトータルフラクションのアセチル化チューブリンを検出したもので、（ｆ）は（ｄ）をグラフ化したものでイソプレナリンは微小管フラクションにおけるアセチル化チューブリンの量を増加させることを示している。 ヒトP301L変異体タウを過剰発現したマウス（P301L tau Tgマウス）において、イソプレナリンによる脳内のサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち（ａ）はサルコシル不溶性フラクションを検出したもので、（ｂ）は（ａ）をグラフ化したものでイソプレナリンはP301L tau Tgマウスの脳内におけるサルコシル不溶性タウの量を減少させることを示している。 イソプレナリンがP301L tau Tgマウスが示す神経細胞数の低下を抑制することを示す図であり、そのうち（ａ）は神経細胞数を測定した脳内領域と測定方法を示した図であり、（ｂ）はイソプレナリンが嗅内皮質における細胞数の低下を抑制した図であり、（ｃ）はイソプレナリンが側頭領域における細胞数の低下を抑制した図である。 野生型タウを過剰発現したマウス（WT tau Tgマウス）においてイソプレナリンによるTBS可溶性タウの脱リン酸化増加を示す図であり、そのうち（ａ）はTBS可溶性フラクションの脱リン酸化をtau1抗体で検出した図であり、（ｂ）はタウに対する脱リン酸化タウの比率を示す。 d-イソプレナリンによるチオフラビンT活性の変化を示す図であり、そのうち（ａ）はd-イソプレナリン、（ｂ）はd/l-イソプレナリンのチオフラビンT活性抑制効果を示している。 ショ糖密度勾配遠心法にて検出したd-イソプレナリンによるタウの凝集抑制効果を示すSDS-PAGEウェスタンブロット法の結果であり、そのうち（ａ）はd-イソプレナリン、（ｂ）はd/l-イソプレナリンの結果を示している。 原子間力顕微鏡を用いたd-イソプレナリンによるタウ凝集の形態学的変化を示す図であり、そのうち（ａ）はコントロールの写真図であり、（ｂ）はタウ凝集サンプルに対するd-イソプレナリンの効果を示す写真図であり、（ｃ）はタウ凝集体の直径を測定し、グラフ化したものでd-イソプレナリンは顆粒状タウ凝集体及びタウ線維の数を低下させることを示している。 P301L tau Tgマウスの大脳皮質において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち（ａ）はサルコシル不溶性フラクションのタウを検出したもので、（ｂ）はTBS可溶性フラクションでのタウ及びGAPDH（内在性コントロール）を検出したものである。 P301L tau Tgマウスの大脳皮質において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち（ａ）はTBS可溶性タウに対するサルコシル不溶性タウの比率を、（ｂ）はTBS可溶性フラクションにおいてGAPDHに対するタウの比率を示す。 P301L tau Tgマウスの海馬において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち（ａ）はサルコシル不溶性フラクションのタウを検出したもので、（ｂ）はTBS可溶性フラクションでのタウ及びGAPDH（内在性コントロール）を検出したものである。 P301L tau Tgマウスの海馬において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち（ａ）はTBS可溶性タウに対するサルコシル不溶性タウを、（ｂ）はTBS可溶性フラクションにおいてGAPDHに対するタウの比率を示す。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、カテコール構造含有化合物が、タウオパチーの予防及び治療に有益であるという新知見を見いだし、この事実に基づいて本発明を完成させた。ここでのカテコール構造含有化合物とは、構造式中にカテコール構造を含有する化合物である。カテコール構造とは、置換基の２つがヒドロキシル基であって、該２つのヒドロキシル基が１位と２位との関係にある化合物であるカテコールの構造を意味する。
　カテコール構造含有化合物は、具体的には、イソプレナリン、ドーパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ及びドロキシドパからなる群から選ばれる。本実施形態に係るタウ凝集阻害剤は、これらのカテコール構造含有化合物を単一で用いても良く、また複数を組み合わせて用いることも可能である。
　好ましくはイソプレナリンである。イソプレナリンは、ｌ体（Ｒ配置）、ｄ体（Ｓ配置）、又はｄ/ｌ体のいずれのものでも好適に用いることができる。イソプレナリンの副作用として心悸亢進、心筋虚血等があるところ、イソプレナリンはｌ体がｄ体に比べ作用が強く、これら副作用についてもｌ体、ｄ/ｌ体、ｄ体の順で副作用の程度が大きい。その一方で、後述するように、d-イソプレナリンはd/l-イソプレナリンとほぼ同様のタウ凝集抑制効果を有する。そのため、光学異性体の中でも、ほぼ同様のタウ凝集抑制効果を有しながらも副作用が少ないという意味においてイソプレナリンを認知症治療薬に使用する場合、ｄ体が最も好ましいと考えられる。
　これらカテコール構造含有化合物の塩は、薬理的に許容される塩であって、例えば、アルカリ金属塩（例えばカリウム塩、ナトリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等の金属塩、炭酸アルカリ金属（例えば、炭酸リチウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム等）、炭酸水素アルカリ金属（例えば、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）等の無機塩基の塩；トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン等）、ピリジン、キノリン、ピペリジン、イミダゾール、ピコリン、ジメチルアミノピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ－アルキル－モルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ等の有機塩基の塩；塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸の塩；ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ピクリン酸塩、メタンスルホン酸塩、グルタミン酸塩等の有機酸の塩等である。
　本実施形態に係るタウ凝集阻害剤は、カテコール構造含有化合物及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効量を、薬学的に許容される担体と共に含有することも可能である。担体は、賦形剤等の固体、又は、希釈剤等の液体が用いられる。具体的には、例えばステアリン酸マグネシウム、乳糖、スターチ、ゼラチン、寒天、タルク、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール、蒸留水等である。
　タウオパチーとは、神経細胞やグリア細胞内にリン酸化タウの蓄積がみられる神経変性疾患のことである。タウオパチーは、例えば、AD、ダウン症、Pick病、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)等である。
　タウオパチーの予防とは、タウオパチー障害が生じることを防ぐことを意味し、タウオパチーの治療とは、タウオパチー障害の進行を阻止、又は改善・軽減することを意味する。
　本実施形態に係るタウ凝集阻害剤は、製薬上許容される等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、ｐＨ調整剤から選択される１又はそれ以上の添加剤を適宜配合することができる。
　等張化剤としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、ホウ酸、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マルトース、ショ糖、ソルビトール、ブドウ糖等が使用できる。
　緩衝剤としては、例えば、アミノ酸、コハク酸等の有機酸、及び、ホウ酸、リン酸等の無機酸等、及びその医薬的に許容される塩類等が挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の高分子；ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポロオキシエチレンポリオキシプロピレン等の界面活性剤；プロピレングリコール等の多価アルコール；安息香酸、ソルビン酸等の有機酸；アスパラギン酸、ヒスチジン、グリシン、リジン等のアミノ酸等が使用できる。
　防腐剤としては、例えば、ベンゼトニウム、ベンザルコニウム、ベンゾドデシニウム等の第四アンモニウムの塩、クロルヘキシジン等の陽イオン化合物の塩、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール等のアルコール化合物等を使用することができる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、硫酸、塩酸、酢酸、乳酸、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を使用することができる。
　本実施形態に係るタウ凝集阻害剤の投与量は、適切な効果が生じる限り特に限定されるものではなく、投与される患者の症状の程度、性別、年齢等を考慮して適宜決定される。例えば、タウ凝集阻害剤の量が１日成人１人当たり０.０００１～１０００ｍｇとすることができる。この１日当たりの投与量は、１日に１回で投与してもよいが、１日に数回に分けて投与することが好ましい。
　本実施形態に係るタウ凝集阻害剤は、投与態様に応じた製剤形態に調製できる。経口投与形態としては、例えば、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤等の固形剤及び液剤形態とすることができる。また、非経口投与形態としては、例えば、静注、筋注等の注射剤形態とすることができる。
　タウはリン酸化されると会合してタウオリゴマーを形成する。このタウオリゴマーが成長しβシート構造を持つようになると、球状の顆粒状タウ凝集体が形成される。顆粒状タウ凝集体は約４０個のタウ分子によって構成されていると考えられる。この顆粒状タウ凝集体が連結して、ペアになった螺旋状フィラメント（paired helical filament：PHF）と呼ばれるタウ線維を形成する（NFT）。近年のマウスモデルを用いた研究では、タウの過剰発現をNFTが出来る時期に抑制するとマウスの記憶学習は改善されるが、NFTは形成され続けた。このことは、主として、NFTよりもそれを形成する過程で神経機能低下が起きていることが示唆される。NFT自体は毒性を持たず、そこに至るまでの凝集過程が神経毒性の主原因であると考えられる。本実施形態に係るタウ凝集阻害剤は、顆粒状タウ凝集体が連結してＰＨＦを形成する過程におけるタウ凝集を阻害するのみならず、球状の顆粒状タウ凝集体が形成される過程におけるタウ凝集をも阻害する。また、脳の神経細胞の変性は変異型タウタンパク質だけでなく、正常なタウタンパク質の蓄積でも起きるが、本発明のタウ凝集阻害剤は、正常なタウタンパク質の凝集をも阻害する。そのためADをはじめとするタウオパチー症状の予防又は治療が可能となる。
　（実施例１）
　タウと結合できる化合物を検索した。10μMの2N4Rタウ(タウ－４４１ ヒューマン)と10μMのヘパリンとを混合し、37℃でインキュベートし、タウを凝集させた。この凝集したタウサンプル（１ml）をショ糖密度勾配溶液（20%, 30%, 40%, 50%を１mlずつ重層）にロードし、遠心した（200000xg, ２h, 20℃）。その後、上層から１mlずつ溶液を回収し、フラクション（Fr）１-５のサンプルとした。また、ペレットはHEPES溶液に懸濁し、Fr６とした。その後、Fr1,3,5に含まれるタウと所定の6600の化合物との結合能を表面プラズモン共鳴法で解析した。表面プラズモン共鳴法とは、薄金膜上に固定した分子の重さの変化等によって生じる屈折率の変化をモニターすることにより、２種類の物質の分子間相互作用を解析する手法である。表面プラズモン共鳴法は、市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばBIAcore2000 (Pharmacia Biosensor社製)によって行うことが可能である。その結果、6600の化合物のうち、111個の化合物がタウと結合することを見出した。
　次に、この111個の化合物がタウ凝集を抑制するかどうかをチオフラビンT染色法を用いて解析した。10μMタウ、化合物（1μM,10μM,または100μM）及びチオフラビンＴ（βsheet構造特異的検出薬）を混合した。その後、タウ凝集インデューサーであるヘパリンを加え、37℃でインキュベーションし、タウを凝集させた。そして、様々な時間でインキュベーションサンプル中のチオフラビンT活性を測定し、化合物によるタウ凝集抑制作用を検討した。その結果、111個の化合物のうち9個の化合物が1μMといった低濃度で、チオフラビンT活性を顕著に抑制した。
　更に、これら9個の化合物のタウ凝集抑制作用を詳細に検討するため、37℃でインキュベーションした後のサンプルを、250000xgで２時間遠心分離し、ペレットを採取し、その中に含まれる不溶性タウの量を検出した。その結果、(R)-(-)-エピネフリン及びピロカテコールバイオレットは濃度依存的に不溶性タウの量を減少させた。この2個の化合物である(R)-(-)-エピネフリン及びピロカテコールバイオレットは、カテコール核という共通の骨格があることが判明した。
　（実施例２）
　次に、(R)-(-)-エピネフリン及びピロカテコールバイオレットの類似構造体が、タウ凝集を抑制するかどうかをチオフラビンT染色法により解析した。その結果、図１に示されるように、レボドパ、ドーパミン、ノルエピネフリン、及びイソプレナリンは、(R)-(-)-エピネフリンと同様に、チオフラビンT活性を顕著に減少させた。ここで、図１（ａ）は(R)-(-)-エピネフリン、図１（ｂ）はレボドパ、図１（ｃ）はドーパミン、図１（ｄ）はノルエピネフリン、図１（ｅ）はイソプレナリンによるチオフラビンT活性の変化を示している。
　この内、(R)-(-)-エピネフリンとイソプレナリンのサンプルをショ糖密度勾配遠心法によりFr1-Fr6に分離した後、SDS-PAGEウェスタンブロット法でタウを検出した。処置した化合物の濃度は100μMである。その結果、図２に示されるように、Controlでは、Fr3,4,5,6で観察される凝集タウが検出されたが、100μMの化合物はfr3,4,5,6のタウを減少させた。ここで、図２（ａ）は(R)-(-)-エピネフリンのタウ凝集抑制効果を、図２（ｂ）はイソプレナリンのタウ凝集抑制効果を示している。以上の結果より、in vitroで、タウ凝集を抑制する新規の共通骨格を見出した。なお、これら化合物の中でイソプレナリンは既存薬であり、さらに他のカテコラミン類の医薬品と比べ、安全性が高いことが考えられた。したがって、以下では、イソプレナリンを用いて解析した。
　（実施例３）
　次に、イソプレナリンが培養細胞において、タウ凝集を抑制するかどうかを検討した。細胞はヒトのP301L変異体タウ(タウアイソフォームの301番目のプロリンがロイシンに変異したタウ)をステーブルに発現したNeuro2a cell lineを使用した。これらの細胞にイソプレナリンを0.01、0.1及び1μMの濃度で48時間処置した。その後、SDS-不溶性フラクションを採取し、タウの量の変化を検討した。その結果、図３に示されるように、イソプレナリンは、ポジティブコントロールのGSK3β(グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β)阻害剤(GSK3βの機能を物理的又は化学的に阻害する物質を意味する)である塩化リチウムと同様にSDS不溶性タウの量を減少させた。ここで、図３（ａ）はSDS不溶性フラクションのタウを検出したものであり、図３（ｂ）は図３（ａ）をグラフ化したものでイソプレナリンはSDS不溶性タウの量を減少させることを示している。
　また、同様の細胞から採取したRIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay)緩衝液可溶性フラクションにおけるタウリン酸化の変化を検討した結果、図４に示されるように、イソプレナリンはAT8（抗リン酸化タウ抗体）で認識するタウリン酸化を低下させた。なお、RIPA緩衝液の組成は、50mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM 塩化ナトリウム, 0.25w/v%デオキシコール酸ナトリウム, 1mM EGTA, 1.0w/v% NP-40 substituteであった。このため、イソプレナリンはタウ凝集に加えて、タウのリン酸化抑制作用も有することが判明した。ここで、図４（ａ）はRIPA可溶性フラクションのリン酸化タウ（AT8サイト）及びタウを検出したもので、図４（ｂ）はタウに対するリン酸化タウの比率を示す。
　（実施例４）
　AT8のタウリン酸化はAD病態で観察されるタウの構造変化（MC1抗体で検出可）を誘発することが知られている。そこで、COS-7細胞（アフリカミドリザル腎由来）にWT tauを発現させ、MC1抗体を用いたドットブロット法でタウの構造変化を検出した。ドットブロット法は、タンパク質を電気泳動により分離することなくニトロセルロース膜やPVDF膜に固定し、酵素標識抗体でタンパク質量を特異的に定量する方法である。その結果、図５（ａ）（ｂ）に示されるように、イソプレナリンはMC1抗体で検出されるタウの構造変化を減少させた。ここで、図５（ａ）はTBS可溶性フラクションでのMC1抗体陽性タウ、タウリン酸化（AT8サイト）、タウ及びGAPDH（内在性コントロール）を検出したもので、図５（ｂ）はタウに対するMC1抗体陽性タウの比率を示す。また、図５（ｃ）に示されるように、同様の条件において、イソプレナリンはリン酸化も減少させた。ここで、図５（ｃ）はタウに対するリン酸化タウの比率を示す。
　（実施例５）
　イソプレナリンが微小管とタウとの結合にどのような影響を及ぼすかを検討した。WT tauを発現したCOS-7細胞にイソプレナリン10μMを24時間処置後、RA buffer(0.1μM MES, 0.5mM MgSO4, 1mM EGTA, 2mM DTT, 0.1% TritonX-100, 20μM taxol, 2mM GTP)でホモジナイズした。3000xgにて25℃で５分間遠心分離後、トータルフラクションとして上清を採取した。このトータルフラクションを更に100000xgにて20℃で20分間遠心分離し、ペレット(微小管フラクション)を採取した。このようにしてWT tauを発現したCOS-7細胞から微小管フラクションを採取し、タウと微小管安定化の指標であるアセチル化チューブリンを検出した。
　その結果、図６に示されるように、WT tau発現COS-7細胞において、イソプレナリン10μMは、微小管フラクションにおけるタウの量を増加させた。図６（ａ）は微小管フラクションのタウ、図６（ｂ）はトータルフラクションのタウを検出したものであり、図６（ｃ）は図６（ａ）をグラフ化したものである。
　また、WT tau発現COS-7細胞において、アセチル化チューブリンはベクター発現細胞と比べて増加した。そこにイソプレナリンを処置すると、図６（ｄ）（ｅ）（ｆ）に示されるように、更にアセチル化チューブリンが増加した。従って、イソプレナリンは微小管を構成しているタウの量を増加させることで、微小管を安定化している可能性が示唆された。ここで、図６（ｄ）は微小管フラクションのアセチル化チューブリン、図６（ｅ）はトータルフラクションのアセチル化チューブリンであり、図６（ｆ）は図６（d）をグラフ化したものである。
　（実施例６）
　次に、イソプレナリンがマウスにおいて、タウ凝集を抑制するかどうかを検討した。P301L tau Tgマウスに粉餌に混合したイソプレナリン（1.5mg/g fed）を3か月間摂取させた。その後、マウスから大脳皮質及び海馬を採取し、－80℃に保存した。これら動物組織から可溶性タウ及び不溶性タウを含む画分を得るため、まず、凍結組織にTBS溶液を加え、ホモジナイズした後に遠心し（23000rpm, 15min, ４℃）、上清とペレットに分けた。その内、上清をTBS可溶性フラクション（可溶性タウを含む）とした。また、ペレットに0.32M スクロースを加え、再度ホモジナイズした後に遠心し（23000rpm, 15min, ４℃）、上清（タウ凝集体を含む）とペレット（核を含む）に分けた。その後、上清に界面活性化剤（１%サルコシル）を加え、インキュベーションし（37℃, １h）、遠心した（200000xg , １h, ４℃）。ペレットをレムリバッファー（2-メルカプトエタノール入り）で溶解したものをサルコシル不溶性フラクションとした。TBS可溶性フラクション及びサルコシル不溶性フラクションにおけるタウをSDS-PAGEウェスタンブロット法で検出した。その結果、図７に示されるように、イソプレナリンはP301L tau Tgマウスの脳内におけるサルコシル不溶性タウの量を減少させた。ここで、図７（ａ）はサルコシル不溶性フラクションのタウを検出したもので、図７（ｂ）は図７（ａ）を定量・グラフ化したものである。NtgはNon-transgenic mouseを意味する。
　（実施例７）
　P301L tau Tgマウスの脳内では、タウ凝集の進展に伴って、神経細胞数が低下する。このため、タウ凝集抑制作用を有するイソプレナリンはこの神経細胞数の低下を改善できる可能性がある。そこで、イソプレナリンを処置したマウスから脳スライスを作製し、神経細胞数をカウントした。その測定方法として、図８（ａ）に示されるような0.1ミリ平方メートルのボックスを嗅内皮質(entorhinal cortex)または側頭領域（temporal area）に描き、その中の細胞数をカウントし、平均化したものを１スライスの値とした。スライスは１個体から２枚作製し、その結果、図８（ｂ）及び図８（ｃ）に示されるように、イソプレナリンはP301L tau Tgマウスが示すentoehinal cortex及びtemporal areaにおける細胞数の低下を抑制した。従って、イソプレナリンはタウ凝集を抑制することで、神経細胞数の低下を改善できる可能性が示唆された。なお、図８（ｂ）及び図８（ｃ）において、Miceは使用したマウス数であり、Sliceは細胞数を測定した１個体あたりのスライスの数である。
　（実施例８）
　WT tau Tgマウスから採取したTBS可溶性フラクションにおけるタウリン酸化の変化を検討した。その結果、図９に示されるように、イソプレナリンはモノクローナル抗体tau1で認識するタウの脱リン酸化を増加させた。ここで、図９（ａ）はTBS可溶性フラクションであり、図９（ｂ）はタウに対する脱リン酸化タウの比率である。このため、マウスにおいてもイソプレナリンはタウ凝集及びタウのリン酸化を抑制することが示唆された。
　なお、上述した実施例はイソプレナリンによる効果を示すものであるが、タウの凝集を抑制する新規の共通骨格としてカテコールアミン構造骨格を見いだしており（上記実施例２）、ドパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ及びドロキシドパは、イソプレナリンと同様にカテコールアミン構造を有するため、これらについてもイソプレナリンと同様に培養細胞及び動物においてタウ凝集を抑制する効果があると考えられる。
　（実施例９）
　タウ（10μM）、d-及びd/l-イソプレナリン（1～100μM）とチオフラビンＴを混合した。その後、ヘパリンを加え、37℃でインキュベーションし、タウを凝集させた。また、図中に示した時間において、インキュベーションサンプル中のチオフラビンT活性を測定し、化合物によるタウ凝集抑制作用を検討した。図１０（ａ）はd-イソプレナリン、図１０（ｂ）はd/l-イソプレナリンがチオフラビンT活性に及ぼす影響を検討した図である。図１０（ａ）（ｂ）に示されるように、d-イソプレナリンは、d/l-イソプレナリンとほぼ同様のチオフラビンT活性抑制作用を示した。
　次に、d-及びd/l-イソプレナリンによるタウ凝集の変化を生化学的に解析するため、インキュベーションしたタウ凝集サンプルをショ糖密度勾配遠心法により、Fr1-Fr6に分離した後、SDS-PAGEウェスタンブロット法でタウを検出した。図１１は、ショ糖密度勾配遠心法にて検出したタウの凝集抑制効果を示すSDS-PAGEウェスタンブロット法の結果であり、そのうち、図１１（ａ）でd-イソプレナリン、図１１（ｂ）はd/l-イソプレナリンの結果を示している。図１１（ａ）（ｂ）に示されるように、d-イソプレナリンは、d/l-イソプレナリンとほぼ同様にFr３以降に検出されるタウ（顆粒状タウ凝集体及びタウ線維）を明らかに低下させた。
　次に、d-イソプレナリンによるタウ凝集の変化を形態学的に解析するため、原子間力顕微鏡を用いて検討した。120時間までインキュベーションしたタウ凝集サンプルをmica板上にロードして吸着させた。サンプルを除去後、milliQ水でmica板を満たし、原子間力顕微鏡でタウの形態を観察した。図１２は、原子間力顕微鏡を用いたタウ凝集の形態学的変化を示す図であり、そのうち図１２（ａ）はコントロールの写真図であり、図１２（ｂ）はタウ凝集サンプルに対するd-イソプレナリンの効果を示す写真図であり、（ｃ）はタウ凝集体の直径を測定し、グラフ化したものである。図１２（ａ）（ｂ）（ｃ）に示されるように、d-イソプレナリンは長径20nm以上のタウ凝集体（顆粒状タウ凝集体及びタウ線維）の数を明らかに低下させた。
　動物におけるd-イソプレナリンのタウ凝集抑制作用を検討するため、P301L tau Tgマウスを用いて検討した。20～21ヶ月齢のP301L tau Tgマウスに粉餌に混合したd-イソプレナリン（2.168mg/g fed）を３ヶ月間摂取させた。その後、マウスから大脳皮質及び海馬を採取し、－80℃に保存した。その後、これら脳組織からTBS可溶性フラクション及びサルコシル不溶性フラクションを調整し、SDS-PAGEウェスタンブロット法でタウを検出した。
　図１３は、P301L tau Tgマウスの大脳皮質において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち図１３（ａ）はサルコシル不溶性フラクションのタウ、図１３（ｂ）はTBS可溶性フラクションのタウ及び内在性コントロールのGAPDHを検出したものである。また、図１４は、P301L tau Tgマウスの大脳皮質において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、図１４（ａ）はTBS可溶性タウに対するサルコシル不溶性タウの比率を、図１４（ｂ）はTBS可溶性フラクションにおいてGAPDHに対するタウの比率を示す。図１３及び図１４に示されるように、d-イソプレナリンは、P301L tau Tgマウスの大脳皮質における不溶性タウの量を明らかに低下させた。
　上記のP301L tau Tgマウスの大脳皮質における不溶性タウの量を検討した試験と同様にして、P301L tau Tgマウスの海馬における不溶性タウの量を試験した。図１５は、P301L tau Tgマウスの海馬において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち図１５（ａ）はサルコシル不溶性フラクションのタウ、図１５（ｂ）はTBS可溶性フラクションのタウ及び内在性コントロールのGAPDHを検出したものである。また、図１６は、P301L tau Tgマウスの海馬において、d-イソプレナリンによるサルコシル不溶性タウの低下を示す図であり、そのうち図１６（ａ）はTBS可溶性タウに対するサルコシル不溶性タウの比率を、図１６（ｂ）はTBS可溶性フラクションにおいてGAPDHに対するタウの比率を示す。図１５及び図１６に示されるように、d-イソプレナリンは、P301L tau Tgマウスの海馬における不溶性タウの量を明らかに低下させた。
　タウオパチーの治療に有益である。

Claims (6)

  1. 　イソプレナリン又はその塩を含む、タウオパチーの予防及び／又は治療に用いられるタウ凝集阻害剤。
  2. 　前記イソプレナリンはｄ体である請求項１記載のタウ凝集阻害剤。
  3. 　前記イソプレナリンはｄ/ｌ体である請求項１記載のタウ凝集阻害剤。
  4. 　前記タウオパチーは、AD、ダウン症、Pick病、皮質基底核変性症(CBD)、又は進行性核上性麻痺(PSP)である請求項１記載のタウ凝集阻害剤。
  5. 　更に製薬上許容される等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、及びｐＨ調整剤から選択される１又はそれ以上の添加剤を含有する請求項１記載のタウ凝集阻害剤。
  6. 　ドーパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ及びドロキシドパからなる群から選ばれたカテコール構造含有化合物又はその塩を含む、タウオパチーの予防及び／又は治療に用いられるタウ凝集阻害剤。
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