WO2013035779A1 - 細胞間の相互作用の解析方法 - Google Patents

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俊平 石川
河村　大輔
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    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a method for comprehensively and quantitatively evaluating protein interactions between cells derived from different individuals.
  • the constituent cell In various physiological and pathological conditions including diseases such as proliferation, cell death, development, differentiation, cancer and inflammation, the constituent cell (cell A) is a signal from the surrounding cell (cell B) Stimulated, they play an important role in the establishment of physiological and pathological conditions. Conversely, when the constituent cell A gives a signal or stimulus to the surrounding cell B, it similarly plays an important role in establishing a physiological or pathological state.
  • cells A and B that give signals and stimuli include stromal cells including cancer cells and blood vessels, skin epidermis cells and dermal cells, bone marrow blood stem cells and bone marrow stromal cells, cells that have fallen into cells, and inflammatory cells And so on.
  • Non-Patent Document 1 the level of expression level at a single cell or single tissue level can be comprehensively measured, but it is different. It did not comprehensively evaluate the interaction between cells, and did not allow quantitative comparison. If there are technologies and techniques that make this possible, cell interactions and signals important for biological phenomena and diseases can be identified, leading to the elucidation of the mechanisms of biological phenomena and the development of disease treatment methods.
  • the present invention provides an analysis method for comprehensively and quantitatively evaluating protein interactions between cells in a system in which cells derived from different individuals coexist, and identifying signals having strong interactions or strong interdependencies. The purpose is to do.
  • the present inventors performed transcriptome sequencing in a culture system in which different types of cells such as mice transplanted with human cancer tissues coexisted. Whether it is derived from an individual or not, the gene expression in each cell was profiled with high accuracy. Then, for example, select a combination of proteins that can interact, such as a ligand and a receptor, and use the profiling results and various databases to express the expression level of one protein in one of the coexisting cells. By searching for cells with a large amount of the other protein expressed in the other cell, the inventors succeeded in identifying signals having important interactions and strong interdependence between the cells.
  • the present invention [1] A step of obtaining a gene expression profile in a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist, classified for each individual; Selecting a combination of two proteins that can interact between cells; Based on the expression profile, in one of the two or more individuals among the combination of the proteins, the expression level of a gene encoding one of the proteins is higher than the other individuals, and the one individual When the expression level of the gene encoding the other protein is higher in other individuals than in the other individuals, the interaction by the combination of the proteins is between cells derived from the two or more individuals.
  • a method for analyzing protein interactions between cells derived from two or more individuals including: [2]
  • the step of classifying the expression profile for each individual comprises: Extracting RNA from the microenvironment and decoding at least a portion of the base sequence of each RNA; Identifying the individual from which the RNA is derived based on the decoded sequence data, and determining the expression level of each gene in each individual; and
  • the two or more individuals belong to different species
  • the step of obtaining the expression profile for each individual is obtained by: Extracting RNA from the microenvironment, and decoding at least a portion of the base sequence of each RNA with a parallel sequencer; Aligning each decoded sequence with a sequence in a database of gene sequences for each species from which the individual is derived, and classifying which species is derived depending on whether the similarity is greater than or equal to a predetermined value; After classification, a step of determining the expression level of the gene based on
  • a therapeutic agent for pancreatic cancer comprising at least one member of the group consisting of Picropodophyllin (PPP), PD173074, and PF562271;
  • a method for treating pancreatic cancer comprising administering at least one member of the group consisting of Picropodophyllin (PPP), PD173074, and PF562271;
  • a method for screening an antiviral agent infecting an animal or plant cell with a virus in vitro to form a microenvironment in which the animal or plant cell and the virus coexist; The method according to any one of [1] to [8] above, the step of identifying a combination of proteins that have an important interaction between the cell and the virus; Selecting a pharmaceutical agent that inhibits the interaction between the proteins.
  • a first analyzer that obtains a gene expression profile in a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist;
  • a protein-protein interaction database that accumulates interaction information between proteins, including directionality, as interaction data; 2nd which analyzes the interdependency of the interaction between individuals based on the interaction data contained in the intercellular protein interaction database and the expression profile for each solid created by the first analysis device
  • An analysis device Based on the analysis result by the second analysis device, a chart relating to the interdependency of the interaction between individuals is created, and a third analysis device that outputs to the output device;
  • a system for analyzing protein interactions between cells derived from two or more individuals comprising: About.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing one embodiment of a protein analysis method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram (upper row) showing a process of transplanting a human cancer cell line into the mouse of Example 1, and a tissue photograph (lower row) of a graft (xenograft).
  • FIG. 3 shows an example of a data format obtained by sequencing a RNA extracted from a microenvironment in which human cancer cells and mouse stromal cells coexist in a mouse transplanted with human cancer cells using a parallel sequencer in Example 1.
  • FIG. 4 is a part of an expression profile obtained by dividing the sequence-decoded RNA into human and mouse sequences in Example 1.
  • FIG. 5 is a part of the results of calculating input dependency, output dependency, and signal intensity using expression profiles for combinations of proteins that can interact in Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram created in Example 1 by taking the input dependency of each protein interaction on the X axis and the output dependency on the Y axis. The larger the circle, the stronger the signal intensity, and the darker the color, the greater the degree of induction.
  • FIG. 7 shows the cell-cell interaction that is the target of the molecular target drug marketed for solid cancer in the same diagram as FIG.
  • FIG. 8 shows the strong interaction considered to be a target of an antitumor drug among signals from mouse stromal cells to human cancer cells in the same diagram as FIG.
  • FIG. 9 shows changes over time in tumor volume after administration of the interaction inhibitor shown in FIG.
  • FIG. 10 shows antibody clones and dilution ratios used for immunostaining of human pancreatic cancer tissue.
  • FIG. 11 shows the results of immunostaining of human pancreatic cancer tissue.
  • FIG. 12 shows the sequence of human tissue-derived RNA and mouse cell-derived RNA to verify the accuracy of the separation ability in the process of separating human and mouse sequences, and into mouse RefSeq RNA and human RefSeq RNA. The result of the number of arrangement
  • FIG. 13 shows an example of an analysis system for interaction between cells.
  • FIG. 13 shows an example of an analysis system for interaction between cells.
  • FIG. 14 shows a part of an expression profile obtained by dividing the sequence-decoded RNA into human and mouse sequences in Example 2.
  • FIG. 15 shows a part of the results of calculating input dependency, output dependency, and signal intensity using expression profiles for combinations of proteins that can interact in Example 2.
  • FIG. 16 is a diagram created in Example 2 by taking the input dependency of the interaction of each protein on the X axis and the output dependency on the Y axis. The larger the circle, the stronger the signal intensity, and the darker the color, the greater the degree of induction.
  • FIG. 17 shows the cell-cell interactions in the main epidermal keratinocytes and fibroblasts reported so far in the same diagram as FIG.
  • One aspect of the protein interaction analysis method is a protein interaction analysis method between cells derived from two or more individuals, Obtaining a gene expression profile in a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist, and classifying each individual; Selecting a combination of two proteins that can interact between cells; Based on the expression profile, in one of the two or more individuals among the combination of the proteins, the expression level of a gene encoding one of the proteins is higher than the other individuals, and the one individual When the expression level of the gene encoding the other protein is higher in other individuals than in the other individuals, the interaction by the combination of the proteins is between cells derived from the two or more individuals. Inferring a more important interaction.
  • the two or more individuals may be different individuals having a nucleic acid, and may be the same or different species.
  • individuals having nucleic acids include animals (humans, mice, rats, monkeys, sheep, horses, cows, etc.), plants, and viruses.
  • the microenvironment means an in vivo or in vitro environment in which cells from different individuals can interact, and includes a sufficient number of cells to obtain a gene expression profile.
  • a microenvironment in which cells from two or more individuals coexist can be created by contacting and co-cultivating cells so that each cell can interact, or by infecting cells with viruses or bacteria.
  • the microenvironment may be a natural environment created by infection with a virus or bacteria.
  • each individual can be identified by a sequence of about 20 bp to about 3000 bp which is the decoding length of the parallel sequencer. Is desirable.
  • Examples of systems in which cells or viruses derived from two or more individuals coexist in a microenvironment include mixed culture systems of rabbit cells and human cells; mixed culture systems of mouse cells and human cells; rabbit cells, mouse cells, and 3 types of mixed culture systems such as human cells; host cells infected with viruses; mixed culture system of cells derived from separate bodies of the same species; system for evaluating the interaction between cancer and stroma in a human cancer cell line mouse transplant model; Interaction evaluation system for stem cell maintenance in human ES / iPS cell and mouse feeder cell co-culture model; evaluation system for blood stem cell maintenance microenvironment in human blood stem cell mouse bone marrow transplantation model; epidermis layer in human skin three-dimensional culture model (human ) And dermis layer (mouse) interaction evaluation system, and the like, but are not limited thereto.
  • These cultures and infection of host cells with viruses can be performed by methods known to those skilled in the art or similar methods.
  • the expression profile of a gene refers to information indicating how much gene is expressed in a plurality of (usually a large number of) gene groups.
  • the expression level may be expressed as an absolute numerical value or may be expressed as a relative numerical value.
  • the expression level may be expressed as a normalized value so that the genes can be appropriately compared.
  • expression is used to include both transcription in which RNA is produced using genomic DNA as a template and translation in which protein is synthesized according to information defined in the base sequence of RNA.
  • RNA or protein contained in the microenvironment is measured according to a known method or a method equivalent thereto, and each RNA or protein is This can be done by determining whether it originates from an individual.
  • RNA is extracted from a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist, and at least a part of the base sequence of each RNA is decoded. Based on the decoded sequence data, the RNA It is possible to carry out by the process of specifying which individual each of these is derived from and determining the expression level of each gene in cells derived from each individual.
  • RNA can be extracted by a known method or a method analogous thereto. For example, guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), Acid guanidinium-Phenol-Chloroform method (AGPC method; Chomczynski, P. et al., Anal. Total RNA may be prepared according to Biochem. (1987) 162, 156-159). By extracting and analyzing total RNA, the transcriptome in a microenvironment can be comprehensively examined.
  • a parallel sequencer can be used for decoding the base sequence of RNA.
  • Parallel type sequencers are also called massively parallel type sequencers, next-generation type sequencers, high-speed sequencers, etc., and parallelize sequences of a large number of nucleic acid fragments (for example, tens of millions to 100 million nucleic acids of about 100 bp) at extremely high speed.
  • Genome Analyzer / Hiseq / Miseq Illumina
  • SOLiD / IonTorrent PGM LifeTechnologies
  • the PacBio RS Pacific BioScience
  • Heliscope Helicos
  • the Polonator Diagonal Component Synthesis
  • 454 GS Roche
  • the base sequence of RNA can also be decoded by a microarray.
  • the nucleic acid used for decoding the base sequence can be a cDNA produced by reverse transcriptase from the extracted RNA.
  • cDNA derived from mRNA, small RNA such as microRNA, non-coding RNA, and intronic RNA
  • cDNA is also included, it is not limited to this and may be genomic DNA.
  • the base sequence may be decoded for the entire length of the nucleic acid fragment or for a part thereof.
  • the step of identifying which individual each RNA is derived from is, for example, when the sequence is decoded with a parallel sequencer, each sequence is the gene of the species to which each individual belongs. Alignment is performed on the sequences listed in the sequence database, and the determination can be made based on whether or not the similarity is a predetermined value or more.
  • the database used in this step include a database provided by RefSeq provided by National Center for Biotechnology Information (NCBI), UCSC Genome Browser, and European Bioinformatics Institute (EBI).
  • each sequence decoded by the parallel type sequencer is aligned with the human sequence stored in RefSeq.
  • mouse genes are classified as mouse genes, aligned with mouse sequences, and those having a similarity higher than a predetermined value are classified as mouse genes.
  • whether or not the similarity is higher than a predetermined value can be determined using a score indicating similarity, or may be determined based on the fact that the number of mismatches is less than the predetermined number.
  • a score indicating similarity or may be determined based on the fact that the number of mismatches is less than the predetermined number.
  • the present invention analyzes an interaction between cells derived from two or more individuals, a gene that cannot be identified from which individual (in the above example, a gene that cannot be identified as a human or a mouse) May be removed from consideration at this stage.
  • a gene that cannot be identified from which individual in the above example, a gene that cannot be identified as a human or a mouse
  • only the database on the gene sequence of the former individual is used and is included in the database. Those that do not align with the sequence may be classified as the latter individual.
  • the sequence is decoded by a parallel sequencer, the expression level of each gene in each individual can be determined, for example, by counting the number of times the same sequence is decoded.
  • the sequence of the microarray probe is designed so that the individual can be identified when the sequence is decoded by the microarray. Can be done.
  • the expression level of each gene can be measured by a known method such as fluorescence intensity when detecting a nucleic acid hybridized with a probe.
  • the steps of classifying gene expression profiles in the microenvironment for each individual include extracting peptides (including proteins) from the microenvironment and decoding at least a portion of the amino acid sequence of each peptide; Based on the data, it may be carried out by specifying which individual each of the peptides is derived from and determining the expression level of each peptide in each individual. Extraction of the peptide from the microenvironment can be performed by a known method or a method analogous thereto.
  • the step of decoding the amino acid sequence of each peptide can be performed by a known method or a method according thereto, and examples thereof include a peptide sequencer and a mass spectrometer.
  • the process of identifying which individual each of the peptides is derived from is compared to the amino acid sequence in the protein database of the species to which each individual belongs, as in the case of RNA. Then, alignment can be performed, and the determination can be made based on whether or not the predetermined similarity or more. Examples of the database used in this step include RefSeq provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • surface shows an expression level. For example, when two or more individuals are human and mouse, there are 20,000-30,000 genes, respectively, and it is considered that about 300,000 RNAs are expressed per cell. Therefore, when extracting the total RNA, decoding the sequence with a parallel sequencer, aligning the sequences published in the sequence database for each species, and allocating them to human and mouse sources, the result of the alignment is human or mouse. Even if genes that cannot be identified are excluded, the table below is expected to exceed several thousand digits.
  • Step of selecting protein combination In one embodiment of the protein interaction analysis method according to the present invention, the above-described step of obtaining an expression profile is performed, and a combination of two proteins that can interact between cells is selected.
  • the step of selecting a combination of two or more proteins that can interact between cells can be performed based on databases, literatures, and experimental data relating to various interactions of proteins. For example, as a combination of proteins that can interact, a combination of proteins to be bound can be selected using a database of protein binding information or interaction information. Further, using a protein localization information database, a combination in which any protein is localized extracellularly or in a cell membrane may be selected. Moreover, you may select the combination contained in all of the combinations selected on the several conditions.
  • the direction of signal transduction between proteins in the protein combination may be specified using a database of protein pathway information.
  • Specifying the direction of signal transduction means, for example, specifying which protein is activated or inhibited and which protein is activated or inhibited.
  • a molecule upstream in the direction of signal transduction that is, a protein that activates or inhibits is called an input molecule
  • a molecule that is downstream that is, a protein that undergoes activation or inhibition
  • a molecule is an input molecule
  • a receptor is an output molecule.
  • HPRD URL http://www.hprd.org/
  • KEGG is a database of protein binding information / interaction information, localization information, and pathway information that can be used in this step.
  • BIND URL http://bind.ca XXX
  • BioGRID URL http://thebiogrid.org/
  • other commercial databases databases newly created based on literatures, experimental data, and the like may be used, or a plurality of databases may be used in combination.
  • step of obtaining the expression profile for each individual and the step of selecting the protein combination may be performed first or in parallel.
  • an important interaction is estimated between cells derived from two or more individuals from the combination of proteins selected in the above step.
  • the expression level of the gene encoding one of the proteins in any one of the two or more individuals among the selected combination of proteins based on the expression profile is higher than the other individuals, and
  • an expression level of a gene encoding the other protein is higher than that of the other individual in an individual different from the above-mentioned one individual, cells derived from two or more individuals have an interaction caused by the combination of the proteins. I guess it is a more important interaction.
  • the combination of the selected proteins is protein X, Y, and the gene encoding this is gene x, y Is assumed.
  • the expression profile of the cell derived from the individual A and the cell derived from the individual B is compared, when the gene x is highly expressed in the cell derived from A and the gene y is high expressed in the cell derived from B, the proteins X and Y are It can be evaluated that there is a high possibility that an important interaction is carried out between these cells.
  • the higher the tendency that one gene is highly expressed in A-derived cells and the other gene is highly expressed in B-derived cells the more likely that it is an important combination. Can be evaluated.
  • Input dependency X A / (X A + X B )
  • Output dependency Y A / (Y A + Y B )
  • Signal intensity X A ⁇ Y B
  • a and B each represent an individual
  • X and Y represent individual proteins included in the selected combination
  • X A represents the expression level of protein X in individual A
  • X B represents the expression of protein X in individual B Amount
  • Y A represents the expression level of protein Y in individual A
  • Y B represents the expression level of protein Y in individual B, respectively.
  • X is an input molecule
  • Y is an output molecule.
  • the input dependency (X A / (X A + X B )) is an index indicating whether the expression level of a gene encoding a protein serving as an input molecule (eg, a ligand) is biased to a cell derived from which individual. .
  • Input dependency input molecule mouse / (input molecule mouse + input molecule human)
  • Input dependency input molecule human / (input molecule mouse + input molecule human)
  • Input molecule XX indicates the expression level of the input molecule in the cell of XX).
  • a signal transmitted between cells having a high index is such that the expression of an input molecule is offset by a cell derived from one individual, and it is considered that the cell derived from that individual greatly contributes to the input of the signal.
  • various indicators can be used that indicate to which individual cells the expression of a protein that can be an input molecule or its RNA is offset.
  • Output dependency (Y A / (Y A + Y B )) is an index indicating whether the expression level of a gene encoding a protein that is an output molecule (for example, a receptor) is biased to a cell derived from which individual. is there.
  • Output dependency output molecule human / (output molecule mouse + output molecule human)
  • Output dependency output molecule mouse / (output molecule mouse + output molecule human) It becomes.
  • the signal transmitted between cells having a high index is such that the output molecule is shifted to a cell derived from one individual, and it is considered that the cell derived from that individual greatly contributes to the output of the signal.
  • various indicators can be used that indicate to which individual cells the expression of a protein that can be an output molecule or its RNA is offset.
  • the signal intensity (X A ⁇ Y B ) is the product of the expression levels of the input molecule and the output molecule. If this index is high, it is considered that the signal or stimulation between cells is strong.
  • the product of the expression level may be expressed as a logarithm. In addition to this, various indexes that take into account both the expression level of the input molecule and the expression level of the output molecule can be used.
  • the contribution of cells from one individual in signal input is large, and the contribution of cells from the other individual in output is large.
  • This may mean that the signal transmitted between both cells is a highly interdependent signal that occurs only when both cells coexist in a microenvironment.
  • the signal intensity is strong, it can be evaluated that the interaction is more important between both cells.
  • f (t) and g (t) as monotonically increasing functions, f (X A ) / f (X A + X B ), f (Y A ) / f (Y A + Y B ), g (X A ) * g (Y B ) Or f (X A ) ⁇ f (X A + X B ), f (Y A ) ⁇ f (Y A + Y B ), g (X A ) + g (Y B ) It is also possible to evaluate the importance of interaction using the above as an index.
  • an increase in the expression level compared to when each cell is cultured alone may be used as an index (degree of induction).
  • degrees of induction Those with a high degree of induction are understood to have increased expression levels due to the coexistence of cells. Therefore, a combination of proteins having a high degree of induction can be evaluated that the interaction is important between both cells.
  • proteins responsible for important interactions between cells derived from each individual are obtained. Can be identified.
  • the analysis method according to the present invention is not limited to the specific examples described above, and can be implemented by those skilled in the art with appropriate modifications.
  • indicators such as input dependency, output dependency, and signal intensity
  • other indicators can be used as long as the object of the present invention is achieved.
  • a combination of two proteins that can interact is selected, but by using the method of the present invention a plurality of times, it can be used for analysis of the interaction of three or more proteins. Is possible.
  • the method for screening a physiologically active substance according to the present invention includes a step of forming a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist, and a cell derived from two or more individuals in the analysis method of the present invention. Identifying a combination of proteins that have important interactions and selecting a pharmaceutical agent that inhibits the interaction between such proteins. According to this method, a substance capable of regulating the function of a living body can be identified through inhibition of an important interaction between cells derived from two or more individuals. The identified physiologically active substance can be used as a medicine or an experimental reagent.
  • One embodiment of the screening method of the present invention includes a screening method for anticancer agents.
  • a step of transplanting a cancer cell line derived from a species different from the model animal to the model animal to form a microenvironment in which the cancer cell and the model animal-derived cell coexist In the analysis method, in the model animal, a step of identifying a protein combination that has an important interaction between a cancer cell and a model animal-derived cell, and a step of selecting a compound that inhibits the interaction between the proteins And including. According to such a method, it is possible to identify an important interaction that occurs for the first time between a cancer cell and a model animal cell by transplanting a cancer cell line.
  • the compound selected by this method is, for example, when the transplanted cancer cell is derived from a human, and is primarily a protein expressed in a human cancer cell and a protein expressed in a model animal-derived cell. It is possible to inhibit the interaction.
  • the present inventors have found that proteins that are highly expressed in model animal-derived cells when human cancer cells and model animal-derived cells coexist are present around human cancer cells. It was confirmed that expression was also increased in human stromal cells. Therefore, the drug selected by the screening method according to the present invention may exhibit an anticancer effect by inhibiting the interaction between cancer cells and surrounding cells even in the human body. It is considered expensive.
  • the type of cancer targeted by the anticancer agent that can be selected by this screening method is not particularly limited as long as it can be transplanted into a model animal.
  • a drug for cancer cachexia can also be selected by this screening method.
  • the screening method of an antiviral agent is mentioned as another aspect of the screening method which concerns on this invention.
  • in vitro infection of animal or plant cells with a virus to form a microenvironment in which the cells and viruses coexist and the analysis method of the present invention, there is an important interaction between the cells and the viruses. Identifying a combination of proteins that act, and selecting a compound that inhibits the interaction between the proteins. According to such a method, an antiviral agent that prevents the action of viruses on animal cells can be selected.
  • the step of selecting a compound that inhibits the interaction between proteins may be performed, for example, by searching a database or the like for compounds that are already known to inhibit the interaction between the proteins. Good.
  • a screening system for identifying a compound that inhibits the interaction between the proteins may be constructed according to a known method or a method equivalent thereto, and may be searched by conducting an experiment.
  • Candidate compounds include, but are not limited to, low molecular compounds, high molecular compounds, nucleic acids, peptides (including proteins), and the like.
  • the therapeutic agent for pancreatic cancer according to the present invention includes at least one member of the group consisting of Picropodophyllin (PPP), PD173072 and PF562271.
  • PPP Picropodophyllin
  • PD173072 PD173072
  • PF562271 PF562271.
  • the present inventors i) IGF1 ⁇ IGF1R, ii) FGF7 ⁇ FGFR3, iii) FN1, COL1A2, COL1A2 ⁇ ITGA2, ITGA3, ITGB6 Three types of interactions were identified as important.
  • the therapeutic agent for pancreatic cancer according to the present invention is obtained by mixing the above compound with a pharmacologically acceptable carrier (excipient, binder, disintegrant, lubricant, coloring agent, flavoring agent, etc.). It can be administered orally or parenterally in the form of a composition or formulation (eg, tablet, tablet, powder, fine granule, granule, capsule, liquid, injection, etc.).
  • a pharmacologically acceptable carrier excipient, binder, disintegrant, lubricant, coloring agent, flavoring agent, etc.
  • the pharmaceutical composition can be formulated according to a usual method.
  • the therapeutic agent for pancreatic cancer according to the present invention can be appropriately selected according to the degree of symptoms, age, sex, body weight, administration time interval, administration method, sensitivity to drugs, and the like.
  • 1 to 10,000 mg, preferably 10 to 2,000 mg per day is usually administered as an adult in 1 to several times a day.
  • it is usually 0.1 mg to 10000 mg, preferably 1 mg to 2000 mg per day as a normal adult.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining an embodiment of an analysis method according to the present invention.
  • human cancer cells were transplanted into mice to form a microenvironment in which human cancer cells and mouse stromal cells coexist.
  • RNA is extracted from the microenvironment, the base sequence of each RNA is decoded with a parallel sequencer (upper right), and the existing database is used to sort out whether each RNA is derived from humans or mice.
  • An expression profile for each human or mouse was obtained (lower right).
  • select a combination of proteins that can interact using various databases etc. (lower center)
  • use the expression profile to determine the input dependency, output dependency, signal intensity, and induction degree of each combination, Graphed (bottom left).
  • each step will be described in detail.
  • RNA extraction Pancreatic cancer cell lines Capan-1, KLM-1, PK-8, Panc-1, and PH45H were cultured under the conditions of RPMI-1640 + 10% FBS, DMEM + 2 mM L-glutamine + 20% FBS, 5% CO2, and transplanted cells. Number: 2-8 ⁇ 10 ⁇ 6 cells 5-6 weeks old female BALB / cAJc1-mu / mu mice (CLEA, Japan): transplanted by injecting the mice subcutaneously (FIG. 2). The prepared transplanted strain was taken out, and total RNA was extracted from the tumor tissue having a diameter of about 3 mm excluding the surrounding skin tissue and connective tissue using Trizol Reagent (Invitrogen).
  • a library was prepared from total RNA according to the RNA-seq pair-end protocol of Genome Analyzer (Illumina), and 50 bp of each end was sequenced. A part of the format of the obtained data is shown in FIG. About 50 to 50 million digits of sequence data of 50 bp were obtained. The resulting sequence is mapped to the mouse and human public gene sequence RefSeq sequence (NCBI) using the Eland program (Illumina) under the condition that 1 bp mismatch in 50 bp is allowed, and both ends are mapped to the same gene. Rejected except those.
  • This step was performed by constructing a cell-protein interaction database from a public pathway and a protein-protein binding database.
  • a protein which is a gene product
  • one protein is defined as Ligand
  • the other is defined as a receptor.
  • a protein that activates or inhibits is defined as Ligand
  • a protein that undergoes sexualization or inhibition is defined as Receptor.
  • Ligand and Receptor When this numerical index is close to 1, the expression of Ligand and Receptor is different between mouse cells and human cells, and it is considered that the interdependence between different cells is high for the signal.
  • Ligand input molecule
  • Ligand-H / Ligand-M + Ligand-H
  • Receptor output molecule
  • a numerical index (0 to 1) such that / (Receptor-H + Receptor-M) was obtained.
  • signal intensity a logarithm with the base of Ligand x Receptor as 2 was used. The above three numerical values (input dependency, output dependency, and signal intensity) were calculated for the 1791 interactions determined in 3.
  • FIG. 5 shows a part of the results.
  • FIG. 7 shows the cell-cell interaction that is the target of molecular target drugs that have been marketed so far for solid cancer in the same diagram as FIG.
  • Each interaction and molecular target drug are shown in the table below.
  • the targeted interactions of the marketed molecular targeting drugs are shown to be fairly high (close to 1), either input-dependent or output-dependent, which is important in the method according to the present invention. We were able to verify that it was possible to predict various interactions.
  • the signal pathways of i), ii), and iii) are small molecule inhibitors Picropodophyllin (PPP) (Yin S. et a., Neuro Oncol. 2010 Jan; 12 (1): 19-27.), PD 173074 (Lamont FR. Et al., Br J Cancer. 2011 Jan 4; 104 (1): 75-82.), PF562271 (Roberts WG. Et al., Cancer Res. 2008 Mar 15; 68 (6): 1935- 44.) is reported to be capable of inhibition.
  • PPP Picropodophyllin
  • receptor IGF1R and ITGA2 mainly show strong staining in cancer cells
  • Ligand Collagen Type 1 and FN1 mainly stain stromal cells. Sex was obtained. As a result, it was confirmed that the results of the cell-cell interaction analysis of the model system using human cells and mouse cells well reflect actual biological phenomena.
  • FIG. 12 shows the results of the number of sequences mapped to mouse RefSeq RNA and human RefSeq RNA.
  • the origin animal species could be identified with an accuracy of 99.9% or more.
  • FIG. 13 shows an example of an analysis system for interaction between cells.
  • the first analysis device 72 implements the step 2 above, and obtains an expression profile of a gene in a microenvironment in which cells derived from two or more individuals coexist, for each individual. Can do.
  • the second analysis device 73 implements the above step 5.
  • the second analysis device 73 analyzes the interdependency of the interaction between individuals based on the intercellular protein interaction database and the expression profile for each individual.
  • the third analysis device 75 implements the above-described step 6, and creates a chart relating to the analysis result of the interdependency of the interaction between individuals.
  • the sequence file relating to the sequence decoded by the parallel sequencer 71 is input to the first analysis device 72.
  • the first analyzer performs sequence data distribution processing and creates expression profiles for humans and mice, respectively.
  • FIG. 4 is an example of human and mouse expression profiles created by the first analyzer 72.
  • the created expression profile is transferred to the second analysis device 73.
  • the second analyzer 73 is based on the interaction data included in the intercellular protein interaction database 74 and the expression profiles of the human and the mouse received from the first analyzer 72, so that the human and mouse cells Analyze protein interactions and calculate three values (input dependency, output dependency, signal intensity) that indicate the interdependence of each interaction.
  • the interaction database 74 is a database in which interaction information between proteins including directionality is accumulated as interaction data, and the databases described in 3. and 4. above are applicable.
  • FIG. 5 is an example of numerical values calculated by the second analysis device 73.
  • the third analysis device 75 creates a chart that visualizes the interdependency of the interaction based on the numerical value indicating the interdependency of the interaction calculated by the second analysis device 73, and displays a display or the like.
  • FIG. 6 is an example of a chart output to the output device 76.
  • RNA is extracted from the microenvironment, the base sequence of each RNA is decoded with a parallel sequencer, and the existing database is used to assign whether each RNA is derived from humans or mice.
  • Each expression profile was obtained.
  • combinations of proteins that can interact with each other were selected using various databases, etc., and input dependence, output dependence, and signal intensity of each combination were obtained using an expression profile, and plotted in a graph.
  • RNA extraction Human epithelial normal cells cultured in KG-2 (Kurabo) after seeding 0.1 to 3 X 10 ⁇ 4 mouse embryonic fibroblast cell line NIH-3T3 on 6 well plate and culturing with DMEM + 10% FBS The cells were seeded on 6-well plates seeded with NIH-3T3 cells at 0.1-3 ⁇ 10 ⁇ 4 cells, further cultured with DMEM + 10% FBS for 48 hours, and then total RNA was extracted using RNeasy mini kit (Quiagen).
  • Example 2 [2. Sequencing and creating mouse and human expression profiles] In the same manner as in Example 1, a library was prepared from Total RNA according to the RNA-seq pair-end protocol of Genome Analyzer (Illumina), and 50 bp at both ends were sequenced. In the same data format as shown in FIG. 3, about 50 to 50 million digits of 50 bp sequence data were obtained. From the sequence obtained, an expression profile was prepared in the same manner as in [2. Sequence decoding and creation of mouse and human expression profiles] in Example 1. A part of the obtained expression profile is shown in FIG.
  • Ligand input molecule
  • Ligand-H / Ligand-M + Ligand-H
  • Receptor output molecule
  • a numerical index (0 to 1) such that -M / (Receptor-H + Receptor-M) was obtained.
  • signal intensity a logarithm with the base of Ligand x Receptor as 2 was used. The above three numerical values (input dependency, output dependency, and signal intensity) were calculated for the 1791 interactions determined in 3.
  • FIG. 15 shows a part of the result.
  • FIG. 16 a diagram showing one cell-cell protein interaction as one circle was created (FIG. 16). The size of the circle represents the signal intensity. Signals from human epidermal keratinocytes to mouse fibroblasts (left) and signals from mouse fibroblasts to human epidermal keratinocytes (right) were generated separately.
  • FIG. 17 shows the cell-cell interactions in the main epidermal keratinocytes and fibroblasts reported so far in the same diagram as FIG. Each interaction and reference is shown in the table below. As shown in the figure, the cell-cell interaction in the reported epidermal keratinocytes and fibroblasts is shown to be close to 1 in either input dependence or output dependence. We were able to verify that important interactions could be predicted using.

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Abstract

　本発明は、異なる個体に由来する細胞が共存する系で、細胞間のタンパク質相互作用を網羅的かつ定量的に評価し、重要な相互作用や相互依存性の強いシグナルを同定する解析方法を提供することを目的とする。　本発明は、２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る工程と、細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程と、前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の組合せの中で、前記２以上の個体の１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高く、かつ、前記１の個体とは別の個体において、前記タンパク質の他方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高くなっている場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、を含む、２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析方法を提供する。

Description

細胞間の相互作用の解析方法
　本発明は、異なる個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用を網羅的かつ定量的に評価する方法等に関する。
　増殖・細胞死・発生・分化・癌や炎症などの疾患をはじめ様々な生理的・病理的状態において構成成分の細胞（細胞Ａとする）は周囲の細胞（細胞Ｂとする）からのシグナルや刺激を受けており、それらが生理的、病理的状態の成立に重要な役割を果たしている。また逆に構成細胞Ａが周囲の細胞Ｂに対してシグナルや刺激を与えることにより同様に生理的、病理的状態の成立に重要な役割をはたす。シグナルや刺激を与えあう細胞Ａ及び細胞Ｂの例として、癌細胞と血管を含む間質細胞、皮膚の表皮細胞と真皮細胞、骨髄血液幹細胞と骨髄間質細胞、細胞死に陥った細胞と炎症細胞などが考えられる。
　これらの細胞間の相互作用は通常分泌タンパク質や細胞表面タンパク質によって媒介され、相手の細胞の表面の受容体等のタンパク質に結合することによりシグナル・刺激が伝えられる。これまで細胞間相互作用に関して多数の研究やそれに関する文献があり、重要と考えられるシグナルやそれを媒介するタンパク質が同定されてきた。しかしながらこれらの多数報告された相互作用に関して、それらを比較してその重要度を定量的に比較したり、最も重要な相互作用群を選び出したりする報告はほとんど行われていない。
　その大きな原因として多数の相互作用を網羅的かつ定量的に評価する手法がなかったことが考えられる。マイクロアレイや並列型シーケンサーを用いた遺伝子発現プロファイル（例えば、非特許文献１参照。）においては、単一細胞、単一組織レベルでの発現量の高低を網羅的に測定することはできるが、異なる細胞間の相互作用に関して網羅的に評価し、定量的比較を可能にするものではなかった。これを可能にする技術や手法が存在すれば、生物現象や疾患に重要な細胞間相互作用やシグナルを同定でき、生物現象のメカニズムの解明や疾患治療法の開発につなげることが出来る。
Valk, P.J. e.a. Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine 350, 1617 (2004).
　本発明は、異なる個体に由来する細胞が共存する系で、細胞間のタンパク質相互作用を網羅的かつ定量的に評価し、重要な相互作用や相互依存性の強いシグナルを同定する解析方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、ヒト癌組織を移植したマウスなど異なる種類の細胞を共存させた培養系において、トランスクリプトームのシーケンシングを行い、いずれの個体に由来するするのか配列に基づいて振り分けるとともに、それぞれの細胞における遺伝子発現を高精度にプロファイリングした。そして、例えばリガンドと受容体のように相互作用しうるタンパク質の組合せを選択し、プロファイリングの結果と各種データベースを使用して、当該組合せのうち、共存させた細胞の一方において一方のタンパク質の発現量が多く、他方の細胞において他方のタンパク質の発現量が多いものを探索することにより、その細胞間で重要な相互作用や相互依存性の強いシグナルを同定することに成功した。
　さらに、上記方法で、ヒト癌組織を移植したマウスの例で重要な相互作用であると同定されたタンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を投与したところ、マウスにおいて癌組織の増殖が抑制されること等を確認して、上記方法の有効性を検証し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
〔１〕２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る工程と、
　細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程と、
　前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の組合せの中で、前記２以上の個体の１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高く、かつ、前記１の個体とは別の個体において、前記タンパク質の他方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高くなっている場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、
を含む、２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析方法：
〔２〕前記発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、
　前記微小環境からＲＮＡを抽出し、各ＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列を解読する工程と、
　前記解読した配列データに基づいて、前記ＲＮＡがそれぞれどの個体に由来するか特定し、かつ、各個体における各遺伝子の発現量を求める工程と、
を含む、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記２以上の個体がそれぞれ異なる種に属し、
　前記発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、
　前記微小環境からＲＮＡを抽出し、各ＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列を並列型シーケンサーで解読する工程と、
　前記解読した各配列を、前記個体が由来する種ごとの遺伝子配列のデータベース中の配列とアラインメントし、類似性が所定値以上であるか否かでどの種に由来するか分類する工程と、
　分類後、ＲＮＡの数に基づいて遺伝子の発現量を求める工程と、
を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程は、
　タンパク質間の結合情報のデータベースを利用して、結合するタンパク質の組合せを選択する工程と、
　タンパク質の局在情報のデータベースを利用して、いずれのタンパク質も細胞外又は細胞膜に局在する組合せを選択する工程と、
の少なくとも一方を含む、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔５〕前記相互作用しうる２以上のタンパク質の組合せを選択する工程において、さらに、
　タンパク質のパスウェイ情報のデータベースを利用して、前記タンパク質の組合せにおけるタンパク質間のシグナル伝達の方向を特定する、
上記〔４〕に記載の方法；
〔６〕前記重要な相互作用を推測する工程は、
　前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の各組合せにつき、それぞれをコードする遺伝子について、前記２以上の個体における発現量の合計に対する、各個体における発現量の割合を求める工程と、
　前記２以上の個体のうちの１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の前記発現量の割合がより高く、別の個体において、他方のタンパク質をコードする遺伝子の前記発現量の割合がより高い場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、を含む、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔７〕前記２以上の個体が２の個体Ａ、Ｂであり、前記タンパク質の組合せが、タンパク質Ｘ、Ｙ（但し、Ｘはシグナル伝達においてＹより上流にある）であるときに、
　前記重要な相互作用を推測する工程は、
　前記発現プロファイルにおける、個体Ａ、Ｂのタンパク質Ｘをコードする遺伝子の発現量をそれぞれＸA、ＸBとし、タンパク質Ｙをコードする遺伝子の発現量をそれぞれＹA、ＹBとしたときに、
　入力依存性を式：ＸA／（ＸA＋ＸB）で表し、
　出力依存性を式：ＹA／（ＹA＋ＹB）で表し、
　シグナル強度を式：ＸA×ＹBで表し、
　入力依存性、出力依存性、及びシグナル強度のうち、少なくともいずれかの値がより高い組合せは、より重要な相互作用を担うと推測する工程を含む、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔８〕前記２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境に代えて、ウイルスと細胞が共存している微小環境を用いる、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕生理活性物質のスクリーニング方法であって、
　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境を形成する工程と、
　上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法で、前記２以上の個体に由来する細胞間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法；
〔１０〕抗がん剤のスクリーニング方法であって、
　モデル動物に、該モデル動物とは異なる種に由来するがん細胞株を移植し、がん細胞とモデル動物由来細胞とが共存している微小環境を形成する工程と、
　上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法で、前記モデル動物において、がん細胞とモデル動物由来細胞との間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法；
〔１１〕Picropodophyllin(PPP)、PD173074、及びPF562271からなる群の少なくとも１種を含む膵癌の治療剤；
〔１２〕Picropodophyllin(PPP)、PD173074、及びPF562271からなる群の少なくとも１種を投与する膵癌の治療方法；
〔１３〕
　抗ウイルス剤のスクリーニング方法であって、
　in vitroで動物又は植物細胞にウイルスを感染させ、動物又は植物細胞とウイルスとが共存している微小環境を形成する工程と、
　上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法で、前記細胞とウイルスの間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法。
〔１４〕２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る第１の解析装置と、
　方向性を含めたタンパク質間の相互作用の情報を相互作用データとして蓄積した細胞間タンパク相互作用データベースと、
　前記細胞間タンパク相互作用データベースに含まれる相互作用データと、前記第１の解析装置によって作成された固体ごとの発現プロファイルとに基づいて、個体間の相互作用の相互依存性を解析する第２の解析装置と、
　前記第２の解析装置による解析結果に基づいて、個体間の相互作用の相互依存性に関する図表を作成し、出力装置に出力する第３の解析装置と、
を備える２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析システム、
に関する。
　本発明によれば、異なる個体に由来する細胞を共存させた場合に、細胞間において重要な相互作用を司るタンパク質の組合せを同定することができる。
　同定された相互作用は、医薬品開発のターゲットにもなり得る
図１は、本発明に係るタンパク質の解析方法の一実施態様を示す概念図である。 図２は、実施例１のマウスにヒト癌細胞株を移植する工程を示す概念図（上段）、及び移植片（xenograft）の組織写真（下段）である。 図３は、実施例１において、ヒト癌細胞を移植したマウスにおけるヒト癌細胞とマウス間質細胞が共存する微小環境から抽出したRNAについて並列型シーケンサーで配列解読して得られるデータの形式の一部である。 図４は、実施例１において、配列解読したRNAをヒトとマウスの配列に分けた発現プロファイルの一部である。 図５は、実施例１において、相互作用しうるタンパク質の組合せについて、発現プロファイルを用いて入力依存性、出力依存性及びシグナル強度を計算した結果の一部である。 図６は、実施例１において、各タンパク質の相互作用の入力依存性をＸ軸に、出力依存性をＹ軸に取って作成した図である。円が大きいほどシグナル強度が強いことを示し、色が濃いほど誘導度が大きいことを示す。 図７は、図６と同じ図に、固形癌を対象として上市された分子標的薬のターゲットとなる細胞間相互作用を示したものである。 図８は、図６と同じ図に、マウス間質細胞からヒト癌細胞へのシグナルのうち、抗腫瘍薬の標的となり得ると考えられる強い相互作用を示したものである。 図９は、ヒト癌細胞株を移植したマウスに、図８に示す相互作用の阻害剤と既存及び／又は抗癌剤を投与した後の腫瘍容積の経時変化を示す。 図１０は、ヒトの膵癌組織の免疫染色に用いた抗体のクローン及び希釈倍率を示す。 図１１は、ヒトの膵癌組織の免疫染色の結果を示す。 図１２は、ヒトとマウスの配列を分離する工程の分離能の精度の検証を行うために、ヒト組織由来RNA、マウス細胞由来のRNAをそれぞれ配列解読し、マウスのRefSeq RNA、ヒトRefSeq RNAにマッピングして振り分けられた配列の数の結果を示す。 図１３は、細胞間の相互作用の解析システムの一例を示す。 図１４は、実施例２において、配列解読したRNAをヒトとマウスの配列に分けた発現プロファイルの一部である。 図１５は、実施例２において、相互作用しうるタンパク質の組合せについて、発現プロファイルを用いて入力依存性、出力依存性及びシグナル強度を計算した結果の一部である。 図１６は、実施例２において、各タンパク質の相互作用の入力依存性をＸ軸に、出力依存性をＹ軸に取って作成した図である。円が大きいほどシグナル強度が強いことを示し、色が濃いほど誘導度が大きいことを示す。 図１７は、図１６と同じ図に、これまでに報告されている主な表皮角化細胞と線維芽細胞における細胞間相互作用を示したものである。
　本発明に係るタンパク質の相互作用の解析方法の一態様は、２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析方法であって、
　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る工程と、
　細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程と、
　前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の組合せの中で、前記２以上の個体の１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高く、かつ、前記１の個体とは別の個体において、前記タンパク質の他方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高くなっている場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、を含む。
［発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程］
　本明細書において、２以上の個体は、核酸を有する異なる個体であればよく、同種の個体であっても、異種の個体であってもよい。核酸を有する個体としては、例えば、動物（ヒト、マウス、ラット、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ等）、植物、及びウイルスが挙げられる。
　本明細書において、微小環境とは、異なる個体に由来する細胞が相互作用しうるよう共存したin vivo又はin vitroの環境を意味し、遺伝子の発現プロファイルを得るために十分な数の細胞を含む限り、大きさは特に限定されない。
　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境は、それぞれの細胞が相互作用しうるように接触させて共培養することや、ウイルスや細菌を細胞に感染させることによって作ることができる。また、微小環境は、ウイルスや細菌が感染することによって作り出された天然の環境であってもよい。
　なお、後述するとおり、遺伝子の発現プロファイルを得るために並列型シーケンサーを用いる場合には、それぞれの個体が、並列型シーケンサーの解読長となる約２０ｂｐ～約３０００ｂｐ程度の配列で識別可能であることが望ましい。
　２以上の個体に由来する細胞又はウイルスを微小環境で共存させた系の例としては、ウサギ細胞とヒト細胞の混合培養系；マウス細胞とヒト細胞の混合培養系；ウサギ細胞、マウス細胞、及びヒト細胞などの３種混合培養系；ウイルスを感染させた宿主細胞；同一種の別個体に由来する細胞の混合培養系；ヒト癌細胞株マウス移植モデルにおける癌と間質の相互作用評価系；ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞とマウスフィーダー細胞共培養モデルにおける幹細胞維持のための相互作用評価系；ヒト血液幹細胞マウス骨髄移植モデルにおける血液幹細胞維持微小環境の評価系；皮膚３次元培養モデルにおける表皮層（ヒト）と真皮層（マウス）の相互作用の評価系などが挙げられるがこれらに限定されない。これらの培養や、宿主細胞へのウイルスの感染は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
　本明細書において、遺伝子の発現プロファイルとは、複数の（通常は多数の）遺伝子群において、どの遺伝子がどれくらい発現しているかを示す情報をいう。発現量は、絶対的な数値で表されていてもよく、相対的な数値で表されていてもよい。発現量は、遺伝子間で適切に比較できるよう、ノーマライズした数値で表されていてもよい。
　また、本明細書において、用語「発現」は、ゲノムＤＮＡを鋳型としてRNAが産生される転写と、RNAの塩基配列に規定された情報に従ってタンパク質が合成される翻訳のいずれも含むものとして使用される。
　微小環境における遺伝子の発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法にしたがって、微小環境に含まれるRNA又はタンパク質の発現量を測定し、それぞれのRNA又はタンパク質がいずれの個体に由来するか判別することによって行うことができる。
　例えば、２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境から、ＲＮＡを抽出し、各ＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列を解読する工程と、前記解読した配列データに基づいて、前記ＲＮＡのそれぞれがどの個体に由来するかを特定し、かつ、それぞれの個体に由来する細胞おける各遺伝子の発現量を求める工程によって行うことができる。
　ＲＮＡの抽出は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。例えば、グアニジン－塩化セシウム超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）や、Acid guanidinium-Phenol-Chloroform法（ＡＧＰＣ法；Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）により、全ＲＮＡを調製してもよい。全ＲＮＡを抽出して解析を行うことにより、微小環境におけるトランスクリプトームを網羅的に調べることができる。
　ＲＮＡの塩基配列の解読には、並列型シーケンサーを用いることができる。並列型シーケンサーは、超並列型シーケンサー、次世代型シーケンサー、高速シーケンサー等とも呼ばれ、大量の核酸断片（例えば、数千万から1億の100bp程度の核酸）の配列を並行して極めて高速で解読できる装置をいう。典型的にはGenome Analyser・Hiseq・Miseq（Illumina社）、SOLiD・IonTorrent PGM（LifeTechnologies社）、The PacBio RS（Pacific BioScience社）、Heliscope（Helicos社）、The Polonator（Dover Systems社）、454 GS（Roche社）、Oxford Nanopore Technologies社の技術を用いた製品などが含まれるがこれらに限定されるものではない。
　また、ＲＮＡの塩基配列の解読は、マイクロアレイによって行うこともできる。
　塩基配列の解読に用いられる核酸は、抽出ＲＮＡから逆転写酵素によって作られたｃＤＮＡとすることができ、例えば、mRNA由来のｃＤＮＡや、microRNAなどのsmall RNA、non-coding RNA、intronic RNA由来のcDNAも含まれるが、これに限定されることなくゲノムＤＮＡであってもよい。
　なお、塩基配列の解読は、遺伝子の発現プロファイルが得られる限り、核酸の断片の全長について行ってもよく、一部について行ってもよい。
　次に、解読した配列データに基づいて、ＲＮＡのそれぞれがどの個体に由来するかを特定する工程は、例えば、並列型シーケンサーで配列を解読した場合、各配列を、各個体が属する種の遺伝子配列のデータベースに収載されている配列に対してアラインメントを行い、類似性が所定値以上か否かで決定することができる。この工程に用いられるデータベースとしては、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）が提供するRefSeq、UCSC Genome Browser、European Bioinformatics Institute（EBI）が提供するデータベースが挙げられる。
　例えば、ヒトとマウスに由来する細胞が共存する系の場合、並列型シーケンサーで解読した各配列を、RefSeqに保存されたヒトの配列に対してアラインメントし、類似性が所定値より高いものはヒトの遺伝子として分類し、マウスの配列に対してアラインメントし、類似性が所定値より高いものはマウスの遺伝子として分類する。ここで、類似性が所定値より高いか否かは、類似性を示すスコアを用いて行うこともできるし、ミスマッチの数が所定の数より少ないことをもって判断してもよい。
　例えば、ヒトの遺伝子配列のデータベースでアラインメントを行った結果、５０塩基あたりミスマッチを３つ含むものまで、ヒト由来であると判定することができる。５０塩基あたりのミスマッチを２つ、又は１つ含むものまでヒト由来と分類することで、より精度をあげることができる。
　本発明は、２以上の個体に由来する細胞間の相互作用を解析するものであるため、いずれの個体に由来するのか判別できない遺伝子（上記の例であれば、ヒトかマウスか判別できない遺伝子）は、この段階で検討対象からはずしてもよい。
　また、遺伝子配列が既知の個体由来の細胞と、遺伝子配列が未知の個体由来の細胞が共存している微小環境を解析する場合、前者の個体の遺伝子配列に関するデータベースのみを用い、データベースに収載された配列とアラインしないものを後者の個体由来と分類してもよい。
　並列型シーケンサーで配列を解読した場合、それぞれの個体における各遺伝子の発現量は、例えば、同じ配列が解読された回数を数えることによって行うことができる。
　また、解読した配列データに基づいて、ＲＮＡのそれぞれがどの個体に由来するかを特定する工程は、マイクロアレイで配列を解読する場合、個体を判別できるようにマイクロアレイのプローブの配列をデザインしておくことによって行うことができる。
　マイクロアレイで配列を解読する場合、各遺伝子の発現量は、例えば、プローブにハイブリダイズした核酸を検出する際の蛍光強度等、公知の方法で測定することができる。
　微小環境における遺伝子の発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、微小環境からペプチド（タンパク質を含む）を抽出し、各ペプチドの少なくとも一部のアミノ酸配列を解読する工程と、前記解読した配列データに基づいて、前記ペプチドのそれぞれがどの個体に由来するかを特定し、かつ、それぞれの個体における各ペプチドの発現量を求める工程によって行ってもよい。
　微小環境からのペプチドの抽出は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。各ペプチドのアミノ酸配列を解読する工程は、公知の方法またはそれに準ずる方法で行うことができ、例えばペプチドシーケンサーや質量分析器が挙げられる。
　各アミノ酸配列が同定されたら、ペプチドのそれぞれがどの個体に由来するかを特定する工程は、ＲＮＡの場合と同様に、各配列を、各個体が属する種のタンパク質のデータベース中のアミノ酸配列と比較してアライメントを行い、所定の類似性以上か否かで決定することができる。この工程に用いられるデータベースとしては、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）が提供するRefSeqが挙げられる。
　上述の工程で得られる発現プロファイルの一例を下表に示す。表中の数値は発現量を示す。
　例えば、２以上の個体がヒトとマウスである場合、それぞれ２万－３万の遺伝子があり、１細胞あたりRNAが３０万程度発現していると考えられている。したがって、全ＲＮＡを抽出して並列型シーケンサーで配列を解読し、種ごとの配列データベースで公開されている配列に対してアラインメントし、ヒト由来とマウス由来に振り分ける場合、アラインメントの結果ヒトかマウスか判別できない遺伝子は対象外としても、下表は数千桁を超えるものになることが想定される。
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［タンパク質の組合せを選択する工程］
　本発明に係るタンパク質の相互作用の解析方法の一態様では、上述した発現プロファイルを得る工程を行う一方、細胞間で相互作用し得る２つのタンパク質の組合せを選択する。
　細胞間で相互作用しうる２以上のタンパク質の組合せを選択する工程は、タンパク質の種々の相互作用に関するデータベースや文献、実験データに基づいて行うことができる。　例えば、相互作用しうるタンパク質の組合せとして、タンパク質の結合情報又は相互作用情報のデータベースを利用して、結合するタンパク質の組合せを選択することができる。また、タンパク質の局在情報のデータベースを利用して、いずれのタンパク質も細胞外又は細胞膜に局在する組合せを選択してもよい。また、複数の条件で選択された組合せのいずれにも含まれる組合せを選択してもよい。
　また、データベースの情報だけでは、細胞表面のタンパク質間の相互作用が同一細胞上で起こるのか、異なる細胞間で起こるのか判別できない場合がある。かかる場合には、文献や実験データ等に基づいて、細胞間で相互作用するタンパク質の組合せのみ選択してもよい。このような情報を含めて細胞間で相互作用しうるタンパク質の組合せについて、新たにデータベースを構築してもよい。
　さらに、タンパク質のパスウェイ情報のデータベースを利用して、上記タンパク質の組合せにおけるタンパク質間のシグナル伝達の方向を特定しておいてもよい。シグナル伝達の方向を特定するとは、例えば、どちらのタンパク質が活性化や阻害を行い、どちらのタンパク質が活性化や阻害を受けるのかを特定することを意味する。
　以下、相互作用しうるタンパク質の組合せにおいて、シグナル伝達の方向の上流にある分子、即ち活性化や阻害を行うタンパク質を入力分子と呼び、下流にある分子、即ち活性化や阻害を受けるタンパク質を出力分子と呼ぶことがある。例えば、リガンドは入力分子であり、受容体は出力分子である。
　本工程で用いることができるタンパク質の結合情報・相互作用情報のデータベース、局在情報のデータベース、パスウェイ情報のデータベースとしては、例えば、HPRD(URL http://www.hprd.org/),KEGG(URL www.genome.jp/kegg/),BIND(URL  http://bind.ca XXX),BioGRID(URL http://thebiogrid.org/)等が挙げられる。また、その他の商用データベース、文献や実験データ等に基づいて新たに作成したデータベースを用いてもよく、複数のデータベースを組み合わせて用いてもよい。
　なお、発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程と、タンパク質の組合せを選択する工程とは、いずれを先に行ってもよく、並行して行ってもよい。
［重要な相互作用を推測する工程］
　次に、上記で得られた情報に基づいて、上記工程で選択したタンパク質の組合せの中から、２以上の個体に由来する細胞間において重要な相互作用を推測する。
　この工程では、発現プロファイルに基づいて、選択したタンパク質の組合せの中で、２以上の個体のいずれか１の個体において、タンパク質の一方をコードする遺伝子の発現量が他の個体より高く、かつ、上記１の個体とは別の個体において、タンパク質の他方をコードする遺伝子の発現量が他の個体より高くなっている場合に、そのタンパク質の組合せによる相互作用が、２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する。
　例えば、個体Ａ及びＢに由来する細胞が共存する微小環境を解析した場合であって、選択されたタンパク質の組合せがタンパク質Ｘ、Ｙであり、これをコードする遺伝子が遺伝子ｘ、ｙである場合を想定する。個体Ａ由来の細胞と個体Ｂ由来の細胞の発現プロファイルを比較して、遺伝子ｘはＡ由来の細胞において発現が高く、遺伝子ｙはＢ由来の細胞において発現が高い場合、タンパク質ＸとＹは、これらの細胞間において重要な相互作用を担っている可能性が高いと評価することができる。
　また、複数のタンパク質の組合せにおいて、一方の遺伝子がＡ由来の細胞において発現が高く、他方の遺伝子はＢ由来の細胞において発現が高いという傾向が高いほど、重要な組合せである可能性が高いと評価することができる。
　相互作用をより具体的に評価する指標の例として、以下に示す入力依存性、出力依存性、及びシグナル強度を用いてもよい。
　入力依存性：ＸA／（ＸA＋ＸB）
　出力依存性：ＹA／（ＹA＋ＹB）
　シグナル強度：ＸA×ＹB
　ただし、Ａ、Ｂはそれぞれ個体を示し、Ｘ及びＹは選択された組合せに含まれる個々のタンパク質を示し、ＸAは個体Ａにおけるタンパク質Ｘの発現量、ＸBは個体Ｂにおけるタンパク質Ｘの発現量、ＹAは個体Ａにおけるタンパク質Ｙの発現量、ＹBは個体Ｂにおけるタンパク質Ｙの発現量をそれぞれ示す。ここでＸは入力分子、Ｙは出力分子である。
　入力依存性（ＸA／（ＸA＋ＸB））は、入力分子（例えばリガンド）となるタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、どちらの個体に由来する細胞に偏っているかを表す指標である。例えばマウス細胞からヒト細胞へのシグナル伝達を考えた場合、すなわち入力分子がマウス細胞に由来し、出力分子がヒト細胞に由来する場合、
　入力依存性＝入力分子マウス／（入力分子マウス＋入力分子ヒト）
となり、逆にヒト細胞からマウス細胞へのシグナル伝達を考えた場合、
　入力依存性＝入力分子ヒト／（入力分子マウス＋入力分子ヒト）
となる（入力分子XXは、ＸＸの細胞での入力分子の発現量を示す。）。
　この指標が高い細胞間で伝達されるシグナルは、入力分子の発現が片方の個体由来の細胞に片寄っており、シグナルの入力にはその個体由来の細胞の寄与が大きいと考えられる。この指標以外にも入力分子となりうるタンパク質やそのＲＮＡの発現がどの個体由来の細胞に片寄っているかということを示す種々の指標を用いることができる。
　出力依存性（ＹA／（ＹA＋ＹB））は、出力分子（例えば受容体）となるタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、どちらの個体に由来する細胞に偏っているかを表す指標である。例えばマウス細胞からヒト細胞へのシグナル伝達を考えた場合、
　出力依存性＝出力分子ヒト／（出力分子マウス＋出力分子ヒト）
となり、逆にヒト細胞からマウス細胞へのシグナル伝達を考えた場合、
　出力依存性＝出力分子マウス／（出力分子マウス＋出力分子ヒト）
となる。
　この指標が高い細胞間で伝達されるシグナルは、出力分子が片方の個体由来の細胞に片寄っており、シグナルの出力にはその個体由来の細胞の寄与が大きいと考えられる。この指標以外にも出力分子となりうるタンパク質やそのＲＮＡの発現がどの個体由来の細胞に片寄っているかということを示す種々の指標を用いることができる。
　シグナル強度（ＸA×ＹB）は、入力分子と出力分子の発現量の積であり、この指標が高いと細胞間のシグナルや刺激が強いと考えられる。発現量の積は対数で表してもよい。これ以外にも入力分子の発現量と出力分子の発現量の両方を加味した種々の指標を用いることができる。
　入力依存性、出力依存性の両者が高いものは、シグナル入力において一方の個体由来の細胞の寄与が大きく、出力において他方の個体由来の細胞の寄与が大きいと考えられる。このことは、両細胞間で伝達されるシグナルが、両細胞が微小環境において共存することによって初めて生じる相互依存性の強いシグナルであることを意味しうる。さらに、シグナル強度が強い場合、当該相互作用が両細胞間においてより重要であると評価することができる。
　また、上記入力依存性、出力依存性、及びシグナル強度に代わるものとして、f(t)及びg(t)を単調増加関数として、
　f(XA)/f(XA+XB)、f(YA)/f(YA+YB)、g(XA)*g(YB)
　または、
　f(XA)－f(XA+XB)、f(YA)－f(YA+YB)、g(XA)＋g(YB)
などを指標として、相互作用の重要性を評価することもできる。
　入力依存性、出力依存性、及びシグナル強度に加えて、それぞれの細胞を単独で培養した場合と比較した発現量の増加を指標（誘導度）としてもよい。誘導度が高いものは、細胞を共存させることによって発現量が増加したものと理解される。したがって、誘導度が高いタンパク質の組合せも、その相互作用が両細胞間において重要であると評価することができる。
　上述のとおり、本発明に係るタンパク質の相互作用の解析方法によれば、２以上の個体に由来する細胞が共存する環境において、それぞれの個体に由来する細胞間の重要な相互作用を担うタンパク質を特定することができる。
　なお、本発明に係る解析方法は、上述した具体例に限定されることなく、当業者が適宜変更を加えて実施することができる。例えば、入力依存性、出力依存性、シグナル強度等の指標は、本発明の目的が達成される限り、別の指標を用いることができる。
　また、本発明に係るタンパク質の解析方法では、相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択するが、本発明の方法を複数回用いることにより、３以上のタンパク質の相互作用の解析に用いることも可能である。
［スクリーニング方法］
　本発明に係る解析方法を用いて各種のスクリーニングを行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法の一態様として、生理活性物質のスクリーニング方法が挙げられる。
　本発明に係る生理活性物質のスクリーニング方法は、２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境を形成する工程と、本発明の解析方法で、２以上の個体に由来する細胞間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、かかるタンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む。
　この方法によれば、２以上の個体に由来する細胞間の重要な相互作用の阻害を通じて、生体の機能を調節しうる物質を同定することができる。同定された生理活性物質は、医薬や実験用試薬として利用することができる。
　本発明のスクリーニング方法の一態様として、抗がん剤のスクリーニング方法が挙げられる。
　この場合、モデル動物に、該モデル動物とは異なる種に由来するがん細胞株を移植し、がん細胞とモデル動物由来細胞とが共存している微小環境を形成する工程と、本発明の解析方法で、前記モデル動物において、がん細胞とモデル動物由来細胞との間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、前記タンパク質間の相互作用を阻害する化合物を選択する工程と、を含む。
　かかる方法によれば、がん細胞株を移植することによって、がん細胞とモデル動物細胞との間に初めて生じる重要な相互作用を同定することができる。かかる相互作用は、がん細胞の増殖に関与するものと考えられるから、これを阻害する化合物は抗がん効果を有しうる。
　なお、この方法で選択される化合物は、例えば移植されたがん細胞がヒトに由来するものである場合、一義的にはヒトがん細胞で発現するタンパク質とモデル動物由来細胞で発現するタンパク質との相互作用を阻害しうるものである。しかしながら、本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、ヒトがん細胞とモデル動物由来細胞を共存させたときにモデル動物由来細胞で発現が高くなるタンパク質は、ヒトがん細胞周囲のヒト間質細胞においても発現が増加していることを確認した。したがっ・BR>ト、本発明に係るスクリーニング方法で選択された医薬品は、ヒトの生体内においてもがん細胞と周辺細胞との相互作用を阻害することによって、抗がん作用を示す可能性が高いものと考えられる。
　本スクリーニング方法によって選択可能な抗がん剤が対象とするがんの種類は、モデル動物に移植できるものである限り、特に限定されない。例えば、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、骨肉腫、大腸癌、皮膚癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫が挙げられるがこれらに限定されない。また、このスクリーニング方法で、癌悪液質に対する医薬も選択されうる。
　また、本発明に係るスクリーニング方法の別の態様として、抗ウイルス剤のスクリーニング方法が挙げられる。この場合、in vitroで動物又は植物細胞にウイルスを感染させ、細胞とウイルスとが共存している微小環境を形成する工程と、本発明の解析方法で、細胞とウイルスとの間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、前記タンパク質間の相互作用を阻害する化合物を選択する工程と、を含む。
　かかる方法によれば、ウイルスによる動物細胞への作用を防ぐ抗ウイルス剤が選択されうる。
　本スクリーニング方法において、タンパク質間の相互作用を阻害する化合物を選択する工程は、例えば、当該タンパク質間の相互作用を阻害することが既に知られている化合物をデータベース等から検索することによって行ってもよい。
　また、公知の方法又はそれに準ずる方法にしたがって、当該タンパク質間の相互作用を阻害する化合物を同定するスクリーニング系を構築し、実験を行って探索してもよい。
　候補化合物としては、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド（タンパク質を含む）等が挙げられるがこれらに限定されない。
［膵癌の治療薬及び治療方法］
　本発明に係る膵癌の治療薬は、Picropodophyllin（ＰＰＰ）、PD173072及びPF562271からなる群の少なくとも１種を含む。
　本発明者らは、本発明に係る解析方法により、ヒト膵癌細胞株を移植したマウスにおいて、i) IGF1→IGF1R、ii) FGF7→FGFR3、iii) FN1,COL1A2,COL1A2→ITGA2,ITGA3,ITGB6の３種類の相互作用が重要であることを同定した。
　そして、これらの相互作用を阻害することが知られている３種の化合物Picropodophyllin（PPP）、PD173072、及びPF562271を混合してモデルマウスに投与したところ、後述する実施例に示すとおり、３種の化合物の合計の濃度が、従来の実験に用いられる量の投与量の１０分の１程度であったにもかかわらず、腫瘍細胞の増殖が著しく抑制されることを確認した。
　本発明に係る膵癌の治療薬は、上記化合物を薬理学上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（例えば、錠剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、等）の形態で経口的又は非経口的に投与することができる。医薬組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。
　本発明に係る膵癌の治療薬は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与時間間隔、投与方法、薬剤に対する感受性等に応じて適宜選ぶことができる。例えば、経口剤の場合は、通常成人として１日あたり、１－１００００ｍｇ、好ましくは１０－２０００ｍｇを１日１－数回に分けて投与する。注射剤の場合は、通常成人として１日あたり、通常０．１ｍｇ－１００００ｍｇであり、好ましくは１ｍｇ－２０００ｍｇである。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
　図１に、本発明に係る解析方法の一実施例を説明する概念図を示す。
　まず、図左上に示すようにマウスにヒトの癌細胞を移植して、ヒト癌細胞とマウス間質細胞が共存する微小環境を形成した。次に、その微小環境からRNAを抽出し、並列型シーケンサーで各RNAの塩基配列を解読し（上段右）、既存のデータベースを用いて、各RNAがヒトとマウスのどちらに由来するのかを振り分け、ヒト又はマウスごとの発現プロファイルを得た（下段右）。続いて、各種データベース等を用いて相互作用しうるタンパク質の組合せを選択し（下段中央）、発現プロファイルを用いて各組合せの入力依存性、出力依存性、シグナル強度、及び誘導度を求めて、グラフにした（下段左）。
　以下、各工程について詳しく説明する。
［1. RNA抽出］
　膵癌細胞株Capan-1、KLM-1、PK-8、Panc-1、PH45Hの5株についてRPMI-1640+10%FBS、DMEM＋2mM L-glutamine＋20%FBS、5%CO2の条件で培養し、移植細胞数：2～8×10＾6個の細胞を5～6週令の雌BALB/cAJc1-mu/muマウス（日本クレア）：マウスの皮下に注射し移植株を作成した（図２）。
　作成した移植株を取り出し周囲の皮膚組織、結合組織を除いた径3mm程度の腫瘍組織からTrizol Reagent（Invitrogen）を用いてtotal RNAを抽出した。
［2. 配列解読とマウス、ヒトの発現プロファイル作成］
　Total RNAからGenome Analyser（Illumina社）のRNA-seqのpair-endプロトコールに従いライブラリーを作成し、両端50bpずつを配列解読した。得られるデータの形式の一部を図３に示す。50bpの配列データが3000～5000万桁程度得られた。
　得られた配列をマウス、ヒトの公共遺伝子配列であるRefSeq 配列(NCBI)にEland program（Illumina社）を用いて50bp中1bpのミスマッチは許容するという条件でマッピングし、両端が同じ遺伝子にマッピングされるもの以外は棄却した。
　マウスのRefSeq、ヒトのRefSeqに対して両者ともにマッピングされるものは棄却し、ヒト、マウスどちらか一方の由来が決まるもののみ採用した。その結果それぞれの細胞株に対して約1000万～3000万個程度の配列をデータとして採用した。ヒト、マウスの個々のRefSeqに対してマッピングされた配列の個数をカウントし発現量とした。発現量は遺伝子のpoly-Aからの距離、GCコンテンツ、マッピング可能な領域の長さで補正し、発現が上位の10%の遺伝子を除いたのち全体の数値の和が30万（一般に１細胞あたりのRNAの個数といわれている）になるようにノーマライズを行った。
　得られた発現プロファイルの一部を図４に示す。
［3. 相互作用しうるタンパク質の選択-1］
　本工程は、公共パスウェイ、タンパク質間結合データベースから、細胞間タンパク相互作用データベースの構築することにより行った。
　以下では、遺伝子産物であるタンパク質とタンパク質の相互作用において、一方のタンパク質をLigand、もう一方をReceptorと定義する。特に相互作用に方向性がある場合、活性化や阻害を行うタンパク質（入力分子）をLigand、性化や阻害をうけるタンパク質（出力分子）をReceptorと定義する。
　LigandやReceptorとなるタンパク質の局在について、タンパク質間データベースであるHPRD(HPRD interaction: www.hprd.org/)の局在情報をXMLファイルより抽出し、primary locationがExtracellularもしくはPlasma membraneを含むものを取り出した。
　パスウェイデータベースKEGG（http://www.genome.jp/kegg/）より方向性を含めた相互作用の情報をXMLファイルより取り出した。LigandおよびReceptorの割り振りについては、KEGGデータベース中に方向性があるものはその通り従い、ないものは適当に割り振った。HPRDとKEGGのファイルを併せて共通するものを抽出し細胞間タンパク質相互作用ファイルの原型を作成した。
［4. 相互作用しうるタンパク質の選択-2］
　上記3.で得られた細胞間タンパク質相互作用ファイルの原型について、個別に根拠となった文献をあたり遺伝子名の間違いや同一細胞上でしか相互作用しない膜タンパク同士の相互作用を棄却した。その結果KEGGの異なるパスウェイ上に複数出現するものを含めて1791個の細胞間タンパク相互作用データベースが作成された。
［5. 発現プロファイルと細胞間タンパク相互作用データベースを用いた、相互依存性の算出］
　上記2.で求めたマウス、ヒトの遺伝子発現プロファイルを、4.で求めた細胞間タンパク質相互作用のデータベースに組み入れることにより、それぞれの相互作用の相互依存性を算出した。
　具体的にはマウスの間質細胞からヒト癌細胞へのシグナルの依存性については、Ligand（入力分子）についてはLigand-M/（Ligand-H+Ligand-M）、Receptor（出力分子）についてはReceptor-H/(Receptor-M+Receptor-H)となるような数値指標（0～1）を求めた。Receptor-Mは解析モデル系におけるマウス側の受容体の発現量を表す。この数値指標が１に近いと、LigandとReceptorのそれぞれの発現がマウス細胞、ヒト細胞で異なることになり、当該シグナルについては異種細胞同士の相互依存性が高いと考えられる。
　同様にヒト癌細胞からマウスの間質細胞へのシグナルの依存性についてはLigand（入力分子）についてはLigand-H/（Ligand-M+Ligand-H）、Receptor（出力分子）についてはReceptor-M/（Receptor-H+Receptor-M）となるような数値指標（0～1）を求めた。またシグナル強度についてはLigand x Receptorの底を2とする対数を用いた。3.で求めた1791個の相互作用について上記の3つの数値（入力依存性、出力依存性、シグナル強度）を求めた。図５に結果の一部を示す。
［6. 細胞間シグナル相互依存性の全体像の可視化］
　1.～5.の工程で解析した細胞株の一つについて、入力依存性をＸ軸、出力依存性をＹ軸に取り、一つの細胞間タンパク相互作用を一つの円で表した図を作成した（図６）。円の大きさはシグナル強度を表す。
　ヒト癌細胞からマウスの間質細胞へのシグナル（左）、およびマウスの間質細胞からヒト癌細胞へのシグナル（右）を別個に作成した。シャーレで培養している状態のがん細胞から抽出したRNAについても、1.及び2.と同様の遺伝子発現プロファイルを行い、左図についてはヒトLigandの遺伝子について、右図についてはヒトReceptorの遺伝子について、移植した状態とシャーレで培養した状態との発現量の比（誘導度）を円の色の濃さで表した。
　図７は、図６と同じ図に、これまでに固形癌を対象として上市された分子標的薬のターゲットとなる細胞間相互作用を示したものである。それぞれの相互作用と分子標的薬を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　図示されるとおり、上市されている分子標的薬のターゲットとなる相互作用は、入力依存性又は出力依存性の少なくともいずれかがかなり高い（1に近い）ことが示され、本発明による方法で重要な相互作用を予測できることを検証できた。
［7. 低分子化合物で介入可能な、マウス間質細胞からヒト癌細胞へのシグナルの選択］
　上記5.で求めた1791個の相互作用の数値、および6.の工程でそれを可視化した図を用いて、すでに抗腫瘍薬として臨床治験に入っている低分子化合物を用いて阻害が可能と思われる3つの相互作用を選び出した。すなわちi) IGF1→IGF1R、ii) FGF7→FGFR3、iii) FN1,COL1A2,COL1A2→ITGA2,ITGA3,ITGB6のシグナルである。
　これらの相互作用はCapan-1、KLM-1、PK-8、Panc-1、PH45Hの5個の細胞株の入力依存性、出力依存性、シグナル強度の中央値が図８に示される通りであり間質細胞と癌細胞の相互作用が強いと考えられる。
［8. 膵癌移植株への低分子阻害剤投与による、相互作用の実証］
　上記i)、ii)、及びiii)のシグナル経路はそれぞれ低分子阻害剤Picropodophyllin(PPP)（Yin S. et a., Neuro Oncol. 2010 Jan; 12(1):19-27.）、PD 173074（Lamont FR. et al., Br J Cancer. 2011 Jan 4;104(1):75-82.）、PF562271（Roberts WG. et al., Cancer Res. 2008 Mar 15;68(6):1935-44.）を用いて阻害可能であることが報告されている。
　そこで、これらの3つの化合物を用いて、Panc-1の細胞株についてヌードマウスに1.と同様の手法で皮下移植株を作成した。
　外表から測定した腫瘍の大きさが平均80mm3程度になった時点で、5mg/KgBWで週2回の投与を開始し、腫瘍の増殖が抑制されるか確認を行った。また併せて膵癌に特異的なゲノムの変異のおこるK-rasのシグナルを阻害する低分子阻害剤Salirasib（FTA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=17909812）との相乗効果も検討した。コントロール群、その腫瘍の容積を測定した結果を図９に示す。
　Picropodophyllin(PPP)、PD173074、PF562271の3剤混合、およびFTAの単独投与群ではコントロール群に対して有意な腫瘍の抑制は見られないが、両者を併用投与すると腫瘍の増殖が抑制され、両者に相乗効果があることがわかった。3剤の投与量は、上記のそれぞれの文献で報告されている投与量に比較して、週当たりの投与量がそれぞれ1/28倍程度、1/14程度、1/35程度であり3剤を併用することの相乗効果が十分あると考えられる。
［9. 膵癌臨床検体を用いた癌と間質の相互作用の検証］
　上記7.で選択したマウス間質細胞→ヒト癌細胞に向かう3つのシグナルのLigand、Receptorとなる分子が、実際のヒトの膵癌組織においてそれぞれ血管を含む間質細胞と膵癌細胞に主な発現が局在しているかをその一部について免疫染色にて検証した。ホルマリン固定パラフィン包埋原発性膵癌の手術摘出検体症例の薄切組織を使って、ITGA2,  CollagenType1 (COL1A1,COL1A2によって構成される),FN1,IGF1R のタンパクに対する一次抗体を用いて免疫染色を行った（クローンおよび希釈倍率は図１０）。結果を図１１に示す。マウス移植株での相互作用解析の結果と一致してReceptorとなるIGF1R,ITGA2は主に癌細胞に強い染色性が見られ、LigandとなるCollagen Type1, FN1は主に間質の細胞に強い染色性が得られた。これによりヒト細胞、マウス細胞を用いたモデル系の細胞間相互作用解析の結果が、実際の生物現象をよく反映することが確認された。
［10. マウスとヒトの配列分離能の検証］
　上記2.で行ったヒトとマウスの配列を分離する工程の分離能の精度の検証を行うために、ヒト組織由来RNA、マウス細胞由来のRNAをそれぞれ配列解読して2.と同じ工程を行った。
　マウスのRefSeq RNA, ヒトRefSeq RNAにマッピングして振り分けられた配列の数の結果を図１２に示す。ヒト組織、マウス細胞のいずれの場合でも99.9%以上の精度で由来の動物種を特定できた。これにより本発明の実施例で行われた2.の工程は精度よくヒトとマウスの動物種別にＲＮＡ断片を分離可能であることが確認された。
［11. 解析システムの構成］
　上記解析方法の各工程は、それぞれ特定用途のハードウェアまたは汎用のハードウェアによって実装可能である。
　図１３は、細胞間の相互作用の解析システムの一例を示す。第１の解析装置７２は、上記2.の工程を実装するものであり、２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得ることができる。第２の解析装置７３は、上記5.の工程を実装するものであり、細胞間タンパク相互作用データベースと固体ごとの発現プロファイルとに基づいて、個体間の相互作用の相互依存性を解析する。第３の解析装置７５は、上記6.の工程を実装するものであり、個体間の相互作用の相互依存性の解析結果に関する図表を作成する。
　まず、第１の解析装置７２に、並列型シーケンサー７１によって解読された配列に関する配列ファイルが入力される。第１の解析装置は配列データの振り分け処理を行い、ヒトとマウスそれぞれの発現プロファイルを作成する。なお、図４は、第１の解析装置７２によって作成されたヒトとマウスの発現プロファイルの一例である。
　作成された発現プロファイルは第２の解析装置７３に渡される。第２の解析装置７３は、細胞間タンパク相互作用データベース７４に含まれる相互作用データと第１の解析装置７２から受け取ったヒトとマウスそれぞれの発現プロファイルとに基づいて、ヒトとマウスの細胞間におけるタンパク質の相互作用を解析し、それぞれの相互作用の相互依存性を示す3つの数値（入力依存性、出力依存性、シグナル強度）を算出する。相互作用データベース７４は、方向性を含めたタンパク質間の相互作用の情報を相互作用データとして蓄積したデータベースであり、上記3.及び4.に記載されたデータベースを適用可能である。なお、図５は、第２の解析装置７３によって算出された数値の一例である。
　第３の解析装置７５は、第２の解析装置７３により算出された相互作用の相互依存性を示す数値に基づいて、相互作用の相互依存性を可視化して示す図表を作成し、ディスプレイ等の出力装置７６に出力する。なお、図６は、出力装置７６に出力される図表の一例である。
　本発明がIn vitro環境下の培養細胞においても相互作用解析可能であることを検証する目的で、ヒト由来表皮角化細胞およびマウス由来線維芽細胞を共培養し、両細胞が共存する微小環境を形成した。次に、その微小環境からRNAを抽出し、並列型シーケンサーで各RNAの塩基配列を解読し、既存のデータベースを用いて、各RNAがヒトとマウスのどちらに由来するのかを振り分け、ヒト又はマウスごとの発現プロファイルを得た。続いて、各種データベース等を用いて相互作用しうるタンパク質の組合せを選択し、発現プロファイルを用いて各組合せの入力依存性、出力依存性、シグナル強度を求めて、グラフにした。
　以下、各工程について詳しく説明する。
［1. RNA抽出］
　マウス胎仔由来線維芽細胞株NIH-3T3を6 well plateに0.1～3 X 10^4個播種し、DMEM+10%FBSで培養後、KG-2（クラボウ社）で培養したヒト表皮正常細胞をNIH-3T3細胞を播種した6well plateに0.1～3 X 10^4個で播種し、さらにDMEM+10%FBSで48時間培養後RNeasy mini kit（Quiagen）を用いてTotal RNAを抽出した。
［2. 配列解読とマウス、ヒトの発現プロファイル作成］
　実施例１と同様に、Total RNAからGenome Analyser（Illumina社）のRNA-seqのpair-endプロトコールに従いライブラリーを作成し、両端50bpずつを配列解読した。図３に示すのと同様のデータ形式で、50bpの配列データが3000～5000万桁程度得られた。
　得られた配列から、実施例１の［2. 配列解読とマウス、ヒトの発現プロファイル作成］と同じ方法で発現プロファイルを作製した。
　得られた発現プロファイルの一部を図１４に示す。
［3. 相互作用しうるタンパク質の選択-1］
　本工程も、実施例１の［3. 相互作用しうるタンパク質の選択-1］と同様に行った。
［4. 相互作用しうるタンパク質の選択-2］
　上記3.で得られた細胞間タンパク質相互作用ファイルの原型について、個別に根拠となった文献をあたり遺伝子名の間違いや同一細胞上でしか相互作用しない膜タンパク同士の相互作用を棄却した。その結果KEGGの異なるパスウェイ上に複数出現するものを含めて1791個の細胞間タンパク相互作用データベースが作成された。
［5. 発現プロファイルと細胞間タンパク相互作用データベースを用いた、相互依存性の算出］
　上記2.で求めたマウス、ヒトの遺伝子発現プロファイルを、4.で求めた細胞間タンパク質相互作用のデータベースに組み入れることにより、それぞれの相互作用の相互依存性を算出した。
　具体的にはマウスの線維芽細胞からヒト表皮角化細胞へのシグナルの依存性については、Ligand（入力分子）についてはLigand-M/（Ligand-H+Ligand-M）、Receptor（出力分子）についてはReceptor-H/(Receptor-M+Receptor-H)となるような数値指標（0～1）を求めた。Receptor-Mは解析モデル系におけるマウス側の受容体の発現量を表す。この数値指標が１に近いと、LigandとReceptorのそれぞれの発現がマウス細胞、ヒト細胞で異なることになり、当該シグナルについては異種細胞同士の相互依存性が高いと考えられる。
　同様にヒト表皮角化細胞からマウスの線維芽細胞へのシグナルの依存性についてはLigand（入力分子）についてはLigand-H/（Ligand-M+Ligand-H）、Receptor（出力分子）についてはReceptor-M/（Receptor-H+Receptor-M）となるような数値指標（0～1）を求めた。またシグナル強度についてはLigand x Receptorの底を2とする対数を用いた。3.で求めた1791個の相互作用について上記の3つの数値（入力依存性、出力依存性、シグナル強度）を求めた。図１５に結果の一部を示す。
［6. 細胞間シグナル相互依存性の全体像の可視化］
　1.～5.の工程で算出した入力依存性をＸ軸、出力依存性をＹ軸に取り、一つの細胞間タンパク相互作用を一つの円で表した図を作成した（図１６）。円の大きさはシグナル強度を表す。
　ヒト表皮角化細胞からマウスの線維芽細胞へのシグナル（左）、およびマウスの線維芽細胞からヒト表皮角化細胞へのシグナル（右）を別個に作成した。
　図１７は、図１６と同じ図に、これまでに報告されている主な表皮角化細胞と線維芽細胞における細胞間相互作用を示したものである。それぞれの相互作用と参考文献を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　図示されるとおり、既報告の表皮角化細胞および線維芽細胞における細胞間相互作用は、入力依存性又は出力依存性の少なくともいずれかが1に近いことが示され、In vitroモデルにおいても本発明を用いて重要な相互作用を予測できることを検証できた。

Claims (14)

  1. 　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る工程と、
    　細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程と、
    　前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の組合せの中で、前記２以上の個体の１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高く、かつ、前記１の個体とは別の個体において、前記タンパク質の他方をコードする遺伝子の発現量がその他の個体より高くなっている場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、
    を含む、２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析方法。
  2. 　前記発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、
    　前記微小環境からＲＮＡを抽出し、各ＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列を解読する工程と、
    　前記解読した配列データに基づいて、前記ＲＮＡがそれぞれどの個体に由来するか特定し、かつ、各個体における各遺伝子の発現量を求める工程と、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記２以上の個体がそれぞれ異なる種に属し、
    　前記発現プロファイルを個体ごとに分類して得る工程は、
    　前記微小環境からＲＮＡを抽出し、各ＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列を並列型シーケンサーで解読する工程と、
    　前記解読した各配列を、前記個体が由来する種ごとの遺伝子配列のデータベース中の配列とアラインメントし、類似性が所定値以上であるか否かでどの種に由来するか分類する工程と、
    　分類後、ＲＮＡの数に基づいて遺伝子の発現量を求める工程と、
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記細胞間で相互作用しうる２つのタンパク質の組合せを選択する工程は、
    　タンパク質間の結合情報のデータベースを利用して、結合するタンパク質の組合せを選択する工程と、
    　タンパク質の局在情報のデータベースを利用して、いずれのタンパク質も細胞外又は細胞膜に局在する組合せを選択する工程と、
    の少なくとも一方を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記相互作用しうる２以上のタンパク質の組合せを選択する工程において、さらに、
    　タンパク質のパスウェイ情報のデータベースを利用して、前記タンパク質の組合せにおけるタンパク質間のシグナル伝達の方向を特定する、
    請求項４に記載の方法。
  6. 　前記重要な相互作用を推測する工程は、
    　前記発現プロファイルに基づいて、前記タンパク質の各組合せにつき、それぞれをコードする遺伝子について、前記２以上の個体における発現量の合計に対する、各個体における発現量の割合を求める工程と、
    　前記２以上の個体のうちの１の個体において、前記タンパク質の一方をコードする遺伝子の前記発現量の割合がより高く、別の個体において、他方のタンパク質をコードする遺伝子の前記発現量の割合がより高い場合に、該タンパク質の組合せによる相互作用が、前記２以上の個体に由来する細胞間においてより重要な相互作用であると推測する工程と、を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記２以上の個体が２の個体Ａ、Ｂであり、前記タンパク質の組合せが、タンパク質Ｘ、Ｙ（但し、Ｘはシグナル伝達においてＹより上流にある）であるときに、
    　前記重要な相互作用を推測する工程は、
    　前記発現プロファイルにおける、個体Ａ、Ｂのタンパク質Ｘをコードする遺伝子の発現量をそれぞれＸA、ＸBとし、タンパク質Ｙをコードする遺伝子の発現量をそれぞれＹA、ＹBとしたときに、
    　入力依存性を式：ＸA／（ＸA＋ＸB）で表し、
    　出力依存性を式：ＹA／（ＹA＋ＹB）で表し、
    　シグナル強度を式：ＸA×ＹBで表し、
    　入力依存性、出力依存性、及びシグナル強度のうち、少なくともいずれかの値がより高い組合せは、より重要な相互作用を担うと推測する工程を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境に代えて、ウイルスと細胞が共存している微小環境を用いる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　生理活性物質のスクリーニング方法であって、
    　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境を形成する工程と、
    　請求項１から８のいずれか１項に記載の方法で、前記２以上の個体に由来する細胞間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
    　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法。
  10. 　抗がん剤のスクリーニング方法であって、
    　モデル動物に、該モデル動物とは異なる種に由来するがん細胞株を移植し、がん細胞とモデル動物由来細胞とが共存している微小環境を形成する工程と、
    　請求項１から８のいずれか１項に記載の方法で、前記モデル動物において、がん細胞とモデル動物由来細胞との間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
    　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法。
  11. 　Picropodophyllin(PPP)、PD173074、及びPF562271からなる群の少なくとも１種を含む膵癌の治療剤。
  12. 　Picropodophyllin(PPP)、PD173074、及びPF562271からなる群の少なくとも１種を投与する膵癌の治療方法。
  13. 　抗ウイルス剤のスクリーニング方法であって、
    　in vitroで動物又は植物細胞にウイルスを感染させ、動物又は植物細胞とウイルスとが共存している微小環境を形成する工程と、
    　請求項１から８のいずれか１項に記載の方法で、前記細胞とウイルスの間において重要な相互作用をするタンパク質の組合せを特定する工程と、
    　前記タンパク質間の相互作用を阻害する医薬品を選択する工程と、を含む方法。
  14. 　２以上の個体に由来する細胞が共存している微小環境における遺伝子の発現プロファイルを、個体ごとに分類して得る第１の解析装置と、
    　方向性を含めたタンパク質間の相互作用の情報を相互作用データとして蓄積した細胞間タンパク相互作用データベースと、
    　前記細胞間タンパク相互作用データベースに含まれる相互作用データと、前記第１の解析装置によって作成された固体ごとの発現プロファイルとに基づいて、個体間の相互作用の相互依存性を解析する第２の解析装置と、
    　前記第２の解析装置による解析結果に基づいて、個体間の相互作用の相互依存性に関する図表を作成し、出力装置に出力する第３の解析装置と、
    を備える２以上の個体に由来する細胞間におけるタンパク質の相互作用の解析システム。
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